DE69932345T2 - PREPARATION AND SCALING OF INTERESTING DNA BANKS IN CELLS OF FILAMENTOUS MUSHROOMS - Google Patents

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Abstract

A method of constructing and screening a library of polynucleotide sequences of interest in filamentous fungal cells by use of an episomal replicating AMA1-based plasmid vector, thus achieving a high frequency of transformation and a stable and standard uniformly high level of gene expression.

Description

Gebiet der ErfindungTerritory of invention

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Erstellen und Durchmustern einer Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen in filamentösen Pilzzellen.The The present invention relates to methods for creating and screening a bank of polynucleotide sequences of interest in filamentous fungal cells.

Hintergrund der Erfindungbackground the invention

Filamentöse Pilze sind weitgehend als Wirtszellen für die kommerzielle Herstellung von Polypeptiden verwendet worden. Wenn es jedoch wünschenswert ist, eine Variante des Polypeptids mit spezifisch veränderten charakteristischen Merkmalen, z. B. Thermostabilität, pH-Aktivitätsprofil, spezifische Aktivität, Substratspezifität, Km, Vmax usw., herzustellen, erfordert die Erstellung und das Durchmustern einer Bank von die Variante kodierenden Sequenzen üblicherweise die Verwendung eines Zwischenwirts, z. B. Bakterienzellen oder Hefe, aufgrund der geringen Transformationshäufigkeit und einer Variation in der Kopienzahl zwischen unabhängig voneinander transformierten filamentösen Pilzzellen.Filamentous fungi have been widely used as host cells for the commercial production of polypeptides. However, if it is desirable to use a variant of the polypeptide having specifically altered characteristics, e.g. Thermostability, pH activity profile, specific activity, substrate specificity, K m , V max , etc., the generation and screening of a library of variant coding sequences usually requires the use of an intermediate host, e.g. B. bacterial cells or yeast, due to the low transformation frequency and a variation in the copy number between independently transformed filamentous fungal cells.

Es sind mehrere Verfahren für die Erstellung von Banken von interessierenden Polynukleotidsequenzen in Hefe offenbart worden, in welchen die Banken vor der Transformation eines für die Produktion relevanten Wirtes, wie zum Beispiel filamentösen Pilzen, mit den potentiellen interessierenden Varianten-Polynukleotidsequenzen, in Hefe durchmustert werden.It are several procedures for the creation of libraries of polynucleotide sequences of interest in yeast, in which the banks before the transformation one for the production of relevant hosts, such as filamentous mushrooms, with the potential variant polynucleotide sequences of interest, be screened in yeast.

Häufig jedoch kann eine Polynukleotidsequenz, die durch ein Durchmustern in Hefe oder Bakterien identifiziert wird, nicht exprimiert werden oder wird bei niedrigem Level exprimiert, wenn sie in für die Produktion relevante filamentöse Pilzzellen transformiert wird. Dies kann durch eine beliebige Anzahl von Gründen verursacht werden, einschließlich Unterschieden in der Codonnutzung (Codon usage), in der Regulation des mRNA-Levels, in dem Translokationsapparat, in dem post-translationalen Modifikationsmechanismus (z. B. Cysteinbrücken, Glycosylierungs- und Acylierungsmuster) usw.Often, however can be a polynucleotide sequence by screening in yeast or bacteria is identified, not expressed or is expressed at low levels when in for production relevant filamentous Fungal cells is transformed. This can be by any number caused by reasons be inclusive Differences in codon usage, in regulation mRNA level, in the translocating apparatus, in the post-translational Modification mechanism (eg, cysteine bridges, glycosylation and Acylation pattern) etc.

Zweitens ist es nicht notwendigerweise vorhersagbar, ob eine interessierende Polynukleotidsequenz in dem Produktionswirt bei kommerziell verwendbarem Level exprimiert werden würde. Zum Beispiel unterscheiden sich die Protease-Profile, wenn der Organismus, der für das Durchmustern der Bank verwendet wird, z. B. eine Bakterien- oder Hefezelle ist, und die für die Produktion relevante Wirtszelle eine filamentöse Wirtszelle ist. Somit kann eine Sequenz, die ein oder mehrere interessierende charakteristische(s) Merkmal(e) kodiert, welche in Hefe identifiziert worden ist/sind, durch Proteasen degradiert werden, die in der für die Produktion relevanten filamentösen Pilzwirtszelle exprimiert werden. Weiterhin ist eine direkte Manipulation des Produktionswirtes erforderlich, um optimierte Ausbeuten des exprimierten Produktes durch Verändern der Funktion von regulatorischen Proteinen oder regulatorischen Sequenzen zu erhalten.Secondly it is not necessarily predictable whether a person of interest Polynucleotide sequence in the production host of commercially useful Level would be expressed. For example, the protease profiles differ when the organism, the for the screening of the bank is used, e.g. B. a bacterial or yeast cell, and that for the production relevant host cell a filamentous host cell is. Thus, a sequence containing one or more of interest characteristic feature (s) which identifies in yeast have been / are degraded by proteases that are in the for production relevant filamentous Pilzwirtszelle be expressed. Furthermore, there is a direct manipulation the production host required optimized yields of the by changing the expressed product the function of regulatory proteins or regulatory To get sequences.

A. Aleksenko und A. J. Clutterbuck (1997. Fungal Genetics and Biology 21: 373–387) offenbaren die Verwendung von autonom replikativen Vektoren oder sich autonom replizierenden Sequenzen (ARS) für Genklonierungs- und -expressionsuntersuchungen. AMA1 (autonomous maintenance in Aspergillus) ist eines der diskutierten Plasmidreplikatorelementen. Es besteht aus zwei invertierten Kopien eines genomischen Repeats (Wiederholung), das als MATE1 (mobile Aspergillus transformation enhancer) bezeichnet wird, die durch einen zentralen Spacer von 0,3 kB separiert sind. AMA1 fördert die Plasmidreplikation ohne Umordnung (Reorganisation), Multimerisierung oder chromosomaler Integration. (Siehe ebenfalls D. H. Gems et al., Current Genetics 24: 520–524 (1993). Co-transformation with autonomously replicating helper plasmids facilitates gene cloning from an Aspergillus michelans gene library).A. Aleksenko and A. J. Clutterbuck (1997. Fungal Genetics and Biology 21: 373-387) disclose the use of autonomic replicative vectors or autonomously replicating sequences (ARS) for gene cloning and expression studies. AMA1 (autonomous maintenance in aspergillus) is one of the discussed ones Plasmidreplikatorelementen. It consists of two inverted copies of a genomic repeat, called MATE1 (mobile Aspergillus transformation enhancer) is called, by a central spacer of 0.3 kb are separated. AMA1 promotes the Plasmid replication without rearrangement (reorganization), multimerization or chromosomal integration. (See also D.H. Gems et al., Current Genetics 24: 520-524 (1993). Co-transformation with autonomously replicating helper plasmids gene gene cloning from Aspergillus michelans gene library).

Zusammenfassung der ErfindungSummary the invention

Es ist herausgefunden worden, dass AMA1-basierte Plasmide zwei Vorteile bei der Klonierung von Genen in filamentösen Pilzen bereitstellen. Der erste ist eine hohe Transformationshäufigkeit, welche sowohl die potentielle Größe der Bank erhöht, als auch das Erfordernis der Amplifikation der Bank in einem Zwischenwirt, z. B. E. coli, ausschalten kann, so dass ein Empfängerstamm von Aspergillus direkt mit einer Ligationsmischung transformiert werden kann. Zweitens sind die Eigenschaften der Transformanten einheitlich, dadurch dass eine stabile und standardgemäße Umgebung für die Genexpression bereitgestellt wird.It It has been found that AMA1-based plasmids have two advantages provide in the cloning of genes in filamentous fungi. Of the First is a high frequency of transformations, which is both the potential size of the bank elevated, as well as the requirement of amplification of the bank in an intermediate host, z. B. E. coli, so that a recipient strain of Aspergillus directly transformed with a ligation mixture can be. Second, the properties of the transformants uniform, by providing a stable and standard environment for the Gene expression is provided.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Verfahren zum Erstellen und Durchmustern von Banken von interessierenden Polynukleotidsequenzen in filamentösen Pilzzellen unter Verwendung eines episomal replizitierenden DNA-Vektors bereitzustellen, um eine hohe Transformationshäufigkeit und einen einheitlich hohen Level der Genexpression zwischen unabhängig voneinander transformierten Zellen bereitzustellen. Indem die Variation in der Kopienzahl zwischen unabhängig voneinander transformierten Zellen minimiert wird, kann ein interessierendes Varianten-Polypeptid direkt auf der Basis der Expression des/der interessierenden charakteristischen Merkmals/Merkmale identifiziert werden.It is an object of the present invention to provide improved methods for constructing and screening libraries of polynucleotide sequences of interest in filamentous fungal cells using of an episomally replicating DNA vector to provide a high frequency of transformation and a uniformly high level of gene expression between independently transformed cells. By minimizing the variation in copy number between independently transformed cells, a variant polypeptide of interest can be identified directly based on the expression of the characteristic feature or features of interest.

Demgemäß betrifft die vorliegenden Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Erstellen und Selektieren oder Durchmustern einer Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen in filamentösen Pilzzellen, wobei das Verfahren umfasst:

  • (a) Transformieren der Pilzzellen mit einer Population von DNA-Vektoren, wobei jeder Vektor umfasst:
  • (i) eine Polynukleotidsequenz, die einen Selektionsmarker für Pilze und eine Replikationsinitiationssequenz für Pilze kodiert, wobei der Marker und die Replikationsinitiationssequenz innerhalb der Population nicht variieren; und
  • (ii) eine interessierende Polynukleotidsequenz, wobei die Population von DNA-Vektoren mehr als eine Variante der Polynukleotidsequenz enthält;
  • (b) Kultivieren der Zellen unter Selektionsdruck;
  • (c) Selektieren von oder Durchmustern nach einem oder mehreren Transformanten, der/die ein gewünschtes charakteristisches Merkmal exprimiert/exprimieren; und
  • (d) Isolieren des/der interessierenden Transformanten.
Accordingly, in a first aspect, the present invention relates to a method of constructing and selecting or screening a library of polynucleotide sequences of interest in filamentous fungal cells, the method comprising:
  • (a) transforming the fungal cells with a population of DNA vectors, each vector comprising:
  • (i) a polynucleotide sequence encoding a selection marker for fungi and a replication initiation sequence for fungi, wherein the marker and the replication initiation sequence do not vary within the population; and
  • (ii) a polynucleotide sequence of interest, wherein the population of DNA vectors contains more than one variant of the polynucleotide sequence;
  • (b) culturing the cells under selection pressure;
  • (c) selecting or screening for one or more transformants expressing a desired characteristic; and
  • (d) isolating the transformant (s) of interest.

In anderen Aspekten betrifft die Erfindung die Verwendung einer Replikationsinitiationssequenz für Pilze zum Erstellen einer Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen und zum Durchmustern oder Selektieren einer Bank von solchen Polynukleotidsequenzen.In In other aspects, the invention relates to the use of a replication initiation sequence for mushrooms to create a library of polynucleotide sequences of interest and for screening or selecting a library of such polynucleotide sequences.

Kurze Beschreibung der FigurenShort description the figures

1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pENI1298, dessen Erstellung in Beispiel 1 beschrieben wird; 1 shows a restriction map of the plasmid pENI1298, the preparation of which is described in Example 1;

2 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pENI1299, dessen Erstellung in Beispiel 1 beschrieben wird; 2 shows a restriction map of the plasmid pENI1299, the preparation of which is described in Example 1;

3 zeigt eine Restriktionskarte der Plasmide pDM156.2, pJRoy47 und pDM222.A, die in Beispiel 5 beschrieben werden; und 3 Figure 4 shows a restriction map of plasmids pDM156.2, pJRoy47 and pDM222.A described in Example 5; and

4 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pJRoy44, das in Beispiel 5 beschrieben wird. 4 Figure 4 shows a restriction map of the plasmid pJRoy44 described in Example 5.

Ausführliche Beschreibung der ErfindungFull Description of the invention

In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erstellen und Selektieren oder Durchmustern einer Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen in filamentösen Pilzzellen, wobei das Verfahren umfasst:

  • (a) Transformieren der Pilzzellen mit einer Population von DNA-Vektoren, wobei jeder Vektor umfasst: (i) eine Polynukleotidsequenz, die einen Selektionsmarker für Pilze und eine Replikationsinitiationssequenz für Pilze kodiert, wobei der Marker und die Replikationsinitiationssequenz innerhalb der Population nicht variieren; und (ii) eine interessierende Polynukleotidsequenz, wobei die Population von DNA-Vektoren mehr als eine Variante der Polynukleotidsequenz enthält;
  • (b) Kultivieren der Zellen unter Selektionsdruck;
  • (c) Selektieren von oder Durchmustern nach einem oder mehreren Transformanten, der/die ein gewünschtes charakteristisches Merkmal exprimiert/exprimieren; und
  • (d) Isolieren des/der interessierenden Transformanten.
In a first embodiment, the present invention relates to a method of constructing and selecting or screening a library of polynucleotide sequences of interest in filamentous fungal cells, the method comprising:
  • (a) transforming the fungal cells with a population of DNA vectors, each vector comprising: (i) a polynucleotide sequence encoding a fungal selection marker and a fungal replication initiation sequence, wherein the marker and the replication initiation sequence do not vary within the population; and (ii) a polynucleotide sequence of interest, wherein the population of DNA vectors contains more than one variant of the polynucleotide sequence;
  • (b) culturing the cells under selection pressure;
  • (c) selecting or screening for one or more transformants expressing a desired characteristic; and
  • (d) isolating the transformant (s) of interest.

Der Begriff „eine Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen" bezeichnet eine Sammlung von Polynukleotidsequenzen, welche die gleiche interessierende Funktion oder Aktivität kodieren oder besitzen. Die Bank kann „eine Bank von Varianten einer interessierenden Polynukleotidsequenz" sein, welche hierin als eine Sammlung von Varianten definiert wird, wobei die Varianten sich von einer Eltern-Polynukleotidsequenz/Eltern-Polynukleotidsequenzen unterscheiden, indem sie eine oder mehrere Modifikation(en) der Eltern-Polynukleotidsequenz umfassen. Die Polynukleotidsequenzen oder Varianten werden geeigneterweise von mindestens einer interessierenden Eltern-Polynukleotidsequenz durch Mutagenese, bevorzugt Zufallsmutagene, erzeugt, was in einer Mindestzahl von vier und bevorzugt einem Minimum von 25 verschiedenen Polynukleotidsequenzen in der Sammlung resultiert. Verschiedenartige Verfahren, die für die Mutagenisierung einer Eltern-Polynukleotidsequenz verwendbar sind, werden in den nachstehenden Abschnitten, die mit „Zufallsmutagenese" und „Lokalisierte Zufallsmutagenese" bezeichnet werden, beschrieben. Der Begriff „Modifikation(en)" ist dazu gedacht, eine Substitution, Insertion und/oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotid(en) in der Sequenz im Vergleich zu der der Variante anzuzeigen, und kann ein Hybrid aus zwei oder mehreren verschiedenen Eltern-Polynukleotiden einschließen.The term "a bank of polynucleotide sequences of interest" refers to a collection of polynucleotide sequences that encode or possess the same function or activity of interest. The library may be "a library of variants of a polynucleotide sequence of interest," which is defined herein as a collection of variants. wherein the variants differ from a parent polynucleotide sequence / parent polynucleotide sequences by comprising one or more modifications of the parent polynucleotide sequence. The polynucleotide sequences or variants are suitably generated from at least one parent polynucleotide sequence of interest by mutagenesis, preferably random mutagenesis, resulting in a minimum of four, and preferably a minimum of 25, different Po lynucleotide sequences in the collection results. Various methods that are useful for mutagenizing a parent polynucleotide sequence are described in the following sections, referred to as "random mutagenesis" and "localized random mutagenesis." The term "modification (s)" is intended to indicate a substitution, insertion and / or deletion of one or more nucleotide (s) in the sequence as compared to that of the variant, and may be a hybrid of two or more different parent genes. Include polynucleotides.

Die Polynukleotidsequenzen oder Varianten können ebenfalls aus natürlich vorkommenden allelen Variationen einer Eltern-Polynukleotidsequenz resultieren. Eine allele Variante zeigt jede beliebige von zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens an, das denselben chromosomalen Ort (Locus) besetzt. Eine allele Variation entsteht auf natürliche Weise durch Mutation und kann in einem phänotypischen Polymorphismus innerhalb von Populationen resultieren. Genmutationen können still sein (d. h. keine Veränderung in dem kodierten Polypeptid) oder können Polypeptide kodieren, die veränderte Aminosäuresequenzen besitzen. Weiterhin können die Polynukleotidsequenzen der Bank, eher als von einer oder mehreren Eltern-Nukleotidsequenz(en) erzeugt zu werden, von verschiedenen Quellen abgeleitet werden und verschiedene, jedoch hochgradig verwandte Polypeptide kodieren, welche die gleiche Aktivität oder Funktion besitzen. Im vorliegenden Zusammenhang ist „hochgradig verwandt" dazu gedacht, anzuzeigen, dass die Polypeptide die gleiche Aktivität oder Funktion besitzen und zusätzlich durch Polynukleotidsequenzen kodiert werden, die konservierte Regionen gemeinsam haben, wie in dem nachfolgenden Abschnitt, der mit „DNA-Shuffling" bezeichnet wird, definiert.The Polynucleotide sequences or variants may also be naturally occurring allelic variations of a parent polynucleotide sequence. An allelic variant shows any one of two or more alternative forms of a gene, the same chromosomal location (Locus) occupied. An allelic variation arises naturally by mutation and may be in a phenotypic polymorphism within populations. Gene mutations can be silent be (that is, no change in the encoded polypeptide) or may encode polypeptides, the changed one amino acid sequences have. Furthermore you can the polynucleotide sequences of the library, rather than one or more Parent nucleotide sequence (s) to be generated from different Sources are derived and various, but highly related Encode polypeptides having the same activity or function. in the present context is "high grade related "meant to indicate that the polypeptides have the same activity or function own and in addition are encoded by polynucleotide sequences that share conserved regions have, as in the following section, which is referred to as "DNA shuffling", Are defined.

Der Begriff „abgeleitet von" ist dazu gedacht, anzuzeigen, dass die Polynukleotidsequenz von einer spezifischen Quelle, wie einem Mikroorganismus, isoliert ist. Die Polynukleotidsequenz kann eine sein, die von einem nicht-kultivierbaren Organismus erzeugt wird. Die Polynukleotidsequenz(en) kann jede beliebige Polynukleotidsequenz sein, die eine interessierende biologische Aktivität oder Funktion besitzt oder kodiert und eine Untersequenz von mindestens sechs Nukleotiden umfasst, um die Herstellung einer Varianten-Nukleotidsequenz zu erlauben.Of the Term "derived by "is meant to indicate that the polynucleotide sequence of a specific Source, such as a microorganism isolated. The polynucleotide sequence may be one that is produced by a non-cultured organism becomes. The polynucleotide sequence (s) may be any polynucleotide sequence be a biological activity or function of interest has or encodes and a subsequence of at least six Nucleotides involves the production of a variant nucleotide sequence to allow.

Der Begriff „die gleiche Aktivität oder Funktion", wie er bezüglich der Polynukleotidsequenzen, die in der Bank enthalten sind, verwendet wird, ist dazu gedacht, anzuzeigen, dass die Polynukleotidsequenzen Polypeptide kodieren, welche die gleiche oder ähnliche biologische Aktivität oder Funktion (qualitativ bestimmt) besitzen, oder dass die Polynukleotidsequenzen selbst die gleiche (qualitative) Aktivität oder Funktion besitzen. Zum Beispiel können die Polynukleotidsequenzen Promotoraktivität besitzen, d. h. in der Lage sein, die Transkription zu fördern, oder können Polypeptide mit der gleichen qualitativen Aktivität oder Funktion, wie der gleichen enzymatischen Aktivität oder Funktion, z. B. Protease-, Lipase- oder Amylaseaktivität, kodieren.Of the Term "the same activity or function ", how he regards of the polynucleotide sequences contained in the library is intended to indicate that the polynucleotide sequences Polypeptides encoding the same or similar biological activity or function (qualitatively determined) or that the polynucleotide sequences own the same (qualitative) activity or function. To the Example can the polynucleotide sequences have promoter activity, d. H. in a position be to promote transcription or can Polypeptides having the same qualitative activity or function, as the same enzymatic activity or function, e.g. Protease, Lipase or amylase activity, encode.

Der Begriff „DNA-Vektor" ist eine Polynukleotidsequenz, welche die Fähigkeit besitzt, sich autonom zu replizieren, und welche fähig ist, eine interessierende Sequenz zu enthalten. Demnach enthält ein DNA-Vektor eine Replikationsinitiationssequenz, wie einen (Replikations-) Startpunkt (z. B. ColE1-Startpunkt, F1-Startpunkt, M13-Startpunkt, 2μ- Startpunkt (Hefe), oriP (EB Virus) (pi). Der DNA-Vektor kann beispielsweise ein Plasmid sein.Of the Term "DNA vector" is a polynucleotide sequence, which the ability has to replicate autonomously and which is capable to contain a sequence of interest. Accordingly, a DNA vector contains a Replication initiation sequence, such as a (replication) start point (eg ColE1 start point, F1 start point, M13 start point, 2μ start point (yeast), oriP (EB virus) (pi). The DNA vector may be, for example, a plasmid be.

Der Begriff „wobei die Population von DNA-Vektoren mehr als eine Variante der Polynukleotidsequenz enthält" ist dazu gedacht, anzuzeigen, dass die Population von DNA-Vektoren verschiedene Polynukleotidsequenzen enthält, die eine interessierende biologische Funktion oder Aktivität kodieren oder besitzen.Of the Term "where the population of DNA vectors contains more than one variant of the polynucleotide sequence "is intended indicate that the population of DNA vectors have different polynucleotide sequences contains which encode a biological function or activity of interest or own.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die interessierenden Polynukleotidsequenzen Polypeptid-kodierende Sequenzen. Der Begriff „Polypeptid" umfasst Peptide, Oligopeptide und Proteine und ist daher nicht auf eine spezifische Länge des kodierten Produktes beschränkt. Das Polypeptid kann nativ zu der Wirtszelle sein oder kann ein heterologes Polypeptid sein. Der Begriff „heterologes Polypeptid" wird als ein Polypeptid definiert, welches nicht nativ zu der Wirtszelle ist. Das Polypeptid kann ebenfalls ein rekombinantes Polypeptid sein, welches ein Polypeptid ist, das nativ zu einer Zelle ist, welches durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die eine oder mehrere Kontrollsequenz(en) umfasst, die fremd zu der Nukleinsäuresequenz ist/sind, welche in die Produktion des Polypeptids involviert ist/sind. Die Nukleinsäuresequenz, welche das Polypeptid kodiert, kann auf irgendeine Weise, wie infra beschrieben, manipuliert worden sein. Das Polypeptid kann ein Wildtyp-Polypeptid oder eine Variante hiervon sein, das/die dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterworden wird/werden. Das Polypeptid kann ebenfalls ein Hybrid-Polypeptid sein, welches eine Kombination von teilweisen oder vollständigen Polypeptidsequenzen enthält, die von mindestens zwei verschiedenen Polypeptiden erhalten werden, wobei eine oder mehrere der Polypeptide heterolog zu der Zelle sein kann/können. Polypeptide schließen ferner natürlich vorkommende allele und gentechnisch hergestellte Variationen der oben erwähnten Polypeptide ein.In a preferred embodiment For example, the polynucleotide sequences of interest are polypeptide-encoding Sequences. The term "polypeptide" includes peptides, Oligopeptides and proteins and is therefore not specific Length of the coded product limited. The polypeptide may be native to the host cell or may be a heterologous one Be polypeptide. The term "heterologous Polypeptide "is is defined as a polypeptide which is not native to the host cell is. The polypeptide may also be a recombinant polypeptide which is a polypeptide native to a cell, which encodes by a nucleic acid sequence which comprises one or more control sequences that are foreign to the nucleic acid sequence is / are, which is / are involved in the production of the polypeptide. The Nucleic acid sequence which encodes the polypeptide may in some way, such as infra described, manipulated. The polypeptide may be a wild-type polypeptide or a variant thereof, which is the method of the present invention Invention is / will be subject. The polypeptide can also a hybrid polypeptide which is a combination of partial or complete Contains polypeptide sequences, obtained from at least two different polypeptides, wherein one or more of the polypeptides may be heterologous to the cell. polypeptides shut down furthermore, of course occurring alleles and genetically engineered variations of the mentioned above Polypeptides.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die interessierende Polynukleotidsequenz eine Kontrollsequenz, die normalerweise mit einer Polypeptid-kodierenden Sequenz assoziiert ist. Kontrollsequenzen schließen sämtliche Bestandteile, die funktionsfähig mit der Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz kodiert, verknüpft sind oder auf andere Weise in die Produktion des Polypeptids involviert sind, ein. Solche Kontrollsequenzen schließen ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, einen Promotor, eine Signalsequenz, eine Propeptidsequenz, einen Transkriptionsterminator, einen Leader, eine Promotorerkennungssequenz, eine Enhancersequenz und eine Polyadanylierungssequenz, wie hierin beschrieben. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die interessierende Polynukleotidsequenz eine Kombination aus einer Polypeptid-kodierenden Sequenz (oder einem Teil einer solchen Sequenz) und a) einer Kontrollsequenz (oder einem Teil einer solchen Kontrollsequenz) oder b) zwei oder mehreren Kontrollsequenzen (oder Teilen solcher Sequenzen). Jede der Kontrollsequenzen kann nativ oder fremd zu der kodierenden Sequenz sein.In another preferred embodiment the polynucleotide sequence of interest is a control sequence, which is normally associated with a polypeptide coding sequence is. Close control sequences all Ingredients that are functional with the nucleic acid sequence, which encodes the polypeptide sequence are linked or otherwise involved in the production of the polypeptide. Such control sequences shut down include, but are not limited to, a promoter, a signal sequence, a propeptide sequence, a transcription terminator, a leader, a promoter recognition sequence, an enhancer sequence and a polyadanylation sequence, as described herein. In yet another embodiment For example, the polynucleotide sequence of interest is a combination of a polypeptide coding sequence (or part of such Sequence) and a) a control sequence (or a part of such Control sequence) or b) two or more control sequences (or Parts of such sequences). Each of the control sequences may be native or foreign to the coding sequence.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid, das durch eine interessierende Polynukleotidsequenz kodiert wird, ein Antikörper oder Anteile davon, ein Antigen, ein Blutgerinnungsfaktor, ein Enzym, ein Hormon oder eine Hormonvariante, ein Rezeptor oder Anteile davon, ein regulatorisches Protein, ein strukturelles Protein, ein Reporter oder ein Transportprotein.In a preferred embodiment is the polypeptide represented by a polynucleotide sequence of interest is encoded, an antibody or portions thereof, an antigen, a blood coagulation factor, an enzyme Hormone or a hormone variant, a receptor or parts thereof, a regulatory protein, a structural protein, a reporter or a transport protein.

In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym eine Oxidoreductase, Transferase, Hydrolase, Lyase, Isomerase oder Ligase.In one stronger preferred embodiment the enzyme is an oxidoreductase, transferase, hydrolase, lyase, Isomerase or ligase.

In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym eine Aminopeptidase, Amylase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Catalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Desoxyribonuklease, Dextranase, Esterase, alpha-Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, Haloperoxidase, Invertase, Laccase, Lipase, Mannosidase, Mutanase, Oxidase, pectinolytisches Enzym, Peroxidase, Phytase, Polyphenoloxidase, proteolytisches Enzym, Ribonuclease, Transglutaminase oder Xylanase. Ein spezifisches Beispiel einer Lipase ist eine Lipase, die von Thermomyces lanuginosa abgeleitet ist oder eine Variante dieser Lipase, z. B. eine Variante, bei der eine N-terminale Verlängerung zu dem reifen Lipaseenzym hinzugefügt worden ist, wie in WO 97/04079 offenbart.In one more preferred embodiment the enzyme is an aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, Catalase, cellulase, chitinase, cutinase, deoxyribonuclease, dextranase, Esterase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamylase, alpha-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, Laccase, lipase, mannosidase, mutanase, oxidase, pectinolytic Enzyme, peroxidase, phytase, polyphenol oxidase, proteolytic enzyme, Ribonuclease, transglutaminase or xylanase. A specific example A lipase is a lipase derived from Thermomyces lanuginosa is or a variant of this lipase, z. B. a variant in which an N-terminal extension has been added to the mature lipase enzyme, as in WO 97/04079 disclosed.

In einer anderen Ausführungsform ist das Polypeptid humanes Insulin oder ein Analog hiervon, humanes Wachstumshormon, Erythropoietin oder Insulinotropin.In another embodiment For example, the polypeptide is human insulin or an analog thereof, human Growth hormone, erythropoietin or insulinotropin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Kontrollsequenz eine Promotorsequenz, bevorzugt eines Promotors von einem Pilz, wie eines Promotors, der von dem Gen abgeleitet ist, das Aspergillus oryzae TAKA Amylase, NA2-tpi (ein Hybrid der Promotoren von den Genen, welche die neutrale α-Amylase von A. niger und die Triosephosphatisomerase von A. oryzae kodieren) und Aspergillus niger oder Aspergillus awamori Glucoamylase kodiert.In a further preferred embodiment the control sequence is a promoter sequence, preferably a promoter from a fungus, such as a promoter, derived from the gene is the Aspergillus oryzae TAKA amylase, NA2-tpi (a hybrid of the Promoters of the genes containing the A. niger neutral α-amylase and the Encode triose phosphate isomerase from A. oryzae) and Aspergillus niger or Aspergillus awamori glucoamylase.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Kontrollsequenz eine Promotorerkennungssequenz, wie die amyR-Erkennungssequenz (Wo 98/01470), die creA (WO 94/13820) und areA (WO 95/35385).In another preferred embodiment the control sequence is a promoter recognition sequence such as the amyR recognition sequence (Wo 98/01470), creA (WO 94/13820) and areA (WO 95/35385).

Beispiele von weiteren im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung interessierenden Kontrollsequenzen werden weiterhin nachstehend aufgelistet, in dem Abschnitt, der mit „DNA-Vektoren und Kontrollsequenzen" bezeichnet ist.Examples of further interest in connection with the present invention Control sequences are further listed below in which Section that contains "DNA Vectors and control sequences " is.

Selektionsmarker für filamentöse Pilzeselection marker for filamentous mushrooms

Der Begriff „Selektionsdruck" wird hierin definiert als das Kultivieren einer filamentösen Pilzzelle, welche einen DNA-Vektor mit einem Selektionsmarkergen für Pilze und einer interessierenden Polynukleotidsequenz enthält, in der Gegenwart einer wirksamen Menge oder in der Abwesenheit eines geeigneten Selektionsmittels. Die wirksame Menge des Selektionsmittels wird hierin definiert als eine Menge, die ausreichend ist, um die Selektion von Zellen, welche den Selektionsmarker enthalten, von Zellen, welche den Selektionsmarker nicht enthalten, zu ermöglichen.Of the The term "selection pressure" is defined herein as the culturing of a filamentous fungal cell containing a DNA vector with a selection marker gene for fungi and one of interest Contains polynucleotide sequence, in the presence of an effective amount or in the absence of one suitable selection agent. The effective amount of the selection agent is defined herein as an amount sufficient to withstand the Selection of cells containing the selection marker from Cells that do not contain the selection marker to allow.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Selektionsmarker für Pilze ausgewählt aus der Gruppe von Genen, welche ein Produkt kodieren, das in der Lage ist, eine Resistenz gegenüber Biozid- oder viraler Toxizität, eine Resistenz gegenüber Schwermetalltoxizität oder Prototrophie oder Auxotrophe bereitzustellen.In a preferred embodiment is the selection marker for Mushrooms selected from the group of genes which encode a product that is described in the Able to resist Biocidal or viral toxicity, a resistance to Heavy metal toxicity or to provide prototrophy or auxotrophs.

In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Prototrophie von einem Enzym erhalten, ausgewählt aus der Gruppe von Stoffwechselwegen, bestehend aus Nukleotidsynthese, Cofaktorsynthese, Aminosäuresynthese, Acetamidstoffwechsel, Prolinstoffwechsel, Sulfatstoffwechsel und Nitratstoffwechsel.In a more preferred embodiment, the prototrophy is obtained from an enzyme selected from the group of metabolic pathways consisting of nucleotide synthesis, cofactor synthesis, Ami Nosäure synthesis, acetamide metabolism, Prolinstoffwechsel, sulfate metabolism and nitrate metabolism.

In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist der Selektionsmarker für Pilze ein Gen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus argB (Ornithincarbamoyltransferase), amdS (Acetamidase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase), hemA (5-Aminolevulinatsynthase), hemB (Porphobilinogensynthase), hygB (Hygromycinphosphotransferase), niaD (Nitratreductase), prn (Prolinpermease), pyrG (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase), pyroA, riboB, sC (Sulfatadenyltransferase) und trpC (Anthranilatsynthase).In one more preferred embodiment is the selection marker for Mushrooms a gene selected from the group consisting of argB (ornithine carbamoyltransferase), amdS (acetamidase), bar (phosphinothricin acetyltransferase), hemA (5-aminolevulinate synthase), hemB (porphobilinogen synthase), hygB (hygromycin phosphotransferase), niaD (nitrate reductase), prn (proline permease), pyrG (orotidine-5'-phosphate decarboxylase), pyroA, riboB, sC (sulfate adenyltransferase) and trpC (anthranilate synthase).

Die Pilzzelle wird in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zum Durchmustern nach oder Selektieren von Transformanten, welche die interessierende Varianten-Polynukleotidsequenz, welche das gewünschte charakteristische Merkmal besitzt oder kodiert, beherbergen, kultiviert. Die Kultivierung kann in Übereinstimmung mit im Stand der Technik gut bekannter Verfahren zum Durchmustern von Polynukleotidsequenzbanken durchgeführt werden.The Fungal cell is placed in a suitable medium and under suitable conditions to screen for or select transformants which the variant polynucleotide sequence of interest having the desired characteristic Feature owns or encodes, harbors, cultivates. The cultivation can in accordance with screening methods well known in the art of polynucleotide sequence libraries.

ReplikaktionsinitiationssequenzenReplication initiating sequences

Wie hierin verwendet, wird der Begriff „Replikationsinitiationssequenz für Pilze" als eine Nukleinsäuresequenz definiert, welche in der Lage ist, die autonome Replikation eines extrachromosomalen Moleküls, z. B. eines DNA-Vektors, wie ein Plasmid, in einer Pilzwirtszelle zu unterstützen, normalerweise ohne strukturelle Umordnung des DNA-Vektors oder Integration in das Wirtszellgenom. Die Replikationsinitiationssequenz kann von jeder beliebigen Herkunft sein, solange sie in der Lage ist, die Replikaktionsinitiationsaktivität in einer Pilzzelle zu vermitteln. Zum Beispiel kann die Replikationsinitiationssequenz ein Telomer humaner Herkunft sein, welches auf das Plasmid die Fähigkeit überträgt, in Aspergillus zu replizieren (Aleksenko und Ivanova, Mol. Gen. Genet. 260 (1998) 159–164). Bevorzugt wird die Replikationsinitiationssequenz von einer filamentösen Pilzzelle erhalten, stärker bevorzugt von einem Stamm von Aspergillus, Fusarium oder Alternaria, und noch stärker bevorzugt von einem Stamm von A. nidulans, A. oryzae, A. niger, F. oxysporum oder Alternaria altenata.As used herein, the term "replication initiation sequence for fungi "as a nucleic acid sequence which is capable of autonomous replication of a extrachromosomal molecule, z. A DNA vector, such as a plasmid, in a fungal host cell to support, usually without structural rearrangement of the DNA vector or integration into the host cell genome. The replication initiation sequence can be from be of any origin, as long as she is able to Replication initiating activity to mediate in a fungal cell. For example, the replication initiation sequence be a telomer of human origin which confers the ability to the plasmid in Aspergillus to replicate (Aleksenko and Ivanova, Mol. Gen. Genet. 260 (1998) 159-164). Preferably, the replication initiation sequence is from a filamentous fungal cell get, stronger preferably from a strain of Aspergillus, Fusarium or Alternaria, and even stronger preferably from a strain of A. nidulans, A. oryzae, A. niger, F. oxysporum or Alternaria altenata.

Eine Replikationsinitiationssequenz für Pilze kann durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren identifiziert werden. Zum Beispiel kann die Sequenz unter genomischen Fragmenten, die von dem in Frage stehenden Organismus abgeleitet sind, als eine Sequenz identifiziert werden, die in der Lage ist, eine autonome Replikation in Hefe zu erhalten (Ballance und Turner, Gene, 36 (1985), 321–331), was eine Indikation für die Fähigkeit der autonomen Replikation in filamentösen Pilzzellen ist. Die Replikaktionsinitiationsaktivität in Pilzen mit einer gegebenen Sequenz kann ebenfalls bestimmt werden, indem die Pilze mit vorgesehenen Plasmidreplikatoren transformiert werden und nach Kolonien selektiert werden, die eine unregelmäßige Morphologie besitzen, was den Verlust eines sekretorischen Plasmids anzeigt, welches wiederum zu einem Wachstumsverlust auf Selektionsmedium führen würde, wenn nach einem auf dem Plasmid befindlichen Gen selektiert wird (Gems et al., Gene, 98 (1991) 61–67). AMA1 wurde auf diese Weise isoliert. Ein alternativer Weg, um eine Replikationsinitiationssequenz zu isolieren, ist es, natürlich vorkommende Plasmide zu isolieren (z. B. wie offenbart von Tsuge et al., Genetics 146 (1997) 111–120 für Alternaria aternata).A Replication initiation sequence for Fungi can be identified by methods well known in the art become. For example, the sequence may be under genomic fragments, which are derived from the organism in question, as one Sequence that is capable of being autonomous Replication in yeast (Ballance and Turner, Gene, 36 (1985), 321-331) what an indication for the ability of autonomous replication in filamentous fungal cells. The replication initiation activity in mushrooms with a given sequence can also be determined by the fungi are transformed with intended plasmid replicators and are selected for colonies that have an irregular morphology which indicates the loss of a secretory plasmid, which in turn leads to a loss of growth on selection medium to lead would, when selecting for a gene present on the plasmid (Gems et al., Gene, 98 (1991) 61-67). AMA1 was on this Way isolated. An alternative way to a replication initiation sequence it is, of course, to isolate isolated plasmids (eg as disclosed by Tsuge et al., Genetics 146 (1997) 111-120 for Alternaria aternata).

Beispiele von Replikaktionsinitiationssequenzen für Pilze schließen ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, die ANS1- und AMA1-Sequenzen von Aspergillus nidulans, z. B., wie jeweils beschrieben von Cullen, D., et al. (1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163–9175) und Gems, D., et al., (1991, Gene 98: 61–67).Examples of replication initiation sequences for fungi, but are not limited to this the ANS1 and AMA1 sequences of Aspergillus nidulans, e.g. B., like each described by Cullen, D., et al. (1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175) and Gems, D., et al., (1991, Gene 98: 61-67).

Der Begriff „Replikaktionsinitiationsaktivität" wird hierin in seiner herkömmlichen Bedeutung verwendet, d. h., um anzuzeigen, dass die Sequenz in der Lage ist, die autonome Replikation eines extrachromosomalen Moleküls, wie eines Plasmids oder eines DNA-Vektors, in einer Pilzzelle zu unterstützen.Of the The term "replication initiation activity" is used herein in its usual Meaning used, d. h. to indicate that the sequence in the Capable of autonomous replication of an extrachromosomal molecule, such as a plasmid or a DNA vector, to assist in a fungal cell.

Der Begriff „ohne strukturelle Umordnung des Plasmids" wird hierin mit der Bedeutung verwendet, dass kein Teil des Plasmids deletiert wird oder in einen anderen Teil des Plasmids eingefügt wird, noch, dass irgendeine genomische DNA des Wirtes in das Plasmid eingefügt wird.Of the Term "without Structural rearrangement of the plasmid "is used herein to mean that no part of the plasmid is deleted or in another part of the plasmid will, nor that any genomic DNA of the host in the plasmid added becomes.

Bevorzugt ist die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendende Replikationsinitiationssequenz eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

  • (a) einer Nukleotidsequenz, welche mindestens 50 % Identität mit der Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 besitzt, und welche in der Lage ist, die Replikation in einer Pilzzelle zu initiieren;
  • (b) einer Nukleotidsequenz, welche in der Lage ist, die Replikation zu initiieren, welche unter niedrigen Stringenzbedingungen mit
  • (i) der Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 oder
  • (ii) den jeweils komplementären Strängen hybridisiert, wobei die niedrigen Stringenzbedingungen durch Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42 °C in 5 × SSPE, 0,3 % SDS, 200 mg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA und 25 % Formamid definiert sind, und Waschbedingungen bei 50 °C für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,2 % SDS definiert sind; und
  • (c) einer Untersequenz von (a) oder (b), wobei die Untersequenz in der Lage ist, die Replikation in einer Pilzzelle zu initiieren.
Preferably, the replication initiation sequence to be used in the methods of the present invention is a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
  • (a) a nucleotide sequence which has at least 50% identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and which is capable of initiating replication in a fungal cell;
  • (b) a nucleotide sequence which is capable of initiating replication occurring under low stringency conditions
  • (i) the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or
  • (ii) the respective complementary strands hybridized, the low stringency conditions being defined by prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5x SSPE, 0.3% SDS, 200 mg / ml sheared and denatured salmon sperm DNA and 25% formamide, and Washing conditions are defined at 50 ° C for 30 minutes in 2 x SSC, 0.2% SDS; and
  • (c) a subsequence of (a) or (b), wherein the subsequence is capable of initiating replication in a fungal cell.

In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die Nukleotidsequenz einen Identitätsgrad mit der in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 gezeigten Nukleinsäuresequenz von mindestens ungefähr 50 %, stärker bevorzugt ungefähr 60 %, noch stärker bevorzugt ungefähr 70 %, noch stärker bevorzugt ungefähr 80 %, noch stärker bevorzugt ungefähr 90 % und am stärksten bevorzugt ungefähr 97 % Identität (nachfolgend „homologes Polynukleotid"). Das homologe Polynukleotid umfasst ebenfalls eine Untersequenz von SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2, welche Replikaktionsinitiationsaktivität in Pilzzellen besitzt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann der Identitätsgrad auf geeignete Weise durch im Stand der Technik bekannte Computerprogramme bestimmt werden, wie GAP, bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–45), unter Verwenden von GAP mit den folgenden Einstellungen für einen Polynukleotidsequenzvergleich: GAP Creation Penalty von 5.0 und GAP Extension Penalty von 0.3.In a preferred embodiment the nucleotide sequence has an identity level as shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 of at least about 50%, more preferred approximately 60%, even stronger preferably about 70%, even stronger preferably about 80%, even stronger preferably about 90% and strongest preferably about 97% identity (hereinafter "homologous Polynucleotide "). The homologous polynucleotide also comprises a subsequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, which replicating initiation activity in fungal cells has. For the purposes of the present invention may be the degree of identity suitable manner by known in the art computer programs determined, such as GAP, provided in the GCG program package (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45), using GAP with the following settings for one Polynucleotide Sequence Comparison: GAP Creation Penalty of 5.0 and CAP extension penalty of 0.3.

Eine Hybridisierung zeigt an, dass durch Verfahren von Southern Blotting-Standardvorgehensweisen die Replikationsinitiationssequenz mit einer Oligonukleotidsonde, die von der in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 gezeigten Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist, unter niedrigen bis hohen Stringenzbedingungen (d. h., Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42 °C in 5 × SSPE, 0,3 % SDS, 200 μg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA und entweder 25, 35 oder 50 % Formamid für niedrige, mittlere bzw. hohe Stringenzen) hybridisiert. Um einen Klon oder eine DNA zu identifizieren, welcher/welche homolog zu SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, wird die Hybridisierungsreaktion dreimal für 30 Minuten, jeweils unter Verwenden von 2 × SSC, 0,2 % SDS, bevorzugt bei mindestens 50 °C, stärker bevorzugt mindestens 55 °C, stärker bevorzugt mindestens 60 °C, stärker bevorzugt mindestens 65 °C, noch stärker bevorzugt mindestens 70°C und am stärksten bevorzugt mindestens 75 °C, gewaschen.A Hybridization indicates that by procedures of standard Southern blotting procedures Replication initiation sequence with an oligonucleotide probe, the from the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 under low to high stringency conditions (i.e. h., prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5x SSPE, 0.3% SDS, 200 μg / ml sheared and denatured salmon sperm DNA and either 25, 35 or 50% formamide for low, medium or high stringencies) hybridized. To one Clone or to identify a DNA which is homologous to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 becomes the hybridization reaction three times for 30 minutes, each using 2x SSC, 0.2% SDS at least 50 ° C, stronger preferably at least 55 ° C, stronger preferably at least 60 ° C, stronger preferably at least 65 ° C, even stronger preferably at least 70 ° C and the strongest preferably at least 75 ° C, washed.

Die Oligonukleotidsonde kann die Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 oder eine jeweilige Untersequenz hiervon sein. Genauer kann die Oligonukleotidsonde beträchtlich kürzer sein als die gesamte Sequenz, sollte jedoch mindestens 15, bevorzugt mindestens 25 und stärker bevorzugt mindestens 40, Nukleotide in der Länge betragen. Es können sowohl DNA- als auch RNA-Sonden verwendet werden.The Oligonucleotide probe may be the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a respective subsequence thereof. Specifically, the oligonucleotide probe can be considerably shorter than the entire sequence, however, should be at least 15, preferably at least 25 and more preferred at least 40 nucleotides in length. It can both DNA and RNA probes are used.

Die Sonden werden typischerweise zum Detektieren des entsprechenden Gens markiert (zum Beispiel mit 32P, 3H, 35S, Biotin oder Avidin). Zum Beispiel können Moleküle, mit denen eine 32P-, 3H- oder 35S-markierte Oligonukleotidsonde hybridisiert, unter Verwenden eines Röntgenfilms detektiert werden.The probes are typically labeled to detect the corresponding gene (for example with 32 P, 3 H, 35 S, biotin or avidin). For example, molecules to which a 32 P, 3 H or 35 S-labeled oligonucleotide probe hybridizes can be detected using an X-ray film.

Wenn eine Replikationsinitiationssequenz zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung isoliert wird, wird eine genomische DNA-, cDNA- oder eine kombinatorisch chemische Bank, die von solch einem Organismus, wie oben definiert, hergestellt wird, von dem erwartet wird, dass er die Sequenz beherbergt, nach DNA durchmustert, die mit der oben beschriebenen Oligonukleotidsonde, die Replikaktionsinitiationsaktivität besitzt, hybridisiert. Genomische oder andere DNA von solchen anderen Organismen können durch Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder anderen Separationstechniken separiert werden. DNA von den Banken oder die separierte DNA kann auf Nitrocellulose oder einem anderen geeigneten Trägermaterial transferiert und immobilisiert werden. Ein Klon oder DNA, welche homolog zu SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, kann dann Southern Blotting-Standardvorgehensweisen folgend identifiziert werden.If a replication initiation sequence for use in the present invention Is isolated, is a genomic DNA, cDNA or a combinatorial chemical bank derived from such an organism, such as defined above, which is expected to be harboring the sequence, screened for DNA with the above described oligonucleotide probe having replicase initiation activity, hybridized. Genomic or other DNA from such other organisms can by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis or others Separation techniques are separated. DNA from the banks or the separated DNA may be appropriate for nitrocellulose or another support material be transferred and immobilized. A clone or DNA, which is homologous to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, then Southern Blotting standard procedures following identified.

Die Techniken, die verwendet werden, um eine Nukleinsäuresequenz zu isolieren oder zu klonieren, die Replikaktionsinitiationsaktivität besitzt, sind im Stand der Technik bekannt und schließen eine Isolation von genomischer DNA oder cDNA ein. Die Klonierung von solcher DNA kann bewirkt werden, z. B. unter Verwenden von Verfahren, die auf einer Polymerasekettenreaktion (PCR) basieren, um klonierte DNA-Fragmente mit gemeinsamen strukturellen Merkmalen zu detektieren (siehe z. B. Innis, et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York). Andere Nukleinsäure-Amplifizierungsvorgehensweisen, wie der Ligasekettenreaktion (LCR), können verwendet werden.The Techniques that are used to construct a nucleic acid sequence to isolate or clone that has replica action initiation activity, are known in the art and include isolation of genomic DNA or cDNA. The cloning of such DNA can be effected z. Using methods based on a polymerase chain reaction (PCR) to cloned DNA fragments with common structural To detect features (see, e.g., Innis, et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York). Other Nucleic acid Amplifizierungsvorgehensweisen, like the ligase chain reaction (LCR), can be used.

In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die Replikationsinitiationssequenz die Nukleinsäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 oder eine jeweilige funktionelle Untersequenz hiervon. Zum Beispiel ist eine funktionelle Untersequenz von SEQ ID NR: 1 eine Nukleinsäuresequenz, die von SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 umfasst ist, mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere Nukleotid(e) von den 5'- und/oder 3'-Ende deletiert worden ist/sind. Bevorzugt enthält eine Untersequenz mindestens 100 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens 1000 Nukleotide und am stärksten bevorzugt mindestens 2000 Nukleotide. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform enthält eine Untersequenz von SEQ ID NR: 1 mindestens die in SEQ ID NR: 2 gezeigten Nukleinsäuresequenz.In a preferred embodiment, the replication initiation sequence has the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a respective functional subsequence thereof. For example, a functional subsequence of SEQ ID NO: 1 is a nucleic acid sequence encompassed by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, with the exception that one or more nucleotides of the 5 'and / or or 3'-end has been deleted / are. Preferably, a subsequence contains at least 100 nucleotides, more preferably at least 1000 nucleotides, and most preferably at least 2000 nucleotides. In a more preferred embodiment, a subsequence of SEQ ID NO: 1 contains at least the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

DNA-Vektor und KontrollsequenzenDNA vector and control sequences

In dem DNA-Vektor, der eine Polynukleotidsequenz umfasst, die einen Selektionsmarker für Pilze, eine Replikationsinitiationssequenz für Pilze und eine interessierende Polynukleotidsequenz umfasst, kann die Polynukleotidsequenz ein Polypeptid kodieren, in welchem Fall sie funktionsfähig verknüpft ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenz(en), welche die Expression der kodierenden Sequenz leitet/leiten. Alternativ ist die Polynukleotidsequenz eine Kontrollsequenz, in welchem Fall, abhängig von der in Frage stehenden Kontrollsequenz, sie normalerweise funktionsfähig verknüpft ist mit einer Polypeptid-kodierenden Sequenz, um in der Lage zu sein, die Aktivität der Kontrollsequenz festzulegen (und so in der Lage zu sein, Varianten der Eltern-Kontrollsequenz zu selektieren, die die gewünschten Eigenschaften besitzen).In the DNA vector comprising a polynucleotide sequence comprising a Selection marker for Fungi, a replication initiation sequence for fungi and a species of interest Polynucleotide sequence, the polynucleotide sequence may include Polypeptide encode, in which case it is operably linked with one or more control sequences expressing expression the coding sequence conducts / direct. Alternatively, the polynucleotide sequence is a control sequence, in which case, depending on the one in question Control sequence, it is normally operably linked to a polypeptide-encoding Sequence to be able to determine the activity of the control sequence (and so to be able to find variants of the parent control sequence to select the ones you want Own properties).

Die Vorgehensweisen, die verwendet werden, um die Elemente des DNA-Vektors zu ligieren, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al, 1989, supra).The Procedures that are used to identify the elements of the DNA vector ligands are well known to those skilled in the art (see, eg, Sambrook et al, 1989, supra).

Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" wird hierin definiert als eine Konfiguration, in welcher eine Kontrollsequenz auf geeignete Weise an einer Position relativ zu der Polypeptidkodierenden Sequenz platziert ist, so dass die Kontrollsequenz die Expression des Polypeptids leitet oder auf andere Weise in die Produktion des Polypeptids involviert ist.Of the The term "operably linked" is defined herein as a configuration in which a control sequence is appropriate At a position relative to the polypeptide-encoding sequence is placed so that the control sequence the expression of the polypeptide or otherwise involved in the production of the polypeptide is.

Im Folgenden werden verschiedene Kontrollsequenzen im weiteren Detail diskutiert. Die Kontrollsequenzen sind solche, welche funktionsfähig mit den interessierenden Polynukleotidsequenzen verknüpft sind (wenn die interessierenden Polynukleotidsequenzen ein Polypeptid kodieren), und solche, welche die interessierenden Polynukleotidsequenzen darstellen (wenn die Polynukleotidsequenz eine Kontrollsequenz ist). Es versteht sich, dass ein und dieselbe Kontrollsequenz entweder als eine interessierende Polynukleotidsequenz (wenn die Bank eine Bank von Kontrollsequenzen ist) oder als eine Kontrollsequenz, welche in die Produktion eines Polypeptids involviert ist, das durch eine interessierende Polynukleotidsequenz kodiert wird (wenn die Bank eine Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen, die ein Polypeptid kodieren, ist) verwendet werden kann, und dass die folgende Offenbarung dazu gedacht ist, beide Verwendungstypen der Kontrollsequenz abzudecken.in the Following are various control sequences in further detail discussed. The control sequences are those which are functional with are linked to the polynucleotide sequences of interest (if the polynucleotide sequences of interest encode a polypeptide), and those which are the polynucleotide sequences of interest (if the polynucleotide sequence is a control sequence). It understands itself, that one and the same control sequence either as an interesting Polynucleotide sequence (if the bank has a bank of control sequences or as a control sequence involved in the production of a Polypeptide involved by a polynucleotide sequence of interest (if the bank has a bank of polynucleotide sequences of interest, which encode a polypeptide) can be used, and that the following disclosure is intended to both types of use to cover the control sequence.

Die Kontrollsequenz kann eine geeignete Promotorsequenz sein, eine Nukleinsäuresequenz, welche durch eine Wirtszelle für die Expression einer Polypeptid-kodierenden Sequenz erkannt wird. Die Promotorsequenz enthält Transkriptions-Kontrollsequenzen, welche die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promotor kann jede beliebige Nukleinsäuresequenz sein, welche Transkriptionsaktivität in der gewählten Wirtszelle zeigt, einschließlich mutierten, verkürzten und Hybrid-Promotoren, und kann von Genen erhalten werden, die extrazelluläre oder intrazelluläre Polypeptide kodieren, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind.The Control sequence may be a suitable promoter sequence, a nucleic acid sequence, which by a host cell for the expression of a polypeptide coding sequence is recognized. The promoter sequence contains Transcriptional control sequences which express the polypeptide convey. The promoter may be any nucleic acid sequence its transcriptional activity in the chosen host cell shows, including mutated, shortened and hybrid promoters, and can be obtained from genes that are extracellular or intracellular Polypeptides encoding either homologous or heterologous to the Host cell are.

Beispiele von geeigneten Promotoren zum Leiten der Transkription einer Polypeptidkodierenden Nukleotidsequenz in einer filamentösen Pilzwirtszelle sind Promotoren, die von den Genen erhalten werden, die die TAKA Amylase von Aspergillus oryzae, die Asparaginproteinase von Rhizomucor miehei, die neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger, die säurestabile alpha-Amylase von Aspergillus niger, die Glucoamylase (glaA) von Aspergillus niger oder Aspergillus awamori, die Lipase von Rhizomucor miehei, die alkalische Protease von Aspergillus oryzae, die Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae, die Acetamidase von Aspergillus nidulans, die Trypsin-ähnliche Protease von Fusarium oxysporum (US Patent Nr. 4,288,627) kodieren, und mutierte, verkürzte und Hybridpromotoren hiervon. Insbesondere bevorzugte Promotoren für die Verwendung in filamentösen Pilzwirtszellen sind die TAKA Amylase, NA2-tpi- (ein Hybrid der Promotoren von den Genen, welche die neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger und die Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae kodieren) und glaA-Promotoren.Examples suitable promoters for directing transcription of a polypeptide Nucleotide sequence in a filamentous fungal host cell are promoters, obtained from the genes containing the TAKA amylase from Aspergillus oryzae, the asparagine proteinase of Rhizomucor miehei, the neutral Aspergillus niger alpha-amylase, the acid-stable alpha-amylase of Aspergillus niger, the glucoamylase (glaA) of Aspergillus niger or Aspergillus awamori, the lipase of Rhizomucor miehei, the alkaline protease from Aspergillus oryzae, the triosephosphate isomerase of Aspergillus oryzae, the acetamidase of Aspergillus nidulans, the trypsin-like ones Encode protease from Fusarium oxysporum (US Pat. No. 4,288,627), and mutated, shortened and hybrid promoters thereof. Especially preferred promoters for the Use in filamentous Fungal host cells are the TAKA amylase, NA2-tpi- (a hybrid of the Promoters of the genes encoding the neutral alpha-amylase of Aspergillus niger and the triose phosphate isomerase of Aspergillus oryzae encode) and glaA promoters.

Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine geeignete Transkriptionsterminatorsequenz sein, eine Sequenz, die von einer filamentösen Pilzzelle erkannt wird, um die Transkription zu beenden. Die Terminatorsequenz ist funktionsfähig mit dem 3'-Terminus der Polypeptidkodierenden Nukleotidsequenz verknüpft. Jeder beliebige Termiantor, welcher in der filamentösen Pilzzelle funktionell ist, kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden.The control sequence may also be a suitable transcription terminator sequence, a sequence recognized by a filamentous fungal cell to terminate transcription. The terminator sequence is operably linked to the 3'-terminus of the polypeptide-encoding nucleotide sequence. Everyone Any termiantor which is functional in the filamentous fungal cell may be used in the present invention.

Bevorzugte Terminatoren werden von den Genen erhalten, welche die TAKA Amylase von Aspergillus oryzae, die Glucoamylase von Aspergillus niger, die Anthranilatsynthase von Aspergillus nidulans, die alpha-Glucosidase von Aspergillus niger und die Trypsin-ähnliche Protease von Fusarium oxysporum kodieren.preferred Terminators are obtained from the genes that contain the TAKA amylase of Aspergillus oryzae, the glucoamylase of Aspergillus niger, the anthranilate synthase of Aspergillus nidulans, alpha-glucosidase of Aspergillus niger and the trypsin-like protease of Fusarium encode oxysporum.

Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine geeignete Leadersequenz sein, eine nicht-translatierte Region einer mRNA, welche wichtig für die Translation durch die filamentöse Pilzzelle ist. Die Leadersequenz ist funktionsfähig verknüpft mit dem 5'-Terminus der Polypeptid-kodierenden Nukleotidsequenz. Jede beliebige Leadersequenz, welche in der filamentösen Pilzzelle funktionell ist, kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden.The Control sequence may also be a suitable leader sequence, an untranslated one Region of a mRNA important for translation through the filamentous Fungal cell is. The leader sequence is operably linked to the 5'-terminus of the polypeptide-encoding gene Nucleotide sequence. Any leader sequence found in the filamentous fungal cell is functional, can for the present invention can be used.

Bevorzugte Leader werden von den Genen erhalten, die die TAKA Amylase von Aspergillus oryzae und die Triosephosphatisomerase von Aspergillus nidulans kodieren.preferred Leaders are obtained from the genes that contain the TAKA amylase from Aspergillus oryzae and the triose phosphate isomerase of Aspergillus nidulans encode.

Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine Polyadenylierungssequenz sein, eine Sequenz, welche funktionsfähig verknüpft ist mit dem 3'-Terminus der Polypeptid-kodierenden Nukleotidsequenz, welche, wenn sie transkribiert wird, von einer filamentösen Pilzzelle als ein Signal erkannt wird, um Polyadenosinreste zu der transkribierten mRNA hinzuzufügen. Jede beliebige Polyadenylierungssequenz, welche in der filamentösen Pilzzelle funktionell ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.The Control sequence may also be a polyadenylation sequence a sequence which is functional connected is with the 3'-terminus the polypeptide-encoding nucleotide sequence which, when transcribed is, by a filamentous Fungal cell is recognized as a signal to polyadenosine residues to the transcribed add mRNA. Any polyadenylation sequence found in the filamentous fungal cell is functional, can be used in the present invention.

Bevorzugte Polyadenylierungssequenzen werden erhalten von den Genen, welche die TAKA Amylase von Aspergillus oryzae, die Glucoamylase von Aspergillus niger, die Anthranilatsynthase von Aspergillus nidulans und die alpha-Glucosidase von Aspergillus niger kodieren.preferred Polyadenylation sequences are obtained from the genes which the TAKA amylase from Aspergillus oryzae, the glucoamylase from Aspergillus niger, the anthranilate synthase of Aspergillus nidulans and the encode alpha-glucosidase from Aspergillus niger.

Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine Signalpeptid-kodierende Region sein, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, die mit dem Aminoterminus des Polypeptids verknüpft ist, welche das kodierte Polypeptid in den Sekretionsweg der Zelle leiten kann. Das 5'-Ende der Polypeptid-kodierenden Nukleotidsequenz kann schon inhärent eine Signalpeptid-kodierende Region enthalten, die naturgemäß in dem Translations-Leserahmen mit dem Segment der kodierenden Region, welche das sekretierte Polypeptid kodiert, verknüpft ist. Alternativ kann das 5'-Ende der kodierenden Sequenz eine Signalpeptid-kodierende Region enthalten, welche fremd zu der kodierenden Sequenz ist. Die fremde Signalpeptid-kodierende Region kann erforderlich sein, wenn die kodierende Sequenz normalerweise keine Signalpeptid-kodierende Region enthält. Alternativ kann die fremde Signalpeptid-kodierende Region einfach die natürliche Signalpeptid-kodierende Region ersetzen, um eine verstärkte Sekretion des Polypeptids zu erhalten. Die Signalpeptid-kodierende Region kann von einem Glucoamylase- oder einem Amylasegen von einer Art von Aspergillus oder einem Lipase- oder Proteinasegen von einer Art von Rhizomucor erhalten werden. Jedoch kann jede beliebige Signalpeptidkodierende Region, welche das exprimierte Polypeptid in den Sekretionsweg einer filamentösen Pilzzelle leitet, für die vorliegende Erfindung verwendet werden.The Control sequence may also be a signal peptide coding region which is an amino acid sequence encoded with the amino terminus of the polypeptide, which direct the encoded polypeptide into the secretory pathway of the cell can. The 5'-end the polypeptide-encoding nucleotide sequence may inherently a Signal peptide-coding region naturally occurring in the Translation reading frame with the coding region segment, which encodes the secreted polypeptide. Alternatively, the 5 'end of the coding Sequence contain a signal peptide coding region which foreign to the coding sequence. The foreign signal peptide coding Region may be required if the coding sequence is normal does not contain a signal peptide coding region. Alternatively, the stranger Signal peptide coding region simply the natural signal peptide coding Replace region to strengthen To obtain secretion of the polypeptide. The signal peptide coding Region may be of a kind of glucoamylase or amylase gene of Aspergillus or a lipase or proteinase gene of one Type of rhizomucor can be obtained. However, any signal peptide may be coding A region expressing the expressed polypeptide in the secretory pathway of a filamentous Fungal cell conducts, for the present invention can be used.

Eine effektive Signalpeptid-kodierende Region ist die Signalpeptid-kodierende Region, die von dem TAKA Amylasegen von Aspergillus oryzae, dem neutrale Amylasegen von Aspergillus niger, dem Asparaginproteinasegen von Rhizomucor miehei oder dem Cellulasegen von Humicola lanuginosa erhalten wird.A effective signal peptide coding region is the signal peptide coding Region derived from the TAKA amylase gene of Aspergillus oryzae, the neutral amylase gene of Aspergillus niger, the asparagine proteinase gene of Rhizomucor miehei or the cellulase gene of Humicola lanuginosa is obtained.

Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine Propeptid-kodierende Region sein, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, die an dem Aminoterminus eines Polypeptids positioniert ist. Das resultierende Polypeptid ist als ein Proenzym oder Propolypeptid (oder in einigen Fällen ein Zymogen) bekannt. Ein Propolypeptid ist im Allgemeinen inaktiv und kann durch katalytische oder autokatalytische Spaltung des Propeptids von dem Propolypeptid in ein reifes, aktives Polypeptid umgewandelt werden. Die Propeptid-kodierende Region kann von dem Asparaginproteinasegen von Rhizomucor miehei oder dem Laccasegen von Myceliophthora thermophila erhalten werden (WO 95/33836).The Control sequence may also be a propeptide coding region which is an amino acid sequence which positions at the amino terminus of a polypeptide is. The resulting polypeptide is as a proenzyme or propolypeptide (or in some cases a zymogen). A propolypeptide is generally inactive and may be by catalytic or autocatalytic cleavage of the propeptide converted from the propolypeptide into a mature, active polypeptide become. The propeptide coding region may be from the asparagine proteinase gene from Rhizomucor miehei or the Laccasegen from Myceliophthora thermophila be (WO 95/33836).

Wo sowohl Signalpeptid- als auch Propeptidregion an dem Aminoterminus eines Polypeptids vorhanden sind, ist die Propeptidregion angrenzent an den Aminoterminus eines Polypeptids positioniert und die Signalpeptidregion ist angrenzend an den Aminoterminus der Propeptidregion positioniert.Where both signal peptide and propeptide regions at the amino terminus of a polypeptide, the propeptide region is contiguous positioned at the amino terminus of a polypeptide and the signal peptide region is positioned adjacent to the amino terminus of the propeptide region.

Die Polypeptid-kodierende Nukleotidsequenz kann ebenfalls funktionsfähig verknüpft sein mit einer oder mehreren Nukleinsäuresequenz(en), welche einen oder mehrere Faktoren kodiert/kodieren, die vorteilhaft ist/sind, um die Expression des Polypeptids zu leiten, z. B. ein transkriptionaler Aktivator (z. B. ein trans-wirkender Faktor), ein Chaperon und eine Processing-Protease. Jeder beliebige Faktor, der in einer filamentösen Pilzzelle funktionell ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Nukleinsäuren, die einen oder mehrere dieser Faktoren kodieren, sind nicht notwendigerweise in einer Reihe mit der Polypeptid-kodierenden Nukleotidsequenz.The polypeptide-encoding nucleotide sequence may also be operably linked to one or more nucleic acid sequences that encode / encode one or more factors that are advantageous for directing expression of the polypeptide, e.g. B. a transcriptional activator (eg trans-acting factor), a chaperone and a processing protease. Any factor that is functional in a filamentous fungal cell can be used in the present invention. The nucleic acids encoding one or more of these factors are not necessarily in alignment with the polypeptide-encoding nucleotide sequence.

Ein Aktivator ist ein Protein, welches die Transkription einer Polypeptid-kodierenden Nukleotidsequenz aktiviert (Kudla et al., 1990, EMBO Journal 9: 1355–1364; Jarai und Buxton, 1994, Current Genetics 26: 2238–244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271–297). Die Nukleinsäuresequenz, die einen Aktivator kodiert, kann von den Genen erhalten werden, die das Hämaktivatorprotein 1 (hap1) von Saccharomyces cerevisiae, das Galactose-metabolisierende Protein 4 (gal4) von Saccharomyces cerevisiae, das Ammoniakregulationsprotein (areA) von Aspergillus nidulans und den alpha-Amylaseaktivator (amyR) von Aspergillus oryzae kodieren. Für weitere Beispiele siehe Verdier, 1990, supra und MacKenzie et al., 1993, Journal of General Microbiology 139: 2295–2307.One Activator is a protein encoding the transcription of a polypeptide Nucleotide sequence activated (Kudla et al., 1990, EMBO Journal 9: 1355-1364; Jarai and Buxton, 1994, Current Genetics 26: 2238-244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271-297). The nucleic acid sequence, which encodes an activator can be obtained from the genes the heme activator protein 1 (hap1) of Saccharomyces cerevisiae, the galactose-metabolizing Protein 4 (gal4) of Saccharomyces cerevisiae, the ammonia regulatory protein (areA) of Aspergillus nidulans and the alpha-amylase activator (amyR) of Aspergillus encode oryzae. For further For examples see Verdier, 1990, supra and MacKenzie et al., 1993, Journal of General Microbiology 139: 2295-2307.

Ein Chaperon ist ein Protein, welches einem anderen Protein hilft, sich richtig zu falten (Hart1 et al., 1994, TIBS 19: 20–25; Bergeron et al., 1994, TIBS 19: 124–128; Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnology 32: 179–189; Craig, 1993, Science 260: 1902–1903; Gething und Sambrook, 1992, Nature 355: 33–45; Puig und Gilbert, 1994, Journal of Biological Cbemistry 269: 7764–7771; Wang und Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515– 11157; Robinson et al., 1994, Bio/Technology 1:381–384; Jacobs et al., 1993, Molecular Microbiology 8: 957–966). Die Nukleinsäuresequenz, die ein Chaperone kodiert, kann von den Genen erhalten werden, welche die Proteindisulfidisomerase von Aspergillus oryzae oder Calnexin von Saccharomyces cerevisiae, BiP/GRP78 von Saccharomyces cerevisiae und Hsp70 von Saccharomyces cerevisiae kodieren. Für weitere Beispiele siehe Gething und Sambrook, 1992, supra, und Hart1 et al., 1994, supra).One Chaperone is a protein that helps another protein to fold properly (Hart1 et al., 1994, TIBS 19: 20-25, Bergeron et al., 1994, TIBS 19: 124-128; Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnology 32: 179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething and Sambrook, 1992, Nature 355: 33-45; Puig and Gilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 7764-7771; Wang and Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515-11157; Robinson et al., 1994, Bio / Technology 1: 381-384; Jacobs et al., 1993, Molecular Microbiology 8: 957-966). The nucleic acid sequence, which encodes a chaperone can be obtained from the genes which the protein disulfide isomerase of Aspergillus oryzae or Calnexin of Saccharomyces cerevisiae, BiP / GRP78 of Saccharomyces cerevisiae and Hsp70 from Saccharomyces cerevisiae. For further Examples see Gething and Sambrook, 1992, supra, and Hart1 et al., 1994, supra).

Eine Processing-Protease ist eine Protease, die ein Propeptid spaltet, um ein reifes biochemisch aktives Polypeptid zu erzeugen (Enderlin und Ogrydziak, 1994, Yeast 10: 67–79; Fuller et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434–1438; Julius et al., 1984, Cell 37: 1075–1089; Julius et al., 1983, Cell 32: 839–852; US Patent Nr. 5,702,934). Die Nukleinsäuresequenz, die eine Processing-Protease kodiert, kann von den Genen erhalten werden, welche die Dipeptidylaminopeptidase von Saccharomyces cerevisiae, Kex2 von Saccharomyces cerevisiae, die zweibasig Processing-Endoprotease (xpr6) von Yarrowia lipolytica und die Metalloprotease (p45-Gen) von Fusarium oxysporum kodieren.A Processing protease is a protease that cleaves a propeptide to produce a mature biochemically active polypeptide (Enderlin and Ogrydziak, 1994, Yeast 10: 67-79; Fuller et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Julius et al., 1984, Cell 37: 1075-1089; Julius et al., 1983, Cell 32: 839-852; US Pat. No. 5,702,934). The nucleic acid sequence, which encodes a processing protease can be obtained from the genes containing the dipeptidyl aminopeptidase from Saccharomyces cerevisiae, Kex2 from Saccharomyces cerevisiae, the dibasic processing endoprotease (xpr6) from Yarrowia lipolytica and the metalloprotease (p45 gene) of Fusarium oxysporum.

Es kann ebenfalls wünschenswert sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, welche die Regulation der Expression des Polypeptids relativ zu dem Wachstum der filamentösen Pilzzelle erlaubt. Beispiele von regulatorischen Systemen sind solche, welche bewirken, dass die Expression des Gens an- oder abgeschaltet wird, in Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Reiz, einschließlich der Gegenwart einer regulatorischen Verbindung. Der TAKA alpha-Amylasepromotor, Glucoamylasepromotor von Aspergillus niger und der Glucoamylasepromotor von Aspergillus oryzae können als regulatorische Sequenzen verwendet werden. Andere Beispiele von regulatorischen Sequenzen sind solche, welche die Genamplifikation erlauben, z. B. die Metallothioneingene, welche bei Schwermetallen amplifiziert werden. In diesen Fällen würde die Polypeptid-kodierende Nukleotidsequenz mit der regulatorischen Sequenz funktionsfähig verknüpft sein.It may also be desirable be to add regulatory sequences that regulate the expression of the polypeptide relative to the growth of the filamentous fungal cell allowed. Examples of regulatory systems are those which cause expression of the gene to be turned on or off, in response to a chemical or physical stimulus, including the Presence of a regulatory compound. The TAKA alpha-amylase promoter, Aspergillus niger glucoamylase promoter and the glucoamylase promoter of Aspergillus oryzae be used as regulatory sequences. Other examples of regulatory sequences are those encoding gene amplification allow, for. As the metallothionein genes, which in heavy metals be amplified. In these cases would the Polypeptide-encoding nucleotide sequence with the regulatory sequence functioning connected be.

Die Einführung des DNA-Vektors in eine filamentöse Pilzzelle kann einen Prozess involvieren, der aus einer Protoplastenbildung, der Transformation der Protoplasten und der Regeneration der Zellwand in einer per se bekannten Weise besteht. Geeignete Vorgehensweisen zur Transformation von Wirtszellen von Aspergillus werden in EP 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470–1474 beschrieben. Ein geeignetes Verfahren zum Transformieren von Arten von Fusarium wird von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156 oder in WO 96/00787 beschrieben.The introduction of the DNA vector into a filamentous fungal cell may involve a process consisting of protoplast formation, transformation of the protoplasts and regeneration of the cell wall in a manner known per se. Appropriate procedures for the transformation of host cells of Aspergillus are described in US Pat EP 238 023 and Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. A suitable method for transforming species of Fusarium is described by Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 or in WO 96/00787.

Pilzzellenfungal cells

Die mit der Population von DNA-Vektoren zu transformierenden Pilzzellen sind filamentöse Pilzzellen.The with the population of DNA vectors to be transformed fungal cells are filamentous Fungal cells.

„Filamentöse Pilze" schließen alle filamentösen Formen der Untereinteilung Eumycota und Oomycota (wie definiert von Hawksworth et al., 1995, supra) ein. Die filamentösen Pilze sind durch eine myceliale Wand, die aus Chitin, Cellulose, Glucan, Chitosan, Mannan und anderen komplexen Polysacchariden zusammengesetzt gekennzeichnet ist. Vegetatives Wachstum erfolgt durch hyphale Verlängerung (Zellfadenverlängerung) und der Kohlenstoffkatabolismus ist obligatorisch aerob. Im Gegensatz dazu erfolgt das vegetative Wachstum bei Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, durch Knospung eines unizellulären Thallus und der Kohlenstoffkatabolismus kann fermentativ sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzzelle eine Zelle einer der Arten von, jedoch nicht hierauf beschränkt, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Scytalidium, Thielavia, Tolypocladium und Trichoderma."Filamentous fungi" include all filamentous forms of the subdivision Eumycota and Oomycota (as defined by Hawksworth et al., 1995, supra) .The filamentous fungi are characterized by a mycelial wall consisting of chitin, cellulose, glucan, chitosan, mannan and others Vegetative growth occurs by hyphal elongation (cell thread extension) and carbon catabolism is compulsorily aerobic In contrast, vegetative growth in yeasts such as Saccharomyces cerevisiae occurs by budding of a unicellular thallus and carbon catabolism can be fermentative In the preferred embodiment, the filamentous fungal cell is a cell one of the types of, but not limited to, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Scytalidium, Thielavia, Tolypocladium and Trichoderma.

Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden filamentöse Pilzzelle wird normalerweise auf der Basis der interessierenden Polynukleotidsequenz gewählt. Zum Beispiel ist, wenn das interessierende Polynukleotid eine Kontrollsequenz ist, für die die Verwendung in einer Zelle von Aspergillus beabsichtigt ist, ist die filamentöse Pilzzelle normalerweise eine Zelle von Aspergillus. Beispiele von filamentösen Pilzzellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen eine Zelle von Aspergillus, eine Zelle von Acremonium, eine Zelle von Fusarium, eine Zelle von Humicola, eine Zelle von Mucor, eine Zelle von Myceliophthora, eine Zelle von Neurospora, eine Zelle von Penicillium, eine Zelle von Thielavia, eine Zelle von Tolypocladium und eine Zelle von Trichoderma ein.The filamentous fungal cell to be used in the present invention is usually based on the polynucleotide sequence of interest selected. For example, if the polynucleotide of interest is a control sequence is for which is intended to be used in a cell of Aspergillus, is the filamentous Fungal cell usually a cell of Aspergillus. Examples of filamentous Fungal cells for use in the present invention include Cell of Aspergillus, a cell of Acremonium, a cell of Fusarium, a cell of Humicola, a cell of Mucor, a cell of Myceliophthora, a cell of Neurospora, a cell of Penicillium, a cell of Thielavia, a cell of Tolypocladium and a cell from Trichoderma.

Genauer ist die filamentöse Pilzzelle eine Zelle von Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae;
eine Zelle von Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotricioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum oder eine Zelle von Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov); eine Zelle von Humicola insolens oder eine Zelle von Humicola lanuginosa; eine Zelle von Mucor miehei; eine Zelle von Myceliophthora thermophila; eine Zelle von Neurospora crassa; eine Zelle von Penicillium purpurogenum; eine Zelle von Thielavia terrestris; oder eine Zelle von Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder Trichoderma viride.
More specifically, the filamentous fungal cell is a cell of Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger or Aspergillus oryzae;
a cell of Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotricioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum , Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum or a cell of Fusarium venenatum (Nirenberg sp.nov); a cell of Humicola insolens or a cell of Humicola lanuginosa; a cell of Mucor miehei; a cell of Myceliophthora thermophila; a cell of Neurospora crassa; a cell of Penicillium purpurogenum; a cell of Thielavia terrestris; or a cell of Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei or Trichoderma viride.

Selektieren oder Durchmustern der Bank nach interessierenden TransformantenSelect or screening the bank for transformants of interest

Es versteht sich, dass das Verfahren, das für das Durchführen des Selektions- oder Durchmusterungsschrittes c) des Verfahrens der Erfindung zu verwenden ist, abhängig ist von der in Frage stehenden Polynukleotidsequenz. Der Begriff „Selektieren oder Durchmustern" nach einem oder mehreren Transformanten, die ein gewünschtes charakteristisches Merkmal exprimieren", wie in Schritt c) verwendet, ist dazu gedacht, anzuzeigen, dass das Durchmustern oder Selektieren durchgeführt wird, um Transformanten zu identifizieren, welche eine modifizierte interessierende Polynukleotidsequenz enthalten (welche auf der Basis der interessierenden Polynukleotidsequenzen während des Kultivierungsschrittes b) erzeugt wurde, welche die gewünschte Aktivität oder Funktion und optional weitere gewünschte charakteristische Merkmale, wie nachfolgend beispielhaft aufgeführt, besitzt) enthalten.It It is understood that the procedure for performing the Selection or screening step c) of the method of To use invention is dependent is of the polynucleotide sequence in question. The term "Select or screening " one or more transformants having a desired characteristic Expression of the trait ", as used in step c) is intended to indicate that the screening or selecting is done to transformants to identify which is a modified polynucleotide sequence of interest (which are based on the polynucleotide sequences of interest while of the culturing step b) which has the desired activity or function and optionally further desired has characteristic features, as exemplified below) contain.

Daher, wenn die interessierende Polynukleotidsequenz ein Polypeptid mit einer bestimmten Aktivität oder Funktion kodiert, erlaubt es die Selektion lediglich den Transformanten, die ein Polypeptid mit der gewünschten Aktivität oder Funktion exprimieren, zu wachsen. Demnach, wenn die interessierende Polynukleotidsequenz ein Polypeptid mit einer bestimmten Aktivität oder Funktion kodiert, wird das Durchmustern durchgeführt, um Transformanten zu identifizieren, die ein Polypeptid mit der gewünschten Aktivität oder Funktion exprimieren. Zum Beispiel, wenn die interessierende Polynukleotidsequenz ein Enzym kodiert, wie eine Lipase, wird der Selektions- oder Durchmusterungsschritt c) durchgeführt werden, um Transformanten zu identifizieren, die eine Lipaseaktivität exprimieren. Wenn es gewünscht wird, dass die zu identifizierende Lipase ein spezielles charakteristisches Merkmal besitzt, wie eine hohe Thermostabilität, ist die Durchmusterung unter Bedingungen durchzuführen (typischen Temperaturen), bei denen Lipasen mit der gewünschten hohen Thermostabilität identifiziert werden können.Therefore, when the polynucleotide sequence of interest has a polypeptide with a certain activity or Function, the selection allows only the transformants, which is a polypeptide with the desired activity or express function to grow. Accordingly, if the person of interest Polynucleotide sequence is a polypeptide having a particular activity or function the screening is performed to identify transformants, which is a polypeptide with the desired activity or express function. For example, if the interested Polynucleotide sequence encodes an enzyme, such as a lipase, is the Selection or screening step c) are performed, to identify transformants expressing lipase activity. If desired is that the lipase to be identified a special characteristic Feature possesses, like a high thermostability, is the screening under conditions perform (typical temperatures), where lipases with the desired high thermal stability can be identified.

Analog hierzu, wenn die interessierende Polynukleotidsequenz eine Kontrollsequenz, wie eine Promotorsequenz, ist, wird der Selektions- oder Durchmusterungsschritt c) unter Bedingungen durchgeführt, bei denen eine Promotoraktivität festgestellt werden kann. Typischerweise sind die interessierenden Promotorpolynukleotidsequenzen in der Bank mit einer zweiten zu transkribierenden Sequenz (z. B. einer Polypeptid-kodierenden Sequenz) funktionsfähig verknüpft, so dass die Promotoraktivität unter Bezugnahme auf die Transkription der zweiten Sequenz überprüft werden kann.Analogous this, if the polynucleotide sequence of interest has a control sequence, which is a promoter sequence, becomes the selection or screening step c) carried out under conditions where a promoter activity can be determined. Typically, those of interest are Promoter polynucleotide sequences in the bank with a second to transcribing sequence (eg a polypeptide coding sequence) functioning connected, so the promoter activity be checked with reference to the transcription of the second sequence can.

Erstellung einer Bank in Bakterien- oder Hefewirtencreation a bank in bacteria or yeast hosts

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zum Erstellen und Durchmustern oder Selektieren einer Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen in filamentösen Pilzzellen, umfassend:

  • (a) Transformieren einer Kultur von Bakterien- und Hefezellen mit einer Population von DNA-Vektoren, wobei jeder Vektor umfasst:
  • (i) eine Polynukleotidsequenz, die einen Selektionsmarker für filamentöse Pilze, eine Replikationsinitiationssequenz für filamentöse Pilze, einen Selektionsmarker für Bakterien oder Hefen bzw. eine Replikationsinitiationssequenz für Bakterien oder Hefen kodiert, wobei keine von denen innerhalb der Population von DNA-Vektoren wesentlich variiert und
  • (ii) eine interessierende Polynukleotidsequenz, wobei mehr als eine Variante der Polynukleotidsequenz in der Population von DNA-Vektoren enthalten ist;
  • (b) Kultivieren der Bakterien- oder Hefezellen unter Selektionsdruck;
  • (c) Isolieren der DNA-Vektoren aus den Transformanten aus (b);
  • (d) Transformieren von filamentösen Pilzzellen mit den DNA-Vektoren aus (c);
  • (e) Kultivieren der filamentösen Pilzzellen aus (d) unter Selektionsdruck;
  • (f) Selektieren von oder Durchmustern nach einem oder mehreren filamentösen Pilztransformanten, der/die ein gewünschtes charakteristisches Merkmal exprimiert/exprimieren; und
  • (g) Isolieren des/der interessierenden filamentösen Pilztransformanten.
The present invention also relates to methods of constructing and screening or selecting a library of polynucleotide sequences of interest in filamentous fungal cells comprising:
  • (a) transforming a culture of bacterial and yeast cells with a population of DNA vectors where in each vector includes:
  • (i) a polynucleotide sequence encoding a filamentous fungus selection marker, a filamentous fungus replication initiation sequence, a bacteria or yeast selection marker, or a bacteria or yeast replication initiation sequence, none of which varies substantially within the population of DNA vectors and
  • (ii) a polynucleotide sequence of interest, wherein more than one variant of the polynucleotide sequence is included in the population of DNA vectors;
  • (b) culturing the bacterial or yeast cells under selection pressure;
  • (c) isolating the DNA vectors from the transformants of (b);
  • (d) transforming filamentous fungal cells with the DNA vectors of (c);
  • (e) cultivating filamentous fungal cells from (d) under selection pressure;
  • (f) selecting or screening for one or more filamentous fungal transformants expressing a desired characteristic trait; and
  • (g) isolating the filamentous fungal transformant (s) of interest.

Der Vorteil der Verwendung von Hefe oder Bakterien als Zwischenwirte ist es, dass die Transformationshäufigkeit 100- bis 1000-fach höher als für filamentöse Pilzzellen, wie Aspergillus, ist, was in einer größeren Bank resultiert, wenn zuerst die manipulierten und optional ligierten DNA-Vektoren in Hefe oder Bakterien transformiert werden und dann die isolierten supercoiled Vektoren in die filamentöse Pilzzelle transformiert wird.Of the Advantage of using yeast or bacteria as intermediate hosts it is that the transformation frequency is 100 to 1000 times higher than for filamentous fungal cells, like Aspergillus, is what results in a larger bank, though first the manipulated and optionally ligated DNA vectors in Yeast or bacteria are transformed and then isolated supercoiled vectors is transformed into the filamentous fungal cell.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen durch Zufallsmutagenese oder natürlich vorkommende allele Varianten von mindestens einer Eltern-Polynukleotidsequenz, welche eine interessierende biologische Funktion besitzt oder kodiert, wie oben beschrieben, hergestellt.In a preferred embodiment The library of polynucleotide sequences of interest Random mutagenesis or natural occurring allelic variants of at least one parent polynucleotide sequence, which has or encodes a biological function of interest, as described above.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Bakterienzelle ein Stamm von E. coli.In another preferred embodiment the bacterial cell is a strain of E. coli.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Hefezelle ein Stamm von Saccharomyces sp., insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri oder Schizosaccharomyces sp. Weitere Beispiele von geeigneten Hefezellen sind Stämme von Kluyveromyces, wie K. lactis, Hansenula, z. B. H. polymorpha, oder Pichia, z. B. P. pastoris.In another preferred embodiment the yeast cell is a strain of Saccharomyces sp., in particular strains of Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces kluyveri or Schizosaccharomyces sp. Further examples of suitable yeast cells are strains of Kluyveromyces, such as K. lactis, Hansenula, e.g. B. H. polymorpha, or Pichia, z. B. P. pastoris.

Gemäß dem obigen Verfahren enthält der Vektor einen Selektionsmarker, welcher die leichte Selektion von transformierten Bakterien- oder Hefezellen ermöglicht. Beispiele von Selektionsmarkern für Bakterien schließen ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, Marker, die eine Antibiotikaresistenz übertragen, wie eine Ampicillin-, Kanamycin-, Erythromycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz. Weiterhin kann die Selektion durch Co-Transformation erreicht werden, z. B. wie in WO 91/09129 beschrieben, wo der Selektionsmarker auf einem separaten Vektor vorliegt.According to the above Procedure contains the vector a selection marker, which allows easy selection of transformed bacterial or yeast cells allows. Examples of selection markers for bacteria include, but are not limited to this Markers conferring antibiotic resistance, such as an ampicillin, Kanamycin, erythromycin, chloramphenicol or tetracycline resistance. Furthermore, the selection can be achieved by co-transformation, z. As described in WO 91/09129, where the selection marker on a separate vector is present.

Geeignete Marker für Hefewirtszellen sind ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 und URA3.suitable Markers for Yeast host cells are ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 and URA3.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt der Selektionsmarker für Bakterien oder Hefen eine Resistenz gegenüber einem Biozid bereit, wobei das Biozidmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Hygromycin und Methotrexat.In a preferred embodiment represents the selection marker for Bacteria or yeasts are resistant to a biocide, wherein the biocide selected is from the group consisting of ampicillin, kanamycin, tetracycline, Chloramphenicol, neomycin, hygromycin and methotrexate.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Selektionsmarker für Bakterien oder Hefen ausgewählt aus der Gruppe von Genen, die ein Produkt kodieren, welches eine Resistenz gegenüber Biozid- und viraler Toxizität, eine Resistenz gegenüber Schwermetalltoxizität oder Phototrophie oder Auxotrophe bereitstellt.In another preferred embodiment is the selection marker for Selected bacteria or yeasts from the group of genes that encode a product that has a Resistance to Biocidal and viral toxicity, a resistance to Heavy metal toxicity or phototrophy or auxotrophs.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Phototrophie von einem Enzym erhalten, ausgewählt aus der Gruppe von Stoffwechselwegen, bestehend aus Nukleotidsynthese, Cofaktorsynthese, Aminosäuresynthese, Acetamidstoffwechsel, Prolinstoffwechsel, Sulfatstoffwechsel und Nitratstoffwechsel.In another preferred embodiment Phototrophy is obtained from an enzyme selected from the group of metabolic pathways consisting of nucleotide synthesis, Cofactor synthesis, amino acid synthesis, Acetamidstoffwechsel, proline metabolism, sulfate metabolism and Nitrate metabolism.

Für die autonome Replikation kann der Vektor weiterhin einen Replikaktionsstartpunkt umfassen, welcher es dem Vektor ermöglicht, sich autonom in der in Frage stehenden Bakterien- oder Hefezelle zu replizieren. Beispiele von bakteriellen Replikaktionsstartpunkten sind Replikaktionsstartpunkten der Plasmide pBR322, pUC19, pACYC177 und pACYC184, welche die Replikation in E. coli ermöglichen.For the autonomous Replication allows the vector to continue to have a replica start point include, which allows the vector to autonomously in the to replicate in question bacterial or yeast cell. Examples of bacterial replication initiation points are replication initiation points plasmids pBR322, pUC19, pACYC177 and pACYC184, which replicate in E. coli.

Beispiele von Replikaktionsstartpunkten zur Verwendung in einer Hefewirtszelle sind der 2 Micron Replikaktionsstartpunkt, ARS1, ARS4, die Kombination aus ARS1 und CEN3 und die Kombination aus ARS4 und CEN6.Examples of replica initiation points for use in a yeast host cell are the 2 micron replica launch point, ARS1, ARS4, the combination from ARS1 and CEN3 and the combination of ARS4 and CEN6.

Die Transformation der Bakterien- oder Hefezelle kann zum Beispiel durch Verwenden von kompetenten Zellen, durch Elektroporation oder durch Konjugation von Bakterienzellen bewirkt werden (siehe z. B. J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York). Die Kultivierung dieser Zellen unter Selektionsdruck kann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren durchgeführt werden.The Transformation of the bacterial or yeast cell can for example by Use of competent cells, by electroporation or by Conjugation of bacterial cells (see, e.g., J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York). The cultivation these cells under selection pressure may be known in the art Procedure performed become.

Der Selektionsmarker für filamentöse Pilze, die Replikationsinitiationssequenz für Pilze und die interessierende Polynukleotidsequenz ist vorzugsweise eine, wie hierin z.B. in den Abschnitten, die mit „Selektionsmarker für filamentöse Pilze" und „Replikaktionsinitiationssequenzen" beschrieben, bezeichnete.Of the Selection marker for filamentous Fungi, the replication initiation sequence for fungi and those of interest Polynucleotide sequence is preferably one, as described herein e.g. in the Sections marked with "selection marker for filamentous fungi "and" replicating initiation sequences ".

Die Selektion von oder das Durchmustern nach interessierenden Transformanten kann, wie oben in dem mit „Selektion und Durchmustern von Transformanten" bezeichneten Abschnitt, durchgeführt werden.The Selection of or screening for transformants of interest can, as in the above with the "selection and Screening Transformants "section.

Interessierende Polynukleotidsequenzeninterest polynucleotide sequences

Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung für das Durchmustern oder Selektieren von Banken von jeder beliebigen Art von interessierender Polynukleotidsequenz verwendbar ist.It It will be understood that the present invention is for screening or selection of libraries of any type of polynucleotide sequence of interest is usable.

Genauer können die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendenden interessierenden Polynukleotidsequenzen von einer Eltern-Polynukleotidsequenz erzeugt werden, welche eine interessierende biologische Aktivität oder Funktion besitzt oder kodiert. Zum Beispiel werden die interessierenden Polynukleotidsequenzen von einem Gen, welches ein interessierendes Polypeptid kodiert, durch Zufallsmutagenes des Gens, erzeugt. Alternativ ist die interessierende Polynukleotidsequenz eine Kontrollsequenz, wie oben definiert, zum Beispiel eine Promotorsequenz. Ebenfalls können die interessierenden Polynukleotidsequenzen von verschiedenen Herkünften abgeleitet werden, wie von verschiedenen natürlich vorkommenden Herkünften, wie Mikroorganismen, wie weiter oben beschrieben. Die interessierende Polynukleotidsequenz kann eine Kombination aus einer Polypeptid-kodierenden Sequenz und einer Kontrollsequenz sein.More accurate can those to be used in the processes of the present invention polynucleotide sequences of interest from a parent polynucleotide sequence which is a biological activity or function of interest owns or encodes. For example, the polynucleotide sequences of interest become from a gene encoding a polypeptide of interest, by random mutagenesis of the gene. Alternatively, the one of interest Polynucleotide sequence, a control sequence as defined above, for Example, a promoter sequence. Also, the polynucleotide sequences of interest may be of different origins derived from different naturally occurring origins, such as Microorganisms, as described above. The interesting one Polynucleotide sequence may be a combination of a polypeptide-encoding Sequence and a control sequence.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Modifikation einer Eltern-Polynukleotidsequenz durch die Verwendung eines physikalisch oder chemisch mutagenisierenden Mittels, die Verwendung eines gedopten („doped") Oligonukleotids, DNA-Schuffling oder indem die Nukleotidsequenz einer PCR-erzeugten Mutagenese unterzogen wird, oder durch die Verwendung einer beliebigen Kombination davon.In a preferred embodiment the modification of a parent polynucleotide sequence occurs through use a physically or chemically mutagenizing agent which Use of a doped oligonucleotide, DNA shuffling or by the nucleotide sequence of a PCR-generated mutagenesis or by using any combination from that.

Alternativ können die interessierenden Polynukleotidsequenzen erhalten werden, indem die Sequenz einer Mutagenese durch den Fehleinbau von Nukleotidbasen unter Verwendung einer Fehler-auslösenden („error-prone") Polymerase oder einer Polymerase, die unter suboptimalen Bedingungen arbeitet, um die Bildung von Fehlern zu fördern, d. h. einer Fehler-auslösenden PCR, unterworfen wird. Eine Fehler-auslösende DNA-Synthese kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden, wie durch die Verwendung von verschiedenartigen Mutator-Stämmen.alternative can the polynucleotide sequences of interest are obtained by the sequence of mutagenesis due to the misincorporation of nucleotide bases using an error-prone polymerase or a polymerase that works under suboptimal conditions to to promote the formation of errors, d. H. an error-triggering one PCR, is subjected. An error-inducing DNA synthesis can be found in performed in vitro or in vivo as by the use of various mutator strains.

Zufallsmutageneserandom mutagenesis

Ein allgemeiner Ansatz, um Varianten-Polynukleotidsequenzen zu erzeugen, die modifizierte Proteine und Enzyme kodieren, ist auf der Zufallsmutagenese basiert worden, zum Beispiel wie in US 4,894,331 und WO 93/01285 offenbart. Dieser Ansatz kann ebenfalls in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann die Zufallsmutagenese durch die Verwendung eines geeigneten physikalisch oder chemisch mutagenisierenden Mittels, durch die Verwendung eines geeigneten Oligonukleotids oder indem die Polynukleotidsequenz einer PCR-erzeugten Mutagenese unterzogen wird, durchgeführt werden. Weiterhin kann die Zufallsmutagenese durch Verwendung einer beliebigen Kombination dieser mutagenisierenden Mittel durchgeführt werden. Das mutagenisierende Mittel kann beispielsweise eines sein, welches Transitionen, Transversionen, Inversionen, Scrambling, Deletionen und/oder Insertionen induziert.A general approach to generate variant polynucleotide sequences encoding modified proteins and enzymes has been based on random mutagenesis, for example as in US 4,894,331 and WO 93/01285. This approach can also be used in conjunction with the present invention. For example, random mutagenesis may be performed by the use of a suitable physically or chemically mutagenizing agent, by the use of a suitable oligonucleotide, or by subjecting the polynucleotide sequence to PCR-generated mutagenesis. Furthermore, random mutagenesis can be performed by using any combination of these mutagenizing agents. The mutagenizing agent may be, for example, one that induces transitions, transversions, inversions, scrambling, deletions and / or insertions.

Beispiele eines physikalisch oder chemisch mutagenisierenden Mittels, das für den vorliegenden Zweck geeignet ist, schließt ultraviolette (UV) Bestrahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, salpetrige Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotidanaloga. Wenn solche Mittel verwendet werden, wird die Mutagenese typischerweise durchgeführt, indem die interessierende Polynukleotidsequenz in Gegenwart des gewählten mutagenisierenden Mittels unter für das Auftreten der Mutagenese geeigneten Bedingungen inkubiert wird.Examples of a physically or chemically mutagenizing agent suitable for the present purpose include ultraviolet (UV) irradiation, hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), O-methylhydroxylamine, nitrous acid, ethylmethanesulfonate ( EMS), sodium bisulfite, formic acid and nucleotide analogs. When such agents are used, mutagenesis is typically carried out results by incubating the polynucleotide sequence of interest in the presence of the chosen mutagenizing agent under conditions suitable for the occurrence of mutagenesis.

Wenn die Mutagenese unter Verwendung eines Oligonukleotids durchgeführt wird, kann das Oligonukleotid während der Synthese des Oligonukleotids, an Positionen, die zu verändern sind, gedopt sein oder mit drei Nicht-Eltern-Nukleotiden gespickt („spiked") sein. Das Dopen oder Spicken („doping or spiking") kann erfolgen, damit ungewollte Aminosäuren vermieden werden. Das gedopte oder gespickte Oligonukleotid kann in das interessierende Polynukleotid durch jede beliebige veröffentlichte Technik eingebaut werden, beispielsweise unter Verwenden von PCR, LCR oder jeder beliebigen DNA-Polymerase und -Ligase, die geeignet erscheint.If the mutagenesis is carried out using an oligonucleotide, can the oligonucleotide during the synthesis of the oligonucleotide, at positions to be changed, be doped or spiked with three non-parent nucleotides or spiking ("doping or spiking ") done so that unwanted amino acids are avoided. The doped or spiked oligonucleotide may be present in the interest Polynucleotide incorporated by any published technique using, for example, PCR, LCR or any DNA polymerase and ligase that appears appropriate.

Vorzugsweise wird das Dopen unter Verwenden von „konstantem Zufallsdopen" („constant random doping") durchgeführt, wobei der Prozentsatz von Wildtyp und Mutation an jeder Position vorbestimmt wird. Weiterhin kann das Dopen in Richtung auf eine Referenz für die Einführung von bestimmten Nukleotiden und dadurch einer Präferenz für die Einführung von einem oder mehreren spezifischen Aminosäureresten gelenkt werden. Das Dopen kann so vorgenommen werden, dass es beispielsweise die Einführung von 90 % Wildtyp und 10 % Mutationen an jeder Position ermöglicht. Eine weitere Erwägung bei der Wahl eines Doping-Schemas basiert sowohl auf genetischen als auch auf Protein-strukturellen Einschränkungen. Das Doping-Schema kann unter Verwenden des DOPE-Programms erfolgen (siehe Tomandl, D., et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11: 29–38; Jensen, L J, Andersen, K V, Svendsen, A., und Kretzschmar, T., 1998. Nucleic Acids Research 26: 697–702), welches unter anderem sicherstellt, dass die Einführung von Stopcodons vermieden wird.Preferably Doping is done using "constant random-dope" ("constant random doping ") carried out, the percentage of wildtype and mutation at each position is predetermined. Furthermore, the Dopen can move towards one Reference for the introduction of certain nucleotides and thereby a preference for the introduction of one or more specific amino acid residues be steered. The Dopen can be made such that, for example the introduction of 90% wild type and 10% mutations at each position. Another consideration when choosing a doping scheme is based on both genetic and protein structural Restrictions. The doping scheme can be done using the DOPE program (See Tomandl, D., et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11: 29-38; Jensen, LJ, Andersen, K.V., Svendsen, A., and Kretzschmar, T., 1998. Nucleic Acids Research 26: 697-702), which, among other things, ensures that the introduction of Stop codons is avoided.

Wenn die PCR-erzeugte Mutagenese verwendet wird, wird entweder eine chemisch behandelte oder eine nicht behandelte interessierende Eltern-Polynukleotidsequenz einer PCR unterworfen, unter Bedingungen, die den Fehleinbau von Nukleotiden erhöhen (Deshler, J.O., 1992. Genetic Analysis, Techniques and Applications 9: 103–106; Leung, et al., 1989. Technique 1: 11–15).If the PCR-generated mutagenesis is used, either a chemical treated or untreated interest parent polynucleotide sequence subjected to a PCR under conditions that prevent the misincorporation of Increase nucleotides (Deshler, J.O., 1992. Genetic Analysis, Techniques and Applications 9: 103-106; Leung, et al., 1989. Technique 1: 11-15).

Ein Mutor-Stamm von E. coli (Fowler, et al., 1974. Molec. Gen. Genet. 133: 179–191), S. cereviseae oder jedem beliebigen anderen mikrobiellen Organismus kann für die Zufallsmutagenese der interessierenden Eltern-Polynukleotidsequenz verwendet werden, indem beispielsweise ein Plasmid, welches die Eltern-Polynukleotidsequenz enthält, in den Mutator-Stamm transformiert wird, wachsen lassen des Mutator-Stammes mit dem Plasmid wachsen gelassen wird und das mutierte Plasmid aus dem Mutator-Stamm isoliert wird. Das mutierte Plasmid kann nachfolgend in den Expressionsorganismus transformiert werden.One Mutor strain of E. coli (Fowler, et al., 1974. Molec. Gen. Genet. 133: 179-191), S. cereviseae or any other microbial organism can for the random mutagenesis of the parent polynucleotide sequence of interest can be used by, for example, a plasmid containing the Contains parent polynucleotide sequence, into the mutator strain, grow the mutator strain with the plasmid is grown and the mutant plasmid isolated from the mutator strain. The mutated plasmid can be mentioned below be transformed into the expression organism.

Die zu mutagenisierende Polynukleotidsequenz kann geeigneterweise in einer genomischen oder cDNA-Bank vorhanden sein, die von einem Organismus hergestellt wird, der die Sequenz beherbergt. Alternativ kann die Sequenz auf einem geeigneten Vektor vorhanden sein, wie einem Plasmid oder einem Bakteriophagen, der als solcher mit dem mutagenisierenden Mittel inkubiert werden kann oder auf andere Weise dem mutagenisierenden Mittel ausgesetzt werden kann. Die zu mutagenisierende Polynukleotidsequenz kann in isolierter Form vorliegen. Es versteht sich, dass die einer Zufallsmutagenese zu unterwerfende Polynukleotidsequenz vorzugsweise eine cDNA- oder genomische DNA-Sequenz ist. Die mutierte DNA-Sequenz kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die Funktionen kodiert, welche die Expression der mutierten DNA-Sequenz erlauben.The The polynucleotide sequence to be mutagenized may suitably be described in U.S. Pat a genomic or cDNA library to be present from an organism which harbors the sequence. Alternatively, the Sequence on a suitable vector, such as a plasmid or a bacteriophage as such with the mutagenizing Medium can be incubated or otherwise the mutagenizing Funds can be suspended. The polynucleotide sequence to be mutagenized may be in isolated form. It is understood that the one Random mutagenesis to be subjected polynucleotide sequence preferably a cDNA or genomic DNA sequence. The mutated DNA sequence can continue a DNA sequence which encodes functions that express the mutant Allow DNA sequence.

DNA-ShufflingDNA shuffling

Alternative Verfahren zur schnellen Herstellung von Varianten einer interessierenden Polynukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Verfahren des in vivo oder in vitro DNA-Shufflings ein, wobei DNA-Shuffling als eine Rekombination, entweder in vivo oder in vitro, von Nukleotidsequenzfragment(en) zwischen zwei oder mehreren homologen Polynukleotiden definiert wird, was in einer Ausbeute (Output) an Polynukleotiden (d. h. Polynukleotiden, die dem Shuffling-Zyklus unterworfen worden sind), die eine Zahl ausgetauschter Nukleotidfragmente enthalten, im Vergleich zu den eingesetzten (Input) Polynukleotiden (d. h. den Polynukleotiden, die dem Shuffling unterworfen worden sind) resultiert. Das Shuffling kann erzielt werden, entweder in vitro oder in vivo, durch Rekombination innerhalb einer Zelle anhand von im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, von denen Beispiele nachfolgend aufgelistet werden.alternative Method for the rapid production of variants of a subject of interest Polynucleotide sequence according to the present invention Close invention A method of in vivo or in vitro DNA shuffling, wherein DNA shuffling as a recombination, either in vivo or in vitro, of nucleotide sequence fragment (s) which defines two or more homologous polynucleotides in an output of polynucleotides (i.e., polynucleotides, which have been subjected to the shuffling cycle) which is a number exchanged nucleotide fragments, compared to the (input) polynucleotides (i.e., the polynucleotides, which have been subjected to the shuffling) results. The shuffling can be achieved, either in vitro or in vivo, by recombination within a cell by means of those described in the prior art Procedures, examples of which are listed below.

Zum Beispiel beschreiben H. Weber und Weissmann, C. (1983. Nucleic Acids Research 11: 5661–5669) ein Verfahren zum Modifizieren von Genen durch eine in vivo Rekombination zwischen zwei homologen Genen, in welchem die Rekombinanten unter Verwenden eines Resistenzmarkers identifiziert und isoliert werden.For example, H. Weber and Weissmann, C. (1983. Nucleic Acids Research 11: 5661-5669) describe a method of modifying genes by in vivo recombination between two homologous genes in which the recombinants are identified using a resistance marker and be isolated.

Pompon et al., (1989, Gene 83: 15–24) beschreiben ein Verfahren zum Shuffling von Gendomänen des Cytochrom P-450 aus Säugetier durch in vivo Rekombination von teilweisen homologen Sequenzen in Saccaromyces cerevisiae durch Transformieren von Saccaromyces cerevisiae mit einem linearisierten Plasmid mit aufgefüllten Enden und einem DNA-Fragment, das teilweise homolog zu den Enden des Plasmids ist.bobble et al., (1989, Gene 83: 15-24) describe a method for shuffling gene domains of the Cytochrome P-450 from mammal by in vivo recombination of partial homologous sequences in Saccaromyces cerevisiae by transforming Saccaromyces cerevisiae with a linearized plasmid with filled-in ends and a DNA fragment, which is partially homologous to the ends of the plasmid.

In WO 97/07205 wird ein Verfahren beschrieben, in welchem Polypeptidvarianten durch Shuffling von verschiedenen Nukleotidsequenzen von homologen DNA-Sequenzen durch eine in vivo Rekombination unter Verwenden von Plasmid-DNA als Template hergestellt werden.In WO 97/07205 describes a method in which polypeptide variants by shuffling different nucleotide sequences from homologs DNA sequences by in vivo recombination using Plasmid DNA can be produced as a template.

US Patent Nr. 5,093,257 (Genencor International, Inc.) offenbart ein Verfahren zum Herstellen von Hybrid-Polypeptiden durch in vivo Rekombination.US U.S. Patent No. 5,093,257 (Genencor International, Inc.) discloses A method for producing hybrid polypeptides by in vivo recombination.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die interessierenden Varianten-Polynukleotidsequenzen durch eine in vivo Rekombination zwischen zwei oder mehreren homologen interessierenden Nukleinsäuresequenzen erhalten, umfassend:

  • (a) Identifizieren von mindestens einer konservierten Region zwischen den interessierenden Polynukleotidsequenzen;
  • (b) Erzeugen von Fragmenten von jeder der interessierenden Polynukleotidsequenzen, wobei die Fragmente die konservierte(n) Region(en) aus (a) umfassen; und
  • (c) Rekombinieren der Fragmente aus (b) unter Verwenden der konservierten Region(en) als (a) homologe(n) Verknüpfungspunkt(e).
In a preferred embodiment, the variant polynucleotide sequences of interest are obtained by in vivo recombination between two or more homologous nucleic acid sequences of interest, comprising:
  • (a) identifying at least one conserved region between the polynucleotide sequences of interest;
  • (b) generating fragments of each of the polynucleotide sequences of interest, wherein the fragments comprise the conserved region (s) of (a); and
  • (c) recombining the fragments of (b) using the conserved region (s) as (a) homologous attachment point (s).

Bevorzugt kodieren die interessierenden Polynukleotidsequenzen ein Polypeptid oder einen Teil davon oder sind Kontrollsequenzen, wie oben definiert, oder eine beliebige Kombination aus beiden.Prefers the polynucleotide sequences of interest encode a polypeptide or a part thereof or are control sequences as defined above, or any combination of both.

Der Begriff „konservierte Region" zeigt eine Untersequenz an, bevorzugt von mindestens 10 Bp, die zwei oder mehreren Sequenzen gemeinsam ist, wobei ein Identitätsgrad zwischen den Untersequenzen von mindestens ungefähr 50 %, stärker bevorzugt mindestens ungefähr 60 %, noch stärker bevorzugt mindestens ungefähr 70 %, noch stärker bevorzugt mindestens ungefähr 80%, noch stärker bevorzugt mindestens ungefähr 90 % und am stärksten bevorzugt mindestens ungefähr 97 %, besteht.Of the Term "conserved Region "shows one Subsequence, preferably of at least 10 bp, the two or more Sequences is common, with a degree of identity between the subsequences of at least about 50%, stronger preferably at least about 60%, even stronger preferably at least about 70%, even stronger preferably at least about 80%, even stronger preferably at least about 90% and strongest preferably at least about 97% exists.

Damit die konservierte Region als ein „Verknüpfungspunkt" zwischen zwei Sequenzen zu verwenden ist, ist der Identitätsgrad zwischen den Sequenzen innerhalb der konservierten Region(en) ausreichend hoch, um eine Hybridisierung, z.B. unter den supra beschriebenen Bedingungen, zwischen den Sequenzen zu ermöglichen, wobei die konservierte Region als Verknüpfungspunkt dient.In order to the conserved region is to be used as a "point of attachment" between two sequences, is the degree of identity between sequences within the conserved region (s) high to allow hybridization, e.g. under the conditions described supra, to allow between the sequences wherein the conserved region serves as a point of attachment.

Ein Verfahren zum Shuffling von homologen DNA-Sequenzen in vitro ist von Stemmer (Stemmer, 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10747–10751; Stemmer, 1994. Nature 370: 389–391; Crameri, A., et al., 1997. Nature Biotechnology 15:436–438) beschrieben worden. Das Verfahren betrifft das Shuffling von homologen DNA-Sequenzen unter Verwenden von in vitro PCR-Techniken. Positiv rekombinante Gene, die „shuffled" DNA-Sequenzen enthalten, werden aus einer DNA-Bank auf Basis der verbesserten Funktion der exprimierten Proteine selektiert.One A method for shuffling homologous DNA sequences in vitro Stemmer (Stemmer, 1994. Proc Natl Acad Sci. USA, 91: 10747-10751; Stemmer, 1994. Nature 370: 389-391; Crameri, A., et al., 1997. Nature Biotechnology 15: 436-438) Service. The method relates to the shuffling of homologous DNA sequences using in vitro PCR techniques. Positive recombinant Genes that contain "shuffled" DNA sequences be from a DNA bank based on the improved function of selected proteins selected.

Das oben genannte Verfahren wird ebenfalls in WO 95/22625 beschrieben in Bezug auf ein Verfahren zum Shuffling von homologen DNA-Sequenzen. Ein wichtiger Schritt in dem Verfahren ist es, die homologen doppelsträngigen Polynukleotid-Template in zufällige Fragmente einer gewünschten Größe zu spalten, gefolgt von dem homologen Wiederzusammenbau der Fragmente zu Volllängen-Genen.The The above method is also described in WO 95/22625 with respect to a method for shuffling homologous DNA sequences. An important step in the process is the homologous double-stranded polynucleotide template in random Fragments of a desired Size to split, followed by homologous reassembly of the fragments into full-length genes.

WO 98/41653 offenbart ein Verfahren des DNA-Shufflings, in welchem eine Bank von rekombinierten homologen Polynukleotiden aus einer Anzahl von verschiedenen eingesetzten (Input) DNA-Templates und Primern durch induzierte Template-Shifts während der in vitro DNA-Synthese erstellt wird.WHERE 98/41653 discloses a method of DNA shuffling in which a bank of recombined homologous polynucleotides from one Number of different (input) DNA templates used and Primers induced by template shifts during in vitro DNA synthesis is created.

Lokalisierte Zufallsmutageneselocalized random mutagenesis

Die Zufallsmutagenese kann vorteilhafterweise auf einen Teil einer in Frage stehenden Eltern-Polynukleotidsequenz lokalisiert werden. Die zu modifizierende Sequenz kann beispielsweise die kodierende Region eines Gens oder eines Teils davon, der essentiell für die Aktivität des Genprodukts ist, sein oder eine Kontrollsequenz oder ein Teil davon, wie oben definiert. Ein bevorzugtes Beispiel einer solchen Kontrollsequenz ist eine Promotorsequenz oder ein funktioneller Teil davon, d.h. ein Teil, der ausreichend ist, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu bewirken.The random mutagenesis may be advantageously localized to a portion of a parent polynucleotide sequence in question. The sequence to be modified may be, for example, the coding region of a gene or part thereof that is essential for the activity of the gene product, or a control sequence or part thereof, as defined above. A preferred example of such a control sequence is a promoter sequence or a functional portion thereof, ie, a portion sufficient to effect expression of the nucleic acid sequence.

Lokalisierte Zufallsmutagenese kann z.B. vorteilhaft sein, wenn bestimmte Regionen der interessierenden Polynukleotidsequenz dahingehend identifiziert worden sind, dass sie besondere Bedeutung haben. Zum Beispiel kann, wenn die interessierende Polynukleotidsequenz ein Polypeptid kodiert, die bedeutende Region eine sein, die essentiell für eine gegebene Eigenschaft des Polypeptids ist, wobei von der Modifikation dieser Region erwartet wird, dass sie in einer Variante resultiert, bei der diese Eigenschaft verbessert worden ist. Solche Regionen können normalerweise identifiziert werden, wenn die Tertiärstruktur des Eltern-Polypeptids aufgeklärt worden ist und mit seinen Funktionen in Beziehung gesetzt worden ist. Auf analoge Weise, wenn die interessierende Polynukleotidsequenz eine Kontrollsequenz ist, wie ein Promotor, kann die interessierende Region eine sein, von der erwartet wird, dass sie essentiell für oder involviert in die Promotoraktivität ist.localized Random mutagenesis may e.g. be beneficial if certain regions of the polynucleotide sequence of interest have been that they have special meaning. For example, when the polynucleotide sequence of interest encodes a polypeptide, the significant region being one that is essential for a given Property of the polypeptide, wherein the modification of this Region is expected to result in a variant at this property has been upgraded. Such regions can normally be identified if the tertiary structure of the parent polypeptide enlightened has been and has been related to its functions is. In an analogous manner, if the polynucleotide sequence of interest a control sequence, such as a promoter, may be the one of interest Be a region that is expected to be essential for or involved in the promoter activity.

Die lokalisierte oder Region-spezifische Zufallsmutagenese wird zweckmäßigerweise unter Verwenden von PCR-erzeugten Mutagenese-Techniken, wie oben beschrieben, oder jeder beliebigen anderen geeigneten im Stand der Technik bekannten Technik durchgeführt. Alternativ kann die Nukleotidsequenz, welche den Teil der zu modifizierenden Polynukleotidsequenz kodiert, isoliert werden, z.B. durch Insertion in einen geeigneten Vektor, und der Teil kann nachfolgend einer Mutagenese unterworfen werden unter Verwendung von jedem beliebigen der oben diskutierten Mutageneseverfahren.The localized or region-specific random mutagenesis conveniently using PCR-generated mutagenesis techniques as above described, or any other suitable in the state of Technology known technique performed. Alternatively, the nucleotide sequence, which encodes the part of the polynucleotide sequence to be modified, isolated, e.g. by insertion into a suitable vector, and the part may subsequently be subjected to mutagenesis using any of the mutagenesis methods discussed above.

Verwendung einer Replikationsinitiationssequenz für Pilzeuse a replication initiation sequence for fungi

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Replikationsinitiationssequenz für Pilze, wie hierin definiert, für das Erstellen und Selektieren oder Durchmustern einer Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen in filamentösen Pilzzellen. Bevorzugt wird die Bank durch das Verfahren gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung erstellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Replikationsinitiationssequenz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

  • (a) einer Replikationsinitiationssequenz, welche mindestens 50% Identität mit der Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 besitzt, und welche in der Lage ist, die Replikation zu initiieren;
  • (b) einer Replikationsinitiationssequenz, welche unter niedrigen Stringenzbedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 oder (ii) den jeweils komplementären Strängen hybridisiert, wobei die niedrigen Stringenzbedingungen durch Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42 °C in 5 × SSPE, 0,3 % SDS, 200 mg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA und 25 % Formamid definiert sind, und Waschbedingungen bei 50 °C für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,2 % SDS definiert sind; und
  • (c) einer Untersequenz von (a) oder (b), wobei die Untersequenz Replikationsinitiationsaktivität besitzt.
In another aspect, the invention relates to the use of a replication initiation sequence for fungi, as defined herein, for constructing and selecting or screening a library of polynucleotide sequences of interest in filamentous fungal cells. Preferably, the bank is created by the method according to the first or second aspect of the invention. In a preferred embodiment, the replication initiation sequence is selected from the group consisting of:
  • (a) a replication initiation sequence which has at least 50% identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and which is capable of initiating replication;
  • (b) a replication initiation sequence which under low stringency conditions hybridizes with (i) the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or (ii) the respective complementary strands, the low stringency conditions being determined by prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 mg / ml sheared and denatured salmon sperm DNA and 25% formamide, and wash conditions at 50 ° C for 30 minutes are defined in 2x SSC, 0.2% SDS; and
  • (c) a subsequence of (a) or (b), wherein the subsequence has replication initiation activity.

Bevorzugt wird die Replikationsinitiationssequenz von einer filamentösen Pilzzelle erhalten, insbesondere von einem Stamm von Aspergillus, wie A. nidulans. In der stärksten bevorzugten Ausführungsform besitzt die Replikationsinitiationssequenz die in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 dargestellte Nukleinsäuresequenz oder ist eine jeweils funktionelle Untersequenz davon. Die gemäß diesem Aspekt zu verwendende Replikationsinitiationssequenz kann, wie in dem obigen Abschnitt, der mit „Replikationsinitiationssequenzen" bezeichnet ist, sein.Prefers becomes the replication initiation sequence of a filamentous fungal cell especially from a strain of Aspergillus such as A. nidulans. In the strongest preferred embodiment the replication initiation sequence has the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 shown nucleic acid sequence or is one each functional subsequence thereof. The to be used according to this aspect Replication initiation sequence may, as in the above section, labeled "replication initiation sequences", be.

Bank von interessierenden PolynukleotidsequenzenBank of interest polynucleotide sequences

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen, welche Bank filamentöse Pilzzellen umfasst, die mit einer Population von DNA-Vektoren transformiert sind, wobei jeder Vektor umfasst:

  • (i) ein Gen, das einen Selektionsmarker für Pilze und eine Replikationsinitiationssequenz für Pilze kodiert, wobei der Marker und die Replikationsinitiationssequenz innerhalb der Population nicht variieren; und
  • (ii) eine interessierende Polynukleotidsequenz, wobei die Population von DNA-Vektoren mehr als eine Variante der Polynukleotidsequenz enthält.
In another aspect, the invention features a library of polynucleotide sequences of interest, which library comprises filamentous fungal cells transformed with a population of DNA vectors, each vector comprising:
  • (i) a gene encoding a fungal selection marker and a fungal replication initiation sequence, wherein the marker and the replication initiation sequence do not vary within the population; and
  • (ii) a polynucleotide sequence of interest, wherein the population of DNA vectors contains more than one variant of the polynucleotide sequence.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor ferner eine Nukleinsäuresequenz, die einen Selektionsmarker für Bakterien oder Hefe und eine Replikationsinitiationssequenz für Bakterien oder Hefe kodiert. Bevorzugt wird die Bank durch das Verfahren gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung hergestellt. Bevorzugt sind die Elemente der Bank, wie der DNA-Vektor und dessen erwähnte Bestandteile, wie hierin beschrieben.In a preferred embodiment The vector further comprises a nucleic acid sequence encoding a selection marker for bacteria or yeast and a replication initiation sequence for bacteria or yeast encoded. Preferably, the bank is by the method according to the first or second aspect of the invention. Preferred are the Elements of the bank, such as the DNA vector and its constituents, as described herein.

Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele beschrieben, welche nicht dazu ausgelegt werden sollten, den Gegenstand (Schutzbereich) der Erfindung zu beschränken.The The present invention is further illustrated by the following examples described which should not be construed to be the subject matter (Protection) of the invention.

BeispieleExamples

Materialienmaterials

Die Chemikalien, die als Puffer und Substrate verwendet werden, sind kommerzielle Produkte mit mindestens Reinheitsgrad.The Chemicals that are used as buffers and substrates are commercial products with at least purity.

Plasmideplasmids

  • pMT1505: konstruiert, wie in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenpMT1505: constructed as in the example below 1 described
  • pHelp1: enthält das pyr-Gen von A. oryzae als Selektionsmarker und die AMA1-Sequenz, welche die autonome Replikation in A. nidulans ermöglicht, wie von Gems, D., et al. (1991. Gene 98: 61–67) beschriebenpHelp1: contains the A. oryzae pyr gene as a selection marker and the AMA1 sequence containing the autonomous replication in A. nidulans, as described by Gems, D., et al. (1991. Gene 98: 61-67) described
  • pToC68: wie beschrieben in EP 0 531 372 (Novo Nordisk A/S)pToC68: as described in EP 0 531 372 (Novo Nordisk A / S)
  • pAHL: wie beschrieben in WO 92/05249, enthaltend eine Lipase-kodierende SequenzPAHL: as described in WO 92/05249, containing a lipase-encoding sequence
  • pSO2: wie beschrieben in WO 96/29391, enthaltend das pyr-Gen von Aspergillus oryzaepSO2: as described in WO 96/29391, containing the pyr gene of Aspergillus oryzae
  • pENI1127: konstruiert, wie in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenpENI1127: constructed as described in Example 1 below
  • pENI1245: konstruiert, wie in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenpENI1245: constructed as described in Example 1 below
  • pENI1246: konstruiert, wie in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenpENI1246: constructed as described in Example 1 below
  • pENI1298: konstruiert, wie in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenpENI1298: constructed as described in Example 1 below
  • pENI1299: konstruiert, wie in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenpENI1299: constructed as described in Example 1 below

Stämmestrains

  • JaL250: ein Derivat von A1560 von Aspergillus oryzae, in welchem das pyr-Gen inaktiviert worden ist, wie in WO 98/01470 beschriebenJaL250: a derivative of A1560 from Aspergillus oryzae, in in which the pyr gene has been inactivated, as described in WO 98/01470
  • DH5a: eine Wirtszelle von E. coli, bezogen von GIBCO BRL (Life Technologies, Inc., Rockville MD)DH5a: a host cell of E. coli purchased from GIBCO BRL (Life Technologies, Inc., Rockville MD)
  • DLM 15: ein Derivat von Fusarium venenatum, wie in dem nachfolgenden Beispiel 5 beschrieben.DLM 15: a derivative of Fusarium venenatum, as in the following Example 5 described.

Beispiel 1: Konstruktion von pENI1298 und pENI1299Example 1: Construction from pENI1298 and pENI1299

pMT1466 wurde konstruiert, indem ein SphI/NarI-Fragment von pHelp1 in pToC68 eingefügt wurde. pMT1489 wurde konstruiert, indem pMT1466 mit SphI und StuI verdaut wurde und dann wieder ligiert wurde. pMT1500 wurde konstruiert, indem pMT1489 mit AatII und NarI verdaut wurde und mit einem Linker ligiert wurde. pMT1504 wurde konstruiert, in dem pMT1500 mit NheI verdaut wurde und wieder ligiert wurde. pMT1505 wurde konstruiert, in dem ein XbaI-Fragment von 2,7 kB, welches das amdS-kodierende Gen von A. nidulans genomischer DNA enthält (Corrick, C. M., et al. 1987, Gene 53: 63–71), in pMT1504, das mit NheI geschnitten worden war, eingefügt wurde. pENI1127 wurde konstruiert aus pMT1505, welches mit SalI verdaut worden war, um eines der AMA1-Repeats (AMA1-Wiederholungen) und die zentrale Spacerregion zu entfernen.pMT1466 was constructed by adding a SphI / NarI fragment from pHelp1 to pToC68 added has been. pMT1489 was constructed by pMT1466 with SphI and StuI was digested and then ligated again. pMT1500 was designed pMT1489 was digested with AatII and NarI and with a linker was ligated. pMT1504 was constructed in which pMT1500 with NheI was digested and ligated again. pMT1505 was constructed in which a 2.7 kb XbaI fragment containing the amdS coding Gen of A. nidulans genomic DNA (Corrick, C.M., et al. 1987, Gene 53: 63-71), in pMT1504 cut with NheI. pENI1127 was constructed from pMT1505 which digests with SalI had been to one of the AMA1 repeats (AMA1 repeats) and the central spacer region to remove.

pENI1127 und pMT1505 wurden jeweils mit HindIII geschnitten, welches in Fragmenten von 2408 Bp bzw. 5253 Bp resultierte, welche aus einem 1 %igen Agarosegel aufgereinigt wurden und in die HindIII-Stelle in dem Vektor pAHL kloniert wurden, welcher eine Lipase-kodierende Sequenz enthält. Die resultierenden Plasmide wurden pENI1245 bzw. pENI1246 genannt.pENI1127 and pMT1505 were each cut with HindIII, which was in fragments of 2408 bp and 5253 bp, respectively, resulting from a 1% agarose gel and into the HindIII site in the vector pAHL were cloned, which contains a lipase-coding sequence. The resulting plasmids were called pENI1245 and pENI1246, respectively.

Ein StuI/BbuI-Fragment von 3527 Bp, welches das pyr-Gen enthält, wurde aus pSO2 ausgeschnitten und in eine StuI/BbuI-Stelle von sowohl pENI1245 als auch pENI1246 eingefügt. Die resultierenden Plasmide wurden pENI1298 bzw. pENI1299 genannt. Die Restriktionskarte für pENI1298 wird in 1 und für pENI1299 in 2 gezeigt.A StuI / BbuI fragment of 3527 bp containing the pyr gene was excised from pSO2 and inserted into a StuI / BbuI site of both pENI1245 and pENI1246. The resulting plasmids were named pENI1298 and pENI1299, respectively. The restriction map for pENI1298 is in 1 and for pENI1299 in 2 shown.

Beispiel 2: Expressionslevel von Lipase in unabhängig voneinander gewachsenen Transformanten von Aspergillus oryzaeExample 2: Expression level from lipase to independent mutant Aspergillus oryzae transformants

JaL250 wurde mit pENI1298 und pENI1299 unter Verwenden von Standardvorgehensweisen transformiert, siehe wie in WO 98/01470 beschrieben. Die Zellen wurden dann auf Cove-Platten bei 37 °C kultiviert.JaL250 was used with pENI1298 and pENI1299 using standard procedures transformed, as described in WO 98/01470. The cells were then on Cove plates at 37 ° C cultured.

Nach drei Tagen Inkubation erschienen Transformanten bei einer Transformationshäufigkeit von 104 bis 105/μg DNA, einem 100- bis 10.000-fachen Anstieg gegenüber der Transformationshäufigkeit in Abwesenheit einer AMA1-Sequenz.After three days of incubation, transformants appeared at a transformation frequency of 10 4 to 10 5 / μg of DNA, a 100 to 10,000-fold increase over the transformation frequency in the absence unit of an AMA1 sequence.

Dreißig unabhängige Transformanten aus den pENI1298- und pENI1299-Transformationen wurden auf Cove-Platten isoliert und zur gleichen Zeit in eine 96-Well-Mikrotiterschale inokuliert, die 200 μl Minimalmedium von 1*vogel, 2 % Maltose (z.B. Methods in Enzymology, Band 17, S. 84) in jeder Vertiefung enthielt.Thirty independent transformants from the pENI1298 and pENI1299 transformations were made on Cove plates isolated and at the same time in a 96-well microtiter dish inoculated, the 200 μl Minimal medium of 1% bird, 2% maltose (e.g., Methods in Enzymology, Volume 17, p. 84) in each well.

Nach drei Tagen Inkubation bei 34 °C wurden die Medien von den Kulturen in den Mikrotiterschalen auf eine Lipaseaktivität hin untersucht. Ein Aliquot von 10 μl der Medien aus jedem Well (Vertiefung) wurde zu einem Mikrotiter-Well hinzugefügt, das 200 μl eines Lipasesubstrats aus 0,018 % p-Nitrophenylbutyrat, 0,1 % Triton X-100, 10 mM CaCl2, 50 mM Tris pH 7,5 enthielt. Die Aktivität wurde spektrophotometrisch in 15-Sekunden-Intervallen über einen Zeitraum von fünf Minuten hinweg untersucht unter Verwenden eines kinetischen Mikroplattenlesegerätes (Molecular Device Corp., Sunnyvale CA) unter Verwenden eines Standardprotokolls für Enzyme (z.B. Enzyme Kinetics, Paul C. Engel, Herausgeber, 1981, Chapman und Hal1 Ltd.). Kurz beschrieben wird die Produktbildung während der Anfangsrate des Substratumsatzes gemessen und wird definiert als der Anstieg der Kurve, die aus der Absorbanz bei 405 nm alle 15 Sekunden für 5 Minuten berechnet wird. Die willkürlichen Lipaseaktivitätseinheiten werden gegen den Transformanten normiert, der die höchste Lipaseaktivität zeigt. Für jede Gruppe der dreißig Transformanten wurde ein durchschnittlicher Wert und die Standardabweichung berechnet.After three days of incubation at 34 ° C, the media were assayed for lipase activity by the cultures in the microtiter dishes. An aliquot of 10 μl of media from each well was added to a microtiter well containing 200 μl of a lipase substrate of 0.018% p-nitrophenyl butyrate, 0.1% Triton X-100, 10 mM CaCl 2 , 50 mM Tris pH 7.5. The activity was examined spectrophotometrically at 15 second intervals over a period of five minutes using a microplate kinetic reader (Molecular Device Corp., Sunnyvale CA) using a standard enzyme protocol (eg Enzyme Kinetics, Paul C. Engel, Ed. 1981, Chapman and Hal1 Ltd.). Briefly described, product formation is measured during the initial rate of substrate turnover and is defined as the slope of the curve calculated from the absorbance at 405 nm every 15 seconds for 5 minutes. The arbitrary lipase activity units are normalized against the transformant showing the highest lipase activity. For each group of the thirty transformants, an average value and the standard deviation were calculated.

Zur gleichen Zeit wurden die Transformanten, welche auf den Cove-Platten für drei Tage bei 37 °C kultiviert worden waren, auf eine zweite Cove-Platte reisoliert und in einen Mikrotiter-Well reinokuliert, wie zuvor beschrieben. Die Vorgehensweise der Untersuchung, Reisolierung und Reinokulierung wurde noch einmal nach weiteren drei Tagen Kultivierung wiederholt.to same time, the transformants were on the cove plates for three Days at 37 ° C had been cultured, reisolated on a second cove plate and in a microtiter well reinoculated as previously described. The procedure of the investigation, Reisolierung and reinoculation was again after further repeated three days of cultivation.

Die Ergebnisse, die in nachfolgender Tabelle 1 zusammengefasst sind, zeigen die Menge der produzierten Lipase, relativ zu der Menge, die von den pENI1298-Transformanten sechs Tage nach der Transformation produziert wurde. Wie durch die geringen Werte für die Standardabweichung angezeigt wird, liegt dort eine geringe Variation in dem Lipase-Expressionslevel zwischen den 30 unabhängig voneinander wachsenden Transformanten vor. Normalerweise ist, wenn eine Transformation von filamentösen Pilzen vorgenommen wird, eine viel größere relative Standardabweichung zu sehen (70 % bis 100 %) aufgrund von sowohl zufälliger Integration in das Genom des Vektors als auch Unterschieden in der Zahl von Vektoren, die integriert werden. Es kann ein 100- bis 1000-facher Unterschied in den Expressionsleveln zwischen den am schlechtesten und am besten produzierenden Pilztransformanten liegen.The Results summarized in Table 1 below show the amount of lipase produced, relative to the amount, those from the pENI1298 transformants six days after transformation was produced. As indicated by the low values for the standard deviation there is little variation in lipase expression level between the 30 independent growing transformants. Usually, though a transformation of filamentous Mushrooms is made, a much larger relative standard deviation to see (70% to 100%) due to both random integration into the genome of the vector as well as differences in the number of Vectors being integrated. It can be 100-1000 times Difference in the expression levels between the worst and the best producing fungal transformants.

Figure 00380001
Tabelle 1. Die durchschnittlichen Expressionslevel von Lipase von 30 unabhängig voneinander gewachsenen Transformanten relativ zu pENI1298, sechs Tage nach der Transformation, und die jeweilige Standardabweichung.
Figure 00380001
Table 1. The average expression levels of lipase from 30 independently grown transformants relative to pENI1298, six days after transformation, and the respective standard deviation.

Beispiel 3: Überprüfen der Umordnung des PlasmidsExample 3: Check the Rearrangement of the plasmid

Transformanten von Jal250, die entweder pENI1298 oder pENI1299 enthielten, wurden in YPD-Medium über Nacht wachsen gelassen.Transformants of Jal250 containing either pENI1298 or pENI1299 in YPD medium over Night grown.

Die DNA von jedem der Transformanten wurde unter Verwenden eines QIAprep® Minprep Kits (QIAGEN, Venlo, Niederlande) präpariert, wobei die von dem Hersteller bereitgestellte Vorgehensweise modifiziert worden war. Kurz beschrieben wurde jeder Stamm in 5 ml YPD für drei Tage wachsen gelassen. Die Mycelien wurden durch Filtration gesammelt und mit 200 ml Wasser gewaschen, dann in ein 2 ml Mikrofugenröhrchen transferiert und durch Zentrifugation unter Vakuum für drei Stunden bei 60 °C lyophilisiert. Die getrockneten Mycelien wurden dann verrieben und einem ml Lysispuffer (100 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8,0, 1 % Triton X-100, 500mM Guanidin-HCl, 200 mM NaCl) resuspendiert, gefolgt von einem gründlichen Mischen (Mixen). Zwanzig mg RNAse wurde zu jedem Röhrchen hinzugefügt, welches dann bei 37 °C für 10 Minuten inkubiert wurde. Einhundert μg Proteinase K wurde hinzugefügt und die Reaktion wurde für 30 Minuten bei 50 °C inkubiert. Jedes Röhrchen wurde dann für 15 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit in einer „standard bench top" Mikrofuge zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine QIAprep® Drehsäule (spin column) appliziert, dann zentrifugiert und das Filtrat wurde verworfen. Als nächstes wurde die Säule in 0,5 ml PB, das in dem Kit bereitgestellt war, gewaschen und wiederum für eine Minute zentrifugiert. Nachdem das Filtrat verworfen wurde, wurde die Säule in 0,75 ml PE, das in dem Kit bereitgestellt war, gewaschen, dann ein weiteres Mal mehr für eine Minute zentrifugiert. Die Säule wurde an der Luft getrocknet und die DNA wurde durch Zugabe von 100 μl TE-Puffer eluiert, gefolgt von einer einminütigen Enddrehung („final spin").The DNA from each of the transformants was prepared using a QIAprep ® Minprep Kit (QIAGEN, Venlo, Netherlands), wherein the provided by the manufacturer had been modified procedure. Briefly, each strain was grown in 5 ml of YPD for three days. The mycelia were collected by filtration and washed with 200 ml of water, then into a 2 ml microfuge tube and lyophilized by centrifugation under vacuum for three hours at 60 ° C. The dried mycelia were then triturated and resuspended in one ml of lysis buffer (100mM EDTA, 10mM Tris pH 8.0, 1% Triton X-100, 500mM guanidine-HCl, 200mM NaCl), followed by thorough mixing (mixing). Twenty mg of RNAse was added to each tube, which was then incubated at 37 ° C for 10 minutes. One hundred μg proteinase K was added and the reaction was incubated for 30 minutes at 50 ° C. Each tube was then centrifuged for 15 minutes at top speed in a "standard bench top" microfuge. The supernatant was applied to a QIAprep ® spin column (spin column) is applied, then centrifuged and the filtrate was discarded. The column was next in 0.5 ml of PB provided in the kit, and again centrifuged for one minute After the filtrate was discarded, the column was washed in 0.75 ml of PE provided in the kit, then once more for one The column was air-dried and the DNA was eluted by adding 100 μl of TE buffer, followed by a one-minute final spin.

Es wurden Transformanten erhalten, wenn die DNA in E. coli DH5a transformiert wurde, was bestätigte, dass die Plasmide episomal in A. oryzae verblieben. Die Plasmid-DNA wurde aus den Bakterienzellen unter Verwenden des QIAprep® Miniprep Kits (QIAGEN) aufgereinigt, gemäß den Instruktionen des Herstellers.Transformants were obtained when the DNA was transformed into E. coli DH5a, confirming that the plasmids remained episomal in A. oryzae. The plasmid DNA was purified from the bacterial cells using the QIAprep ® miniprep kit (QIAGEN) according to manufacturer's instructions.

Die aufgereinigte Plasmid-DNA wurde dann mit ScaI verdaut und das Restriktionsmuster wurde unter Verwenden von Standardtechniken für Agarosegel-Fraktionierung analysiert.The purified plasmid DNA was then digested with ScaI and the restriction pattern was performed using standard techniques for agarose gel fractionation analyzed.

Die Resultate zeigten, wenn sie mit dem Restriktionsmuster des originalen Plasmids verglichen wurden, keine Umordnung in fünf pENI1299-JaL250-Transformanten und lediglich eine in acht pENI1298-JaL250-Transformanten, was die Seltenheit von Plasmid-Umordnungsereignissen anzeigt.The Results showed when compared with the restriction pattern of the original No rearrangement into five pENI1299-JaL250 transformants and only one in eight pENI1298-JaL250 transformants, which the Rarity of plasmid rearrangement events displays.

Beispiel 4: Durchmustern einer BankExample 4: Screening a bank

Um Varianten-Polypeptide mit verbesserten funktionellen charakteristischen Merkmalen, die bei einem Level exprimiert wurden, der mit dem Eltern-Polypeptid vergleichbar ist, zu identifizieren, wurde eine Bank von Varianten-Polynukleotidsequenzen erstellt und durchmustert in Aspergillus oryzae. Polymerasekettenreaktionen unter Verwenden von pENI1298 als Template und 2 pmol/ml von jedem Primer: oligo 19670 als ein Primer, und als ein zweiter Primer gedoptes Oligo 23701, 23702 oder 23703, wie nachfolgend beschrieben, liefen unter den folgenden Bedingungen laufen gelassen: 94 °C, 5 Minuten; 30 Zyklen mit (94 °C, 30 Sekunden; 50 °C, 30 Sekunden; 72 °C, 1 Minute) und 72 °C, 5 Minuten. Eine kommerzielle Taq-Polymerase, AmpliTaq, wurde verwendet, wie von dem Anbieter empfohlen (Perkin-Elme Corp., Branchburg NJ, USA). 19670: SEQ ID NR: 3. 23701: SEQ ID NR: 4. 23702: SEQ ID NR: 5. 23703: SEQ ID NR: 6. In order to identify variant polypeptides with improved functional characteristics expressed at a level comparable to the parent polypeptide, a library of variant polynucleotide sequences was constructed and screened in Aspergillus oryzae. Polymerase chain reactions using pENI1298 as template and 2 pmol / ml of each primer: oligo 19670 as a primer, and oligo 23701, 23702 or 23703 doped as a second primer, as described below, were run under the following conditions: 94 ° C , 5 minutes; 30 cycles with (94 ° C, 30 seconds, 50 ° C, 30 seconds, 72 ° C, 1 minute) and 72 ° C, 5 minutes. A commercial Taq polymerase, AmpliTaq, was used as recommended by the supplier (Perkin-Elme Corp., Branchburg NJ, USA). 19670: SEQ ID NO: 3. 23701: SEQ ID NO: 4. 23702: SEQ ID NO: 5. 23703: SEQ ID NO: 6.

Die resultierenden Produkte wurden unter Verwenden von Mikrofugen-Spinsäulen 5300 (Pharmacia-LKB, Uppsala SE) aufgereinigt. Die aufgereinigten Produkte, einschließlich der pENI1298-DNA wurden dann einer zweiten PCR-Amplifikationsrunde unterworfen, unter den folgenden Bedingungen: 94 °C, 5 Minuten; 30 Zyklen mit (94 °C, 1 Minute; 50 °C, 10 Minuten; 72 °C, 2 Minuten und 72 °C, 7 Minuten) unter Verwenden des folgenden Primers: 19671: SEQ ID NR: 7. The resulting products were purified using microfuge spin columns 5300 (Pharmacia-LKB, Uppsala SE). The purified products, including pENI1298 DNA, were then subjected to a second PCR amplification round under the following conditions: 94 ° C, 5 minutes; 30 cycles of (94 ° C, 1 minute, 50 ° C, 10 minutes, 72 ° C, 2 minutes and 72 ° C, 7 minutes) using the following primer: 19671: SEQ ID NO: 7.

Die Produkte wurden danach einer Verdauung mit DpnI unterworfen, um Template-DNA zu entfernen und wurden dann bei 94 °C für 30 Minuten inkubiert, um das DpnI-Enzym zu inaktivieren.The Products were then subjected to digestion with DpnI to Remove template DNA and were then incubated at 94 ° C for 30 minutes incubated to inactivate the DpnI enzyme.

JaL250 wurde unter Verwenden von 2 μg pENI1298, das mit BalI und SgrA1 verdaut worden war, um den größten Teil der Lipase-kodierenden Sequenz zu entfernen, und 5 μg von einem der PCR-Fragmente, das aus den Reaktionen mit gedoptem Oligo 23701, 23702 oder 23703 stammt, transformiert. Dem Vektor und dem PCR-Fragment wurden ermöglicht in vivo zu rekombinieren, wie in WO 97/07205 beschrieben. JaL250-Zellen wurden ebenfalls mit dem verdauten pENI1298 oder jedem der PCR-Produkte allein transformiert. Es wurde ein Transformant erhalten, wenn die Zellen mit dem Vektor allein transformiert wurden, und es resultierten keine Transformanten aus der Transformation mit dem PCR-Fragment allein.JaL250 was using 2 μg pENI1298, which had been digested with BalI and SgrA1, for the most part of the lipase coding sequence, and 5 μg of one the PCR fragments resulting from the reactions with gedoptem oligo 23701, 23702 or 23703, transformed. The vector and the PCR fragment were made possible to recombine in vivo as described in WO 97/07205. JaL250 cells were also with the digested pENI1298 or any of the PCR products transformed alone. There was a transformant when the Cells were transformed with the vector alone and resulted no transformants from the transformation with the PCR fragment alone.

15, 12 und 26 Transformanten wurden von den 23701-, 23702- bzw. 23703-Banken in Mikrotiterplatten inokuliert, die 200 μl 1*vogel, 2 % Glucosemedium enthielten und für 72 Stunden inkubiert. JaI250-Transformanten von pENI1298 wurden ebenfalls als eine Kontrolle inokuliert. Die Kulturen wurden dann auf Cove-Platten ausgestrichen. Die Lipaseaktivität in den Mikrotiterkulturen wurde untersucht, wie in dem obigen Beispiel 2 beschrieben, und in einem Detergent-enthaltenden Assay, in welchem in Mikrotiterwells 10 μl der Mikrotiterkultur zu 200 μl eines Lipasesubstrats hinzugefügt wurden, das unter Verwenden eines kommerziellen Waschdetergenz hergestellt wurde. Die Aktivität wurde spektrophotometrisch bei 405 nm gemessen und, wie oben in Beispiel 2 beschrieben, berechnet.15 12 and 26 transformants were from the 23701, 23702 and 23703 banks, respectively inoculated into microtiter plates containing 200 μl 1 * bird, 2% glucose medium contained and for Incubated for 72 hours. JaI250 transformants of pENI1298 were also inoculated as a control. The cultures were then Streaked on Cove plates. Lipase activity in the Microtiter cultures were examined as in Example 2 above and in a detergent-containing assay in which in microtiter wells 10 μl the microtiter culture to 200 ul a lipase substrate added were prepared using a commercial washing detergent has been. The activity was measured spectrophotometrically at 405 nm and, as in Example above 2, calculated.

Jeder der Transformanten, der eine Aktivität in dem Detergent-enthaltenden Assay zeigte, wurde auf einer Cove-Platte reisoliert. Von jeder der Cove-Platten, die für 72 Stunden bei 37 °C inkubiert worden waren, wurden zwei Kolonien in einer Mikrotiterschale, wie oben beschrieben, zusammen mit zehn pENI1298-Transformanten inokuliert, dann für 72 Stunden bei 34 °C kultiviert. Sämtliche Klone wiesen eine Aktivität in dem Detergent-Assay auf, während die pENI1298-Transformanten dies nicht taten. Ferner zeigten die Transformanten, die als voneinander unabhängige Doppelkulturen wuchsen, relativ ähnliche Aktivitätslevel. Die Resultate werden in nachfolgender Tabelle 2 zusammengefasst.Everyone the transformant having an activity in the detergent-containing Assay showed was reisolated on a cove plate. Of each the cove plates used for 72 hours at 37 ° C were incubated two colonies in a microtiter dish, as described above, along with ten pENI1298 transformants inoculated, then for 72 hours at 34 ° C cultured. All Clones had an activity in the detergent assay on while the pENI1298 transformants did not. Furthermore, the Transformants that grew as mutually independent double cultures, relatively similar Activity Level. The results are summarized in Table 2 below.

Figure 00420001
Tabelle 2. Lipaseaktivität gegenüber pnp-Butyrat und einem herkömmlichem Waschdetergent.
Figure 00420001
Table 2. Lipase activity towards pnp butyrate and a conventional detergent detergent.

Da der Klon 23701.1 sowohl eine ausgezeichnete Expression als auch Leistung sowohl in dem pnp-Butyrat- als auch dem Detergent-Assays zeigte, wurde die DNA isoliert, um die abgeleitete N-terminale Sequenz des Polypeptids zu bestimmen, welche mit SPPRRPP bestimmt wurde. Die natürlich vorkommende N-terminale Sequenz ist SPIRRE, welche ein Propeptid kodiert, das durch eine kex2-ähnliche Protease abgespalten wird. DNA von einigen der anderen Transformanten wurde sequenziert, was die folgenden abgeleiteten N-terminalen Sequenzen ergab: 23701.2 (SPPRRRR), 23702.1 (SPPRPRRR), 23702.7 (SPPRPRRP), 23703.1 (SPPRRRRRP), und 23703.4 (SPPRRPRRR). Demnach wurde an Varianten-Polypeptid mit verbesserten funktionellen charakteristischen Merkmalen, welches bei einem Level exprimiert werden kann, der mit dem des Eltern-Polypeptids vergleichbar ist, in einem Produktionswirt identifiziert.Since clone 23701.1 showed both excellent expression and performance in both the pnp-butyrate and detergent assay, the DNA was isolated to determine the deduced N-terminal sequence of the polypeptide as determined by SPPRRPP. The naturally occurring N-terminal sequence is SPIRRE, which encodes a propeptide that is cleaved by a kex2-like protease. DNA from some of the other transformants was sequenced, yielding the following deduced N-terminal sequences: 23701.2 (SPPRRRR), 23702.1 (SPPRPRRR), 23702.7 (SPPRPRRP), 23703.1 (SPPRRRRRP), and 23703.4 (SPPRRPRRR). Thus, variant polypeptide having improved functional characteristics that can be expressed at a level comparable to that of the parent polypeptide has been identified in a production host.

Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung ist in ihrem Gegenstand (Schutzbereich) nicht durch die hierin offenbarten spezifischen Ausführungsformen zu beschränken, da diese Ausführungsformen als Illustrationen von mehreren Aspekten der Erfindung gedacht sind. Jede beliebigen äquivalenten Ausführungsformen sind dazu gedacht, in dem Gegenstand (Schutzbereich) dieser Erfindung zu liegen. In der Tat werden dem Fachmann verschiedenartige Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu solchen, die hierin gezeigt und beschrieben sind, aus der vorangehenden Beschreibung offensichtlich werden. Solche Modifikationen sind ebenfalls dazu gedacht, unter den Gegenstand (Schutzbereich) der angefügten Ansprüche (Patentansprüche) zu fallen.The The invention described and claimed herein is in its subject matter (Range of protection) not by the specifics disclosed herein embodiments restrict, since these embodiments as Illustrations of several aspects of the invention are intended. Any equivalent embodiments are intended to be within the scope of this invention to lie. In fact, various modifications will become apparent to those skilled in the art the invention additionally to those shown and described herein from the foregoing Description become obvious. Such modifications are also intended to be covered by the subject matter (scope) of the appended claims (claims) fall.

Alle hierin erwähnten Publikationen sind hierin durch Bezugnahme zum Zwecke des Beschreibens und des Offenbarens der besonderen Information, für welche die Publikation zitiert worden ist, eingeschlossen. Die oben diskutierten Publikationen werden einzig für ihre Offenbarung vor dem Anmeldedatum der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Nichts hierin ist als ein Zugeständnis (admission) auszulegen, dass die Erfinder nicht berechtigt sind, eine solche Offenbarung aufgrund einer früheren Erfindung vorwegzunehmen.All mentioned herein Publications are incorporated herein by reference for the purpose of describing and the disclosure of the special information for which the publication cites been included. The publications discussed above become only for its disclosure prior to the filing date of the present application provided. Nothing herein is to be construed as an admission that the inventors are not entitled to such a disclosure due to an earlier Anticipate invention.

Es ist zu verstehen, dass diese Erfindung nicht auf die besonderen Verfahren beschränkt ist, und dass Zusammensetzungen, die als solche beschrieben werden, selbstverständlich variieren können. Es versteht sich ebenfalls, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich dem Zweck der Beschreibung von besonderen Ausführungsformen dient und nicht dazu gedacht ist, beschränkend zu sein, da der Gegenstand (Schutzbereich) der vorliegenden Erfindung lediglich durch die angefügten Ansprüche (Patentansprüche) beschränkt wird.It It should be understood that this invention is not limited to the particular ones Restricted procedure and that compositions which are described as such Of course can vary. It is also to be understood that the terminology used herein merely for the purpose of describing particular embodiments serves and is not intended to be limiting as the object (Protection) of the present invention only by the appended claims (claims) is limited.

Sofern sie nicht anderweitig definiert werden, besitzen sämtliche hierin verwendeten technischen und naturwissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie von einem Fachmann, in dessen Bereich diese Erfindung fällt, üblicherweise verstanden wird. Obwohl alle beliebigen Materialien oder Verfahren, die ähnlich oder äquivalent zu solchen sind, die hierin beschrieben werden, in der Praxis oder dem Überprüfen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien hierin beschrieben.Provided they are not otherwise defined, all have technical and scientific terms used herein the same meaning as that of a specialist in whose field this invention usually falls is understood. Although any materials or processes, the similar or equivalent to those described herein in the field or in the art checking the can be used in the present invention, the preferred Methods and materials described herein.

Beispiel 5: Erstellung von Stämmen von Fusarium venenatum Stamm DLM15Example 5: Creation of tribes of Fusarium venenatum strain DLM15

Der Stamm A3/5 von Fusarium, nunmehr neu klassifiziert als Fusarium venenatum (Yoder und Christianson, 1998, Fungal Genetics und Biology 23: 62–80; O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics und Biology 23: 57–67) wurde von Dr. Anthony Trinci, University of Manchester, Manchester, England oder von der American Type Culture Collection, Manassas, VA, als Stamm ATCC 20334 von Fusarium erhalten. Eine morphologische Mutante von Fusarium venenatum A3/5, die als CC1-3 bezeichnet wird (Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555–562; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 95:1284–1288; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 96: 555–562) ist eine hochverzweigte Kolonie-bildende Variante. Der in diesem Experiment verwendete Stamm MLY3 wurde von der morphologischen Mutante CC1-3 von Fusarium venenatum A3/5 abgeleitet. Er besitzt identische identische charakteristische Komplementationsmerkmale mit CC1-3.Of the Strain A3 / 5 from Fusarium, now reclassified as Fusarium venenatum (Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80; O'Donnell et al. 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67). Anthony Trinci, University of Manchester, Manchester, England or by the American Type Culture Collection, Manassas, VA, as strain ATCC 20334 obtained from Fusarium. A morphological mutant of Fusarium venenatum A3 / 5, designated CC1-3 (Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555-562; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 95: 1284-1288; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 96: 555-562) is a hyperbranched colony-forming variant. The one in this Experiment used strain MLY3 was from the morphological mutant CC1-3 derived from Fusarium venenatum A3 / 5. He owns identical identical characteristic complementation features with CC1-3.

Medien und LösungenMedia and solutions

Minimalmedium war pro Liter aus 6 g NaNO3, 0,52 g KCl, 1,52 g KH2PO4, 1 ml COVE-Spurenmetalllösung, 1 g Glucose, 500 mg MgSO4·7 H2O, 342,3 g Saccharose und 20 g Noble-Agar bei pH 6,5 zusammengesetzt.Minimal medium per liter was 6 g NaNO 3 , 0.52 g KCl, 1.52 g KH 2 PO 4 , 1 mL COVE trace metal solution, 1 g glucose, 500 mg MgSO 4 .7H 2 O, 342.3 g sucrose and 20 g Noble agar at pH 6.5.

RA-Sporulationsmedium war pro Liter aus 50 g Succinsäure (Bernsteinsäure) 12,1 g NaNO3, 1 g Glucose, 20 ml 50 × Vogels und 0,5 ml einer 10 mg/ml NaMoO4-Stammlösung, pH eingestellt auf 6,0, zusammengesetzt.RA sporulation medium was per liter of 50 g succinic acid (succinic acid) 12.1 g NaNO 3 , 1 g glucose, 20 ml 50x bird and 0.5 ml of 10 mg / ml NaMoO 4 stock, pH adjusted to 6.0 , composed.

YEPG-Medium war pro Liter aus 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Glucose zusammengesetzt.YEPG medium per liter of 10 g of yeast extract, 20 g of peptone and 20 g of glucose composed.

STC war zusammengesetzt aus 0,8 M Sorbitol, 25 mM Tris pH 8, 25 mM CaCl2.STC was composed of 0.8 M sorbitol, 25 mM Tris pH 8, 25 mM CaCl 2 .

SPTC war zusammengesetzt aus 40 % PEG 4000, 0,8 M Sorbitol, 25 mM Tris pH 8, 25 mM CaCl2.SPTC was composed of 40% PEG 4000, 0.8 M sorbitol, 25 mM Tris pH 8, 25 mM CaCl 2 .

COVE-Spurenmetalllösung war pro Liter aus 0,04 g NaB4O7·10 H2O, 0,4 g CuSO4·5 H2O, 1,2 g FeSO4·7 H2O, 0,7 g MnSO4·H2O, 0,8 g Na2MoO2·2H2O und 10 g ZnSO4·7 H2O zusammengesetzt.COVE trace metal solution was 0.04 g NaB 4 O 7 .10H 2 O per liter, 0.4 g CuSO 4 .5H 2 O, 1.2 g FeSO 4 .7H 2 O, 0.7 g MnSO 4 4 x H 2 O, 0.8 g Na 2 MoO 2 .2H 2 O and 10 g ZnSO 4 .7H 2 O.

50 × COVE-Salzlösung war pro Liter aus 26 g KCl, 26 g MgSO4·7 H2O, 76 g KH2PO4 und 50 ml COVE-Spurenmetallen zusammengesetzt.50 x COVE saline solution was composed per liter of 26 g KCl, 26 g MgSO 4 .7H 2 O, 76 g KH 2 PO 4 and 50 ml COVE trace metals.

COVE-Top-Agarose war pro Liter zusammengesetzt aus 20 ml 50 × COVE-Salzen, 0,8 M Saccharose, 1,5 mM Cäsiumchlorid, 1,0 mM Acetamid und 10 g niedrig schmelzender Agarose, pH eingestellt auf 6,0, zusammengesetzt.COVE top agarose was per liter composed of 20 ml of 50x COVE salts, 0.8 M sucrose, 1.5 mM cesium chloride, 1.0mM acetamide and 10g low melting agarose, pH adjusted to 6.0, composed.

COVE-Medium war pro Liter aus 342,3 g Saccharose, 20 ml 50 × COVE-Salzlösung, 10 ml 1 M Acetamid, 10 ml 1,5 M CsCl2 und 25 g Noble-Agar zusammengesetzt.COVE medium was composed per liter of 342.3 g sucrose, 20 ml 50X COVE saline, 10 ml 1 M acetamide, 10 ml 1.5 M CsCl 2 and 25 g Noble agar.

50 × Vogels-Medium war pro Liter aus 150 g Natriumcitrat, 250 g KH2PO4, 10 g MgSO4· 7 H2O, 10 g CaCl2· 2 H2O, 2,5 ml Biotin-Stammlösung und 5,0 ml AMG-Spurenmetalllösung zusammengesetzt.50 x bird medium per liter was 150 g sodium citrate, 250 g KH 2 PO 4 , 10 g MgSO 4 .7H 2 O, 10 g CaCl 2 .2H 2 O, 2.5 ml biotin stock and 5, 0 ml AMG trace metal solution composed.

Vogel's/Acetamid-Agar war pro Liter aus 30 g Saccharose, 1 × Vogel's-Salzen, 10 mM Acetamid, 15 mM CsCl und 25 g Noble-Agar zusammengesetzt.Vogel's / acetamide agar was per liter of 30 g sucrose, 1 x Vogel's salts, 10 mM acetamide, 15 mM CsCl and 25 g of Noble agar.

Fluoracetamidmedium war pro Liter zusammengesetzt aus 12 g Natriumacetat, 2 g Natriumchlorid, 0,5 g MgSO4, 3 g KH2PO4, 0,3 g Harnstoff, 2 g Fluoracetamid, 1 ml 50 × Vogels-Salzen und 15 g Agarose I (Amresco; Solon, Ohio), pH 6,1, zusammengesetzt.Fluoracetamide medium per liter was composed of 12 g sodium acetate, 2 g sodium chloride, 0.5 g MgSO 4 , 3 g KH 2 PO 4 , 0.3 g urea, 2 g fluoroacetamide, 1 ml 50X Vogels salts and 15 g agarose I (Amresco, Solon, Ohio), pH 6.1.

Deletion des pyr-Gens in Fusarium venenatum MLY3Deletion of the pyr gene in Fusarium venenatum MLY3

Eine unmarkierte Deletion von pyrG in dem Genom des Expressionswirts MLY3 von Fusarium venenatum wurde erzeugt, indem anfänglich das pyr-Gen deletiert wurde und durch das amdS-Gen von Aspergillus nidulans ersetzt wurde, das von repeted (wiederholten) DNA-Sequenzen flankiert wurde, die aus der Region stromaufwärts des pyr-Gens von Aspergillus oryzae isoliert wurden. Isolate, die von dem amdS Gen geheilt waren („cured of the amdS gen"), wurden dann durch Wachstum auf Platten, die Fluoracetamid enthielten, selektiert.A unlabelled deletion of pyrG in the genome of the expression host MLY3 of Fusarium venenatum was generated by initially using the pyr-gene was deleted and by the amdS gene of Aspergillus nidulans flanked by repeted (repeated) DNA sequences was taken from the region upstream of the pyr gene of Aspergillus oryzae were isolated. Isolates that were cured of the amdS gene ( "Cured of the amdS gen "), were then grown by growth on plates containing fluoroacetamide selected.

Das Plasmid pDM156.2 wurde konstruiert, indem ein genomisches EcoRI pyrG-Fragment, das von dem Stamm ATCC 20334 von Fusarium venenatum kloniert wurde, in die EcoRI-Stelle von pUC 118 eingefügt wurde. Das pyrG-Fragment enthielt die gesamte kodierende Region plus 1,3 kB des Promoters und 1,5 kB des Terminators (3). Das native pyr-Gen von Fusarium venenatum MLY3 wurde über homologe Rekombination durch ein Fragment von 4,4 kB ersetzt, von welchem der gesamte offene Leserahmen von pyrG deletiert wurde und durch das amdS-Gen ersetzt wurde, das von 230 bP repeated (wiederholten) Sequenzen flankiert wird, wie in 3 gezeigt.The plasmid pDM156.2 was constructed by inserting an EcoRI pyrG genomic fragment cloned from Fusarium venenatum ATCC 20334 strain into the EcoRI site of pUC 118. The pyrG fragment contained the entire coding region plus 1.3 kb of the promoter and 1.5 kb of the terminator ( 3 ). The native pyr gene of Fusarium venenatum MLY3 was replaced by homologous recombination by a 4.4 kb fragment from which the entire open reading frame of pyrG was deleted and replaced by the amdS gene, which was repopulated from 230 bP repeated (repeated) Sequences flanked, as in 3 shown.

pJRoy47 wurde erstellt, indem zunächst pJRoy43 erstellt wurde, welches zusammengesetzt ist aus pNEB193 (New England Biolabs), in welchem die PacI- und XbaI-Stellen durch eine SwaI-Stelle ersetzt wurden. Um dies zu erreichen, wurde ein Linker erzeugt, der eine BamHI-Stelle an dem 5'-Ende, eine SwaI-Stelle in der Mitte und eine SalI-Stelle an dem 3'-Ende enthält, indem die folgenden zwei Oligos miteinander annealed (verbunden) wurden: Primer 1: SEQ ID NR: 8. Primer 2: SEQ ID NR: 9. pJRoy47 was constructed by first creating pJRoy43, which is composed of pNEB193 (New England Biolabs), in which the PacI and XbaI sites have been replaced by a SwaI site. To accomplish this, a linker was created which contains a BamHI site at the 5 'end, a SwaI site in the middle, and a SalI site at the 3' end by annealing the following two oligos ( connected) were: Primer 1: SEQ ID NO: 8. Primer 2: SEQ ID NO: 9.

Der resultierende Linker wurde in pNEB193 ligiert, welcher mit BamHI und SalI verdaut worden war, um pJRoy43 zu erzeugen.Of the resulting linker was ligated into pNEB193, which was labeled with BamHI and SalI was digested to produce pJRoy43.

Dann wurde eine Region mit 230 Bp stromaufwärts des pyr-Gens von Aspergillus oryzae als eine Repeat-Sequenz (Wiederholungssequenz) in Fusarium venenatum ausgewählt. Diese Region wurde als zwei verschiedene Produkte von dem Aspergillus oryzae pyrG Plasmid pJaL335 (WO 98/12300) amplifiziert, unter Verwenden der folgenden zwei Primerpaare, Primer 3 und 4 und Primer 5 und 6: Primer 3: SEQ ID NR: 10. Primer 4: SEQ ID NR: 11. Primer 5: SEQ ID NR: 12. Primer 6: SEQ ID NR: 13. Then, a 230 bp region upstream of the Aspergillus oryzae pyr gene was selected as a repeat sequence in Fusarium venenatum. This region was amplified as two different products from the Aspergillus oryzae pyrG plasmid pJaL335 (WO 98/12300) using the following two primer pairs, primers 3 and 4 and primers 5 and 6: Primer 3: SEQ ID NO: 10. Primer 4: SEQ ID NO: 11. Primer 5: SEQ ID NO: 12. Primer 6: SEQ ID NO: 13.

Die Amplifikationsreaktionen (50 μl) wurden unter Verwenden von ungefähr 40 bis 50 ng genomischer DNA, die unter Verwenden des DNeasy Plant Mini Kit hergestellt wurde, als Template hergestellt. Jede Reaktion enthielt die folgenden Bestandteile: 40 bis 50 ng genomische DNA, 50 pmol jeweils der Primer 3 und 4 oder der Primer 5 und 6, 200 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 × Taq-DNA-Polymerasepuffer und 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase. Die Reaktionen wurden in einem Perkin-Elmer-Modell 480 Thermal Cycler inkubiert, der wie folgt programmiert wurde: Zyklus 1 bei 94 °C für 2,5 Minuten und 72 °C für 2,5 Minuten; Zyklen 2 bis 26 jeweils bei 94 °C für 45 Sekunden, 50 °C für 45 Sekunden und 72 °C für 2 Minuten; und Zyklus 27 bei 94 °C für 45 Sekunden, 50 °C für 45 Sekunden und 72 °C für 10 Minuten.The Amplification reactions (50 μl) were using about 40 to 50 ng of genomic DNA using the DNeasy Plant Mini Kit was made as a template. Every reaction contained the following components: 40 to 50 ng genomic DNA, 50 pmol each of primers 3 and 4 or primers 5 and 6, 200 uM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP, 1 x Taq DNA polymerase buffer and 2.5 units Taq DNA polymerase. The reactions were in one Perkin-Elmer Model 480 Thermal Cycler incubated as follows cycle 1 at 94 ° C for 2.5 minutes and 72 ° C for 2.5 minutes; Cycles 2 to 26 each at 94 ° C for 45 Seconds, 50 ° C for 45 Seconds and 72 ° C for 2 minutes; and cycle 27 at 94 ° C for 45 Seconds, 50 ° C for 45 Seconds and 72 ° C for 10 Minutes.

Die Reaktionsprodukte wurden über ein 1 %iges Agarosegel isoliert, wobei Fragmente von ungefähr 230 Bp isoliert wurden. Das erste PCR-Produkt (ein Fragment von ungefähr 230 Bp) enthielt eine SwaI-Stelle an dem 5'-Ende und eine EcoRV-Stelle an dem 3'-Ende, während das zweite PCR-Produkt (ein Fragment von ungefähr 230 Bp) eine EcoRV-Stelle an dem 5'-Ende und eine PmeI-Stelle an dem 3'-Ende enthielt. Die zwei aufgereinigten Repeat-Fragmente (Wiederholungs-Fragmente) wurden zunächst mit EcoRV verdaut und miteinander ligiert. Nach der Aufreinigung (Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation) wurde das Ligationsprodukt dann mit PmeI und SwaI verdaut, um ein Fragment von ungefähr 500 Bp herzustellen, welches mittels Agarosegelelektrophorese und Agarasebehandlung aufgereinigt wurde.The Reaction products were over isolated a 1% agarose gel, with fragments of approximately 230 bp were isolated. The first PCR product (a fragment of about 230 bp) contained a SwaI site at the 5'-end and an EcoRV site at the 3'-end, while the second PCR product (a fragment of about 230 bp) an EcoRV site at the 5 'end and a PMeI site at the 3 'end. The two purified repeat fragments (Repeat fragments) were first digested with EcoRV and ligated together. After purification (phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation) The ligation product was then digested with PmeI and SwaI to give a Fragment of about 500 bp, which by means of agarose gel electrophoresis and Agarase treatment was purified.

Das resultierende Fragment wurde in mit PmeI und SwaI verdautes pJRoy43 kloniert, um pJRoy44 zu erzeugen (4). Dieser Vektor enthält die zwei Repeats (Wiederholungen), die durch eine EcoRV-Stelle separiert werden und von SwaI- und PmeI-Stellen flankiert werden.The resulting fragment was cloned into PmeI and SwaI digested pJRoy43 to generate pJRoy44 ( 4 ). This vector contains the two repeats that are separated by an EcoRV site and flanked by SwaI and PmeI sites.

Ein EcoRI-Fragment, welches das amdS-Gen und eine regulatorische Region enthält, wurde von einem Subklon (Unterklon) von p3SR2 isoliert (Kelly und Hynes, 1985, EMBO Journal 4: 475–479) mit dem Klenow-Fragment mit glatten Enden versehen („made blunt") und in mit EcoRV verdautem pJRoy44 ligiert, um pJRoy47 zu erzeugen (3).An EcoRI fragment containing the amdS gene and a regulatory region was isolated from a subclone (subclone) of p3SR2 (Kelly and Hynes, 1985, EMBO Journal 4: 475-479) with the blunt-ended Klenow fragment ("Made blunt") and ligated into EcoRV digested pJRoy44 to generate pJRoy47 ( 3 ).

Das amdS-Gen, welches von den repeated (wiederholten) Sequenzen von 230 Bp flankiert wird, wurde von pJRoy47 als ein SwaI/PmeI-Fragment erhalten und in mit EcoRV/StuI verdautem pDM156.2 eingefügt, um pDM222.A zu erzeugen (3). pDM222.A wurde mit EcoRI verdaut und das EcoRI-Fragment von 4,4 kB, welches die pyrG-Deletionskassette enthält, wurde unter Verwenden des Qiaquick Gelextraktionskits (Qiagen, Chatsworth, CA) vor der Transformation Gel-aufgereinigt.The amdS gene flanked by the 230 bp repeated sequences was obtained from pJRoy47 as a SwaI / PmeI fragment and inserted into EcoRV / StuI digested pDM156.2 to generate pDM222.A ( 3 ). pDM222.A was digested with EcoRI and the 4.4 kb EcoRI fragment containing the pyrG deletion cassette was gel purified using the Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) prior to transformation.

Sporen von MLY3 von Fusarium venenatum wurden erzeugt, indem ein Kolben, der 500 ml RA-Sporulationsmedium enthielt, mit drei 1 cm2 Mycelien-Plugs von einer Platte mit Minimalmedium inokuliert wurde und bei 28 °C, 150 upm für 2 bis 3 Tage inkubiert wurde. Die Sporen wurden mittels Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA) geerntet und 20 Minuten bei 7.000 upm in einer Sorvall RC-5B Zentrifuge (E. I. DuPont De Nemours und Co., Wilmington, DE) zentrifugiert. Die pelletierten Sporen wurden zweimal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen, in einem kleinen Volumen Wasser resuspendiert und dann unter Verwenden eines Hemocytomers gezählt.Spores of MLY3 from Fusarium venenatum were generated by inoculating a flask containing 500 ml of RA sporulation medium with three 1 cm 2 mycelial plugs from a minimal medium plate and incubating at 28 ° C, 150 rpm for 2-3 days has been. The spores were harvested by Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA) and centrifuged for 20 minutes at 7,000 rpm in a Sorvall RC-5B centrifuge (EI DuPont De Nemours and Co., Wilmington, DE). The pelleted spores were washed twice with sterile distilled water, resuspended in a small volume of water and then counted using a hemocytomer.

Protoplasten wurden durch Inokulieren von 100 ml YEPG-Medium mit 4 × 107 Sporen von MLY3 von Fusarium venenatum hergestellt und für 16 Stunden bei 24 °C und 150 upm inkubiert. Die Kulturen wurden für 7 Minuten bei 3500 upm in einer Sorvall RT 6000D (E. I. DuPont De Nemours und Co., Wilmington, DE) zentrifugiert. Die Pellets wurden zweimal mit 30 ml 1 M MgSO4 gewaschen und in 15 ml 5 mg/ml NOVOZYME 234TM (Charge PPM 4356, Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark) in 1 M MgSO4 resuspendiert. Die Kulturen wurden bei 24 °C und 150 upm inkubiert, bis sich Protoplasten bildeten. Ein Volumen von 35 ml 2 M Sorbitol wurde zu dem Protoplastenverdau („protoplast digest") hinzugefügt und die Mischung wurde bei 2500 upm für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde resuspendiert, zweimal mit STC gewaschen und bei 2000 upm für 10 Minuten zentrifugiert, um die Protoplasten zu pelletieren. Die Protoplasten wurden mit einem Hemocytometer gezählt und in einer 8 : 2 : 0,1-Lösung STC : SPTC : DMSO zu einer Endkonzentration von 1,25 × 107 Protoplasten/ml resuspendiert. Die Protoplasten wurde bei –80 °C gelagert, nach Geschwindigkeits-kontrolliertem Gefrieren in einem Nalgene Cryo 1 °C Gefrierbehälter (VWR Scientific, Inc., San Francisco, CA).Protoplasts were prepared by inoculating 100 ml of YEPG medium with 4 x 10 7 spores of MLY3 from Fusarium venenatum and incubating for 16 hours at 24 ° C and 150 rpm. The cultures were centrifuged for 7 minutes at 3500 rpm in a Sorvall RT 6000D (EI DuPont De Nemours and Co., Wilmington, DE). The pellets were washed twice with 30 ml of 1 M MgSO 4 and resuspended in 15 ml of 5 mg / ml NOVOZYME 234 (lot PPM 4356, Novo Nordisk A / S, Bagsværd, Denmark) in 1 M MgSO 4 . The cultures were incubated at 24 ° C and 150 rpm until protoplasts formed. A volume of 35 ml of 2 M sorbitol was added to the protoplast digest and the mixture was centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes The pellet was resuspended, washed twice with STC and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes to give The protoplasts were counted with a hemocytometer and resuspended in a 8: 2: 0.1 solution of STC: SPTC: DMSO to a final concentration of 1.25 x 10 7 protoplasts / ml ° C after speed-controlled freezing in a Nalgene Cryo 1 ° C freezer (VWR Scientific, Inc., San Francisco, CA).

Die gefrorenen Protoplasten von MLY3 von Fusarium venenatum wurden auf Eis aufgetaut. Ein μg des EcoRI-Fragments von 4,4 kB von pDM222.A, oben beschrieben, und 5 μl Heparin (5 mg pro ml STC) wurden zu einem 50 ml sterilen Polypropylenröhrchen hinzugefügt. Einhundert μl Protoplasten wurden hinzugefügt, vorsichtig gemischt und auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Ein ml SPTC wurde hinzugefügt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 25 ml 40 °C COVE-Top-Agarose plus 10 mM Uridin, wurde die Mischung auf eine Platte mit einem Durchmesser von 150 mm gegossen, die COVE-Agar enthielt, um nach dem Einbau des amdS-Gens zu selektieren.The frozen protoplasts of MLY3 from Fusarium venenatum were thawed on ice. One μg of the 4.4 kb EcoRI fragment from pDM222.A described above and 5 μl heparin (5 mg per ml STC) were added to a 50 ml sterile polypropylene tube. One hundred μl protoplasts were added, mixed gently and incubated on ice for 30 minutes. One ml of SPTC was added and incubated for 20 minutes at room temperature. After adding 25 ml of 40 ° C COVE top agarose plus 10 mM uridine, the mixture was poured onto a 150 mm diameter plate containing COVE agar to select after incorporation of the amdS gene.

Das native EcoRI-Fragment von 3,9 kB des pyr-Gens von MLY3 von Fusarium venenatum wurde über homologe Rekombination durch das Fragment von 4,4 kB, welches die pyrG-flankierende Sequenz und das amdS-Gen, flankiert von den repeated (wiederholten) Sequenzen von 230 Bp enthielt, ersetzt. Dieses resultierte in der Deletion der gesamten pyrG-kodierenden Region plus 0,78 kB der 5'-nicht-translatierten und 0,8 kB der 3'-nicht-translatierten Regionen. Der Ersatz des nativen pyr-Gens durch die Deletionskassette wurde durch Southernhybridisierung bestätigt. Southernhybridisierungen wurden unter Verwenden der Amersham (Arlington, IL) Vistra und Rapid Hyb-Protokolle oder des Boehringer Mannheim DIG-System-Protokolls, bereitgestellt durch den Hersteller, durchgeführt. Die genomische DNA von Pilzen von putativen Deletanten wurde unter Verwenden des DNeasy Plant Mini Kits (Qiagen Chatsworth, CA) hergestellt und mit EcoRI verdaut. Southern Blots wurden unter Verwenden einer Magnagraph-Membran (Micron Separations, Inc; Westborough, MA) und molekularbiologischen Standardtechniken hergestellt. Die Membranen wurden entwickelt, indem den Instruktionen des Herstellers gefolgt wurde und unter Verwenden von STORM 860 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) für Fluoresceinmarkierte Sonden gescannt oder für DIG-markierte Sonden auf einem Film belichtet. Die pyrG-Sonde von 3,2 kB enthielt die gesamte pyrG-kodierende Region 0,64 kB 5'-Region und 1,42 kB 3'-nicht-translatierte Region.The native 3.9 kb EcoRI fragment of the FYarium MLY3 pyr gene Venenatum was about homologous Recombination by the 4.4 kb fragment containing the pyrG flanking sequence and the amdS gene, flanked by the repeated sequences of 230 bp, replaced. This resulted in the deletion the entire pyrG coding Region plus 0.78 kb of 5 'untranslated and 0.8 kb of the 3 'untranslated regions. Replacement of the native pyr gene by the deletion cassette was performed Southern hybridization confirmed. Southern hybridizations were performed using Amersham (Arlington, IL) Vistra and Rapid Hyb protocols or Boehringer Mannheim DIG system protocol provided by the manufacturer. The Genomic DNA of fungi from putative deletants was used manufactured and manufactured by DNeasy Plant Mini Kits (Qiagen Chatsworth, CA) digested with EcoRI. Southern blots were made using a Magnagraph membrane (Micron Separations, Inc., Westborough, MA) and molecular biology Standard techniques produced. The membranes have been developed by following the instructions of the manufacturer and under Using STORM 860 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) for fluorescein labeled Probes scanned or for DIG-labeled probes exposed on a film. The pyrG probe from 3.2 kb, the entire pyrG coding region contained 0.64 kb 5 'region and 1.42 kb 3'-untranslated Region.

Ein Deletantenstamm wurde in RA-Medium plus 10 mM Uridin für ungefähr 3 Tage bei 28 °C, 150 upm sporuliert und einzelne Sporen wurden unter Verwenden eines Mikromanipulators isoliert. Die Sporenisolate wurden auf Vogel's/Acetamid-Agar plus 10 mM Uridin wachsen gelassen. Ein Sporenisolat wurde in RA-Medium plus 10 mM Uridin sporuliert. Die Sporenkultur wurde über Miracloth filtriert, um die Mycelien zu entfernen. Eine Selektion nach dem Verlust des amdS-Markers erfolgte durch Verteilen von 9,5 × 105 Sporen des bestätigten pyrG-Deletanten auf jede von fünf 150 mm Platten, die Fluoracetamidmedium plus 10 mM Uridin enthielten. Diese Platten wurden bei Raumtemperatur für bis zu 2 Wochen inkubiert. Resultierende Kolonien wurden subkultiviert auf COVE-Platten und Fluoracetamid-Platten plus 10 mM Uridin. Kolonien, die gut auf Fluoracetamid wuchsen und kaum oder gar nicht auf COVE wuchsen, wurden weiter analysiert. Sporenisolate von drei dieser Stämme wurden Southern Blot-Analysen unterworfen. Genomische DNA wurde mit EcoRI geschnitten und mit der pyrG-Sonde sondiert, wie oben beschrieben. Einige der Sporenisolate ergaben eine Hybridisierungsbande von 1,4 kB, was einen amdS „loop-out" anzeigte. Ein Sporenisolat wurde ausgewählt und wurde als DLM 15 von Fusarium venenatum bezeichnet.A deletion strain was sporulated in RA medium plus 10 mM uridine for about 3 days at 28 ° C, 150 rpm, and individual spores were isolated using a micromanipulator. The spore isolates were grown on Vogel's / acetamide agar plus 10 mM uridine. Spore isolate was sporulated in RA medium plus 10 mM uridine. The spore culture was filtered over Miracloth to remove the mycelia. Selection for loss of the amdS marker was done by spreading 9.5 x 10 5 spores of the confirmed pyrG deletant on each of five 150 mm plates containing fluoroacetamide medium plus 10 mM uridine. These plates were incubated at room temperature for up to 2 weeks. Resulting colonies were subcultured on COVE plates and fluoroacetamide plates plus 10 mM uridine. Colonies that grew well on fluoroacetamide and grew barely or not at all on COVE were further analyzed. Spore isolates from three of these strains were subjected to Southern blot analysis. Genomic DNA was cut with EcoRI and probed with the pyrG probe as described above. Some of the spore isolates gave a 1.4 kb hybridization band, indicating an amdS "loop-out." One spore isolate was selected and designated as DLM 15 of Fusarium venenatum.

Beispiel 6: Expressionslevel von Lipase in unabhängig voneinander gewachsenen DLM15-Transformanten von Fusarium venenatumExample 6: Expression level from lipase to independent grown DLM15 transformants of Fusarium venenatum

Der pyrG minus Stamm DLM15 von Fusarium venenatum, beschrieben in Beispiel 5, wurde mit pENI1298 (beschrieben in Beispiel 2) transformiert unter Verwenden von Standardvorgehensweisen, wie beschrieben in Royer et al. 1995, Biotech. 13 1479–1483, wobei Acetamid durch Natriumnitrat (25 mM) ersetzt wurde. Die Zellen wurden dann auf Minimalplatten bei Raumtemperatur kultiviert. Nach zwei Wochen Inkubation erschienen Transformanten bei einer Transformationshäufigkeit von 50 bis 100/μg DNA, einem 10- bis 100-fachen Anstieg gegenüber der Transformationshäufigkeit in der Abwesenheit einer AMA1-Sequenz. 20 Transformanten wurden auf Platten mit Minimalmedien isoliert und für weitere 2 Wochen bei Raumtemperatur wachsen gelassen. Die Transformanten wurden in eine Mikrotiterschale in 20 μl Vogel-Medien (wie in Beispiel 2), entweder mit 20 mM Uridin ergänzt oder ohne Uridin, inokuliert und bei Raumtemperatur wachsen gelassen. Die Transformanten, bei denen Uridin ergänzt wurden, wuchsen gut, waren jedoch nicht in der Lage, zu wachsen, wenn sie auf Platten mit Minimalmedien ohne Uridin isoliert wurden, was anzeigt, dass das Plasmid, welches das pyr-Gen enthält, verloren worden war, und somit, dass das Plasmid autonom replizierend war. Es konnte keine Lipaseaktivität von Transformanten detektiert werden, die in Medien, die mit Uridin ergänzt waren, wuchsen. Eine Lipaseaktivität konnte detektiert werden in den Medien von Transformanten, die in Minimalmedien wuchsen, die nicht mit Uridin ergänzt waren. Die durchschnittliche willkürliche Aktivität betrug 34,8 mit einer relativen Standardabweichung von 15 %, wenn sie mit unabhängig voneinander gewachsenen Fusarium-Transformanten verglichen wurde. Demnach kann dieses Plasmid potentiell für die Erzeugung von Banken in Arten von Fusarium verwendet werden.Of the pyrG minus strain DLM15 of Fusarium venenatum described in Example 5, was transformed with pENI1298 (described in Example 2) using standard procedures as described in Royer et al. 1995, Biotech. 13 1479-1483, wherein acetamide by Sodium nitrate (25 mM) was replaced. The cells were then opened Cultured minimal plates at room temperature. After two weeks incubation transformants appeared at a transformation frequency from 50 to 100 / μg DNA, a 10- to 100-fold increase over the transformation frequency in the absence of an AMA1 sequence. 20 transformants were isolated on plates with minimal media and grow for a further 2 weeks at room temperature calmly. The transformants were placed in a microtiter plate in 20 μl bird media (as in Example 2), either with 20 mM uridine supplemented or without uridine, inoculated and grown at room temperature. The transformants supplemented with uridine grew well however, unable to grow when placed on minimal media plates were isolated without uridine, indicating that the plasmid, which contains the pyr gene, had been lost, and thus that the plasmid replicating autonomously was. It could not detect lipase activity of transformants which grew in media supplemented with uridine. A lipase activity could be detected in the media of transformants in minimal media grew, which were not supplemented with uridine. The average arbitrary activity was 34.8 with a relative standard deviation of 15% when she with independent grown Fusarium transformants was compared. Thus, this plasmid can potentially be used for the generation of libraries used in species of Fusarium.

Beispiel 7: Überprüfen der Cotransformation von PCR-FragmentenExample 7: Check the Cotransformation of PCR fragments

Das folgende Experiment wurde ausgeführt, um zu bewerten, ob mehrere PCR-Fragmente in vivo mit einem geschnittenen Vektor (wie in Beispiel 4) in derselben Zelle rekombinieren würden und die Expression von mehreren Enzymen von demselben Klon beibehalten würden. Es wurden zwei PCR-Fragmente hergestellt, die entweder das Lipasegen oder das AMG-Gen (einschließlich Promoter und Terminator) enthielten unter Verwenden von PCR-Standardbedingungen (94 °C, 5 Minuten; 30 Zyklen mit (94 °C, 30 Sekunden; 50 °C, 30 Sekunden; 72 °C, 1 Minute) und 72 °C, 5 Minuten) Oligo 115120 (SEQ ID NR: 14), oligo 134532 (SEQ ID NR: 15) und entweder einem pAHL-Derivat (Lipasevariante in pAHL) oder einem pENI1543-Derivat (AMG-Variante) als Template. pENI1543 wurde durch Erzeugen eines PCR-Fragments erstellt, das das Glucoamylasegen (cDNA) von Aspergillus niger (EMBL:AC:X00548 als Template) enthält unter Verwenden von Oligo 139123 (SEQ ID NR: 16) und 139124 (SEQ ID NR: 17), das mit BglII und SalI geschnitten wurde und in pAHL kloniert wurde, welches mit BamHI und XhoI geschnitten worden war.The the following experiment was carried out to evaluate whether multiple PCR fragments in vivo with a cut Vector (as in Example 4) would recombine in the same cell and maintain expression of multiple enzymes from the same clone would. Two PCR fragments were made, which were either the lipase gene or the AMG gene (including Promoter and terminator) using standard PCR conditions (94 ° C, 5 minutes; 30 cycles with (94 ° C, 30 seconds; 50 ° C, 30 seconds; 72 ° C, 1 minute) and 72 ° C, 5 minutes) Oligo 115120 (SEQ ID NO: 14), oligo 134532 (SEQ ID NO: 15) and either a pAHL derivative (lipase variant in pAHL) or a pENI1543 derivative (AMG variant) as a template. pENI1543 was by generating a PCR fragment containing the glucoamylase gene (cDNA) of Aspergillus niger (EMBL: AC: X00548 as template) contains Using Oligo 139123 (SEQ ID NO: 16) and 139124 (SEQ ID NO: 17) which was cut with BglII and SalI and cloned into pAHL, which had been cut with BamHI and XhoI.

Ungefähr 1 μg von jedem PCR-Fragment wurde in Jal250 (wie in Beispiel 4 beschrieben) zusammen mit pENI1299 (1 μg), das mit BalI und SgrAI geschnitten worden war, transformiert und mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt. 20 Transformanten wurden isoliert und in Minimalmedien (wie in Beispiel 4) inokuliert. Nach 72 Stunden Inkubation wurden die Kulturmedien auf die Gegenwart von Lipase (pnp-Butyrataktivität) und Glucoamylase (pnp-Glucopyranosidaktivität), hin untersucht. Keine Transformanten zeigten sowohl Lipase- als auch Glucoamylase-Aktivität, was somit anzeigt, dass die Cotransformation und Expression von mehreren Varianten in derselben Zelle ein sehr seltenes Ereignis ist, und damit kein Problem bei dem Durchmustern von Banken von filamentösen Pilzen darstellt.About 1 μg of each PCR fragment was in Jal250 (as described in Example 4) together with pENI1299 (1 μg), which had been cut with BalI and SgrAI, transformed and with calf intestinal phosphatase treated. 20 transformants were isolated and in minimal media inoculated (as in Example 4). After 72 hours incubation were the culture media for the presence of lipase (pnp-butyrate activity) and glucoamylase (pnp-glucopyranoside activity) examined. No transformants showed both lipase and Glucoamylase activity, thus indicating that cotransformation and expression of multiple variants in the same cell a very rare event is, and therefore no problem in the screening of banks of filamentous Representing mushrooms.

Beispiel 8: Erstellung von pJerS2801 und pHPOD1Example 8: Creation of pJerS2801 and pHPOD1

Eine Drei-Stück-Ligation wurde durchgeführt unter Verwenden eines BglII/SphI-Fragments von 5,8 kB von pENI1298, eines BssHII/SphI-Fragments von 4,0 kB von pENI1298 und eines BssHI/BglII-Fragments von 0,75 kB von pBANe6 (TAKA/NA2/TPI-Promoter/AMG-Terminator; beschrieben in WO 98/11203), womit pJers 2801 erzeugt wurde. Ein PCR-Fragment, welches die Haloperoxidase von Curvularia verruculosa (Patent WO 974102-A1) enthielt, wurde unter Verwenden des Oligos 1029fwp (SEQ ID NR: 18) und 1029rev (SEQ ID NR: 19) erzeugt. Das PCR-Fragment wurde mit SwaI und NotI geschnitten und in pJers2801, welches mit den gleichen Restriktionenzymen geschnitten wurde, kloniert, womit pHPOD1 erzeugt wurde.A Three-piece ligation was carried out using a 5.8 kb BglII / SphI fragment from pENI1298, a 4.0 kb BssHII / SphI fragment from pENI1298 and a BssHI / BglII fragment 0.75 kb of pBANe6 (TAKA / NA2 / TPI promoter / AMG terminator; in WO 98/11203), thus producing pJers 2801. A PCR fragment which Haloperoxidase of Curvularia verruculosa (Patent WO 974102-A1) using the oligos 1029fwp (SEQ ID NO: 18) and 1029rev (SEQ ID NO: 19). The PCR fragment was washed with SwaI and NotI cut and pJers2801, which with the same Restriction enzymes was cloned, thus generating pHPOD1 has been.

Beispiel 9: Expressionslevel von Haloperoxidase in unabhängig voneinander gewachsenen TransformantenExample 9: Expression level of haloperoxidase in independently grown transformants

pHPOD1 wurde in Jal250 transformiert, wie in Beispiel 2. Es wurde ungefähr die gleiche Transformationshäufigkeit erhalten, wie für pENI1298 (Beispiel 2). 10 unabhängige Transformanten von Aspergillus wurden auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte inokuliert, die 200 μl G2-Gly-Medium in jedem Well enthielt und für 72 Stunden wachsen gelassen. Die Haloperoxidaseaktivität wurde für jeden der 10 Transformanten bestimmt, im Wesentlichen wie von De Boer et al (1987; Vanadium containing bromoperoxidase: An example of an oxidoreductase with a high operationel stability in aqueous and organic media, Biotechnol. Bioeng. 30: 607–610) beschrieben. Der durchschnittliche Expressionslevel betrug 82,5 ± 9,1 (willkürliche Einheiten). Die relative Standardabweichung bei dem Expressionslevel zwischen voneinander unabhängigen Transformanten beträgt ungefähr 11 %, welches überraschend niedrig ist. Demnach ist diese Erfindung nicht nur auf eine Lipase anwendbar, sondern ebenso auf andere Enzyme.pHPOD1 was transformed to Jal250 as in Example 2. It became approximately the same transformation frequency get as for pENI1298 (Example 2). 10 independent Transformants of Aspergillus were plated on a 96-well microtiter plate inoculated, the 200 μl Contained G2-Gly medium in each well and allowed to grow for 72 hours. Haloperoxidase activity was for each of the 10 transformants is determined, essentially as described by De Boer et al (1987; Vanadium containing bromoperoxidase: An example of oxidoreductase with a high operational stability in aqueous and organic media, Biotechnol. Bioeng. 30: 607-610). The average Expression level was 82.5 ± 9.1 (arbitrary Units). The relative standard deviation at the expression level between independent Transformants amounts approximately 11%, which surprisingly is low. Thus, this invention is not just a lipase applicable, but also to other enzymes.

Beispiel 10: Co-Transformation von zwei Plasmiden, die zwei verschiedene Enzyme kodieren, in Jal250Example 10: Co-transformation of two plasmids encoding two different enzymes in Jal250

Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um zu bewerten, ob zwei Plasmide, die zwei verschiedene Enzyme kodieren und in derselben Zelle transformiert werden während des Wachstums verbleiben, und somit zu der extrazellulären Co-Expression von mehr als einem Plasmid-kodierten Enzym führen können.The The following experiment was performed to evaluate if two Plasmids that encode two different enzymes and in the same Cell to be transformed during of growth, and thus extracellular co-expression can lead to more than one plasmid-encoded enzyme.

Jal250 wurde co-transformiert mit sowohl 0,1 μg pENI1299 als auch 0,1 μg pHPOD1 (wie in Beispiel 2). 40 unabhängige Transformanten wurden isoliert und in Minimalmedien (wie in Beispiel 4) inokuliert. Nach 72 Stunden Inkubation wurden die Kulturmedien auf die Anwesenheit von Lipase- (wie in Beispiel 4) als auch Haloperoxidase-Aktivität (wie in Beispiel 8) hin untersucht. Keine Transformanten zeigten sowohl Lipase als auch Haloperoxidase-Aktivität, was anzeigt, dass eine Co-Transformation und -Expression von mehreren Varianten in derselben Zelle ein sehr seltenes Ereignis ist, und damit kein Problem in dem Durchmustern von Banken von filementösen Pilzen darstellt.JaL250 was co-transformed with both 0.1 μg pENI1299 and 0.1 μg pHPOD1 (as in Example 2). 40 independent Transformants were isolated and stored in minimal media (as in Example 4) inoculated. After 72 hours of incubation, the culture media became for the presence of lipase (as in Example 4) as well as haloperoxidase activity (as in Example 8). No transformants showed up Lipase as well as haloperoxidase activity, indicating that a co-transformation and expression of multiple variants in the same cell a very rare event is, and therefore no problem in the screening from banks of filementösen Representing mushrooms.

SEQUENZPROTOKOLL

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SEQUENCE LISTING
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Claims (29)

Verfahren zum Erstellen und Selektieren oder Durchmustern einer Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen in filamentösen Pilzzellen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Transformieren der Pilzzellen mit einer Population von DNA-Vektoren, wobei jeder Vektor umfasst: (i) eine Polynukleotidsequenz, die einen Selektionsmarker für Pilze und eine Replikationsinitiationssequenz für Pilze kodiert, wobei der Marker und die Replikationsinitiationssequenz innerhalb der Population nicht variieren; und (ii) eine interessierende Polynukleotidsequenz, wobei die Population von DNA-Vektoren mehr als eine Variante der Polynukleotidsequenz enthält; (b) Kultivieren der Zellen unter Selektionsdruck; (c) Selektieren von oder Durchmustern nach einem oder mehreren Transformanten, der/die ein gewünschtes charakteristisches Merkmal exprimiert/exprimieren; und (d) Isolieren des/der interessierenden Transformanten.A method of constructing and selecting or screening a library of polynucleotide sequences of interest in filamentous fungal cells, the method comprising: (a) transforming the fungal cells with a population of DNA vectors, each vector comprising: (i) a polynucleotide sequence encoding a selection marker for fungi and a replication initiation sequence for fungi, wherein the marker and the replication initiation sequence do not vary within the population; and (ii) a polynucleotide sequence of interest, wherein the population of DNA vectors contains more than one variant of the polynucleotide sequence; (b) culturing the cells under selection pressure; (c) selecting or screening for one or more transformants expressing a desired characteristic; and (d) isolating the transformant of interest. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen durch Zufallsmutagenese oder natürlich vorkommende allele Variationen von mindestens einer Eltern-Polynukleotidsequenz, die eine interessierende biologische Aktivität oder Funktion besitzt oder kodiert, hergestellt wird.The method of claim 1, wherein the bank of polynucleotide sequences of interest by random mutagenesis or of course occurring allelic variations of at least one parent polynucleotide sequence, which has a biological activity or function of interest or coded is produced. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Polynukleotidsequenz ein Polypeptid kodiert oder eine Kontrollsequenz ist; oder in welchem die Polynukleotidsequenz ein Polypeptid oder einen Teil davon kodiert und weiterhin eine Kontrollsequenz, die in die Expression des Polypeptids involviert ist, oder einen Teil einer solchen Kontrollsequenz, umfasst.Method according to claim 1 or 2, in which the Polynucleotide sequence encoding a polypeptide or a control sequence is; or in which the polynucleotide sequence is a polypeptide or encodes a part of it and furthermore a control sequence which is involved in the expression of the polypeptide, or a part of a such control sequence. Verfahren nach Anspruch 3, in welchem das Polypeptid ein Hormon, ein Enzym, ein Rezeptor oder ein Anteil davon, ein Antikörper oder ein Anteil davon oder ein Reporter oder ein regulatorisches Protein ist.The method of claim 3, wherein the polypeptide a hormone, an enzyme, a receptor or a part thereof, an antibody or a portion thereof or a reporter or a regulatory protein is. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem das Enzym eine Oxidoreductase, eine Transferase, eine Hydrolase, eine Lyase, eine Isomerase oder eine Ligase ist.The method of claim 4, wherein the enzyme is a Oxidoreductase, a transferase, a hydrolase, a lyase, a Isomerase or a ligase. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 4 oder 5, in welchem das Enzym eine Aminopeptidase, Amylase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Catalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextringlycosyltransferase, Desoxyribonuclease, Esterase, alpha-Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, Invertase, Laccase, Lipase, Mannosidase, Mutanase, Oxidase, ein pektinolytisches Enzym, Peroxidase, Phytase, Polyphenoloxidase, ein proteolytisches Enzym, Ribonuclease, Transglutaminase oder Xylanase ist.A method according to any of claims 4 or 5, in which the enzyme is an aminopeptidase, amylase, carbohydrase, Carboxypeptidase, catalase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycosyltransferase, Deoxyribonuclease, esterase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, Glucoamylase, alpha-glucosidase, beta-glucosidase, invertase, laccase, lipase, Mannosidase, mutanase, oxidase, a pectinolytic enzyme, peroxidase, Phytase, polyphenol oxidase, a proteolytic enzyme, ribonuclease, transglutaminase or xylanase. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Kontrollsequenz eine Enhancersequenz, eine Leadersequenz, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, ein Promotor, eine Replikationsinitiationssequenz, eine Signalsequenz, ein Transkriptionsterminator oder ein Translationsterminator ist.Method according to claim 1 or 2, in which the Control sequence an enhancer sequence, a leader sequence, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, a replication initiation sequence, a signal sequence, a transcription terminator or a translation terminator is. Verfahren nach Anspruch 7, in welchem der Promoter von dem Gen abgeleitet ist, das Aspergillus oryzae TAKA Amylase, NA2-tpi und Aspergillus niger oder Aspergillus awamori Glucoamylase kodiert.The method of claim 7, wherein the promoter derived from the gene, the Aspergillus oryzae TAKA amylase, NA2-tpi and Aspergillus niger or Aspergillus awamori glucoamylase coded. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, in welchem der Selektionsmarker ausgewählt ist aus der Gruppe von Genen, die ein Produkt kodieren, welches eine Resistenz gegenüber Biozid- oder viraler Toxizität, eine Resistenz gegenüber Schwermetalltoxizität oder Prototrophie oder Auxothrophe bereitstellt.Method according to any one of claims 1 to 8, in which the selection marker is selected from the group of Genes encoding a product that has resistance to biocidal or viral toxicity, a resistance to Heavy metal toxicity or prototrophy or auxotrophs. Verfahren nach Anspruch 9, in welchem die Phototrophie von einem Enzym erhalten wird, ausgewählt aus der Gruppe von Stoffwechselwegen, bestehend aus Nukleotidsynthese, Cofaktorsynthese, Aminosäuresynthese, Acetamidstoffwechsel, Prolinstoffwechsel, Sulfatstoffwechsel und Nitratstoffwechsel.The method of claim 9, wherein the phototrophy obtained from an enzyme selected from the group of metabolic pathways, consisting of nucleotide synthesis, cofactor synthesis, amino acid synthesis, Acetamidstoffwechsel, proline metabolism, sulfate metabolism and Nitrate metabolism. Verfahren nach Anspruch 9, in welchem der Selektionsmarker ein Gen ist, ausgewählt aus de Gruppe, bestehend aus argB (Ornithincarbamoyltransferase), amdS (Acetamidase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase), hemA (5-Aminolevulinatsynthase), hemB (Porphobilinogensynthase), hygB (Hygromycinphosphotransferase), niaD (Nitratreductase), prn (Prolinpermease), pyrG (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase), pyroA, riboB, sC (Sulfatadenyltransferase) und trpC (Anthranilatsynthase).The method of claim 9, wherein the selection marker a gene is selected from the group consisting of argB (ornithine carbamoyltransferase), amdS (acetamidase), bar (phosphinothricin acetyltransferase), hemA (5-Aminolevulinatsynthase) hemB (porphobilinogen synthase), hygB (hygromycin phosphotransferase), niaD (nitrate reductase), prn (proline permease), pyrG (orotidine-5'-phosphate decarboxylase), pyroA, riboB, sC (sulfate adenyltransferase) and trpC (anthranilate synthase). Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 11, in welchem die Replikationsinitiationssequenz eine Nukleinsäuresequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Replikationsinitiationssequenz, welche mindestens 50 % Identität mit der Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 besitzt, und welche in der Lage ist, die Replikation zu initiieren; (b) einer Replikationsinitiationssequenz, welche unter niedrigen Stringenzbedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 oder (ii) den jeweils komplementären Strängen hybridisiert, wobei die niedrigen Stringenzbedingungen durch Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42 °C in 5 × SSPE, 0,3 % SDS, 200 mg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA und 25 % Formamid definiert sind, und Waschbedingungen bei 50 °C für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,2 % SDS definiert sind; und (c) einer Untersequenz von (a) oder (b), wobei die Untersequenz Replikationsinitiationsaktivität besitzt.The method of any one of claims 1 to 11, wherein the replication initiation sequence is a nucleic acid sequence selected from the group consisting of: (a) a replication initiation sequence having at least 50% identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO : Has 2, and which is able to initiate the replication; (b) a replication initiation sequence which under low stringency conditions hybridizes with (i) the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or (ii) the respective complementary strands, the low stringency conditions being determined by prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5x SSPE, 0.3% SDS, 200 mg / ml sheared and denatured salmon sperm DNA and 25% formamide are defined, and wash conditions at 50 ° C for 30 minutes are defined in 2x SSC, 0.2% SDS; and (c) a subsequence of (a) or (b), wherein the subsequence has replication initiation activity. Verfahren nach Anspruch 12, in welchem die Nukleinsäuresequenz mindestens 50 % Identität, stärker bevorzugt ungefähr 60 %, noch stärker bevorzugt ungefähr 70 %, noch stärker bevorzugt ungefähr 80 %, noch stärker bevorzugt ungefähr 90 % und am stärksten bevorzugt ungefähr 97 % Identität mit der Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 besitzt.The method of claim 12, wherein the nucleic acid sequence at least 50% identity, more preferred approximately 60%, even stronger preferably about 70%, even stronger preferably about 80%, even stronger preferably about 90% and strongest preferably about 97% identity with the nucleic acid sequence from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Verfahren nach Anspruch 12, in welchem die Replikationsinitiationssequenz aus einer filamentösen Pilzzelle erhalten wird.The method of claim 12, wherein the replication initiation sequence from a filamentous fungal cell is obtained. Verfahren nach Anspruch 14, in welchem die filamentöse Pilzzelle ein Stamm (von einem Stamm) von Aspergillus ist.The method of claim 14, wherein the filamentous fungal cell is a strain (of a strain) of Aspergillus. Verfahren nach Anspruch 15, in welchem der Stamm von Aspergillus von einem Stamm von A. nidulans erhalten wird.The method of claim 15, wherein the strain of Aspergillus is obtained from a strain of A. nidulans. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12 bis 16, in welchem die Replikationsinitiationssequenz die in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 dargestellte Nukleinsäuresequenz besitzt oder eine jeweils funktionelle Untersequenz davon ist.A method according to any of claims 12 to 16, in which the replication initiation sequence described in SEQ ID NR: 1 or SEQ ID NO: 2 has or a nucleic acid sequence shown each functional subsequence thereof. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die Modifikation der Eltern-Polynukleotidsequenz durch Mutagenese, bevorzugt Zufallsmutagenese, unter Verwendung eines physikalisch oder chemisch mutagenisierenden Mittels, Verwendung eines gedopten („doped") Oligonukleotids, DNA-Shuffling oder, indem die Nukleinsäuresequenz einer PCR-erzeugten Mutagenese unterzogen wird, oder Verwendung einer beliebigen Kombination davon, durchgeführt wird.Process according to claim 2, in which the modification the parent polynucleotide sequence by mutagenesis, preferably random mutagenesis, using a physically or chemically mutagenizing agent, use a doped oligonucleotide, DNA shuffling or by making the nucleic acid sequence of a PCR-generated Subjected to mutagenesis, or use of any combination of it, carried out becomes. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem die interessierenden Polynukleotidsequenzen durch in vivo Rekombination zwischen zwei oder mehr homologen Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid oder eine regulatorische Sequenz oder eine beliebige Kombination aus beidem kodieren, erhalten wird, umfassend: (a) Identifizieren von mindestens einer konservierten Region zwischen den interessierenden Polynukleotidsequenzen; (b) Erzeugen von Fragmenten von jeder der interessierenden Polynukleotidsequenzen, wobei die Fragmente die konservierte(n) Region(en) aus (a) umfassen; und (c) Rekombinieren der Fragmente aus (b) unter Verwenden der konservierten Region(en) als (a) homologe(n) Verknüpfungspunkt(e).The method of claim 18, wherein the Polynucleotide sequences by in vivo recombination between two or more homologous nucleic acid sequences, which is a polypeptide or a regulatory sequence or any Combining both is obtained, comprising: (A) Identifying at least one conserved region between the polynucleotide sequences of interest; (b) generating Fragments of each of the polynucleotide sequences of interest, wherein the fragments comprise the conserved region (s) of (a); and (c) recombining the fragments of (b) using the conserved region (s) as (a) homologous attachment point (s). Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 19, in welchem die filamentöse Pilzzelle, die mit der Population von DNA-Vektoren transformiert wird, eine Zelle von einem Stamm von Acremonium, Aspergillus, Coprinus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliopthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma ist.Method according to any one of claims 1 to 19, in which the filamentous Fungal cell that transforms with the population of DNA vectors a cell from a strain of Acremonium, Aspergillus, Coprinus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliopthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium or Trichoderma is. Verfahren nach Anspruch 20, in welchem die Zelle eine Zelle von Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Coprinus cinereus, Fusarium oxysporum oder Trichoderma reesei ist.The method of claim 20, wherein the cell a cell of Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Coprinus cinereus, Fusarium oxysporum or Trichoderma reesei is. Verfahren zum Erstellen und Durchmustern oder Selektieren einer Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen in einer filamentösen Pilzzelle, wobei das Verfahren umfasst: (a) Transformieren einer Kultur von Bakterien- oder Hefezellen mit einer Population der DNA-Vektoren, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 21 beschrieben, wobei der Vektor weiterhin eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die einen Selektionsmarker für Bakterien oder Hefen und eine Replikationsinitiationssequenz für Bakterien oder Hefen kodiert; (b) Kultivieren der Bakterien- oder Hefezellen unter Selektionsdruck; (c) Isolieren der DNA-Konstrukte aus den Transformanten aus (b); (d) Transformieren von filamentösen Pilzzellen mit den DNA-Konstrukten aus (c); (e) Kultivieren der filamentösen Pilzzellen aus (d); (f) Selektieren von oder Durchmustern nach einem oder mehreren filamentösen Pilztransformanten, die ein gewünschtes charakteristisches Merkmal exprimieren; und (g) Isolieren des/der interessierenden filamentösen Pilztransformanten.Method for creating and screening or selecting a bank of polynucleotide sequences of interest in one filamentous Fungal cell, the method comprising: (a) Transform a culture of bacterial or yeast cells with a population the DNA vectors as in any one of claims 1 to 21, wherein the vector further comprises a nucleic acid sequence, which is a selection marker for Bacteria or yeasts and a replication initiation sequence for bacteria or yeasts encoded; (b) culturing the bacterial or yeast cells under selection pressure; (c) isolating the DNA constructs the transformant from (b); (d) transforming filamentous fungal cells with the DNA constructs from (c); (e) culturing the filamentous fungal cells from (d); (f) selecting or screening for one or several filamentous Mushroom transformants that a desired express characteristic feature; and (g) isolating the interesting filamentous Fungal transformants. Verfahren nach Anspruch 22, in welchem der Selektionsmarker für Bakterien oder Hefen ausgewählt ist aus der Gruppe von Genen, die ein Produkt kodieren, welches eine Resistenz gegenüber Biozid- oder viraler Toxizität, eine Resistenz gegenüber Schwermetalltoxizität oder Prototrophie oder Auxothrophe bereitstellt.The method of claim 22, wherein the selection marker for bacteria or yeasts is selected from the group of genes that encode a product that has a Resistance to Biocidal or viral toxicity, a resistance to Heavy metal toxicity or prototrophy or auxotrophs. Verwendung einer Replikationsinitiationssequenz für Pilze bei der Erstellung einer Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen.Use of a replication initiation sequence for mushrooms in creating a library of polynucleotide sequences of interest. Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Replikationsinitiationssequenz für Pilze eine Nukleinsäuresequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Replikationsinitiationssequenz, welche mindestens 50 % Identität mit der Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 besitzt, und welche in der Lage ist, die Replikation zu initiieren; (b) einer Replikationsinitiationssequenz, welche unter niedrigen Stringenzbedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 oder (ii) den jeweils komplementären Strängen hybridisiert, wobei die niedrigen Stringenzbedingungen durch Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42 °C in 5 × SSPE, 0,3 % SDS, 200 mg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA und 25 % Formamid definiert sind, und Waschbedingungen bei 50 °C für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,2 % SDS definiert sind; und (c) einer Untersequenz von (a) oder (b), wobei die Untersequenz Replikationsinitiationsaktivität besitzt.Use according to claim 24, wherein the replication initiation sequence for mushrooms a nucleic acid sequence is, selected from the group consisting of: (a) a replication initiation sequence, which at least 50% identity with the nucleic acid sequence from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and which are capable is to initiate replication; (b) a replication initiation sequence, which under low stringency conditions with (i) the nucleic acid sequence from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or (ii) the respective complementary strands hybridized, wherein the low stringency conditions by prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5x SSPE, 0.3 % SDS, 200 mg / ml sheared and denatured salmon sperm DNA and 25% formamide are defined, and wash conditions at 50 ° C for 30 minutes in 2 × SSC, 0.2% SDS are defined; and (c) a subsequence of (a) or (b), wherein the subsequence has replication initiation activity. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Replikationsinitiationssequenz aus einer filamentösen Pilzzelle, insbesondere von einem Stamm von Aspergillus, wie A. nidulans, erhalten wird.Use according to claim 25, wherein the replication initiation sequence from a filamentous Fungal cell, in particular from a strain of Aspergillus, such as A. nidulans, is obtained. Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Replikationsinitiationssequenz die in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 dargestellte Nukleinsäuresequenz besitzt oder eine jeweils funkionelle Untersequenz davon ist.Use according to claim 25 or 26, wherein the replication initiation sequence the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or is a respective functional subsequence thereof. Bank von interessierenden Polynukleotidsequenzen, welche Bank filamentöse Pilzzellen umfasst, die mit einer Population von DNA-Vektoren transformiert sind, wobei jeder Vektor umfasst: (i) ein Gen, das einen Selektionsmarker für Pilze und eine Replikationsinitiationssequenz für Pilze kodiert, wobei der Marker und die Replikationsinitiationssequenz innerhalb der Population nicht variieren; und (ii) eine interessierende Polynukleotidsequenz, wobei die Population von DNA-Vektoren mehr als eine Variante der Polynukleotidsequenz enthält.Bank of polynucleotide sequences of interest, which bank filamentous Fungal cells transformed with a population of DNA vectors are, each vector comprising: (i) a gene that is a selection marker for mushrooms and a replication initiation sequence for fungi, wherein the Marker and the replication initiation sequence within the population do not vary; and (ii) a polynucleotide sequence of interest, the population of DNA vectors being more than a variant of the Contains polynucleotide sequence. Bank nach Anspruch 28, wobei der Vektor weiterhin eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die einen Selektionsmarker für Bakterien oder Hefen und eine Replikationsinitiationssequenz für Bakterien oder Hefen kodiert.The bench of claim 28, wherein the vector is still a nucleic acid sequence includes a selection marker for bacteria or yeasts and encodes a replication initiation sequence for bacteria or yeasts.
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