DE69820053T2

DE69820053T2 - Stör-notokord zur verminderung der symptome / behandlung von arthritis

Info

Publication number: DE69820053T2
Application number: DE69820053T
Authority: DE
Inventors: Seiji Aoyagi; J. Stephen DeMICHELE; W. Paul JOHNS; B. Terrence MAZER
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-07-02
Filing date: 1998-06-23
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2018-06-24
Also published as: ATE254924T1; HK1028949A1; DE69820053D1; EP0988043B1; ES2212310T3; WO1999001147A1; CA2294090C; US5849336A; US6149946A; PT988043E; US6423347B1; CA2294090A1; DK0988043T3; EP0988043A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Notochord zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Symptome von Arthritis bei Säugetieren, und ausdrücklicher durch enterale Verabreichung. Die Erfindung nutzt bevorzugt Störnotochord, Kollagen abgeleitet von Störnotochord, oder Mischungen davon, um die klinischen Manifestationen von Arthritis zu unterdrücken. Die Erfindung betrifft auch enterale Zusammensetzungen, die Notochord und seine Strukturkomponenten enthalten, um Arthritis bei Säugetieren zu unterdrücken und/oder zu behandeln.
Hintergrund der Erfindung
Arthritis und besonders rheumatoide Arthritis (RA) ist eine schmerzhafte und oftmals lähmende Krankheit, die anfänglich zu geschwollenen und entzündeten Gelenken führt, aber häufig fortschreitet, um Gelenke zu verformen oder vollständig zu zerstören. Das ist ein Ergebnis davon, dass der Körper irrtümlicherweise seinen eigenen Knorpel angreift. Knorpel ist eine spezielle Art von Bindegewebe, welche bei menschlichen Erwachsenen in drei Formen vorgefunden wird: hyaliner oder glänzender Knorpel; elastischer Knorpel; und Faserknorpel. Hyaliner Knorpel ist der Typ, der in den ventralen Enden von Rippen, in Gelenken und in den Wänden der größeren Atemwege vorgefunden wird. Es ist der hyaline Knorpel, der eine niedrige Reibungsfläche bereitstellt, um Knochen daran zu hindern, während einer Bewegung an Knochen zu reiben. So wie Arthritis fortschreitet, wird Knorpel zerstört, und Knochen kann ebenfalls zu erodieren anfangen. Das führt zu starken Schmerzen und zur endgültigen Zerstörung des Gelenkes selbst.
Arthritis ist eine Gruppe von Krankheiten, die Gelenke und die Komponentengewebe betreffen. Mehrere Arten von Arthritis sind anerkannt und diese können in mehrere Gruppen durch ihren klinischen Verlauf oder ihre pathologischen Manifestationen unterteilt werden. Die verbreitetste Form von Arthritis ist Osteoarthritis (OA). Osteoarthritis wird hauptsächlich verursacht durch mechanische Zerstörung der Gelenke, entweder durch wiederholten Gebrauch von einzelnen Gelenken, wie zu sehen bei Athleten und körperlich arbeitenden Menschen, oder durch Überlasten von Strukturgelenken, wie zu sehen in den Kniegelenken von übergewichtigen Personen.
Die zweithäufigste Form dieser Krankheit ist RA, was eine chronische Multisystemkrankheit mit unbekannter Ursache ist. RA ist gekennzeichnet durch chronische Entzündung der Synovialhaut, verbunden mit beträchtlicher Erosion von sowohl Knorpel als auch Knochen, insbesondere in und um die Gelenke herum. RA wird gegenwärtig verstanden als eine Autoimmunkrankheit, in welcher der pathologische Prozess durch das Erscheinen eines unbekannten "rheumatoiden" Selbst-Antigens durch eine Antigen-darstellende Zelle zu beginnen scheint. Studien, die die Familiengeschichte angehen, zeigen eine genetische Prädisposition, worin eine einzelne Aminosäuresequenz in der dritten hypervariablen Region des HLA-DR-Moleküls ein genetisches Hauptelement ist, das Anfälligkeit für RA andeutet. Siehe Lipsky PE, "Rheumatoid Arthritis" in Harrisons' Principles of Internal Medicine, 13 Ausgabe, Mc.Graw-Hill, Inc., New York, NY.
Der T-Zell-Rezeptor an CD4⁺-T-Zellen, welcher das Ziel für das Antigen bildet, spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in dem Entzündungsprozess. Das Erscheinen des Antigens verursacht die Aktivierung von CD4^–-T-Zellen, mit der sich ergebenden Sekretion von Zytokinen wie Interleukin-2 (IL-2) und Interferong (IFN-g). Diese Zytokine induzieren eine klonale Expansion der T-Zellen und Aktivierung des Zytokinnetzwerkes. Diese Zytokine lösen die Produktion von Endotheladhäsionsmolekülen (wie ICAM-1) aus, deren Expression in rheumatoider Synovialhaut die Aktivierung von Entzündungszellen in den Gelenken steigert. Siehe Vitali C., Sciuto M., Bombardieri S., "Immunotherapy in Rheumatoid Arthritis: A Review", Int. J. Art Organs 1993; 16, 196–200.
Die moderne Therapie für arthritische Zustände beginnt mit nichtsteroiden entzündungshemmenden Medikamenten wie Aspirin, Anthranilsäure und Ibuprofen; und aggressivere Therapien schließen Krankheits-modifizierende antirheumatische Medikamente ein wie D-Penicillamin, Methotrexat und Sulfasalazin. Jedoch sind diese Behandlungen häufig ungenügend in ihrer Wirksamkeit und Verträglichkeit und verursachen eine breite Palette von ernsthaften Nebenwirkungen. Schwerere Formen der Krankheit können sogar einen operativen Eingriff erfordern.
(A) Orale Toleranz
Neuartige Therapien zur Behandlung von Arthritis umfassen Immunantwortmodifizierer, Gentherapie, Enzymhemmer, monoklonale Antikörper und Nahrungstherapie. Nahrungstherapie für Arthritis hat über die Jahre hinweg sehr viel Publizität erlangt. Auch wenn derzeit die wissenschaftliche Grundlage für Nahrungsarzneimittel immer noch zweifelhaft ist, gibt es zulässige Gründe für die Überlegung, ob Nahrungsmanagement die Krankheitsaktivität erfolgreich modifizieren könnte, wenn wir ihre Etiologie und Pathologie besser verstehen. "Orale Toleranz" ist ein seit langem anerkanntes Verfahren, um eine periphere Immunantwort zu induzieren. Sie wurde zuerst 1911 durch Wells beschrieben als ein Zustand, in welchem systemische Anaphylaxie bei Meerschweinchen verhindert wurde, indem sie zuvor mit Hühnereiproteinen gefüttert wurden. Siehe Wells H., "Studies on the Chemistry of Anaphylaxis III. Experiments with Isolated Proteins, Especially Those of Hen's Eggs", J. Inf. Dis. 1911 : 9: 147–151.
Insbesondere wird für orale Toleranz angenommen, dass sie ein idealer Kandidat ist, um als eine Behandlung von RA in Betracht gezogen zu werden wegen der Etiologie von RA als eine Autoimmunkrankheit. Oral verabreichte Autoantigene haben Wirksamkeit in mehreren experimentellen Autoimmunmodellen gezeigt einschließlich experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis, Uveitis, Myasthenie, Diabetes und Kollagen- und Adjuvans-induzierter Arthritis. Siehe Weiner H. L., Friedman A., Miller A., Khoury S. J., Al-Sabbagh A., Santos L., Sayegh M., Nussenblatt R. B., Trentham D. E., Hafler D. A. "Oral Tolerance: Immunologic Mechanisms and Treatment of Animal and Human Organ-Specific Autoimmune Diseases by Oral Administration of Antoantigens", Annu. Rev. Immunol. 1994; 12: 809–837.
Der Mechanismus, wie orale Toleranz funktioniert, ist zur Zeit unklar. Für die wichtigsten Mechanismen, durch welche ein oral verabreichtes Antigen Toleranz induziert, wird vermutet, dass sie über die Erzeugung von aktiver Unterdrückung oder von klonaler Anergie erfolgen.
Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) bei Versuchstieren ist das beste bekannte Tiermodell für humane RA. Siehe Durie F. H., Fava R. A., Noelle R. J., "Collagen-induced Arthritis as a Model of Rheumatoid Arthritis" , siehe Clin. Immun. and Immupath. 1994; 73: 11–18, und Staines N. A., Wooley P. H., "Collagen Arthritis – What Can it Teach Us? Brit. J. Rheum. 1994; 33: 798– 807. Sie wurde zuerst 1977 durch Trentham beschrieben, siehe Trentham D. E., Townes A. S., Kang A. H. "Autoimmunity tio Type II Collagen: An Experimental Model of Arthritis", J. Exp. Med. 1977; 146: 857–868, und es wurde für sie gezeigt, dass sie humaner RA ausreichend ähnelt, um jetzt als ein wichtiges experimentelles Werkzeug anerkannt zu sein. Sie wird generell in anfälligen Stämmen von Versuchstieren (wie Mäusen und Ratten) induziert durch Immunisierung mit heterologem Typ-II-Kollagen (CII), isoliert aus einer heterologen Spezies. Siehe Courtenay J. S., Dallman M. J., Dayyan A. D., Martin A., Mosedale B., "Immunization Against Heterologous Type II Collagen Induced Arthritis in Mice", Nature 1980; 283–665. Bei einem empfänglichen Stamm von Mäusen (DBA/1) löst Immunisierung mit CII eine kombinierte humorale und zelluläre Immunantwort aus, die auf Bindegewebe zielt, wo das Antigen vorwiegend zu finden ist. Unterschiede zwischen dem Tiermodell und der humanen RA schließen folgendes ein:

(1) Das Modell ist ein induzierter Zustand und ereignet sich deshalb nicht spontan wie bei Menschen;
(2) dem Modell mangelt es an extraartikulären (außerhalb des Gelenks) Manifestationen der humanen RA einschließlich subkutaner Knötchen und pulmonaler Fibrose; und
(3) die Induktion der Krankheit ist von schnellem Ausbruch in dem Modell, was sich von dem Ausbruch bei Menschen unterscheidet insofern, als dass es typischerweise Jahre dauert.

Nichtsdestotrotz ist CIA das beste verfügbare Tiermodell für humane RA.
Für die intragastritische Verabreichung von löslichem Typ-II-Kollagen (CII) vor der Immunisierung mit CII ist gezeigt worden, dass sie das Vorkommen von CIA in DBA/1 Lac J-Mäusen und WA/KIR-Ratten unterdrückt. Siehe Nagler-Anderson C., Bober L. A, Robinson M. E., Siskind G. W., Thorbecke G. J, "Suppression of the Type II Collagen-Induced Arthritis by Intragastric Administration of Soluble Type II Collagen", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83: 7443–7446, und Thompson H. S. G, Harper N., Devan D., Staines N. A., "Suppression of CIA by Oral Administration of Type II Collagen: Chances in Immune and Arthritic Responses Mediated by Active Peripheral Suppression", Autoimmunity 1993; 16: 189–199.
Für Adjuvans-induzierte Arthritis bei Lewis-Ratten wurde ebenfalls gezeigt, dass sie durch orale Verabreichung von löslichem CII unterdrückt wird. Siehe Zhang Z. J., Lee C. S. Y., Lider 0., Weiner H., "Suppression of Adjuvant Arthritis in Lewis Rats by Oral Administration of Type II Collagen", J. Immunol. 1990; 145: 2489–2493. Der Typ des Immunogens sowie der Typ des Toleragens scheinen bei der Ausübung ihrer Wirkung beim Induzieren und Schützen des Tiers sehr wichtig zu sein.
Knorpel wird produziert durch Zellen mit dem Namen Chondrozyten, welche eine Matrix von Makromolekülen synthetisieren und um sich selbst herum ablagern, die als Kollagen und Proteoglykane bekannt sind. Eine bemerkenswerte Funktion von Knorpelgewebe ist, dass es sich selbst als Reaktion auf mechanische Kräfte, die auf das Gewebe aufgebracht werden, ergänzt.
Viele Kollagentypen sind identifiziert worden, welche das robuste bindende Merkmal von Knorpel bereitstellen. Die Proteoglykane bestehen hauptsächlich aus den hochmolekularen Molekülen, die als Glykosaminoglykane (GAG) bekannt sind, welche Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat einschließen. GAGs waren früher bekannt als Mucopolysaccharide. Einen Überblick über GAGs und deren Anwendung in der OA-Therapie wird präsentiert von Paroli, et al. in "A Pharmacological Approach to Glycosaminoglycans", Drugs Expth. Clin. Res. VII(1) 9–20 (1991).
Einen Überblick über die verschiedenen Typen von Kollagen ist zu finden in Protein Profile, Vol. 1, 1994, Seite 550–571; P. Sheterline, Herausgeber. Einen Überblick über die Leistungsfähigkeit des Immunsystems, zwischen eigenen und nicht eigenen Strukturen zu unterscheiden, und eine Besprechung darüber, wie das Immunsystem normalerweise mit Knorpel wechselwirkt und wie solche Wechselwirkungen zu Arthritis führen können, wird bekannt gemacht durch Holmdahl, et al., in einem Artikel mit dem Titel "Autoimmune Recognition of Cartilage Collagens", Annals of Medicine 25: 251–264, 1993. Typ-II-Kollagen ist möglicherweise das beste bekannte orale Toleragen für Arthritis, es könnten jedoch andere mögliche Toleragene existieren, die von nichtknorpeligen Geweben abgeleitet sind, wie Glaskörper, Neuralrohr und Neuralretina.
US-Patent 5.529.786 für Moore offenbart die Verwendung von Tiergewebe, das eine therapeutische Menge an CII enthält, für die Behandlung von RA bei Menschen. Dieses Patent beschreibt das Tiergewebe als vorzugsweise Hühnerknorpel, der von Hühnern erhalten wurde, die weniger als ein Jahr alt waren. Andere offenbarte Tiergewebe sind Rinderknorpel, der Glaskörper von Augen und eine Vielfalt von Tieren.
US-Patent 4.473.551 für Schinitsky offenbart eine Zusammensetzung für die Behandlung von entzündlichen Krankheiten (wie RA, OA, Akne, Schuppenflechte und dergleichen), welche Tierknorpel und Glukosamin umfasst. Dieses Patent beschreibt den Synergieeffekt von einem Glukosamin und Knorpel, von welcher Quelle auch immer abgeleitet, einschließlich Haifische und andere Meeresbewohner, Rinder, Schweine, Hühner und dergleichen.
US-Patent 5.075.112 für Lane offenbart die Verwendung von fein verteiltem Haifischknorpel zum Hemmen von Tumorwachstum, Arthritis, insbesondere RA, und entzündlichen Krankheiten mit einer vaskulären Komponente. Dieses Patent setzt Haifischknorpel nicht mit irgend einem anderen Säugetier- oder Vogelknorpel gleich und schlägt dies auch nicht vor.
US-Patent Nr. 5.399.347 für Trentham, et al. offenbart die Verwendung einer hoch aufbereiteten Komponente aus Knorpel, vollständig CII-Protein, für die Behandlung von RA. EP0254289B1 durch Koepff, et al. offenbart die Behandlung von Arthritis durch die Verabreichung von enzymatisch hydrolysiertem Kollagen aus Tierhäuten, Tierknochen, raffiniertem Bindegewebe oder Gelatine (Typ-I-Kollagen) mit einem mittleren Molekulargewicht von 10 bis 80 KD.
Arthritis betrifft schätzungsweise 40.000.000 Menschen (15% der Bevölkerung) in den Vereinigten Staaten von Amerika. Bei einer steigenden Lebenserwartung der Bevölkerung bildet Arthritis eines der größten bestehenden medizinischen, sozialen und wirtschaftlichen Probleme. Die vorliegende Erfindung fördert den Stand der Technik für Arthritisbehandlungen und bietet mehrere Vorteile für derzeit akzeptierte Therapien.
(B) Notochord
Wie unten besprochen und gezeigt werden wird, ist Notochord ein einzigartiges Gewebe für primitive Gruppen von Osteichthyes wie Stör und Neunauge. Notochord erscheint in dem Postgastrulationsembryo als ein sehr spezialisiertes Mesoderm. Bei Wirbeltieren dient Notochord als ein Kern, um welchen sich Mesodermzellen sammeln, um die Wirbel zu bilden (d. h. das Notochord ist die Vorstufe der Wirbelsäule), aber es verschwindet zum Ende des Embryonalstadiums. In den primitivsten Chordaten jedoch bleibt das Notochord als ein primitiver Ersatz für eine Wirbelsäule erhalten. Stör und Neunauge behalten eine signifikante Menge an Notochordgewebe in ihrer Wirbelsäule selbst im Erwachsenenstadium bei. Reguläres Mesoderm ruft die Bindegewebe des Körpers hervor; wie Hyalinknorpel und CII darin. Tatsächlich kann Störnotochordkollagen eine Vorläuferform von CII sein, aber es ist sicherlich nicht CII. Notochord und Knorpel unterscheiden sich evolutionär, entwicklungsmäßig, funktionell und anatomisch voneinander. Diese Unterschiede bei den Merkmalen werden weiter unten aufgezeigt. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von intaktem und ganzen Störnotochord sowie seiner strukturellen und chemischen Komponenten (d. h. Kollagen abgeleitet von dem Notochord) für die Behandlung von RA und OA.
Eine Stütze für die Position des Anmelders, dass Notochord sich von Knorpel unterscheidet, ist zu finden in einem Artikel von Miller und Mathews mit dem Titel "Characterization of Notochord Collagen", veröffentlicht in Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 60, Nr. 1, 1974, und in einem Artikel, veröffentlicht durch Mathews, mit dem Titel "Comparative Biochemistry of Chondroitin Sulfate-Proteins of Cartilage and Notochord", veröffentlicht in Biochem. J., (1971), 125, 37–46. Diese Publikationen besprechen die Charakterisierung von Störnotochord durch chromatographische Eigenschaften, Aminosäurezusammensetzung, Kohlenhydratgehalt, Cyanogenbromidspaltprodukte der Komponente a-Kette, den Molekularparametern von tryptisch-chymotryptischen Hydrolysaten von Chondroitinsulfat-Protein und die Fraktion von Chondroitinsulfat-Protein in einem -Caesiumchloriddichtegradienten. Diese Analysen zeigen einige der chemischen Ähnlichkeiten auf, aber wichtiger, sie zeigen die verschiedenen chemischen und strukturellen Unterschiede zwischen Knorpel und Notochord.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine grafische Darstellung der Daten, die aus den fortlaufenden Beobachtungen von Beispiel IV gesammelt wurden.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung ist allgemein gerichtet auf die enterale Verabreichung von Notochord und Extrakten von Notochord für die Behandlung von Arthritis, besonders RA. Die bevorzugte Quelle für Notochord ist Stör. Störnotochord ist ohne weiteres erhältlich, wirksam und unterscheidet sich von Hühner- und Rinderknorpel. Stör wird wegen seines Fleisches gegenwärtig in Gefangenschaft aufgezogen und folglich kann die Qualität des Notochords (nämlich das Fehlen von Schadstoffen) kontrolliert werden. Ein Vorteil bei der Verwendung von Störnotochord und den davon abgeleiteten Extrakten ist die Einfachheit beim Kombinieren des Materials mit Nahrungskomponenten, die ebenfalls wirksam bei der Unterdrückung von RA sind. Ein weiterer Vorteil ist, dass das intakte Störnotochord nicht einer rigorosen regulatorischen Genehmigung unterzogen wird, wie es bei einem Arzneistoff der Fall wäre.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, bedeutet der Ausdruck "Extrakte von Notochord" die Komponenten, die aus Notochord unter Verwendung geeigneter Extraktionsverfahren extrahiert werden können, einschließlich von zum Beispiel Notochord-Kollagenen und GAG (einschließlich Glukosamin und Chondroitinsulfat).
Es wird eine Zusammensetzung zum oralen Verzehr durch Säuger offenbart, die mindestens eine Komponente umfasst gewählt aus der Gruppe bestehend aus Notochord, Extrakten von Notochord und Mischungen davon. Die Zusammensetzung kann in der Form einer Tablette, einer Pille, einer Kapsel, einer Flüssigkeit (d. h. wässerige oder ölige Suspension), einer zubereiteten Nahrung oder von Nahrungsartikeln, einer ernährungsmäßig vollständigen enteralen Formel oder in der Form einer Nahrungsergänzung sein.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können 10 μg bis 1000 mg Notochord oder Notochordextrakt pro Gramm Zusammensetzung enthalten. Wenn die Zusammensetzung in der Form einer Flüssigkeit ist (d. h. einer wässerigen Suspension oder einer öligen Suspension), kann die Notochordkomponente 10 μg bis 700 g pro Liter, vorzugsweise 10 μg bis 500 g pro Liter, und am besten 50 μg bis 500 mg pro Liter umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die flüssige Zusammensetzung Notochordkollagen bei einer Konzentration von 10 μg bis 10,5 g pro Liter; 10 g bis 20 g Glukosamin pro Liter; oder 8 g bis 16 g Chondroitinsulfat pro Liter.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Zusammensetzung in der Form einer Tablette, Kapsel oder Pille, welche 1,0 μg bis 2,0 g Notochord oder ein Extrakt von Notochord enthält. In einer bevorzugteren Ausführungsform enthält die Pille oder Tablette 50 μg bis 500 mg des Notochords und/oder der Notochordextrakte.
Es wird weiter die Verwendung von Notochord offenbart zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Reduktion der Häufigkeit der Symptome von Arthritis, speziell RA bei Säugetieren, durch orale Verabreichung an das Säugetier für eine Zeit, die wirksam ist, um solche Symptome zu lindern.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Menge von pro Tag verzehrtem Notochord für einen Menschen von 70 kg von 10 μg bis 700 g pro Tag reichen. Besser kann die Dosierung von Notochord von 10 μg bis 11 g pro Tag reichen und am besten von 10 μg bis 1 g pro Tag. Kollagen, als ein Extrakt von Notochord, kann einem 70-kg-Menschen in einer Menge von 1 μg bis 1,05 g pro Tag verabreicht werden. Besser ist die Verabreichung von 1 μg bis 100 mg Kollagen, aufbereitet aus Notochord, pro Tag. Der beste Dosierungsbereich für aus Notochord aufbereitetes Kollagen ist 1 μg bis 10 mg pro Tag. Glukosamin, aufbereitet aus Notochord, wird typischerweise bei einem Pegel von 1000 mg bis 2000 mg pro Tag pro 70 kg Lebendgewicht eines Menschen verabreicht. Das Chondroitinsulfat, aufbereitet aus Notochord, wird bei einem Pegel von 800 mg bis 1600 mg pro Tag verabreicht. Diejenigen, die Fachleute sind, werden erkennen, dass die Rate der Verabreichung der Notochordhaltigen Zusammensetzung mit vielen Faktoren variieren wird und dass optimale Dosierungspegel ohne übermäßiges Experimentieren abgeleitet werden können.
Die Zusammensetzung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung sind auch anwendbar auf nicht zur menschlichen Rasse gehörende Säugetiere wie Hunde und Pferde. Viele Haustiere leiden an RA und sie würden von der hier beschriebenen Entdeckung profitieren. Die Dosierungspegel für einen Menschen von 70 kg, die in dem Abschnitt oben ausgeführt wurden, können umgewandelt werden zu einem Dosisbereich pro Kilogramm Körpergewicht und dieser Bereich kann für Tiere verwendet werden. Zum Beispiel kann die Menge von Notochord, die täglich von einem Hund von 20 kg verzehrt wird, von 2,9 μg bis 200 g pro Tag reichen.
Weiter offenbart wird die Verwendung von therapeutischen Mengen von Notochord, das von einem Tier der Ordnung Osteichthyes oder der Familie Acipenseridae, vorzugsweise der Gattung Acipenser, entnommen und unter reinen oder sterilen Bedingungen zerkleinert wurde, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von RA. Das Notochord wird vorzugsweise vor der Lagerung und Aufnahme mit einem Sterilisationsmittel oder durch ein Sterilisationsverfahren behandelt. Die orale Verabreichung des Notochords oder einer Komponente davon kann mit anderen essbaren Komponenten erreicht werden, wie in einer Nahrungsergänzung, einer zubereiteten Nahrung oder in einer ernährungsmäßig vollständigen Formel.
Die drei Hauptspezies von Stör, die derzeit in der Wassertierzuchtbranche gezüchtet werden, sind weißer Stör (Acipenser transmontanus), italienischer Stör (Acipenser naccarii) und sibirischer Stör (Acipenser baeri). Stör ist ein Knorpelfisch der Familie Acipenseridae, der keine harten Knochen hat. Stör ist in der nördlichen Temperaturzone des Planeten weit verbreitet.
Stör ist eine der ältesten Kreaturen, die auf der Erde gefunden wurde, und hat sich in den letzten 300 Millionen Jahren nicht verändert. Weißer Stör, der größte Frischwasserfisch in Nordamerika, kann bis zu 2.000 Pfund erreichen. Stör, wonach einst zur Kaviarproduktion gesucht wurde, wird in jüngster Zeit wegen der Qualität seines Fleisches geschätzt. Weißer Stör wird jetzt in geschlossenen Behältnissen in kreislaufgeführtem Vertiefungswasser auf Farmen gezüchtet und ist von zahlreichen kommerziellen Quellen erhältlich (z. B. Stolt Sea Farm California, L. L. C., Elverta, Kalifornien, unter dem Handelsnamen Belusa^® White Sturgeon).
Während das Notochord von Stör hier bevorzugt für die Behandlung/Reduktion von Arthritis offenbart wird, wird in Betracht gezogen, dass das Notochord von anderen Chordaten ebenfalls nützlich sein würde. Chordate sind Tiere vom Stamm Chordata und weisen in mindestens einem Stadium ° ihrer Entwicklung ein Notochord, ein dorsal gelegenes zentrales Nervensystem und Kiemenspalten auf.
Für das Störnotochord und Extrakte davon, die in dieser Erfindung beschrieben sind, ist von den Erfindern gezeigt worden, dass sie wirksam bei der Behandlung von experimentell induzierter Arthritis bei Mäusen sind. Wie oben besprochen sind die Mäuse- und Rattenmodelle für Arthritis in der medizinischen Gemeinschaft als hoch prädiktiv für die Wirksamkeit bei Menschen akzeptiert.
BEISPIEL 1:
Vergleichende Untersuchung für verschiedene Kollagen-haltige Zusammensetzungen
Die chemische Heterogenität von Störnotochord aus anderen Kollagen-haltigen Geweben wie Störknorpel, Hühnerknorpel und Rinderknorpel beruht auf Variationen von Hydroxylation, Aminosäurekonstituenten, Glykosylierungsmustern, Quervernetzung, Konformation und dergleichen. Die folgenden Experimente (Experimente 1.1 bis 1.4) wurden durchgeführt, um Störnotochord, Hühnerbrustbeinknorpel und das jeweils daraus aufbereitete Kollagen für Aminosäureprofil, simulierten Magenfluidaufschluss, Trypsinaufschluss und Hexosaminfreisetzung zu vergleichen.
EXPERIMENT 1.1: Aminosäureprofil
In diesem Experiment wurde die Aminosäurezusammensetzung von Störnotochord mit der Aminosäurezusammensetzung von Hühnerbrustbeinknorpel verglichen. Die Proben des Störnotochords wurden erhalten von Stolt Sea Farm California, L. L. C aus Elverta, CA, und der Hühnerknorpel wurde erhalten von Tyson Farms, Inc. aus Springdale, Arkansas.
Ein gleiches Gewicht von jeder Probe wurde mit Flüssigstickstoff gefroren und pulverisiert. Die Proben wurden in 22 Stunden bei 110°C in 6 M HCl zu Aminosäuren hydrolysiert. Die Aminosäuren wurden durch Ionenaustauschchromatographie, getrennt, mit Ninhydrin derivatisiert und mit einem Kolorimeter bestimmt. Das Aminosäureprofil wurde bestimmt unter Verwendung eines Aminosäureanalysators Beckman Modell 6300. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 3 als Rückstände pro 100 dargestellt.
TABELLE 3 Vergleichende Aminosäurezusammensetzung: Hühnerknorpel gegen Störnotochord (Rückstände/100)
Aus Tabelle 3 kann gesehen werden, dass der Proteingehalt auf einer Trockengewichtsbasis etwa der gleiche für jede Probe ist, aber die Häufigkeiten von Serin, Phenylalanin, Lysin, 4-Hydroxyprolin (HPro) und 5-Hydroxylysin (HLys) unterscheiden sich am beträchtlichsten.
Zusätzlich wurde die Aminosäurezusammensetzung von Kollagen, das aus Störnotochord und Rinder-CII (Rinder-Typ-II-Kollagen von Sigma) isoliert wurde, verglichen mit der Aminosäuresequenz von Hühner-CII (Hühner-Typ-II-Kollagen von Sigma). Das Störnotochord-Kollagen wurde isoliert wie in Beispiel V unten beschrieben. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 4 als Rückstände pro 100 aufgeführt.
TABELLE 4 Vergleichende Aminosäurezusammensetzung (Rückstände pro 100)
Tabelle 4 fasst die Aminosäurezusammensetzung für aufbereitetes Hühner-CII, Rinder-CII und Störnotochord-Kollagen zusammen. Die Aminosäureprofile von aufbereitetem Hühner-CII und aufbereitetem Rinder-CII sind ähnlich, jedoch gibt es wesentliche Unterschiede zwischen aufbereitetem Hühner-CII und aufbereitetem Störnotochord-Kollagen (nämlich Serin, Isoleucin und Leucin).
Tabelle 5 veranschaulicht weiter signifikante Unterschiede zwischen den zwei Geweben (Störnotochord und Hühnerknorpel) und den drei aufbereiteten Kollagenen (Hühner-CII, Rinder-CII und Störnotochord-Kollagen).
TABELLE 5 Aminosäureverhältnis-Analyse
Ein Fachmann auf dem Gebiet der Kollagenchemie wird die Bedeutung von HPro (zum Bereitstellen von Stellen zur Quervernetzung innerhalb des Kollagens) und von HLys (zum Bereitstellen von Bindungsstellen für Glykane, Glykosamine und dergleichen, was sich auf Toleragenität ähnlich auswirkt) und von deren relativen Pegeln (da dieses Verhältnis eine Hauptdeterminante für Kollagentypen ist) schnell richtig einschätzen. Somit sind die Unterschiede in den Pegeln dieser Aminosäuren signifikant. Zusätzlich ist das HLys-zu-HPro- Verhältnis in Dorsch-Typ-I-Kollagen und Rinder-Typ-III-Kollagen 0,11 bzw. 0,07 (Daten nicht aufgeführt).
Des weiteren sind die kumulativen absoluten Prozentpunktunterschiede zwischen den Kollagenen größer zwischen Hühner-CII und Störnotochord-Kollagen (263 Prozentpunkte) als zwischen Hühner-CII und Rinder-CII (126 Prozentpunkte). Das bedeutet, dass bei der chemischen Zusammensetzung Rinder-CII näher an Hühner-CII ist als Störnotochord-Kollagen an Hühner-CII. Ähnlich betrug der Unterschied in der Aminosäurezusammensetzung zwischen Hühnerknorpel und Störnotochord 228 Prozentpunkte, was anzeigt, dass sie zueinander sehr unterschiedliches Kollagen enthalten. Diese Erkenntnisse implizieren, dass Störnotochord und das Kollagen, das darin zu finden ist, sich von Hühnerknorpel und von Typ-II-. Kollagen ("CII") im Allgemeinen ausgesprochen unterscheiden.
Wie zuvor angemerkt, rufen diese Unterschiede beträchtliche Zweifel hervor, dass Störnotochord auf die gleiche Art und Weise wie Hühnerknorpel oder Hühner-CII in einem CIA-Modell von RA funktionieren würde. Experimente 1.2 bis 1.4 verstärken die Unterschiede zwischen Notochord und anderen Geweben.
EXPERIMENT 1.2: Magenfluidaufschluss
In diesem Experiment wurden pulverisierte Präparate von Hühnerknorpel und Störnotochord in USP-simuliertem Magenfluid (United States Pharmacopoeia, 23, 1994, Seite 2053) suspendiert und bei 37°C 3 Stunden lang inkubiert. Ein Teil von jedem Aufschluss wurde in festgesetzten Intervallen filtriert, und die Filtrate wurden auf HPro und HLys analysiert, welche als Marker für Kollagen betrachtet werden. Die Filtrate wurden auch durch Aufschlusschromatographie analysiert. Die Aufschlusschromatogramme wurden auf einem Messgerät Hewlett-Packard Modell 1090M generiert mit einer Shodex-Proteinsäule KW-803; 8 × 300 mm; Partikelgröße 7 μm; Waters P/N 35946 und einer 20-μl-Injektion. Eine mobile Phase von 600 Volumen Wasser, 400 Volumen Acetonitril und 0,8 Volumen Trifluoressigsäure wurde bei Umgebungstemperatur bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,3 ml/Minute 60 Minuten lang verwendet. Detektion erfolgte durch UV-Extinktion bei 214 nm.
Tabelle 6 zeigt die Kollagensolubilisierung (gemessen als Konzentration von HPro und HLys über der Zeit) in dem Aufschlussfluid nach Filterung durch eine 0,45-μm-Polysulfonmembran.
TABELLE 6 Simulierter Magenfluidaufschluss Vergleich Störnotochord gegen Hühnerbrustbeinknorpel
Tabelle 6 zeigt, dass in simuliertem Magenfluid Notochord bei einer Geschwindigkeit löslich ist, die die Geschwindigkeit der Hühnerknorpelsolubilisierung übersteigt. Ohne an irgendeine besondere Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass Notochord schneller löslich ist auf Grund seiner weniger entwickelten Matrix aus Chondroitinsulfatketten, Proteoglykanen und Polypeptiden. Weiter würden diese Daten vorschlagen, dass Notochord potentiell einen Vorteil gegenüber Knorpel haben könnte als ein enteral verabreichtes Toleragen, da es schneller durch Magensäfte gelöst wird. Wenn Notochord schneller löslich ist, kann es theoretisch die erforderlichen Dosierungen verringern und/oder die therapeutische Wirkung beschleunigen.
Der Größenausschlußchromatograph zeigte für 0-Minuten-Aufschlüsse einen Peak bei etwa 43 Minuten für Hühnerknorpel an, welcher für Notochord im Wesentlichen fehlt. Bei 45 Minuten Aufschluss beginnen die Notochord- und Hühnerknorpelaufschlüsse wesentlich zu divergieren. Es gibt zum Beispiel wesentliche Peaks zwischen etwa 30 Minuten und 40 Minuten für den Notochordaufschluss, die bei Hühnerknorpelaufschluss entweder fehlen oder stark verringert sind. Am interessantesten ist ein Peak bei etwa 43 Minuten, worin der Notochordpeak etwa ein Fünftel der Größe des Hühnerknorpelpeaks aufweist. Ähnliche Unterschiede erscheinen auch für den 90- und den 180-Minuten-Aufschluss. Dieses Experiment zeigt weiter die wesentlichen und merklichen Unterschiede zwischen dem Störnotochord und dem Hühnerknorpel.
EXPERIMENT 1.3: Trypsinaufschluss
Pulverisierte Zubereitungen von Hühnerknorpel und Notochord wurden suspendiert in 0,05 M TRIS-Puffer, pH 7,5, der Trypsin (Sigma Typ XIII) enthält bei 1 mg/14 mg Trockengewebe, und bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert. Jeder Aufschluss wurde filtriert und die Filtrate wurden "Peptid-kartiert" durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Hewlett-Packard Modell 1090M mit Vydac C18-Protein-und-Peptid-Säule; 4,6 × 250 mm; Partikelgröße 5 μm (The Separations Group; P/N 218TP54) und zwei mobile Phasen: mobile Phase A war 0,08% Trifluoressigsäure in Wasser und mobile Phase B war 0,08% Trifluoressigsäure in Acetonitril. Ein Injektionsvolumen von 25 μl strömte mit 0,8 ml/Minute bei 40°C 90 Minuten lang gemäß dem folgenden Elutionsgradienten. Detektion erfolgte durch UV-Extinktion bei 214 nm und bei 280 nm.
Gradientenelutionsprogramm:
Eine signifikante Zahl von qualitativen und quantitativen Unterschieden wurde zwischen den Notochord- und Knorpelaufschlüssen nachgewiesen, womit angezeigt wird, dass das Trypsin die Gewebe an verschiedenen Stellen spaltete. Diese Tatsache zeigt an, dass sich die Aminosäuresequenzen in diesen Geweben deutlich voneinander unterscheiden. Ausdrücklicher, bei einer Detektion bei 214 nm und bei etwa 17 Minuten bildete Hühnerknorpel einen Peak, der mehr als zweimal so groß war wie der Peak für Störnotochord bei der gleichen Zeit. Bei Detektion bei 280 nm bildete der Knorpel einen Peak bei etwa 50 Minuten, der um mindestens eine Größenordnung größer war als der entsprechende Peak für Notochord.
EXPERIMENT 1.4: Hexosaminfreisetzung
In diesem Experiment wurden Trifluoressigsäure(TFA)-Aufschlüsse von Hühnerknorpel und Störnotochord durchgeführt, um den Galactosamin- und Glukosamingehalt von jedem Gewebe zu bewerten. Galactosamin und Glukosamin sind monomere Komponenten der GAG-Coplymersynthese. Hexosamingehalte können auf ein immunologisches oder Toleragenpotential eines Gewebes bezogen werden.
Pulverisierte Zubereitungen von jedem Gewebe wurden hydrolysiert, und das Galactosamin und Glukosamin, das durch jedes Gewebe freigesetzt wurde, wurden durch HPLC als AQC(6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat)-Derivate gemessen. Die Hydrolyse wurde 14 Stunden lang bei 120°C in 1,35 M TFA durchgeführt. Die Galactosaminkonzentrationen und deren Chondroitinsulfat-Äquivalente (Chondroitinsulfat ist ein Copolymer von N-Acetylgalactosaminsulfat und Glucuronsäure) sowie die Glukosaminkonzentrationen und deren Hyaluronsäure-Äquivalente (Hyaluronsäure ist ein Copolymer von N-Acetylglykosamin und Glucuronsäure) sind in Tabelle 7 dargestellt. Die Hexosamine, die durch TFA-Hydrolyse freigesetzt wurden, wurden getrennt und durch HPLC detektiert unter Verwendung eines Hewlett-Packard Modell 1090M und einer Brownlee Spher-5-RP-8-Säule; 4,6 × 250 nm; Partikelgröße 5 μm (Alltech P/N 141033) und zwei mobile Phasen: mobile Phase A war 0,15 M Natriumacetat, 0,019 M Triethylamin, 10 mg/l Dinatrium-EDTA; pH 5,0; und mobile Phase B war 70 Volumen A + 30 Volumen Acetonitril. Injektionsvolumen von 20 μl strömte mit 0,6 ml/Minute bei 40°C 50 Minuten lang gemäß dem folgenden Elutionsgradienten. Detektion erfolgte durch UV-Extinktion bei 248 nm.
Gradientenelutionsprogramm:
Dieses Experiment ist ein Mittel zum Vergleich des Proteoglycangehalts von jedem Gewebe, was ein ungefähres Maß für dessen Charakter als Immunogen/Toleragen ist. Die Daten, die in Tabelle 7 dargestellt sind, veranschaulichen deutlich den Unterschied in den zwei Geweben.
TABELLE 7 Hexosaminfreisetzung Vergleich Störnotochord gegen Hühnerbrustbeinknorpel Hexosamin freigesetzt pro Gramm Trockengewebe*
Zusammengefasst zeigen die in den Experimenten 1.1 bis 1.4 dargestellten Daten viele bedeutende Unterschiede zwischen Hühnerknorpel und Störnotochord: (1) Aminosäurezusammensetzung; (2) Peptide aus Hydrolyse beruhend auf simuliertem Magenfluidaufschluss; (3) Aminosäuresequenz beruhend auf Trypsinaufschluss; und (4) Proteoglycangehalt. Zusätzlich unterschied sich Kollagen, das aus Störnotochord aufbereitet war, signifikant von Rinder-CII.
Trotz der obigen Demonstration, dass Störnotochord und sein Kollagen sich qualitativ und quantitativ von Hühnerknorpel und darin zu findendem CII unterscheidet, glauben die vorliegenden Erfinder, dass durch Erforschen von Notochord seine Wirksamkeit erwiesen wurde, da Notochord hoch auf schließbar, niedrig von den Kosten und aus einer stark kontrollierten Umgebung erhältlich ist. Die folgenden Beispiele vergleichen die Aktivität von Störnotochord und daraus abgeleitetem Kollagen mit verschiedenen Kollagen-haltigen Geweben einschließlich Hühnerknorpel. Alle folgenden Beispiele wurden in Übereinstimmung mit den aktuellen Richtlinien zum Tierschutz durchgeführt.
BEISPIEL II: Protektive Wirkung
2.1. Protektive Wirkung von Störnotochord
Diese Beispiele wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit von Störnotochord beim Schutz von Mäusen vor Kollageninduzierter Arthritis (CIA) zu untersuchen. Weibliche Mäuse vom Stamm DBA/1 Lac J, ungefähr 6–8 Wochen alt, wurden erhalten von Jackson Laboratories aus Bar Harbor, Maine. Drei Gruppen von 20 Mäusen pro Gruppe wurden an ihre Umgebung 7 Tage lang akklimatisiert. Ein Standardmäusefutter (Purina Certified Mouse Chow Nr. 5015; 11 Gew.-% Fett; Kollagen-frei) und Wasser wurde allen Tiere zum Verzehr nach Belieben bereitgestellt.
An den Tagen –10, –7, –5 und –2 vor der Immunisierung wurden die Mäuse durch eine von drei Testzusammensetzungen sensibilisiert: Rinderserumalbumin (BSA, ein toleragenes inertes Protein in CIA), Barschhautgelatine oder Störnotochord. Rinderserumalbumin (ein Protein abgeleitet von Nicht-Bindegewebe) und Barschhautgelatine (ein Protein abgeleitet von einem anderen Bindegewebe, das Typ-I-Kollagen von einem Fisch enthält) dienten als negative Kontrollen. Störnotochord wurde von farmgezüchtetem Stör erhalten und in flüssigem Stickstoff pulverisiert. Der Gehalt von jeder Testzusammensetzung wurde auf eine Dosis von 300 μg Protein auf Basis des Proteingehalts (einschließlich Kollagen) ausgeglichen. Testartikel wurden in 0,01 M Essigsäure gelöst/suspendiert und 0,3 ml wurden pro Dosis jeder Maus mit einer Fütterungsnadel mit Kugelspitze verabreicht.
Am Tag 0 wurden die Mäuse auf der Basis des Schwanzes mit 100 μg Rinder-CII immunisiert, welches in komplettem Freund-Adjuvans (CFA) emulgiert war. An Tag 7 wurde eine zweite Auffrischdosis von 100 μg Rinder-CII in CFA auf dem gleichen Weg verabreicht. An Tag 14 wurde den Mäusen 100 μg Lipopolysaccharid (LPS) subkutan injiziert. Dieses Protokoll stellt eine sanfte Induktion von CIA dar.
Die Mäuse wurden täglich auf den Ausbruch von CIA inspiziert, gekennzeichnet durch Erytheme und Ödeme. Extremitäten wurden klinisch bewertet und auf einer Skala von 0 bis 3 eingeordnet (0, Fehlen von Arthritis; 1, leichte Schwellung und Erytheme; 2, Schwellung und Erytheme sowohl von Fußwurzel als auch Fußknöchel; 3, Ankylose und Knochendeformation). Mäuse, die keine Arthritis entwickelten, wurden als negativ für Arthritis markiert. Alle Mäuse wurden an Tag 50 durch CO₂ eingeschläfert.
An den Tagen 20, 28, 40 und 50 hatte die Gruppe, die mit Störnotochord gefüttert wurde, folgerichtig weniger Tiere mit CIA als die Gruppen, die mit BSA oder Barschhautgelatine gefuttert wurden (siehe Tabelle 8). Der prozentuelle Ausbruch der Krankheit, berechnet auf der Basis von Tag-50-Daten, zeigte, dass 78% und 79% der Mäuse, die mit BSA bzw. Barschhautgelatine gefüttert wurden, CIA hatten, während nur 58% der Mäuse, die mit Störnotochord gefüttert wurden, CIA zeigten. Weiterhin war der mittlere Tag für den Ausbruch von CIA für die Gruppe, die mit Störnotochord gefüttert wurde, um 13 Tage verzögert im Vergleich zu den negativen Kontrollgruppen. Die mittlere Schwerebewertung war am höchsten für die Gruppe, die mit Barschhautgelatine gefüttert wurde, gefolgt durch die BSA-gefütterte Gruppe, und die Störnotochord-gefütterte Gruppe hat die niedrigste Schwerebewertung. Die hier aufgeführten Daten legen nahe, dass Störnotochord bei der Verzögerung und Dämpfung von CIA im Vergleich zu BSA oder Barschhautgelatine wirksam ist.
Tabelle 8
2.2 Schutzwirkung von Störnotochord – Stärkere Induktion von CIA
Um die Wirksamkeit von Störnotochord beim Schutz von Mäusen vor CIA zu bewerten, wurde dieses Experiment auf eine ähnliche Art und Weise wie in Beispiel 2.1 durchgeführt, außer dass das Immunisierungsprotokoll leicht modifiziert wurde. Das experimentelle Protokoll, das in diesem Experiment eingesetzt wurde, stellt eine stärkere Induktion von CIA im Vergleich zu der von Beispiel 2.1 dar.
Die Mäuse waren vom Stamm DBA/1 Lac J, geliefert durch Jackson Laboratories aus Bar Harbor, Maine. Alle Mäuse waren weiblich und etwa 6–8 Wochen alt. Drei Gruppen von 15–18 Mäusen , pro Gruppe wurden an ihre Umgebungen 7 Tage lang akklimatisiert. Ein Standardmäusefutter und Wasser wurden zum Verzehr nach Belieben bereitgestellt.
An den Tagen –10, –7, –5 und –2 vor der Immunisierung wurden die Mäuse durch eine von drei Testproben sensibilisiert: 1) Bindemittel; 2) Barschhautgelatine; und 3) Störnotochord. Barschhautgelatine (Typ-I-Kollagen) wurde als eine negative Kontrolle verwendet. Störnotochord wurde von farmgezüchtetem Stör erhalten und in flüssigem Stickstoff pulverisiert, wie zuvor beschrieben. Der Gehalt von jeder Testzusammensetzung wurde auf eine Dosis von 300 μg Kollagen pro Dosis ausgeglichen. Testzusammensetzungen wurden in 0,01 M Essigsäure gelöst/suspendiert und 0,3 ml wurden an jede Maus mit einer Fütterungsnadel mit Kugelspitze verabreicht.
An Tag 0 wurden die Mäuse an der Basis des Schwanzes mit 100 μg Rinder-CII immunisiert, welches in CFA emulgiert war. An Tag 14 wurde fünf Tieren von jeder Gruppe retroorbital Blut entnommen und der Anti-Typ-II-Kollagen-Antikörper-Titer in dem Serum wurde durch ein ELISA-Verfahren analysiert, um zu bestätigen, dass die Tiere vorbereitet waren. An Tag 21 wurde den Mäusen 50 μg LPS subkutan injiziert.
TABELLE 9 Typ-II-Kollagen-Antikörper-Titer an Tag 14 – Verdünnung 1 : 1000
Der CII-Antikörper-Titer für die mit Bindemittel gefütterten immunisierten Mäuse stieg auf 0,89 ± 0,27 im Vergleich zu dem mittleren CII-Antikörper-Titer für nicht immunisierte Mäuse von 0,03. Das zeigt an, dass Mäuse durch CII-Immunisierung vorbereitet waren. Andererseits zeigten jene Mäuse, die mit Störnotochord widerstandfähig gemacht worden waren, eine merkliche Reduktion (–76%) beim CII-Antikörper-Titer, was nahe legt, dass ihr Immunsystem im Vergleich zu der mit Bindemittel gefütterten Gruppe desensibilisiert war. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den Antikörperdaten von Nagler-Anderson, et al., "Suppression of Type II Collagen-Induced Arthritis by Intragastric Administration of Soluble Type II Collagen", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1986: 83; 7443–7446, und die 'klinischen Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargelegt. Auch wenn es eine leichte Reduktion gegenüber der Bindemittelkontrolle gab, war die bei der mit Barschhautgelatine gefütterten Gruppe gesehene Reduktion nicht signifikant.
Die Mäuse wurden täglich auf den Ausbruch von CIA inspiziert, gekennzeichnet durch Erytheme und Ödeme. Extremitäten wurden klinisch bewertet und auf einer Skala von 0 bis 6 eingeordnet (0, Fehlen von Arthritis; 0,5, ein oder zwei Zehen geschwollen oder nur die Pfote geschwollen; 1, die gesamte Pfote geschwollen; 2, gesamte Pfote ernsthaft geschwollen; 3, leichte Deformation nachdem Entzündung abgeklungen ist; 4, schwere Deformation; 5, leichte Ankylose mit teilweisem Verlust der Gelenkfunktion in der Pfote; 6, schwere Ankylose mit totalem Verlust der Gelenkfunktion in der Pfote). Alle Mäuse wurden durch CO₂ an Tag 50 eingeschläfert.
TABELLE 10
Die prozentuale Häufigkeit von CIA war über alle Behandlungen hinweg größer als im Vergleich zu Beispiel 2.1, was die scharfe Natur des CIA-Induktionsprotokolls bestätigte, das in diesem Beispiel eingesetzt wurde. Trotzdem hatte die mit Störnotochord gefütterte Gruppe merklich niedrigere Schwerebewertungen (P < 0,05) als jene, die mit Bindemittel oder mit Barschhautgelatine gefüttert wurden. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den Ergebnissen von Beispiel 2.1, wodurch angezeigt wird, dass Störnotochord wirksam bei der Dämpfung von CIA ist."
BEISPIEL III:
Störnotochord gegen Hühnerknorpel
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit von Hühnerknorpel und Störnotochord beim Schutz von Mäusen vor CIA zu vergleichen. Dieses Experiment wurde auf eine ähnliche Art und Weise wie Beispiel II durchgeführt.
Die Behandlungsgruppen waren wie folgt:
Gruppe 1 diente als die Kontrolle. Hühnerknorpel (schwertförmiger Knorpel am Brustbein) wurde erhalten von einer kommerziellen Quelle und wurde in flüssigem Stickstoff pulverisiert und für Gruppe 2 verwendet. Störnotochord, wie zuvor beschrieben, wurde als Gruppe 3 verwendet. Der Dosispegel (300 μg/Dosis) wurde beruhend auf vorherigen Daten gewählt.
Das Sensibilisierungsverfahren bestand aus dem Lösen/Suspendieren von jeder Probe in 0,01 M Essigsäure, und 0,3 ml wurden an jede Maus mit einer Fütterungsnadel mit Kugelspitze an den Tagen –10, –7, –5 und –2 vor der Immunisierung verabreicht. An Tag 0 wurden die Mäuse auf der Basis des Schwanzes mit 100 μg Rinder-CII immunisiert, das in CFA emulgiert war. An Tag 21 wurde den Mäusen subkutan 50 μg LPS injiziert.
Das Körpergewicht von jeder Maus wurde an den Tagen 0, 21, 28 und 35 aufgezeichnet. Mäuse wurden täglich auf den Ausbruch von CIA inspiziert, was durch Erytheme und Ödeme gekennzeichnet war. Extremitäten wurden klinisch bewertet und auf einer Skala von 0 bis 6 eingeordnet, wie zuvor beschrieben.
Die Daten, die in Tabelle 11 dargestellt sind, zeigen, dass Störnotochord wirksam bei der Abschwächung von CIA ist. Tatsächlich war die mit Störnotochord gefütterte Gruppe die einzige Gruppe, die sich merklich (P < 0,05) von der Kontrollgruppe in der Schwerebewertung unterschied. Es gab eine numerische Verbesserung in der Schwerebewertung durch Hühnerknorpel, aber diese unterschied sich nicht signifikant von der Kontrollgruppe.
TABELLE 11 Tolerisierungswirkung von Hühnerknorpel und Störnotochord auf CIA entwickelnde Mäuse – Tag 35
Außerdem und am bedeutendsten zeigt Tabelle 11 überraschenderweise, dass die einzige Gruppe, die an Gewicht zulegte, die Störnotochord-Gruppe war. Die Hühnerknorpel-Gruppe zeigte tatsächlich einen Gewichtsverlust von 10%. Wenn Tiere einem Trauma unterliegen oder ihnen von Krankheiten schlecht wird, verringern sie typischerweise die Nahrungsaufnahme, was zu Gewichtsverlust führt, wie hier bei der Hühnerknorpelgruppe zu sehen ist. Somit unterstützen diese Daten weiter die Annahme der Erfinder, dass Störnotochord überhaupt nicht ähnlich wie Hühnerknorpel ist und tatsächlich besser sein kann.
BEISPIEL IV:
Dosiswirkung
Um die Dosiswirkung von Störnotochord beim Schutz von Mäusen vor CIA zu bewerten wurde dieses Experiment auf eine ähnliche Art und Weise wie in Beispiel II und III durchgeführt. Die Mäuse waren vom Stamm DBA/1 Lac J, geliefert von Jackson Laboratories aus Bar Harbor, Maine. Alle Mäuse waren weiblich und etwa 6–8 Wochen alt. Acht Gruppen von 10–15 Mäusen pro Gruppe wurden an ihre Umgebungen 7 Tage lang akklimatisiert. Ein Standardmäusefutter und Wasser wurde allen Tieren zum Verzehr nach Belieben bereitgestellt.
An den Tagen –10, –7, –5 und –2 vor der Immunisierung wurden Mäuse durch Störnotochord sensibilisiert. Eine Gruppe, die nur mit Bindemittel gefüttert wurde, wurde als die negative Kontrolle verwendet, und eine Gruppe, die mit einer wirksamen Dosis von Dexamethason (0,1 mg/kg per os) gefüttert wurde, wurde als die positive Kontrolle verwendet. Störnotochord wurde von farmgezüchtetem Stör erhalten und in flüssigem Stickstoff pulverisiert. Der Dosispegel für Störnotochord wurde auf 1, 3, 10, 30, 100 oder 300 μg Kollagen pro Dosis auf Basis des Protein- und Kollagengehalts ausgeglichen. Störnotochord wurde in 0,01 M Essigsäure gelöst/suspendiert und 0,3 ml wurden an jede Maus mit einer Fütterungsnadel mit Kugelspitze verabreicht.
Am Tag 0 wurden die Mäuse an der Basis des Schwanzes mit 100 μg Rinder-CII immunisiert, welches in CFA emulgiert war. An Tag 21 wurde den Mäusen 50 μg LPS subkutan injiziert.
Die Mäuse wurden täglich auf den Ausbruch von CIA inspiziert, gekennzeichnet durch Erytheme und Ödeme. Extremitäten wurden klinisch bewertet und auf einer Skala von 0 bis 6 eingeordnet, wie in Beispiel III beschrieben.
Dexamethason (ein Mittel, von dem bekannt ist, dass es CIA reduziert) reduzierte sowohl die prozentuale Häufigkeit als auch die Schwerebewertung (Tabelle 12). Die prozentuale Häufigkeit von CIA war außerdem in allen Gruppen reduziert, die mit Störnotochord gefüttert wurden, unabhängig von dem Dosispegel (außer Tag 35 bei der 3,160-mg/Dosis-Gruppe). Schwerebewertung wurde außerdem bei allen mit Störnotochord.
gefütterten Gruppen auf eine Dosis-abhängige Art und Weise an Tag 26 reduziert. Des weiteren verringerte sich bei der Gruppe, die mit 1,053 mg Störnotochord pro Dosis gefüttert wurde, die Schwerebewertung an Tag 35 signifikant (P < 0,05) (eine Reduktion von 50%) und zeigte eine Reduktion von 20% bei der prozentualen Häufigkeit. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der vorherigen Beispiele, dass Störnotochord bei der Dämpfung von CIA wirksam ist.
TABELLE 12 Dosisstudie
Die Erfinder fuhren fort, vier ausgewählte Gruppen (Bindemittelkontrollgruppe, Störnotochord-Gruppe mit 0,105 mg/Dosis, Störnotochord-Gruppe mit 1,053 mg/Dosis und Dexamethasongruppe) bis Tag 79 zu beobachten. Schwerebewertung aufgetragen über Tage nach der Sensibilisierung sind zu finden in 1.
Aus den erzeugten Daten ist ersichtlich, dass die mit Bindemittel gefütterte Kontrollgruppe einen normalen Krankheitsverlauf zeigte, während Dexamethason in der Lage war, die Schwerebewertung merklich zu unterdrucken. Die Unterdrückungswirkung von Störnotochord dauerte bis zu Tag 79 in der Gruppe, die mit 1,053 mg/Dosis gefüttert wurde. Die Gruppe, die mit 0,105 mg/Dosis gefüttert wurde, zeigte eine ähnliche Wirkung bis zu Tag 70.
BEISPIEL V:
Störkollagen
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung von Kollagen, das aus Störnotochord isoliert wurde, beim Schutz von Mäusen gegen CIA zu zeigen. Dieses Experiment wurde auf eine ähnliche Art und Weise wie Beispiel II, III und IV durchgeführt.
Die Mäuse waren vom Stamm DBA/1 Lac J, geliefert von Jackson Laboratories aus Bar Harbor, Maine. Alle Mäuse waren weiblich und etwa 6–8 Wochen alt . Drei Gruppen von 10–15 Mäusen pro Gruppe wurden an ihre Umgebungen 7 Tage lang akklimatisiert. Ein Standardmäusefutter und Wasser wurde allen Tieren zum Verzehr nach Belieben bereitgestellt.
An den Tagen –10, –7, –5 und –2 vor der Immunisierung wurden Mäuse durch Notochordkollagen sensibilisiert. Störnotochord wurde von farmgezüchtetem Stör erhalten, und Kollagen wurde extrahiert und aufbereitet durch das Verfahren, das beschrieben ist in Eyre und Muir, "The Distribution of Different Molecular Species of Collagen in Fibrous, Elastic and Hyaline Cartilages of the Pig", Biochem. J. (1975) 151; 595–602. Notochordkollagen wurde in 0,01 M Essigsäure gelöst/suspendiert und 0,3 ml wurden an jede Maus mit einer Fütterungsnadel mit Kugelspitze verabreicht. Die getesteten Dosispegel waren 30 oder 100 μg pro Dosis pro Tier.
An Tag 0 wurden die Mäuse auf der Basis des Schwanzes mit 100 μg Rinder-CII immunisiert, welches in CFA emulgiert war. An Tag 21 wurde den Mäusen 50 μg LPS subkutan injiziert.
Mäuse wurden täglich auf den Ausbruch von CIA inspiziert, gekennzeichnet durch Erytheme und Ödeme. Extremitäten wurden klinisch bewertet und auf einer Skala von 0 bis 6 eingeordnet, wie zuvor beschrieben. Tabelle 13 stellt die Ergebnisse von diesem Experiment dar.
TABELLE 13
Die Schwerebewertungen waren in beiden mit Störnotochordkollagen gefütterten Gruppen reduziert. Die mit 30 μg gefütterte Gruppe zeigte eine Reduktion von 42% in der Schwerebewertung an Tag 35 im Vergleich zu der mit Bindemittel gefütterten Gruppe. Die mit 100 μg gefütterte Gruppe zeigte eine Abnahme beim prozentualen Anteil der Häufigkeit. Das ist konsistent mit zuvor veröffentlichten Daten von Zhang Z. J., CSY Lee, 0. Lider, H. L. Weiler, "Suppression of Adjuvant Arthritis in Lewis Rats by Oral Administration of Type II Collagen", J. Immuno (1990), 145; 2489–2493. Es wurde außerdem beobachtet, dass beide mit Störnotochordkollagen gefütterten Gruppen eine Zunahme des Körpergewichts zeigten.
BEISPIEL VI: Protektive Wirkung bei chronischer Arthritis
Wirkung von Störnotochord bei einer chronischen Arthritis, ausgelöst durch humanes Ty-II-Kollagen Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit von Störnotochord beim Schutz von Mäusen vor chronischer CIA zu untersuchen, die durch Verwendung von humanem CII ausgelöst wurde (im Gegensatz zu anderen Beispielen in dieser Anmeldung, welche Rinder-CII verwendeten). Weibliche Mäuse vom Stamm DBA/1 Lac J, ungefähr 6–8 Wochen alt, wurden erhalten von Jackson Laboratorien aus Bar Harbor, Maine. Tiere wurden an ihre Umgebungen 7 Tage lang akklimatisiert. Ein Standardmäusefutter (Teklad-Diät) und Wasser wurde allen Tieren zum Verzehr nach Belieben bereitgestellt.
Die chronische CIA-Auslösung wurde erreicht, indem jede Maus an Tag 0 und Tag 21 auf der Basis des Schwanzes mit 50 mg humanem CII immunisiert wurde, welches in CFA emulgiert war. Tiere in der Bindemittelkontrollgruppe und Dexamethasonkontrollgruppe erhielten 0,01 M Essigsäure an Tag – 10, –7, –5 und –2 und 0,1 mg Dexamethason/kg Körpergewicht an Tag 21 bzw. Tag 35. Die Mäuse, die Störnotochord erhielten, wurden in drei Gruppen eingeteilt und ihnen wurden 100 mg Kollagen pro Dosis zugeteilt, gelöst/suspendiert in 0,01 M Essigsäure, und es wurden 0,3 ml verabreicht. Gruppe 1 erhielt Störnotochord an den Tagen –10, –7, –5 und –2; Gruppe 2 an den Tagen 7, 10, 12 und 14; Gruppe 3 an den Tagen 28, 31, 33 und 35.
Die Mäuse wurden täglich auf den Ausbruch von CIA inspiziert, gekennzeichnet durch Erytheme und Ödeme Extremitäten wurden klinisch bewertet und auf einer Skala von 0 bis 6 eingeordnet (0, Fehlen von Arthritis; 0,5, ein oder zwei Zehen geschwollen oder nur die Pfote geschwollen; 1, die gesamte Pfote geschwollen; 2, gesamte Pfote ernsthaft geschwollen; 3, leichte Deformation nachdem Entzündung abgeklungen ist; 4, schwere Deformation; 5, leichte Ankylose mit teilweisem Verlust der Gelenkfunktion in der Pfote; 6, schwere Ankylose mit totalem Verlust der Gelenkfunktion in der Pfote). Alle Mäuse wurden durch CO₂ an Tag 50 eingeschläfert.
Alle mit Störnotochord dosierten Gruppen hatten eine niedrigere Schwerebewertung als die Bindemittelkontrollgruppe. Besonders Gruppe 2 war sehr wirksam bei der Unterdrückung sowohl von prozentualer Häufigkeit als auch der Schwerebewertung (eine Reduktion von 52% an Tag 49) im Vergleich zu der Bindemittelgruppe. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den Ergebnissen von LPS-potenzierter CIA, aber weiterhin veranschaulichen sie, dass Störnotochord wirksam in einem chronischen CIA-Modell und auf eine Nicht-Antigen-abhängige Art und Weise ist. Das verwendete Modell und die Ergebnisse hierin können implizieren, dass Störnotochord bei der chronischen humanen rheumatoiden Arthritis wirksam sein kann.
Industrielle Anwendbarkeit
Die medizinische Gemeinschaft ist beständig auf der Suche nach verbesserten Behandlungen für Arthritis. Diese Erfindung stellt die Verwendung von Notochord und seinen Extrakten bereit (nämlich Notochordkollagen) zur oralen Verabreichung, um den Ausbruch von Arthritis zu vermindern und die Intensität der Krankheit zu reduzieren. Störnotochord ist besonders geeignet zum Einschluss in Ernährungsformulierungen und Nahrungsergänzungen. Weiterhin ist Störnotochord nicht teuer und reichlich und zuverlässig lieferbar.

Claims

Eine Zusammensetzung, die nützlich ist zum oralen Verzehr durch Säugetiere, die ein Chordatnotochord umfaßt, zur Verwendung als ein Medikament.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Notochord ein Notochord von einem Tier der Osteichthyes oder Acipenseridae Familie ist.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, worin das Notochord Störnotochord ist.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Zusammensetzung in einer festen Dosierform vorliegt, die von 1,0 μg bis 2,0 g Notochord enthält.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, worin die feste Dosierform in Form von einer Tablette, Kapsel, Pille oder Pulver ist.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, worin die Tablette, Kapsel oder Pille von 50 μg bis 500 mg Notochord enthält.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Zusammensetzung in flüssiger Form ist, die das Notochord in einer Konzentration von 10 μg bis 700 g pro Liter enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung, die Chordatnotochord umfaßt, zur Herstellung eines Medikaments zur Reduktion der Häufigkeit der Symptome von Arthritis in Säugetieren, zur oralen Verabreichung in einer Menge und für einen Zeitraum, die bzw. der wirksam ist, um solche Symptome zu lindern.
Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin das Notochord Störnotochord ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin die Verabreichung in einer Geschwindigkeit von 10 μg bis 700 g Notochord pro Tag erfolgt .
Verwendung von Notochord, das aus einem Tier der Ordnung Osteichthyes oder der Familie Acipensiridae entfernt wurde, und das zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von rheumatoider Arthritis in einem Tier zerkleinert wurde, für die orale Verabreichung von therapeutischen Mengen.
Die Verwendung gemäß Anspruch 11, worin das Notochord in einem flüssigen Medium verabreicht werden soll.
Die Verwendung gemäß Anspruch 11, worin das Notochord Störnotochord ist.