DE69819150T3 - Immunstimulierende oligonucleotide, zusammensetzungen davon, und verfahren zur verwendung davon - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft immunmodulatorische Zusammensetzungen, die eine immunstimulatorische Oligonukleotidsequenz (ISS) umfassen. Die Erfindung betrifft außerdem immunmodulatorische Zusammensetzungen, die eine ISS umfassen, in welcher wenigstens eine Base durch eine Base ersetzt worden ist, die durch die Addition an C-5 von Cytosin einer Elektronen-entziehenden Komponente modifiziert worden ist. Sie betrifft außerdem die Verabreichung der Oligonukleotidsequenzen, um zumindest eine Immunantwort zu modulieren. Die Erfindung betrifft darüber hinaus in vitro-Screening-Methoden, um Oligonukleotide mit potenzieller immunmodulatorischer Aktivität zu identifizieren.
  • HINTERGRUND
  • Die Art von Immunantwort, die auf eine Infektion oder andere Antigen-Provokation hin generiert wird, kann generell anhand des Subsets der an der Reaktion beteiligten T-Helfer-(Th)-Zellen unterschieden werden. Das Th1-Subset ist für klassische Zellvermittelte Funktionen verantwortlich, wie etwa eine Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ und die Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), wohingegen das Th2-Subset wirksamer als ein Helfer für die B-Zellaktivierung fungiert. Die Art von Immunantwort auf ein Antigen wird allgemein durch die Zytokine bestimmt, die durch die auf das Antigen reagierenden Zellen produziert werden. Unterschiede bei den durch Th1- und Th2-Zellen sekretierten Zytokinen werden als verschiedene biologische Funktionen dieser beiden Subsets widerspiegelnd erachtet.
  • Das Th1-Subset ist möglicherweise zum Reagieren auf virale Infektionen und intrazelluläre Pathogene besonders geeignet, da es IL-2 und IFN-γ sekretiert, welche CTLs aktivieren. Das Th2-Subset ist möglicherweise zum Reagieren auf frei lebende Bakterien und helminthische Parasiten besonders geeignet und kann allergische Re aktionen vermitteln, da IL-4 und IL-5 für das Induzieren der IgE-Produktion bzw. Eosinophilenaktivierung bekannt sind. Im Allgemeinen sekretieren Th1- und Th2-Zellen unterschiedliche Muster an Zytokinen, und somit kann eine Art von Reaktion die Aktivität der anderen Art von Reaktion moderieren. Eine Verschiebung des Th1/Th2-Gleichgewichts kann beispielsweise zu einer allergischen Reaktion, oder alternativ zu einer verstärkten CTL-Reaktion führen.
  • Die Immunisierung eines Wirtstiers gegen ein bestimmtes Antigen ist herkömmlicherweise durch wiederholte Beimpfung des Wirts mit einer immunogenen Form des Antigens erreicht worden. Zwar rufen die meisten derzeitigen Impfstoffe wirksam humorale (Antikörper oder "Th2-Typ") Reaktionen hervor, doch versagen sie darin, zelluläre Reaktionen (insbesondere auf den Haupthistokompatibilitätskomplex (MH) Klasse I-restringierte CTL- oder "Th1-Typ"-Reaktionen) hervorzurufen, die generell abwesend oder schwach sind. Für viele Infektionskrankheiten, wie etwa Tuberkulose und Malaria, sind Reaktionen vom Th2-Typ von geringem schützendem Wert gegen eine Infektion. Darüber hinaus sind die Antikörperreaktionen bei bestimmten Indikationen ungeeignet, am deutlichsten bei Allergie, bei der eine Antikörperreaktion zu einem anaphylaktischen Schock führen kann. Die vorgeschlagenen Impfstoffe unter Verwendung von Kleinpeptiden, die von dem Zielantigen und weiteren derzeit verwendeten antigenen Agenzien abgeleitet sind, womit die Verwendung potenziell infektiöser intakter Viruspartikel vermieden wird, rufen nicht immer die zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung erforderliche Immunantwort hervor. Das Fehlen eines therapeutisch wirksamen Impfstoffs gegen das humane Immunschwächevirus (HIV) stellt ein unglückliches Beispiel für dieses Versagen dar.
  • Protein-basierte Impfstoffe induzieren typischerweise Immunantworten vom Th2-Typ, die durch hohe Titer an neutralisierenden Antikörpern gekennzeichnet sind, die jedoch ohne signifikante Zell-vermittelte Immunität sind. Im Gegensatz dazu stimuliert der intradermale Transport von "nackter", oder unkomplexierter DNA, die für ein Antigen kodiert, Immunantworten auf das Antigen mit einer Tendenz zum Th1-Typ, gekennzeichnet durch die Expansion von CD4+-T-Zellen. Manickan et al. (1995) J. Immunol. 155:250–265; Xiang et al. (1995) Immunity 2:129–135; Raz et al. (1995) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 93:5141–5145; und Briode et al. (1997) J. Allergy Clin.
  • Immunol. 99:s129. Die Injektion von Antigen-kodierender nackter DNA induziert reproduzierbar sowohl humorale als auch zelluläre Immunantoworten gegen die kodierten Antigene. Pardoll and Beckerleg (1995) Immunity 3:165–169. DNA-Vakzinen können einen neuen Ansatz für die Prophylaxe gegen Infektionskrankheiten bieten. Siehe zum Beispiel Dixon (1995) Bio/Technology 13:420 und darin genannte Literaturstellen.
  • Von bestimmten Typen von DNA ist gezeigt worden, dass sie, ohne translatiert zu sein, Immunantworten stimulieren. Bakterielle DNA induzierte Anti-DNA-Antikörper in injizierten Mäusen, als auch die Zytokin-Produktion durch Makrophagen und natürliche Killer-(NK)-Zellen. Pisetsky (1996) J. Immunol.156:421–423; Shimada et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808–816; Yamamoto et al. (1992a) Microbiol. Immunol. 36:983–897; und Cowdery et al. (1996) J. Immunol.156:4570–4575.
  • Eigenschaften der B-Zell- und NK-Zellaktivierung von bakterieller DNA sind mit einer kurzen (Hexamer aus 6 Basenpaaren) Sequenz in Verbindung gebracht worden, die ein zentrales unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält. Yamamoto et al. (1992a); und Krieg et al. (1995) Nature 374:546–549. Oligonukleotide, die eine CpG-Sequenz, flankiert durch zwei 5'-Purine und zwei 3'-Pyrimidine, umfassen, sind als am potentesten in der B-Zell- und NK-Zellstimulierung gezeigt worden. Wurde zum Beispiel eine Vielfalt von Oligonukleotiden, umfassend Hexamere, auf ihre Fähigkeit zur Verstärkung der NK-Zellaktivität von Mäusemilzzellen getestet, so umfassten die immunogensten Hexamere AACGTT, AGCGCT, GACGTC. Yamamoto et al. (1992b) J. Immunol. 148:4072–4076. Bei einer Untersuchung, bei der die B-Zellaktivierung als Reaktion auf Oligonukleotide gemessen wurde, entsprachen die stimulatorischsten Hexamersequenzen (z.B. AACGTC, AACGTT, GACGTC, GACGTT) auch der Sequenz von 5'-Purin, Purin, CG, Pyrimidin, Pyrimidin-3', Krieg et al. (1995). Wie hierin jedoch gezeigt, ist diese prototypische Hexamersequenz in vielen Oligonukleotiden zu finden, die nicht immunstimulatorisch sind. Somit ist die prototypische Hexamersequenz, wie von Krieg et al. (1995) vorgeschlagen, nicht für die immunstimulatorische Aktivität prädiktiv. Oligonukleotide von weniger als 8 Basen sind als nichtstimulatorisch befunden worden, und von den getesteten oktomeren Oligonukleotiden zeigte TCAACGTT die höchste immunogene Aktivität (WO 96/02555). Von einer Reihe hexamerer Polynukleotide ist gezeigt worden, dass sie immunstimulatorische Eigenschaften aufweisen (WO 98/16247). Polynukleotidsequenzen, die eine Hexamer-Core-Sequenz mit dem Tetramer A/G/T,C,G,C/T enthalten, und oktamere Sequenzen, die ein Core-Hexamer enthalten, dessen erste beiden Basen ausgewählt sind aus einem GT/GG/GA/AT/AA, gefolgt von CG, gefolgt von TT/CT, sind als immunstimulatorisch festgestellt worden (WO 98/18810).
  • Bakterielle DNA stimulierte Makrophagen zur Produktion von IL-12 und TNF-α. Von diesen Makrophagen-produzierenden Zytokinen wurde festgestellt, dass sie die Produktion von IL-12 und IFN-γ von Splenozyten induzieren. Halpern et al. (1996) Cell. Immunol. 167:72–78. Die in vitro-Behandlung von Splenozyten entweder mit bakterieller DNA oder CpG-enthaltendem Oligonukleotid induzierte die Produktion von IL-6, IL-12 und IFN-γ. Klinman et al. (1996) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 93:2879–2883. Die Produktion aller dieser Zytokine ist für die Induktion einer Immunantwort vom Th1-Typ anstelle einer Antwort vom Th2-Typ indikativ.
  • Bis heute ist keine klare Übereinstimmung hinsichtlich der Sequenzen erzielt worden, die für die Immunstimulierung sowohl erforderlich als auch ausreichend sind. Eine neuere Studie, welche die Induktion der NK-Aktivität als Reaktion auf CpG-enthaltende Oligonukleotide untersuchte, legte nahe, dass das unmethylierte CpG-Motiv erforderlich, doch für die Oligonukleotid-Induktion der lytischen NK-Aktivität nicht ausreichend war. Ballas et al. (1996) J.Immunol. 157:1840–1845. Sequenzen, die das CpG flankierten, schienen die immunstimulatorische Aktivität eines Oligonukleotids zu beeinflussen. Die immunstimulatorische Aktivität der immunstimulatorischen Sequenzen schien von der Adenosin-Methylierung unabhängig zu sein, ebenso wie davon, ob das Nukleotid einzel- oder doppelsträngig ist. Siehe zum Beispiel Tokunaga et al. (1989) Microbiol. Immunol. 33:929; Tokunaga et al. (1992) Microbiol. Immunol. 36:55–66; Yamamoto et al. (1992b); Messina et al. (1993) Cell. Immunol. 147:148–157; and Sato et al. (1996) Science 273:352–354. Die Länge des Oligonukleotids scheint ebenfalls kein Faktor zu sein, da doppelsträngige DNA von 4 kb Länge (Sato et al. (1996)) oder einzelsträngige DNA von lediglich 15 Nukleotiden in der Länge (Ballas et al. (1996)) Immunantworten hervorriefen; obschon dann, wenn die Länge des Oligonukleotids auf weniger als 8 Basen vermindert war oder wenn die DNA mit CpG-Methylase methyliert war, die immunstimulatorische Aktivität beseitig war. Krieg et al. (1995).
  • Allergische Reaktionen, einschließlich solcher von allergischem Asthma, sind durch eine Frühphasen-Reaktion gekennzeichnet, die innerhalb von Sekunden bis Minuten nach der Allergenexposition auftritt und durch eine zelluläre Degranulation gekennzeichnet ist, und eine Spätphasenreaktion, die 4 bis 24 Stunden später auftritt und durch die Infiltration von Eosinophilen in die Stelle der Allergenexposition gekennzeichnet ist. Spezifisch stimuliert während der frühen Phase der allergischen Reaktion die Aktivierung der Th2-Typ-Lymphozyten die Produktion von Antigen-spezifischen IgE-Antikörpern, welche wiederum die Freisetzung von Histamin und anderen Vermittlern einer Entzündung aus Mastzellen und Basophilen auslöst. Während der Spätphasenreaktion ist die IL-4- und IL-5-Produktion durch CD4+ Th2-Zellen erhöht. Diese Zytokine scheinen eine signifikante Rolle im Rekrutieren der Eosinophile in die Stelle der Allergenexposition zu spielen, wo eine Gewebeschädigung und -dysfunktion resultiert.
  • Die Antigen-Immuntherapie für allergische Störungen bezieht die subkutane Injektion von geringen, doch nach und nach ansteigenden Mengen an Antigen mit ein. Solche Immunisierungsbehandlungen bergen das Risiko der Induktion einer IgE-vermittelten Anaphylaxie und richten sich nicht auf die Zytokin-vermittelten Ereignisse der allergischen Spätphasenreaktion.
  • Die Impfung mit bestimmten DNA-enthaltenden immunstimulatorischen Motiven induziert eine Immunantwort mit einer Tendenz zum Th1-Typ. Zum Beispiel reagierten Mäuse, die intradermal mit Escherichia coli (E. coli) β-Galactosidase (β-Gal) in Saline oder in dem Adjuvans Alaun injiziert wurden, indem sie spezifische IgG1- und IgE-Antikörper produzierten, und CD4+-Zellen, die IL-4 und IL-5 sekretierten, doch nicht IFN-γ, was zeigt, dass die T-Zellen hauptsächlich vom Th2-Subset waren. Allerdings reagierten Mäuse, die mit Plasmid-DNA (in Saline), die β-Gal kodierte und die eine ISS enthielt, intradermal (oder mit einem Tyne-Hautritzapplikator) injiziert waren, indem sie IgG2a-Antikörper und CD4+-Zellen produzierten, die IFN-γ, doch nicht IL-4 und IL-5 sekretierten, was zeigte, dass die T-Zellen hauptsächlich vom Th1-Subset waren. Darüber hinaus war die spezifische IgE-Produktion durch die mit Plasmid-DNA injizierten Mäusen um 66–75% reduziert. Raz et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5141–5145. Im Allgemeinen ist die Reaktion auf die Immunisierung mit nackter DNA durch die Produktion von IL-2, TNFα und IFN-γ durch Antigen-stimulierte CD4+ T-Zellen gekennzeichnet, was für eine Reaktion vom Th1-Typ indikativ ist. Dies ist besonders wichtig in der Behandlung von Allergie und Asthma, wie durch die verminderte IgE-Produktion gezeigt.
  • In einem anderen Beispiel rief das Vorhandensein einer immunstimulatorischen Sequenz, wie etwa des palindromen Hexamers AACGTT, in einem Antigenkodierenden Plasmidvektor, der intradermal injiziert wurde, die Produktion großer Mengen von IFN-α, IFN-β und IL-12 hervor. Sato et al (1996). IFN-α spielt eine Rolle in der Differenzierung von naiven T-Zellen zu einem Phänotyp vom Th1-Typ hin, antagonisiert Th2-Zellen, hemmt die IgE-Synthese, fördert die IgG2a-Produktion und induziert einen Th1-Phänotyp der Antigen-spezifischen T-Zellklone. IL-12 fördert die IFN-γ-Produktion durch T-Zellen und begünstigt die Reifung von Th1-Zellen.
  • Es wäre zur Behandlung einer breiten Vielfalt von Indikationen nützlich, dazu in der Lage zu sein, die Reaktionen vom Th1-Typ auf ein bestimmtes Antigen spezifisch zu verstärken und gleichzeitig die Reaktion vom Th2-Typ auf dasselbe Antigen herabzuregulieren. Die Behandlung oder Linderung dieser Indikationen beinhaltet, ohne darauf beschränkt zu sein, die Tumortherapie, die Behandlung von allergischen Störungen und die Induktion einer kräftigen zellulären Immunantwort. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die Oligonukleotidsequenzen umfassen, die in diesen Zusammenhängen verwendet werden können.
  • Alle der genannten Literaturstellen, die im vorangegangenen Abschnitt enthalten sind, als auch die genannten Literaturstellen, die in der folgenden Offenbarung enthalten sind, sind hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt bereit:
    ein immunmodulatorisches Oligonukleotid, welches eine immunstimulatorische Sequenz (ISS) umfasst, worin die ISS eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus den Sequenzen der SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 15 und SEQ ID Nr. 16; und ein immunstimulatorisches Oligonukleotid, welches die Sequenz der SEQ ID Nr. 2 umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem immunmodulatorische Zusammensetzungen bereit, die ein Oligonukleotid gemäß der Erfindung umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung bereit, die ein Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die immunmodulatorische Zusammensetzung ein Oligonukleotid, das wenigstens ein ISS-Oktanukleotid gemäß der Erfindung und ein Antigen enthält.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Antigen ausgewählt aus Proteinen, Glykoproteinen, Polysacchariden und Lipiden.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Antigen an das ISS-Oligonukleotid konjugiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die immunmodulatorische Zusammensetzung ein Oligonukleotid, das wenigstens ein immunstimulatorisches (ISS) Oktanukleotid gemäß der Erfindung und einen Faszilitator enthält, ausgewählt aus den costimulatorischen Molekülen, Zytokinen, Chemokinen, Targeting-Proteinligand, einem Transaktivierungsfaktor, einem Peptid, und einem Peptid, das eine modifizierte Aminosäure umfasst.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die immunmodulatorische Zusammensetzung ein Oligonukleotid, das wenigstens ein ISS-Oktanukleotid, ein Antigen und ein Adjuvans enthält.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine immunmodulatorische Zusammensetzung ein immunmodulatorische Oligonukleotid und ein Antigen, die in einem Abstand unmittelbar assoziiert sind, der effektiv ist, um eine Immunantwort zu verstärken.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine immunmodulatorische Zusammensetzung ein immunmodulatorisches Oligonukleotid und ein Antigen, die unmittelbar assoziiert sind, um das Oligonukleotid und das Antigen gemeinsam an ein Immuntarget zu transportieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine immunmodulatorische Zusammensetzung ein immunmodulatorisches Oligonukleotid und das Antigen in Assoziation mit einem Adjuvans. Weiterhin sind das immunmodulatorische Oligonukleotid und das Antigen in Mikropartikeln assoziiert. In einer weiteren Ausführungsform sind das immunmodulatorische Oligonukleotid und das Antigen in Liposomen assoziiert.
  • Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Oligonukleotids oder immunmodulatorischer Zusammensetzung gemäß der Erfindung bei einer Methode zum Modulieren einer Immunantwort bereit, umfassend die Verabreichung einer immunmodulatorischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung. Die Modulation der Immunantwort umfasst die Induktion einer Th1-Reaktion. Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Oligonukleotids oder immunmodulatorischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung bei einer Methode zum Modulieren einer Immunantwort bereit, umfassend die Verabreichung einer immunmodulatorischen Zusammensetzung, die einen immunmodulatorischen Faszilitator und ein Oligonukleotid umfasst, das wenigstens eine ISS enthält.
  • Wir beschreiben außerdem eine Methode zum Durchmustern auf die humane immunstimulatorische Aktivität von Oligonukleotiden, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen von Makrophagenzellen und eines Aliquots des zu testenden Oligonukleotids; (b) Inkubieren der Zellen und des Oligonukleotids aus Schritt a) für eine ausreichende Zeitdauer; und (c) Bestimmen der relativen Menge der Zytokine mit Th1-Tendenz im Überstand der Zellkultur.
  • Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Oligonukleotids oder immunmodulatorischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung bei einer Methode zur Behandlung von Individuen, die einer Immunmodulation bedürfen, bereit, umfassend die Verabreichung einer Zusammensetzung, die ein immunmodulatorisches Oligonukleotid, das wenigstens eine ISS enthält, enthält, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Individuen, die an Krebs, allergischen Erkrankungen, Asthma oder Infektionskrankheiten leiden. Weitere Ausführungsformen stellen die Verwendung der Oligonukleotide oder der immunmodulatorischen Zusammensetzungen bei Methoden zur Behandlung von Individuen bereit, die mit Hepatitis B-Virus, Papillomavirus und humanem Immunschwäche-Virus infiziert sind.
  • Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Oligonukleotids oder immunmodulatorischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung bei einer Methode zur Verhütung oder Behandlung einer Infektionskrankheit in einem Individuum bereit, umfassend die Verabreichung einer immunmodulatorischen Zusammensetzung, die eine ISS und Antigen enthält.
  • Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Oligonukleotids oder immunmodulatorischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung bei einer Methode zur Verhütung oder Behandlung von Infektionskrankheiten aufgrund einer viralen Infektion, einschließlich, doch nicht beschränkt auf solche Erkrankungen aufgrund einer Infektion durch das Hepatitis B-Virus, Influenza-Virus, Herpes-Virus, humanes Immunschwäche-Virus und Papillomavirus, bakteriellen Infektion, einschließlich, doch nicht beschränkt auf solche Erkrankungen aufgrund einer Infektion durch Hemophilus influenza, Mycobacterium tuberculosis und Bordetella pertussis, und Parasiteninfektion, einschließlich, doch nicht beschränkt auf solche Erkrankungen aufgrund einer Infektion durch Malaria-Plasmodia, Leishmania-Spezies, Trypanosoma-Spezies und Schistosoma-Spezies, bereit.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt ein Schaubild, das die Menge an IFN-γ, die in dem Kulturüberstand von Splenozyten nach Exposition an Oligonukleotide für 48 Stunden zu finden ist, darstellt. Siehe Tabelle 1 für die Identifikation der Oligonukleotide.
  • 2 zeigt ein Schaubild, das die Menge an IL-12, die in dem Kulturüberstand von Splenozyten nach Exposition an Oligonukleotide für 48 Stunden zu finden ist, darstellt. Siehe Tabelle 1 für die Identifikation der Oligonukleotide.
  • 3 zeigt ein Schaubild, das die Menge an IL-6, die in dem Kulturüberstand von Splenozyten nach Exposition an Oligonukleotide für 48 Stunden zu finden ist, darstellt. Siehe Tabelle 1 für die Identifikation der Oligonukleotide.
  • 4 zeigt ein Schaubild, das die Menge an IL-6, die in dem Kulturüberstand von Splenozyten nach Exposition an Oligonukleotide für 48 Stunden zu finden ist, darstellt. Siehe Tabelle 2 für die Identifikation der Oligonukleotide.
  • 5 zeigt ein Schaubild, das die Menge an IL-12, die in dem Kulturüberstand von Splenozyten nach Exposition an Oligonukleotide für 48 Stunden zu finden ist, darstellt. Siehe Tabelle 2 für die Identifikation der Oligonukleotide.
  • 6 zeigt ein Schaubild, das die Wirksamkeit verschiedener Oligonukleotide, umfassend modifizierte Cytosine, darin zeigt, die Proliferation von Splenozyten zu stimulieren. Die Zellproliferation wurde nach 48 Stunden in Kultur bestimmt. Siehe Tabelle 2 für die Identifikation der Oligonukleotide.
  • 7 zeigt ein Schaubild, das die Serummengen an Anti-Amb al IgE zeigt, die in behandelten Tieren generiert wurden.
  • 8 zeigt ein Schaubild, das die Serummengen an Anti-Amb al IgG1 zeigt, die in behandelten Tieren generiert wurden.
  • 9 zeigt ein Schaubild, das die Serummengen an Anti-Amb al IgG2a zeigt, die in behandelten Tieren generiert wurden.
  • 10 zeigt ein Schaubild, das die CTL-Reaktionen von Splenozyten der behandelten Tiere darstellt.
  • 11 zeigt ein Schaubild, das die CTL-Reaktionen von Splenozyten der behandelten Tiere darstellt.
  • 12 zeigt ein Schaubild, das IFN-γ, das von Splenozyten der behandelten Tiere produziert wird, darstellt.
  • 13 zeigt ein Schaubild, das IL-10, das von Splenozyten der behandelten Tiere produziert wird, darstellt.
  • 14 zeigt ein Schaubild, das die Serummengen an Anti-HBsAg-Antikörpern vier Wochen nach der Primärimmunisierung zeigt.
  • 15 zeigt ein Schaubild, das die Serummengen an Anti-HBsAg-Antikörpern eine Woche nach der Sekundärimmunisierung zeigt.
  • 16 zeigt ein Schaubild, das die Serummengen an Anti-HBsAg-Antikörpern vier Wochen nach der Sekundärimmunisierung zeigt.
  • AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Es ist nun festgestellt worden, dass ein bestimmter Satz von Oligonukleotidsequenzen das Oligonukleotid zur Modulierung einer Immunantwort fähig macht. Solche Oligonukleotidsequenzen umfassen eine immunstimulatorische Oktanukleotidsequenz (ISS). Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen das ISS-enthaltende Oligonukleotid alleine oder in Verbindung mit einem immunmodulatorischen Agens, wie etwa einem Peptid, einem Antigen und/oder einem zusätzlichen Adjuvans. Von den Oligonukleotiden selbst ist festgestellt worden, dass sie eine Adjuvans-Aktivität aufweisen und zur alleinigen Verwendung als Adjuvanzien geeignet sind, und ist ebenfalls festgestellt worden, dass sie die Wirkung eines anderen Adjuvans potenzieren.
  • Zuvor beschriebene immunstimulatorische Sequenzen sind dahingehend definiert worden, dass sie eine Hexamersequenz mit einem zentralen CpG-Dinukleotid enthalten. Ungünstigerweise ergibt die Bezugnahme auf die Hexamersequenz zur Vorhersage der immunstimulatorischen Aktivität größtenteils immunologisch inaktive Oligonukleotide. Wie in Beispiel 1 gezeigt, hatten zum Beispiel 5 verschiedene Oligonukleotide mit dem Hexamer AACGTT eindeutig eine immunstimulatorische Aktivität gezeigt, wohingegen 5 andere Oligonukleotide mit AACGTT eine stark verminderte immunstimulatorische Aktivität aufwiesen. Somit ist der bisherige Hexamer-Algorithmus für die immunstimulatorische Aktivität nicht prädiktiv.
  • Die ISS der vorliegenden Erfindung umfasst eine Oktanukleotidsequenz, welche das zuvor beschriebene Hexamer und zwei weitere Nukleotide 3' des Hexamers umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung zeigt, dass, relativ zu der hexameren ISS-Sequenz, das ISS-Oktanukleotid ein zuverlässiger Prädiktor der immunstimulatorischen Aktivität in Oligonukleotiden ist.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das ISS-Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung auch ein CG-Dinukleotid umfassen, in welchem der C-Rest durch Addition an C-5 einer Elektronen-entziehenden Komponente ("modifizierte ISS") modifiziert ist. Wird dasselbe Cytosin methyliert, so geht die gesamte immunstimulatorische Aktivität des Oligonukleotids verloren. Bei solchen Zusammensetzungen ist das Cytosin in der dritten Position von dem 5'-Ende mit 5-Bromcytosin substituiert. Einige der modifizierten ISS weisen in etwa dieselbe, wenn nicht größere, immunstimulatorische Aktivität relativ zu derselben Sequenz ohne einer modifizierten Base auf.
  • Die Erfindung stellt auch eine Methode und Zusammensetzungen für die allgemeine Stimulierung einer Immunantwort durch die Adjuvans-artige Wirkung einer verabreichten ISS bereit.
  • Die Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen für die Verstärkung einer Immunantwort bereit, die ein ISS-Antigen-Konjugat umfassen. Ein ISS-Antigen-Konjugat kann durch kovalente und/oder nicht-kovalente Interaktionen zwischen der ISS und dem Antigen gebildet werden.
  • Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die ein ISS-Antigen-Gemisch umfassen, in welchem die ISS und das Antigen in einem Abstand unmittelbar assoziiert sind, der effektiv ist, um eine Immunantwort zu verstärken, verglichen zu der gemeinsamen Verabreichung des Oligonukleotids und des Antigens in Lösung. Die Erfindung stellt weiterhin Zusammensetzungen bereit, die ein einkapselndes Agens umfassen, das die ISS und das Antigen in unmittelbarer Assoziierung halten kann, bis der ISS-Antigen-Komplex für das Ziel verfügbar ist. In einem ISS-Antigen-Gemisch werden die ISS und das Antigen in unmittelbarer Assoziation in solcher Weise gehalten, dass sowohl die ISS als auch das Antigen durch dieselbe Zielzelle aufgenommen werden können. Weiterhin werden ISS und Antigen in einem Gemisch bei Konzentrationen gehalten, die zur Modulierung einer Immunantwort wirksam sind. Vorzugsweise sind die ISS und das Antigen in einem Abstand unmittelbar assoziiert von etwa 0,04 μm bis etwa 100 μm, bevorzugter in einem Abstand von etwa 0,1 μm bis etwa 20 μm, sogar noch bevorzugter in einem Abstand von etwa 0,15 μm bis etwa 10 μm. Zu Zielen des ISS-Antigen-Konjugats oder des ISS-Antigen-Gemischs zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Antigen-präsentierende Zellen (APCs), wie etwa Makrophagen, dendritische Zellen und/oder Lymphozyten, lymphatische Strukturen, wie etwa Lymphknoten und/oder die Milz, und nicht-lymphatische Strukturen, insbesondere solche, in denen dendritische Zellen gefunden werden, wie etwa Haut, Lungen und/oder Magen-Darm-Trakt.
  • Verstärkung einer Immunantwort durch eine Zusammensetzung, in welcher eine ISS und ein immunmodulatorisches Agens unmittelbar assoziiert sind, bezieht sich auf eine Modulierung einer Immunantwort auf die Verabreichung der Zusammensetzung hin, verglichen zu der Immunantwort auf die Verabreichung der ISS und des immunmodulatorischen Agens, die in Bezug aufeinander frei löslich sind. Die Verstärkung einer Immunantwort beinhaltet die Modulation einer Immunantwort, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Stimulierung, Suppression und eine Verschiebung des Typs der Immunantwort, zum Beispiel zwischen einer Antwort vom Th1-Typ und einer Antwort vom Th2-Typ.
  • Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die ein ISS-Antigen-Konjugat oder ein ISS-Antigen-Gemisch und ein Adjuvans umfassen, wobei auf die gemeinsame Verabreichung hin die Assoziation von ISS-Antigen und Adjuvans darin wirksam ist, eine Immunantwort zu verstärken, verglichen zu der gemeinsamen Verabreichung des ISS-Antigens ohne Adjuvans. In solchen Zusammensetzungen wird das Adjuvans in Assoziation mit dem ISS-Antigen gehalten, um Zielzellen zu dem ISS-Antigen zu rekrutieren und zu aktivieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Methoden für die Verwendung von ISS in Verbindung mit einem Antigen in der Stimulierung einer Immunantwort bereit. Vorzugsweise und wie bei diesen Methoden verwendet, stellt die ISS eine Adjuvansartige Aktivität in der Generierung einer Immunantwort vom Th1-Typ auf das Antigen bereit.
  • Vorzugsweise tendiert die gemäß der Erfindung stimulierte Immunantwort zu dem Phänotyp vom Th1-Typ hin und weg von dem Phänotyp des Th2-Typs. Bezüglich der Erfindung kann die Stimulierung einer Immunantwort vom Th1-Typ in vitro oder ex vivo durch Messen der Zytokin-Produktion von mit ISS behandelten Zellen, verglichen zu solchen, die ohne ISS behandelt sind, bestimmt werden. Zu Methoden zur Bestimmung der Zytokin-Produktion von Zellen zählen solche Methoden, die hierin beschrieben sind und jegliche im Fachgebiet bekannte Methoden. Die Art von Zytokinen, die als Reaktion auf die ISS-Behandlung produziert werden, weisen auf eine Immunantwort mit Tendenz zum Th1-Typ oder zum Th2-Typ durch die Zellen hin. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „zum TH1-Typ tendierende" Zytokin-Produktion auf die messbar erhöhte Produktion von Zytokinen in Verbindung mit einer Immunantwort vom Th1-Typ in der Gegenwart eines Stimulators, verglichen zu der Produktion solcher Zytokine in der Abwesenheit der Stimulation. Zu Beispielen solcher Zytokine mit Tendenz zum Th1-Typ zählen, ohne darauf beschränkt zu sein,. IL-2, IL-12 und IFN-γ. Im Gegensatz dazu bezieht sich "Zytokine mit Tendenz zum Th2-Typ" auf solche in Verbindung mit einer Immunantwort vom Th2-Typ, und umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13. Zu Zellen, die für die Bestimmung der ISS-Aktivität nützlich sind, zählen Zellen des Immunsystems, Primärzellen, die aus einem Wirt und/oder Zelllinien isoliert sind, vorzugsweise APCs und Lymphozyten, sogar noch bevorzugter Makrophagen und T-Zellen.
  • Die Stimulierung einer Immunantwort vom Th1-Typ kann auch in einem Wirt gemessen werden, der mit einer ISS-Antigen-Zusammensetzung behandelt ist, und kann mittels jeglicher im Fachgebiet bekannter Methode bestimmt werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf: (1) eine Reduktion der Mengen an IL-4, gemessen vor und nach der Antigen-Provokation; oder eine Detektion geringerer (oder sogar abwe sender) Mengen an IL-4 in einem mit ISS-Antigen behandelten Wirt, verglichen zu einer Antigen-geprimten, oder geprimten und provozierten, Kontrolle, die ohne ISS behandelt ist; (2) einen Anstieg der Mengen an IL-12, IL-18 und/oder IFN (α, β oder γ) vor und nach der Antigen-Provokation; oder die Detektion höherer Mengen an IL-12, IL-18 und/oder IFN (α, β oder γ) in einem ISS-Antigen-behandelten Wirt, verglichen zu einer Antigen-geprimten, oder geprimten und provozierten, Kontrolle, die ohne ISS behandelt ist; (3) die IgG2a-Antikörper-Produktion in einem ISS-Antigen-behandelten Wirt, verglichen zu einer Kontrolle, die ohne ISS behandelt ist; und/oder (4) eine Verminderung der Mengen an Antigen-spezifischem IgE, wie vor und nach der Antigen-Provokation gemessen; oder die Detektion geringerer (oder sogar abwesender) Mengen an Antigen-spezifischem IgE in einem ISS-Antigen-behandelten Wirt, verglichen zu einer Antigen-geprimten, oder geprimten und provozierten, Kontrolle, die ohne ISS behandelt ist. Eine Vielzahl dieser Bestimmungen kann durch Messen der Zytokine, die durch APCs und/oder Lymphozyten, vorzugsweise Makrophagen und/oder T-Zellen, produziert werden, in vitro oder ex vivo unter Anwendung der hierin beschriebenen Methoden oder jeglicher im Fachgebiet bekannter Methoden vorgenommen werden. Zu den Methoden zur Bestimmung der Antikörper-Produktion zählen jegliche im Fachgebiet bekannte Methoden.
  • Die Zytokin-Induktion mit Tendenz zum Th1-Typ, die als ein Ergebnis der ISS-Verabreichung erfolgt, produziert verstärkte zelluläre Immunantworten, wie etwa jene, die durch NK-Zellen, zytotoxische Killerzellen, Th1-Helfer- und Gedächtniszellen erfolgen. Diese Antworten sind besonders nützlich zur Verwendung in der schützenden oder therapeutischen Impfung gegen Viren, Pilze, protozoische Parasiten, Bakterien, allergische Erkrankungen und Asthma, als auch Tumoren.
  • ALLGEMEINE TECHNIKEN
  • Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wendet, sofern nicht anderweitig angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie an, die innerhalb der Sachkenntnis des Gebiets liegen. Diese Techniken sind in der Literatur umfassend erläutert, wie zum Beispiel in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Zweite Auflage (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, Hrsg., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, Hrsg., 1987); "Methods of Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, Hrsg.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, Hrsg., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., Hrsg., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., Hrsg., 1994); und "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al., Hrsg., 1991).
  • ISS ENTHALTENDE ZUSAMMENSETZUNGEN
  • Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist eine ISS, die zur Hervorrufung einer gewünschten Immunantwort fähig ist. Die Abkürzung "ISS", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Oligonukleotidsequenzen, die eine messbare Immunantwort bewirken, wie in vitro, in vivo und/oder ex vivo gemessen. Zu Beispielen messbarer Immunantworten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Antigenspezifische Antikörperproduktion, Sekretion von Zytokinen, Aktivierung oder Expansion von Lymphozyten-Populationen, wie etwa NK-Zellen, CD4+ T-Lymphozyten, CD8+ T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und ähnliche. Vorzugsweise aktivieren die ISS-Sequenzen präferenziell eine Antwort vom Th1-Typ. Das Oligonukleotid der Zusammensetzung enthält wenigstens eine oktamere ISS.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält das Oligonukleotid mindestens eine ISS und kann vielfache ISS enthalten. Die ISS können innerhalb des Oligonukleotids benachbart sein, oder sie können durch weitere Nukleotidbasen innerhalb des Oligonukleotids getrennt sein.
  • Wie hierin austauschbar verwendet, umfassen die Begriffe "Oligonukleotid" und "Polynukleotid" einzelsträngige DNA (ssDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA), einzelsträngige RNA (ssRNA) und doppelsträngige RNA (dsRNA), modifizierte Oligonukleotide und Oligonukleoside oder Kombinationen davon. Das Oligonukleotid kann linear oder zirkulär konfiguriert sein, oder das Oligonukleotid kann sowohl lineare als auch zirkuläre Segmente enthalten.
  • Im Allgemeinen übt die dsRNA eine immunstimulatorische Wirkung aus und ist von der Erfindung umfasst. Zu Modifikationen der ISS zählen Modifikationen der 3'OH- oder 5'OH-Gruppe, Modifikationen der Zuckerkomponente und Modifikationen der Phosphatgruppe. Verschiedene solcher Modifikationen sind nachstehend beschrieben.
  • MODIFIZIERTE BASEN UND BASENANALOGA
  • Oligonukleotide sind Polymere von Nukleosiden, die im Allgemeinen durch Phosphoester-Verknüpfungen verbunden sind. Ein Nukleosid besteht aus einer Purin-(Adenin oder Guanin oder Derivat davon) oder Pyrimidin- (Thymin, Cytosin oder Uracil, oder Derivat davon)-Base, die an einen Zucker gebunden ist. Die vier Nukleosid-Einheiten (oder Basen) in DNA sind als Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin und Desoxycytidin bezeichnet. Ein Nukleotid ist ein Phosphatester eines Nukleosids.
  • Vielfache Zucker, oder Phosphate in jeglicher Kombination, können in die ISS substituiert werden.
  • Das Oligonukleotid der Erfindung kann Ribonukleotide (die Ribose als der einzigen oder hauptsächlichen Zuckerkomponente enthalten), Desoxyribonukleotide (die Desoxyribose als der hauptsächlichen Zuckerkomponente enthalten) umfassen, oder, gemäß dem Stand der Technik, können modifizierte Zucker oder Zucker-Analoga in die ISS aufgenommen werden. So kann, zusätzlich zu der Ribose und Desoxyribose, die Zucker-Komponente Pentose, Desoxypentose, Hexose, Desoxyhexose, Glukose, Arabinose, Xylose, Lyxose und eine Zucker-"analoge" Zyklopenthylgruppe sein. Der Zucker kann in Pyranosyl- oder in einer Furanosyl-Form vorliegen. In der ISS ist die Zucker-Komponente vorzugsweise das Furanosid von Ribose, Desoxyribose, Arabinose oder 2'-O-Methylribose, und der Zucker kann an die jeweiligen heterozyklischen Basen entweder in einer α- oder β-anomären Konfiguration gebunden sein. Die Präparierung dieser Zucker oder Zucker-Analoga und der jeweiligen "Nukleoside", worin solche Zucker oder Analoga an eine heterozyklische Base (Nukleinsäure-Base) gebunden sind, ist als solches bekannt und braucht hierin nicht beschrieben zu werden, außer in dem Umfang, in dem sich diese Präparierung auf irgendein spezifisches Beispiel bezieht.
  • Das phosphorige Derivat (oder die modifizierte Phosphatgruppe), die an die Zucker- oder Zuckeranalogon-Komponente in den Oligonukleotiden der vorliegenden Erfindung gebunden werden kann, kann ein Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, Alkylphosphat, Alkanphosphat, Phosphorthioat, Phosphordithioat oder ähnliches sein. Eine Phosphorthioat-Verknüpfung kann anstelle einer Phosphodiester-Verknüpfung verwendet werden. Die Präparierung der oben genannten Phosphat-Analoga und ihr Einbau in Nukleotide, modifizierte Nukleotide und Oligonukleotide ist als solches bekannt und braucht hierin nicht ausführlich beschrieben zu werden. Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841–1848; Chaturvedi et al.(1996) Nucleic Acids Res. 24:2318–2323; und Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966–2973. Vorzugsweise umfassen die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung Phosphothioat-Verknüpfungen. Oligonukleotide mit Phosphothioat-Rückgraten können immunogener sein als solche mit Phosphodiester-Rückgraten und scheinen resistenter gegenüber einem Abbau nach Injektion in den Wirt zu sein. Braun et al. (1988) J. Immunol. 141:2084–2089; und Latimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1057–1064.
  • Die heterozyklischen Basen, oder Nukleinsäure-Basen, die in die ISS aufgenommen werden, können natürlich vorkommende Purin- und Pyrimidin-Hauptbasen sein (nämlich Thymin, Cytosin, Adenin und Guanin, wie oben erwähnt).
  • In einer Ausführungsform umfasst die ISS wenigstens eine modifizierte Base. Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck "modifizierte Base" synonym mit "Basenanalogon", und zum Beispiel ist "modifiziertes Cytosin" synonym mit "Cytosin-Analogon". Entsprechend sind "modifizierte" Nukleoside oder Nukleotide hierin als synonym mit Nukleosid- oder Nukleotid-"Analoga" definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Cytosin der ISS mit einem Cytosin substituiert, das durch die Addition an C-5 von Cytosin einer Elektronen-entziehenden Komponente modifiziert ist. Solch ein modifiziertes Cytosin ist 5-Bromcytosin.
  • METHODEN ZUR MODULIERUNG VON IMMUNANTWORTEN MIT ISS
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die ISS als der einzigen immunologisch aktiven Substanz umfassen. Auf die Verabreichung hin induziert diese ISS eine Stimulierung des Immunsystems.
  • In anderen Ausführungsformen kann die ISS in Verbindung mit ein oder mehreren Mitgliedern der Gruppe der immunmodulatorischen Moleküle verabreicht werden, umfassend Antigene (einschließlich, doch nicht beschränkt auf Proteine, Glykoproteine, Polysaccharide und Lipide) und/oder immunmodulatorische Faszilitatoren, wie etwa costimulatorische Moleküle (einschließlich, doch nicht beschränkt auf Zytokine, Chemokine, Targeting-Proteinligand, Transaktivierungsfaktoren, Peptide, und Peptide, die eine modifizierte Aminosäure umfassen) und Adjuvanzien (einschließlich, doch nicht beschränkt auf Alaun, Lipidemulsionen und Polylaktid/Polyglycolid-Mikropartikel). Der Begriff "immunmodulatorisch", wie hierin verwendet, umfasst immunstimulatorische als auch immunsuppressive Effekte. Zu immunstimulatorischen Effekten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, solche, die zelluläre oder humorale Immunreaktionen direkt oder indirekt verstärken. Zu Beispielen der immunstimulatorischen Wirkungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine erhöhte Antigenspezifische Antikörperproduktion; die Aktivierung oder Proliferierung einer Lymphozyten-Population, wie etwa von NK-Zellen, CD4+ T-Lymphozyten, CD8+ T-Lymphozyten, Makrophagen und ähnliches; eine erhöhte Synthese von immunstimulatorischen Zytokinen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α und ähnliches. Zu immunsuppressiven Wirkungen zählen solche, die zelluläre oder humorale Immunreaktionen direkt oder indirekt vermindern. Zu Beispielen der immunsuppressiven Wirkungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Verminderung der Antigen-spezifischen Antikörperproduktion, wie etwa eine reduzierte IgE-Prduktion, die Aktivierung von Lymphozyten oder anderen Zellpopulationen, die immunsuppressive Aktivitäten aufweisen, wie etwa solche, die zu einer Immuntoleranz führen; und eine erhöhte Synthese von Zytokinen, die suppressive Wirkungen auf bestimmte zelluläre Funktionen aufweisen. Ein Beispiel dafür ist IFN-γ, welches einen IL-4-induzierten Klassen-Übergang zu IgE und IgG1 zu blockieren scheint, wobei die Mengen dieser Antikörper-Unterklassen reduziert werden.
  • Die ISS und das Antigen und/oder der immunmodulatorische Faszilitator können zusammen in der Form eines Konjugats verabreicht werden oder in einem Gemisch in ausreichend dichtem Zeitabstand gemeinsam verabreicht werden, um eine Immunantwort zu modulieren. Vorzugsweise werden die ISS und das immunmodulatorische Molekül gleichzeitig verabreicht. Der Ausdruck "Co-Verabreichung", wie hierein verwendet, bezieht sich auf die Verabreichung wenigstens zweier unterschiedlicher Substanzen in ausreichend dichtem Zeitabstand, um eine Immunantwort zu modulieren. Vorzugsweise bezieht sich die Co-Verabreichung auf die gleichzeitige Verabreichung wenigstens zweier unterschiedlicher Substanzen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Konjugat" auf einen Komplex, in welchem eine ISS und ein immunmodulatorisches Molekül verbunden sind. Zu solchen Konjugat-Bindungen zählen kovalente und/oder nicht-kovalente Bindungen.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff "Antigen" eine Substanz, die durch einen Antikörper oder durch einen T-Zell-Antigenrezeptor erkannt und spezifisch gebunden wird. Antigene können Peptide, Proteine, Glykoproteine, Polysaccharide, Ganglioside und Lipide umfassen; Abschnitte davon und Kombinationen davon. Die Antigene können solche sein, die in der Natur zu finden sind, oder können synthetisch sein. Haptene sind innerhalb des Umfangs von "Antigen" umfasst. Ein Hapten ist eine niedermolekulare Verbindung, die aus sich selbst heraus nicht immunogen ist, doch immunogen gemacht wird, wenn sie mit einem immunogenen Molekül konjugiert wird, das antigene Determinanten enthält.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Adjuvans" auf eine Substanz, die bei Zugabe zu einem immunogenen Agens, eine Immnunantwort auf ein Agens in dem Empfänger auf die Exposition an das Gemisch hin nicht-spezifisch verstärkt oder potenziert.
  • In der Stimulierung einer Immunantwort ist von den meisten Adjuvanzien generell festgestellt worden, dass sie Makrophagen an die Stelle der Injektion stimulieren. Wie hierin beschrieben, wurde von der ISS gezeigt, dass sie die Zytokin-Produktion aus Makrophagenzellen stimuliert, weshalb als solche immunstimulatorische Polynukleotide als Adjuvanzien fungieren. Somit stellt bei einer Ausführungsform die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die ISS und ein Antigen umfassen. Für die Verabreichung mit ISS geeignete Antigene umfassen jegliches Molekül, das zur Hervorrufung einer B-Zell- oder T-Zell-Antigen-spezifischen Reaktion fähig ist. Vorzugsweise rufen Antigene eine Antikörperreaktion hervor, die für das Antigen spezifisch ist. Eine breite Vielfalt von Molekülen sind Antigene. Zu diesen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Zucker, Lipide und Polypeptide, als auch Makromoleküle, wie etwa komplexe Kohlehydrate und Phospholipide. Kleine Moleküle müssen möglicherweise haptenisiert werden, um antigen gemacht zu werden. Vorzugsweise zählen zu Antigenen der vorliegenden Erfindung Peptide, Lipide (z.B. Sterole, Fettsäuren und Phospholipide), Polysaccharide, wie etwa solche, die in Hemophilus influenza-Impfstoffen verwendet werden, Ganglioside und Glykoproteine.
  • Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "Peptid" Peptide und Proteine, die von ausreichender Länge und Zusammensetzung sind, um eine biologische Reaktion zu bewirken, z.B. die Antikörperproduktion oder Zytokin-Aktivität, ob das Peptid nun ein Hapten ist oder nicht. Typischerweise betragen die Peptide wenigstens sechs Aminosäurereste in der Länge. Der Begriff "Peptid" umfasst außerdem modifizierte Aminosäuren, wobei zu solchen Modifikationen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Phosphorylierung, Glykosylierung, Pegylierung, Lipidisierung und Methylierung.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die ISS und antigene Peptide umfassen. Zu antigenen Peptiden können gereinigte native Peptide, synthetische Peptide, rekombinante Proteine, Rohproteinextrakte, abgeschwächte oder inaktivierte Vieren, Zellen, Mikroorganismen oder Fragmente solcher Peptid zählen.
  • Viele antigene Peptide und Proteine sind bekannt und im Fachgebiet verfügbar; andere können unter Anwendung herkömmlicher Techniken identifiziert werden. Zu Protein-Antigenen, die als immunmodulatorische Faszilitatoren dienen können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden Beispiele. Isolierte native oder rekombinante Antigene können von Pflanzenpollen stammen (siehe zum Beispiel Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1229–1236; Breiteneder et al. (1989) EMBO J. 8:1935–1938; Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17–31; und Malley (1989) J. Reprod. Immunol. 16:173–186), Staubmilbenproteinen (siehe zum Beispiel Chua et al. (1988) J. Exp. Med. 167:175–182; Chua et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124–129; und Joost van Neerven et al. (1993) J. Immunol. 151:2326–2335), Tierhautschuppen (siehe zum Beispiel Rogers et al. (1993) Mol. Immunol. 30:559–568), Tierspeichel, Bienengift und Pilzsporen. Lebende, abgeschwächte und inaktivierte Mikroorganismen, wie etwa HIV-1, HIV-2, Herpes simplex-Virus, Hepatitis A-Virus (Bradley et al. (1984) J. Med. Virol. 14:373–386), Rotavirus, Poliovirus (Jiang et al. (1986) J. Biol. Stand. 14:103–109), Hepatitis B-Virus, Masernvirus (James et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332:1262–1266), humanes und bovines Papillomavirus, und Slow-Brain-Viren können Peptid-Antigene liefern. Zur Immunisierung gegen die Tumorbildung können immunmodulatorische Peptide Tumorzellen (lebend oder bestrahlt), Tumorzellextrakte oder Proteinuntereinheiten von Tumorantigenen enthalten. Impfstoffe für die immunbasierte Kontrazeption können durch Aufnahme von Spermaproteinen, die mit ISS verabreicht werden, gebildet werden. Lea et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:263.
  • Die ISS und das Antigen können als ein ISS-Antigen-Konjugat verabreicht werden und/oder sie können als ein Komplex in der Form eines Gemischs, wie etwa in einer Emulsion, gemeinsam verabreicht werden. Die Assoziation aus der ISS und den Antigen-Molekülen in einem ISS-Antigen-Konjugat kann durch kovalente Interaktionen und/oder durch nicht-kovalente Interaktionen erfolgen, einschließlich hochaffiner und/oder niederaffiner Interaktionen. Zu Beispielen der nicht-kovalenten Interaktionen, die eine ISS und ein Antigen in einem ISS-Antigen-Konjugat koppeln können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, ionische Bindungen, hydrophobe Interaktionen, Wasserstoffbrückenbindungen und van der Waalsche Anziehungskräfte.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die ISS in Verbindung mit ein oder mehreren immunmodulatorischen Faszilitatoren verabreicht werden. Somit stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die eine ISS und einen immunmodulatorischen Faszilitator umfasst. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "immunmodulatorischer Faszilitator" auf Moleküle, die die immunmodulatorische Aktivität einer ISS för dern und/oder verstärken. Beispiele der immunmodulatorischen Faszilitatoren können co-stimulatorische Moleküle umfassen, wie etwa Zytokine und/oder Adjuvanzien. Die ISS und der Faszilitator können als ein ISS-Faszilitator-Konjugat verabreicht werden und/oder sie können als ein Komplex in der Form eines Gemischs, wie z.B. in einer Emulsion, gemeinsam verabreicht werden. Die Assoziation der ISS und der Faszilitator-Moleküle in einem ISS-Faszilitator-Konjugat kann durch kovalente Interaktion und/oder durch nicht-kovalente Interaktionen, einschließlich hochaffiner und/oder niederaffiner Interaktionen, erfolgen. Beispiele der nicht-kovalenten Interaktionen, die eine ISS und einen Faszilitator in einem ISS-Faszilitator-Konjugat koppeln können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, ionische Bindungen, hydrophobe Interaktionen, Wasserstoffbrückenbindungen und van der Waalsche Anziehungskräfte.
  • Immunmodulatorische Faszilitatoren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, costimulatorische Moleküle (wie etwa Zytokine, Chemokine, Targeting-Proteinligand, Transaktivierungsfaktoren, Peptide, und Peptide, die eine modifizierte Aminosäure umfassen) und Adjuvanzien (wie etwa Alaun, Lipidemulsionen und Polylaktid/Polyglycolid-Mikropartikel).
  • Unter geeigneten immunmodulatorischen Zytokin-Peptiden für die Verabreichung mit ISS befinden sich die Interleukine (z.B. IL-1, IL-2, IL-3 etc.), Interferone (z.B. IFN-α, IFN-β, IFN-γ), Erythropoetin, Kolonie-stimulierende Faktoren (z.B. G-CSF, M-CSF, GM-CSF) und TNF-α. Vorzugsweise sind immunstimulatorische Peptide zur Verwendung in Verbindung mit ISS-Oligonukleotiden solche, die Immunantworten vom Th-1-Typ stimulieren, wie etwa IL-12 (Bliss et al. (1996) J. Immunol. 156:887–894), IL-18, TNF-α, β und γ und/oder transformierender Wachstumsfaktor-(TGF)-α.
  • Peptide, die mit ISS verabreicht werden, können auch Aminosäuresequenzen umfassen, die eine Proteinbindung an einen spezifischen Rezeptor vermitteln, oder die das Targeting auf einen spezifischen Zelltyp oder Gewebe vermitteln. Zu Beispielen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Antikörper oder Antikörperfragmente, Peptidhormone, wie etwa humanes Wachstumshormon, und Enzyme. Zu immunmodulatorischen Peptiden zählen auch Peptidhormone, Peptidneurotransmitter und Peptid wachstumsfaktoren. Costimulatorische Moleküle, wie etwa B7 (DC80), TRAPs-aktivierende Proteine, wie etwa Transkriptionsfaktoren, Chemokine, wie etwa Makrophagen-chemotaktisches Protein (MCP) und weitere Chemoattraktanzien oder chemotaktische Peptide sind ebenfalls nützliche Peptide für die Verabreichung mit ISS.
  • Die Erfindung stellt auch die Verabreichung von ISS in Verbindung mit einem Adjuvans bereit. Die Verabreichung eines Antigens mit einer ISS und einem Adjuvans führt zu der Potenzierung einer Immunantwort auf das Antigen und kann somit eine verstärkte Immunantwort, verglichen zu der, die aus einer Zusammensetzung resultiert, die die ISS und das Antigen alleine umfasst, ergeben. Beispielsweise haben wir gezeigt, dass die Verabreichung eines Antigens mit einer ISS und einem Adjuvans zu einer verstärkten primären Immunantwort führt. Somit stellt die Erfindung in einer anderen Ausführungsform Zusammensetzungen bereit, umfassend die ISS, ein Antigen und ein Adjuvans, wobei die ISS/das Antigen/das Adjuvans gemeinsam verabreicht werden. Vorzugsweise enthält die immunogene Zusammensetzung eine Menge eines Adjuvans, die ausreicht, um die Immunantwort auf das Antigen zu potenzieren. Vorzugsweise umfassen die Adjuvanzien, ohne darauf beschränkt zu sein, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Alaun (Aluminiumsalze), Liposome und Mikropartikel, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Polystyrol, Stärke, Polyphosphazen und Polylaktid/Polyglycoside. Bevorzugter werden die ISS und das Antigen gemeinsam mit Alaun verabreicht. Noch bevorzugter werden die ISS und das Antigen gemeinsam mit Liposomen verabreicht. Sogar noch bevorzugter werden die ISS und das Antigen gemeinsam mit einer Öl-in-Wasser-Emulsion verabreicht.
  • Zu geeigneten Adjuvanzien zählen auch, ohne darauf beschränkt zu sein, Squalen-Gemische (SAF-1), Muramylpeptid, Saponin-Derivate, Mykobakterium-Zellwand-Präparate, Monophosphoryl-Lipid-A, Mycolinsäure-Derivate, nicht-ionische Blockcopolymer-Surfaktanzien, Quil A, Choleratoxin-B-Untereinheit, Polyphosphazen und Derivate, und immunstimulierende Komplexe (ISCOMs), wie etwa die von Takahashi et al. (1990) Nature 344:873–875 beschriebenen, als auch Lipid-basierte Adjuvanzien und andere hierein beschriebene. Für die veterinärmedizinische Anwendung und für die Produktion von Antikörpern in Tieren können mitogene Komponenten von Freund-Adjuvans (sowohl komplett als auch inkomplett) verwendet werden.
  • Wie mit allen immunogenen Zusammensetzungen, müssen die immunologisch wirksamen Mengen der Komponenten empirisch bestimmt werden. Zu Faktoren, die bedacht werden müssen, zählen die Antigenität, ob die ISS und/oder das Antigen mit einem immunmodulatorischen Faszilitator komplexiert oder kovalent daran gebunden werden wird oder nicht, ein Adjuvans oder Trägerprotein oder anderer Träger, der Verabreichungsweg und die Anzahl der zu verabreichenden Immunisierungsdosen. Diese Faktoren sind im Gebiet der Impfstoffe bekannt, und es liegt durchaus innerhalb der Befähigung von Immunologen, derartige Bestimmungen ohne unnötiges Experimentieren vorzunehmen.
  • Die Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen bereit, in welchen die ISS und ein oder mehrere immunmodulatorische Moleküle in einem Abstand unmittelbar assoziiert sind, der effektiv ist, um die Immunantwort zu verstärken, die verglichen zur Verabreichung der ISS und des immunmodulatorischen Moleküls als einem Gemisch erzeugt wird. Somit stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Methoden zu deren Verwendung bereit, umfassend ein einkapselndes Agens, das die unmittelbare Assoziation der ISS und des immunmodulatorischen Moleküls aufrecht erhalten kann, bis der Komplex für das Ziel verfügbar ist. Vorzugsweise liegt die Zusammensetzung, die eine ISS, ein immunmodulatorisches Molekül und ein Einkapselungsagens umfasst, in der Form von Adjuvans-Öl-in-Wasser-Emulsionen, Partikeln und/oder Liposomen vor. Bevorzugter liegen die Adjuvans-Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mikropartikel und/oder Liposomen, die ein ISS-immunmodulatorisches Molekül einkapseln, in der Form von Partikeln in einer Größe von etwa 0,04 μm bis etwa 100 μm, bevorzugter von etwa 0,1 μm bis etwa 20 μm, sogar noch bevorzugter von etwa 0,15 μm bis etwa 10 μm vor.
  • Kolloidale Dispersionssysteme, wie etwa Mikrokügelchen, Beads, makromolekulare Komplexe, Nanokapseln und Lipid-basierte Systeme, wie etwa Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposome, können für die wirksame Einkapselung der ISS-enthaltenen Zusammensetzungen sorgen.
  • Die Einkapselungs-Zusammensetzung umfasst außerdem eine beliebige aus einer breiten Vielfalt von Komponenten. Zu diesen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Alaun, Lipide, Phospholipide, Lipidmembranstrukturen (LMS), Polyethylenglykol (PEG) und andere Polymere, wie etwa Polypeptide, Glykopeptide und Polysaccharide.
  • Polypeptide, die für Einkapselungskomponenten geeignet sind, umfassen jegliche im Fachgebiet bekannte, wozu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fettsäurebindende Proteine. Modifizierte Polypeptide enthalten jegliche aus einer Vielfalt von Modifikationen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Glykosylierung, Phosphorylierung, Myristylierung, Sulfierung und Hydroxylierung. Wie hierin verwendet, ist ein geeignetes Polypeptid ein solches, das eine ISS-enthaltende Zusammensetzung schützen wird, um dessen immunmodulatorische Aktivität beizubehalten. Zu Beispielen der Bindungsproteine zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Albumine, wie etwa Rinderserumalbumin (BSA) und Erbsenalbumin.
  • Weitere geeignete Polymere können jegliche im Fachgebiet der Pharmazeutika bekannte sein und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, natürlich vorkommende Polymere, wie etwa Dextrane, Hydroxyethylstärke und Polysaccharide, und synthetische Polymere. Zu Beispielen der natürlich vorkommenden Polymere zählen Proteine, Glykopeptide, Polysaccharide, Dextran und Lipide. Das zusätzliche Polymer kann ein synthetisches Polymer sein. Zu Beispielen der synthetischen Polymere, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyalkylglykole (PAG), wie etwa PEG, polyoxyethylierte Polyole (POP), wie etwa polyoxyethyliertes Glycerol (POG), Polytrimethylenglykol (PTG), Polypropylenglykol (PPG), Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyvinylalkohol (PVA), Polyacrylsäure, Polyethyloxazolin, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyaminosäuren, Polyurethan und Polyphosphazen. Die synthetischen Polymere können auch linear oder verzweigt, substituiert oder unsubstituiert, ein Homopolymer, Copolymer oder Blockcopolymer aus zwei oder mehreren unterschiedlichen synthetischen Monomeren sein. PEGs stellen eine vielfältige Gruppe von Molekülen dar. Eine allge meine Formel für PEGs ist die folgende: R1O-(CH2CH20)n-R3 worin R1 und R3 unabhängig H, H3C, OH, oder eine lineare oder verzweigte, substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe sind und n eine ganze Zahl zwischen 1 und etwa 1.000 ist. Der Begriff "PEG" umfasst sowohl unsubstituiertes (R1 und R3 = H) als auch substituiertes PEG. Die PEGs zur Verwendung in Einkapselungs-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden entweder von Chemikalienlieferanten bezogen oder unter Anwendung der einem Fachmann des Gebiets bekannten Techniken synthetisiert.
  • Der Begriff "LMS", wie hierin verwendet, meint lamellare Lipidpartikel, worin polare Kopfgruppen eines polaren Lipids so angeordnet sind, dass sie zur wässrigen Phase einer Grenzfläche zeigen, um Membranstrukturen herzustellen. Zu Beispielen der LMS zählen Liposomen, Mizellen, Cochleaten (d.h. generell zylindrische Liposomen), Mikroemulsionen, unilamellare Vesikel, multilamellare Vesikel und ähnliches.
  • Ein bevorzugtes kolloidales Dispersionssystem dieser Erfindung ist ein Liposom. In Mäusen, die mit einem Liposom-verkapselten Antigen immunisiert wurden, schienen die Liposome eine Immunantwort vom Th-1-Typ auf das Antigen zu verstärken. Aramaki et al. (1995) Vaccine 13:1809–1814. Wie hierein verwendet, ist ein "Liposom" oder "Lipidvesikel" ein kleines Vesikel, das durch mindestens eine und möglicherweise mehr als eine Doppelschicht-Lipidmembran umgrenzt ist. Liposome werden künstlich aus Phospholipiden, Glykolipiden, Lipiden, Steroiden, wie etwa Cholesterol, verwandten Molekülen oder einer Kombination davon mittels irgendeiner im Fachgebiet bekannten Technik, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Beschallung, Extrusion oder Entfernung von Detergenz aus Lipid-Detergenz-Komplexen, hergestellt.
  • Ein Liposom kann wahlweise auch zusätzliche Komponenten umfassen, wie etwa eine Gewebe-anzielende Komponente. Es ist klar, dass eine "Lipidmembran" oder ""Lipid-Doppelschicht" nicht ausschließlich aus Lipiden zu bestehen braucht, sondern zusätzlich jegliche weitere geeignete Komponenten enthalten kann, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Cholesterol und andere Steroide, Lipid-lösliche Chemikali en, Proteine einer beliebigen Länge, und weitere amphipatische Molekülen, vorausgesetzt, dass die generelle Struktur der Membran eine Platte aus zwei hydrophilen Oberflächen ist, zwischen die ein hydrophober Kern eingebracht ist. Für eine allgemeine Erörterung der Membranstruktur, siehe The Encyclopedia of Molecular Biology von J. Kendrew (1994). Für geeignete Lipide, siehe z.B. Lasic (1993) "Liposomes: from Physics to Applications" Elsevier, Amsterdam.
  • Vorzugsweise wird eine liposomale Zusammensetzung gewählt, die die Bildung der Membran mit reproduzierbaren Qualitäten, wie etwa dem Durchmesser, erlaubt und die in der Gegenwart von Elementen stabil ist, die erwartungsgemäß dort auftreten, wo das Liposom angewendet werden wird, wie etwa physiologische Puffer und zirkulierende Moleküle. Vorzugsweise ist das Liposom elastisch gegenüber den Effekten der Handhabung bei Lagerung, Gefriertrocknung und Mischung mit pharmazeutischen Exzipienten.
  • Zu für die Aufnahme in Lipidmembranstrukturen geeigneten Lipiden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, natürliche, halbsynthetische oder synthetische Mono- oder Diglycerophospholipide, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Phosphatidylcholine (PCs), Phosphatidylethanolamine (PEs), Phosphatidylglycerole (PGs), Phosphatidylinositole (PLs), Phosphatidinsäuren (PAs), Phosphatidylserine (PSs), Glycero- und Cardiolipide. Sphingolipide, wie etwa Sphingomyelin (SM) und Cerebroside können ebenfalls aufgenommen werden. Zwar kommen natürliche Phospholipide vor, bei denen sich die Phospho-Komponente an der sn-3-Position befindet und hydrophobe Ketten an den sn-1- und sn-2-Positionen, doch können synthetische Lipide eine alternative Stereochemie aufweisen, wobei z.B. die Phospho-gruppe an der sn-1- oder sn-2-Position liegt. Weiterhin können die hydrophoben Ketten an das Glycerol-Rückgrat durch Acyl-, Ether-, Alkyl- oder andere Verknüpfungen gebunden sein. Derivate dieser Lipide sind auch für den Einbau in Liposome geeignet. Zu Derivaten, die zur Verwendung geeignet sind, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Haloalkyl-Derivate, einschließlich solcher, in denen alle oder ein Teil der Wasserstoffatome der Alkylketten mit z.B. Fluor substituiert sind. Außerdem können auch Cholesterol und andere amphipatische Steroide, Bolaamphiphile (Lipide mit polaren Komponenten an beiden Enden des Moleküls, die Monoschicht-Membranen bilden) und Polyglycerolmonoalkylether aufgenommen werden. Liposome können sich aus einem einzelnen Lipid oder Gemischen aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Lipiden zusammensetzen.
  • In einer Ausführungsform wird die Lipid-Doppelschicht des Liposoms primär aus Phospholipiden gebildet. Vorzugsweise ist die Phospholipid-Zusammensetzung ein komplexes Gemisch, das eine Kombination aus PS und zusätzlichen Lipiden, wie PC, PA, PE, PG und SM, PI und/oder Cardiolipin (Diphosphatidylglycerol) umfasst. Wenn erwünscht, kann SM durch einen größeren Anteil an PC, PE oder eine Kombination davon ersetzt werden. PS kann wahlweise durch PG ersetzt werden. Die Zusammensetzung wird so gewählt, dass sie der LMS sowohl während der Lagerung als auch der Verabreichung Stabilität verleiht.
  • Ausführende Fachleute werden bei üblicher Sachkenntnis ohne weiteres erkennen, dass jedes Phospholipid in der vorangegangenen Liste in seiner Struktur in Abhängigkeit von den Fettsäure-Komponenten, die mit der Glycerol-Komponente des Phospholipids verestert sind, variieren kann. Generell können die handelsüblichsten Formen eines jeweiligen Phospholipids verwendet werden. Allerdings können Phospholipide, die bestimmte Fettsäure-Komponenten enthalten, für bestimmte Anwendungen bevorzugt sein.
  • Ein genereller Prozess zur Herstellung von Liposomen, die ISS-enthaltende Zusammensetzungen enthalten, ist der folgende. Eine wässrige Dispersion von Liposomen wird aus Membrankomponenten, wie etwa Phospholipiden, (z.B. PS, PC, PG, SM und PE) und Glykolipiden gemäß irgendeiner der bekannten Methoden hergestellt. Siehe z.B. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980). Die Liposome können außerdem Sterole, Dialkylphosphate, Diacylphosphatidinsäuren, Stearylamin, α-Tocopherol etc. in der liposomalen Membran enthalten.
  • Der derart hergestellten liposomalen Dispersion wird eine wässrige Lösung der ISS-enthaltenden Zusammensetzung zugesetzt und das Gemisch für einen gegebenen Zeitraum, vorzugsweise unter Erwärmung auf eine Temperatur oberhalb der Phasenübergangstemperatur der Membran oder über 40°C, stehen gelassen, gefolgt von einer Abkühlung, um dabei Liposome herzustellen, die die ISS-enthaltende Zusammensetzung in der liposomalen Membran enthalten.
  • Alternativ können die gewünschten Liposome auch durch vorheriges Vermischen der oben beschriebenen Membrankomponenten und der ISS-enthaltenden Zusammensetzung und Behandeln des Gemischs gemäß bekannter Methoden zur Herstellung von Liposomen hergestellt werden.
  • Die Lipidvesikeln können mittels irgendeiner im Fachgebiet bekannten Technik hergestellt werden. Zu den Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Mikroverkapselung, Mikrofluidisierung, LLC-Methode, Ethanolinjektion, Freoninjektion, die "Bubble"-Methode, Detergenzdialyse, Hydratation, Beschallung und Umkehrphasenverdampfung. Im Überblick wiedergegeben bei Watwe et al. (1995) Curr. Sci. 68:715–724. Zum Beispiel erzeugen die Ultrabeschallung und Dialysemethoden allgemein kleine unilamellare Vesikeln; die Extrusion und Umkehrphasenverdampfung erzeugen allgemein Vesikeln von größerer Größe. Die Techniken können kombiniert werden, um Vesikeln mit den erwünschtesten Attributen bereitzustellen.
  • Wahlweise umfasst die LMS auch Steroide, um die Starrheit der Membran zu verbessern. Es kann eine beliebige Menge eines Steroids verwendet werden. Zu geeigneten Steroiden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Cholesterol und Cholestanol. Zu weiteren Molekülen, die zur Erhöhung der Starrheit der Membran verwendet werden können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, vernetzte Phospholipide.
  • Weitere bevorzugte LMSs zur Verwendung in vivo sind solche mit einer erhöhten Fähigkeit, in das retikuloendotheliale System einzudringen, das normalerweise phagozytosiert und nicht-native Materialien zerstört, wodurch den Liposomen einen längerer Zeitraum gegeben wird, in welchem sie die Zielzelle erreichen können. In dieser Hinsicht wirksame Lipidzusammensetzungen sind solche mit einem großen Anteil an SM und Cholesterol, oder SM und PI. LMSs mit verlängerter Zirkulationszeit umfassen auch solche, die das Monosialogangliosid GM1, Glucuronid oder PEG umfassen.
  • Die Erfindung umfasst LMS-enthaltende Gewebe oder zelluläre Targeting-Komponenten. Solche Targeting-Komponenten sind Komponenten einer LMS, die ihre Anhäufung an bestimmten Gewebe oder zellulären Stellen in Präferenz zu anderen Gewebe und zellulären Stellen fördert, wenn sie an ein intaktes Tier, Organ oder Zellkultur verabreicht werden. Eine Targeting-Komponente ist allgemein von der Außenseite des Liposoms zugänglich und ist daher vorzugsweise entweder an die äußere Oberfläche gebunden oder in die äußere Lipid-Doppelschicht eingeführt. Eine Targeting-Komponente kann unter anderem ein Peptid, eine Region eines größeren Peptids, ein für ein Zelloberflächenmolekül oder Marker spezifischer Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, eine Nukleinsäure, ein Kohlehydrat, eine Region eines komplexen Kohlehydrats, ein spezielles Lipid oder ein kleines Molekül, wie etwa ein Wirkstoff, Hormon oder Hapten, in Bindung an irgendeines der zuvor genannten Moleküle, sein. Antikörper mit Spezifität gegenüber Zelltyp-spezifischen Zelloberflächenmarkern sind im Fachgebiet bekannt und lassen sich mittels im Fachgebiet bekannter Methoden ohne weiteres präparieren.
  • Die LMSs lassen sich auf jeden Zelltyp richten, auf den eine therapeutische Behandlung gelenkt werden soll, z.B. einen Zelltyp, der eine Immunantwort modulieren und/oder daran teilhaben kann. Zu solchen Zielzellen und Organen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, APCs, wie etwa Makrophagen, dendritische Zellen und Lymphozyten, lymphatische Strukturen, wie etwa Lymphknoten und die Milz, und nicht-lymphatische Strukturen, insbesondere solche, in denen dendritische Zellen zu finden sind.
  • Die LMS-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können außerdem Surfaktanzien umfassen. Die Surfaktanzien können kationisch, anionisch, amphiphil oder nicht-ionisch sein. Eine bevorzugte Klasse von Surfaktanzien sind nicht-ionische Surfaktanzien; besonders bevorzugt sind solche, die wasserlöslich sind. Zu nichtionischen, wasserlöslichen Surfaktanzien zählen Polyoxyethylen-Derivate der Fettalkohole, Fettsäureester der Fettalkohole und Glycerylester, wobei die Polyoxyethylengruppe über eine Etherbindung an eine Alkoholgruppe gekoppelt ist. Zu Beispielen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureester, Polyoxyethylen-Castoröl-Derivate, Polyoxyethylen-gehärtete Castoröl-Derivate, Fett säure-Natriumsalze, Natriumcholate, Polyoxyethylen-Fettsäureester und Polyoxyethylenalkylether.
  • Zu den hierin umfassten LMS-Zusammensetzungen zählen Mizellen. Der Begriff "Mizellen", wie hierein verwendet, meint Aggregate, die sich aus Tensidmolekülen in wässrigen Lösungen oberhalb einer spezifischen Temperatur (Krafft-Punkt) oder einer charakteristischen Konzentration, der kritischen Mizellisierungskonzentration (cmc), bilden. Wird die cmc überschritten, so bleibt die Monomerkonzentration praktisch konstant und bilden die überschüssigen Tensidmoleküle Mizellen. Mizellen sind thermodynamisch stabile Assoziationskolloide der grenzflächenaktiven Substanzen, bei welchen die hydrophoben Radikale der Monomere im Inneren der Aggregate liegen und durch hydrophobe Interaktion zusammengehalten werden; die hydrophilen Gruppen liegen dem Wasser zugewandt und liefern durch Solvatisierung die Löslichkeit des Kolloids. Mizellen kommen in verschiedenen Formen (Kugeln, Stäbe, Scheiben) in Abhängigkeit von der chemischen Konstitution des Tensids und von der Temperatur, Konzentration oder Ionenstärke der Lösung vor. Das Erreichen der cmc äußert sich durch abrupte Veränderungen der Oberflächenspannung, des osmotischen Drucks, der elektrischen Leitfähigkeit und der Viskosität.
  • Ein Prozess zur Herstellung von Mizellen, die ISS-enthaltende Zusammensetzungen enthalten, ist der folgende. Ein Mizellen-bildendes Surfaktant, wie etwa Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureester, Polyoxyethylen-Castoröl-Derivate, Polyoxyethylengehärtete Castoröl-Derivate, Fettsäure-Natriumsalze, Natriumcholate, Polyoxyethylen-Fettsäureester und Polyoxyethylenalkylether, Alkylglycoside wird Wasser bei einer Konzentration oberhalb der cmc zur Herstellung einer Mizellendispersion zugegeben. Der Mizellendispersion wird eine wässrige Lösung einer ISS-enthaltenden Zusammensetzung zugegeben, und das Gemisch wird für einen gegebenen Zeitraum, vorzugsweise unter Erwärmung bei 40°C oder höher, stehen gelassen, gefolgt von einer Abkühlung, um dabei Mizellen herzustellen, die ISS-enthaltende Zusammensetzungen in der mizellare Membran enthalten. Alternativ können die gewünschten Mizellen auch durch zuvoriges Mischen der oben beschriebenen Mizellenbildenden Substanzen und der ISS-enthaltenden Zusammensetzungen und Behan deln des Gemischs gemäß bekannter Methoden für die Mizellenbildung hergestellt werden.
  • ISS-Synthese
  • a) ISS
  • Die ISS kann unter Anwendung von Techniken und Nukleinsäure-Synthesegeräten, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, synthetisiert werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf enzymatische Methoden, chemische Methoden und die Degradation großer Oligonukleotidsequenzen. Siehe zum Beispiel Ausubel et al. (1987); und Sambrook et al. (1989). Bei enzymatischem Zusammenbau können die einzelnen Einheiten zum Beispiel mit einer Ligase, wie etwa einer T4 DNA- oder RNA-Ligase, ligiert werden. US-Patent Nr. 5,124,246. Die chemische Synthese der Oligonukleotide kann herkömmliche automatisierte Methoden einbeziehen, wie etwa die Phosphoramidit-Methode, wie beschrieben von Warner et al. (1984) DNA 3:401 . Siehe auch US-Patent Nr. 4,458,066. Die Oligonukleotid-Degradation kann durch die Exposition eines Oligonukleotids an eine Nuklease erreicht werden, wie beispielhaft veranschaulicht in US-Patent Nr. 4,650,675.
  • Die ISS kann ebenso unter Anwendung herkömmlicher Polynukleotid-Isolierungsverfahren isoliert werden. Zu solchen Verfahren zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Hybridisation von Sonden an genomische oder cDNA-Bibliotheken, um geteilte Nukleotidsequenzen zu detektieren, das Antikörper-Screening von Expressionsbibliotheken, um geteilte strukturelle Merkmale zu detektieren, und die Synthese bestimmter nativer Sequenzen durch die Polymerase-Kettenreaktion.
  • Zirkuläre ISS kann isoliert, durch rekombinante Methoden synthetisiert oder chemisch synthetisiert werden. Wo die zirkuläre ISS durch Isolierung oder durch rekombinante Methoden erhalten wird, wird die ISS vorzugsweise ein Plasmid sein. Die chemische Synthese kleinerer zirkulärer Oligonukleotide kann unter Anwendung jeglicher in der Literatur beschriebenen Methode vorgenommen werden. Siehe zum Beispiel Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:2025–2029; und Wang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326–2333.
  • Die ISS kann auch auf Phosphor basierende modifizierte Oligonukleotide enthalten. Diese können unter Anwendung standardmäßiger chemischer Transformationen synthetisiert werden. Die effiziente, auf einem festen Träger basierende Konstruktion von Methylphosphonaten ist ebenfalls beschrieben worden. Die Synthese weiterer auf Phosphor basierender modifizierter Oligonukleotide, wie etwa Phosphotriester (Miller et al. (1971) JACS 93:6657–6665), Phosphoramidate (Jager et al. (1988) Biochem. 27:7247–7246), und Phosphordithioate (US-Patent Nr. 5,453,496) ist ebenfalls beschrieben worden. Weitere nicht auf Phosphor basierende modifizierte Nukleotide können ebenfalls verwendet werden. Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129–6141.
  • Die Techniken zur Erzeugung der Phosphatgruppen-Modifikationen an Oligonukleotiden sind im Fachgebiet bekannt. Für einen Überblick über eine dieser nützlichen Techniken wird ein intermediäres Phosphattriester für das Oligonukleotid-Zielprodukt hergestellt und zu dem natürlich vorkommenden Phosphattriester mit wässrigem Iod oder mit anderen Agenzien, wie etwa anhydrischen Aminen, oxidiert. Die resultierenden Oligonukleotidphosphoramidate können mit Schwefel behandelt werden, um Phosphorthioate zu erhalten. Dieselbe allgemeine Technik (mit Ausnahme des Schwefelbehandlungsschritts) kann zum Erhalt von Methylphosphoamiditen aus Methylphosphonaten angewendet werden. Siehe auch US-Patent Nrn. 4,425,732; 4,458,066; 5,218,103; und 5,453,496.
  • Die Herstellung von Basen-modifizierten Nukleosiden, und die Synthese von modifizierten Oligonukleotiden unter Verwendung dieser Basen-modifizierten Nukleoside als Vorläufer ist zum Beispiel in US-Patenten Nrn. 4,910,300, 4,948,882, und 5,093,232 beschrieben worden. Diese Basen-modifizierten Nukleoside sind so entworfen worden, dass sie mittels chemischer Synthese entweder in die terminalen oder internen Positionen eines Oligonukleotids eingebaut werden können. Solche Basen-modifizierten Nukleoside, die entweder an terminalen oder internen Positionen eines Oligonukleotids vorhanden sind, können als Stellen für die Bindung eines Pep tids oder anderen Antigens dienen. Nukleoside, die in ihrer Zucker-Komponente modifiziert worden sind, sind ebenfalls beschrieben worden (einschließlich, doch nicht beschränkt z.B. auf US-Patente Nrn. 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800, 5,118,802) und können in ähnlicher Weise verwendet werden.
  • b) Immunmodulatorische Moleküle
  • Abgeschwächte und inaktivierte Viren sind zur Verwendung hierin als dem Antigen geeignet. Die Präparierung dieser Viren ist im Fachgebiet wohl bekannt. Poliovirus kann mittels chemischer Agenzien, wie etwa Beta-Propiolakton, inaktiviert werden. Jiang et al. (1986). Das Wachstum von abgeschwächten Stämmen des Hepatitis A-Virus ist beschrieben worden (Bradley et al. (1984)), als auch das Wachstum von abgeschwächtem Masernvirus (James et al. (1995). Außerdem können auch abgeschwächte und inaktivierte Viren, wie etwa HIV-1, HIV-2, Herpes simplex-Virus, Hepatitis B-Virus, Rotavirus, humanes und nicht-humanes Papillomavirus und Slow-Brain-Viren Peptid-Antigene bereitstellen.
  • Allergene sind zur Verwendung hierin als immunmodulatorische Moleküle geeignet. Die Präparierung vieler Allergene ist im Fachgebiet wohl bekannt, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Präparierung des Traubenkraut-(Ragweed)-Pollenallergens Antigen E (Amb an (Rafnar et al. 1991), den Staubmilben-Hauptallergene Der pl und Der PII (Chua et al. (1988); und Chua et al. (1990)), Weißbirkenpollen Betvl (Breitneder et al. 1989), Hauskatzen-Allergen Fel dl (Rogers et al. (1993) und Protein-Antigenen von Baumpollen (Elsayed et al. (1991)). Die Herstellung von Protein-Antigenen aus Graspollen für die in vivo-Verabreichung ist berichtet worden. Malley (1989).
  • Immunmodulatorische Peptide können nativ oder chemisch oder enzymatisch synthetisiert sein. Jegliche im Fachgebiet bekannte Methode der chemischen Synthese ist geeignet. Die Lösungsphasen-Peptidsynthese kann zum Konstruieren von Peptiden einer mäßigen Größe angewendet werden, oder es kann für die chemische Konstruktion von Peptiden die Festphasensynthese angewendet werden. Atherton et al. (1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362:833–839. Auch können proteolytische Enzyme zur Kopplung von Aminosäuren für den Erhalt von Peptiden verwendet werden. Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc. Alternativ kann das Peptid unter Anwendung der biochemischen Maschinerie einer Zelle oder durch Isolieren aus einer biologischen Quelle erhalten werden. Rekombinante DNA-Techniken können für die Produktion von Peptiden angewendet werden. Hames et al. (1987) Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press. Die Peptide können auch unter Anwendung standardmäßiger Techniken, wie etwa der Affinitätschromatographie, isoliert werden.
  • Vorzugsweise sind die Antigene Peptide, Lipide (z.B. Sterole, Fettsäuren und Phospholipide), Polysaccharide, wie etwa die in H. influenza-Impfstoffen verwendeten, Ganglioside und Glykoproteine. Diese können mittels mehrerer, im Fachgebiet bekannter Methoden erhalten werden, einschließlich der Isolierung und Synthese unter Anwendung chemischer und enzymatischer Methoden. In bestimmten Fällen, wie etwa bei vielen Sterolen, Fettsäuren und Phospholipiden, sind die antigenen Abschnitte der Moleküle kommerziell verfügbar.
  • c) ISS-immunmodulatorisches Molekül-Konjugate
  • Der ISS-Abschnitt kann mit dem immunmodulatorischen Molekülabschnitt eines Konjugats in vielfältigen Weisen gekoppelt werden, einschließlich kovalenter und/oder nicht-kovalenter Interaktionen.
  • Die Verknüpfung zwischen den Abschnitten kann an dem 3'- oder 5'-Ende der ISS vorgenommen werden, oder an einer geeignet modifizierten Base an einer internen Position in der ISS. Ist das immunmodulatorische Molekül ein Peptid und enthält es eine geeignete reaktive Gruppe (z.B. einen N-Hydroxysuccinimidester), so kann es mit der N4-Aminogruppe von Cytosin-Resten direkt reagiert werden. In Abhängigkeit von der Anzahl und Lokalisation der Cytosin-Reste in der ISS kann eine spezifische Markierung an einem oder mehreren Resten erreicht werden.
  • Alternativ können modifizierte Oligonukleoside, wie sie im Fachgebiet bekannt sind, an beiden Endigungen oder an internen Positionen in die ISS eingebaut werden.
  • Diese können blockierte funktionelle Gruppen enthalten, die bei Entblockierung mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen reaktiv sind, die an dem immunmodulatorischen Molekül von Interesse vorhanden oder daran gebunden sein können.
  • Wo das immunmodulatorische Molekül ein Peptid ist, kann dieser Abschnitt des Konjugats an das 3'-Ende der ISS durch Festträger-Chemie gebunden werden. Zum Beispiel kann der ISS-Abschnitt an einen Polypeptid-Abschnitt addiert werden, der vorab auf einem Träger synthetisiert worden ist. Haralambidis et al. (1990a) Nucleic Acids Res. 18:493–499; und Haralambidis eta. (1990b) Nucleic Acids Res. 18:501–505. Alternativ kann die ISS so synthetisiert werden, dass sie an einen festen Träger durch einen spaltbaren Linker, der sich von dem 3'-Ende erstreckt, gebunden ist. Auf die chemische Spaltung der ISS von dem Träger hin bleibt eine terminale Thiolgruppe an dem 3'-Ende des Oligonukleotids zurück (Zuckermann et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:5305–5321; und Corey et al. (1987) Science 238:1401–1403) oder bleibt eine terminate Amingruppe an dem 3'-Ende des Oligonukleotids zurück (Nelson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:1781–1794). Die Konjugation der Amino-modifizierten ISS an Aminogruppen des Peptids kann vorgenommen werden, wie beschrieben bei Benoit et al. (1987) Neuromethods 6:43–72. Die Konjugation der Thiol-modifizierten ISS an Carboxylgruppen des Peptids kann vorgenommen werden, wie beschrieben bei Sinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press. Die Kopplung eines Oligonukleotids, das ein anhängendes Maleinid an der Thiol-Seitenkette eines Cysteinrests eines Peptids trägt, ist ebenfalls beschrieben worden. Tung et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2:464–465.
  • Der Peptidabschnitt des Konjugats kann an das 5'-Ende der ISS durch eine Amin-, Thiol- oder Carboxylgruppe gebunden werden, die in das Oligonukleotid während seiner Synthese eingebaut worden ist. Vorzugsweise ist, während das Oligonukleotid an dem festen Träger fixiert ist, eine Verknüpfungsgruppe, umfassend ein geschütztes Amin, Thiol oder Carboxyl an einem Ende und ein Phosphoramidit an dem anderen, kovalent an das 5'-Hydroxyl gebunden. Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227–6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485–4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:2891–2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131–3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164:336–344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283–10299; und US-Patente Nrn. 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800 und 5,118,802. Nach der Schutzentfernung können die latenten Amin-, Thiol- und Carboxyl-Funktionalitäten zur kovalenten Bindung des Oligonukleotids an ein Peptid verwendet werden. Benoit et al. (1987); und Sinah et al. (1991).
  • Der Peptidabschnitt kann an ein modifiziertes Cytosin oder Uracil an jeglicher Position in der ISS gebunden werden. Die Aufnahme eines "Linkerarms", der eine latente reaktive Funktionalität besitzt, wie etwa eine Amin- oder Carboxylgruppe, an C-5 der modifizierten Base, liefert eine Handhabe für die Peptidverknüpfung. Ruth, 4th Annual Congress for Recombinant DNA Research, S. 123.
  • Ein ISS-immunmodulatorisches Molekül-Konjugat kann ebenfalls durch nicht-kovalente Interaktionen gebildet werden, wie etwa ionische Bindungen, hydrophobe Interaktionen, Wasserstoffbrückenbindungen und/oder van der Waalsche Anziehungskräfte.
  • Nicht-kovalent verknüpfte Konjugate können eine nicht-kovalente Interaktion umfassen, wie etwa einen Biotin-Streptavidin-Komplex. Eine Biotinylgruppe kann zum Beispiel an eine modifizierte Base einer ISS gebunden werden. Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643–7651. Der Einbau einer Streptavidin-Komponente in den Peptidabschnitt erlaubt die Bildung eines nicht-kovalent gebundenen Komplexes des Streptavidin-konjugierten Peptids und des biotinylierten Oligonukleotids.
  • Nicht-kovalente Assoziationen können auch durch ionische Interaktionen unter Beteilung einer ISS und von Resten innerhalb des immunmodulatorischen Moleküls, wie etwa geladene Aminosäuren, oder durch die Verwendung eines Linkerabschnitts, der geladene Reste umfasst, die sowohl mit dem Oligonukleotid als auch dem immunmodulatorischen Molekül interagieren können, erfolgen. Zum Beispiel kann eine nicht-kovalente Konjugation zwischen einer generell negativ geladenen ISS und positiv geladenen Aminosäure-Resten eines Peptids, z.B. Polylysin- und Polyarginin-Resten, erfolgen.
  • Eine nicht-kovalente Konjugation zwischen ISS und immunmodulatorischen Molekülen kann durch DNA-Bindungsmotive von Molekülen erfolgen, die mit DNA als deren natürlichen Liganden interagieren. Zum Beispiel sind solche DNA-Bindungsmotive in Transkriptionsfaktoren und Anti-DNA-Antikörpern zu finden.
  • Die Verknüpfung der ISS mit einem Lipid kann unter Anwendung standardmäßiger Methoden erfolgen. Zu diesen Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Synthese von Oligonukleotid-Phospholipid-Konjugaten (Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189–192), Oligonukleotid-Fettsäure-Konjugaten (Grabarek eta. (1990) Anal. Biochem. 185:131–135; und Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156:220–222) und Oligonukleotid-Sterol-Konjugaten. Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728–5731.
  • Die Verknüpfung des Oligonukleotids mit einem Oligosaccharid kann unter Anwendung standardmäßig bekannter Methoden gebildet werden. Zu diesen Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Synthese von Oligonukleotid-Oligosaccharid-Konjugaten, wobei das Oligosaccharid eine Komponente eines Immunglobulins ist. O'Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7:347–355.
  • Die Verknüpfung einer zirkulären ISS mit einem Peptid oder Antigen kann in mehreren Weisen gebildet werden. Wo die zirkuläre ISS unter Anwendung rekombinanter oder chemischer Methoden synthetisiert wird, ist ein modifiziertes Nukleosid geeignet. Ruth (1991) in Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press. Eine standardmäßige Verknüpfungstechnologie kann dann zum Binden der zirkulären ISS an das Antigen oder andere Peptid angewendet werden. Goodchild (1990) Bioconjug. Chem. 1:165. Wo die zirkuläre ISS isoliert ist, oder unter Anwendung rekombinanter oder chemischer Methoden synthetisiert wird, kann die Verknüpfung durch chemische Aktivierung, oder Photoaktivierung, einer reaktiven Gruppe (z.B. Carben, Radikal), die in das Antigen oder andere Peptid aufgenommen worden ist, gebildet werden.
  • Weitere Methoden zur Bindung von Peptiden und anderen Molekülen an Oligonukleotide sind zu finden in US-Patent Nr. 5,391,723; Kessler (1992) "Nonradioactive labeling methods for nucleic acids" in Kricka (Hrsg.) Nonisotopic DNA Probe ling methods for nucleic acids" in Kricka (Hrsg.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; und Geoghegan et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3:138–146.
  • Auswertung der Immunantwort auf ISS
  • Die Analyse (sowohl qualitativ als auch quantitativ) der Immunantwort auf ISS-enthaltende Zusammensetzungen kann mittels jeglicher im Fachgebiet bekannter Methode vorgenommen werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Messung der Antigen-spezifischen Antikörperproduktion, Aktivierung spezifischer Populationen von Lymphozyten, wie etwa CD4+ T-Zellen oder NK-Zellen, und/oder die Produktion von Zytokinen, wie etwa IFN, IL-2, IL-4 oder IL-12. Zu Methoden zur Messung der spezifischen Antikörperreaktionen zählen der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), wobei diese im Fachgebiet wohl bekannt sind. Die Messung der Anzahl an spezifischen Typen von Lymphozyten, wie etwa CD4+ T-Zellen, kann zum Beispiel mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) erreicht werden. Zytotoxizitäts-Assays können zum Beispiel vorgenommen werden, wie beschrieben bei Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519–9523. Die Serumkonzentrationen der Zytokine können zum Beispiel mittels ELISA gemessen werden. Diese und weitere Assays zur Auswertung der Immunantwort auf ein Immunogen sind im Fachgebiet wohl bekannt. Siehe zum Beispiel Selected Methods in Cellular Immunology (1980) Mishell und Shiigi, Hrsg., W.H. Freeman and Co.
  • Verabreichung der ISS
  • Die ISS kann alleine oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen und/oder immunogenen und/oder immunstimulatorischen Agenzien verabreicht werden und kann mit einem physiologisch akzeptablen Träger dafür kombiniert werden. Die wirksame Menge und Methode der Verabreichung der jeweiligen ISS-Formulierung kann ausgehend von dem individuellen Patienten und dem Stadium der Erkrankung und weiteren Faktoren, die einem Fachmann des Gebiets offensichtlich sind, variieren. Der oder die Verabreichungswege, die bei einer bestimmten Anwendung nützlich sind, sind einem Fachmann des Gebiets offensichtlich. Zu Verabreichungswegen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, der topische, dermale, transdermale, trans mukosale, epidermale, parenterale, gastrointestinale, und nasopharyngeale und pulmonale, einschließlich transbronchiale und transalveolare Weg. Ein geeigneter Dosierungsbereich ist ein solcher, der ausreichend ISS-enthaltende Zusammensetzung liefert, um eine Gewebekonzentration von etwa 1–10 μm zu erreichen, wie mittels der Blutspiegel gemessen. Die jedem Patienten verabreichte Absolutmenge hängt von pharmakologischen Eigenschaften wie der Bioverfügbarkeit, Clearancerate und dem Verabreichungsweg ab.
  • Wie hierin beschrieben, sind APCs und Gewebe mit einer hohen Konzentration an APCs bevorzugte Ziele für die ISS-enthaltenden Zusammensetzungen. Somit ist die Verabreichung von ISS an Säugerhaut und/oder -schleimhaut, wo APCs in relativ hoher Konzentration vorhanden sind, bevorzugt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ISS-enthaltende Zusammensetzungen bereit, die für die topische Anwendung geeignet sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf physiologisch akzeptable Implantate, Salben, Cremes, Spülungen und Gele. Die topische Verabreichung erfolgt zum Beispiel mittels eines Verbandes oder einer Bandage, in der ein Darreichungssystem dispergiert ist, oder durch direkte Verabreichung eines Darreichungssystems in Einschnitte oder offene Wunden. Cremes, Spülungen, Gele oder Salben, in denen eine ISS-enthaltende Zusammensetzung dispergiert ist, sind zur Verwendung als topische Salben oder Wundfüllmittel geeignet.
  • Bevorzugte Wege für die dermale Verabreichung sind solche, die am wenigsten invasiv sind. Bevorzugt unter diesen Methoden sind die transdermale Übertragung, epidermale Verabreichung und subkutane Injektion. Von diesen Methoden ist die epidermale Verabreichung aufgrund der größeren Konzentrationen an APCs, die sich erwartungsgemäß in intradermalem Gewebe finden, bevorzugt.
  • Die transdermale Verabreichung wird durch Auftragen einer Creme, Spülung, Gel etc. erreicht, die dazu in der Lage sind, die ISS-enthaltende Zusammensetzung in die Haut eindringen und in den Blutstrom eintreten zu lassen. Für die transdermale Verabreichung geeignete Zusammensetzungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, pharmazeutisch akzeptable Suspensionen, Öle, Cremes und Salben, die direkt auf die Haut aufgetragen oder in einen schützenden Träger aufgenommen werden, wie etwa ein transdermales Element (sogenanntes "Patch"). Beispiele geeigneter Cremes, Salben etc. sind zum Beispiel in der Physician's Desk Reference zu finden.
  • Für die transdermale Übertragung stellt die Iontophorese eine geeignete Methode dar. Die iontophoretische Übertragung kann unter Verwendung handelsüblicher Patches erreicht werden, die ihr Produkt durch unverletzte Haut für Zeiträume von mehreren Tagen oder mehr kontinuierlich abgeben. Die Anwendung dieser Methode erlaubt die kontrollierte Übertragung von pharmazeutischen Zusammensetzungen in relativ großen Konzentrationen, gestattet die Infusion von Kombinations-Wirkstoffen und erlaubt die gleichzeitige Anwendung eines Absorptionförderers.
  • Ein Beispiel eines Patchprodukts zur Anwendung bei dieser Methode ist das LEC-TRO PATCH, ein Markenprodukt von General Medical Company of Los Angeles, CA. Dieses Produkt unterhält elektronisch Speicherelektroden bei neutralem pH und kann daraufhin angepasst werden, Dosierungen von unterschiedlichen Konzentrationen abzugeben, oder kontinuierlich und/oder periodisch zu dosieren. Die Herstellung und Verwendung des Patch sollte gemäß den schriftlichen Anleitungen des Herstellers, die dem LECTRO PATCH-Produkt beiliegen, erfolgen; diese Anleitungen sind hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen.
  • Für die transdermale Übertragung stellt auch der niederfrequente Ultraschalltransport eine geeignete Methode dar. Mitragotri et al. (1995) Science 269:850–853. Die Anwendung niederfrequenter Ultraschallfrequenzen (etwa 1 MHz) erlaubt die generell kontrollierte Darreichung von therapeutischen Zusammensetzungen, einschließlich solcher von hohem Molekulargewicht.
  • Die epidermale Verabreichung bezieht in der Hauptsache die mechanische oder chemische Reizung der äußersten Schicht der Epidermis in einem ausreichenden Maße ein, um eine Immunantwort auf den Reizstoff zu provozieren. Spezifisch sollte die Reizung eine ausreichende sein, um APCs an die Stelle der Reizung zu locken.
  • Ein Beispiel einer mechanischen Reizmethode verwendet eine Vielzahl von kurzen Zinken mit sehr engem Durchmesser, die zur Reizung der Haut und Anlockung der APCs an die Stelle der Reizung verwendet werden können, um die ISS-enthaltenden Zusammensetzungen, die vom Ende der Zinken übertragen werden, aufzunehmen. Zum Beispiel enthält der MONO-VACC-Alttuberkulin-Test, hergestellt von Pasteur Merieux in Lyon, Frankreich, eine Vorrichtung, die zur Einführung der ISS-enthaltenden Zusammensetzungen geeignet ist.
  • Die Vorrichtung (die in den USA durch Connaught Laboratories, Inc. in Swiftwater, PA, vertrieben wird) besteht aus einem Kunststoffbehälter mit einem Spritzentaucher an einem Ende und einer Zinkenscheibe an dem anderen. Die Zinkenscheibe trägt eine Vielzahl von Zinken mit engem Durchmesser einer Länge, die die äußerste Schicht der epidermalen Zellen gerade eben anritzen wird. Jede dieser Zinken in dem MONO-VACC-Kit ist mit Alttuberkulin beschichtet; bei der vorliegenden Erfindung ist jede Nadel mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung der ISS-enthaltenden Zusammensetzung beschichtet. Die Anwendung der Vorrichtung erfolgt vorzugsweise gemäß den schriftlichen Anleitungen des Herstellers, die in dem Vorrichtungsprodukt enthalten sind. Ähnliche Vorrichtungen, die ebenfalls bei dieser Ausführungsform verwendet werden können, sind solche, die derzeit zur Durchführung von Allergietests verwendet werden.
  • Ein anderer geeigneter Ansatz für die epidermale Verabreichung von ISS besteht in der Anwendung einer Chemikalie, die die äußersten Zellen der Epidermis reizt, wodurch eine ausreichende Immunreaktion provoziert wird, um APCs in diesen Bereich zu locken. Ein Beispiel ist ein keratinolytisches Agens, wie etwa die Salicylsäure, die in der handelsüblichen topischen Enthaarungscreme, vertrieben von Noxema Corporation unter dem Handelsnamen NAIR, verwendet wird. Dieser Ansatz kann auch zur Erzielung der epithelialen Verabreichung in die Schleimhaut angewendet werden. Der chemische Reizstoff kann auch in Verbindung mit dem mechanischen Reizmittel verwendet werden (wie es beispielsweise der Fall wäre, wenn die Zinken des MONO-VACC-Typs außerdem mit dem chemischen Reizstoff beschichtet wären). Die ISS kann in einem Träger suspendiert werden, der außerdem den chemischen Reizstoff enthält, oder gleichzeitig damit verabreicht werden.
  • Eine andere Darreichungsmethode zur Verabreichung der ISS-enthaltenden Zusammensetzungen macht Gebrauch von Nicht-Lipidpolymeren, wie etwa einem synthetischen polykationischen Aminopolymer. Leff (1997) Bioworld 86:1–2.
  • Zu parenteralen Verabreichungswegen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die elektrische (Iontophorese) oder direkte Injektion, zum Beispiel die direkte Injektion in eine zentrale Venenlinie, die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale oder subkutane Injektion. Zu Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, pharmazeutisch akzeptable sterile isotonische Lösungen. Zu solchen Lösungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Saline und Phosphat-gepufferte Saline für die Injektion der ISS-enthaltenden Zusammensetzung.
  • Zu gastrointestinalen Verabreichungswegen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Ingestion und der rektale Weg. Die Erfindung umfasst ISS-enthaltende Zusammensetzungen, die für die gastrointestinale Verabreichung geeignet sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf pharmazeutisch akzeptable Pulver, Pillen oder Flüssigkeiten für die Ingestion und Zäpfchen für die rektale Verabreichung.
  • Zu nasopharyngealen und pulmonalen Verabreichungswegen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Mitinhalation, transbronchiale und transalveolare Wege. Die Erfindung umfasst ISS-enthaltende Zusammensetzungen, die für die Verabreichung durch Mitinhalation geeignet sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf verschiedene Typen von Aerosolen für die Inhalation, als auch Pulverformen für Darreichungssysteme. Vorrichtungen, die für die Verabreichung durch Mitinhalation von ISS-enthaltenden Zusammensetzungen geeignet sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Atomisatoren und Vaporisatoren. Mit den Pulvern befüllte Atomisatoren und Vaporisatoren zählen zu einer Vielfalt von Vorrichtungen, die zur Verwendung in der Darreichung von Pulvern durch Mitinhalation geeignet sind. Siehe z.B. Lindberg (1993) Summary of Lecture at Management Forum 6.–7. Dezember 1993 "Creating the Future for Portable Inhalers."
  • Die Methoden zur Herstellung geeigneter Vorrichtungen für die Injektion, topische Anwendung, Atomisatoren und Vaporisatoren sind im Fachgebiet bekannt und werden nicht ausführlich beschrieben werden.
  • Die Wahl der Darreichungswege kann zur Modulierung der hervorgerufenen Immunantwort eingesetzt werden. Zum Beispiel waren IgG-Titer und CTL-Aktivitäten identisch, wenn ein Influenzavirus-Vektor über intramuskuläre oder epidermale (Genpistole) Wege verabreicht wurde; die muskuläre Beimpfung erbrachte jedoch in erster Linie IgG2A, wohingegen der epidermale Weg größtenteils IgG1 erbrachte. Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70:6119–6125. Somit kann ein Fachmann des Gebiets Nutzen ziehen aus leichten Unterschieden in der Immunogenität, die durch die verschiedenen Verabreichungswege der immunmodulatorischen Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung hervorgerufen werden.
  • Die oben genannten Zusammensetzungen und Methoden der Verabreichung sollen die Methoden der Verabreichung der ISS-enthaltenden Zusammensetzungen der Erfindung beschreiben, doch nicht beschränken. Die Methoden zur Herstellung der verschiedenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen liegen innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns des Bereichs und werden hierin nicht ausführlich beschrieben.
  • Screening für ISS
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Methode für das Screening auf die immunmodulatorische Aktivität von ISS bereit. Insbesondere erlaubt die bereitgestellte Methode das in vitro-Screening von ISS auf die Fähigkeit, eine Immunantwort vom Th1-Typ in vivo zu stimulieren. Wie in Beispiel 6 beschrieben, kann die Screeningmethode die Verwendung entweder einer murinen Zelllinie, z.B. P388D.1, oder einer humanen Zelllinie, z.B. 90196.B, einbeziehen. Die Behandlung dieser Zelllinien mit Oligonukleotiden mit potenzieller ISS-Aktivität und die anschließende Bestimmung der Zytokin-Produktion aus den behandelten Zellen lieferte einen zuverlässigen Hinweis bezüglich der immunstimulatorischen Aktivität des Oligonukleotids, wenn in vivo verabreicht. Die Verwendung von Zelllinien, wie P388D.1 und/oder 90109.B, ermög licht eine leicht verfügbare, stete Zellpopulation, an der die Wirkung der Oligonukleotid-Zusammensetzung gemessen werden kann. Im Allgemeinen zeigen Oligonukleotide, die bei Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 10 μg/ml verabreicht werden, und die die Produktion von Zytokin, zum Beispiel von IL-6 und/oder IL-12, auf eine Konzentration von > 2 ng/ml in dem Kulturüberstand nach 48 bis 72 Stunden stimulierten, eine immunmodulatorische Aktivität. Einzelheiten der in vitro-Techniken, die zur Durchführung solch einer Auswertung nützlich sind, sind in den Beispielen angegeben; Fachleute des Gebiets werden bei üblicher Sachkenntnis auch andere Methoden zur Messung der Zytokinsekretion und Antikörperproduktion entsprechend der hierin gelehrten Parameter kennen oder ohne weiteres bestimmen können.
  • Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung, jedoch nicht zur Beschränkung der Erfindung angegeben.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Stimulierung der Zytokinproduktion durch Oligonukleotide die ein ISS-Oktanukleotid umfassen
  • Wie oben beschrieben, war die ISS-Aktivität in Polynukleotiden anfänglich mit einer DNA assoziiert, die unmethylierte CpG-Dinukleotide enthielt. Das ISS-Element war weiterhin als eine hexamere Sequenz definiert, vorzugsweise die Sequenz 5'-Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin-3' (Krieg et al. (1995)). Unglücklicherweise erbringt das Vertrauen auf die Hexamersequenz zur Vorhersage der immunstimulatorischen Aktivität größtenteils inaktive Oligonukleotide. Weitere, hierin angegebene Experimente zeigen jedoch, dass Nukleotide, die das ISS-Hexamer umgeben, signifikant zu der immunstimulatorischen Aktivität in Verbindung mit dem ISS-Element beitragen können. Insbesondere sind spezifische ISS-Sequenzen identifiziert worden, die eine Immunantwort vom Th1-Typ stimulieren. Experimente, die solche ISS-Elemente Identifiziert haben, sind nachstehend beschrieben.
  • Über 150 verschiedene Oligonukleotide (siehe Tabelle 1 für Beispiele) wurden auf die immunstimulatorische Aktivität an Maus-Splenozyten und/oder an humanen peripheren mononukleären Blutzellen (hPBMCs) getestet. Die Immunstimulation als Reaktion auf Oligonukleotide wurde durch Messen der Zytokinsekretion in das Kulturmedium und durch die Zellproliferation ausgewertet. Die Zytokinmengen in dem Kulturüberstand wurden durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Tests bestimmt.
  • Die Oligonukleotide wurden unter Anwendung standardmäßiger Festphasen-Oligonukleotidtechniken synthetisiert. Die fertigen Festphasen-Analog-Monomere wurden bezogen von Glen Research, Sterling, VA und in der standardmäßigen Weise in einen Festphasen-Oligonukleotid-Synthetisierer aufgenommen. Die Synthese der Oligonukleotide wurde durch TriLink BioTechnologies Inc., San Diego, CA, durchgeführt.
  • Die Zellen wurden isoliert und unter Anwendung standardmäßiger Techniken präpariert. hPBMCs wurden aus heparinisiertem peripherem Blut von gesunden Spendern mittels Ficoll-Hypaque-Gradienten heparinisiert. Die Milzen von BALB/c-Mäusen wurden entnommen und die Splenozyten unter Anwendung einer standardmäßigen Anlockung und Behandlung mit ACK-Lysepuffer von BioWhittaker, Inc., isoliert. Die isolierten Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 2 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 50 μm 2-Mercaptoethanol, 1 % Penicillin-Streptomycin und 2 ml L-Glutamin, gewaschen und bei etwa 4 × 106 Zellen/ml in 10 % FCS/RPMI (RPMI 1640-Medium mit 10 % hitzeinaktiviertem FCS, 50 μm 2-Mercaptoethanol, 1 % Penicillin-Streptomycin und 2 ml L-Glutamin) resuspendiert.
  • Generell wurden die Zellkulturen im Triplikat bei etwa 4 × 105 Zellen/Well in einer 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte in 100 μl an 10 % FCS/RPMI vorgenommen, wobei die Zellen für mindestens eine Stunde nach dem Ausplattieren ruhen durften. Für die Oligonukleotid-Aktivitätsassays wurden die Oligonukleotide in 10 % FCS/RPMI verdünnt, und 100 μl der gewünschten Oligonukleotid-Verdünnung wurden dem entsprechenden Well zugegeben. Im Allgemeinen umfassten die endgültigen Oligo nukleotid-Konzentrationen 0,1 μg/ml, 1,0 μg/ml und 10 μg/ml. Die Zellen wurden dann für 1, 2 oder 3 Tage inkubiert.
  • Zur Bestimmung der Zellproliferation wurden 100 μl des Überstands aus jedem Well an den entsprechenden Tagen geerntet, mit 1,0 μm tritiertem Thymidin gepulst und über Nacht inkubiert. Standardmäßige Methoden zur Auswertung des Einbaus von tritiertem Thymidin wurden zur Bestimmung der Zellproliferation angewendet. Die Zytokinproduktion durch die Zellen wurde mittels ELISAs des Kulturüberstands unter Verwendung kommerziell verfügbarer Antikörper zu den Zytokinen bestimmt.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den 1–3 graphisch dargestellt. Die verwendeten Oligonukleotide umfassten das folgende:
  • TABELLE 1
    Figure 00480001
  • Alle in diesen Experimenten verwendeten Oligonukleotide enthielten ein Phosphorthioat-Rückrat.
  • Wie in 1–3 gezeigt, sind die Phosphorthioat-Oligonukleotide 1, 2 und 7 (SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 bzw. SEQ ID Nr. 7) potente Stimulatoren der Sekretion von IL-12, IFN-γ und IL-6 aus murinen Splenozyten. Diese Oligonukleotide stimulieren auch die Zytokinsekretion aus hPBMCs. Alle drei dieser Oligonukleotide umfassen die bevorzugte Oktanukleotidsequenz von 5'-Purin, Purin, Cytosin, Guanosin, Pyrimidin, Pyrimidin, Cytosin, Guanosin-3' (siehe Tabelle).
  • Zu Beispielen weiterer Oligonukleotide mit immunstimulatorischer Aktivität zählen Oligonukleotide 4 und 6 (SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 6). Diese immunstimulatorischen Oligonukleotide umfassen außerdem eine bevorzugte Oktanukleotidsequenz (siehe Tabelle 1). 1–3 und Tabelle 1 zeigen auch, dass die Einbeziehung eines hexameren ISS-Elements, wie definiert durch Grieg et al. (1995) als 5'-Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin-3', in ein Oligonukleotid kein zuverlässiger Prädiktor der immunstimulatorischen Aktivität für das Oligonukleotid war. Siehe zum Beispiel Oligonukleotide 5 und 8–11.
  • BEISPIEL 2
  • Stimulierung der Zytokinproduktion durch ISS, die modifizierte Basen umfasst
  • Mehrere Oligonukleotide, umfassend modifizierte Basen, wurden auf ihre immunstimulatorische Aktivität an Maus-Splenozyten und an hPBMCs getestet. Die Immunstimulierung als Reaktion auf Oligonukleotid wurde durch Messen der Zytokinsekretion in das Kulturmedium und durch die Zellproliferation, wie oben beschrieben, ausgewertet. Zellkulturen und Oligonukleotid-Aktivitätsassays wurden vorbereitet und wie oben beschrieben durchgeführt.
  • TABELLE 2
    Figure 00500001
  • 4–6 zeigen die Zytokinproduktion und Zellproliferations-Ergebnisse aus einem Experiment, in welchem Maus-Splenozyten mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Oligonukleotiden kultiviert wurden, wobei b 5-Bromcytosin ist und eine ISS-Oktamersequenz fettgedruckt und unterstrichen dargestellt ist. Die Oligonukleotide wurden bei einer Endkonzentration von 1,0 μg/ml oder 10 μg/ml verwendet. Die Behandlung der Zellen mit Oligonukleotiden, die wenigstens eine ISS enthielten, führte zur Produktion von IL-6 und IL-12 aus den Zellen, als auch zu einer Stimulierung der Zellproliferation. Die Oligonukleotide, die eine modifizierte ISS enthielten, waren im Allgemeinen ebenso wirksam oder wirksamer als das Oligonukleotid mit einer unmodifizierten ISS. Oligonukleotide ohne eine ISS waren zur Stimulierung der IL-6- oder IL-12-Produktion oder Zellproliferation unfähig. Alle in diesem Experiment verwendeten Oligonukleotide enthielten ein Phosphorthioat-Rückgrat.
  • BEISPIEL 3
  • Potenzierung einer Immunantwort bei Co-Verabreichung von Adjuvans
  • Der Effekt der Co-Verabreichung von Adjuvans mit Antigen und ISS auf eine Immunantwort auf das Antigen wurde unter Verwendung des Adjuvans Aluminiumhydroxid (Alaun) und des Öl-in-Wasser-Emulsion-Adjuvans MF59 untersucht. Zusammensetzungen, umfassend 1 μg AgE, auch bekannt als Amb al, eine allergene Hauptkomponente des Beifußblättrigen Traubenkrauts (short ragweed), wurde intradermal in Mäuse bei Woche 0, 2 und 4 injiziert. Die verwendeten Antigen-
  • Zusammensetzungen sind in Tabelle 3 aufgelistet. Oligonukleotid 2 (SEQ ID Nr. 2) wurde in den Zusammensetzungen wie angegeben verwendet.
  • TABELLE 3
    Figure 00510001
  • Die Menge an Anti-AgE-Antikörper in dem Serum der Mäuse wurde am Tag 0 und Wochen 2, 4 und 6 bestimmt. Anti-AgE-IgG1- und Anti-AgE-IgG2a-Antikörper-Assays wurden mittels ELISA-Tests unter Verwendung des ursprünglichen AgE-Impfstoffs als dem beschichteten Antigen auf Mikrotiterplatten durchgeführt, wie beschrieben bei Raz et al. (1996). Der Anti-AgE-IgE wurde mittels standardmäßiger Radioummunoassay-Techniken bestimmt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 7–9 dargestellt.
  • Wie in 7 gezeigt, führte die Verabreichung von Antigen alleine oder in einem Gemisch mit ISS zu nahezu keiner Anti-AgE-IgG2a-Produktion, wohingegen die Verabreichung eines Antigen-ISS-Konjugats eine signifikante Menge an Anti-AgE-IgG2a-Antikörper generierte. Die gleichzeitige Co-Verabreichung eines Antigen-ISS-Konjugats und von Adjuvans MF59 führte zu einer etwa zweifachen Zunahme der Anti-AgE-IgG2a-Antikörperproduktion, relativ zu der, die aus der Verabreichung des Antigen-ISS-Konjugats alleine erhalten wurde. Somit erhöhte die Verabreichung von Antigen und ISS in unmittelbarer Assoziation, wie etwa in der Form eines Konjugats, oder die Co-Verabreichung von MF59 und Antigen-ISS die primäre Immunantwort vom Th1-Typ, wie durch das Antigen beziehungsweise durch das Antigen-ISS- Konjugat erzeugt, was darauf hinweist, dass die ISS eine unabhängige Adjuvans-Aktivität aufweist.
  • Die Anti-AgE-IgG2a-Produktion als ein Ergebnis der Co-Verabreichung von Alaun und Antigen-ISS-Konjugat, im Vergleich zu der der Co-Verabreichung von Antigen und Alaun, weist ebenfalls auf eine unabhängige Adjuvans-Aktivität in Verbindung mit ISS hin (9).
  • Vor kurzem wurde gezeigt, dass CpG-enthaltende Oligonukleotide eine Immunantwort vom Th1-Typ fördern, wenn mit Antigen und inkomplettem Freund-Adjuvans (IFA) verabreicht, verglichen zu der Reaktion vom Th2-Typ, die durch die Verabreichung von Antigen mit IFA alleine erzeugt wird. Chu et al. (1997) J. Exp. Med. 10:1623–1631. Bei dieser Studie wurden die Oligonukleotide immer in der Gegenwart von IFA verabreicht. Obschon diese Studie zeigt, dass die Co-Verabreichung von CpG-enthaltenden Oligonukleotiden mit einem Antigen und einem Adjuvans zu einer Verschiebung der Immunantwort von einer Reaktion vom Th2-Typ zu einer Reaktion vom Th1-Typ hin führt, wurden keine Experimente durchgeführt, um irgendeine unabhängige Adjuvans-Aktivität für das Oligonukleotid zu indizieren, wie in der vorliegenden Erfindung präsentiert.
  • BEISPIEL 4
  • Selektive Induktion einer Reaktion vom Th1-Typ in einem Wirt nach Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine ISS umfasst
  • Wie hierin beschrieben, ist eine Immunantwort vom Th1-Typ mit der Produktion spezifischer Zytokine, wie etwa IFN-γ, assoziiert und führt zur Produktion von CTLs.
  • Um zu bestimmen, ob eine Immunantwort vom Th1-Typ in Mäusen produziert werden würde, die ISS-Oligonukleotid-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung erhielten, wurden die Mäuse mit β-Galaktosidase (β-Gal)-Protein in verschiedenen Zusammensetzungen, mit und ohne Co-Verabreichung von ISS-Oligonukleotiden, im munisiert. Die verwendeten Zusammensetzungen enthielten 1 oder 10 μg β-Gal und sind in Tabelle 4 aufgelistet.
  • Tabelle 4
    Figure 00530001
  • BALB/c-Mäuse wurden intradermal mit den oben gezeigten Mengen und Zusammensetzungen injiziert und 2 Wochen nach der Injektion geopfert. Ihre Antigenabhängigen CTL-Reaktionen und ihr Zytokin-Sekretionsprofil wurden in vitro getestet. Die CTL-Reaktionen wurden bestimmt, wie beschrieben bei Sato et al. (1996). Die Zytokinsekretion wurde mittels ELISA-Tests bestimmt. Naive Mäuse wurden ebenfalls in das Experiment einbezogen. Die Ergebnisse sind in 10–13 dargestellt.
  • Zu einem frühen Zeitpunkt der Immunreaktion, zwei Wochen nach der Verabreichung der Zusammensetzungen, wurde eine CTL-Aktivität von Zellen der Mäuse festgestellt, die 10 μg Antigen, konjugiert mit einer ISS, erhielten (10). Splenzozyten von Mäusen, die 1 μg βGal, konjugiert mit ISS, erhielten, generierten eine Menge der CTL-Aktivität, die der jener Mäuse vergleichbar war, die 10 μg βGal, konjugiert mit ISS, erhielten (11). IFN-γ, ein Zytokin mit Tendenz zum Th1-Typ, wurde lediglich von Zellen der Mäuse produziert, die βGal, konjugiert mit ISS, erhalten hatten (12). Zellen von diesen Mäusen produzierten auch IL-10, ein Zytokin mit Tendenz zum Th2-Typ (13).
  • BEISPIEL 5
  • Primaten-Immunantwort auf Antigen-ISS-Zusammensetzungen
  • Um die immunmodulatorische Aktivität von ISS über in vitro- und murine Experimente hinaus zu untersuchen, wurden Immunantworten in der Gegenwart von ISS in Primaten untersucht.
  • Javaneraffen wurden intramuskulär mit 10 μg Hepatitis B-Oberflächenantigen (HbsAg) entweder alleine oder gemischt mit entweder 50 μg Oligonukleotid 2 (SEQ ID Nr. 2) oder 500 μg Oligonukleotid 2 bei Wochen 0, 4 und 8 immunisiert. Die Antikörperreaktionen auf HBsAg wurden unter Verwendung des Abbott Laboratories AUSAB-Kits bei Woche 4 (4 Wochen nach der Erstinjektion), Woche 5 (5 Wochen nach der Erstinjektion und eine Woche nach der Zweitinjektion) und Woche 8 (8 Wochen nach der Erstinjektion und 4 Wochen nach der Zweitinjektion) gemessen. Die Ergebnisse sind in 14, 15 und 16 gezeigt. Zu jedem untersuchten Zeitpunkt führte die Co-Verabreichung von Antigen mit ISS allgemein zu einer stärkeren Antikörperreaktion auf das Antigen. Somit liefert ISS in Primaten eine Adjuvans-artige Aktivität in der Generierung einer Immunantwort auf das co-verabreichte Antigen.
  • In dem Experiment mit Javaneraffen wurden ISS und Antigen als ein Gemisch verabreicht. Um die immunmodulatorische Aktivität eines ISS-Antigen-Konjugats in Primaten zu bestimmen, wurden Paviane mit Zusammensetzungen injiziert, die ISS-Amb al-Konjugate umfassten. In geeigneten Intervallen wurden die Antigen-spezifischen Immunantworten bestimmt, wie hierin beschrieben. Zum Beispiel werden die Antigen-spezifische Serum-Antikörpermengen bestimmt und mit den Mengen in Prä-Immunserum verglichen.
  • BEISPIEL 6
  • Methode zum Screening auf immunstimulatorische Oligonukleotide
  • Um Oligonukleotide mit potenzieller ISS-Aktivität zu identifizieren, werden Zelllinien mit den zu testenden Oligonukleotiden behandelt und die resultierende Zytokinproduktion bestimmt, sofern vorhanden. Die für das Screening der ISS-Aktivität verwendeten Zelllinien sind die murine Zelllinie P3888D.1 oder die humane Zelllinie 90196.B, die beide erhältlich sind von der American Type Culture Collection.
  • Die Zellen werden gezüchtet und unter Anwendung standardmäßiger Techniken präpariert. Die Zellen werden während der Wachstumsphase geerntet und in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 2 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 50 μM 2-Mercaptoethanol, 1 % Penicillin-Streptomycin und 2 mM L-Glutamin, gewaschen und bei etwa 4 × 106 Zellen/ml in 10 % FCS/RPMI resuspendiert.
  • Die Zellkulturen werden im Triplikat bei etwa 4 × 105 Zellen/Well in einer 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte in 100 μl an 10 % FCS/RPMI eingerichtet, wobei die Zellen für wenigstens 1 Stunde nach der Ausplattierung ruhen dürfen. Die zu testenden Oligonukleotide werden in 10 % FCS/RPMI verdünnt, und 100 μl der Oligonukleotid-Verdünnung werden einem entsprechenden Well zugegeben. Allgemein umfassen die endgültigen Oligonukleotid-Konzentrationen 0,1 μg/ml, 1,0 μg/ml und 10 μg/ml. Die Zellen werden dann für 1, 2 oder 3 Tage inkubiert.
  • Um die Zellproliferation zu bestimmen, werden 100 μl des Überstandes von jedem Well an den entsprechenden Tagen geerntet, mit 1,0 μm tritiertem Thymidin gepulst und über Nacht inkubiert. Standardmäßige Methoden zur Auswertung des Einbaus an tritierten Thymidin werden zur Bestimmung der Zellproliferation angewendet.
  • Die Zytokinproduktion durch die Zellen wird mittels ELISAs des Kulturüberstands unter Verwendung kommerziell verfügbarer Antikörper zu den Zytokinen bestimmt. Der Nachweis von > 2 ng/ml IFN-γ und/oder IL-12 in dem Zellkultur-Überstand 48 oder 72 Stunden nach der Zugabe eines Oligonukleotids zu den Zellen ist für die ISS-Aktivität in dem Oligonukleotid indikativ. Die Produktion von IFN-γ und/oder IL-12 ist insbesondere für die Aktivität zur Induzierung einer ISS-Immunantwort vom Th1-Typ indikativ.
  • Obschon die vorangegangene Erfindung in einiger Ausführlichkeit anhand von Veranschaulichung und Beispielen zu Zwecken der Klarheit des Verständnisses beschrieben worden ist, wird es für Fachleute des Gebiets offensichtlich sein, dass bestimmte Veränderungen und Abwandlungen daran vorgenommen werden können. Daher sollten die Beschreibungen und Beispiele nicht als Beschränkung des Rahmens der Erfindung, der durch die Ansprüche im Anhang umrissen ist, verstanden werden.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001

Claims (22)

  1. Immunmodulatorisches Oligonukleotid, welches eine Sequenz umfasst, die gewählt ist aus den Sequenzen SEQ.ID.NR. 4, SEQ.ID.NR. 1, SEQ.ID.NR. 6, SEQ.ID.NR. 7, SEQ.ID.NR. 12, SEQ.ID.NR. 15 und SEQ.ID.NR. 16.
  2. Immunmodulatorisches Oligonukleotid, umfassend: ein immunmodulatorisches Oligonukleotid nach Anspruch 1 und ein Antigen.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, welche außerdem ein Adjuvans umfasst.
  4. Immunmodulatorische Zusammensetzung, umfassend: ein immunmodulatorisches Oligonukleotid nach Anspruch 1; und einen Faszilitator, gewählt aus costimulatorischen Molekülen, Zytokinen, Chemokinen, Targeting-Proteinligand, einem Transaktivierungsfaktor, einem Peptid und einem Peptid, das eine modifizierte Aminosäure umfasst.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Peptiden, Glykoproteinen, Polysacchariden und Lipiden.
  6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Antigen oder der Faszilitator an das immunmodulatorische Oligonukleotid konjugiert ist.
  7. Immunmodulatorische Zusammensetzung, welche ein Oligonukleotid nach Anspruch 1 und ein Antigen umfasst, wobei das Oligonukleotid und das Antigen nicht konjugiert sind und in einem Abstand unmittelbar assoziiert sind, der effektiv ist, um eine Immunantwort zu verstärken, verglichen zur gemeinsamen Verabrei chung des Oligonukleotids und des Antigens in Lösung.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, welche außerdem ein Adjuvans umfasst.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Oligonukleotid und das Antigen durch Einkapselung, vorzugsweise innerhalb von Liposomen, unmittelbar assoziiert sind.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Oligonukleotid und das Antigen in einem Abstand von etwa 0,04 μm bis etwa 100 μm, vorzugsweise von etwa 0,1 μm bis etwa 20 μm und noch bevorzugter von etwa 0,15 μm bis etwa 10 μm unmittelbar assoziiert sind.
  11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das Oligonukleotid und das Antigen derart unmittelbar assoziiert sind, dass das Oligonukleotid und das Antigen gemeinsam an ein Immuntarget transportiert werden.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Immuntarget eine lymphatische Struktur oder eine Antigen-präsentierende Zelle ist.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Antigen-präsentierende Zelle eine dendritische Zelle, ein Makrophage oder ein Lymphozyt ist.
  14. Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 13 zur Verwendung bei einer Methode zum Modulieren einer Immunantwort in einem Individuum.
  15. Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 13 zur Verwendung in der Behandlung von Krebs, einer allergischen Erkrankung, Asthma oder einer Infektionskrankheit.
  16. Oligonukleotid nach Anspruch 15, wobei die Infektionskrankheit durch ein Virus, gewählt aus Hepatitis-V-Virus, Influenza-Virus, Herpes-Virus, humanem Immunschwäche-Virus, Papillomavirus, oder durch ein Bakterium, gewählt aus Hemo philus influenza, Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis, oder durch einen Parasiten, gewählt aus Malaria-Plasmodia, Leishmania-Spezies, Trypanosoma-Spezies und Schistosoma-Spezies, verursacht ist.
  17. Immunmodulatorisches Oligonukleotid, welches die Sequenz der SEQ.ID.NR. 2 umfasst.
  18. Immunmodulatorische Zusammensetzung, welche ein immunmodulatorisches Oligonukleotid nach Anspruch 17 umfasst; und ein Antigen.
  19. Oligonukleotid nach Anspruch 17 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Verwendung im Modulieren einer Immunantwort in einem Individuum.
  20. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 17 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 18 in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs, einer allergischen Erkrankung oder einer Infektionskrankheit.
  21. Zusammensetzung, welche ein Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder 17 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst.
  22. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 13, welche außerdem einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst.
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