DE69738521T2

DE69738521T2 - Alphaviren-vektors mit einer reduzierten inhibierung der synthese von zellmakromolekülen

Info

Publication number: DE69738521T2
Application number: DE69738521T
Authority: DE
Inventors: Thomas W. Rancho Santa Fe DUBENSKY; John M. Encinitas POLO; Barbara A. San Diego BELLI; Sondra St. Louis SCHLESINGER; Sergey A. St. Louis DRYGA; Ilya St. Louis FROLOV
Original assignee: University of Washington; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of Washington; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2017-04-05
Also published as: EP0907746A2; JP2008200051A; ES2301178T3; DE69738521D1; WO1997038087A3; EP0907746B1; EP1997900A3; JP2001521369A; WO1997038087A2; JP4383530B2; ATE386811T1; AU2800797A; EP1997900A2

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die rekombinante DNA-Technologie; und spezifischer die Entwicklung von rekombinanten Vektoren, die für das Lenken der Expression von einem oder mehreren heterologen Genprodukten nützlich sind.
Hintergrund der Erfindung
Alphaviren umfassen einen Satz von serologisch verwandten, durch Arthropoden übertragenen Viren der Togaviridae-Familie. Diese Viren sind weltweit verbreitet und persistieren in der Natur durch einen Stechmücke-zu-Vertebraten-Zyklus. Vögel, Nager, Pferde, Primaten und Menschen sind unter den definierten Alphavirus-Vertebraten-Reservoirs/Wirten.
26 bekannte Viren und Virus-Subtypen sind innerhalb der Alphavirus-Gattung unter Anwendung des Hämagglutinin-Inhibitions (HI)-Tests klassifiziert worden. Dieser Test trennt die 26 Alphaviren in drei Hauptkomplexe auf: den Venezuelanischen Pferde-Encephalitis (VEE)-Komplex, den Semliki Forest (SF)-Komplex und den westlichen Pferde-Encephalitis (WEE)-Komplex. Zusätzlich erhalten vier andere Viren, östliche Pferde-Encephalitis (EEE), Barmah Forest, Middelburg und Ndumu eine individuelle Klassifizierung basierend auf dem serologischen HI-Test.
Mitglieder der Alphavirus-Gattung werden auch basierend auf ihren relativen klinischen Eigenschaften in Menschen klassifiziert: Alphaviren, die primär mit einer Encephalitis assoziiert sind, und Alphaviren, die primär mit Fieber, Hautausschlag und Polyarthritis assoziiert sind. Eingeschlossen in die erstere Gruppe sind die VEE- und WEE-Komplexe und EEE. Im Allgemeinen kann eine Infektion mit dieser Gruppe in permanenten Folgekrankheiten, einschließlich Verhaltensstörungen und Lernschwierigkeiten oder Tod, resultieren. In der letzteren Gruppe ist der SF-Komplex, der die individuellen Alphaviren Semliki Forest, Sindbis, Ross River, Chikungunya, O'nyony-nyong und Mayaro umfasst. In Bezug auf diese Gruppe ist die Infektion, obwohl schwere Epidemien berichtet worden sind, im Allgemeinen selbst-limitierend ohne permanente Folgekrankheiten.
Das Sindbis-Virus ist das Prototyp-Mitglied der Alphavirus-Gattung der Togaviridae-Familie. Seine Replikationsstrategie nach der Infektion von Zellen (siehe 1) ist in Hühnerembryofibroblasten (CEF) und Babyhamsternieren (BHK)-Zellen, wo das Sindbis-Virus schnell zu einem hohen Titer anwächst, gut charakterisiert worden und dient als ein Modell für andere Alphaviren. Kurz, das Genom des Sindbis-Virus (wie von anderen Alphaviren) ist ein ungefähr 12 kb großes, einzelsträngiges Positivsense-RNA-Molekül, das mit einer Kappenstruktur versehen und polyadenyliert und in einer Virus-codierten Capsid-Proteinhülle enthalten ist. Das Nucleocapsid wird weiterhin von einer Wirts-abstammenden Lipidhülle umgeben, in die die zwei viral-spezifischen Glycoproteine E1 und E2 inseriert und am Nucleocapsid verankert sind. Bestimmte Alphaviren (z. B. SF) bewahren auch ein zusätzliches Protein, E3, das ein Spaltungsprodukt des E2-Vorläuferproteins PE2 ist. Nach der Viruspartikel-Absorption an Zielzellen, Penetration und dem Entfernen der Hülle des Nucleocapsids, um die virale genomische RNA in das Cytoplasma freizusetzen, wird der replikative Vorgang durch die Translation der Nichtstrukturproteine (nsPs) von den 5'-gelegenen zwei Dritteln des viralen Genoms initiiert. Die vier nsPs (nsP1–nsP4) werden direkt von der genomischen RNA-Matrize als eines von zwei Polyproteinen (nsP123 oder nsP1234) translatiert und post-translationell durch eine aktive Protease in der C-terminalen Domäne nsP2 in monomere Einheiten prozessiert. Ein durchlässiges Opal (UGA)-Codon, das zwischen nsP3 und nsP4 der meisten Alphaviren vorhanden ist, macht einen 10 bis 20% Überfluss des nsP1234-Polyproteins im Vergleich zum nsP123-Polyprotein aus. Beide Nichtstrukturpolyproteine und ihre abgeleiteten monomeren Einheiten können am replikativen RNA-Vorgang teilnehmen, der die Bindung an die konservierten Nucleotidsequenz-Elemente (CSEs), die an den 5'- und 3'-Enden vorhanden sind, und einen subgenomischen Verbindungsregion-Promotor, der innen im Genom gelegen ist (was weiter unten diskutiert wird), involviert.
Die genomische Positivstrang-RNA dient als eine Matrize für die nsP-katalysierte Synthese eines komplementären Volllängen-Negativstrangs. Die Synthese des komplementären Negativstrangs wird nach der Bindung des nsP-Komplexes an das 3'-terminale CSE der genomischen Positivstrang-RNA katalysiert. Der Negativstrang dient wiederum als eine Matrize für die Synthese von zusätzlicher genomischer Positivstrang-RNA und einer abundant exprimierten subgenomischen 26S-RNA, intern initiiert am Verbindungsregion-Promotor. Die Synthese einer zusätzlichen genomischen Positivstrang-RNA erfolgt nach der Bindung des nsP-Komplexes an das 3'-terminale CSE der komplementären genomischen Negativstrang-RNA-Matrize. Die Synthese der subgenomischen mRNA von der genomischen Negativstrang-RNA-Matrize wird vom Verbindungsregion-Promotor initiiert. Daher sind die 5'-End- und die Verbindungsregion-CSEs der genomischen Positivstrang-RNA nur funktionell, nachdem sie in das genomische Negativstrang-RNA-Komplement transkribiert werden (d. h. das 5'-End-CSE ist funktionell, wenn es das 3'-Ende des genomischen negativ-strängigen Komplements ist). Die Strukturproteine (sPs) werden von der subgenomischen 26S-RNA translatiert, die ein Drittel des Genoms im 3'-Bereich repräsentiert, und werden wie die nsPs posttranslationell in die individuellen Proteine prozessiert.
Einige Gruppen haben das Ausnutzen von bestimmten Mitgliedern der Alphavirus-Gattung als einen Expressionsvektor vorgeschlagen, einschließlich zum Beispiel Sindbis-Virus (Xiong et al., Science 243: 1188-1191, 1989; Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683, 1992; Dubensky et al., J. Virol 70: 508-519, 1996), Semliki Forest-Virus (Liljestrom, Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991) und Venezuelanisches Pferde-Encephalitis-Virus (Davis et al., J. Cell. Biochem. Ergänz. 19A: 10, 1995). Zusätzlich hat eine Gruppe das Verwenden von Alphavirus-abgeleiteten Vektoren für die Abgabe von therapeutischen Genen in vivo vorgeschlagen. Eine Schwierigkeit mit den oben in Bezuggenommenen Vektoren ist jedoch, dass die Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese (d. h. Protein- oder RNA-Synthese) innerhalb weniger Stunden nach der Infektion beginnt, und cytopathische Effekte (CPE) treten innerhalb von 12 bis 16 Stunden nach der Infektion (hpi) auf. Die Inhibition und das Abschalten der Wirtszell-Proteinsynthese beginnt in der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Strukturproteinexpression in BHK-Zellen, die mit rekombinanten viralen Partikeln infiziert wurden, innerhalb von 2 hpi, was nahe legt, dass die frühen Vorgänge nach der Virusinfektion (z. B. die Synthese von nsPs und der Minusstrang-RNA) die Inhibition der Wirtszell-Proteinsynthese und die folgende Entwicklung von CPE und Zelltod direkt beeinflussen können.
SN-1 ist ein varianter Stamm, der von Wildtyp-Sindbis abgeleitet wurde, und er wurde von einer Kultur von BHK-Zellen, die über einen Zeitraum von einem Monat persistent mit Sindbis-Virus infiziert wurden, isoliert (Weiss et al., J. Virol. 33: 463-474, 1980). Ein reiner SIN-1-Virusbestand, der durch Expansion von einem einzelnen Plaque erhalten wurde, tötet die BHK-Zellen, die er infiziert, nicht. Wichtig ist, dass die Viruserträge (> 10³ PbE/Zelle) in BHK-Zellen, die mit Wildtyp-Sindbis-Virus oder dem varianten SIN-1-Virus infiziert wurden, dieselben sind. Daher wird der Hauptphänotyp von SIN-1 in infizierten BHK-Zellen durch die Produktion von Wildtyp-Spiegeln des infektiösen Virus in der Abwesenheit von virusinduziertem Zelltod charakterisiert.
Die vorliegende Erfindung liefert rekombinante Vektoren mit ausgewählten wünschenswerten Phänotypen für die Verwendung in einer Vielfalt von Anwendungen, einschließlich zum Beispiel der Gentherapie und rekombinanten Proteinproduktion, und liefert weiterhin andere in Beziehung stehende Vorteile. Aspekte der folgenden Offenbarung, die nicht spezifisch mit der beanspruchten Erfindung in Beziehung stehen, sind nur zum Vergleich und zur Veranschaulichung eingeschlossen.
Zusammenfassung der Erfindung
Kurz angegeben betrifft die vorliegende Erfindung RNA-Vektor-Replikons, Alphavirus-Vektorkonstrukte, eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme und rekombinante Alphaviruspartikel, die eine reduzierte, verzögerte oder keine Inhibition der zellulären Makromolekülsynthese (z. B. Protein- oder RNA-Synthese) zeigen, wobei die Verwendung dieser Vektoren für die Proteinexpression, Gentherapie und dergleichen mit reduzierter, verzögerter oder ohne Entwicklung von CPE oder Zelltod ermöglicht wird. Solche Vektoren können aus einer weiten Vielfalt von Alphaviren (z. B. Semliki Forest-Virus, Ross River-Virus, Venezuelanisches Pferde-Encephalitisvirus oder Sindbis-Virus) konstruiert und gestaltet werden, um zahlreiche heterologe Sequenzen zu exprimieren (z. B. eine Sequenz, die einem Protein entspricht, eine Sequenz, die einer Antisense-RNA entspricht, eine Sequenz, die einer nicht-codierenden Sense-RNA entspricht, oder eine Sequenz, die einem Ribozym entspricht).
Hierin werden isolierte Nucleinsäuremoleküle offenbart, umfassend ein verändertes Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Gen, das, wenn es funktionell in ein rekombinantes Alphavirus inkorporiert werden, die Zeit verlängert, die benötigt wird, um 50% Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese nach der Expression in Säugerzellen im Vergleich zu einem Wildtyp-Alphavirus zu erreichen. Wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung angewendet, bezeichnet ein „verändertes Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Gen" ein Gen, das, wenn es funktionell in ein Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon, ein rekombinantes Alphaviruspartikel oder ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem inkorporiert wird, den erwünschten Phänotyp (z. B. eine reduzierte, verzögerte oder keine Inhibition der zellulären Makromolekülsynthese) produziert. Solche veränderten Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Gene werden eine oder mehrere Nucleotid-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen haben, die die Nucleotidsequenz von jener des Wildtyp-Alphavirusgens verändern. Das Gen kann entweder künstlich (z. B. aus gelenkten Selektionsvorgehensweisen; siehe Beispiel 2 unten) oder von natürlich vorkommenden viralen Varianten (siehe Beispiel 1 unten) abstammen. Zusätzlich sollte verstanden werden, dass, wenn die hierin offenbarten, isolierten Nucleinsäuremoleküle in ein Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon, ein rekombinantes Alphaviruspartikel oder ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem, wie oben diskutiert, inkorporiert werden, sie die Zeit, die benötigt wird, um eine 50% Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese zu erreichen, wesentlich verlängern können, bis zu und einschließlich im Wesentlichen keiner nachweisbaren Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese. Tests, die für das Nachweisen der Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese in Prozent geeignet sind, schließen zum Beispiel jene ein, die im Beispiel 1 beschrieben sind.
Hierin sind auch isolierte Nucleinsäuremoleküle offenbart, umfassend ein verändertes Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Gen, das, wenn es funktionell in ein rekombinantes Alphaviruspartikel, ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem oder ein RNA-Vektor-Replikon inkorporiert wird, in einem reduzierten Spiegel (z. B. 2-fach, 5-fach, 10-fach, 50-fach oder mehr als 100-fach) der vektorspezifischen RNA-Synthese im Vergleich zum Wildtyp und demselben oder einem höheren Spiegel des Proteins, das durch die RNA, die vom viralen Verbindungsregion-Promotor transkribiert wird, codiert wird, im Vergleich zu einem rekombinanten Wildtyp-Alphaviruspartikel, einem eukaryontischen geschichteten Wildtyp-Vektorinitiationssystem oder einem Wildtyp-RNA-Vektor-Replikon resultiert. Repräsentative Tests für das Quantifizieren von RNA-Spiegeln schließen [³H]-Uridin-Inkorporierung, wie im Beispiel 1 beschrieben, oder eine RNA-Akkumulierung, wie durch Northern-Blot-Analyse nachgewiesen (Siehe Beispiel 4), ein. Repräsentative Tests für das Quantifizieren von Proteinspiegeln schließen Raster-Densitometrie (siehe Beispiel 4) und verschiedene enzymatische Tests (siehe Beispiele 3–5) ein.
In einem Aspekt der obigen Offenbarung codiert das isolierte Nucleinsäuremolekül das Nichtstrukturprotein 2 (nsP2). In einem weiteren Aspekt hat das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Mutation im LXPGG-Motiv von nsP2.
Hierin werden auch Expressionsvektoren offenbart, umfassend einen Promotor, der mit einem der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle funktionell verknüpft ist. In einem Aspekt umfasst der Expressionsvektor weiterhin eine Polyadenylierungssequenz oder eine Transkriptions-Terminierungssequenz 3' des Nucleinsäuremoleküls.
Die Erfindung liefert Alphavirusvektoren, wie in den Ansprüchen definiert.
In einem Aspekt liefert die Erfindung einen Alphavirusvektor, umfassend ein verändertes Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen, das, wenn es in eine Wirtszelle eingebracht wird, die Zeit, die benötigt wird, um eine 50% Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese zu erreichen, im Vergleich zu einem Vektor verlängert, der ein Wildtyp-Alphavirus-nsP2-Gen hat, und das in Spiegeln der heterologen Genexpression resultiert, die äquivalent oder höher im Vergleich zu den Expressionsspiegeln eines Vektors sind, der ein Wildtyp-Alphavirus-nsP2-Gen aufweist, wobei das veränderte Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen eine oder mehrere Nucleotid-Substituionen, -Deletionen oder -Insertionen aufweist, die die Nucleotidsequenz von jener des Wildtyp-Alphavirus-nsP2-Gens verändern, wobei das veränderte Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen ein biologisch aktives nsP2-Protein bereitstellt.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Alphavirus-Vektorkonstrukte geliefert, umfassend einen 5'-Promotor, der die Synthese von viraler RNA in vitro aus cDNA initiiert, eine 5'-Sequenz, die die Transkription von Alphavirus-RNA nach dem 5'-Promotor initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, das alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine funktionell codiert, einschließlich eines veränderten nsP2-Gens, wie oben beschrieben, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz, einen 3'-Polyadenylat-Bereich und eine ausgewählte heterologe Sequenz stromabwärts von und funktionell verknüpft mit einer viralen Verbindungsregion.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden RNA-Vektor-Replikons, die zur Translation in einem eukaryontischen System in der Lage sind, geliefert, umfassend eine 5'-Sequenz, die die Transkription von Alphavirus-RNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, das funktionell alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine codiert, einschließlich des veränderten nsP2-Gens, das oben diskutiert wird, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz und einen 3'-Polyadenylat-Bereich und eine ausgewählte heterologe Sequenz stromabwärts von und funktionell verknüpft mit einer viralen Verbindungsregion. In weiteren Aspekten der Erfindung werden Wirtszellen geliefert, die eines der hierin beschriebenen RNA-Vektor-Replikons enthalten. In zusätzlichen Aspekten der Erfindung werden Arzneimittel geliefert, umfassend RNA-Vektor-Replikons, wie oben beschrieben, und einen/ein pharmazeutisch verträglichen/s Träger oder Verdünnungsmittel.
In anderen Aspekten der Erfindung werden rekombinante Alphaviruspartikel geliefert, umfassend ein oder mehrere Alphavirus-Strukturproteine, eine Lipidhülle und ein RNA-Vektor-Replikon, wie hierin beschrieben. In einer Ausführungsform werden eines oder mehrere der Alphavirus-Strukturproteine von einem anderen Alphavirus als dem Alphavirus, von dem das RNA-Vektor-Replikon abgeleitet wurde, abgeleitet. In anderen Ausführungsformen werden das Alphavirus-Strukturprotein und die Lipidhüllen von anderen Spezies abgeleitet. In anderen Aspekten werden Arzneimittel geliefert, umfassend ein rekombinantes Alphaviruspartikel, wie oben offenbart, und einen/ein pharmazeutisch verträglichen/s Träger oder Verdünnungsmittel. Weiterhin werden auch Säugerzellen, die mit solchen rekombinanten Alphaviruspartikeln infiziert sind, geliefert.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können die oben beschriebenen Vektoren oder Partikel weiterhin einen Resistenzmarker umfassen, der im Rahmen mit der heterologen Sequenz fusioniert worden ist. Repräsentative Beispiele von solchen Resistenzmarkern schließen die Hygromycin-Phosphotransferase oder Neomycin ein.
In anderen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Verfahren für das Selektieren von Alphavirus- oder rekombinanten Alphavirus-Vektorvarianten offenbart, die den hierin beschriebenen Phänotyp einer reduzieren, verzögerten oder keiner Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese zeigen. Repräsentative Beispiele von solchen Verfahren schließen die Verwendung von selektierbaren Arzneistoffen oder antigenen Markern ein und werden detaillierter unten in Beispiel 2 geliefert.
In anderen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Togavirus-Capsidpartikel offenbart, die im Wesentlichen keine genomischen (d. h. Wildtyp-Virusgenom) oder RNA-Vektor-Replikon-Nucleinsäuren enthalten. Repräsentative Beispiele von Togaviren schließen zum Beispiel Alphaviren und Rubiviren (z. B. Rubella) ein. In bestimmten Aspekten umfassen die Capsidpartikel weiterhin eine Lipidhülle, die ein oder mehrere Alphavirus-Glycoproteine enthält. In anderen Aspekten umfasst das Capsidpartikel weiterhin eine Alphavirus-Hülle (d. h. die Lipid-Doppelschicht und das Glycoprotein-Komplement). In verwandten Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Arzneimittel geliefert, umfassend die oben erwähnten Capsidpartikel (mit oder ohne eine Lipid-Doppelschicht (z. B. eine virale Hülle, die Alphavirus-Glycoproteine enthält)) zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel. In weiteren Aspekten können solche Capsidpartikel (mit oder ohne eine Lipid-Doppelschicht (z. B. eine virale Hülle, die Alphavirus-Glycoproteine enthält)) oder Arzneimittel als ein Impfmittel angewendet werden, um eine Immunantwort gegen ein erwünschtes Togavirus zu induzieren.
In weiteren Aspekten dieser Offenbarung werden induzierbare Promotoren offenbart, umfassend eine Kern-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, eine funktionell verknüpfte Nucleinsäuresequenz, die die DNA-Bindung eines Proteins lenkt, das die Transkription der Kern-Promotorsequenz aktiviert, und eine funktionell verknüpfte Nucleinsäuresequenz, die die DNA-Bindung eines Proteins lenkt, das die Transkription der Kern-Promotorsequenz unterdrückt. Solche Promotoren können in den hierin beschriebenen Gen-Abgabevehikeln so wie einer weiten Vielfalt von anderen Vektoren, die Fachleuten bekannt sind, verwendet werden.
In anderen Aspekten dieser Offenbarung sind Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassetten offenbart, umfassend einen 5'-Promotor, der die Synthese von viraler RNA aus DNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, das ein oder mehrere funktionelle Alphavirus-Strukturproteine codiert, einen selektierbaren Marker, der funktionell mit der Transkription der Expressionskassette verknüpft ist, und optionell eine 3'-Sequenz, die die Transkriptions-Terminierung kontrolliert. In einem Aspekt umfassen solche Expressionskassetten weiterhin eine 5'-Sequenz, die die Transkription von Alphavirus-RNA initiiert, einen viralen Verbindungsregion-Promotor und eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz. In einem weiteren Aspekt umfasst die Expressionskassette weiterhin eine katalytische Ribozym-Prozessierungssequenz, post-translationelle transkriptionelle regulatorische Elemente, die den RNA-Export aus dem Nukleus ermöglichen, und/oder Elemente, die die Translation von multicistronischer mRNA erlauben, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Internen Ribosom-Eingangsstelle-Elementen, Elementen, die das ribosomale Durchlesen fördern, und der BiP-Sequenz. In anderen Aspekten ist der selektierbare Marker funktionell mit einem 5'-Promotor verknüpft, der zum Initiieren der Synthese von Alphavirus-RNA aus cDNA in der Lage ist. In weiteren Aspekten wird der selektierbare Marker stromabwärts eines Verbindungsregion-Promotors und des Nucleinsäuremoleküls positioniert, das Alphavirus-Strukturproteine codiert. In noch anderen Aspekten ist der 5'-Promotor ein induzierbarer Promotor, wie hierin beschrieben. In einem anderen Aspekt umfasst die Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette weiterhin ein Alphavirus-Capsidproteingen oder eine andere Sequenz (z. B. einen Tabak-Ätz-Virus- oder „TEV"-Führer), der zum Verstärken der Translation von einem oder mehreren funktionellen Alphavirus-Strukturproteingenen, die 3' der Enhancersequenz gelegen sind, in der Lage ist. Vorzugsweise wird die Casidprotein-Gensequenz von einem anderen Alphavirus als jenem abgeleitet, von dem die Sequenz erhalten wird, die die Alphavirus-Strukturgene codiert.
In noch anderen Aspekten dieser Offenbarung werden Alphavirus-Verpackungszelllinien offenbart, umfassend eine Zelle, die eine Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette, wie oben beschrieben, enthält. In bestimmten Aspekten sind die Alphavirus-Verpackungszelllinien stabil mit den Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassetten, die hierin offenbart werden, transformiert. In verwandten Aspekten werden Alphavirus-Hersteller-Zelllinien bereitgestellt, umfassend eine Zelle, die eine stabil transformierte Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette enthält, und einen Vektor, der aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus RNA-Vektor-Replikons, Alphavirus-Vektorkonstrukten und eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystemen.
In noch anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme bereitgestellt, umfassend einen 5'-Promotor, der zum Initiieren der 5'-Synthese von RNA aus cDNA in vivo in der Lage ist, eine Sequenz, die die Transkription von Alphavirus-RNA nach dem 5'-Promotor initiiert; ein Nucleinsäuremolekül, das funktionell alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine codiert, einschließlich eines veränderten nsP2-Gens, wie oben diskutiert, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz, einen 3'-Polyadenylat-Bereich und eine heterologe Sequenz, die funktionell mit einer viralen Verbindungsregion verknüpft ist. Repräsentative Beispiele von geeigneten 5'-Promotoren schließen RNA-Polymerase I-Promotoren, RNA-Polymerase II-Promotoren, RNA-Polymerase III-Promotoren, den HSV-TK-Promotor, RSV-Promotor, Tetracyclin-induzierbaren Promotor, MoMLV-Promotor, einen SV40-Promotor und einen CMV-Promotor ein. In bevorzugten Ausführungsformen ist der 5'-Promotor ein induzierbarer Promotor, wie hierin beschrieben.
In bestimmten Ausführungsformen werden eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme geliefert, die weiterhin ein post-transkriptionelles regulatorisches Element umfassen, das den RNA-Export aus dem Nukleus ermöglicht. In weiteren Ausführungsformen können die hierin bereitgestellten eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssysteme weiterhin ein Transkriptions-Terminierungssignal umfassen.
In verwandten Aspekten liefert die vorliegende Erfindung auch Wirtszellen (z. B. Wirbeltier oder Insekt), enthaltend ein stabil transformiertes eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem, wie oben beschrieben. In weiteren Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Verfahren für das Abgeben einer ausgewählten heterologen Sequenz an einen Vertebraten oder ein Insekt offenbart, umfassend den Schritt des Verabreichens eines Alphavirus-Vektorkonstrukts, eines RNA-Vektor-Replikons, eines rekombinanten Alphaviruspartikels oder eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems, wie hierin beschrieben, an einen Vertebraten oder ein Insekt. In bestimmten Aspekten wird das Alphavirus-Vektorkonstrukt, das RNA-Vektor-Replikon, das rekombinante Alphaviruspartikel oder das eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme an Zellen des Vertebraten ex vivo verabreicht, gefolgt von einer Verabreichung der Vektor- oder der Partikel-enthaltenden Zellen an ein warmblütiges Tier.
In anderen Aspekten werden Arzneimittel geliefert, umfassend ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem, wie oben diskutiert, und einen/ein pharmazeutisch verträglichen/s Träger oder Verdünnungsmittel. in bestimmten Ausführungsformen wird das Arzneimittel als ein liposomales Präparat bereitgestellt.
In weiteren Aspekten werden Verfahren zum Herstellen von rekombinanten Alphaviruspartikeln geliefert, umfassend die Schritte von (a) Einbringen eines Vektors wie eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems, eines RNA-Vektor-Replikons oder eines Alphavirus-Vektorpartikels, wie oben beschrieben, in eine Population von Verpackungszellen unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um die Produktion von rekombinanten Alphaviruspartikeln zu ermöglichen, und (b) Ernten der rekombinanten Alphaviruspartikel. In verwandten Aspekten werden Verfahren zum Herstellen eines ausgewählten Proteins geliefert, umfassend die Schritte von (a) Einbringen eines Vektors, der ein ausgewähltes heterologes Protein codiert, wie eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems, eines RNA-Vektor-Replikons oder eines Alphavirus-Vektorpartikels, wie oben beschrieben, in eine Population von Verpackungszellen oder anderer Zellen unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um die Produktion des ausgewählten Proteins zu erlauben, und (b) Ernten des Proteins, das durch die Vektor-enthaltenden Zellen produziert wird. In noch anderen Aspekten werden Verfahren zum Herstellen eines ausgewählten Proteins geliefert, umfassend den Schritt des Einbringens eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems, das zum Produzieren eines ausgewählten heterologen Proteins in der Lage ist, in eine Wirtszelle unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um die Expression des ausgewählten Proteins zu erlauben. In weiteren Aspekten werden Wirtszelllinien geliefert, die ein RNA-Vektor-Replikon, wie hierin beschrieben, enthalten.
In noch anderen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Alphavirus-Impfstoffe offenbart, umfassend eines der oben beschriebenen Alphavirus-Vektorkonstrukte, RNA-Vektor-Replikons, eukaryontischen Vektorinitiationssysteme oder rekombinanten Alphaviruspartikel, die eine der heterologen Sequenzen, die hierin geliefert werden, exprimieren können oder nicht (z. B. können sie nur als ein Impfstoff für das Behandeln oder Verhindern von alphaviralen Krankheiten verwendet werden). Zum Beispiel werden in einem Aspekt dieser Offenbarung rekombinante Togavirus-Partikel offenbart, die im Wesentlichen keine Nucleinsäure oder RNA-Vektor-Replikon-Nucleinsäure aufweisen. In einem weiteren Aspekt werden rekombinante Togavirus-Partikel offenbart, die heterologe virale Nucleinsäuren (d. h. von einem anderen Virus als dem Togavirus-Partikel) enthalten. In noch einem anderen Aspekt ist das rekombinante Togavirus-Partikel T = 3 oder größer.
In weiteren Aspekten dieser Offenbarung werden rekombinante chimäre Togavirus-Partikel (entweder leer oder Nucleinsäuren enthaltend) offenbart, wobei das virale Partikel virale Strukturkomponenten aufweist, die von anderen Togaviridae erhalten oder abgeleitet werden (z. B. wird das Capsidprotein und Glycoprotein von verschiedenen Alphavirus-Quellen erhalten).
Diese und andere Aspekte werden durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angefügten Figuren ersichtlich. Zusätzlich sind verschiedene Bezugnahmen hierin dargelegt, die bestimmte Vorgehensweisen oder Zusammensetzungen (z. B. Plasmide, Sequenzen usw.) detaillierter beschreiben.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die Figuren, die sich nicht spezifisch auf die beanspruchte Erfindung beziehen, dienen nur zum Vergleich und zur Veranschaulichung.
1 ist eine schematische Darstellung der Sindbis-Genom-Organisierung und der Replikationsstrategie.
2 ist eine Graphik der Virusfreisetzung aus BHK-Zellen, die mit SIN-1-, SIN-1/nsP1-4-, Toto1101- oder Sin-1/nsP2-Viren bei einer MOI von 10 infiziert wurden. Die Kulturüberstände wurden 3, 6, 9 und 12 Stunden nach der Infektion gewonnen. Die Virustiter wurden durch Plaque-Test bestimmt.
3 ist eine Grafik, die die virale RNA-Synthese in BHK-Zellen nach der Infektion durch Toto1101-, SIN-1/nsP2-, SIN-1/nsP1-4- oder SIN-1-Virus zeigt. Die Zellen wurden bei einer MOI von 10 infiziert, und 1 Stunde nach der Infektion wurden Actinomycin D und ³H-Uridin zugefügt. Die Menge der ³H-Uridin-Inkorporation wurde 3, 6, 9 und 12 hpi bestimmt.
4 ist eine Graphik, die die virale RNA-Synthese in BHK-Zellen zeigt, die durch SIN-1/nsP1, SIN-1/nsP2, SIN-1/nsP3, SIN-1/nsP3-4, SIN-1/nsP4, SIN-1/nsP2-O, SIN-1/nsP2-N, Toto1101, SIN-1 oder SIN-1/nsP1-4 infiziert wurden. Die Spiegel der ³H-Uridin-Inkorporation werden relativ zur Wildtyp (Toto 1101)-Infektion ausgedrückt.
5 ist eine Graphik, die das Abschalten der Wirtszell-Proteinsynthese in BHK-Zellen zeigt, die mit SIN-1nsP1-4-, SIN-1-, SIN-1nsP2- oder Toto1101-Viren infiziert wurden.
6 ist die cDNA-Sequenz von 8000 Basen des SIN-1-Virus (SEQ. ID NO. 101).
7 ist die cDNA-Sequenz von 8000 Basen des SINCG-Virus (SEQ. ID NO. 102).
8 ist die cDNA-Sequenz des Toto 1101-Virus (SEQ. ID NO. 103).
9A ist ein Northern-Blot von RNAs, die von BHK-21-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP- oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNAs transfiziert wurden, isoliert und mit einer radioaktiv-markierten viralen RNA-Sonde hybridisiert wurden. 9B ist eine Graphik, die einen 7 Tage-Zeitverlauf der alkalischen Phosphatase-Expression in BKH-Zellen zeigt, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP- oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNAs transfiziert wurden.
10 ist eine Graphik, die einen 4 Tage-Zeitverlauf der Luciferase-Expression in BHK-Zellen zeigt, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-luc- oder pBG/wt ELVS 1.5-luc-Plasmid-DNAs transfiziert wurden.
11A ist ein Northern-Blot von RNAs, die von BHK-21-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-gal- oder pBG/wt ELVS 1.5-β-Gal-Plasmid-DNAs transfiziert wurden, isoliert und mit einer radioaktiv markierten viralen RNA-Sonde hybridisiert wurden. 11B ist ein Western-Blot, der die β-Gal-Expression in BHK-21-Zellen nachweist, die mit entweder pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-gal- oder pBG/wt ELVS 1.5-R-gal-Plasmid-DNAs transfiziert wurden. 11C ist eine Graphik, die einen 5 Tage- Verlauf der alkalischen Phosphatase-Expression in BHK-Zellen zeigt, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-gal- oder pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmid-DNAs transfiziert wurden.
12A & B sind Graphiken, die die β-gal-Expression in HT1080- und BHK-21-Zellen zeigen, die mit ELVS β-gal-Vektoren mit oder ohne HBV-PRE-Sequenzen transfiziert wurden, gemessen durch RLU (relative Lichteinheiten).
13 ist eine schematische Darstellung der RNA-Amplifikation, Strukturprotein-Expression und Vektor-Verpackung durch Vektor-induzierbare Alphavirus-Verpackungszelllinien.
14 ist eine schematische Darstellung der Vektor-induzierbaren Strukturprotein-Expressionskassetten, die in der Herstellung von Alphavirus-Verpackungszelllinien verwendet werden.
15 ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung (Transfer der Expression) durch verschiedene Alphavirus-Verpackungszelllinien zeigt.
16 ist ein Western-Blot, der die Vektor-induzierbare Strukturprotein-Expression durch eine Alphavirus-Verpackungszelllinie zeigt.
17A ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung durch C6/36-Stechmückenzellen, enthaltend die pDCMV-intSINrbz-Strukturprotein-Expressionskassette, zeigt. 17B ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung durch menschliche 293-Verpackungszellen zeigt, die stabil mit dem Plasmid pBGSVCMVdlneo transformiert wurden.
18 ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung durch verschiedene Alphavirus-Verpackungszelllinien zeigt.
19 ist eine RNA-Gel-Autoradiographie, die ³H-Uridin-markierte RNAs von BHK-Zellen zeigt, die mit SINrep/LacZ-Vektorpartikeln, die von einer Alphavirus-Verpackungszelllinie produziert wurden, infiziert wurden.
20 ist eine Proteingel-Autoradiographie, die ³⁵S-Methionin-markierte Proteine von BHK-Zellen zeigt, die mit SINrep/LacZ-Vektorpartikeln, die von einer Alphavirus-Verpackungszelllinie produziert wurden, infiziert wurden.
21 ist ein Western-Blot, der die Vektor-induzierbare Capsidprotein-Expression nach einer β-Gal- oder Glycoprotein-Vektor-Transfektion einer Capsid-Zelllinie zeigt.
22 ist eine schematische Darstellung der Region von Strukturprotein-Expressionskassetten, umfassend ein Wildtyp- oder deletionsmutiertes Ross River-Virus-Capsidprotein-Gen.
23 ist eine schematische Darstellung von Vektor-induzierbaren Strukturprotein-Expressionskassetten, enthaltend ein Wildtyp- oder deletionsmutiertes Ross River-Virus-Capsidprotein-Gen.
24 ist eine schematische Darstellung der Vektor-Verpackung durch „gespaltene" Strukturprotein-Genexpressionskassetten, die eine Ross River-Virus-Capsidprotein-Gensequenz stromaufwärts der Sindbis-Virus-Glycoprotein-Gene enthalten.
25 ist eine schematische Darstellung der Vektor-Verpackung durch „gespaltene" Strukturprotein-Genexpressionskassetten, die eine Ross River-Virus-Capsidprotein-Gensequenz stromaufwärts der Sindbis-Virus-Glycoprotein-Gene auf einer Kassette und das Sindbis-Virus-Capsidprotein-Gen in einer getrennten Kassette enthalten.
26 ist eine Tabelle, die die Ergebnisse der Vektorpartikel-Verpackung unter Verwendung der obigen „gespaltenen" Strukturprotein-Genexpressionskassetten zeigt.
27 ist eine schematische Darstellung der Verwendung von Alphavirus-Verpackungszelllinien für die Amplifizierung von verpackten Vektorpartikel-Präparaten und die Massenproduktion von rekombinantem Protein.
28 ist eine Graphik, die die Amplifizierung und Produktion von β-Gal-Protein im Zeitverlauf unter Verwendung von Alphavirus-Verpackungszelllinien zeigt.
29 ist eine schematische Darstellung der Verwendung eines Tetracyclin-regulierten Promotorsystems, um die Expression der Alphavirusvektor-RNA aus cDNA in vivo zu kontrollieren.
30 ist eine schematische Darstellung der Verwendung eines verknüpften transkriptionellen Repressors und eines transkriptionellen Induktor/Aktivatorregulierten Promotorsystems, um die Expression von Alphavirusvektor-RNA aus cDNA in vivo zu steuern.
31A & B sind Autoradiographien von [³H]-Uridin-markierten RNAs, die einer Elektrophorese auf denaturierenden Glyoxal-Gelen unterzogen wurden und die von BHK-Zellen, welche mit SINrep/LacZ-Replikon und DH-RNAs von verschiedenen RRV-Capsid-enthaltenden DH-Konstrukten durch Elektroporation behandelt wurden, und von den Vektorpartikeln, die 18 Stunden nach der Elektroporation in den Kulturflüssigkeiten vorhanden waren, isoliert wurden.
32A & B sind Proteingel-Autoradiographien, die ³⁵S-Methionin-markierte Proteine von BHK-Zellen, die mit SINrep/LacZ-Replikon und DH-RNAs von verschiedenen RRV-Capsid-enthaltenden DH-Konstrukten durch Elektroporation behandelt wurden, und von den Vektorpartikeln zeigen, die 18 Stunden nach der Elektroporation in den Kulturflüssigkeiten vorhanden sind.
33A–D sind Kyte-Doolittle-Hydrophobie-Diagramme von verschiedenen Ross River-Virus (RRV)-Capsidproteinen, die vom Wildtyp-Gen (A) und den drei Deletionsmutanten CΔ1rrv, CΔ2rrv und CΔ3rrv (B–D) exprimiert wurden.
34 ist ein Schema, das die Aminoterminus-RRV-Capsidproteine illustriert, die vom Wildtyp-Gen (SEQ. ID NO. 114) und den drei Deletionsmutanten CΔ1rrv (SEQ. ID NO. 115), CΔ2rrv (SEQ. ID NO. 116) und CΔ3rrv (SEQ. ID NO. 117) exprimiert werden. Die Lysinreste, die in den RRV-Capsid-Genmutanten deletiert sind, sind angezeigt.
35 ist eine Graphik, die die relativen Spiegel von [³⁵S]Methionin und [³H]-Uridin illustriert, die in die Viruspartikel in BHK-Zellen, die bei einer hohen MOI mit Toto1101-Wildtyp-Virus infiziert wurden, inkorporiert wurden.
36 ist eine Graphik, die die relativen Spiegel von [³⁵S]-Methionin und [³H]Uridin illustriert, die in Viruspartikel in BHK-Zellen, die mit SINrep/lacZ und DH-BB (5' tRNA) Crrv DH RNAs durch Elektroporation behandelt wurden, inkorporiert wurden.
37 ist eine Graphik, die die relativen Spiegel von [³⁵S]Methionin und [³H]Uridin illustriert, die in Viruspartikel in BHK-Zellen, die mit SlNrep/lacZ und den RRV-Capsid-Deletionsmutante-DH-BB (5' tRNA) CΔ3rrv DH-RNAs durch Elektroporation behandelt wurden, inkorporiert wurden.
38 ist eine Graphik, die die Ergebnisse, die in den 35–37 gezeigt werden, zusammenstellt, die die relativen Spiegel von [³⁵S]Methionin und [³H]Uridin zeigen, die in Viruspartikel in BHK-Zellen, die mit SINrep/lacZ und DH-RNAs durch Elektroporation behandelt oder mit dem Toto1101-Wildtyp-Virus infiziert wurden, inkorporiert wurden.
39 ist eine Graphik, die die Luciferase-Vektor-Verpackung durch BHK-Zellen illustriert, die stabil mit pBGSVCMVdlhyg transformiert wurden.
Definition der Begriffe
Die folgenden Begriffe werden im Verlauf der Beschreibung verwendet. Außer wenn es anderweitig angezeigt wird, werden diese Begriffe wie folgt definiert:
"Genomische RNA" bezeichnet RNA, die die gesamte genetische Information enthält, die nötig ist, um ihre eigene Amplifizierung oder Selbstreplikation in vivo in einer Zielzelle zu lenken. Um ihre eigene Replikation zu lenken, kann das RNA-Molekül: 1) ein oder mehrere Polymerase-, Replikase- oder andere Proteine codieren, die mit den viralen oder wirtszellabgeleiteten Proteinen, Nucleinsäuren oder Ribonucleoproteinen interagieren können, um den RNA-Amplifizierungsvorgang zu katalysieren; und 2) cis-RNA-Sequenzen enthalten, die für die Replikation nötig sind und während des Vorgangs der Replikation durch ihre selbst-codierten Proteine oder nicht selbst-codierten zellabstammenden Proteine, Nucleinsäuren oder Ribonucleoproteine oder Komplexe zwischen irgendwelchen dieser Komponenten gebunden werden können. Ein Alphavirus-abgeleitetes genomisches RNA-Molekül sollte die folgenden geordneten Elemente enthalten: 5' virale oder defekte-interferierende RNA-Sequenz(en), die für die Replikation in cis benötigt werden, Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine (z. B. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) codieren, virale 3'-Sequenzen, die für die Replikation in cis benötigt werden, und einen Polyadenylat-Bereich. Das Alphavirus-abgeleitete genomische RNA-Vektor-Replikon kann auch einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor, der in bestimmten Ausführungsformen modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen Fragments zu verhindern, erhöhen oder zu reduzieren, und Sequenzen enthalten, die, wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Strukturproteine (z. B. C, E3, E2, 6K, E1) codieren. Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff genomische RNA auf ein Molekül von positiver Polarität oder „Message"-Sense, und die genomische RNA kann eine Länge haben, die verschieden von jener von irgendeinem bekannten natürlich vorkommenden Alphavirus ist. Vorzugsweise enthält die genomische RNA keine Sequenzen, die irgendein (irgendwelche) alphavirales(n) Strukturprotein(e) codieren; vielmehr werden jene Sequenzen mit heterologen Sequenzen substituiert. In jenen Fällen, in denen die genomische RNA in ein rekombinantes Alphaviruspartikel verpackt werden soll, muss sie eine oder mehrere Sequenzen enthalten, die dazu dienen, Interaktionen mit Alphavirus-Strukturproteinen zu initiieren, die zur Partikelbildung führen, und hat vorzugsweise eine Länge, die durch das Verpackungssystem, das angewendet wird, wirksam verpackt wird.
„Subgenomische RNA" oder „26S"-RNA bezieht sich auf ein RNA-Molekül mit einer Länge oder Größe, die kleiner ist als die genomische RNA, von der sie abgeleitet wurde. Die subgenomische RNA sollte von einem internen Promotor transkribiert werden, dessen Sequenzen sich in der genomischen RNA oder ihrem Komplement befinden. Die Transkription der subgenomischen RNA kann durch viralcodierte Polymerase(n), wirtszellcodierte Polymerase(n), Transkriptionsfaktor(en), Ribonucleoprotein(e) oder eine Kombination davon vermittelt werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die subgenomische RNA von einem Vektor gemäß der Erfindung produziert und codiert oder exprimiert das Gen (die Gene) oder Sequenz(en) von Interesse. Die subgenomische RNA muss nicht notwendigerweise einen Sedimentationskoeffizienten von 26 haben.
"Alphavirus-Vektorkonstrukt" bezieht sich auf eine Anordnung, die zum Lenken der Expression einer Sequenz (von Sequenzen) oder eines Gens (von Genen) von Interesse in der Lage ist. Solche Vektorkonstrukte umfassen eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der Lage ist (im Hintergrund auch als 5'-CSE bezeichnet), sowie Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine (z. B. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) codieren, und eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz (im Hintergrund auch als 3'-CSE bezeichnet). Zusätzlich sollte das Vektorkonstrukt einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor, der in bestimmten Ausführungsformen modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen Fragments zu verhindern, erhöhen oder zu reduzieren, und auch einen Polyadenylat-Bereich einschließen. Der Vektor kann auch Sequenzen von einem oder mehreren Strukturprotein-Genen oder Teile davon, fremde Nucleinsäuremolekül(e), die von einer Größe sind, die ausreicht, um die Produktion von lebensfähigem Virus zu ermöglichen, einen 5'-Promotor, der zum Initiieren der Synthese von viraler RNA in vitro aus cDNA in der Lage ist, eine heterologe Sequenz, die exprimiert werden soll, sowie eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion von heterologen Sequenzen einschließen.
"Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon", "RNA-Vektor-Replikon" und "Replikon" bezieht sich auf ein RNA-Molekül, das zum Lenken seiner eigenen Amplifizierung oder Selbstreplikation in vivo in einer Zielzelle in der Lage ist. Um seine eigene Amplifizierung zu lenken, kann das RNA-Molekül: 1) ein oder mehrere Polymerase-, Replikase- oder andere Proteine codieren, die mit den viralen oder wirtszellabgeleiteten Proteinen, Nucleinsäuren oder Ribonucleoproteinen interagieren können, um die RNA-Amplifizierung zu katalysieren; und 2) cis-RNA-Sequenzen enthalten, die für eine Replikation benötigt werden und die durch ihre selbstcodierten Proteine oder nicht-selbstcodierten zellabgeleiteten Proteine, Nucleinsäuren oder Ribonucleoproteine oder Komplexe zwischen irgendwelchen von diesen Komponenten gebunden werden können. In bestimmten Ausführungsformen kann die Amplifizierung auch in vitro erfolgen. Ein Alphavirus-abgeleitetes RNA-Vektor-Replikonmolekül sollte die folgenden geordneten Elemente enthalten: virale 5'-Sequenzen, die für die Replikation in cis erforderlich sind (im Hintergrund auch als 5'-CSE bezeichnet), Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine (z. B. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) codieren, virale 3'-Sequenzen, die für die Replikation in cis benötigt werden (im Hintergrund auch als 3'-CSE bezeichnet), und einen Polyadenylat-Bereich. Das Alphavirus-abgeleitete RNA-Vektor-Replikon kann auch einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor, der in bestimmten Ausführungsformen modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen Fragments zu verhindern, steigern oder zu reduzieren, Sequenzen von einem oder mehreren Strukturprotein-Genen oder Teile davon, fremde Nucleinsäuremolekül(e), die von einer ausreichenden Größe sind, um die Produktion von lebensfähigem Virus zu ermöglichen, sowie heterologe Sequenz(en), die exprimiert werden soll(en), enthalten. Die Quelle der RNA-Vektor-Replikons in einer Zelle kann aus einer Infektion mit einem Virus oder einem rekombinanten Alphaviruspartikel oder einer Transfektion von Plasmid-DNA oder in vitro-transkribierter RNA stammen.
"Rekombinantes Alphaviruspartikel" bezieht sich auf eine Virion-Einheit, die ein Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon enthält. Im Allgemeinen umfasst das rekombinante Alphaviruspartikel ein oder mehrere Alphavirus-Strukturproteine, eine Lipidhülle und ein RNA-Vektor-Replikon. Vorzugsweise enthält das rekombinante Alphaviruspartikel eine Nucleocapsid-Struktur, die in einer zellabstammenden Lipid-Doppelschicht wie einer Plasmamembran, in der alphaviral-codierte Hüllen-Glycoproteine eingebettet sind, enthalten ist. Das Partikel kann auch andere Komponenten (z. B. Targeting-Elemente wie Biotin, andere virale Strukturproteine oder andere Rezeptorbindungs-Liganden), die den Tropismus des Partikels, von dem das Alphavirus abgeleitet wurde, lenken, oder andere RNA-Moleküle enthalten.
„Strukturprotein-Expressionskassette" bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül, das zum Lenken der Synthese von einem oder mehreren Alphavirus-Strukturproteinen in der Lage ist. Die Expressionskassette sollte einen 5'-Promotor, der zum Initiieren der Synthese von RNA aus cDNA in vivo in der Lage ist, sowie Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, ein oder mehrere biologisch aktive Alphavirus-Strukturproteine (z. B. C, E3, E2, 6K, E1) codieren, und eine 3'-Sequenz, die die Transkriptions-Terminierung kontrolliert, einschließen. Die Expressionskassette kann auch eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der Lage ist (im Hintergrund auch als 5'-CSE bezeichnet), einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor und eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz (im Hintergrund auch als 3'-CSE bezeichnet) einschließen. In bestimmten Ausführungsformen kann die Expressionskassette auch Spleiß-Erkennungssequenzen, eine katalytische Ribozym-Prozessierungssequenz, eine Sequenz, die einen selektierbaren Marker codiert, ein nukleäres Exportsignal sowie eine Polyadenylierungssequenz einschließen. Zusätzlich kann die Expression des Alphavirus-Strukturproteins (der Alphavirus-Strukturproteine) in bestimmten Ausführungsformen durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors reguliert werden.
"Stabile Transformierung" bezieht sich auf das Einbringen eines Nucleinsäuremoleküls in eine lebende Zelle und eine Langzeit- oder permanente Bewahrung jenes Nucleinsäuremoleküls in den Nachkommen-Zellen durch aufeinanderfolgende Zyklen der Zellteilung. Das Nucleinsäuremolekül kann in jedem zellulären Kompartiment bewahrt werden, einschließlich des Nukleus, der Mitochondrien oder des Cytoplasmas, aber nicht beschränkt darauf. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Nucleinsäuremolekül im Nukleus bewahrt. Das Bewahren kann intrachromosomal (integriert) oder extrachromosomal als ein episomales Ereignis auftreten.
„Alphavirus-Verpackungszelllinie" bezieht sich auf eine Zelle, die eine Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette enthält und die nach dem Einbringen eines Alphavirus-Vektorkonstrukts, eines RNA-Vektor-Replikons, eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems oder eines rekombinanten Alphaviruspartikels rekombinante Alphaviruspartikel produziert. Die Elternzelle kann von Säuger- oder nicht-Säuger-Ursprung sein. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verpackungszelllinie stabil mit der Strukturprotein-Expressionskassette transformiert.
"Alphavirus-Hersteller-Zelllinie" bezieht sich auf eine Zelllinie, die zum Herstellen von rekombinanten Alphaviruspartikeln in der Lage ist, umfassend eine Alphavirus-Verpackungszelllinie, die auch ein Alphavirus-Vektorkonstrukt, ein RNA-Vektor-Replikon, ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem oder ein rekombinantes Alphaviruspartikel enthält. Vorzugsweise ist das Alphavirus-Vektorkonstrukt ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem, und die Hersteller-Zelllinie ist stabil mit dem Vektorkonstrukt transformiert. In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Transkription des Alphavirus-Vektorkonstrukts und die folgende Herstellung von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln nur als Antwort auf einen oder mehrere Faktoren oder den Differenzierungsstatus der Alphavirus-Hersteller-Zelllinie.
"Defektes Helferkonstrukt" bezieht sich auf eine Anordnung, die zur RNA-Amplifizierung oder -Replikation und Expression von einem oder mehreren Alphavirus-Strukturproteinen als Antwort auf biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine, die in trans bereitgestellt werden, in der Lage ist. Das defekte Helferkonstrukt sollte die folgenden geordneten Elemente enthalten: virale 5' oder defekte-interferierende RNA-Sequenzen, die für die Replikation in cis benötigt werden, einen viralen subgenomischen Verbindungsregion-Promotor, Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, ein oder mehrere biologisch aktive Alphavirus-Strukturproteine (z. B. C, E3, E2, 6K, E1) codieren, virale 3'-Sequenzen, die für die Replikation in cis benötigt werden, und einen Polyadenylat-Bereich. Das defekte Helferkonstrukt kann auch einen 5'-Promtor, der zum Initiieren der Synthese von viraler RNA aus cDNA in der Lage ist, eine 3'-Sequenz, die die Transkriptions- Terminierung steuert, Spleiß-Erkennungsequenzen, eine katalytische Ribozym-Prozessierungssequenz, eine Sequenz, die einen selektierbaren Marker codiert, und ein nukleäres Exportsignal enthalten.
„Eukaryontische qeschichtete Vektorinitiiationssysteme" beziehen sich auf eine Anordnung, die zum Lenken der Expression einer Sequenz (von Sequenzen) oder eines Gens (von Genen) von Interesse in der Lage ist. Das eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssystem sollte einen 5'-Promotor, der zum Initiieren der Synthese von RNA aus cDNA in vivo (d. h. in einer Zelle) in der Lage ist, und eine Nucleinsäure-Vektorsequenz, die zum Lenken ihrer eigenen Replikation in einer eukaryontischen Zelle und auch zum Exprimieren einer heterologen Sequenz in der Lage ist, enthalten. Die Nucleinsäuresequenz, die zum Lenken ihrer eigenen Amplifikation in der Lage ist, kann von viralem oder nicht-viralem Ursprung sein. In bestimmten Ausführungsformen ist die Nucleinsäure-Vektorsequenz eine Alphavirus-abgeleitete Sequenz und umfasst eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der Lage ist (im Hintergrund auch als 5'-CSE bezeichnet), sowie Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine (z. B. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) codieren, und eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz (im Hintergrund auch als 3'-CSE bezeichnet). Zusätzlich kann die Vektorsequenz auch einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor, der in bestimmten Ausführungsformen modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen Fragments zu verhindern, zu erhöhen oder zu reduzieren, Sequenzen von einem oder mehreren Strukturprotein-Genen oder Teile davon, fremde(s) Nucleinsäuremolekül(e), die (das) von einer ausreichenden Größe sind (ist), um eine optimale Amplifizierung zu erlauben, eine heterologe Sequenz, die exprimiert werden soll, eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion von heterologen Sequenzen sowie eine Polyadenylierungssequenz einschließen. Das eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssystem kann auch Spleiß-Erkennungssequenzen, eine katalytische Ribozym-Prozessierungssequenz, ein nukleäres Exportsignal und eine Transkriptions-Terminierungssequenz enthalten. In bestimmten Ausführungsformen kann die in vivo-Synthese der Vektor-Nucleinsäuresequenz aus cDNA durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors reguliert werden.
„Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukt” bezieht sich auf eine Anordnung, die zum Lenken der Expression einer Sequenz (von Sequenzen) oder eines Gens (von Genen) von Interesse in der Lage ist. Das Vektorkonstrukt umfasst eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der Lage ist (auch als 5'-CSE bezeichnet), sowie Sequenzen, die, wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine (z. B. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) codieren, und eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz (im Hintergrund auch als 3'-CSE bezeichnet). Zusätzlich sollte das Vektorkonstrukt einen 5'-Promotor, der zum Initiieren der Synthese von viraler RNA aus cDNA in vitro in der Lage ist, und eine 3'-Sequenz einschließen, die die Transkriptions-Terminierung kontrolliert. In bestimmten Ausführungsformen kann das Vektorkonstrukt weiterhin einen viralen subgenomischen „Verbindungsregion"-Promotor umfassen, der in bestimmten Ausführungsformen modifiziert sein kann, um die virale Transkription des subgenomischen Fragments zu verhindern, zu erhöhen oder zu reduzieren. Der Vektor kann auch Sequenzen von einem oder mehreren Strukturprotein-Genen oder Teile davon, fremde(s) Nucleinsäuremolekül(e), die (das) von ausreichender Größe sind (ist), um die Produktion von lebensfähigem Virus zu ermöglichen, eine heterologe Sequenz, die exprimiert werden soll, eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion von heterologen Sequenzen, Spleiß-Erkennungssequenzen, eine katalytische Ribozym-Prozessierungssequenz, ein nukleares Exportsignal sowie eine Polyadenylierungssequenz einschließen. In bestimmten Ausführungsformen kann die in vivo-Synthese von viraler RNA aus cDNA durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors reguliert werden.
"Gen-Abgabevehikel" bezieht sich auf ein Konstrukt, das verwendet werden kann, um ein Gen oder eine Sequenz von Interesse abzugeben. Repräsentative Beispiele schließen Alphavirus-RNA-Vektor-Replikons, Alphavirus-Vektorkonstrukte, eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme und rekombinante Alphaviruspartikel ein.
Zahlreiche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden für Fachleute bei Inbetrachtziehen der folgenden detaillierten Beschreibung, die eine Erhellung der Praxis der Erfindung liefert, ersichtlich werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung neue Gen-Abgabevehikel, einschließlich zum Beispiel RNA-Vektor-Replikons, Alphavirus-Vektorkonstrukte, eukaryontischer geschichteter Vektorinitiationssysteme und rekombinanter Alphaviruspartikel. Kurz, das Einbringen von Plasmid-DNA-, in vitro-transkribierten RNA- oder partikelbasierten Vektoren der vorliegenden Erfindung in eine Zelle resultiert in Spiegeln der heterologen Genexpression, die im Vergleich zu den Expressionsspiegeln der Wildtyp-abgeleiteten alphaviralen Vektoren äquivalent oder höher sind. Unerwarteterweise ist jedoch der Spiegel der synthetisierten vektorspezifischen RNA in kultivierten Zellen, die ein Gen-Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung enthalten, mindestens etwa 5- bis 10-fach niedriger im Vergleich zu Wildtyp-abgeleiteten Vektoren. Darüber hinaus zeigen solche Gen-Abgabevehikel im Vergleich zu Wildtyp-abgeleiteten Vektoren eine reduzierte, verzögerte oder keine Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese nach dem Einbringen in eine Wirtszelle.
Wie unten detaillierter diskutiert wird, betrifft die vorliegende Erfindung: (A) Quellen von Wildtyp-Alphaviren, die zum Konstruieren der Gen-Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung geeignet sind; (B) Verfahren zum Selektieren von Alphaviren mit einem erwünschten Phänotyp; (C) Konstruktion von Alphavirus-Vektorkonstrukten und Alphavirus-RNA-Vektor-Replikons; (D) Konstruktion von eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystemen; (E) Konstruktion von rekombinanten Alphaviruspartikeln; (F) heterologe Sequenzen, die durch die Gen-Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung exprimiert werden können; (G) Konstruktion von Alphavirus-Verpackungs- oder Helfer-Zelllinien; (H) Arzneimittel; und (I) Verfahren zum Anwenden von Alphavirus-basierenden Vektoren.
A. Quellen des Wildtyp-Alphavirus
Wie oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung eine breite Vielfalt von Alphavirus-basierten Vektoren (z. B. RNA-Vektor-Replikons, Alphavirus-Vektorkonstrukte, eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme und rekombinante Alphaviruspartikel) sowie Verfahren zum Anwenden solcher Vektorkonstrukte und Partikel. Kurz, Sequenzen, die Wildtyp-Alphaviren codieren, die für die Verwendung im Herstellen der oben beschriebenen Vektoren geeignet sind, können leicht in Anbetracht der hierin gelieferten Offenbarung aus natürlich vorkommenden Quellen oder von Hinterlegungsstellen (z. B. der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) erhalten werden. Zusätzlich können Wildtyp-Alphaviren zum Vergleichen des Spiegels der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese in Zellen, die mit dem Wildtyp-Alphavirus infiziert wurden, mit dem Spiegel der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese in Zellen, die die Gen-Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung enthalten, verwendet werden.
Repräsentative Beispiele von geeigneten Alphaviren schließen Aura-Virus (ATCC VR-368), Bebaru-Virus (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou-Virus (ATCC VR-922), Chikungunya-Virus (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), östliches Pferde-Encephalomyelitis-Virus (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan-Virus (ATCC VR-924), Getah-Virus (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach-Virus (ATTC VR-927), Mayaro-Virus (ATCC VR-66, ATCC VR-1277), Middelburg-Virus (ATCC VR-370), Mucambo-Virus (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu-Virus (ATCC VR-371), Pixuna-Virus (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), Ross River-Virus (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), Semliki Forest-Virus (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), Sindbis-Virus (ATCC VR-68, ATCC VR-1248; siehe auch CMCC #4640, unten beschrieben), Tonate-Virus (ATCC VR-925), Triniti-Virus (ATCC VR-469), Una-Virus (ATCC VR-374), Venezuelanisches Pferde-Encephalomyelitis-Virus (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR-1249, ATCC VR-532), westliches Pferde-Encephalomyelitis-Virus (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa-Virus (ATCC VR-926) und Y-62-33-Virus (ATCC VR-375) ein.
Zu Zwecken des Vergleichens von Spiegeln der zellulären Makromolekülsynthese können die folgenden Plasmide auch als eine Standardquelle von Wildtyp-Alphavirus-Beständen verwendet werden. Diese Plasmide schließen ein: für das Semliki Forest-Virus pSP6-SFV4 (Liljestrom et al., J. Virol. 65: 4107-4113, 1991); für das Venezuelanische Pferde-Encephalitisvirus pV2000 (Davis et al., Vir. 183: 20-31, 1991); für das Ross River-Virus pRR64 (Kuhn et al., Vir. 182: 430-441, 1991). Kurz, für diese Plasmide kann das Virus von BHK-Zellen, die mit in vitro-transkribierter genomischer RNA von dem Plasmid transfiziert wurden, erhalten werden. Für das Sindbis-Virus kann das infektiöse Virus von BHK-Zellen, die mit pVGELVIS (ATCC Nr. 75891)-Plasmid-DNA transfiziert wurden, direkt isoliert oder alternativ als ein Wildtyp-Virusbestand erhalten werden (siehe Hinterlegungsinformation, die unten in Bezug auf ATCC Nr. VR-2526 geliefert wird).
B. Selektion von Alphaviren mit einem erwünschten Phänotyp
Die Dauer der heterologen in vivo-Genexpression von Alphavirus-basierten Vektoren wird durch einige Mechanismen beeinflusst, einschließlich Inhibition der wirtszellgerichteten Makromolekülsynthese. Vor der vorliegenden Erfindung hatte es jedoch kein offensichtliches Verfahren gegeben, um auf codierende oder nicht-codierende viralspezifische Vektorsequenzänderungen zu selektieren oder diese zu identifizieren, die in einem nicht-cytopathischen Phänotyp resultieren. Daher werden in einem Aspekt der vorliegenden Offenbarung Verfahren zum Isolieren und/oder Konstruieren von Alphavirus-abgeleiteten Gen-Abgabevehikeln mit reduzierter oder ohne Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese offenbart.
1. Biologische Selektion von Virusvarianten
a. Selektion aus Virusbeständen, die DI-Partikel enthalten
Ein Ansatz zum Isolieren von nicht-cytopathischen Alphavirusvarianten nutzt das Vorliegen von defekten interferierenden (DI) Partikeln in Wildtyp-Virus-Präparaten aus. Kurz, obwohl bestimmte RNA-Viren, zum Beispiel Rhabdoviren (z. B. vesikuläres Stomatitisvirus) und Alphaviren (z. B. Sindbis-Virus und Semliki Forest-Virus), hochgradig cytopathisch sind, können sie nichtsdestotrotz eine persistente Langzeit-Infektion in kultivierten Zellen in der Anwesenheit von DI-Partikeln etablieren. DI-Partikel werden definitionsgemäß vom Wildtyp-Virus abgeleitet und enthalten eine oder mehrere Mutationen (z. B. Deletionen, Umlagerungen, Nucleotid-Substitutionen, usw.) vom Wildtyp-Genom, die die autonome Replikation durch das DI verhindern. Im Allgemeinen ist das Genom der DI-Partikel kleiner und von einer geringeren Komplexität im Vergleich zum Wildtyp-Virus, und Protein-codierende Regionen sind deletiert, wohingegen Regionen bewahrt werden, die für die Replikation in cis benötigt werden. Solche cis-Sequenzen sind oft verdoppelt und/oder umgelagert. Im Fall von bestimmten Alphaviren (z. B. Sindbis-Virus) sind die Sequenz und die Organisation der DI-RNA-Genome analysiert worden, und es wurde gefunden, dass sie zusätzlich zu der viralen Sequenz ein Minimum von 50 nt des äußersten 3'-Endes des Wildtyp-Virusgenoms und an ihren 5'-Enden entweder eine Wildtyp-Sequenz oder eine zelluläre tRNA (z. B. tRNA)-Sequenz enthalten. In allen Fällen erfordert die Vermehrung und Bewahrung der mutierten DI-Genome die Co- Existenz eines Eltern-Helfervirus in der infizierten Zelle. Dennoch ist die DI-Genomreplikation als ein Ergebnis ihrer genetischen Struktur erheblich überlegen und vergleichbar abundant gegenüber seinem Wildtyp-Gegenstück. Dieses Charakteristikum resultiert in einer Interferenz der Wildtyp-Genomreplikation, dem Fehlen einer oder einem niedrigen Spiegel der Produktion von infektiösem Virus und der Etablierung einer persistenten Langzeit-Infektion von Zellen.
Daher liefert die Fähigkeit, eine persistente Langzeit-Infektion in permissiven Zellen (z. B. Säugerzellen, einschließlich Zellen von menschlichem Ursprung) zu etablieren, wie unten in den Beispielen 1 und 2 gezeigt, durch Infizieren mit einem gemischten Alphavirusbestand, der eine Population von DI-Partikeln enthält, einen Mechanismus, um im Laufe der Zeit vollkommen intakte Virusvarianten zu isolieren, die in der Lage sind, sogar in der Abwesenheit von DI-Partikeln eine persistente Infektion zu etablieren. Solche infektiösen Virusvarianten können von persistent infizierten Langzeitkulturen durch mehrere Runden einer Plaque-Reinigung isoliert werden, und es ist gefunden wurden, dass sie in den Wirtszellen eine produktive, persistente und nicht-cytopathische Infektion initiieren. Darüber hinaus ist der Spiegel des varianten Virus, das von solch einer produktiven, persistenten und nicht-cytopathischen Infektion produziert wird, nicht unterscheidbar von der Wildtyp-Virusinfektion. Diese Beobachtung ist in deutlichem Kontrast zu der früheren Voraussetzung für die Etablierung von persistenten Infektionen mit Virusbeständen, die ein Gemisch von DI-Partikeln enthalten.
b. Selektion aus Virusbeständen, die keine DI-Partikel enthalten
Zusätzlich zur Selektion aus Virusbeständen, die defekte interferierende Partikel enthalten, können Virusvarianten, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, von gereinigten Virusbeständen (ohne DI Partikel) erhalten werden, die entweder vor der Infektion von empfänglichen kultivierten Zellen einer zufälligen Mutagenese ausgesetzt wurden oder denen erlaubt wurde, während der RNA-Replikation mit den kultivierten Zellen nichtspezifische Mutationen herzustellen. Kurz, der anfängliche Virusbestand kann als ein natürliches Isolat oder eine biologische Variante, die davon abgeleitet wurde, erhalten werden oder kann durch Transfizieren von kultivierten Zellen mit einem infektiösen Nucleinsäuremolekül, das einen genomischen cDNA-Clon oder eine in vitro-transkribierte RNA umfasst, hergestellt werden. Wenn erwünscht, kann der Virusbestand dann einer physikalischen oder chemischen Mutagenese ausgesetzt werden (obwohl es bevorzugt wird, dass solch eine Mutagenese nicht erforderlich ist). Im Fall einer chemischen Mutagenese verwenden bevorzugte Ausführungsformen vor der Virus-Infektion ein leicht verfügbares mutagenes Agens, zum Beispiel salpetrige Säure, 5-Azacytidin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder Ethylmethansulfonat (Sigma, St. Louis, MO). Nach der zufälligen Mutagenese werden spezifische Selektionsvorgehensweisen angewendet, um die Virusvarianten zu isolieren, die den gewünschten Phänotyp besitzen, wie detaillierter unten in Beispiel 2 beschrieben.
2. Genetische Selektion von Virusvarianten
In einem verwandten Ansatz können Mutationen nicht unter Verwendung eines Virusbestands, sondern vielmehr unter Verwendung von clonierter genomischer cDNA des Virus, das danach verwendet werden kann, um infektiöse virale RNA in vitro (zum Beispiel Sindbis-Virus (Rice et al., J. Virol. 61: 3809-3819, 1987; Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996, SFV (Liljeström et al., J. Virol. 65: 4107-4113, 1991, VEE (Davis et al., Virology 183: 20-31, 1991), Ross River-Virus (Kuhn et al., Virology 182: 430-441, 1991), Poliovirus (Van Der Werf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2330-2334, 1984)) oder in vivo zu transkribieren (Sindbis-Virus (Dubensky et al., ebd.), Poliovirus (Racaniello und Baltimore, Science 214: 916-919, 1981)), erhalten werden. Kurz, die infektiöse Nucleinsäure wird in empfängliche kultivierte Zellen (z. B. Säugerzellen, einschließlich Zellen von menschlichem Ursprung) entweder direkt oder nach einer Mutagenese unter Verwendung eines der oben in Bezug genommenen Verfahren eingebracht. Alternativ kann die Vektor-Nucleinsäure anfänglich in Partikel verpackt werden, und die Partikel können verwendet werden, um den Vektor für eine Selektion in die Zielzell-Population abzugeben. Danach werden spezifische Selektionsvorgehensweisen angewendet, um die Virusvarianten zu isolieren, die den gewünschten Phänotyp besitzen, und diese sind unten beschrieben.
In bestimmten Aspekten kann eine zufällige Mutagenese anfänglich durch Vermehrung des Plasmids, das die virale cDNA im XL1-Red-Stamm von E. coli (Stratagene, San Diego, Ka.) enthält, dem drei der primären DNA-Reparatur- Signalwege fehlen, die aus mutS-, mutD- und mutT-Mutationen resultieren, durchgeführt werden. Dennoch können andere Mutagenese-Vorgehensweisen leicht unter Verwendung von veröffentlichten Protokollen substituiert werden, einschließlich, aber nicht limitiert auf Linker-Scanning-Mutagenese (Haltiner et al., Nucleic Acids Res. 13: 1015, 1985; Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4202, 1985), zufällige Oligonucleotid-gelenkte Mutagenese (Kunkel et al., Methods Enzymol. 155: 166, 1987; Zoller und Smith, Methods Enzymol. 154: 329, 1987; Hill et al., Methods Enzymol. 155: 558, 1987; Hermes et al., Gene 84: 143, 1989) und PCR-Mutagenese (Herlitze und Koenen, Gene 91: 143, 1990). Die resultierende gemischte Population von mutierten cDNA-Clonen wird direkt oder nach einer Transkription in vitro in empfängliche kultivierte Zellen eingebracht. Eine Anreicherung von transfizierten Zellen, die das mutierte Virus des erwünschten Phänotyps enthalten, wird basierend auf einer erhöhten Überlebenszeit gegenüber den Wildtyp-Virus-infizierten Zellen erreicht, wie unten beschrieben.
3. Genetische Selektion von Varianten unter Verwendung von Virus-abgeleiteten Vektoren
In einem anderen Ansatz können Mutationen in jeder Region eines Virus-abgeleiteten Expressionsvektors, einschließlich der regulatorischen, nicht-translatierten Regionen oder der Protein-codierenden Gen-Regionen, hergestellt werden. Zum Beispiel werden in einem Aspekt dieser Offenbarung Verfahren zum Selektieren von viralen Varianten mit reduzierter oder ohne Inhibition der wirtszellgelenkten Makromolekülsynthese offenbart, umfassend die Schritte von: (a) Einbringen eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems, eines RNA-Vektor-Replikons oder eines rekombinanten Alphaviruspartikels, das die Expression eines immunogenen Zelloberflächenproteins lenkt (geeignet für den Nachweise von Vektor-enthaltenden Zellen), oder alternativ eines selektierbaren Markers (entweder eines Wirkstoff- oder nicht-Wirkstoff-Markers, wobei nicht-Vektor-enthaltende Zellen bei Zugabe zum Beispiel eines Wirkstoffs wie Neomycin, Hygromycin, Phleomycin, gpt, Puromycin oder Histidinol getötet werden), in eine Zelle; (b) Inkubieren oder Kultivieren der Zellen unter Bedingungen und für einen Zeitraum, der ausreicht, um Vektor-enthaltende Zellen, die den erwünschten Phänotyp zeigen, zu selektieren; gefolgt von (c) Isolieren der Zellen, die den Vektor des erwünschten Phänotyps enthalten, und (d) Analyse des Vektors auf die zugrunde liegende Mutation.
Wie oben angemerkt, können die viralen Vektoren von einer breiten Vielfalt von Viren abstammen (z. B. Sindbis-Virus (Xiong et al., Science 243: 1188-1191, 1989; Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683, 1992; Schlesinger, Trends Biotechnol. 11: 18-22, 1993; Dubensky et al., ebd.), Semliki Forest-Virus (Liljestrom und Garoff, Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991), Venezuelanisches Pferde-Encephalitisvirus (Davis et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 19A: 310, 1995), Poliovirus (Choi et al., J. Virol. 65: 2875-2883, 1991; Ansardi et al., Cancer Res. 54: 6359-6364, 1994; und Andino et al., Science 265: 1448-1451, 1994). Repräsentative Beispiele der oben beschriebenen Verfahren werden unten im Beispiel 2 detaillierter beschrieben.
4. Verwendung von viralen Varianten
Wie hierin detaillierter diskutiert, können virale Varianten, die unter Anwendung der hierin offenbarten Verfahren selektiert oder hergestellt worden sind, angewendet werden, um eine breite Vielfalt von rekombinanten Gen-Abgabevehikeln zu konstruieren, die den erwünschten Phänotyp zeigen. In bestimmten Ausführungsformen enthält das Gen-Abgabevehikel eine Mutation im Leu-Xaa-Pro-Gly-Gly („LXPGG")-Motiv des nsP2-Gens. Kurz, bei Alphaviren, wobei die veröffentlichte Sequenz des nsP2-Gens erhältlich ist, wird ein hochgradig konserviertes Aminosäuremotiv -Leu-Xaa-Pro-Gly-Gly- („LXPGG") beobachtet. Wie durch Standard-Protein-Modellierungsalgorithmen (Chou und Fasman, Adv. Enzym. 47: 45-148, 1978) vorhergesagt, umfassen die Reste dieses Motivs möglicherweise eine β-Schleife in der Struktur. Prolin 726 von nsP2 ist im Sindbis-Virus der zentrale Rest dieses Motivs. Das entsprechende Motiv in anderen Alphaviren wird in der Tabelle unten illustriert.

*Alphavirusstämme mit veröffentlichten nsP2-Sequenzen: (1) Strauss et al., Virology 133: 92-110, 1984; (2) Simpson et al., Virology 222: 464-469 1996; (3) Shirako et al., Virology 182: 753-764, 1991; (4) Rumenapf et al., Virology 208: 621-633, 1995; (5) Takkinen, Nucleic Acids Res. 14: 5667-5682, 1986; (6) Kinney et al., Virology 170: 19-30, 1989; und (7) Faragher et al. Virology 163: 509-526, 1988.

Daher werden in verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Gen-Abgabevehikel geliefert, worin das Gen-Abgabevehikel ein nsP2-Gen mit einer Mutation im LXPGG-Motiv enthält. In einer Ausführungsform ist das Leu-Codon zu einer anderen Aminosäure mutiert, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val oder einer anderen seltenen oder Nichtprotein-Aminosäure besteht (siehe z. B. Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, Inc., N. Y. N. Y., 1975). In einer anderen Ausführungsform ist das Pro-Codon zu einer anderen Aminosäure mutiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val oder einer anderen seltenen oder Nichtprotein-Aminosäure. In anderen Ausführungsformen können eines oder beide der Gly-Codons zu einer anderen Aminosäure mutiert sein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val. oder einer anderen seltenen oder Nichtprotein-Aminosäure. In noch anderen Ausführungsformen können die Xaa-Aminosäure oder die Aminosäuren zwischen 1 und 3 Reste stromaufwärts oder stromabwärts des LXPGG-Motivs von der Wildtyp-Aminosäure mutiert sein, um den Phänotyp des resultierenden Gen-Abgabevehikels zu bewirken. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann das LXPGG-Motiv mutiert sein, um mehr als eine Codonveränderung oder alternativ eine oder mehrere Codon-Insertionen oder -Deletionen zu enthalten.
C. Alphavirus-Vektorkonstrukte und Alphavirus-RNA-Vektor-Replikons
Wie oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung sowohl DNA- als auch RNA-Konstrukte, die von Alphaviren stammen. Kurz, in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Alphavirus-Vektorkonstrukte geliefert, umfassend einen 5'-Promotor, der die Synthese der viralen RNA aus cDNA in vitro initiiert, eine 5'-Sequenz, die die Transkription von Alphavirus-RNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, das alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine, einschließlich eines veränderten nsP2-Gens, wie oben beschrieben, funktionell codiert, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz und einen 3'-Polyadenylat-Bereich. In anderen Aspekten werden RNA-Vektor-Replikons geliefert, umfassend eine 5'-Sequenz, die die Transkription von Alphavirus-RNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, dass alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine, einschließlich der oben diskutierten veränderten nsP2-Gene, funktionell codiert, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz und einen 3'-Polyadenylat-Bereich. Die obigen Konstrukte umfassen weiterhin eine virale Verbindungsregion. Jeder dieser Aspekte wird unten detaillierter diskutiert.
1. 5'-Promotoren, die die Synthese von viraler RNA initiieren
Wie oben angemerkt, werden in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung Alphavirus-Vektorkonstrukte geliefert, die 5'-Promotoren enthalten, die (z. B. DNA-abhängige RNA-Polymerase-Promotoren) die Synthese von viraler RNA aus cDNA durch einen Vorgang der in vitro-Transkription initiieren. In bevorzugten Ausführungsformen schließen solche Promotoren zum Beispiel die Bakteriophage; T7-, T3- und SP6-RNA-Polymerase-Promotoren ein. In ähnlicher Weise werden eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme geliefert (z. B. DNA-abhängige RNA-Polymerase-Promotoren), die 5'-Promtoren enthalten, die die Synthese von viraler RNA aus cDNA in vivo (d. h. in einer Zelle) initiieren. In bestimmten Ausführungsformen können solche RNA-Polymerase-Promotoren (entweder für Alphavirus-Vektorkonstrukte oder eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme) sowohl von prokaryontischen als auch eukaryontischen Organismen abgeleitet werden und schließen zum Beispiel die bakteriellen β-Galactosidase- und trpE-Promotoren und die eukaryontischen viralen Affenvirus 40 (SV40)- (z. B. früh oder spät), Cytomegalievirus(CMV)- (z. B. sehr früh), murinen Moloney Leukämievirus (MOMLV)- oder Rous-Sarcomvirus(RSV)-LTR- und Herpes simplex Virus (HSV)-(Thymidinkinase)-Promotoren ein.
2. Sequenzen, die die Transkription initiieren
Wie oben angemerkt, enthalten die Alphavirus-Vektorkonstrukte und RNA-Vektor-Replikons der vorliegenden Erfindung in bevorzugten Ausführungsformen eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der Lage ist (auch als 5'-End-CSE oder 5'-cis-Replikationssequenz bezeichnet). Repräsentative Beispiele von solchen Sequenzen schließen die Nucleotide 1-60 und zu einem geringeren Grad die Nucleotide durch die Basen 150-210 des Wildtyp-Sindbis-Virus, die Nucleotide 10-75 für tRNA^Asp (Asparginsäure, Schlesinger et al., US-Patent Nr. 5,091,309 ) und die 5'-Sequenzen von anderen Alphaviren, die eine Transkription initiieren, ein. Es ist das Komplement dieser Sequenzen, das dem 3'-Ende der genomischen Minus-Strang-Kopie entspricht, wobei die Sequenzen durch den nsP-Replikase-Komplex und möglicherweise zusätzliche Wirtszell-Faktoren gebunden werden, von denen die Transkription der genomischen Positivstrang-RNA initiiert wird.
3. Alphavirus-Nichtstrukturproteine
Die Alphavirus-Vektorkonstrukte und RNA-Vektor-Replikons, die hierin geliefert werden, benötigen auch Sequenzen, die alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine, einschließlich eines veränderten nsP2-Gens, das den oben diskutierten erwünschten Phänotyp liefert, codieren. Kurz, eine breite Vielfalt von Sequenzen, die Alphavirus-Nichtstrukturproteine codieren, können zusätzlich zu jenen, die ausdrücklich hierin geliefert werden, in der vorliegenden Erfindung angewendet werden und sollen daher angesehen werden, dass sie in den Rahmen des Ausdrucks „Alphavirus-Nichtstrukturproteine" fallen. Zum Beispiel kann aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes mehr als ein Codon eine gegebene Aminosäure codieren. Daher kann eine breite Vielzahl von Nucleinsäuresequenzen, die Alphavirus-Nichtstrukturproteine codieren, hergestellt werden. Darüber hinaus können Aminosäure-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen an jeder von zahlreichen Positionen noch funktionelle oder biologisch aktive Nichtstrukturproteine bereitstellen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gelten Alphavirus-Nichtstrukturproteine als biologisch aktiv, wenn sie die Selbstreplikation des Vektorkonstrukts fördern, d. h. die Replikation von viralen Nucleinsäuren und nicht notwendigerweise die Produktion von infektiösem Virus, und können leicht durch metabolisches Markieren oder RNase-Protektionstests, die über einen Zeitverlauf durchgeführt werden, bestimmt werden. Verfahren zum Herstellen von solchen Derivaten werden angesichts der hierin bereitgestellten Offenbarung leicht durch einen Fachmann erreicht.
Alphaviren exprimieren vier Nichtstrukturproteine, bezeichnet als nsp1, nsp2, nsp3 und nsp4. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung, die von Alphaviren stammen, sollten Sequenzen enthalten, die die vier Nichtstrukturproteine codieren. Im Wildtyp-Sindbis-Virus werden die Nichtstrukturproteine 1-3 durch die Nucleotide 60 bis 5747 codiert, während nsP4 durch die Nucleotide 5769 bis 7598 codiert wird (siehe 1). Die Nichtstrukturproteine werden von der genomischen Positivstrang-RNA als eines von zwei großen Polyproteinen, bekannt als P123 beziehungsweise P1234 translatiert, abhängig davon, (i) ob es ein Opal-Terminierungs-Codon zwischen den codierenden Regionen von nsP3 und nsP4 gibt und (ii) ob solch ein Opal-Codon vorhanden ist, ob es eine Translations-Terminierung des entstehenden Polypeptids an jenem Punkt oder ein Durchlesen und daher die Produktion von P1234 gibt. Das Opal-Terminierungs-Codon ist an der nsP3/nsP4-Verbindung der Alphaviren SIN (Stamm AR339 und der hierin beschriebene SIN-1-Stamm), AURA, WEE, EEE, VEE und RR vorhanden, und daher werden die P123- und P1234-Spezies in Zellen, die mit diesen Viren infiziert sind, exprimiert. Im Gegensatz dazu ist an der nsP3/nsP4-Verbindung der Alphaviren SIN (Stamm AR86, SF und ONN) kein Terminierungs-Codon vorhanden, und daher wird nur die P1234-Spezies in den Zellen exprimiert, die mit diesen Viren infiziert sind. Sowohl das Polyprotein als auch prozessierte monomere Formen der Nichtstrukturproteine wirken in der Replikation des Alphavirus-RNA-Genoms. Experimente, die die Wachstums-Charakteristika von Alphavirus-Nichtstrukturprotein-Spaltungsmutanten untersucht haben, haben darauf hingewiesen, dass die Polyproteine in die Synthese der genomischen negativ-strängigen RNA involviert sind, wohingegen die individuellen monomeren Proteine die Synthese der genomischen und subgenomischen positiv-strängigen RNA-Spezies katalysieren (Shirako und Strauss, J. Virol. 68: 1874-1885, 1994). Translationelles Durchlesen erfolgt im Allgemeinen in etwa 10%–20% der Fälle in Zellen, die mit dem Wildtyp-Sindbis-Virus, das das Opal-Terminierungs-Codon an der nsP3/nsP4-Verbindung enthält, infiziert sind. Das Verarbeiten von P123 und P1234 erfolgt durch eine Proteinase-Aktivität, die durch eines der Nichtstrukturproteine codiert wird, und wird weiter unten diskutiert. Die Reihenfolge der Prozessierung, ob in cis oder in trans, hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich des Stadiums der Infektion. Zum Beispiel produzieren Sindbis-Virus und SFV früh in der Infektion P123 und nsp4 und später in der Infektion P12 und P34. Ein weiteres Prozessieren setzt dann die individuellen Nichtstrukturproteine frei. Jedes Nichtstrukturprotein hat einige Funktionen, wobei manche davon unten beschrieben werden.
a. nsP1
Das Nichtstrukturprotein 1 wird für die Initiierung der (oder das Fortsetzen der) Minusstrang-RNA-Synthese benötigt. Es spielt auch eine Rolle bei der Bildung der Kappenstruktur des 5'-Terminus von genomischen und subgenomischen Alphavirus-RNAs während der Transkription, da nsP1 sowohl eine Methyltransferase- (Mi und Stollar, Vir. 184: 423-427, 1991) als auch Guanyltransferase-Aktivität (Strauss und Strauss, Microbiol. Rev. 58(3): 491-562, 1994) besitzt. NsP1 moduliert auch die Proteinase-Aktivität von nsP2, da Polyproteine, die nsP1 enthalten, nicht wirksam zwischen nsP2 und nsP3 spalten (de Groot et al., EMBO J. 9: 2631-2638, 1990).
b. nsP2
Das Nichtstrukturprotein 2 ist ein multifunktionelles Protein, das in die Replikation der viralen RNA und die Prozessierung des Nichtstrukturproteins involviert ist. Es wird angenommen, dass die N-terminale Domäne des Proteins (umspannend etwa die ersten 460 Aminosäuren) eine Helicase ist, die in der Duplex-Entwindung während der RNA-Replikation und Transkription aktiv ist. Die Synthese der subgenomischen 26S-mRNA, die in Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung die Gene (das Gen) von Interesse codiert, erfordert funktionelles nsP2. Die C-terminale Domäne von nsP2 zwischen den Aminosäureresten 460-807 des Sindbis- Virus spaltet das Nichtstrukturprotein in trans und in cis zwischen den nsP1/nsP2-, nsP2/nsP3- und nsP3/nsP4-Verbindungen proteolytisch. Die Ausrichtung der primären Sequenzen der C-terminalen Alphavirus-nsP2-Domänen legt nahe, dass nsP2 eine Papain-ähnliche Proteinase ist (Hardy und Strauss, J. Virol. 63: 4653-4664, 1988).
Bis jetzt ist anderen beobachteten Charakteristika von nsP2 keine Funktion zugeschrieben worden, die sich direkt auf die Vermehrung von Alphaviren bezieht. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass nsP2 in SFV-infizierten Zellen eng mit Ribosomen assoziiert ist und mit rRNA durch UV-Bestrahlung vernetzt werden kann (Ranki et al., FEBS Lett. 108: 299-302, 1979). Weiterhin sind 50% von nsP2 in der nucleären Matrix, insbesondere im Bereich der Nucleoli von SFV-infizierten BHK-Zellen lokalisiert (Peränen et al., J. Virol. 64: 1888-1896, 1990). Die Lokalisierung von nsP2 in die Nuclei erfolgt vermutlich durch aktiven Transport, da es die Größe von kleinen Proteinen und Metaboliten (etwa 20–60 kDa), die in den Nucleus durch Diffusion durch nucleäre Kernkomplexe eintreten können, übersteigt (Paine et al., Nature 254: 109-114, 1975). Mutmaßliche NLS-Sequenzen sind in den Alphaviren SFV, SIN, RR, ONN, OCK und VEE identifiziert worden (Rikkonen et al., Vir. 189: 462-473, 1992).
c. nsP3
Das Nichtstrukturprotein nsP3 enthält zwei deutliche Domänen, obwohl ihre genauen Rollen in der viralen Replikation nicht gut verstanden sind. Die N-terminale Domäne liegt in verschiedenen Alphaviren in der Länge im Bereich von 322 bis 329-Resten und zeigt ein Minimum von 51% Aminosäure-Sequenzidentität zwischen jeglichen zwei Alphaviren. Die C-terminale Domäne ist jedoch unter den bekannten Alphaviren weder in der Länge noch in der Sequenz konserviert, und mehrere Änderungen werden toleriert (Li et al., Virology, 179: 416-427). Das Protein wird in Assoziation mit Replikationskomplexen in einem stark phosphorylierten Status gefunden. In Alphaviren, deren Genome ein Opal-Terminierungs-Codon zwischen der nsP3/nsP4-Verbindung enthalten, werden zwei verschiedene Proteine produziert, abhängig davon, ob es ein Durchlesen des Opal-Terminierungssignals gibt oder nicht. Ein Durchlesen resultiert in einem nsP3-Protein, das nach der Spaltung des Polyproteins 7 zusätzliche carboxy-terminale Aminosäuren enthält. Es ist klar, dass nsP3 in einer gewissen Kapazität für die virale RNA-Synthese benötigt wird, da bestimmte Mutanten dieses Proteins RNA-negativ sind und das P123-Polyprotein für die Minusstrang-RNA-Synthese benötigt wird.
d. nsP4
NsP4 ist die viruscodierte RNA-Polymerase und enthält das GDD-Motiv, das für solche Enzyme charakteristisch ist (Kamer und Argos, Nucleic Acids Res. 12: 7269-7282, 1984). Daher ist nsP4 für die Alphavirus-RNA-Replikation unentbehrlich. Die Konzentration von nsP4 wird in infizierten Zellen streng reguliert. In den meisten Alphaviren erfordert die Translation von nsP4 das Durchlesen eines Opal-Codons zwischen den nsP3- und nsP4-codierenden Regionen, was im Vergleich zu anderen Nichtstrukturproteinen in niedrigeren intrazellulären Spiegeln resultiert. Zusätzlich ist der Großteil von nsP4 durch Degradierung durch den N-End Regelweg metabolisch instabil (Gonda et al., J. Biol. Chem. 264: 16700-16712, 1989). Dennoch ist manches nsP4 aufgrund seiner Assoziation mit Replikationskomplexen, die Degradierungssignale verbergen, stabil. Daher kann sich die Stabilisierung des Enzyms durch Verändern des aminoterminalen Rests im Fördern einer vermehrten Langzeit-Expression der Proteine, die durch die hierin beschriebenen Vektoren codiert werden, als nützlich erweisen. Stabilisierende aminoterminale Reste schließen Methionin, Alanin und Tyrosin ein.
4. Virale Verbindungsregionen
Die virale Alphavirus-Verbindungsregion kontrolliert normalerweise die Transkriptions-Initiierung der subgenomischen mRNA; daher wird dieses Element auch als der subgenomische mRNA-Promotor bezeichnet. Im Fall des Sindbis-Virus beginnt die normale virale Verbindungsregion typischerweise ungefähr bei Nucleotidnummer 7579 und setzt sich bis mindestens Nucleotidnummer 7612 (und möglicherweise darüber hinaus) fort. Es wird angenommen, dass mindestens die Nucleotide 7579 bis 7602 (5'-ATC TCT ACG GTG GTC CTA AAT AGT-SEQ. ID NO. 1) für die Transkription des subgenomischen Fragments notwendig sind. Diese Region (Nucleotid 7579 bis 7602) wird hierin nachstehend als der „minimale Verbindungsregion-Kern" bezeichnet.
In bestimmten Aspekten dieser Offenbarung wird die virale Verbindungsregion inaktiviert, um die Synthese des subgenomischen Fragments zu verhindern. Wie es im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung angewendet wird, bedeutet „inaktiviert", dass die Spezies, die der subgenomischen mRNA entspricht, nicht in Autoradiogrammen von denaturierenden Gelen von elektrophoretisch aufgetrennter RNA beobachtet wird, die von Zellen gereinigt wurde, die diese Vektoren enthalten und mit 1 μg/ml Dactinomycin behandelt und mit [³H]-Uridin markiert wurden, wie beschrieben (Frolov und Schlesinger, J. Virol. 68: 1721-1727, 1994).
In einer Ausführungsform dieser Offenbarung können die Gen-Abgabevehikel durch das Platzieren von Signalen, die entweder ein Ribosomen-Durchlesen oder einen internen Ribosom-Eintritt unmittelbar stromabwärts des unterdrückten Verbindungsregion-Promotors fördern, konstruiert werden. In dieser Vektorkonfiguration kann keine Synthese der subgenomischen Botschaft erfolgen; die heterologen Proteine werden jedoch von mRNA genomischer Länge entweder durch ribosomales Durchlesen (Scanning) oder internen Ribosomen-Eintritt exprimiert.
In bestimmten Anwendungen der hierin beschriebenen Gen-Abgabevehikel ist die Expression von mehr als einem heterologen Gen erwünscht. Zum Beispiel können, um metabolische Störungen wie das Gaucher-Syndrom zu behandeln, mehrere Verabreichungen der Gen-Abgabevehikel oder Partikel erforderlich sein, da die Dauer des therapeutischen Linderungsmittels limitiert sein kann. Daher kann es in bestimmten Aspekten dieser Offenbarung wünschenswert sein, das Adenovirus 2-E3-Gen in einer Zielzelle zusammen mit einem therapeutischen Linderungsmittel wie dem Glucocerebrosidase-Gen zu co-exprimieren. Im Wildtyp-Virus wird die polycistronische Strukturprotein (sP)-Botschaft in ein einzelnes Polyprotein translatiert, das danach zum Teil durch die sP-Capsid-Proteinase in individuelle Proteine prozessiert wird. Daher erfordert die Expression von mehreren heterologen Genen von einer polycistronischen Botschaft einen Mechanismus, der sich vom Wildtyp-Virus unterscheidet, da die Protease-Aktivität des Capsid-sP oder die Peptide, die für die Spaltung erkannt werden, in der Ersatzregion der Alphavirusvektoren nicht vorhanden sind. Daher können in weiteren Aspekten dieser Offenbarung funktionelle Elemente, die die Translation von mehreren unabhängigen heterologen Sequenzen, einschließlich des ribosomales Durchlesens, der Kappen- unabhängigen Translation, des internen Ribosomen-Eintritts oder der minimalen Verbindungsregion-Kernsequenzen, ermöglichen, verwendet werden.
5. Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz und Poly(A)-Bereich
Wie oben angemerkt, sollten Alphavirus-Vektorkonstrukte oder RNA-Vektor-Replikons der vorliegenden Erfindung auch eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz (auch „Alphavirus-Replicase-Erkennungssequenz", „3'-terminales CSE" oder „3'-cis-Replikationssequenz" genannt) einschließen. Kurz, die Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz, die in der 3'-Endregion der genomischen positiv-strängigen RNA gelegen ist, liefert eine Erkennungsstelle, an der das Virus die Replikation durch Synthese des Negativ-Strangs beginnt. Eine breite Vielfalt von Sequenzen kann als eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz verwendet werden. Zum Beispiel können in einer Ausführungsform Sindbis-Virus-Vektorkonstrukte, in denen die Polymerase-Erkennung auf die kleinste Region, die noch als eine Erkennungssequenz wirken kann (z. B. Nucleotide 11,684 bis 11,703), verkleinert ist, verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können Sindbis-Virus-Vektorkonstrukte, in denen die gesamte nicht-translatierte Region stromabwärts vom E1-sP-Gen bis zum 3'-Ende des viralen Genoms, einschließlich der Polymerase-Erkennungsstelle (z. B. die Nucleotide 11,382 bis 11,703), verwendet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann das Alphavirus-Vektorkonstrukt oder das RNA-Vektor-Replikon zusätzlich einen Poly(A)-Bereich enthalten, der den beobachteten Spiegel der heterologen Genexpression in Zellen, die mit Alphavirus-abgeleiteten Vektoren transfiziert sind, dramatisch steigern (siehe z. B. Dubensky et al., vorstehend). Kurz, der Poly(A)-Bereich kann von jeder Größe sein, die ausreicht, um die Stabilität im Cytoplasma zu fördern, wodurch die Wirksamkeit des Initiierens des viralen Lebenszyklus erhöht wird. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Poly(A)-Sequenz mindestens 10 Adenosin-Nucleotide und am meisten bevorzugt mindestens 25 Adenosin-Nucleotide. In einer Ausführungsform ist die Poly(A)-Sequenz direkt an das Sindbis-Virus-Nucleotid 11,703 angeheftet.
D. Eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme
Aufgrund der Größe eines genomischen Volllängen-Alphavirus-cDNA-Clous ist die in vitro-Transkription von mit einer Kappenstruktur versehenen Volllängen-RNA-Molekülen ziemlich unwirksam. Dies resultiert in einer erniedrigten Transfektionswirksamkeit, als infektiöse Zentren des Virus (gemessen durch Plaquebildung), im Verhältnis zur Menge der transfizierten in vitro-transkribierten RNA. Eine solche Unwirksamkeit ist auch relevant im Bezug auf die in vitro-Transkription von Alphavirus-Expressionsvektoren. Das Testen von cDNA-Kandidatenclonen und anderen Alphavirus-cDNA-Expressionsvektoren auf ihre Fähigkeit, einen infektiösen Zyklus zu initiieren oder die Expression einer heterologen Sequenz zu lenken, kann daher sehr erleichtert werden, wenn ein cDNA-Clon als ein DNA-Molekül in empfängliche Zellen transfiziert wird, was dann die Synthese von viraler RNA in vivo lenkt.
Daher werden in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung DNA-basierte Vektoren (als „eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme" bezeichnet) geliefert, die zum Lenken der Synthese von viraler RNA (genomisch oder Vektor) in vivo in der Lage sind. Im Allgemeinen umfassen eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme einen 5'-Promotor, der zum Initiieren der 5'-Synthese von RNA aus cDNA in vivo (d. h. in einer Zelle) in der Lage ist, ein Konstrukt, das zum Lenken seiner eigenen Replikation in einer Zelle in der Lage ist, wobei das Konstrukt auch zum Exprimieren einer heterologen Nucleinsäuresequenz in der Lage ist, und eine 3'-Sequenz, die die Transkriptions-Terminierung steuert (z. B. ein Polyadenylat-Bereich). Solche eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssysteme liefern einen Zwei-Phasen oder „geschichteten" Mechanismus, der die Expression von heterologen Nucleotidsequenzen kontrolliert. Kurz, die erste Schicht initiiert die Transkription der zweiten Schicht und umfasst einen Promotor, der zum Initiieren der 5' zu 3'-Synthese von RNA aus cDNA in vivo in der Lage ist (z. B. einen eukaryontischen 5'-Promotor), und kann weiterhin andere Elemente umfassen, einschließlich einer 3'-Transkriptions-Terminierungs/Polyadenylierungsstelle, einer oder mehrerer Spleißstellen sowie anderer nukleäre RNA-Exportelemente, einschließlich zum Beispiel des post-transkriptionellen Hepatitis B-Virus-Regulationselements (PRE) (Huang et al., Mol. Cell. Biol. 13: 7476, 1993; Huang et al., J. Virol. 68: 3193, 1994; Huang et al., Mol. Cell. Biol., 15: 3864-3869, 1995), des konstitutiven Transportelements (CTE), des Mason-Pfizer-Affenvirus (Brav et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1256-1260, 1994), des responsiven HIV Rev-Elements (Malim et al., Nature 338: 254-257, 1989; Cullen et al., Trends Biochem. Sci. 16: 346, 1991) und anderer ähnlicher Elemente, wenn erwünscht. Repräsentative Promotoren, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen sowohl eukaryontische (z. B. pol I, II oder III) als auch prokaryontische Promotoren und induzierbare oder nicht induzierbare (d. h. konstitutive) Promotoren wie zum Beispiel die murinen Moloney-Leukämievirus-Promotoren, Metallothionein-Promotoren, den Glucocorticoid-Promotor, den distalen Drosophila-Actin-5C-Promotor, den SV40-Promotor, den Hitzeschock-Protein 65-Promotor, den Hitzeschock-Protein 70-Promotor, die Immunglobulin-Promotoren, den Maus-Polyomvirus-Promotor (Py), Rous Sarcom-Virus (RSV), den Herpes simplex-Virus (HSV)-Promotor, die BK-Virus- und JC-Virus-Promotoren, den Maus-Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor, die Alphavirus-Verbindungsregion, den CMV-Promotor, die Adenovirus-E1- oder VA1RNA-Promotoren, die rRNA-Promotoren, den tRNA-Methionin-Promotor, den CaMV-35S-Promotor, den Nopalin-Synthetase-Promotor, den Tetracyclin-responsiven Promotor und den lac-Promotor ein.
In noch anderen Ausführungsformen der Erfindung können induzierbare Promotoren verwendet werden. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform induzierbare Promotoren, die die Synthese von RNA aus DNA initiieren, umfassend eine Kern-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, und eine funktionell verknüpfte Nucleinsäuresequenz, die die DNA-Bindung eines transkriptionellen Aktivator-Proteins lenkt, und eine funktionell verknüpfte Nucleinsäuresequenz, die die DNA-Bindung eines transkriptionellen Repressor-Proteins lenkt, bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform ist die Nucleinsäuresequenz, die die DNA-Bindung eines transkriptionellen Aktivator-Proteins lenkt, eine Sequenz, die ein Tetracyclin-Repressor/VP16-Transaktivator-Fusionsprotein bindet. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Nucleinsäuresequenz, die die DNA-Bindung eines Transkriptions-Repressorproteins lenkt, eine Sequenz, die ein Lactose-Repressor/Kruppel-Domänen-Fusionsprotein bindet.
Die zweite Schicht umfasst ein autokatalytisches Vektorkonstrukt, das zum Exprimieren von einer oder mehreren heterologen Nucleotidsequenzen und zum Lenken seiner eigenen Replikation in einer Zelle entweder autonom oder als Antwort auf einen oder mehrere Faktoren (d. h. induzierbar ist) in der Lage ist. Das zweite Schicht-Konstrukt ist ein Alphavirus-Vektorkonstrukt, wie oben beschrieben.
Eine breite Vielfalt von Vektorsystemen kann als die erste Schicht des eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems verwendet werden, einschließlich zum Beispiel viraler Vektorkonstrukte, die von DNA-Viren entwickelt wurden, wie jenen, die in den Poxviridae klassifiziert sind, einschließlich zum Beispiel Kanarienpockenvirus oder Vacciniavirus (z. B. Fisher-Hoch et al., PNAS 86: 317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17-21, 1990; US-Patent Nr. 4,603,112 , 4,769,330 und 5,017,487 ; WO 89/1973 ), Papoviridae wie BKV, JCV oder SV40 (z. B. Mulligan et al., Nature 277: 108-114, 1979); Adenoviridae wie Adenovirus (z. B. Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991); Parvoviridae wie Adeno-assoziiertes Virus (z. B. Samulski et al., J. Vir. 63: 3822-3828, 1989; Mendelson et al., Virol. 166: 154-165, 1988; PA 7/222,684), Herpesviridae wie Herpes simplex-Virus (z. B. Kit, Adv. Exp. Med. Biol. 215: 219-236, 1989) und Hepadnaviridae (z. B. HBV) sowie bestimmter RNA-Viren, die durch eine DNA-Zwischenstufe replizieren, wie die Retroviridae (siehe z. B. US-Patent Nr. 4,777,127 , GB 2,200,651 , EP 0,345,242 und WO 91/02805 ; Retroviridae schließen Leukämie-Viren wie MoMLV und Immunschwäche-Viren wie HIV ein, z. B. Poznansky, J. Virol. 65: 532-536, 1991).
Die Replikationskompetenz des autokatalytischen Vektorkonstrukts, das in der zweiten Schicht des eukaryontischen Vektorinitiationssystems enthalten ist, kann durch eine Vielfalt von Tests, die einer Fachperson bekannt sind, gemessen werden, einschließlich zum Beispiel der Ribonuclease-Protektionstests, die Anstiege sowohl von Positivsense- als auch von Negativsense-RNA in transfizierten Zellen im Zeitverlauf in der Anwesenheit eines Inhibitors der zellulären RNA-Synthese wie Dactinomycin messen, und auch der Tests, die die Synthese einer subgenomischen RNA oder die Expression eines heterologen Reportergens in transfizierten Zellen messen.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssysteme geliefert, die einen 5'-Promotor, der zum Initiieren der in vivo-Synthese von Alphavirus-RNA aus cDNA in der Lage ist (d. h. einen DNA-Promotor der RNA-Synthese), gefolgt von einer 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der Lage ist, einer Nucleinsäuresequenz, die funktionell alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine (einschließlich eines veränderten nsP2-Gens, wie oben beschrieben, das, wenn es in ein rekombinantes Alphaviruspartikel funktionell inkorporiert wird, im erwünschten Phänotyp resultiert) codiert, einer Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz, einer 3'-Sequenz, die die Transkriptions-Terminierung/Polyadenylierung steuert, und einer viralen Verbindungsregion verknüpft ist, die funktionell mit einer heterologen Sequenz, die exprimiert werden soll, umfassen. In verschiedenen Ausführungsformen kann die virale Verbindungsregion modifiziert sein, so dass die virale Transkription des subgenomischen Fragments eher erhöht oder reduziert als inaktiviert ist. In anderen Ausführungsformen kann eine zweite virale Verbindungsregion inseriert werden, die der ersten inaktivierten viralen Verbindungsregion folgt, wobei die zweite virale Verbindungsregion entweder aktiv oder modifiziert ist, so dass die virale Transkription des subgenomischen Fragments erhöht oder reduziert ist.
Nach der Transkription des eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems umfasst das resultierende Alphavirus-RNA-Vektor-Replikonmolekül eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription einer Alphavirus-RNA in der Lage ist, eine Nucleotidsequenz, die biologisch aktive Alphavirus-Nichtstrukturproteine codiert, eine virale Verbindungsregion, eine heterologe Nucleotidsequenz, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz und eine Polyadenylat-Sequenz.
Verschiedene Aspekte der Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukte sind oben diskutiert worden, einschließlich der 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription eines Alphavirus in der Lage ist, der Nucleotidsequenz, die Alphavirus-Nichtstrukturproteine codiert, der viralen Verbindungsregion, einschließlich der Verbindungsregionen, die inaktiviert worden sind, so dass die virale Transkription des subgenomischen Fragments verhindert wird, und der Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz. Zusätzlich sind auch modifizierte Verbindungsregionen und Tandem-Verbindungsregionen oben diskutiert worden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssystem von einem Alphavirusvektor wie einem Sindbis-Vektorkonstrukt, das angepasst worden ist, um in einer oder mehreren Zelllinien einer bestimmten eukaryontischen Spezies, insbesondere einer Säugerspezies wie Menschen zu replizieren, abgeleitet. Zum Beispiel können, wenn das Gen, das das rekombinante Protein, das exprimiert werden soll, codiert, von menschlichem Ursprung ist und das Protein für eine menschliche therapeutische Verwendung vorgesehen ist, die Produktion in einer geeigneten menschlichen Zelllinie bevorzugt werden, damit das Protein post-translationell modifiziert wird, wie es erwartet würde, dass es in Menschen erfolgt. Dieser Ansatz kann im weiteren Verstärken der rekombinanten Proteinproduktion nützlich sein (wie unten detaillierter diskutiert). In Anbetracht der Gesamtplastizität eines alphaviralen Genoms aufgrund der Untreue der viralen Replikase können variante Stämme mit einer verstärkten Fähigkeit, eine produktive Infektion mit hohem Titer in ausgewählten eukaryontischen Zellen (z. B. menschlichen, murinen, caninen, felinen usw.) zu etablieren, isoliert werden. Zusätzlich können unter Verwendung dieses Ansatzes auch variante alphavirale Stämme isoliert werden, die in eukaryontischen Zellen eine verstärkte Fähigkeit haben, eine persistente Infektion mit hohem Titer zu etablieren. Alphavirus-Expressionsvektoren können dann aus cDNA-Clonen dieser varianten Stämme gemäß den hierin gelieferten Vorgehensweisen konstruiert werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssystem einen Promotor für die anfängliche alphavirale Vektortranskription, der nur in einem differenzierten Zelltyp transkriptionell aktiv ist. Kurz, es ist gut etabliert, dass eine alphavirale Infektion von Säugerzellen in Kultur, wie jener, die vom Hamster (z. B. Babyhamster-Nierenzellen) oder Huhn (z. B. Hühnerembryofibroblasten) stammen, typischerweise in einer Cytotoxizität resultiert. Daher kann das eukaryontische geschichtete Vektorinitiationssystem, um eine stabil transformierte oder transfizierte Wirtszelllinie zu produzieren, in eine Wirtszelle eingebracht werden, in der der Promotor, der die anfängliche Vektoramplifizierung ermöglicht, ein transkriptionell inaktiver, aber induzierbarer Promotor ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist solch ein Promotor vom Differenzierungsstatus abhängig. In dieser Konfiguration trifft die Aktivierung des Promotors und die folgende Aktivierung des Alphavirus-DNA-Vektors mit der Induktion der Zelldifferenzierung zusammen. Beim Wachstum zu einer bestimmten Zellzahl einer solchen stabil transformierten oder transfizierten Zelllinie wird der geeignete Differenzierungsstimulus geliefert, wodurch die Transkription des Vektorkonstrukts und die amplifizierte Expression des erwünschten Gens und der codierten Polypeptide (des codierten Polypeptids) initiiert werden. Viele solche, vom Differenzierungsstatus abhängigen Promotoren sind Fachleuten bekannt, so wie es auch Zelllinien sind, die induziert werden können, um sich bei Anwendung eines spezifischen Stimulus zu differenzieren. Repräsentative Beispiele schließen die Zelllinien F9 und P19, HL60 und die erythroleukämischen Freund-Zelllinien und HEL ein, die durch Retinsäure, Pferdeserum beziehungsweise DMSO aktiviert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können solche Promotoren durch zwei getrennte Komponenten reguliert werden. Zum Beispiel werden, wie im Beispiel 7 beschrieben, Bindungsstellen für sowohl einen transkriptionellen Aktivators als auch einen transkriptionellen Repressor in einer funktionell abhängigen Weise benachbart zu einem „Kern"-Promotor positioniert. In dieser Konfiguration wird der nicht-induzierte Status durch Blockieren der Fähigkeit des transkriptionellen Aktivators, seine Erkennungsstelle zu finden, bewahrt, während dem transkriptionellen Repressor erlaubt wird, konstitutiv exprimiert und an seine Erkennungsstelle gebunden zu werden. Die Induktion wird durch Blockieren des transkriptionellen Repressors und Entfernen der Transaktivator-Blockierung erlaubt. Zum Beispiel kann ein Tetracyclin-responsives Promotorsystem (Gossen und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5547-5551, 1992) für eine induzierbare Transkription einer Alphavirusvektor-RNA verwendet werden. In diesem System stimuliert die Expression eines Tetracyclin-Repressors und einer HSV-VP16-Transaktivator-Domäne als ein „Fusions" protein (rTA) die in vivo-Transkription der Alphavirusvektor-RNA durch spezifisches Binden an eine Tetracyclin-Operator-Sequenz (tetO), die unmittelbar benachbart zu einem minimalen „Kern"-Promotor (zum Beispiel CMV) liegt. Der Bindungs- und Transaktivierungsvorgang wird durch die Anwesenheit von Tetracyclin reversibel blockiert und kann durch Entfernen von Tetracyclin aus den Kulturmedien „angeschaltet" werden. Da die nicht-induzierten Grundspiegel der Transkription unter den verschiedenen Zelltypen variieren werden, können andere verschiedene minimale Kern-Promotoren (zum Beispiel HSV-tk) mit den Tetracyclin-Operator-Sequenzen verknüpft werden, vorausgesetzt, dass die Transkriptionsstartstelle bekannt ist, um eine Nebeneinanderstellung bei dem oder in der unmittelbaren Nähe des Alphavirus-Vektornucleotid(s) 1 zu ermöglichen.
Der rTA-Transaktivator kann durch eine zusätzliche Expressionskassette, die auch stabil in dieselbe Zelllinie transformiert ist, bereitgestellt werden; und in bestimmten Ausführungsformen kann die rTA-Expressionskassette selbst autoregulatorisch sein. Die Verwendung einer autoregulatorischen rTA-Expressionskassette umgeht potenzielle Toxizitätsprobleme, die mit konstitutiver Expression in hohem Spiegel von rTA durch Verknüpfen der Expression mit einer transkriptionellen Kontrolle durch denselben tetO-verknüpften Promotor, an den rTA selbst bindet, assoziiert sind. Dieser Typ des Systems kreiert einen negativen Rückkopplungs-Zyklus, der sicherstellt, dass sehr wenig rTA in der Anwesenheit von Tetracyclin produziert wird, wird aber hochgradig aktiv, wenn das Tetracyclin entfernt wird. Solch eine autoregulatorische rTA-Expressionskassette wird im Plasmid pTettTAk geliefert (Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522-6526, 1995).
Für eine transkriptionelle Repression kann auch die KRAB-Repressionsdomäne von bestimmten Zinkfinger-Proteinen verwendet werden. Kurz, KRAB (Krüppel-assoziierte Box)-Domänen sind hochkonservierte Sequenzen, die in den aminoterminalen Regionen von mehr als einem Drittel aller Krüppel-Klasse-Cys₂His₂-Zinkfinger-Proteine vorhanden sind. Die Domänen enthalten zwei vorhergesagte amphipathische α-Helices, und es ist gezeigt worden, dass sie als DNA-Bindungs-abhängige transkriptionelle RNA-Polymerase II-Repressoren wirken (zum Beispiel Licht et al., Nature 346: 76-79, 1990). Wie andere Transkriptionsfaktoren sind die aktive Repressionsdomäne und die DNA-Bindungsdomäne verschieden und trennbar. Daher kann die Repressionsdomäne als ein Fusionsprotein für das Targeting mit jedem Sequenz-spezifischen DNA-Bindungsprotein verknüpft werden. Daher kann die DNA-Bindungsprotein-Komponente in einer regulierbaren Weise reversibel von der Bindung abgehalten werden, wodurch das transkriptionelle Silencing „abgeschaltet" wird. Zum Beispiel kann die KRAB-Domäne vom menschlichen Kox1 (Thiesen, New Biol. 2: 363-374, 1990) an das DNA-bindende Lactose(lac)-Repressorprotein fusioniert werden, wodurch ein transkriptioneller Hybrid-Silencer mit reversibler, sequenzspezifischer Bindung an eine lac-Operator-Sequenz, die unmittelbar benachbart zum tet-responsiven Promotor konstruiert wurde, gebildet wird. In dieser Konfiguration wird die konstitutive Expression der lac-Repressor/KRAB-Domänen-Fusion (rKR) in der Bindung an die lac-Operator-Sequenz und der Elimination jeglicher „durchlässiger" Basaltranskription vom nicht-induzierten tet-responsiven Promotor resultieren. Wenn eine Vektorexpression erwünscht wird und Tetracyclin aus dem System entfernt wird, wird IPTG zugefügt, um ein transkriptionelles rKR-vermitteltes Silencing zu verhindern.
Zusätzlich können KRAB-Domänen von anderen Zinkfinger-Proteinen, zum Beispiel ZNF133 (Tommerup et al., Hum. Mol. Genet. 2: 1571-1575, 1993), ZNF91 (Bellefroid et al., EMBO J. 12: 1363-1374, 1993), ZNF2 (Rosati et al., Nucleic Acids Res. 19: 5661-5667, 1991), sowie andere transferierbare Repressor-Domänen, zum Beispiel die Drosophila-en- oder -eve-Gene (Jaynes und O'Farrell, EMBO J. 10: 1427-1433, 1991; Han und Manley, Genes Dev. 7: 491-503, 1993), das menschliche Zinkfinger-Protein YY1 (Shi et al., Cell 67: 377-388, 1991), das Wilms-Tumor-Supressorprotein WTI (Madden et al., Science 253: 1550-1553, 1991), der Schilddrüsenhormon-Rezeptor (Baniahmad et al., EMBO J. 11: 1015-1023, 1992), der Retinsäure-Rezeptor (Baniahmad et al., ebd.), Kid-I (Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4514-4518, 1994), gleichermaßen leicht in den hierin bereitgestellten Gen-Abgabevehikeln verwendet werden. Darüber hinaus kann die lac-Repressor/lac-Operator-Komponente dieses Systems durch jede Zahl von anderen regulierbaren Systemen, die von anderen Quellen stammen, zum Beispiel die Tryptophan- und Maltose-Operons oder GAL4, substituiert werden.
E. Rekombinante Alphaviruspartikel und Herstellung und Verwendung von „leeren" Togavirus-Partikeln oder Togavirus-Partikeln, die nicht-homologe virale RNA enthalten
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung wird die Herstellung von rekombinanten Alphaviruspartikeln, die RNA-Alphavirusvektoren enthalten, die zur Infektion von eukaryontischen Zielzellen in der Lage sind, beschrieben. Kurz, solche rekombinanten Alphaviruspartikel umfassen im Allgemeinen ein oder mehrere Alphavirus-Strukturproteine, eine Lipidhülle und ein RNA-Vektor-Replikon, wie hierin beschrieben.
Verfahren zum Herstellen von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln können leicht zum Beispiel durch Co-Transfektion von komplementierenden Vektoren und defekten Helfer (DH)-Molekülen, die von in vitro-transkribierter RNA oder alternativ Plasmid-DNA stammen, oder durch Co-Infektion mit Virus erreicht werden (siehe Xiong et al., Science 243: 1188-1191, 1989, Bredenbeek et al., J. Virol. 67: 6439-6446, 1993, Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996 und Dubensky et al., WO 95/07994 ).
In anderen Aspekten werden Verfahren zum Herstellen von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln von Alphavirus-abgeleiteten Verpackungs- oder Hersteller-Zelllinien geliefert. Kurz, solche PCL und ihre stabil transformierten Strukturprotein-Expressionskassetten können unter Verwendung von Verfahren, die in WO 95/07994 beschrieben werden, oder unter Verwendung von neuen Verfahren, die in dieser Erfindung beschrieben werden, abgeleitet werden. Zum Beispiel kann die Produktion von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln durch PCL nach dem Einbringen von Alphavirus-basierten Vektormolekülen mit wünschenswerten Eigenschaften in die PCL erreicht werden (siehe Beispiel 6), wobei die Vektoren von in vitro-transkribierter RNA, Plasmid-DNA oder vorher erhaltenen rekombinanten Alphaviruspartikeln abgeleitet werden. In noch einem weiteren Beispiel wird die Produktion von rekombinanten Partikeln von Alphavirus-Hersteller-Zelllinien beschrieben (siehe Beispiel 7).
In anderen Aspekten werden Verfahren zum Produzieren von stabilen Togavirus-Capsidpartikeln mit hohem Titer offenbart, die keine genomisch RNA (d. h. im Wesentlich keine virale RNA enthalten) oder RNA-Vektor-Replikons enthalten. Wie in der vorliegenden Offenbarung verwendet, sollte verstanden werden, dass „im Wesentlichen keine" genomische oder RNA-Vektor-Ribonucleinsäuren sich auf Verhältnisse von mehr als 10:1 und vorzugsweise mehr als 15:1 von ³⁵S-Methionin zu ³H-Uridin-Inkorporierung in die Viruspartikel (im Vergleich zum Wildtyp) bezieht (siehe z. B. Beispiel 8 und 38). Zum Beispiel werden in einem Aspekt leere Capsidpartikel (vorzugsweise mit dem Lipid-Doppelschicht und Glycoprotein-Komplement) aus einem ausgewählten pathogenen Virus aus der Togavirus-Familie (wie einem Alphavirus oder Rubivirus) konstruiert und als Immunogene verwendet, um eine schützende Immunität gegen eine Infektion mit dem Wildtyp-Togavirus zu etablieren. Die leeren viralen Partikel sind eine wünschenswerte immunogene Alternative, weil sie nicht in der Lage sind, zu replizieren und Virus zu produzieren, aber trotzdem in der Lage sind, sowohl zelluläre als auch humorale Immunantworten zu erzeugen. Daher können unter Anwendung der Verfahren, die detaillierter in Beispiel 8 beschrieben werden, leere Capsidpartikel, die von Togaviren stammen (mit oder ohne Lipid-Doppelschicht und Glycoprotein-Komplement), von einer breiten Vielfalt von Togaviren hergestellt werden, einschließlich Alphaviren (wie Sindbis-Virus (z. B. SIN-1 oder Wildtyp-Sindbis-Virus), Venezuelanisches Pferde-Encephalitisvirus, Ross River-Virus, östliches Pferde-Encephalitisvirus, westliches Pferde-Encephalitisvirus und Rubiviren (z. B. Rubella), aber nicht darauf limitiert.
In einem zweiten Aspekt können die Sequenzen von heterologen Viren, die Peptide codieren, die an genomische virale RNA binden, in eine defekte Helfer (DH)-Expressionskassette in die aminoterminale Region des Alphavirus-Capsidgens inseriert werden, von dem die Sequenzen deletiert wurden, die die Region des Proteins codieren, das an die homologe genomische Alphavirus-RNA bindet. Zum Beispiel kann bei BHK-Zellen mit einer Alphavirus-Replikon-RNA, einer DH-RNA, die eine Sequenz enthält, die ein heterologes genomisches Virus-RNA-Bindungspeptid codiert, und einem Replikon, das von demselben heterologen Virus stammt, Elektroporation durchgeführt werden. Daher enthalten die produzierten Alphaviruspartikel eine genomische RNA von einem heterologen Virus und besitzen den Wirtsbereich-Tropismus des Alphavirus. Als ein mögliches Beispiel sind gag-Sequenzen, die Proteine codieren, die für eine Retrovirus-RNA-Bindung nötig sind, in das DH-Expressionskassetten-Konstrukt eingeschlossen. In dieser Konfiguration würden die resultierenden Alphaviruspartikel Retrovirus-Vektor-RNA enthalten.
F. Heterologe Sequenzen
Wie oben angemerkt, kann eine breite Vielfalt von Nucleotidsequenzen durch die Gen-Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung getragen und exprimiert werden. Vorzugsweise sollten die Nucleotidsequenzen eine ausreichende Größe aufweisen, um die Produktion von lebensfähigem Virus zu erlauben. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird die Produktion von jedem durch zum Beispiel Plaque-Test, Luciferase-Test oder β-Galactosidase-Test messbaren Titer von infektiösem Virus durch rekombinante Alphaviruspartikel auf geeigneten empfänglichen Einzelzellschichten oder die Expression von nachweisbaren Spiegeln des heterologen Genprodukts durch RNA- oder DNA-Vektoren als „Produktion von lebensfähigem Virus" angesehen. In bevorzugten Ausführungsformen kann die heterologe Sequenz eine heterologe Sequenz von mindestens etwa 100 Basen, 2 kb, 3,5 kb, 5 kb, 7 kb oder sogar eine heterologe Sequenz von mindestens etwa 8 kb umfassen.
Wie für einen Fachmann in Anbetracht der hierin gelieferten Offenbarung ersichtlich werden wird, ist die Wirksamkeit der rekombinanten Alphaviruspartikel-Verpackung und daher der viralen Titer zu einem gewissen Grad abhängig von der Größe der Sequenz, die verpackt werden soll. Daher können, um die Wirksamkeit der Verpackung und die Produktion von lebensfähigem Virus zu erhöhen, zusätzliche nicht-codierende Sequenzen zum Vektorkonstrukt zugefügt werden. Darüber hinaus kann es in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wünschenswert sein, den viralen Titer zu erhöhen oder zu erniedrigen. Dieser Anstieg oder Abfall kann durch Erhöhen oder Erniedrigen der Größe der heterologen Sequenz und daher der Wirksamkeit der Verpackung erreicht werden.
Wie oben kurz angemerkt, kann eine breite Vielfalt von heterologen Sequenzen in den Gen-Abgabevehikeln, die hierin beschrieben sind, eingeschlossen werden, einschließlich zum Beispiel Sequenzen, die Linderungsmittel wie Lymphokine oder Cytokine, Toxine, Prodrug-konvertierende Enzyme, Antigene, die eine Immunantwort stimulieren, Ribozyme, Proteine für eine therapeutische Anwendung wie Wachstums- oder regulatorische Faktoren und Proteine, die eine Immunantwort unterstützen oder sie inhibieren, sowie Antisense-Sequenzen (oder Sense-Sequenzen für „Antisense-Anwendungen") codieren. Zusätzlich können die hierin gelieferten Gen-Abgabevehikel, wie oben diskutiert, zwei oder mehrere heterologe Sequenzen enthalten (und in bestimmten Ausführungsformen exprimieren).
1. Lymphokine
In einer Ausführungsform der Erfindung codiert die heterologe Sequenz ein Lymphokin. Kurz, Lymphokine wirken, um Immun-Effektorzellen zu proliferieren, aktivieren oder differenzieren. Repräsentative Beispiele von Lymphokinen schließen Gamma-Interferon, Tumornekrose-Faktor, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CSF, CSF-1 und G-CSF ein.
In verwandten Ausführungsformen der Erfindung codiert die heterologe Sequenz einen immunmodulatorischen Co-Faktor. Kurz, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet, bezeichnet „immunmodulatorischer Co-Faktor" Faktoren, die, wenn sie durch eine oder mehrere der Zellen, die in eine Immunantwort involviert sind, hergestellt werden, oder wenn sie von außen zu den Zellen zugefügt werden, bewirken, dass die Immunantwort in der Qualität oder Potenz von jener, die in der Abwesenheit des Co-Faktors aufgetreten sein würde, verschieden ist. Die Qualität oder Potenz einer Antwort kann durch eine Vielfalt von Tests, die einem Fachmann bekannt sind, gemessen werden, einschließlich zum Beispiel in vitro-Tests, die die zelluläre Proliferation messen (z. B. ³H-Thymidin-Aufnahme), und cytotoxischer in vitro-Tests (z. B. die eine ⁵¹Cr-Freisetzung messen) (siehe Warner et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 7: 645-655, 1991).
Repräsentative Beispiele von immunmodulatorischen Co-Faktoren schließen Alpha-Interferon (Finter et al., Drugs 42(5): 749-765, 1991; US-Patent Nr. 4,892,743 ; US-Patent Nr. 4,966,843 ; WO 85/02862 ; Nagata et al., Nature 284: 316-320, 1980; Familletti et al., Methods in Enz. 78: 387-394, 1981: Twu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2046-2050, 1989; Faktor et al., Oncogene 5: 867-872, 1990), Beta-Interferon (Seif et al., J. Virol. 65: 664-671, 1991), Gamma-Interferone (Radford et al., American Society of Hepatology: 2008-2015, 1991; Watanabe et al., PNAS 86: 9456-9460, 1989; Gansbacher et al., Cancer Research 50: 7820-7825, 1990; Maio et al., Can. Immunol. Immunother. 30: 34-42, 1989; US-Patent Nr. 4,762,791 und 4,727,138 ), G-CSF ( US-Patent Nr. 4,999,291 und 4,810,643 ), GM-CSF ( WO 85/04188 ), TNFs (Jayaraman et al., J. Immunology 144: 942-951, 1990), Interleukin-2 (IL-2) (Karupiah et al., J. Immunology 144: 290-298, 1990; Weber et al., J. Exp. Med. 166: 1716-1733, 1987; Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172: 1217-1224, 1990; US-Patent Nr. 4,738,927 ), IL-4 (Tepper et al., Cell 57: 503-512, 1989; Golumbek et al., Science 254: 713-716, 1991; US-Patent Nr. 5,017,691 ), IL-6 (Brakenhof et al., J. Immunol. 139: 4116-4121, 1987; WO 90/06370 ), IL-12, IL-15 (Grabstein et al., Science 264: 965-968, 1994; Genbank-EBML-Zugangsnr. V03099), ICAM-1 (Altman et al., Nature 338: 512-514, 1989), ICAM-2, LFA-1, LFA-3, MHC-Klasse I-Moleküle, MHC-Klasse II-Moleküle, ₂-Mikroglobulin, Chaperone, CD3, B7/BB1, MHC-verknüpfte Transporterproteine oder Analoge davon ein.
Die Wahl, welcher immunmodulatorische Co-Faktor in einem Alphavirus-Vektorkonstrukt eingeschlossen werden soll, kann auf bekannten therapeutischen Wirkungen des Co-Faktors basieren oder experimentell bestimmt werden. Zum Beispiel ist gefunden worden, dass Alpha-Interferon in chronischen Hepatitis B-Infektionen wirksam im Kompensieren eines immunologischen Defizits eines Patienten ist und dadurch die Erholung von der Krankheit unterstützt. Alternativ kann ein geeigneter immunmodulatorischer Co-Faktor experimentell bestimmt werden. Kurz, zuerst werden Blutproben von Patienten mit einer Leberkrankheit genommen. Periphäre Blutlymphocyten (PBLs) werden in vitro mit autologen oder HLA-angepassten Zellen (z. B. EBV-transformierten Zellen) re-stimuliert und mit einem Alphavirus-Vektorkonstrukt, das die Expression eines immunogenen Teils eines Hepatitis-Antigens und des immunmodulatorischen Co-Faktors lenkt, transduziert. Stimulierte PBLs werden als Effektoren in einem CTL-Test mit den HLA-angepassten transduzierten Zellen als Ziele verwendet. Ein Anstieg in der CTL-Antwort über jene, die in demselben Test gesehen wird, der unter Verwendung von HLA-angepassten Stimulator- und Zielzellen durchgeführt wird, die mit einem Vektor transduziert wurden, der das Antigen alleine codiert, weist auf einen nützlichen immunmodulatorischen Co-Faktor hin. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der immunmodulatorische Co-Faktor Gamma-Interferon besonders bevorzugt.
Ein weiteres Beispiel eines immunmodulatorischen Co-Faktors ist der co-stimulierende B7/BB1-Faktor. Kurz, die Aktivierung der vollen funktionellen Aktivität von T-Zellen erfordert zwei Signale. Ein Signal wird durch die Interaktion des Antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptors mit Peptiden geliefert, die an Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex (MHC)-Moleküle gebunden sind, und das zweite Signal, bezeichnet als Co-Stimulation, wird durch Antigen-präsentierende Zellen an die T-Zelle abgegeben. Das zweite Signal wird für eine Interleukin-2 (IL-2)-Produktion durch T-Zellen benötigt und scheint die Interaktion des B7/BB1-Moleküls auf Antigen-präsentierenden Zellen mit CD28 und CTLA-4-Rezeptoren auf T-Lymphocyten zu involvieren (Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721-730, 1991a, und J. Exp. Med. 174: 561-570, 1991). In einer Ausführungsform der Erfindung kann B7/BB1 in Tumorzellen eingebracht werden, um eine Co-Stimulierung von CD8⁺-T-Zellen zu bewirken, sodass die CD8⁺-T-Zellen genug IL-2 produzieren, um zu expandieren und völlig aktiviert zu werden. Diese CD8⁺-T-Zellen können Tumorzellen abtöten, die kein B7 exprimieren, weil die Co-Stimulierung nicht mehr für eine weitere CTL-Funktion benötigt wird. Vektoren, die sowohl den co-stimulierenden B7/BB1-Faktor als auch zum Beispiel ein immunogenes HBV-Kernprotein exprimieren, können unter Anwendung der Verfahren, die hierin beschrieben werden, hergestellt werden. Zellen, die mit diesen Vektoren transduziert wurden, werden wirksamere Antigen- präsentierende Zellen werden. Die HBV-kernspezifische CTL-Antwort wird von den völlig aktivierten CD8⁺-T-Zellen durch den co-stimulierenden Liganden B7/BB1 gesteigert.
2. Toxine
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung codiert die heterologe Sequenz ein Toxin. Kurz, Toxine wirken, um das Wachstum einer Zelle direkt zu inhibieren. Repräsentative Beispiele von Toxinen schließen Ricin (Lamb et al., Eur. J. Biochem. 148: 265-270, 1985), Abrin (Wood et al., Eur. J. Biochem. 198: 723-732, 1991; Evensen et al., J. of Biol. Chem. 266: 6848-6852, 1991; Collins et al., J. of Biol. Chem. 265: 8665-8669, 1990; Chen et al., Fed. of Eur. Biochem Soc. 309: 115-118, 1992), Diphtherie-Toxin (Tweten et al., J. Biol. Chem. 260: 10392-10394, 1985), Cholera-Toxin (Mekalanos et al., Nature 306: 551-557, 1983; Sanchez und Holmgren, PNAS 86: 481-485, 1989), Gelonin (Stirpe et al., J. Biol. Chem. 255: 6947-6953, 1980), Kermesbeeren (Irvin, Pharmac. Ther. 21: 371-387, 1983), antivirales Protein (Barbieri et al., Biochem. J. 203: 55-59, 1982; Irvin et al., Arch. Biochem. & Biophys. 200: 418-425, 1980; Irvin, Arch. Biochem. & Biophys. 169: 522-528, 1975), Tritin, Shigella-Toxin (Calderwood et al., PNAS 84: 4364-4368, 1987; Jackson et al., Microb. Path. 2: 147-153, 1987), Pseudomonas-Exotoxin A (Carroll und Collier, J. Biol. Chem. 262: 8707-8711, 1987), Herpes simplex-Virus-Thymidin-Kinase (HSVTK) (Field et al., J. Gen. Virol. 49: 115-124, 1980) und die E. coli-Guanin-Phosphoribosyltransferase ein.
3. Prodrug-konvertierende Enzyme
In anderen Ausführungsformen der Erfindung codiert die heterologe Sequenz ein Prodrug-konvertierendes Enzym. Kurz, wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angewendet, bezeichnet ein Prodrug-konvertierendes Enzym ein Genprodukt, das eine Verbindung mit einer geringen oder ohne Cytotoxizität in ein toxisches Produkt (das Prodrug) aktiviert. Repräsentative Beispiele von solchen Genprodukten schließen HSVTK und VZVTK (sowie Analoge und Derivate davon) ein, die selektiv bestimmte Purin-Arabinoside und substituierte Pyrimidin-Verbindungen mono-phosphorylieren, wobei sie diese zu cytotoxischen oder cytostatischen Metaboliten konvertieren. Genauer, das Aussetzen der Arzneistoffe Ganciclovir, Acyclovir oder jedes ihrer Analoge (z. B. FIAU, FIAC, DHPG) gegenüber HSVTK phosphoryliert den Arzneistoff in seine entsprechende aktive Nucleotidtriphosphatform.
Repräsentative Beispiele von anderen Prodrug-konvertierenden Enzymen, die auch im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein: E. coli-Guanin-Phosphoribosyltransferase, die Thioxanthin in toxisches Thioxanthin-Monophosphat konvertiert (Besnard et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4139-4141, 1987); alkalische Phosphatase, die inaktive phosphorylierte Verbindungen wie Mitomycinphosphat und Doxorubicinphosphat in toxische dephosphorylierte Verbindungen konvertiert; Pilz- (z. B. Fusarium oxysporum) oder bakterielle Cytosindesaminase, die 5-Fluorcytosin in die toxische Verbindung 5-Fluoruracil konvertiert (Mullen, PNAS 89: 33, 1992); Carboxypeptidase G2, die die Glutaminsäure von Para-N-bi(2-chlorethyl)-aminobenzoylglutaminsäure spaltet, wodurch eine toxischer Benzoesäure-Senf kreiert wird; und Penicillin-V-Amidase, die Phenoxyacetabid-Derivate von Doxorubicin und Melphalan in toxische Verbindungen konvertiert (siehe allgemein Vrudhula et al., J. of Med. Chem. 36(7): 919-923, 1993; Kern et al., Canc. Immun. Immunother. 31(4): 202-206, 1990).
4. Antisense-Sequenzen
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die heterologe Sequenz eine Antisense-Sequenz. Kurz, die Antisense-Sequenzen werden gestaltet, um an RNA-Transkripte zu binden und dadurch die zelluläre Synthese eines bestimmten Proteins zu verhindern oder die Verwendung jener RNA-Sequenz durch die Zelle zu verhindern. Repräsentative Beispiele von solchen Sequenzen schließen Antisense-Thymidinkinase, Antisense-Dihydrofolat-Reduktase (Naher und Dolnick, Arch. Biochem. & Biophys. 253: 214-220, 1987; Bzik et al., PNAS 84: 8360-8364, 1987), Antisense-HER2 (Coussens et al., Science 230: 1132-1139, 1985), Antisense-ABL (Fainstein et al., Oncogene 4: 1477-1481, 1989), Antisense-Myc (Stanton et al., Nature 310: 423-425, 1984) und Antisense-ras sowie Antisense-Sequenzen ein, die irgendeine der Zellzyklus-Signalgebungskomponenten (z. B. Cycline, Cyclinabhängige Kinasen, Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitoren) oder Enzyme im Nucleotid-Biosyntheseweg blockieren. Zusätzlich können in anderen Ausführungsformen der Erfindung Antisense-Sequenzen gegen Interferon und 2-Microglobulin verwendet werden, um die Immunantwort zu verringern.
Zusätzlich kann in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die Antisense-RNA als ein Anti-Tumor-Agens verwendet werden, um eine starke Klasse I-eingeschränkte Antwort zu induzieren. Kurz, es wird angenommen, dass zusätzlich zum Binden der RNA und dadurch Verhindern der Translation einer spezifischen mRNA hohe Spiegel von spezifischen Antisense-Sequenzen die erhöhte Expression von Interferonen (einschließlich Gamma-Interferon) aufgrund der Bildung von großen Mengen von doppelsträngiger RNA induzieren. Die erhöhte Expression von Gamma-Interferon verstärkt wiederum die Expression von MHC-Klasse I-Antigenen. Bevorzugte Antisense-Sequenzen für die Verwendung in dieser Hinsicht schließen Actin-RNA, Myosin-RNA und Histon-RNA ein. Eine Antisense-RNA, die eine Fehlpaarung mit Actin-RNA bildet, wird besonders bevorzugt.
5. Ribozyme
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Gen-Abgabevehikel geliefert, die bei einer Infektion einer Wirtszelle Ribozyme produzieren. Kurz, Ribozyme werden verwendet, um spezifische RNAs zu spalten, und werden so gestaltet, dass sie nur eine spezifische RNA-Sequenz beeinflussen können. Im Allgemeinen ist das Substrat, das die Sequenz eines Ribozyms bindet, zwischen 10 und 20 Nucleotide lang. Die Länge dieser Sequenz ist ausreichend, um eine Hybridisierung mit einer Ziel-RNA und das Abspalten des Ribozyms von der gespaltenen RNA zu erlauben.
Eine breite Vielfalt von Ribozymen kann im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich zum Beispiel der Gruppe I-Intron-Ribozyme (Cech et al., US-Patent Nr. 4,987,071 ); Haarnadel-Ribozyme (Hampel et al., Nucl. Acids Res. 18: 299-304, 1990, US-Patent Nr. 5,254,678 und europäische Patent-Veröffentlichung Nr. 0 360 257 ), Hammerkopf-Ribozyme (Rossi, J. J. et al., Pharmac. Ther. 50: 245-254, 1991; Forster und Symons, Cell 48: 211-220, 1987; Haseloff und Gerlach, Nature 328: 596-600, 1988; Walbot und Bruening, Nature 334: 196, 1988; Haseloff und Gerlach, Nature 334: 585, 1988), Hepatitis delta-Virus-Ribozyme (Perrotta und Been, Biochem. 31: 16, 1992); RNase P-Ribozyme (Takada et al., Cell 35: 849, 1983); sowie anderer Typen von Ribozymen (siehe z. B. WO 95/29241 und WO 95/31551 ). Weitere Beispiele von Ribozymen schließen jene ein, die in den US-Patenten Nr. 5,116,742 , 5,225,337 und 5,246,921 beschrieben sind.
6. Proteine und andere zelluläre Bestandteile
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung kann eine breite Vielfalt von Proteinen oder anderen zellulären Bestandteilen durch die hierin gelieferten Gen-Abgabevehikel getragen und/oder exprimiert werden. Repräsentative Beispiele solcher Proteine schließen natürliche oder veränderte zelluläre Komponenten sowie fremde Proteine oder zelluläre Bestandteile ein, die zum Beispiel in Viren, Bakterien, Parasiten oder einem Pilz gefunden werden.
a. Veränderte zelluläre Komponenten
In einer Ausführungsform werden Gen-Abgabevehikel geliefert, die die Expression einer immunogenen, nicht-tumorigenen, veränderten zellulären Komponente lenken (siehe z. B. WO 93/10814 ). Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „immunogen" veränderte zelluläre Komponenten, die unter den geeigneten Bedingungen zum Bewirken einer Immunantwort in der Lage sind. Diese Antwort muss zellvermittelt sein und kann auch eine humorale Antwort einschließen. Der Begriff „nicht-tumorigen" bezeichnet veränderte zelluläre Komponenten, die keine zelluläre Transformierung bewirken oder Tumorbildung in Nacktmäusen induzieren werden. Der Ausdruck „veränderte zelluläre Komponente" bezeichnet Proteine und andere zelluläre Bestandteile, die entweder damit assoziiert sind, eine Zelle tumorigen zu machen oder mit tumorigenen Zellen im Allgemeinen assoziiert sind, aber nicht dafür erforderlich oder wesentlich sind, eine Zelle tumorigen zu machen.
Kurz, vor der Veränderung können die zellulären Komponenten für das normale Zellwachstum und die Regulierung wesentlich sein und schließen zum Beispiel Proteine, die den intrazellulären Proteinabbau, die transkriptionelle Regulierung, Zellzyklus-Kontrolle und Zell-Zell-Interaktion regulieren, ein. Nach der Veränderung führen die zellulären Komponenten nicht mehr ihre regulatorischen Funktionen aus, und die Zelle kann daher ein unkontrolliertes Wachstum erfahren. Repräsentative Beispiele von veränderten zellulären Komponenten schließen ras*, p53*, Rb*, ein verändertes Protein, das durch das Wilms¹-Tumorgen codiert wird, Ubiquitin*, Mucin*, das Protein, das durch die DCC-, APC- und MCC-Gene codiert wird, das Brustkrebs-Gen BRCA1* sowie Rezeptoren oder Rezeptor-ähnliche Strukturen wie neu, Schilddrüsenhormon-Rezeptor, Blutplättchen-abstammenden Wachstumsfaktor (PDGF)-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptor und den Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF)-Rezeptor ein.
Sobald eine Sequenz, die die veränderte zelluläre Komponente codiert, erhalten worden ist, ist es notwendig, sicherzustellen, dass die Sequenz ein nicht-tumorigenes Protein codiert. Verschiedene Tests, die die Tumorigenität einer bestimmten zellulären Komponente bewerten, sind bekannt und können leicht bewältigt werden. Repräsentative Tests schließen einen Rattenfibroblast-Test, die Tumor-Bildung in Nacktmäusen oder -Ratten, die Koloniebildung in weichem Agar und die Herstellung von transgenen Tieren wie transgenen Mäusen ein.
Die Tumorbildung in Nacktmäusen oder -Ratten ist ein besonders wichtiges und empfindliches Verfahren zum Bestimmen der Tumorigenität einer bestimmten zellulären Komponente. Nacktmäusen fehlt ein funktionelles zelluläres Immunsystem (d. h. sie besitzen keine CTLs), und sie liefern daher ein nützliches in vivo-Modell, in dem das tumorigene Potenzial von Zellen getestet wird. Normale, nicht-tumorigene Zellen zeigen keine unkontrollierten Wachstumseigenschaften, wenn sie in Nacktmäuse infiziert werden. Die transformierten Zellen werden jedoch schnell proliferieren und in Nacktmäusen Tumore bilden. Kurz, in einer Ausführungsform wird ein Alphavirus-Vektorkonstrukt an syngene murine Zellen verabreicht, gefolgt von einer Injektion in Nacktmäuse. Die Mäuse werden für einen Zeitraum von 2 bis 8 Wochen nach der Injektion visuell untersucht, um ein Tumorwachstum festzustellen. Die Mäuse können auch getötet und autopsiert werden, um festzustellen, ob Tumore vorhanden sind. (Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 48: 1531-1533, 1972; Furesz et al., Abnormal Cells, New Products and Risk, Hopps und Petricciani (Hrsg.), Tissue Culture Association, 1985; und Levenbook et al., J. Biol. Std. 13: 135-141, 1985.) Die Tumorigenität kann auch durch Betrachten der Koloniebildung in weichem Agar bewertet werden (Macpherson und Montagnier, Virol. 23: 291-294, 1964). Kurz, eine Eigenschaft von normalen nicht-tumorigenen Zellen ist die „Kontakt-Inhibition" (d. h. die Zellen werden aufhören zu proliferieren, wenn sie benachbarte Zellen berühren). Wenn die Zellen in einem halbfesten Agar-Trägermedium plattiert werden, werden normale Zellen schnell kontakt-inhibiert und hören auf zu proliferieren, wohingegen tumorigene Zellen fortfahren werden, zu proliferieren und Kolonien in weichem Agar zu bilden.
Wenn die veränderte zelluläre Komponente damit assoziiert ist die Zelle tumorigen zu machen, dann ist es notwendig, die veränderte zelluläre Komponente nicht-tumorigen zu machen. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform die Sequenz oder das Gen von Interesse, die/das die veränderte zelluläre Komponente codiert, verkürzt, um das Genprodukt nicht-tumorigen zu machen. Das Gen, das die veränderte zelluläre Komponente codiert, kann auf eine Vielfalt von Größen verkürzt werden, obwohl es bevorzugt wird, so viel der veränderten zellulären Komponente wie möglich zu bewahren. Zusätzlich ist es nötig, dass jede Verkürzung zumindest einige der immunogenen Sequenzen der veränderten zellulären Komponente intakt lässt. Alternativ können mehrere translationelle Stoppcodons stromabwärts der immunogenen Region eingebracht werden. Die Insertion von Stoppcodons wird die Proteinexpression vorzeitig beenden, was so die Expression des transformierenden Teils des Proteins verhindert.
Wie oben angemerkt, muss die veränderte zelluläre Komponente, um eine geeignete Immunantwort herzustellen, auch immunogen sein. Die Immunogenität einer bestimmten Sequenz ist oft schwer vorherzusagen, obwohl T-Zell-Epitope oft eine immunogene amphipathische Alpha-Helix-Komponente besitzen. Im Allgemeinen ist es jedoch bevorzugt, die Immunogenität in einem Test zu bestimmen. Repräsentative Tests schließen einen ELISA, der das Vorliegen von Antikörpern gegen den neu eingebrachten Vektor nachweist, sowie Tests ein, die auf T-Helferzellen testen, wie Gamma-Interferon-Tests, IL-2-Produktionstests und Proliferationstests.
Wie oben angemerkt, können in einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung einige verschiedene veränderte zelluläre Komponenten co-exprimiert werden, um ein allgemeines anti-Krebs-Therapeutikum zu bilden. Im Allgemeinen wird es für einen Fachmann offensichtlich werden, dass eine Vielfalt von Kombinationen gemacht werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen kann dieses Therapeutikum auf einen bestimmten Typ von Krebs gerichtet sein. Zum Beispiel besitzen beinahe alle Colon-Krebsarten Mutationen in den ras-, p53-, CCD-, APC- oder MCC-Genen. Ein Alphavirus-Vektorkonstrukt, das eine Reihe dieser veränderten zellulären Komponenten co-exprimiert, kann an einen Patienten mit Colonkrebs verabreicht werden, um alle möglichen Mutationen zu behandeln. Diese Methodik kann auch verwendet werden, um andere Krebsarten zu behandeln. Daher kann ein Alphavirus-Vektorkonstrukt, das Mucin*, ras*, neu, BRCA1* und p53* co-exprimiert, verwendet werden, um Brustkrebs zu behandeln.
b. Antigene von fremden Organismen oder anderen Pathogenen
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Vektoren geliefert, die die Expression von immunogenen Teilen von Antigenen von fremden Organismen oder anderen Pathogenen lenken. Repräsentative Beispiele von solchen Antigen schließen bakterielle Antigene (z. B. E. coli-, Streptokokken-, Staphylokokken-, Mycobakterium- usw.), Pilz-Antigene, parasitische Antigene und virale Antigene (z. B. Grippevirus, felines Leukämie-Virus („FeLV"), Immunschwächviren wie das feline Immunschwäche-Virus („FIV") oder das menschliche Immunschwäche-Virus („HIV"), Hepatitis A-, B- und C-Virus („HAV", „HBV" beziehungsweise „HCV"), menschliches Papillomvirus („HPV"), Epstein-Barr-Virus („EBV"), Herpes simplex-Virus („HSV"), Hantavirus, TTLV1, HTLVII und Cytomegalie-Virus („CMV") ein. Wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet, bezeichnet ein „immunogener Teil" einen Teil des entsprechenden Antigens, das unter den geeigneten Bedingungen zum Bewirken einer Immunantwort in der Lage ist (d. h. zellvermittelt oder humoral). Die „Teile” können von variabler Größe sein, sind aber vorzugsweise mindestens 9 Aminosäuren lang und können das gesamte Antigen einschließen. Zellvermittelte Immunantworten können durch eine Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex („MHC") Klasse I-Präsentierung, MHC Klasse II-Präsentierung oder beide vermittelt werden.
In einem Aspekt der Erfindung werden Alphavirus-Vektorkonstrukte geliefert, die die Expression von immunogenen Teilen von Hepatitis B-Antigenen lenken (siehe z. B. WO 93/15207 ). Kurz, das Hepatitis B-Genom umfasst zirkuläre DNA von etwa 3,2 Kilobasen Länge und ist gut charakterisiert worden (Tiollais et al., Science 213: 406-411, 1981; Tiollais et al., Nature 317: 489-495, 1985; und Ganem und Varmus, Ann. Rev. Biochem. 56: 651-693, 1987; siehe auch EP 0 278,940 , EP 0 241,021 , WO 88/10301 und US-Patent Nr. 4,696,898 und 5,024,938 . Das Hepatitis B-Virus präsentiert einige verschiedene Antigene, unter anderen einschließlich drei HB-„S"-Antigene (HBsAgs), eines HBc-Antigens (HBcAg), eines HBe-Antigens (HBeAg) und eines HBx-Antigens (HBxAg) (sehe Blum et al., T/G 5(5): 154-158, 1989). Kurz, das HBeAg resultiert aus einer proteolytischen Spaltung einer P22-Vorkern-Zwischenstufe und wird von der Zelle sezerniert. Das HBeAg wird im Serum als eine 17 kD-Protein gefunden. Das HBcAg ist ein Protein von 183 Aminosäuren, und das HBxAg ist ein Protein von 145 bis 154 Aminosäuren, abhängig vom Subtyp.
Die HBsAgs (bezeichnet als „groß", „mittel" und „klein") werden von drei Regionen des Hepatitis B-Genoms codiert: S, prä-S2 und prä-S1. Das große Protein, das eine Länge hat, die von 389 bis 400 Aminosäuren variiert, wird durch die prä-S1-, prä-S2- und S-Regionen codiert und wird in glycosylierten und nicht-glycosylierten Formen gefunden. Das mittlere Protein ist 281 Aminosäuren lang und wird durch die prä-S2- und S-Regionen codiert. Das kleine Protein ist 226 Aminosäuren lang und wird durch die S-Region codiert. Es existiert in zwei Formen, glycosyliert (GP 27^S) und nicht-glycosyliert (P24^S). Wenn jede dieser Regionen getrennt exprimiert wird, wird die prä-S1-Region ein Protein von ungefähr 119 Aminosäuren codieren, die prä-S2-Region wird ein Protein von ungefähr 55 Aminosäuren codieren, und die S-Region wird ein Protein von ungefähr 226 Aminosäuren codieren.
Wie für einen Fachmann ersichtlich sein wird, können verschiedene immunogene Teile der oben beschriebenen S-Antigene kombiniert werden, um eine Immunantwort zu induzieren, wenn sie durch eines der hierin beschriebenen Alphavirus-Vektorkonstrukte verabreicht werden. Zusätzlich können aufgrund der großen immunologischen Variabilität, die in verschiedenen geographischen Regionen für den offenen S-Leserahmen von HBV gefunden wird, bestimmte Kombinationen von Antigenen für eine Verabreichung in bestimmten geographischen Regionen bevorzugt werden.
Durch HBV werden auch pol- („HBV pol"), ORF 5- und ORF 6-Antigene präsentiert. Kurz, der offene Leserahmen der Polymerase von HBV codiert eine reverse Transkriptaseaktivität, die in Virionen und Kern-ähnlichen Partikeln in infizierten Lebern gefunden wird. Das Polymeraseprotein besteht aus mindestens zwei Domänen: der aminoterminalen Domäne, die das Protein codiert, das die reverse Transkription initiiert, und der carboxyterminalen Domäne, die die reverse Transkriptase und RNase H-Aktivität codiert. Immunogene Teile von HBV pol können unter Anwenden der hierin beschriebenen Verfahren, unter Anwenden der unten beschriebenen Alphavirus-Vektorkonstrukte bestimmt und verabreicht werden, um eine Immunantwort in einem warmblütigen Tier herzustellen. In ähnlicher Weise können andere HBV-Antigene wie ORF 5 und ORF 6 (Miller et al., Hepatology 9: 322-327, 1989) unter Anwenden der Alphavirus-Vektorkonstrukte exprimiert werden, wie hierin beschrieben.
Wie oben angemerkt, wird mindestens ein immunogener Teil eines Hepatitis B-Antigens in ein Gen-Abgabevehikel inkorporiert. Der (die) immunogene(n) Teil(e), der (die) in die Gen-Abgabevehikel inkorporiert wird (werden), kann (können) von variierender Länge sein, obwohl es im Allgemeinen bevorzugt wird, dass die Teile mindestens 9 Aminosäuren lang sind, und kann (können) das gesamte Antigen einschließen. Die Immunogenität einer bestimmten Sequenz ist oft schwer vorherzusagen, obwohl die T-Zell-Epitope unter Verwendung von Computer-Algorithmen wie TSITES (MedImmune, Maryland) vorhergesagt werden können, um codierende Regionen auf potenzielle T-Helferstellen und CTL-Stellen zu scannen. Aus dieser Analyse werden Peptide synthetisiert und als Ziele in einem cytotoxischen in vitro-Test verwendet. Andere Tests können jedoch auch verwendet werden, einschließlich zum Beispiel ELISA, der das Vorliegen von Antikörpern gegen den neu eingebrachten Vektor nachweist, sowie Tests, die auf T-Helferzellen testen, wie die Gamma-Interferon-Tests, IL-2-Produktionstests und Proliferationstests.
Immunogene Teile können auch durch andere Verfahren selektiert werden. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass die HLA A2.1-transgene Maus nützlich als ein Modell für die menschliche T-Zellerkennung von viralen Antigenen ist. Kurz, in den viralen Influenza- und Hepatitis-B-Systemen erkennt das murine T-Zell-Rezeptorrepertoir dieselben antigenen Determinanten, die durch menschliche T-Zellen erkannt werden. In beiden Systemen ist die CTL-Antwort, die in der HLA A2.1-transgenen Maus hergestellt wird, gegen nahezu dasselbe Epitop gerichtet wie jene, die durch menschliche CTLs des HLA A2.1-Haplotyps erkannt werden (Vitiello et al., J. Exp. Med. 173: 1007-1015, 1991; Vitiello et al., Abstract of Molecular Biology of Hepatitis B Virus Symposia, 1992). Besonders bevorzugte immunogene Teile für die Inkorporation in Alphavirus-Vektorkonstrukte schließen die HBeAg, HBcAg und HBsAgs ein. Zusätzliche immunogene Portionen des Hepatitis B-Virus können durch Verkürzen der codierenden Sequenz an verschiedenen Stellen erhalten werden, einschließlich zum Beispiel der folgenden Stellen:
Bst UI, Ssp I, Ppu M1, and Msp I (Valenzuela et al., Nature 280: 815-19, 1979; Valenzuela et al., Animal Virus Genetics: ICN/UCLA Symp. Mol. Cell Biol., 1980, B. N. Fields und R. Jaenisch (Hrsg.), S. 57-70, New York: Academic).
Wie oben angemerkt, können mehr als ein immunogener Teil in die Gen-Abgabevehikel inkorporiert werden. Zum Beispiel kann ein Gen-Abgabevehikel (getrennt oder als ein Konstrukt) alle oder immunogene Teile von HBcAg, AbeAg, HBsAgs, HBxAg sowie immunogene Teile von HCV-Antigenen exprimieren.
7. Quellen für heterologe Sequenzen
Sequenzen, die die oben beschriebenen Proteine codieren, können leicht von einer Vielfalt von Quellen, einschließlich zum Beispiel Hinterlegungsstellen wie American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), oder von kommerziellen Quellen wie British Bio-Technology Limited (Cowley, Oxford, England) erhalten werden. Repräsentative Beispiele schließen BBG12 (enthaltend das GM-CSF-Gen, das das reife Protein von 127 Aminosäuren codiert); BBG 6 (das Sequenzen enthält, die Gamma-Interferon codieren); ATCC Nr. 39656 (das Sequenzen enthält, die TNF codieren), ATCC Nr. 20663 (das Sequenzen enthält, die alpha-Interferon codieren), ATCC Nr. 31902, 31902 und 39517 (die Sequenzen enthalten, die beta-Interferon codieren), ATCC Nr. 67024 (das eine Sequenz enthält, die Interleukin-1b codiert); ATCC Nr. 39405, 39452, 39516, 39626 und 39673 (die Sequenzen enthalten, die Interleukin-2 codieren); ATCC Nr. 59399, 59398 und 67326 (die Sequenzen enthalten, die Interleukin-3 codieren); ATCC Nr. 57592 (das Sequenzen enthält, die Interleukin-4 codieren), ATCC Nr. 59394 und 59395 (die Sequenzen enthalten, die Interleukin-5 codieren) und ATCC Nr. 67153 (das Sequenzen enthält, die Interleukin-6 codieren) ein.
Sequenzen, die veränderte zelluläre Komponenten, wie oben beschrieben, codieren, können leicht aus einer Vielfalt von Quellen erhalten werden. Zum Beispiel können Plasmide, die Sequenzen enthalten, die veränderte zelluläre Produkte codieren, von einer Hinterlegungsstelle wie der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) oder von kommerziellen Quellen wie Advanced Biotechnologies (Columbia, Maryland) erhalten werden. Repräsentative Beispiele von Plasmiden, die einige der oben beschriebenen Sequenzen enthalten, schließen die ATCC Nr. 41000 (enthaltend eine G-zu-T-Mutation im 12. Codon von ras) und die ATCC Nr. 41049 (enthaltend eine G-zu-A-Mutation im 12. Codon) ein.
Alternativ können Plasmide, die normale zelluläre Komponenten codieren, auch von Hinterlegungsstellen wie der ATCC (siehe zum Beispiel ATCC Nr. 41001, das eine Sequenz enthält, die das normale ras-Protein codiert; ATCC Nr. 57103, das abl codiert; und ATCC Nr. 59120 oder 59121, die den bcr-Locus codieren) erhalten und mutiert werden, um die veränderte zelluläre Komponente zu bilden. Verfahren zum Mutagenisieren von bestimmten Stellen können leicht unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe Sambrook et al., vorstehend, 15.3 ff.), ausgeführt werden. Insbesondere können Punktmutationen von normalen zellulären Komponenten wie ras leicht durch ortsgerichtete Mutagenese des bestimmten Codons, zum Beispiel der Codons 12, 13 oder 61, erreicht werden.
Sequenzen, die die oben beschriebenen viralen Antigene codieren, können ebenso von einer Vielfalt von Quellen erhalten werden. Zum Beispiel können molekular clonierte Genome, die das Hepatitis B-Virus codieren, von Quellen wie der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) erhalten werden. Zum Beispiel enthält die ATCC Nr. 45020 die gesamte genomische DNA von Hepatitis B (extrahiert von gereinigten Dane-Partikeln) (siehe 3 von Blum et al., TIG 5(5): 154-158, 1989) in der Bam HI-Stelle von pBR322 (Moriarty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2606-2610, 1981).
Alternativ können cDNA-Sequenzen, die die oben beschriebenen heterologen Sequenzen codieren, von Zellen erhalten werden, die die Sequenzen exprimieren oder enthalten. Kurz, in einer Ausführungsform wird die mRNA von einer Zelle, die das Gen von Interesse exprimiert, mit reverser Transkriptase unter Verwendung von Oligonucleotid-dT oder zufälligen Primern revers transkribiert. Die einzelsträngige cDNA kann dann durch PCR (siehe US-Patent Nr. 4,683,202 ; 4,683,195 und 4,800,159 . Siehe auch PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification, Ehrlich (Hrsg.), Stockton Press, 1989) unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern, die komplementär zu Sequenzen auf beiden Seiten der gewünschten Sequenzen sind, amplifiziert werden. Insbesondere wird eine doppelsträngige DNA durch Erhitzen in der Anwesenheit der hitzestabilen Taq-Polymerase, sequenzspezifischer DNA-Primer, von dATP, dCTP, dGTP und dTTP denaturiert. Doppelsträngige DNA wird produziert, wenn die Synthese vollständig ist.
Dieser Zyklus kann viele Male wiederholt werden, was in einer faktoriellen Amplifizierung der gewünschten DNA resultiert.
Sequenzen, die die oben beschriebenen Proteine codieren, können zum Beispiel auch auf einem Applied Biosystems Inc. DNA-Synthesegerät (z. B. APB-DNA-Synthesegerät Modell 392 (Foster City, Ka.)) synthetisiert werden.
G. Alphavirus-Verpackungs-/Hersteller-Zelllinien
In weiteren Aspekten dieser Offenbarung werden Alphavirus-Verpackungs- und Hersteller-Zelllinien offenbart. Insbesondere werden in einem Aspekt der vorliegenden Offenbarung Alphavirus-Verpackungszelllinien offenbart, in denen die viralen Strukturproteine von einem oder mehreren stabil transformierten Expressionsvektoren in trans bereitgestellt werden und zum Einkapseln von transfizierten, transduzierten oder intrazellulär produzierten Vektor-RNA-Transkripten im Cytoplasma und Freisetzen der infektiösen, verpackten Vektorpartikel durch die Zellmembran in der Lage sind. In bevorzugten Aspekten werden die für das Verpacken notwendigen Strukturproteine nur nach Induktion durch das RNA-Vektor-Replikon selbst oder einem anderen bereitgestellten Stimulus in hohen Spiegeln synthetisiert, und die Transkripte, die diese Strukturproteine codieren, sind zur cytoplasmatischen Amplifizierung in einer Weise in der Lage, die ausreichende Expressionsspiegel ermöglichen wird, um jene einer natürlichen viralen Infektion zu imitieren. Darüber hinaus ist in anderen Aspekten die Expression eines selektierbaren Markers funktionell mit der Strukturprotein-Expressionskassette verknüpft. Solch ein verknüpfter selektierbarer Marker ermöglicht eine wirksame Herstellung einer funktionellen, stabil transformierten PCL.
Zum Beispiel können Alphavirus-RNA-Vektor-Replikonmoleküle des erwünschten Phänotyps, die verpackt werden sollen und die selbst zur autokatalytischen Replikation im Zellcytoplasma in der Lage sind, in die Verpackungszellen als in vitro-transkribierte RNA, rekombinante Alphaviruspartikel oder als Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukte eingebracht werden. Die RNA-Vektor-Transkripte replizieren dann zu hohen Spiegeln, stimulieren die Amplifikation des (der) Strukturprotein-Gentranskripts (Gentranskripte) und die folgende Proteinexpression und werden danach durch die viralen Strukturproteine verpackt, was infektiöse Vektorpartikel ergibt. Die intrazelluläre Expression von Alphavirus- Proteinen und/oder Vektor-RNA über bestimmte Spiegel kann in cytotoxischen Wirkungen in den Verpackungs- oder Hersteller-Zelllinien resultieren. Daher kann es in bestimmten Aspekten dieser Offenbarung wünschenswert sein, dass diese Elemente von Virusvarianten abgeleitet werden, die auf eine reduzierte Cytotoxizität ihrer exprimierten Strukturproteine, reduzierte Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese und/oder die Fähigkeit, eine persistierende Infektion zu etablieren, selektiert wurden.
Um die Vektor-Verpackungszelllinien-Leistung und den endgültigen Vektortiter zu optimieren, können aufeinanderfolgende Zyklen des Gentransfers und der Vektor-Verpackung durchgeführt werden. Zum Beispiel können Überstände, die infektiöse, verpackte Vektorpartikel enthalten, die von der Vektortransfektion der Verpackungszelllinien stammen verwendet werden, um eine frische Einzelzellschicht von Alphavirus-Verpackungszellen zu infizieren oder zu „transduzieren". Aufeinanderfolgende Transduktionen mit verpackten Vektorpartikeln und frischen Verpackungszellen können gegenüber einer Nucleinsäure-Transfektion aufgrund ihrer höheren RNA-Transfer-Wirksamkeit in Zellen, der optimierten biologischen Platzierung des Vektors in der Zelle und der Fähigkeit, den Vorgang für die Vektorproduktion von zunehmend größeren Zahlen von Verpackungszellen hochzuschrauben („scale-up"), bevorzugt sein. Dies führt zu einer höheren Expression und einem höheren Titer des verpackten, infektiösen rekombinanten Alphavirusvektors.
In anderen Aspekten kann ein stabil integrierter oder episomal bewahrter DNA-Expressionsvektor verwendet werden, um das Alphavirusvektor-RNA-Molekül in der Zelle zu produzieren. Kurz, solch ein DNA-Expressionsvektor kann in bevorzugten Aspekten konfiguriert werden, um induzierbar zu sein, so dass die Transkription der Alphavirusvektor-RNA nur erfolgt, wenn die Zellen zu einer gewünschten Dichte vermehrt worden sind und danach induziert werden. Sobald er transkribiert ist, bewahrt der Alphavirusvektor die Fähigkeit, selbst autokatalytisch zu replizieren, und löst eine Kaskade von Ereignissen aus, die in einer Produktion von verpackten Vektorpartikeln gipfeln. Dieser Ansatz erlaubt eine fortgesetzte Vektorexpression über ausgedehnte Zeiträume des Kultivierens, weil das integrierte DNA-Vektor-Expressionssystem durch einen Wirkstoff oder einen anderen Selektionsmarker bewahrt wird, und das DNA-System wird, sobald es induziert ist, die unveränderten RNA-Vektor-Replikons, die nicht durch die defekten RNA-Kopien ausverdünnt werden können, konstitutiv exprimieren. Die Produktion von verpacktem Alphavirusvektor mit hohem Titer in größerem Maßstab ist in dieser Alphavirus-„Hersteller-Zelllinie"-Konfiguration möglich, der DNA-basierende Alphavirusvektor wird anfänglich durch Transfektion in die Verpackungszelllinie eingebracht, weil Größenrestriktionen die Verpackung des Expressionsvektors in ein virales Vektorpartikel für die Transduktion verhindern könnten.
H. Arzneimittel
Wie oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung auch Arzneimittel, umfassend die hierin beschriebenen Gen-Abgabevehikel in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünner oder Empfänger. Zum Beispiel können in einer Ausführungsform die RNA- oder DNA-Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung für eine Langzeit-Lagerung und den Transport lyophilisiert werden und können vor der Verabreichung unter Verwendung einer Vielfalt von Substanzen rekonstituiert werden, werden aber vorzugsweise unter Verwendung von Wasser rekonstituiert. In bestimmten Fällen können auch verdünnte Salzlösungen verwendet werden, die das Endpräparat zu einer Isotonie bringen. Zusätzlich kann es vorteilhaft sein, wässrige Lösungen zu verwenden, die Komponenten enthalten, die die Aktivität verstärken oder das rekonstituierte Nucleinsäure-Präparat physikalisch schützen. Solche Komponenten schließen Cytokine wie IL-2, Polykationen wie Protaminsulfat, Lipidpräparate oder andere Komponenten ein. Lyophilisierte oder entwässerte rekombinante Vektoren können mit jedem praktischen Volumen von Wasser oder der oben angemerkten rekonstituierenden Mittel, die eine wesentliche und vorzugsweise vollständige Solubilisierung der lyophilisierten oder entwässerten Probe ermöglichen, rekonstituiert werden.
Rekombinante Alphaviruspartikel oder infektiöses rekombinantes Virus (unten werden beide als Virus bezeichnet) können entweder in rohen oder gereinigten Formen konserviert werden. Um das Virus in einer rohen Form zu produzieren, können die produzierenden Zellen zuerst in einem Bioreaktor oder einer Bestandsflachkultur kultiviert werden, wobei die viralen Partikel von den Zellen in die Kulturmedien freigesetzt werden. Das Virus kann dann in roher Form zuerst durch Zufügen einer Menge eines Präparatpuffers, die ausreicht, um eine wässrige Suspension zu bilden, zu den Kulturmedien, die das rekombinante Virus enthalten, konserviert werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist der Präparatpuffer eine wässrige Lösung, die ein Saccharid, einen strukturellen Zusatz von hohem Molekulargewicht und eine puffernde Komponente in Wasser enthält. Die wässrige Lösung kann auch eine oder mehrere Aminosäuren enthalten.
Das rekombinante Virus kann auch in einer gereinigten Form konserviert werden. Genauer kann das oben beschriebene rohe rekombinante Virus vor der Zugabe des Präparatpuffers durch Leiten desselben durch einen Filter geklärt und dann konzentriert werden, wie durch ein Kreuzfluss-Konzentrierungssystem (Filtron Technology Corp., Nortborough, MA). In einer Ausführungsform wird DNase zum Konzentrat zugefügt, um exogene DNA zu verdauen. Der Verdau wird dann diafiltriert, um überschüssige Medienkomponenten zu entfernen und um das rekombinante Virus in einer wünschenswerteren gepufferten Lösung zu etablieren. Das Diafiltrat wird dann über eine Sephadex S-500-Gelsäule geführt, und ein gereinigtes rekombinantes Virus wird eluiert. Eine ausreichende Menge des Präparatpuffers wird dann zu diesem Eluat zugefügt, um eine erwünschte Endkonzentration der Bestandteile zu erreichen und um das rekombinante Virus minimal zu verdünnen. Die wässrige Suspension kann dann vorzugsweise bei –70°C gelagert oder sofort getrocknet werden. Wie oben kann der Präparatpuffer eine wässrige Lösung sein, die ein Saccharid, einen strukturellen Zusatz von hohem Molekulargewicht und eine puffernde Komponente in Wasser enthält. Die wässrige Lösung kann auch eine oder mehrere Aminosäuren enthalten.
Das rohe rekombinante Virus kann auch durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie gereinigt werden. Kurz, das rohe rekombinante Virus kann zuerst durch Leiten desselben durch einen Filter geklärt werden, gefolgt von dem Laden des Filtrats auf eine Säule, die eine hochgradig sulfonierte Cellulosematrix enthält. Das rekombinante Virus kann dann aus der Säule in gereinigter Form durch Verwenden eines Hochsalzpuffers eluiert und der Hochsalzpuffer durch Überführen des Eluats über eine Molekular-Ausschluss-Säule gegen einen wünschenswerteren Puffer ausgetauscht werden. Eine ausreichende Menge des Präparatpuffers wird dann zum gereinigten rekombinanten Virus zugefügt, wie oben diskutiert, und die wässrige Suspension wird entweder sofort getrocknet oder gelagert, vorzugsweise bei –70°C.
Die wässrige Suspension in roher oder gereinigter Form kann durch Lyophilisierung oder Verdunstung bei Umgebungstemperatur getrocknet werden. Kurz, die Lyophilisierung involviert die Schritte des Abkühlens der wässrigen Suspension unter die Gas-Übergangstemperatur oder unter den eutektischen Temperaturpunkt der wässrigen Suspension und Entfernen des Wassers aus der gekühlten Suspension durch Sublimierung, um ein lyophilisiertes Virus zu bilden. In einer Ausführungsform werden Aliquots des formulierten rekombinanten Virus in eine Edward Refrigerated Chamber (3 Fächer-RC3S-Einheit), die an einen Gefriertrockner (Supermodulyo 12 K) angehängt ist, platziert. Ein Gefriertrocknungsverfahren in mehreren Schritten, wie durch Phillips et al. (Cryobiology 18: 414, 1981) beschrieben, wird verwendet, um das formulierte rekombinante Virus vorzugsweise von einer Temperatur von –40°C bis –45°C zu lyophilisieren. Die resultierende Zusammensetzung enthält weniger als 10 Gewichts-% des lyophilisierten Virus an Wasser. Sobald es lyophilisiert ist, ist das rekombinante Virus stabil und kann bei –20°C bis 25°C gelagert werden, wie unten detaillierter diskutiert.
Im Verdunstungsverfahren wird das Wasser aus der wässrigen Suspension durch Verdunstung bei Umgebungstemperatur entfernt. In einer Ausführungsform wird das Wasser durch Sprühtrocknung entfernt ( EP 520,748 ). Im Sprühtrocknungsvorgehen wird die wässrige Lösung in einen Fluss von vorgeheiztem Gas, normalerweise Luft, abgegeben, wodurch das Wasser schnell aus den Tropfen der Suspension verdunstet. Sprühtrockungs-Apparate sind von einer Reihe von Herstellern (z. B. Drytec, Ltd., Tonbridge, England; Lab-Plant, Ltd., Huddersfield, England) erhältlich. Sobald es entwässert ist, ist das rekombinante Virus stabil und kann bei –20°C bis 25°C gelagert werden. In den hierin beschriebenen Verfahren kann der resultierende Feuchtigkeitsgehalt des getrockneten oder lyophilisierten Virus durch die Verwendung eines Karl-Fischer-Apparats (EM Science Aquastar' V1B-volumetrischer Titrator, Cherry Hill, NJ) oder durch ein gravimetrisches Verfahren bestimmt werden.
Die wässrigen Lösungen, die für das Formulieren verwendet werden, wie vorher beschrieben, setzten sich vorzugsweise aus einem Saccharid, einem strukturellen Zusatz mit hohem Molekulargewicht, einer puffernden Komponente und Wasser zusammen. Die Lösung kann auch eine oder mehrere Aminosäuren einschließen. Die Kombination dieser Komponenten wirkt, um die Aktivität des rekombinanten Virus beim Frieren oder bei der Lyophilisierung oder Trocknung durch Verdunstung zu konservieren. Obwohl ein Saccharid, das verwendet werden kann, Lactose ist, können andere Saccharde ebenso verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Saccharose, Mannit, Glukose, Trehalose, Inosit, Fructose, Maltose oder Galactose. Zusätzlich können Kombinationen von Sacchariden verwendet werden, zum Beispiel Lactose und Mannit oder Saccharose und Mannit. Eine besonders bevorzugte Konzentration von Lactose ist 3–4 Gewichts-%. Vorzugsweise ist die Konzentration des Saccharids im Bereich von 1 bis 12 Gewichts-%.
Der strukturelle Zusatz von hohem Molekulargewicht hilft im Verhindern einer viralen Aggregation durch das Frieren und liefert eine strukturelle Unterstützung im lyophilisierten oder getrockneten Zustand. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden strukturelle Zusätze als von „hohem Molekulargewicht" angesehen, wenn sie mehr als 5000 MG sind. Ein bevorzugter struktureller Zusatz von hohem Molekulargewicht ist menschliches Serumalbumin. Andere Substanzen können jedoch auch verwendet werden, wie Hydroxyethylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Dextran, Cellulose, Gelatine oder Povidon. Eine besonders bevorzugte Konzentration von menschlichem Serumalbumin ist 0,1 Gewichts-%. Vorzugsweise liegt die Konzentration des strukturellen Zusatzes von hohem Molekulargewicht im Bereich von 0,1 bis 10 Gewichts-%.
Die Aminosäuren, wenn sie vorhanden sind, wirken, um die virale Infektiosität beim Abkühlen und Auftauen der wässrigen Suspension weiter zu konservieren. Zusätzlich wirken die Aminosäuren, um die virale Infektiosität weiter während der Sublimierung der gekühlten wässrigen Suspension und während des lyophilisierten Stadiums zu konservieren. Eine bevorzugte Aminosäure ist Arginin, aber andere Aminosäuren wie Lysin, Ornithin, Serin, Glycin, Glutamin, Aspargin, Glutaminsäure oder Asparginsäure können auch verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Arginin-Konzentration in 0,1 Gewichts-%. Vorzugsweise liegt die Aminosäurekonzentration im Bereich von 0,1 bis 10 Gewichts-%.
Die puffernde Komponente wirkt, um die Lösung durch Bewahren eines relativ konstanten pH-Werts zu Puffern. Eine Vielfalt von Puffern kann abhängig vom erwünschten pH-Bereich, vorzugsweise zwischen 7,0 und 7,8, verwendet werden. Geeignete Puffer schließen Phosphatpuffer und Citratpuffer ein. Ein besonders bevorzugter pH-Wert des rekombinanten Viruspräparats ist 7,4, und bevorzugter Puffer ist Tromethamin.
Zusätzlich wird es bevorzugt, dass die wässrige Lösung ein neutrales Salz enthält, das verwendet wird, um das endgültige formulierte rekombinante Alphavirus auf eine geeignete iso-osmotische Salzkonzentration einzustellen. Geeignete neutrale Salze schließen Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Magnesiumchlorid ein. Ein bevorzugtes Salz ist Natriumchlorid.
Wässrige Lösungen, die die erwünschte Konzentration der oben beschriebenen Komponenten enthalten, können als konzentrierte Bestandslösungen hergestellt werden.
Es wird für Fachleute angesichts der hierin bereitgestellten Offenbarung offensichtlich werden, dass es bevorzugt werden kann, bestimmte Saccharide in der wässrigen Lösung zu verwenden, wenn das lyophilisierte Virus für eine Lagerung bei Raumtemperatur vorgesehen ist. Genauer wird es bevorzugt, Disaccharide wie Lactose oder Trehalose zu verwenden, insbesondere für eine Lagerung bei Raumtemperatur.
Die lyophilisierten oder entwässerten Viren der gegenständlichen Erfindung können unter Verwendung einer Vielfalt von Substanzen rekonstituiert werden, werden aber vorzugsweise unter Verwendung von Wasser rekonstituiert. In bestimmten Fällen können auch verdünnte Salzlösungen, die das Endpräparat auf Isotonie bringen, verwendet werden. Zusätzlich kann es vorteilhaft sein, wässrige Lösungen zu verwenden, die Komponenten enthalten, von denen bekannt ist, dass sie die Aktivität des rekonstituierten Virus verstärken. Solche Komponenten schließen Cytokine wie IL-2, Polykationen wie Protaminsulfat oder andere Komponenten ein, die die Transduktions-Wirksamkeit des rekonstituierten Virus verstärken. Das lyophilisierte oder entwässerte rekombinante Virus kann mit jedem zweckmäßigen Volumen von Wasser oder des oben erwähnten rekonstituierenden Mittels rekonstituiert werden, das eine wesentliche und vorzugsweise völlige Solubilisierung der lyophilisierten oder entwässerten Probe erlaubt.
1. Verfahren zum Verwenden der Gen-Abgabevehikel
Hierin werden auch Verfahren für das Abgeben einer ausgewählten heterologen Sequenz an einen Vertebraten (z. B. einen Säuger wie einen Menschen oder ein anderes warmblütiges Tier wie ein Pferd, Rind, Schwein, Schaf, einen Hund, eine Katze, Ratte oder eine Maus) oder ein Insekt offenbart, umfassend den Schritt des Verabreichens eines Gen-Abgabevehikels, wie hierin beschrieben, das zum Exprimieren der ausgewählten heterologen Sequenz in der Lage ist, an einen Vertebraten oder ein Insekt. Solche Gen-Abgabevehikel können entweder direkt (z. B. intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, subcutan, oral, rektal, intraoculär, intranasal) oder durch verschiedene physikalische Verfahren wie Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1989), direkte DNA-Injektion (Fung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 353-357, 1983; Seeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5849-5852; Acsadi et al., Nature 352: 815-818, 1991); Mikroprojektil-Bombardierung (Williams et al., PNAS 88: 2726-2730, 1991); Liposomen von einigen Typen (siehe z. B. Wang et al., PNAS 84: 7851-7855, 1987), CaPO₄ (Dubensky et al., PNAS 81: 7529-7533, 1984); DNA-Liganden (Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989); Verabreichung von Nucleinsäuren alleine ( WO 90/11092 ); oder Verabreichung von DNA, die mit einem abgetöteten Adenovirus verknüpft ist (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992); durch Polykationen-Verbindungen wie Polylysin, unter Verwendung von rezeptorspezifischen Liganden; sowie mit Psoralen-inaktivierten Viren wie Sendai- oder Adenovirus verabreicht werden. Zusätzlich können die Gen-Abgabevehikel entweder direkt (d. h. in vivo) oder an Zellen verabreicht werden, die entfernt (ex vivo) und danach zurückgegeben worden sind.
Wie oben detaillierter diskutiert, können die Gen-Abgabevehikel an einen Vertebraten oder ein Insekt für eine breite Vielfalt von therapeutischen und/oder anderen produktiven Zwecken verabreicht werden, einschließlich zum Beispiel zum Zweck des Stimulierens einer spezifischen Immunantwort; des Inhibierens der Interaktion eines Mittels mit einem Wirtszellrezeptor; um ein toxisches Linderungsmittel zu exprimieren, einschließlich zum Beispiel bedingt toxischer Linderungsmittel; um das Immunsystem immunologisch zu regulieren; um die Zellteilung zu verhindern, um Marker zu exprimieren, für eine Gen-Ersatztherapie, um die Wundheilung zu fördern und/oder um ein rekombinantes Protein zu produzieren. Diese und andere Verwendungen werden unten detaillierter diskutiert.
1. Immunstimulation
In einem Aspekt der vorliegenden Offenbarung werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Verabreichen eines Gen-Abgabevehikels offenbart, das zum Verhindern, Inhibieren, Stabilisieren oder Umkehren von infektiösen, krebsartigen, Autoimmun- oder Immunkrankheiten in der Lage ist. Repräsentative Beispiele von solchen Krankheiten schließen virale Infektionen wie HIV, HBV, HCV, HTLV 1, HTLV II, CMV, EBV und HPV, Melanome, Diabetes, Transplantat-Abstoßungskrankheit, Alzheimer-Krankheit und Herzkrankheit ein. Genauer werden in einem Aspekt der vorliegenden Offenbarung Zusammensetzungen und Verfahren zum Stimulieren einer Immunantwort (entweder humoral oder zellvermittelt) gegen ein pathogenes Agens geliefert, so dass das pathogene Agens entweder abgetötet oder inhibiert wird. Repräsentative Beispiele von pathogenen Agenzien schließen Bakterien, Pilze, Parasiten, Viren und Krebszellen ein.
In einem Aspekt ist das pathogene Agens ein Virus, und Verfahren zum Stimulieren einer spezifischen Immunantwort und zum Inhibieren der viralen Ausbreitung durch Verwenden eines Gen-Abgabevehikels werden offenbart, das die Expression eines Antigens oder einer modifizierten Form davon an empfängliche Zielzellen lenkt, die entweder (1) zum Initiieren einer Immunantwort auf das virale Antigen oder (2) zum Verhindern der viralen Ausbreitung durch Besetzen von zellulären Rezeptoren, die für virale Interaktionen benötigt werden, in der Lage sind. Die Expression des Vektornucleinsäure-codierten Proteins kann transient oder mit der Zeit stabil sein. Wo eine Immunantwort auf ein pathogenes Antigen stimuliert werden soll, ist das Gen-Abgabevehikel vorzugsweise gestaltet, um eine modifizierte Form des Antigens zu exprimieren, die eine Immunantwort stimulieren wird und die eine reduzierte Pathogenität im Verhältnis zum natürlichen Antigen hat. Diese Immunantwort wird erreicht, wenn Zellen die Antigene in der korrekten Weise präsentieren, d. h. im Zusammenhang mit den MHC-Klasse I- und/oder II-Molekülen zusammen mit Hilfsmolekülen wie CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1 oder Analogen davon (z. B. Altmann et al., Nature 338: 512, 1989). Es wird erwartet, dass Zellen, die mit den Gen-Abgabevehikeln infiziert sind, dies wirksam zu tun, weil sie die echte virale Infektion eng nachahmen und weil sie: (a) in der Lage sind, nicht-replizierende Zellen zu infizieren, (b) nicht in das Wirtszellgenom integrieren, (c) nicht mit irgendwelchen lebensbedrohlichen Krankheiten assoziiert sind und (d) hohe Spiegel des heterologen Proteins exprimieren. Aufgrund dieser Unterschiede können die Gen-Abgabevehikel leicht als sichere virale Vektoren angesehen werden, die an gesunden Individuen für eine Impfstoff-Verwendung verwendet werden können.
Dieser Aspekt der Offenbarung hat einen weiteren Vorteil gegenüber anderen Systemen, von denen erwartet werden könnte, dass sie in einer ähnlichen Weise wirken, nämlich insofern, dass die Präsentator-Zellen vollständig lebensfähig und gesund sind und im Vergleich zu heterologen Genen niedrige Spiegel der viralen Antigene exprimiert werden. Dies stellt einen deutlichen Vorteil dar, da die exprimierten antigenen Epitope durch selektives Clonieren von Sub-Fragmenten des Gens für das Antigen in das rekombinante Alphavirus verändert werden können, was zu Antworten gegen immunogene Epitope führt, die anderweitig durch immundominante Epitope überschattet sein können. Solche ein Ansatz kann auf die Expression eines Peptids, das mehrere Epitope hat, ausgedehnt werden, wobei eines oder mehrere der Epitope von anderen Proteinen stammen. Weiterhin erlaubt dieser Aspekt der Offenbarung eine wirksame Stimulierung von cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL), die gegen antigene Epitope und Peptid-Fragmente von Antigenen gerichtet sind, die durch Sub-Fragmente von Genen codiert werden, durch intrazelluläre Synthese und Assoziation dieser Peptidfragmente mit den MHC-Klasse I-Molekülen. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um wichtige immundominante Epitope für eine CTL-Induktion zu kartieren.
Eine Immunantwort kann auch durch Transferieren des Gens für den spezifischen T-Zellrezeptor, der das Antigen von Interesse erkennt (wenn nötig im Zusammenhang mit einem geeigneten MHC-Molekül), für ein Immunglobulin, das das Antigen von Interesse erkennt, oder für ein Hybrid der zwei, das eine CTL-Antwort in der Abwesenheit des MHC-Zusammenhangs bereitstellt, an eine geeigneten Immunzelle (wie einen T-Lymphocyten) erreicht werden. Daher können die Gen-Abgabevehikel-Zellen als ein Immunstimulans, Immunmodulator oder Impfstoff verwendet werden.
In einem anderen Aspekt dieser Offenbarung werden Verfahren zum Produzieren von Inhibitor-Linderungsmitteln offenbart, worin die Gen-Abgabevehikel defekte interferierende virale Strukturproteine, die eine virale Zusammenlagerung inhibieren, abgeben und exprimieren. Solche Gen-Abgabevehikel können defekte gag-, pol-, env- oder andere virale Partikelproteine oder Peptide codieren, und diese würden in einer dominanten Weise die Zusammenlagerung von viralen Partikeln inhibieren. Dies erfolgt, weil die Interaktion von normalen Untereinheiten des viralen Partikels durch die Interaktion mit den defekten Untereinheiten gestört ist.
In einem anderen Aspekt dieser Offenbarung werden Verfahren für die Expression der inhibierenden Peptide oder Proteine, die spezifisch für eine virale Protease sind, offenbart. Kurz, die virale Protease spaltet die viralen gag- und gag/pol-Proteine in eine Reihe von kleineren Peptiden. Ein Versagen dieser Spaltung führt in allen Fällen zu einer vollständigen Inhibition der Produktion von infektiösen retroviralen Partikeln. Als ein Beispiel ist bekannt, dass die HIV-Protease eine Aspartyl-Protease ist, und von diesen ist bekannt, dass sie durch Peptide inhibiert werden, die aus Aminosäuren vom Protein oder von Analogen gemacht sind. Gen-Abgabevehikel, die HIV inhibieren sollen, werden eine oder mehrere fusionierte Kopien von solchen Peptid-Inhibitoren exprimieren.
Ein anderer Aspekt involviert die Abgabe von Suppressor-Genen, die, wenn sie in einem Zelltyp deletiert, mutiert oder nicht exprimiert werden, zu einer Tumorentwicklung in jenem Zelltyp führen. Das Wiedereinbringen des deletierten Gens durch ein Gen-Abgabevehikel führt zur Rückbildung des Tumor-Phänotyps in diesen Zellen. Beispiele von solchen Krebsarten sind das Retinoblastom und der Wilms-Tumor. Da eine Malignität als eine Inhibition der zellulären terminalen Differenzierung im Vergleich zum Zellwachstum angesehen werden kann, sollten die Alphavirus-Vektorabgabe und Expression von Genprodukten, die zur Differenzierung eines Tumors führen, im Allgemeinen auch zu einer Rückbildung führen.
In noch einem anderen Aspekt liefert das Gen-Abgabevehikel eine therapeutische Wirkung durch Transkribieren eines Ribozyms (eines RNA-Enzyms) (Haseloff und Gerlach, Nature 334: 585, 1989), das RNA-Moleküle, die mit einer pathogenen Funktion korrespondieren, spalten und daher inaktivieren wird. Da Ribozyme durch Erkennen einer spezifischen Sequenz in der Ziel-RNA wirken und diese Sequenz normalerweise 12 bis 17 bp ist, erlaubt dies eine spezifisches Erkennen einer bestimmten RNA-Spezies wie einer RNA oder eines retroviralen Genoms. Eine zusätzliche Spezifität kann in manchen Fällen dadurch erreicht werden, dass man dies zu einem bedingt toxischen Linderungsmittel macht (siehe unten).
Ein Weg des Erhöhens der Wirksamkeit von inhibitorischen Linderungsmitteln ist es, virale inhibitorische Gene im Zusammenhang mit der Expression von Genen, die die Wahrscheinlichkeit einer Infektion der resistenten Zelle durch das in Frage kommende Virus erhöhen, zu exprimieren. Das Ergebnis ist ein nicht-produktives „Sackgassen"-Ereignis, das um die produktiven Infektionsereignisse konkurrieren würde. Im spezifischen Fall von HIV können die Gen-Abgabevehikel abgegeben werden, die eine HIV-Replikation inhibieren (durch Exprimieren von Antisense-tat usw., wie oben beschrieben) und auch Proteine überexprimieren, die für die Infektion benötigt werden, wie CD4. Auf diese Weise wirkt eine relativ kleine Zahl von Vektor-infizierten, HIV-resistenten Zellen als ein „Ausguss" oder ein „Magnet" für mehrere nicht-produktive Fusionsereignisse mit freiem Virus oder viral infizierten Zellen.
2. Blockierungsmittel
Viele infektiöse Krankheiten, Krebsarten, Autoimmunkrankheiten und andere Krankheiten involvieren die Interaktion von viralen Partikeln mit Zellen, von Zellen mit Zellen oder von Zellen mit Faktoren, die durch sich selbst oder andere Zellen produziert werden. In viralen Infektionen treten Viren üblicherweise durch Rezeptoren auf der Oberfläche von empfänglichen Zellen in die Zellen ein. In Krebsarten oder anderen proliferativen Zuständen (z. B. Restenose) können Zellen unpassend oder gar nicht auf Signale von anderen Zellen oder Faktoren antworten, oder spezifische Faktoren können mutiert, überexprimiert oder unterexprimiert werden, was im Verlust einer passenden Zellzyklussteuerung resultiert. In einer Autoimmunkrankheit gibt es eine unpassende Erkennung von „Eigen"-Markern. In der vorliegenden Offenbarung können solche Interaktionen durch in vivo-Produzieren eines Analogs zu einem der Partner in einer Interaktion blockiert werden. Alternativ kann die Zellzyklussteuerung durch Verhindern des Übergangs von einer Phase in eine andere (z. B. G1- zu S-Phase) unter Verwendung eines blockierenden Faktors, der fehlt oder unterexprimiert wird, wiederhergestellt werden. Diese Blockierungsaktion kann intrazellulär, auf der Zellmembran oder extrazellulär erfolgen, und die Wirkung eines Alphavirusvektors, der ein Gen für ein blockierendes Agens trägt, kann entweder vom Inneren einer empfänglichen Zelle oder durch , Sezernieren einer Version des blockierenden Proteins vermittelt werden, um die pathogene Interaktion lokal zu blockieren.
Im Fall von HIV sind die zwei Agentien der Interaktion das gp120/gp41-Hüllprotein und das CD4-Rezeptormolekül. Daher würde ein geeigneter Blocker ein Gen-Abgabevehikel sein, das entweder ein HIV-env-Analog, das den HIV-Eintritt blockiert, ohne pathogene Wirkungen zu verursachen, oder ein CD4-Rezeptoranalog exprimiert. Das CD4-Analog würde sezerniert werden und würde wirken, um benachbarte Zellen zu schützen, während das gp120/gp41 sezerniert oder nur intrazellulär produziert wird, um nur die Vektor-enthaltenden Zellen zu schützen. Es kann vorteilhaft sein, menschliche schwere Immunglobulin-Ketten oder andere Komponenten zu CD4 hinzuzufügen, um die Stabilität oder Komplement-Lyse zu verstärken. Die Verabreichung eines Gen-Abgabevehikels, das solch ein lösliches Hybrid-CD4 codiert, an einen Wirt resultiert in einem kontinuierlichen Angebot eines stabilen Hybridmoleküls. Die Wirksamkeit der Behandlung kann durch Messen der üblichen Indikatoren des Krankheitsfortschreitens, einschließlich des Antikörperspiegels, der viralen Antigenproduktion, der infektiösen HIV-Spiegel oder der Spiegel von nicht-spezifischen Infektionen getestet werden.
Im Fall von unkontrollierten proliferativen Zuständen wie Krebs oder Restenose kann das Zellzyklus-Fortschreiten durch die Expression einer Reihe von verschiedenen Faktoren, die die Signalgebung durch Cycline oder Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) beeinflussen, gestoppt werden. Zum Beispiel regulieren die Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitoren p16, p21 und p27 alle eine Cyclin:CDK-vermittelte Zellzyklus-Signalgebung. Eine Überexpression dieser Faktoren in einer Zelle durch ein Gen-Abgabevehikel resultiert in einer cytostatischen Suppression der Zellproliferation. Andere Faktoren, die therapeutisch verwendet werden können, wie blockierende Mittel oder Ziele, um die Zellproliferation zu zerstören, schließen zum Beispiel Wildtyp- oder mutiertes Rb, p53, Myc, Fos, Jun, PCNA, GAX, lentivirales vpr und p15 ein. In verwandten Aspekten können cardiovaskuläre Krankheiten wie Restenose oder Atherosklerose mit Vektoren behandelt oder verhindert werden, die Produkte exprimieren, die eine Re-Endothelialisierung oder vaskuläre Umgestaltung fördern (z. B. VEGF, TFPI, SOD).
3. Expression von Linderungsmitteln
Techniken, die ähnlich zu jenen sind, die oben beschrieben wurden, können verwendet werden, um Gen-Abgabevehikel zu produzieren, die die Expression eines Mittels (oder „Linderungsmittels") lenken, das zum Inhibieren einer Funktion eines pathogenen Agens oder Gens in der Lage ist. In der vorliegenden Erfindung bedeutet „zum Inhibieren einer Funktion in der Lage sein", dass das Linderungsmittel entweder direkt die Funktion inhibiert oder dies indirekt tut, zum Beispiel durch Konvertieren eines Agens, das in der Zelle vorhanden ist, von einem, das normalerweise eine Funktion des pathogenen Agens nicht inhibieren würde, zu einem, das dies tut. Beispiele von solchen Funktionen für virale Krankheiten schließen Adsorption, Replikation, Genexpression, Zusammenlagerung und Austreten des Virus aus infizierten Zellen ein. Beispiele von solchen Funktionen für eine krebsartige Zelle, einen Krebs-fördernden Wachstumsfaktor oder einen unkontrollierten proliferativen Zustand (z. B. eine Restenose) schließen Lebensfähigkeit, Zellreplikation, veränderte Anfälligkeit gegenüber externen Signalen (z. B. Kontakt-Inhibition) und Fehlen einer Produktion oder Produktion von mutierten Formen von anti-oncogenen Proteinen ein.
a. Inhibitor-Linderungsmittel
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung lenkt das Gen-Abgabevehikel die Expression eines Gens, das mit einer Funktion eines pathogenen Agens interferieren kann, zum Beispiel in viralen oder malignen Krankheiten. Eine solche Expression kann entweder im Wesentlichen kontinuierlich oder als Antwort auf das Vorliegen eines anderen Agens, das entweder mit dem pathogenen Zustand oder mit einem spezifischen Zelltyp assoziiert ist (ein „identifizierendes Agens"), in der Zelle sein. Zusätzlich kann die Vektorabgabe durch Lenken des Vektoreintritts spezifisch auf den erwünschten Zelltyp (zum Beispiel eine viral infizierte oder maligne Zelle) gesteuert werden, wie oben diskutiert.
Ein Verfahren der Verabreichung ist Leukophorese, in der etwa 20% der PBLs eines Individuums zu irgendeinem Zeitpunkt entfernt und in vitro manipuliert werden. So können ungefähr 2 × 10⁹ Zellen behandelt und ersetzt werden. Wiederholte Behandlungen können auch durchgeführt werden. Alternativ kann Knochenmark behandelt und ihm erlaubt werden, die Wirkung zu amplifizieren, wie oben beschrieben. Zusätzlich können Verpackungszelllinien, die einen Vektor produzieren, direkt in ein Subjekt injiziert werden, was eine kontinuierliche Produktion von rekombinanten Virionen erlaubt.
In einer Ausführungsform können Gen-Abgabevehikel, die RNA exprimieren, die komplementär zu pathogenen Schlüssel-Gentranskripten sind (zum Beispiel ein virales Genprodukt oder ein aktiviertes zelluläres Oncogen), verwendet werden, um die Translation jenes Transkripts in ein Protein zu inhibieren, wie die Inhibition der Translation des HIV-tat-Proteins. Da die Expression dieses Proteins für die virale Replikation wesentlich ist, würden Zellen, die das Gen-Abgabevehikel enthalten, resistent gegen eine HIV-Replikation sein.
In einer zweiten Ausführungsform, wo das pathogene Agens ein einzelsträngiges Virus ist, das ein Verpackungssignal aufweist, wird RNA, die komplementär zum viralen Verpackungssignal ist (z. B. einem HIV-Verpackungssignal, wenn das Linderungsmittel gegen HIV gerichtet ist), exprimiert, so dass die Assoziation von diesen Molekülen mit dem viralen Verpackungssignal im Fall von Retroviren die Stammschleifen-Bildung oder tRNA-Primerbindung, die für eine korrekte Verkapselung oder Replikation des Alphavirus-RNA-Genoms benötigt wird, inhibieren wird.
In einer dritten Ausführungsform kann ein Gen-Abgabevehikel eingebracht werden, das ein Linderungsmittel, das zum selektiven Inhibieren der Expression eines pathogenen Gens in der Lage ist, oder ein Linderungsmittel exprimiert, das zum Inhibieren der Aktivität eines Proteins, das durch das pathogene Agens produziert wird, in der Lage ist. Im Fall von HIV ist ein Beispiel ein mutiertes tat-Protein, dem die Fähigkeit fehlt, die Expression der HIV-LTR zu transaktivieren, und das (in einer transdominanten Weise) mit dem normalen Funktionieren des tat-Proteins interferiert. Solch eine Mutante ist für das HTLV II-tat-Protein identifiziert worden ("XII Leu⁵"-Mutante; siehe Wachsman et al., Science 235: 674, 1987). Ein mutiertes Transrepressor-tat sollte die Replikation soweit inhibieren, wie es für einen analogen mutierten Repressor in HSV-1 gezeigt worden ist (Friedmann et al., Nature 335: 452, 1988).
Auf solch ein transkriptionelles Repressorprotein kann in Gewebekultur unter Verwendung jedes viral-spezifischen transkriptionellen Promotors selektiert werden, dessen Expression durch ein virusspezifisches, transaktivierendes Protein stimuliert wird (wie oben beschrieben). Im spezifischen Fall von HIV wird eine Zelllinie, die das HIV-tat-Protein und das HSVTK-Gen, das durch den HIV-Promotor gelenkt wird, exprimiert, in der Anwesenheit von ACV sterben. Wenn jedoch eine Reihe von mutierten tat-Genen in das System eingebracht wird, wird eine Mutante mit den geeigneten Eigenschaften (d. h. welche die Transkription des HIV-Promotors in der Anwesenheit von Wildtyp-tat unterdrückt) wachsen und selektiert werden. Das mutierte Gen kann dann wieder von diesen Zellen isoliert werden. Eine Zelllinie, die mehrere Kopien des bedingt letalen Vektors/tat-Systems enthält, kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass überlebende Zellclone nicht durch endogene Mutationen in diesen Genen verursacht werden. Eine Batterie von zufällig mutagenisierten tat-Genen wird dann unter Verwendung eines „rettungsfähigen" Alphavirusvektors (d. h. eines, der das mutierte tat-Protein exprimiert und einen bakteriellen Ursprung der Replikation und einen Wirkstoff-Resistenzmarker für das Wachstum und die Selektion in Bakterien enthält) in diese Zellen eingebracht. Dies ermöglicht eine große Zahl von zufälligen Mutationen, die bewertet werden sollen, und erlaubt ein leichtes nachfolgendes molekulares Clonieren der erwünschten mutierten Zelllinie. Diese Vorgehensweise kann verwendet werden, um Mutationen in einer Vielfalt von viralen transkriptionellen Aktivator-/viralen Promotorsystemen für potenzielle antivirale Therapien zu identifizieren und anzuwenden.
b. Bedingte toxische Linderungsmittel
Ein anderer Ansatz für das Inhibieren eines pathogenen Agens ist, ein Linderungsmittel zu exprimieren, das für die Zelle, die den pathogenen Zustand exprimiert, toxisch ist. In diesem Fall sollte die Expression des Linderungsmittel vom Gen-Abgabevehikel durch die Anwesenheit einer Einheit limitiert sein, die mit dem pathogenen Agens assoziiert ist, wie einer spezifischen viralen RNA-Sequenz, die den pathogenen Zustand identifiziert, um die Zerstörung von nicht-pathogenen Zellen zu verhindern.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens kann ein Gen-Abgabevehikel verwendet werden, um ein toxisches Gen (wie oben diskutiert) von einem zellspezifischen responsiven Vektor zu exprimieren. In dieser Weise werden vorzugsweise schnell replizierende Zellen, die die RNA-Sequenzen enthalten, die zum Aktivieren der zellspezifischen responsiven Vektoren in der Lage sind, durch das cytotoxische Agens, das durch das Gen-Abgabevehikel produziert wird, zerstört.
In einer ähnlichen Weise zur vorhergehenden Ausführungsform kann das Gen-Abgabevehikel ein Gen für die Phosphorylierung, Phosphoribosylierung, Ribosylierung oder einen anderen Metabolismus eines Purin- oder Pyrimidin-basierten Arzneistoffes tragen. Dieses Gen muss in Säugerzellen kein Äquivalent haben und könnte von Organismen wie einem Virus, Bakterium, Pilz oder einem Protozoon stammen. Ein Beispiel davon würde das E. coli-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Genprodukt sein, das in der Anwesenheit von Thioxanthin letal ist (siehe Besnard et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4139-4141, 1987). Bedingt. letale Genprodukte dieses Typs (oben auch als „Prodrug-konvertierende Enzyme" bezeichnet) haben eine Anwendung in vielen derzeit bekannten Purin- oder Pyrimidin-basierten Antikrebs-Arzneistoffen, die oft eine intrazelluläre Ribosylierung oder Phosphorylierung benötigen, um wirksame cytotoxische Agenzien zu werden. Das bedingt letale Genprodukt könnte auch einen nicht-toxischen Arzneistoff metabolisieren, der kein Purin- oder Pyrimidin-Analog zu einer cytotoxischen Form ist (siehe Searle et al., Brit. J. Cancer 53: 377-384, 1986).
Säugerviren tendieren im Allgemeinen dazu, „sehr frühe" Gene zu haben, die für eine nachfolgende transkriptionelle Aktivierung von anderen viralen Promotorelementen notwendig sind. RNA-Sequenzen dieser Art sind ausgezeichnete Kandidaten für das Aktivieren von intrazellulären Signalen von Alphavirusvektoren (oder „identifizierenden Agenzien") einer viralen Infektion. Daher könnten bedingt letale Gene von zellspezifischen Alphavirus-Vektoren, die auf diese viralen „sehr frühen" Genprodukten responsiv sind, spezifisch Zellen abtöten, die mit irgendeinem bestimmten Virus infiziert sind. Zusätzlich könnte, da die menschlichen und Interferon-Promotorelemente als Antwort auf eine Infektion durch eine breite Vielfalt von nicht verwandten Viren transkriptionell aktiviert werden, das Einbringen von Vektoren, die ein bedingt letales Genprodukt wie HSVTK zum Beispiel als Antwort auf eine Interferonproduktion exprimieren, in der Zerstörung von Zellen resultieren, die mit einer Vielfalt von verschiedenen Viren infiziert sind.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Gen-Abgabevehikel geliefert, die die Expression eines Genprodukts lenken, das zum Aktivieren eines andernfalls inaktiven Vorläufers in einen aktiven Inhibitor des pathogenen Agens in der Lage ist. Zum Beispiel kann das HSVTK-Genprodukt verwendet werden, um potenziell antivirale Nucleosidanaloge wie AZT oder ddC wirksamer zu metabolisieren. Das HSVTK-Gen kann unter der Kontrolle eines zellspezifischen responsiven Vektors exprimiert und in diese Zelltypen eingebracht werden. AZT (und andere antivirale Nucleosidagenzien) müssen durch zelluläre Mechanismen zu der Nucleosidtriphosphat-Form metabolisiert werden, um die retrovirale reverse Transkriptase und so die HIV-Replikation spezifisch zu inhibieren (Furmam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8333-8337, 1986). Die konstituive Expression von HSVTK (einer Nucleosid- und einer Nucleosidkinase mit sehr breiter Substratspezifität) resultiert in einem wirksameren Metabolismus dieser Arzneistoffe in ihre biologisch aktive Nucleotidtriphosphat-Form. Eine AZT- oder ddC-Therapie wird dadurch wirksamer, was niedrigere Dosen, eine weniger generalisierte Toxizität und eine höhere Potenz gegen eine produktive Infektion ermöglicht. Zusätzliche Nucleosid-Analoge, deren Nucleotidtriphosphat-Formen eine Selektivität für eine retrovirale reverse Transkriptase zeigen, die aber als ein Ergebnis der Substratspezifität der zellulären Nucleosid- und Nucleotidkinasen nicht phosphoryliert sind, werden wirksamer gemacht werden.
Die Verabreichung dieser Gen-Abgabevehikel an menschliche T-Zell- und Makrophagen/Monocyten-Zelllinien kann ihre Resistenz gegen HIV in der Anwesenheit von AZT und ddC im Vergleich zu denselben Zellen ohne retrovirale Vektorbehandlung erhöhen. Die Behandlung mit AZT würde bei niedrigeren als den normalen Spiegeln erfolgen, um toxische Nebenwirkungen zu vermeiden, aber die Verbreitung von HIV noch wirksam zu inhibieren. Der Verlauf der Behandlung würde sein, wie für den Blocker beschrieben.
In einer Ausführungsform trägt das Gen-Abgabevehikel ein Gen, das ein Produkt spezifiziert, das selbst nicht toxisch ist, aber wenn es prozessiert oder durch ein Protein wie eine Protease, die spezifisch für ein virales oder anderes Pathogen ist, modifiziert wird, in eine toxische Form konvertiert wird. Zum Beispiel könnte das Gen-Abgabevehikel ein Gen tragen, das ein Pro-Protein für die Ricin A-Kette codiert, die bei Prozessierung durch die HIV-Protease toxisch wird. Genauer, eine synthetische inaktive Pro-Proteinform des Toxins Ricin oder von Diphtherie A-Ketten könnte dadurch, dass bei der HIV-viral-codierten Protease bewirkt wird, dass sie ein geeignetes „Pro"-Element erkennt und abspaltet, in die aktive Form gespalten werden.
In einer anderen Ausführungsform kann das Gen-Abgabevehikel ein „berichtendes Produkt" auf der Oberfläche der Zielzellen als Antwort auf das Vorliegen eines identifizierenden Agens in den Zellen (wie der Expression eines viralen Gens) exprimieren. Dieses Oberflächenprotein kann durch ein cytotoxisches Agens wie Antikörper gegen das berichtende Protein oder durch cytotoxische T- Zellen erkannt werden. In einer ähnlichen Weise kann solch ein System als ein Nachweissystem verwendet werden (siehe unten), um einfach jene Zellen zu identifizieren, die ein bestimmtes Gen aufweisen, das ein identifizierendes Protein exprimiert.
In ähnlicher Weise könnte in einer anderen Ausführungsform ein Oberflächenprotein exprimiert werden, das selbst therapeutisch vorteilhaft sein würde. Im bestimmten Fall von HIV kann die Expression des menschlichen CD4-Proteins spezifisch in HIV-infizierten Zellen in zwei Hinsichten vorteilhaft sein:

1. Die intrazelluläre Bindung von CD4 an HIV-env könnte die Bildung von lebensfähigen viralen Partikeln so weit inhibieren, wie gezeigt worden ist, dass lösliches CD4 dies für freies Virus tut, aber ohne das Problem der systematischen Beseitigung und möglichen Immunogenität, da das Protein membrangebunden bleiben wird und strukturell identisch zu endogenem CD4 ist (gegen das der Patient immunologisch tolerant sein sollte).
2. Da der CD4/HIV-env-Komplex als eine Ursache des Zelltods angenommen worden ist, führt eine zusätzliche Expression von CD4 (in der Anwesenheit eines Überschusses von HIV-env, das in HIV-infizierten Zellen vorhanden ist) zu schnellerem Zelltod und inhibiert so die virale Ausbreitung. Dies kann besonders auf Monocyten und Makrophagen anwendbar sein, die als ein Reservoir für die Virusproduktion als ein Ergebnis ihrer relativen Unbeeinflussbarkeit gegenüber der HIV-induzierten Cytotoxizität (die wiederum offenbar aufgrund des relativen Fehlens von CD4 auf ihren Oberflächen vorliegt) wirken.

In einer anderen Ausführungsform kann das Gen-Abgabevehikel ein Ribozym liefern, das RNA-Moleküle, die für die Lebensfähigkeit der vektorinfizierten Zelle wesentlich sind, spalten und inaktivieren wird. Durch Abhängigmachen der Ribozymproduktion von einer spezifischen RNA-Sequenz, die mit dem pathogenen Zustand korrespondiert, wie HIV-tat, ist die Toxizität spezifisch für den pathogenen Zustand.
4. Expression von Markern
Die oben beschriebene Technik des Exprimierens eines Linderungsmittels in einer Zelle als Antwort auf eine spezifische RNA-Sequenz kann auch modifiziert werden, um einen Nachweis eines bestimmten Gens in einer Zelle, die ein identifizierendes Protein exprimiert (zum Beispiel ein Gen, das durch ein bestimmtes Virus getragen wird), zu ermöglichen und daher den Nachweis von Zellen, die jenes Virus tragen, zu ermöglichen. Zusätzlich ermöglicht diese Technik den Nachweis von Viren (wie HIV) in einer klinischen Probe von Zellen, die ein identifizierendes Protein tragen, das mit dem Virus assoziiert ist.
Diese Modifizierung kann durch Bereitstellen eines Genoms, das ein Produkt codiert, dessen Vorliegen leicht identifiziert werden kann (das „Markerprodukt"), in einem Gen-Abgabevehikel erreicht werden, das auf das Vorliegen des identifizierenden Proteins in den infizierten Zellen reagiert. Zum Beispiel produziert HIV, wenn es geeignete Zellen infiziert, tat und rev. Die Indikatorzellen können daher mit einem Genom geliefert werden (wie durch Infektion mit einem geeigneten rekombinanten Alphavirus), das ein Markergen wie das alkalische Phosphatase-Gen, das β-Galactosidase-Gen oder das Luciferase-Gen codiert, das nach Aktivierung durch das tat- und/oder rev-RNA-Transkript durch das rekombinante Alphavirus exprimiert wird. Im Fall der β-Galactosidase oder alkalischen Phosphatase resultiert das Aussetzen der Zellen gegenüber den Substratanalogen in einer Farb- oder Fluoreszenzänderung, wenn die Probe positiv für HIV ist. Im Fall der Luciferase wird das Aussetzen der Probe gegenüber Luciferin in einer Lumineszenz resultieren, wenn die Probe positiv für HIV ist. Für intrazelluläre Enzyme wie die β-Galactosidase kann der virale Titer direkt durch Zählen der gefärbten oder fluoreszierenden Zellen oder durch Herstellen von Zellextrakten und Durchführen eines geeigneten Tests gemessen werden. Für die Membranbindungsform der alkalischen Phosphatase kann der Virustiter auch durch Durchführen von Enzymtests auf der Zelloberfläche unter Verwenden eines fluoreszierenden Substrats gemessen werden. Für sezernierte Enzyme wie eine manipulierte Form der alkalischen Phosphatase werden kleine Proben des Kulturüberstandes auf die Aktivität getestet, was ein kontinuierliches Überwachen einer einzelnen Kultur im Zeitverlauf ermöglicht. Daher können verschiedene Formen dieses Markersystems für verschiedene Zwecke verwendet werden. Diese schließen das Zählen von aktivem Virus oder empfindliches und einfaches Messen der viralen Ausbreitung in einer Kultur und der Inhibition dieser Ausbreitung durch verschiedene Arzneistoffe ein.
Eine weitere Spezifität kann durch Testen auf das Vorliegen des Virus entweder mit oder ohne neutralisierende(n) Antikörper(n) gegen jenes Virus in das vorhergehende System inkorporiert werden. Zum Beispiel können in einem Teil der klinischen Probe, die getestet wird, neutralisierende Antikörper gegen HIV vorhanden sein; wohingegen es in einem anderen Teil keine neutralisierenden Antikörper geben würde. Wenn die Tests in dem System, wo es Antikörper gab, negativ waren und positiv, wo es keine Antikörper gab, würde dies beim Bestätigen des Vorliegens von HIV behilflich sein.
In einem analogen System für einen in vitro-Test kann das Vorliegen eines bestimmten Gens wie eines viralen Gens in einer Zellprobe bestimmt werden. In diesem Fall sind die Zellen der Probe mit einem geeigneten Gen-Abgabevehikel infiziert, das das Reportergen trägt, das nur in der Anwesenheit des geeigneten viralen RNA-Transkripts exprimiert wird. Das Reportergen wird nach Eindringen in die Probenzellen sein berichtendes Produkt (wie β-Galactosidase oder Luciferase) nur exprimieren, wenn die Wirtszelle die geeigneten viralen Proteine exprimiert.
Diese Tests sind schneller und empfindlicher, da das Reportergen eine größere Menge des berichtenden Produkts als des vorhandenen identifizierenden Agens exprimieren kann, was in einer amplifizierenden Wirkung resultiert.
5. Immun-Herunterregulierung
Wie oben beschrieben, liefert die vorliegende Erfindung auch Gen-Abgabevehikel, die zum Unterdrücken von einem oder mehreren Elementen des Immunsystems in Zielzellen, die mit dem Alphavirus infiziert sind, in der Lage sind. Kurz, eine spezifische Herunterregulierung von ungeeigneten oder unerwünschten Immunantworten wie bei chronischer Hepatitis oder in Transplantaten von heterologem Gewebe wie Knochenmark kann unter Verwendung von immunsuppressiven viralen Genprodukten hergestellt werden, die die Oberflächenexpression von Transplantations(MHC)-Antigen unterdrücken. Die Gruppe C-Adenoviren Ad2 und Ad5 besitzen ein 19 kd-Glycoprotein (gp19), das in der E3-Region des Virus codiert wird. Dieses gp19-Molekül bindet an Klasse I-MHC-Moleküle im endoplasmatischen Retikulum von Zellen und verhindert eine terminale Glycosylierung und Translozierung von Klasse I-MHC an die Zelloberfläche. Zum Beispiel können vor einer Knochenmark-Transplantation Spender-Knochenmarkzellen mit einem gp19-codierenden Gen-Abgabevehikel infiziert werden, das nach Expression des gp19 die Oberflächenexpression von MHC-Klasse I-Transplantationsantigenen inhibiert. Diese Spenderzellen können mit einem geringen Risiko einer Transplantatabstoßung transplantiert werden und können einen minimalen immunsuppresiven Behandlugsplan für den Transplantat-Patienten erfordern. Dies kann einen annehmbaren chimären Spender-Empfänger-Zustand ermöglichen, um mit wenigeren Komplikationen zu existieren. Ähnliche Behandlungen können verwendet werden, um den Bereich der sogenannten Autoimmunkrankheiten, einschließlich Lupus erythromiatis, multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis oder chronischer Hepatitis B-Infektion, zu behandeln.
Ein alternatives Verfahren involviert die Verwendung von Antisense-Botschaft, Ribozym oder einem anderen spezifischen Genexpressionsinhibitor, der spezifisch für T-Zellclone ist, die im Wesen autoreaktiv sind. Diese blockieren die Expression des T-Zell-Rezeptors von bestimmten unerwünschten Clonen, die für eine Autoimmun-Antwort verantwortlich sind. Das Antisense-, Ribozym- oder andere Gen kann unter Verwendung des viralen Vektor-Abgabesystems eingebracht werden.
6. Ersatz- oder Steigerungs-Gentherapie
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft transformierte Zellen eines Vertebraten oder eines Insekts mit einem Gen-Abgabevehikel, das genetische Sequenzen bereitstellt, die zum Exprimieren eines therapeutischen Proteins in der Lage sind. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Gen-Abgabevehikel gestaltet, um ein therapeutisches Protein zu exprimieren, das zum Verhindern, Inhibieren, Stabilisieren oder Umkehren eines vererbten oder nicht-vererbten genetischen Defekts in Metabolismus, der Immunregulierung, der hormonellen Regulierung, einer enzymatischen oder membranassoziierten strukturellen Funktion in der Lage ist. Diese Ausführungsform beschreibt auch das Gen-Abgabevehikel, das zum Transduzieren von individuellen Zellen in der Lage ist, wobei das therapeutische Protein in der Lage ist, systemisch oder lokal von einer spezifischen Zelle oder einem spezifischen Gewebe exprimiert zu werden, wodurch das therapeutische Protein (a) zum Ersatz eines fehlenden oder defekten zellulären Proteins oder Enzyms oder (b) zur ergänzenden Produktion eines defekten oder niedrig exprimierten zellulären Proteins oder Enzyms in der Lage ist. Solche Krankheiten können zystische Fibrose, Parkinson-Krankheit, Hypercholesterinämie, Adenosindesaminase-Mangel, β-Globin-Störungen, Hämophilie A & B, Gaucher-Krankheit, Diabetes und Leukämie einschließen.
Als ein Beispiel der vorliegenden Erfindung kann ein Gen-Abgabevehikel konstruiert und verwendet werden, um die Gaucher-Krankheit zu behandeln. Kurz, die Gaucher-Krankheit ist eine genetische Störung, die durch den Mangel des Enzyms Glucocerebrosidase charakterisiert ist. Dieser Typ der Therapie ist ein Beispiel einer Einzelgen-Ersatztherapie durch Bereitstellen eines funktionellen zellulären Enzyms. Dieser Enzymmangel führt zu der Akkumulierung von Glucocerebrosid in den Lysosomen von allen Zellen im Körper. Dennoch ist der Krankheits-Phänotyp außer in sehr seltenen neuropathischen Formen der Krankheit nur in den Makrophagen manifestiert. Diese Krankheit führt normalerweise zur Vergrößerung der Leber und Milz und zu Läsionen in den Knochen. (Für eine Literaturübersicht siehe Science 256: 794, 1992 und The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6. Aufl. Scriver et al., Bd. 2, S. 1677).
Gen-Abgabevehikel können in ähnlicher Weise verwendet werden, um eine breite Vielfalt von therapeutischen Proteinen abzugeben, um eine Krankheit und einen Krankheitsvorgang zu behandeln, zu heilen, zu verhindern. Repräsentative Beispiele von solchen Genen schließen Insulin (siehe US 4,431,740 und BE 885196 A ), Hämoglobin (Laven et al., Cell 21: 647-51, 1980), Erythropoietin (EPO; siehe US 4,703,008 ), Megakaryocyten-Wachstums- und Differenzierungsfaktor (MGDF), Stammzell-Faktor (SCF), G-CSF (Nagata et al., Nature 319: 415-418, 1986), GM-CSF, M-CSF (siehe WO 8706954 ), den flt3-Liganden (Lyman et al. (1993), Cell 75: 1157-1167), EGF, sauren und basischen FGF, PDGF, Mitglieder der Interleukin- oder Interferonfamilien, vorstehend, neurotropische Faktoren (z. B. BDNF; Rosenthal et al., Endocrinology 129: 1289-1294, 1991, NT-3; siehe WO 9103569 , CNTF; siehe WO 9104316 , NGF; siehe WO 9310150 ), Gerinnungsfaktoren (z. B. Faktoren VIII und IX), thrombolytische Faktoren wie t-PA (siehe EP 292009 , AU 8653302 und EP 174835 ) und Streptokinase (siehe EP 407942 ), das menschliche Wachstumshormon (siehe JP 94030582 und US 4,745,069 ) und andere Tier-Somatotropine, Integrine und andere Zell-Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1 und ELAM (siehe auch oben diskutierte andere „heterologe Sequenzen") und andere Wachstumsfaktoren wie IGF-I und IGF-II, TGF-β, osteogenes Protein-1 (Ozkaynak et al., EMBO J. 9: 2085-2093, 1990) und andere Knochen-morphogenetische Proteine (z. B. BMP-4, Nakase et al., J. Bone Miner. Res. 9: 651-659, 1994) ein, sind aber nicht darauf limitiert.
7. Lymphokine und Lymphokin-Rezeptoren
Wie oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung auch Gen-Abgabevehikel, die unter anderen Funktionen die Expression von einem oder mehreren Cytokinen oder Cytokin-Rezeptoren lenken können. Kurz, zusätzlich zu ihrer Rolle als Krebs-Therapeutika können Cytokine negative Wirkungen haben, die in bestimmten pathologischen Zuständen resultieren. Zum Beispiel exprimieren die meisten ruhenden T-Zellen, B-Zellen, großen granulären Lymphocyten und Monocyten keinen IL-2R (Rezeptor). Im Gegensatz zum Fehlen der IL-2R-Expression auf normalen ruhenden Zellen wird IL-2R von abnormalen Zellen in Patienten mit bestimmten Leukämien (ATL, Hairy-Zell-, Hodgkin-, akute und chronische granulocytäre), Autoimmunkrankheiten exprimiert und ist mit der Allotransplantat-Abstoßung assoziiert. Interessanterweise ist in den meisten dieser Patienten die Serumkonzentration einer löslichen Form von IL-2R erhöht. Daher kann die Therapie mit bestimmten Ausführungsformen der Erfindung durch Erhöhen der Serumkonzentration der löslichen Form des Cytokin-Rezeptors beeinflusst werden. Zum Beispiel kann im Fall von IL-2R ein Gen-Abgabevehikel gestaltet werden, um sowohl löslichen IL-2R als auch IL-2R zu produzieren, was einen löslichen Rezeptor mit hoher Affinität kreiert. In dieser Konfiguration würden die IL-2R-Serumspiegel sinken, was die parakrine Schleife inhibiert. Dieselbe Strategie kann auch gegen Autoimmunkrankheiten wirksam sein. Insbesondere weil manche Autoimmunkrankheiten (z. B. rheumatoide Arthritis, SLE) auch mit abnormaler Expression von IL-2 assoziiert sind, kann ein Blockieren der Wirkung von IL-2 durch Erhöhen des Serumspiegels des Rezeptors auch angewendet werden, um solche Autoimmunkrankheiten zu behandeln.
In anderen Fällen kann das Inhibieren der Spiegel von IL- vorteilhaft sein. Kurz, IL-1 besteht aus zwei Polypeptiden, IL-1 und IL-1, wovon jedes pleiotrope Wirkungen hat. IL-1 wird vorwiegend durch mononukleäre Phagocyten als Antwort auf eine Stimulation durch mikrobielle Produkte oder eine Entzündung synthetisiert. Es gibt einen natürlich vorkommenden Antagonisten des IL-1R, bezeichnet als der IL-1-Rezeptor-Antagonist („IL-1Ra"). Dieser IL-1R-Antagonist hat dieselbe molekulare Größe wie das reife IL-1 und ist strukturell mit demselben verwandt. Dennoch initiiert eine Bindung von IL-1Ra an den IL-1R keine Rezeptor-Signalgebung. Daher hat dieses Molekül einen anderen Wirkungsmechanismus als ein löslicher Rezeptor, der einen Komplex mit dem Cytokin bildet und so die Interaktion mit dem Rezeptor verhindert. IL-1 scheint keine wichtige Rolle in der normalen Homöostase zu spielen. In Tieren reduzieren Antikörper gegen IL-1-Rezeptoren eine Entzündung und Anorexie aufgrund von Endotoxinen und anderen Entzündungs-induzierenden Agenzien.
Im Fall eines septischen Schocks induziert IL-1 sekundäre Verbindungen, die starke Vasodilatoren sind. In Tieren senkt exogen bereitgestelltes IL-1 den mittleren arteriellen Druck und induziert eine Leukopenie. Ein neutralisierender Antikörper gegen IL-1 reduziert Endotoxin-induziertes Fieber in Tieren. In einer Untersuchung von Patienten mit septischem Schock, die für drei Tage mit einer konstanten Infusion von IL-1R behandelt wurden, war die 28-Tage-Mortalität 16% im Vergleich zu 44% in Patienten, die Placebo-Infusionen erhielten. Im Fall einer Autoimmunkrankheit reduziert ein Reduzieren der Aktivität von IL-1 eine Entzündung. In ähnlicher Weise kann das Blockieren der Aktivität von IL-1 mit rekombinanten Rezeptoren in einem erhöhten Allotransplantat-überleben in Tieren resultieren, wieder mutmaßlich durch Senken der Entzündung.
Diese Krankheiten liefern weitere Beispiele, wo Gen-Abgabevehikel gestaltet werden können, um einen löslichen Rezeptor oder genauer das IL-1Ra-Molekül zu produzieren. Zum Beispiel könnte in Patienten, die einen septischen Schock durchmachen, eine einzelne Injektion von IL-1Ra-produzierenden Vektorpartikeln den derzeitigen Ansatz ersetzen, der eine konstante Infusion von rekombinantem IL-1R erfordert.
Cytokin-Antworten oder genauer inkorrekte Cytokin-Antworten können auch in das Versagen, infektiöse Krankheiten zu kontrollieren oder zu lösen, involviert sein. Nicht-heilende Formen von Leishmaniose in Mäusen und Menschen, die starke, aber kontraproduktive T_H2-dominierte Antworten haben, ist das vielleicht am besten untersuchte Beispiel. In ähnlicher Weise ist leprotomatöse Lepra mit einer dominanten, aber unpassenden T_H2-Antwort assoziiert. In diesen Zuständen können Gen-Abgabevehikel für das Steigern der zirkulierenden Spiegel von IFN-Gamma nützlich sein, im Gegensatz zum ortsgerichteten Ansatz, der für eine Therapie von festem Tumor vorgeschlagen wurde. IFN-Gamma wird durch T_H-1-T-Zellen produziert und wirkt als ein negativer Regulator der T_H-2-Subtyp-Proliferation. IFN-Gamma antagonisiert auch viele der IL-4-vermittelten Wirkungen auf B-Zellen, einschließlich des Isotyp-Umschaltens zu IgE.
IgE, Mastzellen und Eosinophile sind in das Vermitteln einer allergischen Reaktion involviert. IL-4 wirkt auf differenzierende T-Zellen, um die TH-2-Entwicklung zu stimulieren, während es T_H-1-Antworten inhibiert. Daher kann eine Alphavirus-basierte Gentherapie auch im Zusammenhang mit traditionellen Allergie-Therapeutika erreicht werden. Eine Möglichkeit ist es, ein Gen-Abgabevehikel abzugeben, das IL4R mit kleinen Mengen des angreifenden Allergens produziert (d. h. traditionelle Allergieschüsse). Lösliches IL-4R würde die Aktivität von IL-4 verhindern und so die Induktion einer starken T_H-2-Antwort verhindern.
B. Suizid-Vektoren
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft die Verwendung von Gen-Abgabevehikel-Suizid-Vektoren, um die Verbreitung von Wildtyp-Alphavirus in den Verpackungs-/Hersteller-Zelllinien zu limitieren. Kurz, in einer Ausführungsform umfasst das Gen-Abgabevehikel eine Antisense- oder Ribozym-Sequenz, die spezifisch für die Wildtyp-Alphavirussequenz ist, die von einem RNA-Rekombinationsereignis zwischen den 3'-Sequenzen der Verbindungsregion des Vektors und den 5'-Alphavirus-Struktursequenzen des Verpackungszelllinien-Expressionsvektors hergestellt wurde. Das Antisense- oder Ribozym-Molekül würde nur in der Anwesenheit der spezifischen Rekombinationssequenz hitzestabil sein und würde keine andere Wirkung in der Alphavirus-Verpackungs-/Hersteller-Zelllinie haben. Alternativ kann auch ein toxisches Molekül (wie jene, die hierin beschrieben werden) im Zusammenhang mit einem Vektor exprimiert werden, der nur in der Anwesenheit von Wildtyp-Alphavirus exprimieren würde.
9. Gen-Abgabevehikel, um die Ausbreitung von metastatischen Tumoren zu verhindern
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft die Verwendung von Gen-Abgabevehikeln für das Inhibieren oder Reduzieren der Invasivität von malignen Neoplasmen. Kurz, das Ausmaß der Malignität bezieht sich typischerweise auf die Vaskularisierung des Tumors. Eine Ursache für die Tumor-Vaskularisierung ist die Produktion von löslichen Tumor-Angiogenese-Faktoren (TAF) (Paweletz et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 9: 197, 1989), die durch manche Tumoren exprimiert werden. In einem Aspekt kann die Tumor-Vaskularisierung unter Anwenden von Gen-Abgabevehikeln, um Antisense- oder Ribozym-RNA-Moleküle, die spezifisch für TAF sind, zu exprimieren, verlangsamt werden. Alternativ können Anti-Angiogenese-Faktoren (Moses et al., Science 248: 1408, 1990; Shapiro et al., PNAS 84: 2238, 1987) entweder alleine oder in Kombination mit den oben beschriebenen Ribozymen oder Antisense-Sequenzen exprimiert werden, um die Tumor-Vaskularisierung zu verlangsamen oder zu inhibieren. Alternativ können die Gen-Abgabevehikel auch verwendet werden, um einen Antikörper zu exprimieren, der spezifisch für die TAF-Rezeptoren auf umgebenden Geweben ist.
10. Verabreichung von Gen-Abgabevehikeln
In anderen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Verfahren zum Verabreichen eines Gen-Abgabevehikels an einen Vertebraten oder ein Insekt offenbart. Kurz, die endgültige Art der Gen-Abgabevehikel-Verabreichung beruht normalerweise auf der spezifischen therapeutischen Anwendung, der besten Weise des Erhöhens der Vektorpotenz und dem praktischsten Weg der Verabreichung. Im Allgemeinen schließt dieser Aspekt Gen-Abgabevehikel ein, die gestaltet werden können, um zum Beispiel durch (1) direkte Injektion in die Blutbahn; (2) direkte Injektion in ein spezifisches Gewebe oder einen Tumor; (3) orale Verabreichung; (4) nasale Inhalation; (5) direkte Anwendung auf Schleimhautgewebe; oder (6) ex vivo-Verabreichung von transduzierten autologen Zellen in den Vertebraten oder das Insekt abgegeben zu werden. In bestimmten Aspekten können für ex vivo-Anwendungen Zellen zuerst von einem Wirt entfernt, positiv und/oder negativ selektiert, um eine Population von Zellen zu erhalten, die mindestens teilweise gereinigt ist (z. B. CD34⁺-Stammzellen, T-Zellen oder dergleichen), mit einem der Gen-Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung transduziert, transfiziert oder infiziert und in entweder denselben Wirt oder ein anderes Individuum wieder eingebracht werden.
Daher kann das therapeutische Gen-Abgabevehikel auf solche Weise verabreicht werden, dass der Vektor (a) eine normale gesunde Zelle transduzieren und die Zelle in einen Hersteller eines therapeutischen Proteins oder Agens, das systemisch oder lokal sezerniert wird, transformieren, (b) eine abnormale oder defekte Zelle transformieren, wobei die Zelle in einen normalen funktionierenden Phänotyp transformiert wird, (c) eine abnormale Zelle transformieren, sodass sie zerstört wird, und/oder (d) Zellen transduzieren kann, um die Immunantwort zu manipulieren.
11. Modulierung der Transkriptionsfaktor-Aktivität
In noch einem anderen Aspekt können die Gen-Abgabevehikel angewendet werden, um die Wachstums-Kontrollaktivität von Transkriptionsfaktoren in der infizierten Zelle zu regulieren. Kurz, Transkriptionsfaktoren beeinflussen das Muster der Genexpression durch sequenzspezifische Trans-Aktivierung oder Unterdrückung direkt (Karin, New Biologist 21: 126-131, 1990). Daher ist es nicht überraschend, dass mutierte Transkriptionsfaktoren eine Familie von Oncogenen repräsentieren. Gen-Abgabevehikel können verwendet werden, um zum Beispiel die Kontrolle an Tumorzellen, deren unreguliertes Wachstum durch oncogene Transkriptionsfaktoren aktiviert wird, und Proteine, die zusammenwirkend die Bindung bei der Bildung von trans-aktivierenden oder unterdrückenden Transkriptionsfaktor-Homo- und Heterodimer-Komplexen fördern oder inhibieren, zurückzugeben.
Ein Verfahren zum Umkehren der Zellproliferation würde sein, das trans-aktivierende Potenzial des c-myc/Max-Heterodimer-Transkriptionsfaktor-Komplexes zu inhibieren. Kurz, das nukleare Oncogen c-myc wird durch proliferierende Zellen exprimiert und kann durch einige ausgeprägte Mechanismen aktiviert werden, einschließlich einer retroviralen Insertion, Amplifizierung und chromosomalen Translozierung. Das Max-Protein wird in ruhenden Zellen exprimiert und wirkt unabhängig von c-myc entweder alleine oder im Zusammenhang mit einem nicht identifizierten Faktor, um die Expression derselben Gene, die durch das myc/Max-Heterodimer aktiviert werden, zu unterdrücken (Cole, Cell 65: 715-716, 1991).
Die Inhibition der c-myc- oder c-myc/Max-Proliferation von Tumorzellen kann durch die Überexpression von Max in Zielzellen, gesteuert durch Gen-Abgabevehikel, erreicht werden. Das Max-Protein ist nur 160 Aminosäuren lang (entsprechend einer 480 Nucleotid-RNA-Länge) und wird leicht in ein Gen-Abgabevehikel entweder unabhängig oder in Kombination mit anderen Genen und/oder Antisense/Ribozym-Einheiten, die Faktoren anzielen, die die Wachstumskontrolle der Zelle freisetzen, inkorporiert.
Eine Modulierung der Homo/Hetero-Komplex-Assoziierung ist ein weiterer Ansatz, um eine Transkriptionsfaktor-aktivierte Genexpression zu kontrollieren. Zum Beispiel wird der Transport des trans-aktivierenden Transkriptionsfaktors NF-B vom Cytoplasma zum Nucleus verhindert, während er in einem Heterodimer-Komplex mit dem Inhibitorprotein IB ist. Nach der Induktion durch eine Vielfalt von Mitteln, einschließlich bestimmter Cytokine, wird IB phosphoryliert und NF-B wird freigesetzt und zum Nucleus transportiert, wo es seine sequenzspezifische trans-aktivierende Funktion ausüben kann (Baeuerle und Baltimore, Science 242: 540-546, 1988). Die Dissoziierung des NF-B/IB-Komplexes kann durch Maskieren der Phosphorylierungsstelle von IB mit einem Antikörper verhindert werden. Dieser Ansatz würde die Trans-Aktivierungsaktivität des NF-IB-Transkriptionsfaktors durch Verhindern seines Transports in den Nucleus wirksam verhindern. Die Expression des IB-Phosphorylierungsstelle-spezifischen Antikörpers oder Proteins in Zielzellen kann mit einem Alphavirus-Gentransfervektor erreicht werden. Ein Ansatz, der ähnlich zu dem hier beschriebenen ist, könnte verwendet werden, um die Bildung des trans-aktivierenden Heterodimer-Transkriptions-Faktors AP-1 (Turner und Tijan, Science 243: 1689-1694, 1989) durch Inhibieren der Assoziation zwischen den jun- und fos-Proteinen zu verhindern.
12. Produktion von rekombinanten Proteinen
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können Alphavirus-Gen-Abgabevehikel angewendet werden, um die Expression eines oder mehrerer rekombinanter Proteine in eukaryontischen Zellen (ex vivo, in vivo oder etablierten Zelllinien) zu lenken. Wie hierin verwendet, betrifft ein „rekombinantes Protein" ein Protein, Polypeptid, Enzym oder Fragment davon. Unter Verwendung dieses Ansatzes können Proteine, die therapeutische oder andere kommerzielle Anwendungen haben, kostengünstiger produziert werden. Darüber hinaus können Proteine, die in eukaryontischen Zellen produziert werden, im Vergleich zu Proteinen, die in prokaryontischen Zellen produziert werden, authentischer post-translationell modifiziert werden (z. B. glycosyliert, sulfatiert, acetyliert usw.). Zusätzlich können solche Systeme in der in vivo-Produktion von verschiedenen chemischen Verbindungen, z. B. Fein- oder Spezial-Chemikalien, angewendet werden.
In diesem Aspekt wird das Gen-Abgabevehikel, das das erwünschte Protein, Enzym oder den Enzymweg codiert (wie es für die Produktion einer erwünschten Chemikalie nötigt sein kann), in eine passende eukaryontische Zelle transformiert, transfiziert, transduziert oder anderweitig eingebracht. Repräsentative Beispiele von Proteinen, die unter Verwendung eines solchen Systems produziert werden können, schließen Insulin (siehe US 4,431,740 und BE 885196 A ), Hämoglobin (Laven et al., Cell 21: 647-51, 1980), Erythropoietin (EPO; siehe US 4,703,008 ), Megakaryocyten-Wachstums- und Differenzierungsfaktor (MGDF), Stammzell-Faktor (SCF), G-CSF (Nagata et al., Nature 319: 415-418, 1986), GM-CSF, M-CSF (siehe WO 8706954 ), den flt3-Liganden (Lyman et al. (1993), Cell 75: 1157-1167), EGF, sauren und basischen FGF, PDGF, Mitglieder der Interleukin- oder Interferon-Familien, vorstehend, neurotrope Faktoren (z. B. BDNF; Rosenthal et al., Endocrinology 129: 1289-1294, 1991, NT-3; siehe WO 9103569 , CNTF, siehe WO 9104316 , NGF; siehe WO 9310150 ), Gerinnungsfaktoren (z. B. die Faktoren VIII und IX), thrombolytische Faktoren wie t-PA (siehe EP 292009 , AU 8653302 und EP 174835 ) und Streptokinase (siehe EP 407942 ), menschliches Wachstumshormon (siehe JP 94030582 und US 4,745,069 ) und andere Tier-Somatotropine, Integrine und andere Zelladhäsionsmoleküle wie ICAM-1 und ELAM (siehe auch die oben diskutierten anderen „heterologen Sequenzen") und andere Wachstumsfaktoren wie IGF-I und IGF-II, TGF-β, osteogenes Protein-1 (Ozkaynak et al., EMBO J. 9: 2085-2093, 1990) und andere Knochen-morphogene Proteine (z. B. BMP-4, Nakase et al., J. Bone Miner. Res. 9: 651-659, 1994) ein, sind aber nicht darauf limitiert. Wie Fachleute anerkennen werden, kann jedes Gen, sobald es charakterisiert ist, leicht in Gen-Abgabevehikel gemäß der vorliegenden Erfindung cloniert werden, gefolgt von Einbringen in eine geeignete Wirtszelle und Expression des erwünschten Gens.
Verfahren zum Produzieren von rekombinanten Proteinen unter Verwendung der Vektoren und Alphavirus-Verpackungszelllinien, die hierin beschrieben sind, werden offenbart (siehe Beispiele 6 und 7). Kurz, die Gen-Abgabevehikel können in der Form von in vitro-transkribierter RNA, Plasmid-DNA oder rekombinanten Vektorpartikeln, die rekombinante Proteine codieren, (durch Transfektion oder Infektion) in Alphavirus-Verpackungszelllinien (PCLs) eingebracht werden, sodass nur eine kleine Fraktion der kultivierten Zellen (≤ 1%) Vektormoleküle enthält. Vektor-Replikons werden durch die sPs verpackt, die durch die PCL in trans bereitgestellt werden, gefolgt von Vektor-RNA-Amplifizierung, die gemäß der Sindbis-Virus-Replikationsstrategie abläuft. Im Gegenzug infizieren die produzierten rekombinanten Vektorpartikel die verbleibenden Zellen der Kultur. Daher resultiert ein Aufblühen der rekombinanten Proteinexpression im Zeitablauf, da rekombinante Vektorpartikel produziert werden und danach alle Zellen in der PCL-Kultur infizieren. In ähnlicher Weise kann die Amplifizierung von Vektorpartikeln mit PCL verwendet werden, um große Partikelbestände mit hohem Titer für andere Anwendungen herzustellen. In noch einem anderen Aspekt wird eine rekombinante Proteinexpression von Hersteller-Zelllinien beschrieben (siehe Beispiel 7). Kurz, Zelllinien werden abgeleitet, die alle die genetischen Elemente, einschließlich der Vektor-Replikon- und defekten Helfer-Expressionskassetten, enthalten, von denen die Produktion der Vektorpartikel durch Zugabe eines extrazellulären Stimulus zu der Kultur induziert werden kann. Daher erfolgt die Expression des Vektor-codierten rekombinanten Proteins als ein Ergebnis der Induktion der Alphavirus-Vektorpartikel-Hersteller-Zelllinien. In noch einem weiteren Aspekt wird eine rekombinante Proteinexpression von Zelllinien, die stabil mit eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystemen transformiert sind, beschrieben (siehe Beispiel 7). Kurz, Zelllinien werden abgeleitet, die mit einer induzierbaren eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystem-Kassette stabil transformiert sind, die ein rekombinantes Protein von Interesse codiert. Daher erfolgt die Expression des Vektor-codierten rekombinanten Proteins als ein Ergebnis der Induktion der eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystem-Kassette.
Wie leicht in Anbetracht der hierin gelieferten Offenbarung verstanden werden sollte, kann eine Proteinproduktion unter Anwendung von RNA-Vektoren-Replikons, eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystemen oder rekombinanten Vektorpartikeln auch durch andere Verfahren als das Einbringen in Verpackungs- oder Hersteller-Zelllinien erreicht werden. Zum Beispiel können solche Vektoren in eine breite Vielfalt von anderen eukaryontischen Wirtszelllinien (z. B. COS, BHK, CHO, 293 oder HeLa-Zellen) eingebracht werden, sowie direkt in vivo oder an ex vivo-Zellen verabreicht werden, um das erwünschte Protein zu produzieren.
J. Hinterlegungs-Information

Die folgenden Materialien sind bei der American Type Culture Collection hinterlegt worden:

Hinterlegung	Bezeichnung	Hinterlegungsdatum	Zugangs-Nr.
Wild typ-Sindbis-Virus	CMCC #4639	April 2, 1996	VR-2526
SIN-1 Sindbis-Virus	CMCC #4640	April 2, 1996	VR-2527
pBG-SIN1 ELVS1.5 SEAP	CMCC #4641	April 2, 1996	97502

Die obigen Materialien wurden durch Chiron Corporation bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklaven Drive, Rockville, Maryland, unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zu Zwecken eines Patentverfahrens hinterlegt. Die Zugangsnummer ist von der ATCC unter der Telefonnummer (301) 881-2600 erhältlich.
Diese Hinterlegungen werden als Annehmlichkeit für Fachleute bereitgestellt und sind kein Zugeständnis, dass eine Hinterlegung unter 35 U. S. C. § 112 benötigt wird. Im Fall eines Fehlers in der hierin beschriebenen Sequenz sollte auf die Nucleinsäuresequenz dieser Hinterlegungen sowie die Aminosäuresequenz der Polypeptide, die dadurch codiert werden, Bezug genommen werden. Eine Lizenz kann erforderlich sein, um die hinterlegten Materialen herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, und hiermit wird keine solche Lizenz gewährt.
Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um die vorliegende Erfindung vollständiger zu illustrieren. Zusätzlich liefern diese Beispiele bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht gedacht, den Rahmen davon zu limitieren. Standardverfahren für viele der Vorgehensweisen, die in den folgenden Beispielen beschrieben werden, oder geeignete alternative Vorgehensweisen werden in weitreichend umorganisierten Handbüchern der Molekularbiologie wie zum Beispiel „Molecular Cloning", zweite Auflage (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1987) und „Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., Hrsg. Greene Associates/Wiley Interscience, NY, 1990) bereitgestellt.
BEISPIELE
Beispiele, die sich nicht spezifisch auf die beanspruchte Erfindung beziehen, werden nur zur Illustration geliefert.
BEISPIEL 1
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON SINI
Unten wird die Identifizierung und molekulare Charakterisierung eines positiv-strängigen RNA-Virus, das eine reduzierte Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese zeigt und zum Etablieren einer persistierenden Infektion in Vertebratenzellen in der Lage ist, im Vergleich zu lytischen, cytopathogenen Wildtyp-Stämmen desselben Virus beschrieben. Zum Beispiel wird das Sindbis-Virus als ein Prototyp verwendet, der für die Alphavirus-Gattung repräsentativ ist.
A. Isolierung, Plaque-Reinigung und Charakterisierung von SIN-1 aus einem Wildtyp-Sindbis-Virusbestand
Die Isolierung, das molekulare Clonieren und die Charakterisierung eines varianten Sindbis-Virus-Stamms wird beschrieben. Dieser Stamm ist in der Lage, eine produktive persistierende Infektion in der Abwesenheit einer Cytopathie zu etablieren, produziert aber Spiegel des Virus, die äquivalent zu jenem des Wildtyp-Virus sind.
Ein Wildtyp-Bestand mit hohem Titer (> 10⁸ PbE/ml), der durch Infektion von BHK-Zellen (ATCC Nr. CCL-10) mit Sindbis-Virus (CMCC #4639) bei einer niedrigen MOI (≤ 0,1) erhalten wurde. Um eine Infektion zu ermöglichen, war das Virus-Inokulum in einem Volumen enthalten, das gerade ausreicht, um die Einzelzellschicht zu bedecken, wenn es zu den Zellen zugefügt wird. BHK-Zellen werden bewahrt, und alle Virusverdünnungen wurden in minimalem essenziellem Eagle-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, durchgeführt. Die Zellen wurden bei 37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre kultiviert. Ein ausgedehnter CPE, gezeigt durch „Abrunden", Verlust der Adhäsion und erhöhte Lichtbrechung der individuellen Zellen in der Einzelzellschicht, und zusätzlich die verminderte Gesamt-Zelldichte der Einzelzellschicht wurden innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion (hpi) beobachtet. Die Zellkultur-Flüssigkeiten wurden gesammelt, Zelltrümmer wurde durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (4000 UpM für 10 min bei Zimmertemperatur) entfernt, und der Virusbestand wurde aliquotiert und bei –70°C gelagert. Der Titer des Sindbis-Virusbestands wurde durch Plaque-Test bestimmt, wie früher beschrieben (Strauss et al., Virology 74: 154-168, 1976). Kurz, Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Einzelzellschichten wurden mit verschiedenen Verdünnungen des Virusbestands infiziert, und die Einzelzellschicht wurde mit Medien, angereichert mit 0,75% Agarose, überschichtet. Nach 24–48 hpi wurden Plaques aufgrund der Zell-Lyse gesehen und entweder direkt oder alternativ durch Färben mit Kristallviolett nach Entfernen der Agaroseüberschichtung quantifiziert. Der Virustiter wurde aus Proben bestimmt, die mit Virusverdünnungen infiziert wurden, in denen die Plaques genau quantifiziert wurden.
Ein Sindbis-Virusbestand, der mit DI-Partikeln angereichert ist, wurde durch wiederholte Passage mit hoher MOI (≥ 5) auf BHK-Zellen erhalten. BHK-Einzelzellschichten wurden anfänglich mit dem Sindbis-Virussaatbestand bei einer MOI = 5 infiziert. Das Kulturmedium wurde gewonnen und durch Niedriggeschwindigkeits-Zentrifugation geklärt, nachdem eine vollständige Zell-Lyse der infizierten Kultur beobachtet wurde (normalerweise innerhalb von 24 hpi). Das geklärte Medium, das von der infizierten Kultur gewonnen wurde, wurde dann verwendet, um eine frische BHK-Einzelzellschicht zu infizieren. Zum Beispiel wurden 2 ml des Virus-Inokulums zu einer frischen BHK-Einzelzellschicht in einer 10 cm-Petrischale zugefügt. Nach 1 hpi wurden 8 ml frisches Medium zu der Virusinfizierten Kultur zugefügt. Wie oben beschrieben, wurde das Kulturmedium gewonnen und nach der Beobachtung einer vollständigen Zell-Lyse der Kultur geklärt. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis die Rate, bei der sich nach der Infektion eine Cytopathogenität in der BHK-Einzelzellschicht entwickelte, bis mindestens 4 Tage verzögert war. Die Verzögerung im Beginn der Cytopathogenität nach der Infektion kennzeichnet das Vorliegen eines hohen Spiegels von DI-Partikeln in der Viruspräparation.
Das Vorliegen eines hohen Spiegels von DI-Partikeln in der Viruspräparation, die von mehreren unverdünnten Reihenpassagen von infiziertem Zellmedium stammt, wurde durch einen Interferenz-Test oder durch RNA-Analyse von infizierten BHK-Zellen bestimmt. Im ersten Verfahren wurde ein homologer Interferenz-Test als ein Maß des Vorliegens von DI-Partikeln durchgeführt. Kurz, BHK-Zellen wurden alleine bei einer MOI = 10 mit dem Hoch-Titer (> 10⁸ PbE/ml)-Wildtyp-Bestand, der, wie oben beschrieben, hergestellt wurde, infiziert. Nach 16 hpi wurde der Virusertrag durch Plaque-Test bestimmt, wie oben beschrieben. Der Virusertrag aus diesem Experiment war typischerweise 1 × 10⁹ bis 1 × 10¹⁰ PbE/ml. In einer anderen Versuchsgruppe wurden die BHK-Zellen simultan mit dem Wildtyp-Bestand (MOI = 10) und dem Virusbestand, der von mehreren unverdünnten Reihenpassagen des infizierten Zellmediums hergestellt wurde (MOI = 5), co-infiziert. Wie vorher wurde der Virusertrag 16 hpi durch Plaque-Test bestimmt. Wenn der Virusbestand von der zweiten Versuchsgruppe einen hohen Spiegel an DI-Partikeln enthält, wird der Virusertrag mindestens 2–3 Größenordnungen niedriger sein als das erste Experiment (z. B. ≤ 1 × 10⁷ PbE/ml).
Als ein maßgeblicheres Verfahren zum Zeigen des Vorliegens von DI-Partikeln in der Viruspräparation wurde die virusspezifische RNA in infizierten BHK-Zellen 16 hpi analysiert. Kurz, die BHK-Zellen wurden mit dem Hoch-Titer (> 10⁸ PbE/ml)-Wildtyp-Bestand oder mit dem Virusbestand, der DI-Partikel enthält, infiziert (MOI = 10). Schein-infizierte Kontrollen und infizierte Zellen wurden von 1 bis 16 hpi mit Dactinomycin (1 mg/ml) behandelt und mit [³H]Uridin (20 mCi/ml) markiert. RNA wurde von infizierten und Kontrollzellen durch Verwenden von RNAzol B isoliert isoliert, wie vom Hersteller (Tel-Test, Inc., Friendswood, Texas) beschrieben. Alternativ wurde RNA mit Tri-Reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, Ohio) oder durch konventionelle Verfahren unter Verwendung der Phenol-Extraktion von Zellen, die in einem Puffer (0,05 M Tris, 0,1 M NaCl, 0,001 M EDTA, pH 7,5), enthaltend 0,5% Triton und 0,5% rekristallisiertes Naphthalendisulfonat, lysiert wurden, isoliert, wie von Weiss et al. (J. Virol. 14: 1189-1198, 1974) beschrieben. Die RNAs wurden mit Glyoxal denaturiert und durch horizontale 1,1% Agarosegele, die in 0,01 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) hergestellt wurden, bei 5 V/cm einer Elektrophorese unterzogen (McMaster und Carmichael, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4835-4838, 1977). Alternativ kann die RNA durch Formaldehydgele einer Elektrophorese unterzogen werden. Nach der Elektrophorese wurde jede Feuchtigkeit von den Gelen unter Vakuum mit einem Geltrockner entfernt, und die getrockneten Gele wurden für eine Fluorographie behandelt und einem Film ausgesetzt. Zwei RNAs, die den genomischen und subgenomischen Spezies entsprechen (42S beziehungsweise 26S), wurden in den Proben von BHK-Zellen, die mit dem Wildtyp-Virusbestand infiziert wurden, beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde eine große Zahl von RNA-Spezies, die verschieden von den viralen 42S- und 26S-Standard-RNAs sind, in Proben von BHK-Zellen beobachtet, die mit dem Virusbestand infiziert wurden, der DI-Partikel enthält. Mehrere RNAs, die den DI-RNAs entsprechen, wanderten vorwiegend bei molekularen Gewichten, die kleiner als die 26S-RNA-Spezies vom Wildtyp-Virus waren. Ein Beispiel von mehreren RNAs zusätzlich zu den 42S- und 26S-Spezies, die in BHK-Zellen beobachtet wurden, die mit einem Virusbestand, enthaltend DI-Partikel, infiziert wurden, kann in 3, Bahn 3, von Weiss et al. (J. Virol. 33: 463-474, 1980) gesehen werden.
Ein varianter Sindbis-Virusstamm, der in der Lage ist, eine produktive persistente Infektion mit verminderter Cytopathogenität zu etablieren, wurde isoliert und von einem Virusbestand, der mit DI-Partikeln angereichert war, molekular cloniert. BHK-Zellen wurden bei einer hohen Multiplizität (MOI = 5) mit dem Sindbis-Virusbestand, der mit DI-Partikeln angereichert war, infiziert. Die Cytopathogenität entwickelte sich im Vergleich zur Infektion von BHK-Zellen mit dem Wildtyp-Virus langsam; dennoch wurden die meisten Zellen schlussendlich lysiert und hoben sich von der Platte ab. Zelltrümmer und nicht-anhaftende Zellen wurden alle zwei Tage durch Mediumwechsel entfernt. Innerhalb von zwei Wochen nach der anfänglichen Infektion wurden getrennte und deutliche Kolonien beobachtet. Diese Kolonien gediehen und zeigten im Vergleich zu nicht-infizierten BHK-Zellkontrollen keinen morphologischen Hinweis auf CPE. Innerhalb von 3–4 Wochen wurden die Zellkolonien groß und mit dem nackten Auge wahrnehmbar. Die Kolonien wurden mit Clonierungsringen isoliert, und die Zellen wurden entweder mit 3 mM EDTA oder Trypsin dispergiert. Die dispergierten Zellen von jeder Kolonie wurden ohne Verdünnung wieder plattiert. Danach wurden die Zellen beim Erreichen der Konfluenz, im Allgemeinen innerhalb von vier Tagen, in einer 1:10-Verdünnung subkultiviert. Aliquots der Zellen, bezeichnet als BHK(SIN-1), wurden nach der fünften Passage für eine Langzeit-Lagerung in flüssigem Stickstoff in Kryoröhrchen präpariert. BHK(Sin-1)-Zellen waren von den ursprünglichen, nicht-infizierten BHK-Zellen in Bezug auf die Wachstumsrate oder Morphologie nicht unterscheidbar.
B. Molekulares Clonieren von SIN-1
Um die Mutation(en) im Sindbis-Genom zu charakterisieren, die mit der Entwicklung der wesentlich reduzierten Cytopathogenität von SIN-1 korrelieren, wurde genomische RNA von SIN-1-Virionen isoliert, revers transkribiert, und die resultierende cDNA, die die Nichtstrukturprotein-Gene umspannt, sequenziert, wie unten vollständiger beschrieben.
Kurz, das SIN-1-Virus wurde vor der Herstellung eines Bestands, der für die Isolierung von RNA verwendet wurde, dreimal plaquegereinigt. Die BHK(SIN-1)-Zellen wurden, wie oben beschrieben, gezüchtet, die Kulturflüssigkeit wurde gewonnen, und verschiedene Verdünnungen wurden verwendet, um primäre Hühnerembryofibroblasten-Einzelzellschichten (CEF, gezüchtet in minimalem essenziellem Medium, angereichert mit 3% fötalem Kälberserum) zu infizieren. Nach der Infektion wurde Medium, enthaltend 0,5% Edelagar, zu den Einzelzellschichten zugefügt. Zusätzlich kann DEAE-Dextran (100 μg/ml) in das Agar-Überschichtungsmedium eingeschlossen werden, um die Größe der SIN-1-Plaques zu erhöhen. Individuelle, diskrete Plaques wurden nach 3 Tagen der Inkubation bei 30°C in Platten, die mit geeignet verdünnten Inokula der BHK(SIN-1)-Kulturflüssigkeit infiziert wurden, beobachtet. Nach der dritten Runde der Reinigung wurde das clonierte SIN-1-Virus einmal bei 30°C in CEF-Zellen passagiert, die bei einer MOI = 0,1 infiziert wurden. Es wurde durch den Interferenz-Test und eine RNA-Analyse in infizierten BHK-Zellen, wie oben beschrieben, festgestellt, dass die Plaque-gereinigten SIN-1-Virus-Präparationen frei von DI-Partikeln waren.
Die BHK-Zellen wurden mit dem Plaque-gereinigten SIN-1-Bestand infiziert (MOI = 10), um die Fähigkeit dieses varianten Wildtyp-Sindbis-Virusstamms, eine Persistenz zu etablieren, zu bestimmen. Wie oben beschrieben, erfordert das Etablieren einer persistenten Infektion in BHK-Zellen mit Wildtyp-Sindbis-Virus das Vorliegen von DI-Partikeln in der Viruspräparation und eine beträchtliche Zeit, um jenen wenigen überlebenden Zellen zu erlauben, auszuwachsen. Im Gegensatz dazu wurde in BHK-Zellen, die bei 37°C mit der SIN-1-Variante infiziert wurden, leicht eine persistente Infektion etabliert, ob DI-Partikel im Virus-Inokulum vorhanden waren oder nicht. Sechs Tage nach der Infektion mit SIN-1 waren die BHK-Zellen vollständig resistent gegen eine Superinfektion mit Wildtyp-Sindbis-Virus, was die Etablierung einer persistenten Infektion zeigt. Dennoch waren diese Zellen empfänglich für eine Infektion durch das heterologe Virus VSV, was zeigt, dass Interferon nicht in die Etablierung einer persistenten SIN-Infektion involviert ist.
Die CEF-Zellen wurden mit dem Plaque-gereinigten SIN-1-Bestand infiziert (MOI = 10), um einen Hoch-Titer-Bestand des Virus für die Isolierung von RNA herzustellen. 90 ml Kulturflüssigkeit (2 × 10¹⁰ PbE/ml) wurden durch Zentrifugation für 5 min bei 2500 UpM in einem Sorvall GSA-Rotor geklärt. Das SIN-1-Virus wurde von der geklärten Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation in einem SW27.1-Rotor für 2 h bei 24000 UpM bei 4°C pelletiert. Das Viruspellet wurde dann in 3 ml Kulturmedien resuspendiert, durch wiederholtes Pipettieren homogenisiert und oben auf einen 25–40% (Gew./Gew.) Saccharose-Gradienten geschichtet. Diesem folgte eine Zentrifugation in einem SW27.1-Rotor für 4 h bei 24000 UpM bei 4°C. Die Virusbande wurde mit Glühlampenlicht-Beleuchtung betrachtet und mit einer 22 Gauge-Nadel/Spritze gewonnen. Die RNA wurde weiter durch Proteinase K (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)-Verdau (56°C, 1 h) gereinigt, gefolgt von einer Extraktion mit einem gleichen Volumen von H₂O-gesättigtem Phenol:Chloroform (1:1 V/V, pH 7,0), gefolgt von einer Präzipitation mit 2 Volumina Ethanol und 0,3 M Natriumacetat, pH 5,2.
Alternativ kann das SIN-1-Virus weiter durch Polyethylenglycol-Präzipitation von infizierten BHK-Zellkulturmedien (Strauss et al. Virology 133: 154-168, 1976) oder alternativ durch Pelletieren durch ein Saccharosekissen gereinigt werden (Polo et al. J. Virol. 62: 2124-2133, 1988).
Zwei Runden der Erststrang-cDNA-Synthese wurden mit der gereinigten viralen RNA unter Verwendung des murinen Moloney-Leukämievirus oder der reversen SuperScript II-Transkriptase (Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland) gemäß den empfohlenen Bedingungen des Herstellers durchgeführt. Sechs getrennte Reaktionen wurden unter Verwendung der Sindbis-Virus-spezifischen Primer, die komplementär zum unten gezeigten positiven Strang sind (die Primer werden mit R bezeichnet), durchgeführt. Alle mit R bezeichneten Primer wurden vor der Synthesereaktion des ersten Strangs an ihrem 5'-Ende mit Polynucleotidkinase (New England Biolabs) phosphoryliert, um das Clonieren zu ermöglichen.
Die Synthese des zweiten Strangs der cDNA-Matrize oben wurde in sechs getrennten Reaktionen mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (New England Biolabs, Beverly, MA) gemäß den empfohlenen Bedingungen des Herstellers erreicht. Sindbis-Virus-spezifische Primer, die komplementär zum negativen Strang sind (die Primer mit F bezeichnet, oben gezeigt) sind, wurden verwendet. Die doppelsträngigen DNA-Produkte wurden stufenweise für die entsprechenden Regionen im Plasmid Toto1101 substituiert, das das Volllängen-Sindbis-Virusgenom enthält (Rice et al., J. Virol, 61: 3809-3819, 1987). Zum Beispiel wurde das T7/1F-1465R-Produkt mit SacI und Eco47III verdaut und in das SacI/Eco47III-verdaute und CIAP-behandelte Toto1101-Plasmid inseriert, das vom kleinen SacI/Eco47III-Fragment (SP6-Promotor, Sindbis-Virus nt, 1-1407) durch 1% Agarose/TAE (50X/Liter: 242 g Tris-Base/57,1 ml Eisessig/100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0)-Elektrophorese und GENECLEAN II weggereinigt wurde. Dieses Konstrukt wurde dann mit Eco47III und AvrII (Sindbis-Virus nt-Nr. 1407 beziehungsweise 4281) verdaut, mit CIAP behandelt, worauf eine Insertion des 3300 bp-Fragments folgte, das vom 1003F-4303R-Produkt isoliert wurde, das mit Eco47III und AvrII verdaut wurde. Der vollständig zusammengesetzte Clon wird als pRSIN-1g bezeichnet (g als eine Bezugnahme zum genomischen Volllängen-Clou) und enthielt alle 11703 bp des viralen Genoms. Eine Untergruppe der Primer, die in der Tabelle oben aufgelistet sind, stellt überflüssige doppelsträngige DNA-Reaktionsprodukte im SIN-1-Genom her. Zum Beispiel liegen die Sequenzen im 4051F/8115R-Produkt innerhalb des 1680F/8115R-Produkts. Diese überflüssigen Produkte werden als Konstruktions-Alternativen für den genomischen SIN-1-Clon bereitgestellt; d. h. im Allgemeinen ist die Wirksamkeit des cDNA-Clonierens umgekehrt proportional zu der Länge des erwünschten Fragments.
Um Teile des viralen Genoms, die nicht durch das obige Verfahren erhalten werden, zu clonieren, wurde das virale SIN-1-RNA-Genom durch reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) cloniert. Die Synthese des ersten Strangs wurde erreicht, wie oben beschrieben. PCR-Amplifikationen der Sindbis-cDNA mit den oben gezeigten Primerpaaren wurden als getrennte Reaktionen unter Verwendung des Klentaql-Enzyms und den Reaktionsbedingungen, wie in Barnes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216-2220, 1940) beschrieben, durchgeführt. Alternativ wurde das Klentaq 1-Enzym unter Verwendung eines Puffers, enthaltend 1,5 mM MgCl₂, der durch den Vertreiber bereitgestellt wurde, mit der hitzestabilen Thermalase-DNA-Polymerase (Amresco Inc., Solon, OH) substituiert. Alternativ wurde die hitzestabile Vent_R-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) in den Amplifizierungsreaktionen verwendet. Zusätzlich enthielten die Reaktionen 5% DMSO und „HOT START WAX"-Kugeln (Perkin-Elmer). Das verwendete PCR-Amplifizierungsprotokoll ist unten gezeigt (Die 72°C-Extensionsinkubationsperiode wurde auf 1 min pro 1 kb der Matrizen-DNA angepasst):

Temperatur (°C) Zeit (Min.) Anzahl d. Zyklen

(a) 95 2 1

(b) 95 55 72 0.5 0.5 3.5 35

(c) 72 10 1
Alternativ kann das Clonieren des Volllängen-SIN-1-RNA-Genoms ähnlich zu den Verfahren, die früher beschrieben worden sind (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996) durchgeführt werden. Kurz, die Synthese des ersten Strangs der cDNA wird mit einem Gemisch von zufälligen Hexamer-Primern (50 ng/ml Reaktionskonzentration) (Invitrogen, San Diego, Kalifornien) und Primer 4B erreicht, dessen Sequenz in der Tabelle unten gezeigt ist. Die Sindbis-Virus-SIN-1-Varianten-cDNA von genomischer Länge wird dann durch PCR amplifiziert. Sechs deutliche Segmente unter Verwendung von sechs Paaren von überlappenden Primern sind ausreichend, um das gesamte Genom zu clonieren. Zusätzlich zu den viralen komplementären Sequenzen enthält der Vorwärtsprimer des SIN-1-5'-Endes eine 19 Nucleotid-Sequenz, die dem bakteriellen SP6-RNA-Polymerase-Promotor entspricht, und die ApaI-Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz, verknüpft mit seinem 5'-Ende. Die bakterielle SP6-RNA-Polymerase wird so eingesetzt, dass eine Transkription in vitro im Einschließen von nur einem einzelnen nicht-viralen G-Ribonucleotid resultiert, das mit dem A-Ribonucleotid, welches dem authentischen Sindbis-Virus-5'-Ende entspricht, verknüpft ist. Der Einschluss der ApaI-Erkennungssequenz ermöglicht die Insertion des PCR-Amplikons in die Plasmidvektor pKS II⁺ (Stratagene, La Jolla, Kalifornien)-Polylinkersequenz. Eine 5 Nucleotid-„Puffersequenz"-Ausdehnung ist auch stromaufwärts der ApaI-Erkennungssequenz gebunden, um einen wirksamen Enzymverdau zu ermöglichen.
Die Sequenzen des SP6-5'-SIN-1-Vorwärtsprimers und aller Primerpaare, die nötig sind, um das gesamte SIN-1-Genom zu amplifizieren, sind in der Tabelle unten gezeigt. (Merke, dass „nt” und „nts", wie hierin nachstehend angewendet, „Nucleotid" beziehungsweise „Nucleotide" bezeichnen). Die Bezugssequenz (GenBank- Zugangsnr. J02363, Locus: SINCG) stammt von Strauss et al., Virology 133: 92-110, 1984).
PCR-Amplifikationen von Sindbis-cDNA mit den oben gezeigten Primerpaaren werden als getrennte Reaktionen unter Verwendung der Thermalase oder Vent_R-DNA-Polymerase (oben zitiert), der Reaktionsbedingungen und der PCR-Amplifizierungsbedingungen, wie oben beschrieben, durchgeführt.
Die Regionen der Sequenzüberlappung zwischen den Amplifikationsprodukten entsprechen einmaligen Enzym-Erkennungsstellen im PCR-Amplikon. Die PCR-Produkte werden gereinigt (QIAquick PCR-Reinigungskit, Qiagen, Chatsworth, Kalifornien) und schrittweise in den pKS II⁺-Vektor zwischen die ApaI- und XbaI-Stellen inseriert. Der vollständig zusammengesetzte Clon wird als pKSRSIN-1g bezeichnet (g als eine Bezugnahme zum genomischen Volllängen-Clon) und enthält alle 11703 bp des viralen Genoms.
C. Sequenz des SIN-1-Phänotyps

Die SIN-1-spefizifischen Nucleotidsequenzen des pRSIN-1g-Clons wurden durch das Didesoxy-Kettenterminierungsverfahren bestimmt. Ein Sequenzvergleich von 8000 bp der viralen Sequenz ergab mehrere Unterschiede zwischen dem hierin beschriebenen SIN-1-Clon und der Sindbis-Virus (Stamm HRsp)-Sequenz, die in GenBank bereitgestellt wird (GenBank-Zugangsnr. J02363, Locus: SINCG). Unterschiede in der Sequenz zwischen SIN-1 (6), SINCG (7) und Toto1101 (8) werden unten präsentiert.

nt. Position	Gen	SINCG		Toto1101		SIN-1
		nt	aa	nt	aa	nt	aa
45	5'NTR	T	-	T	-	C	-
120	nsP1	C	Gln	C	Gln	A	Lys
1775	nsP2	G	null	G	null	A	null
1971	nsP2	T	Phe	T	Phe	C	Leu
2992	nsP2	C	Pro	T	Leu	T	Leu
3579	nsP2	A	Lys	G	Glu	G	Glu
3855	nsP2	C	Pro	C	Pro	T	Ser
3866	nsP2	C	null	C	null	T	null
4339	nsP3	A	Glu	A	Glu	T	Val
4864	nsP3	C	Ser	C	Ser	T	Phe
5702	nsP3	A	null	T	null	T	null
5854*	nsP4	G	Arg	G	Arg	A	His
7612	Verbindung	A	-	A	-	T	-
7837	Capsid	C	Arg	C	Arg	T	Cys

*Diese Mutation wurde in einem cDNA-Clon gefunden. Sie wurde nicht nachgewiesen, wenn die Sin-1-Virus-RNA sequenziert wurde. Sie repräsentiert wahrscheinlich eine unbedeutende Spezies in der RNA-Population.

Die Bestätigung, dass die Sequenzänderungen einmalig für den hierin beschriebenen Clon waren (und nicht ein Ergebnis eines Clonierungs-Artefakts), wurde durch Amplifizieren der SIN-1-Virion-RNA durch RT-PCR, wie oben beschrieben, Erstellen der Sequenz, die die in Frage kommenden Nucleotide enthält, durch direktes Sequenzieren des RT-PCR-Amplikon-Produkts und Vergleichen der Sequenz mit der entsprechenden SIN-1-Sequenz bestimmt.
D. Charakterisierung und genetisches Kartieren des SIN-1-Phänotyps mit molekularen Clonen:

Verschiedene Regionen des SIN-1-Genoms wurden für die entsprechenden Wildtyp-Sindbis-Virusregion im Toto1101-Plasmid substituiert (Rice et al., J. Virol. 61: 3809-3819, 1987), um die Lokalisation des Phänotyps für die Etablierung der Persistenz zu kartieren. Die verschiedenen SIN-1-nsP-Gene wurden in den Toto 1101-Wildtyp-Sindbis-Virus-Hintergrund unter Verwendung von Restriktionsenzym-Fragmenten substituiert, die von pRSIN-1g gereinigt wurden, wie in der Tabelle unten illustriert.

nsP-Gen	Restriktionsfragment	Nucleotid-Koordinaten	Clon-Bezeichnung
nsP1	PleI/Eco 47III	98-1407	pRSIN-1nsP1
nsP2	Eco47III/AvrII	1407-4281	pRSIN-1nsP2
nsP2-N-Terminus	Eco47III/BglII	1407-2289	pRSIN-1nsP2-N
nsP2-C-Terminus	BglII/AvrII	2289-4281	pRSIN-1nsP2-C
nsP3-4	AvrII/EcoRI	4281-5870	pRSIN-1nsP3
nsP3	AvrII/SpeI	4281-5262	pRSIN-1nsP3
nsP4	SpeI/AatII	5263-5870	pRSIN-1nsP4
nsP1-4	PleI/AatII	98-8000	pRSIN-1nsP1-4

Die Koordinaten der Nichtstrukturgen-codierenden Regionen werden in der folgenden Tabelle geliefert:

nsP-Gen Koordinaten des Sindbis-Virusgenoms (nt. Nr.)

nsP1 60-1680

nsP2 1680-4101

nsP3 4101-5769

nsP4 5769-7597

nsP1-4 60-7597

Die verschiedenen SIN-1-, Toto- und chimären SIN-1/Toto-Clone pRSIN-1g, Toto, pRSIN-1nsP1, pRSIN-1nsP2, pRSIN-1nsP2-N, pRSIN-1nsP2-C, pRSIN-1nsP3, pRSIN-1nsP4 und pRSIN-1nsP1-4 wurden durch Verdau mit XhoI linearisiert, das in den cDNA-Clonen einen einzigen Schnitt unmittelbar benachbart und stromabwärts eines 21 Nucleotid-Poly-dA:dT-Bereichs, der dem Sindbis-Virus-3'-Ende folgt (virales nt. 11703) macht. Die linearisierten Clone wurden mit GENECLEAN II (BIO 101, La Jolla, Kalifornien) gereinigt und auf eine Konzentration von 0,5 μg/μl eingestellt. Die Transkription der linearisierten Clone wurde in vitro bei 40°C für 90 Minuten gemäß den folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt: 2 μl DNA/4,25 μl H₂O; 10 μl 2,5 mM NTPs (UTP, ATP, GTP, CTP); 1,25 μl 20 mM Me7G(5')ppp(5')G-Kappen-Analog; 1,25 μl 100 mM DTT; 5 μl 5 × Transkriptionspuffer (Promega, Madison, Wisconsin); 0,5 μl RNasin (Promega); 0,25 μl 10 μg/μl Rinderserumalbumin; und 0,5 μl T7-RNA-Polymerase (Promega). Die in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukte wurden mit DNase I (Promega) verdaut, durch sequenzielle Phenol:CHCl₃- und Ether-Extraktion gereinigt, gefolgt von Ethanol-Präzipitation. Alternativ können die in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukte direkt für die Transfektion verwendet werden. Die in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukte oder gereinigte RNA bildeten mit einer kommerziellen kationischen Lipidverbindung (LIPOFECTIN, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) einen Komplex und wurden auf Baby-Hamsternieren-21 (BHK-21)-Zellen aufgetragen, die in einer 60 mm-Petrischale bei 75% Konfluenz gehalten wurden. Alternativ wurden BHK-Zellen mit den in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukten oder der gereinigten RNA durch Elektroporese behandelt, genau wie früher beschrieben (Liljestrom, Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991). Die transfizierten Zellen wurden bei 37°C inkubiert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Kulturmedien gewonnen, und der Titer jedes Virus wurde durch Plaque-Test bestimmt, wie oben beschrieben. Der titrierte Virusbestand, der von diesen in vitro-Transkription-Reaktionen abgeleitet wurde, wurde bezeichnet, wie in der Tabelle unten gezeigt.

Clon-Bezeichnung	Virus-Bezeichnung
pRSIN-1nsP1	SIN-1nsP1
pRSIN-1nsP2	SIN-1nsP2
pRSIN-1nsP2-N	SIN-1nsP2-N
pRSIN-1nsP2-C	SIN-1nsP2-C
pRSIN-1NSp3-4	SIN-1nsP3-4
pRSIN-1nsP3	SIN-1nsP3
pRSIN-1nsP4	SIN-1nsP4
pRSIN-1nsP1-4	SIN-1nsP1-4
Toto 1101	Toto

Um den persistenten SIN-1-Phänotyp zu kartieren, wurden 8 × 10⁵ BHK-Zellen mit jedem der oben hergestellten Virusbestände infiziert (MOI = S). Drei Tage nach der Infektion wurde die Kultur-Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Farbstoff-Ausschluss bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments (unten gezeigt) zeigen, dass der SIN-1-Phänotyp des Etablierens von persistenten, nicht zellzerstörenden Infektionen auf die Nichtstrukturgene und insbesondere auf das nsP2-Gen kartiert. Die Zahl der Zellen in der Schein-infizierten Kultur repräsentiert ein fortgesetztes Wachstum dieser Zellen, bis sie die stationäre Phase erreichten. 3 dpi waren alle Zellen, die mit SIN-1nsP1, SIN-1nsP3, SIN-1nsP3-4 und SIN-1nsP4 infiziert wurden, abgestorben.
Die Zellen, die die Infektion mit SIN-1nsP2 und SIN-1nsP1-4 überlebten, fuhren fort zu wachsen und waren basierend auf der Färbung mit Antikörpern, die spezifisch für Sindbis-Virus sind, persistent infiziert.

Virus Anzahl der Zellen 3 dpi

SIN-1nsP1 0

SIN-1nsP2 3 × 10⁵

SIN-1nsP3-4 0

SIN-1nsP3 0

S1N-1nsP4 0

SIN-1nsP1-4 5 × 10⁵

Toto 0

Schein 1 × 10⁷
Wie oben gezeigt, kartiert der beobachtete SIN-1-Phänotyp, der nicht zellzerstörende persistente Infektionen etabliert, auf die viralen nsPs im Gegensatz zu den sPs. Diese Schlussfolgerung wurde deutlich durch den Vergleich der Zell-Überlebensspiegel zwischen Kulturen, die mit den Toto- oder SIN-1nsP1-4-Virusbeständen infiziert wurden, gezeigt. Sowohl die Toto- als auch die SIN-1nsP1-4-Viren enthalten die Wildtyp-sPs; ein Zell-Überleben wurde jedoch nur in jenen Kulturen beobachtet, die mit dem Virus (SIN-1nsP1-4) infiziert wurden, das nsPs enthält, die vom SIN-1-Clon stammten. In diesen Experimenten war das Zell-Überleben nicht abhängig von der Quelle der Sindbis-Virus-sPs. Es ist wichtig, dass der SIN-1-Phänotyp weiter auf nsP2 kartiert wurde. Der Spiegel des Zell-Überlebens war vergleichbar zwischen den Kulturen, die mit den SIN-1nsP1-4- oder SIN-1nsP2-Viren infiziert wurden. Weiterhin ist ein C → T-Übergang beim Nucleotid 3855 im SIN-1 nsP2-Gen verantwortlich für den charakteristischen Phänotyp, der eine persistente Infektion etabliert, in Zellen, die mit dem SIN-1-Virus infiziert wurden. Die einzelne Prolin zu Serin-Änderung im nsP2-Protein, das in Zellen produziert wird, die mit dem chimären Virus SIN-1nsP2-C infiziert wurden, war das einzige, das benötigt wurde, um den Wildtyp-Sindbis-Virus (Toto 1101) von einem Virus, das alle infizierten Zellen abtötete, zu einem Virus zu konvertieren, das es vielen der infizierten Zellen erlaubte, zu überleben und fortzufahren, Virus zu produzieren. Die Phänotypen von chimären Viren, die von der Insertion der SIN-1 nsP1-, nsP3- oder nsP4-Gene in den Toto-Hintergrund stammten, waren nicht unterscheidbar vom Wildtyp, und eine vollständige Lyse wurde in Kulturen beobachtet, die mit diesen Viren infiziert wurden.
Die mögliche Wirkung von Aminosäure-Änderungen in den SIN-1 nsPs auf den Spiegel einer produktiven Infektion in BHK-Zellen wurde durch Vergleichen des Virusertrags im Zeitverlauf in BHK-Zellen, die mit den verschiedenen SIN-1-, Wildtyp (Toto)- oder chimären SIN-1/Toto-Stämmen beimpft wurden, bestimmt. Kurz, BHK-Zellen wurden mit SIN-1 (oben beschriebener Plaque-gereinigter Bestand)-, Toto-, SIN-1nsP1-4- oder SIN-1nsP2-Viren infiziert (MOI = 20), und die Kulturflüssigkeiten wurden 3, 6, 9, und 12 Stunden nach der Infektion gewonnen. Die Titer des Virus in den Kulturflüssigkeiten wurden dann durch Plaque-Test bestimmt, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse dieser Untersuchung, die in 2 gezeigt sind, zeigen, dass äquivalente Spiegel des Virus in BHK-Zellen, die mit den Wildtyp- oder SIN-1-Stämmen infiziert wurden, produziert wurden. Die tatsächlichen Virustiter zum 12 hpi-Zeitpunkt sind in der Tabelle unten dargelegt. Mehr als die Hälfte der BHK-Zellen überlebte die Infektion mit dem SIN-1-Virus (und den chimären Viren, die SIN-1nsPs1-4 oder SIN-1 nsP2 enthielten) in Kombination mit Spiegeln der Virusproduktion, die äquivalent zu den Wildtyp-Stämmen waren.

Virus Titer PbE/ml) bei 12 hpi (× 10⁹)

SIN-1 3.6

Toto 2.7

SIN-1nsP1-4 1.8

SIN-1nsP2 2.6
Die mögliche Wirkung von Aminosäure-Änderungen in den SIN-1 nsPs auf den Spiegel der viral-spezifischen RNA-Synthese wurde durch Vergleichen des Spiegels der [³H]Uridin-Inkorporation im Zeitverlauf in BHK-Zellen, die mit den verschiedenen SIN-1-, Wildtyp (Toto)- oder chimären SIN-1/Toto-Stämmen beimpft wurden, bestimmt. BHK-Zellen (3 × 10⁵ Zellen/35 mm-Schale) wurden bei 37°C gemäß den hierin beschriebenen Bedingungen gezüchtet. Die Zellen wurden mit SIN-1-, Toto1101-, SIN-1nsP1-4- oder SIN-1nsP2-Viren infiziert (MOI = 20). 30 min nach der Infektion wurde das Kulturmedium auf 1 μg/ml Actinomycin D angepasst. Nach einer Inkubation für weitere 30 min wurde das Kulturmedium auf 10 μCi/ml [³H]Uridin eingestellt. Bei 3, 6, 9 und 12 hpi wurden die behandelten Zellen mit PBS gewaschen und durch Zugabe von 200 μl TTE-Puffer (0,2% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) lysiert. Die RNA wurde bei 4°C durch Zugabe von 200 μl einer 25% Trichlor-Essigsäure(TCA)-Lösung präzipitiert. Die RNA wurde durch Mikrozentrifugation für 5 min bei 14000 UpM pelletiert, einmal mit 5% TCA gespült und in einer Lösung, bestehend aus 50 mM NaOH/0,1% SDS, bei 55°C gelöst. Die Lösung, enthaltend die gelöste RNA, wurde in Szintillationsröhrchen übertragen, und der Spiegel des inkorporierten [³H]Uridin wurde unter Verwendung einer EcoLume (ICN, Irvine, Ka.)-Szintillationsflüssigkeit bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung, gezeigt in 3, zeigen, dass die Spiegel der virus-spezifischen RNA in BHK-Zellen, die mit SIN-1 infiziert wurden, im Vergleich zum Wildtyp-Virus dramatisch niedriger waren. Dieser Phänotyp des niedrigen Spiegels von virus-spezifischer RNA-Synthese kartiert auf die nsPs, wie durch die äquivalent niedrigen Spiegeln von RNA, die in BHK-Zellen produziert werden, die mit den SIN-1- oder SIN-1nsP1-4-Stämmen infiziert wurden, im Vergleich zum Wildtyp gezeigt wurde.

Virus [³H]Uridin-Inkorporation (× 10³ ZpM)

SIN-1 22

Toto1101 86

SIN-1nsP1-4 28

SIN-1nsP2 62

Schein 8

Die virusspezifische RNA-Synthese in infizierten BHK-Zellen wurde auch unter Verwendung eines jeden der SIN-1-, Toto- und chimären SIN-1/Toto-Stämme bestimmt. Die Spiegel der [³H]Uridin-Inkorporation im Vergleich zur Wildtyp-Infektion (Toto) bei 9 hpi sind in 4 gezeigt und in der Tabelle unten angegeben.

Virus	Zahl der Experimente	Relative RNA-Synthese-Spiegel	Standardabweichung
Toto1101	9	1.0
SIN-1	9	0.1	±0.1
STN-1nsP1-4	8	0.2	±0.1
SIN-1nsP1	7	1.0	±0.2
SIN-1nsP2	8	0.6	±0.1
SIN-1nsP3	4	1.0	±0.0
SIN-1nsP3-4	7	0.4	±0.1
SIN-1nsP4	6	0.8	±0.1
SIN-1nsP2-N	1	0.9
SIN-1nsP2-C	3	0.6	±0.2
Schein	9	0.0

Daher überleben BHK-Zellen eine Infektion mit SIN-1-Virus (und den chimären Viren, die SIN-1nsP1-4 oder SIN-1nsP2 enthalten), werden in BHK-Zellen SIN-1-Virusspiegel, die äquivalent zu den Wildtyp-Stämmen sind, produziert, und ist der Spiegel der synthetisierten viral-spezifischen RNA 10-fach niedriger im Vergleich zum Wildtyp-Virus.
Die mögliche Wirkung von Aminosäure-Änderungen in den SIN-1 nsPs auf den Spiegel der Inhibition der Wirtszell-Proteinsynthese wurde durch Vergleichen des Spiegels der Proteinsynthese im Verhältnis zu nicht-infizierten Zellen über einen Zeitraum in BHK-Zellen, die mit den verschiedenen SIN-1-, Wildtyp (Toto)- oder chimären SIN-1/Toto-Stämmen beimpft wurden, bestimmt. Kurz, 35 mm-Schalen, in die 2 × 10⁵ BHK-Zellen ausgesät wurden, wurden mit den verschiedenen Sindbis-Virusstämmen in einem 0,5 ml-Virusinokulum in einem Puffer, bestehend aus PBS/1% fötales Kälberserum, infiziert (MOI = 20). Die Platten wurden bei 4°C für 1 h unter kontinuierlichem, sanftem Schwenken inkubiert. Das Inokulum wurde durch 2 ml Medium, das vorher beschrieben wurde, enthaltend 10% fötales Kälberserum, ersetzt, und die Schalen wurden in einen CO₂-Brutschrank bei 37°C platziert. 5, 8 und 11 h später wurden die Medien durch 2 ml MEM ohne Methionin (Met-) mit 2% fötalem Kälberserum ersetzt und 30 min inkubiert. Das Medium wurde dann durch 1 ml MEM (Met-), enthaltend 2% fötales Kälberserum und 10 μCi/ml [³⁵S]Methionin, ersetzt. Nach einer 30 min-Inkubationsdauer bei 37°C wurde 1 ml Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, zu jeder Vertiefung zugefügt, und die Schalen wurden für weitere 30 min bei 37°C inkubiert. Diese Verdünnung ist ausreichend, um eine weitere Inkorporation der radioaktiven Markierung in das Protein zu inhibieren, und senkt den Hintergrund des freien [³⁵S]-Methionins, der in Polyacrylamid-Gelen nachgewiesen wird, signifikant. Das Medium wurde dann von der Vertiefung entfernt. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, von der Schale in PBS geschabt, durch Zentrifugation pelletiert und in 25 μl Ladepuffer (0,06 M Tris-HCl, pH 6,7, 2% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, 5% Glycerin, 0,05% Bromphenolblau) gelöst. Ein Fünftel der Probe wurde auf dem Gel analysiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Coomassie-Brilliantblau R gefärbt, getrocknet und autoradiographiert. Die Raten der Inhibition der Wirtszellen-Proteinsynthese wurden durch Quantifizieren der Menge der Radioaktivität im Abschnitt des Gels, der nur Wirts-Proteine enthielt, verglichen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in 5 gezeigt und zeigen, dass der Spiegel der Inhibition der Wirtszellen-Proteinsynthese in SIN-1-Virus-infizierten Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Virus-infizierten Zellen signifikant niedriger ist, insbesondere bei den früheren 6 und 9 Stunden-Zeitpunkten nach der Infektion.
Zusammenfassend überleben BHK-Zellen eine SIN-1-Infektion, Virusspiegel, die äquivalent zu Wildtyp-Stämmen sind, werden in BHK-Zellen produziert, der Spiegel der synthetisierten viral-spezifischen RNA ist zehnfach niedriger als Wildtyp-Virus, und der Spiegel der Inhibition der Wirtszellen-Proteinsynthese in SIN-1-Virus-infizierten Zellen ist im Vergleich zu Wildtyp-Virus-infizierten Zellen signifikant niedriger. Die Phänotypen des hierin beschriebenen SIN-1-Virus kartieren auf die viralen nsP-Gene.
BEISPIEL 2
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON POSITIVSTRANG-RNA-VIREN, DIE EINE REDUZIERTE INHIBITION DER WIRTS-MAKROMOLEKÜLSYNTHESE ZEIGEN
Das Ableiten von Virusvarianten, die die erwünschten Phänotypen einer reduzierten, verzögerten oder keiner Inhibition der Wirtszell-Makromolekülsynthese zeigen, ist abhängig von der Herstellung, Charakterisierung und Isolierung von Sequenzen, die sich von jenen des Wildtyp-Virus unterscheiden. Mit der Ausnahme von Beispiel 1 gibt es jedoch keine offensichtlichen oder früher offenbarten Verfahren, um auf codierende oder nicht-codierende virale Sequenzänderungen zu selektieren oder diese zu identifizieren, die in einer Änderung dieser Virus-basierten Inhibition der Makromolekülsynthese oder der Herstellung von Viren resultieren, die zu einer persistenten und nicht zu einer lytischen Infektion führen. Dieses Beispiel liefert spezifische Verfahren, die es einem ermöglichen, diese Hindernisse zu überwinden.
A. Biologische Selektion von Virusvarianten
Das biologische Ableiten von Virusvarianten, die in einer reduzieren, verzögerten oder keiner Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese resultieren oder die persistente Infektionen etablieren, kann durch Erlauben einer natürlichen, spontanen Mutation in einer Zelle oder zuerst Aussetzen des erwünschten Virusbestands gegenüber einer physikalischen, chemischen oder anderen künstlichen Mutagenese, gefolgt von einer Infektion von empfänglichen Zellen und schrittweisen Anreicherungen auf jene Zellpopulationen, die das mutierte Virus beherbergen, durchgeführt werden. Es ist möglich, dass eine vorherige Mutagenese, obwohl sie nicht notwendig ist, die Herstellung von geeigneten Mutationen erleichtern wird. Die Selektion basiert auf der Fähigkeit der Zellen, die mit der erwünschten Variante infiziert werden, für signifikant längere Zeiträume als die Wildtyp-Virus-infizierten Zellen zu überleben. Das folgende Beispiel liefert detailliert Verfahren unter Verwendung des Sindbis-Virus als ein Beispiel; dennoch kann es leicht durch andere Viren substituiert werden, wie in der detaillierten Beschreibung angemerkt.
Genau wird im Fall einer chemischen Mutagenese eine Sindbis-Virusbestands-Suspension mit einem Titer von mehr als oder gleich 10⁹ PbE/ml mit Nitrosoguanidin in einer Endkonzentration von 100 μg/ml behandelt. Nach 15 Minuten bei Zimmertemperatur wird das Nitrosoguanidin durch Dialyse bei 4°C entfernt, und der mutagenisierte Bestand wird danach für eine Infektion verwendet. Ungefähr 5 × 10⁶ Zellen des erwünschten Typs (zum Beispiel BHK-21), gezüchtet in einer flachen Bestandskultur, werden mit dem mutagenisierten Virus bei einer Multiplizität der Infektion (M. O. I.) von ungefähr 5 infiziert, um sicherzustellen, dass jede Zelle infiziert wird. 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der Infektion wird die Zelleinzelschicht zweimal mit frischem Medium gewaschen, um tote Zellen zu entfernen, und durch Medien, bestehend aus einem Gemisch von 50% frischen Medien und 50% konditionierten Medien, ersetzt. Zu einer gewünschten Zeit nach der Infektion (zum Beispiel 72 Stunden) werden die verbleibenden Zellen sanft trypsinisiert, um sie von der Kulturschale zu lösen und jegliches zellassoziierte extrazelluläre Virus zu entfernen, das dann von den Zellen durch Differenzial-Zentrifugation getrennt wird. Die verbleibenden Zellen werden dann direkt wieder in eine Gewebekulturschale, enthaltend eine semi-konfluente, nicht-infizierte Zelleinzelschicht, in einem Verhältnis von 1 infizierten Zelle pro alle 10³ nicht-infizierten Zellen ausgesät. Zusätzliche Runden der Selektion werden durch Aussäen auf nicht-infizierte Zellen zur Amplifizierung, gefolgt von den obigen Wasch- und Ernteschritten, durchgeführt. Alternativ können die anfänglichen Infektionen unter Verwendung eines Wildtyp-Virusbestands bei einer niedrigen M. O. I. durchgeführt werden, was eine spontane Mutation während der Replikation in der Zelle erlaubt. Unter Verwendung dieses Ansatzes wird eine heterogene Population von mutiertem Virus durch die infizierten Zellen produziert. In jenen Fällen, in denen die Population der infizierten Zellen, die nach der Trypsinierung gewonnen wird, eine signifikante Zahl von nicht lebensfähigen oder schwer geschädigten Zellen enthält, wird eine kurze Behandlung (5 Minuten bei Zimmertemperatur) mit 0,75% NH₄Cl in 17 mM Tris (pH 7,65 mit HCl) oder eine Zentrifugation durch Percoll^TM, um verbleibende tote oder geschädigte Zellen zu entfernen, vor dem Wieder-Aussäen auf nicht-infizierte Zelleinzelschichten eingeschlossen. Nach einem Minimum von zwei aufeinanderfolgenden Runden der Selektion werden Virusvarianten, die den erwünschten Phänotyp zeigen, durch limitierende Verdünnung oder Plaque-Reinigung isoliert und, wie im Beispiel 1 beschrieben, einer cDNA-Clonierung unterzogen. Die Isolierung und Charakterisierung von spezifischen Sequenzen, die für den varianten Phänotyp verantwortlich sind, werden durch Substitution von definierten Regionen der cDNA in einen genomischen Clon oder Expressionsvektor und Testen auf die begleitende phänotypische Änderung erreicht, wie in den Beispielen behandelt.
B. Genetische Selektion von Virusvarianten
In einem verwandten Ansatz wird eine natürliche Mutation oder zufällige Mutagenese nicht bei einem Virusbestand, sondern vielmehr unter Verwendung von clonierter genomischer cDNA des Virus, das in vitro oder in vivo in infektiöse virale RNA transkribiert werden kann, durchgeführt. Zum Beispiel wird im Fall einer früheren Mutagenese das Plasmid pRSINg, das eine genomische Volllängen-Sindbis-cDNA, funktionell verknüpft mit einem Bakteriophagen SP6-Promotor (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996), enthält, in kompetente E. coli XL-1-Red-Mutatorzellen transformiert und auf Ampicillin-Platten plattiert, um Kolonien zu erhalten. Mindestens 200 Kolonien werden zufällig ausgewählt, gepoolt und für eine über Nacht-Kultur in eine 10 ml-Brühe-Kultur, enthaltend Ampicillin, eingeimpft. Plasmid-DNA wird von der Kultur hergestellt, um eine heterogene Population von pRSINg, das verschiedene Mutationen beherbergt, zu erhalten. Die DNA wird mit XbaI linearisiert und in vitro unter Verwendung der SP6-Polymerase transkribiert, wie früher beschrieben (Rice et al., J. Virol. 61: 3809-3819, 1987). Die RNA-Transkripte werden danach durch Elektroporation (Liljestrom und Garoff, Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991) für die Initiierung des Sindbis-Virus-Infektionszyklus in den erwünschten Zelltyp (zum Beispiel BHK-Zellen) transfiziert. Alternativ kann auch in vitro-transkribierte RNA von einer nicht-mutagenisierten Matrize transfiziert werden. Die Selektion von Virusmutanten, die eine persistente Infektion etablieren oder eine reduzierte, verzögerte oder keine Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese zeigen, wird wie oben durchgeführt. Die selektierten Virusmutanten mit dem erwünschten Phänotyp werden durch limitierende Verdünnung oder Plaquereinigung isoliert, einer cDNA-Clonierung unterzogen, und die Sequenzen, die für den varianten Phänotyp verantwortlich sind, werden isoliert und charakterisiert, wie vorher beschrieben.
C. Genetische Selektion von Varianten unter Verwendung von Virus-abgeleiteten Vektoren
1. Vektoren, die ein immunogenes Protein exprimieren
In einem anderen Ansatz wird eine spontane intrazelluläre Mutation oder eine zufällige Mutagenese bei Virus-abgeleiteten Sequenzen eines viral-basierten Expressionsvektors durchgeführt. Diese Sequenzen schließen nicht-codierende und regulatorische Regionen sowie Nichtstrukturprotein-codierende Regionen ein. In bestimmten Fällen können auch Strukturprotein-codierende Sequenzen eingeschlossen sein. Eine solche zufällige Mutagenese oder spontane intrazelluläre Mutation kann unter Verwendung irgendeiner der in dieser Erfindung beschriebenen Techniken zusammen mit der clonierten cDNA eines Virus-abgeleiteten Vektors, der in vitro oder in vivo in RNA transkribiert werden kann, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein Replikations-kompetenter Sindbis-Virus-Expressionsvektor verwendet werden, um ein immunogenes Zelloberflächenprotein oder anderes Peptid zu exprimieren, das durch spezifische Antikörper, die zu den infizierten Zellen zugefügt werden, gebunden werden kann. Zellen, die einen funktionellen Vektor enthalten, werden durch ihre Expression des Vektor-codierten heterologen Antigens und die Fähigkeit, durch einen Antikörper gebunden zu werden, der spezifisch für das codierte Antigen ist, identifiziert. Durch Limitieren des Selektionsvorgangs auf Zellen, die über ausgedehnte Zeiträume (siehe oben) überleben, werden nur jene, die Vektorvarianten enthalten, die den erwünschten Phänotyp zeigen, angereichert.
Genau wird das Plasmid pTE3'2J (Hahn et al., J. Virol. 89: 2679-2683, 1992), umfassend einen SP6-Promotor, der funktionell mit einer genomischen Volllängen-Sindbis-cDNA mit einem verdoppelten subgenomischen Promotor für die Expression von heterologen Genen verknüpft ist, einer zufälligen Mutagenese, wie oben beschrieben, ausgesetzt. Dieser Vorgang resultiert in der Isolierung einer Population eines heterogenen Plasmids, das die zufälligen Mutationen enthält. Parallel wird das erwünschte heterologe Zelloberflächenprotein- oder Markerpeptid-Gen in einen Shuttlevektor für die Insertion in den mutagenisierten pTE3'2J-Vektor cloniert. Bevorzugte Zelloberflächenproteine für die Verwendung als Marker schließen menschliches B7.1 (Freeman et al., J. Immunol. 143: 2714-2722, 1989) und das murine H-2K^b-Klasse I-Molekül (Song et al., J. Biol. Chem. 269: 7024-7029, 1994) ein. Das menschliche B7.1-Gen wird durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 1,5 Minuten-Extension von einem pCDM8-Vektor, enthaltend die Volllängen-cDNA-Sequenz (Freeman et al., ebd.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer, die gestaltet sind, um flankierende XbaI- und BamHI-Stellen zu enthalten, amplifiziert.
Nach der Amplifizierung wird das ungefähr 875 bp-DNA-Fragment unter Verwendung eines QIAquick-spin PCR-Reinigungskits (Qiagen, Chatsworth, Ka.) gereinigt, mit XbaI und BamHI verdaut und in den Sindbis-Shuttlevektor pH3'2J1 (Hahn et al., ebd.) ligiert, der auch mit XbaI und BamHI verdaut und mit intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase behandelt worden ist, um das Konstrukt pH3'B7.1 zu bilden.
Nach einer zufälligen Mutagenese des subgenomischen pTE3'2J-Doppelvektors, wie oben beschrieben, werden das Plasmid pH3'B7.1 und die mutierte Population des Plasmids pTE3'2J mit ApaI und XhoI verdaut, von 0,7% Agarosegelen unter Verwendung von GENECLEAN II II^TM (Bio101, Vista, Ka.) gereinigt und ligiert, um eine heterogene Population eines B7.1-Expressionsvektors, bezeichnet pTE3'B7.1, zu bilden. Ohne E. coli zu transformieren und individuelle Clone zu isolieren, wird die gesamte Population des ligierten Vektors mit XhoI linearisiert und als Matrize für in vitro-SP6-Transkriptionsreaktionen verwendet, wie oben beschrieben. Die heterogene Population von zufällig mutagenisierten B7.1-Vektortranskripten wird dann in den erwünschten Zelltyp (zum Beispiel BHK-Zellen) für die Initiierung des Sindbis-Replikationszyklus durch Elektroporation eingebracht. Die Selektion auf Virusmutanten, die eine persistente Infektion etablieren oder eine reduzierte, verzögerte oder keine Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese zeigen, wird unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch für B7.1 ist (Pharmingen, San Diego, Ka.); und von entweder Magnet- oder Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungs-Protokollen durchgeführt. Die bevorzugten sekundären Antikörper-Marker schließen Ratte-anti-Maus-IgG, konjugiert mit magnetischen Mikroperlen für ein magnetisches Zellsortieren (miniMACS Magnetic Separation System, Miltenyi Biotech, Auburn, Ka.; Miltenyi et al., Cytometry 11: 231-238, 1990), und FITC-konjugiertes Ratte-anti-Maus-IgG (Pharmingen, San Diego, Ka.) für Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren ein. Unter Verwendung eines solchen Ansatzes und des Erntens der Zellen nach einem ausgedehnten Zeitraum (siehe oben) werden nur lebensfähige Zellen, die einen funktionellen Virus-abgeleiteten Vektor enthalten (wie durch B7.1-Expression gezeigt), der den erwünschten Phänotyp zeigt, angereichert.
Genau wird die heterogene Population von zufällig mutagenisierten B7.1-Vektortranskripten in 5 × 10⁷ Zellen gemäß dem Verfahren von Liljestrom und Garoff (1991, ebd.) durch Elektroporation eingebracht und als eine flache Bestandskultur plattiert. 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der Infektion wird die Zelleinzelschicht zweimal mit frischen Medien gewaschen, um toten Zellen zu entfernen, und durch Medien ersetzt, die aus einem Gemisch von 50% frischen Medien und 50% konditionierten Medien bestehen. Zu einer erwünschten Zeit nach der Infektion (zum Beispiel 72 Stunden) werden die verbleibenden Zellen sanft trypsinisiert, um sie von der Kulturschale abzulösen, und durch Zentrifugation bei 1000 UpM, 4°C pelletiert. Die Zellen werden in 2 ml Blockierungslösung (PBS + 10% fötales Kälberserum + 1% BSA) resuspendiert, auf Eis für 10 Minuten inkubiert und wieder pelletiert. Als Nächstes werden die Zellen in 200 μl der primären anti-B7.1-Antikörperlösung (verdünnt in PBS + 0,5% BSA) resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit PBS + 0,5% BSA gewaschen, pelletiert und in 200 μl magnetischer Perlenlösung (200 μl gewaschene magnetische Ratte-anti-Maus-beschichtete Perlen in PBS + 0,5% BSA + 5 mM EDTA) resuspendiert. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 4°C werden die Perlen-gebundenen Zellen zweimal mit PBS + 0,5% BSA + 5 mM EDTA gewaschen und in 1 ml desselben Puffers resuspendiert. Die Perlen-gebundenen Zellen werden dann unter Verwendung der MiniMacs-Magnetsäule gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die eluierten positiven Zellen werden dann direkt in eine Gewebekulturschale, enthaltend eine semi-konfluente, nicht-infizierte Zelleinzelschicht, in einem Verhältnis von 1 infizierten Zelle pro alle 10⁴ nicht-infizierten Zellen wieder ausgesät. Zusätzliche Runden der Selektion werden wie oben für die Amplifizierung/Anreicherung durchgeführt. Die selektierten Vektorvarianten mit dem erwünschten Phänotyp werden durch limitierende Verdünnung oder Plaquereinigung isoliert, einer cDNA-Clonierung unterworfen, und die Sequenzen, die für den varianten Phänotyp verantwortlich sind, werden isoliert und charakterisiert, wie früher beschrieben.
Alternativ kann der B7.1-Expressionsvektor pTE3'B7.1 direkt für eine in vitro-Transkription ohne vorherige Mutagenese verwendet werden. Nach der Transfektion dieser RNA-Transkripte wird eine Selektion auf Mutanten des erwünschten Phänotyps durchgeführt, wie oben beschrieben.
2. Vektoren, die einen selektierbaren Marker exprimieren
Alternativ kann ein Antibiotikum-Resistenzmarker für die Selektion von Virus-Vektorvarianten, die den erwünschten Phänotyp zeigen, verwendet werden. Zum Beispiel wird der Sindbis-Vektor pRSIN-luc (Dubensky et al., ebd.) einer zufälligen Mutagenese ausgesetzt, wie oben beschrieben, und eine Population von heterogenem Plasmid, enthaltend die zufälligen Mutationen, wird isoliert. Zusätzlich wird das Gen, das die Neomycin (G418)-Resistenz codiert, durch Standard-drei-Zyklus-PCR-Amplifizierung mit 1,5 Minuten Extension vom Plasmid pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Ka.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer isoliert, die gestaltet sind, um flankierende XhoI- und NotI-Restriktionsstellen zu enthalten:
Nach der Amplifizierung wird das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt, mit XhoI und NotI verdaut und in die mutierte Population des pRSIN-luc-Vektors ligiert, der auch mit XhoI und NotI verdaut, mit intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase behandelt, und von einem 0,7% Agarosegel von seiner vorherigen Luciferase-Insertion unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Die Ligierung des Neomycin-Resistenzmarkers in den mutierten pRSIN-Vektor bildet eine heterogene Population eines neo^r-Expressionsvektors, bezeichnet pRSIN-neo. Ohne E. coli zu transformieren und individuelle Clone zu isolieren, wird die gesamte Population des ligierten Vektors mit SacI linearisiert und als Matrize für in vitro-SP6-Transkriptionsreaktionen verwendet, wie oben beschrieben. Die heterogene Population von zufällig mutagenisierten neo^r-Vektortranskripten wird in den erwünschten Zelltyp (zum Beispiel BHK-Zellen) für die Initiierung des Sindbis-Replikationszyklus und der heterologen Genexpression durch Elektroporation eingebracht. Ungefähr 12–24 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und wieder in Medien, enthaltend G418, plattiert. Danach werden die Medien in ungefähr 24 Stunden-Intervallen gewechselt, um tote Zellen zu entfernen, und durch G418-enthaltende Medien, bestehend aus einem Gemisch von 50% frischen Medien und 50% konditionierten Medien, ersetzt. Die Medienwechsel werden reduziert, nachdem die Mehrheit der toten Zellen weggewaschen ist und Zellfoci beginnen, sich zu bilden. Unter Verwendung dieser Selektion werden nur lebensfähige Zellen, die einen funktionellen Virus-abgeleiteten Vektor enthalten, der den erwünschten Phänotyp zeigt (gezeigt durch Neomycin-Resistenz), angereichert. Mutierte Vektorvarianten-Genome, die den erwünschten Phänotyp zeigen, werden durch Ernten der RNA direkt aus den Zelllysaten unter Verwendung von RNAzol B (Tel-Test, Friedswood, TX) isoliert. Alternativ werden die Zellen mit einer defekten Helfer-Sindbis-RNA (pR-dlnsPSIN, Dubensky et al., ebd.) transfiziert, was in der Produktion von verpackten pRSIN-neo-Vektor-enthaltenden Partikeln im Kulturüberstand resultiert, die durch Zentrifugation für eine folgende Vektor-RNA-Isolierung wie oben konzentriert werden können. In jedem Fall wird die Vektor-RNA einer cDNA-Clonierung unterworfen, und die Sequenzen, die für den varianten Phänotyp verantwortlich sind, werden isoliert und charakterisiert, wie vorher beschrieben.
Alternativ kann der pRSIN-Vektor mit einem Neomycin-Resistenzmarker direkt für die in vitro-Transkription ohne vorherige Mutagenese verwendet werden. Nach der Transfektion dieser RNA-Transkripte wird die Selektion auf Mutanten des erwünschten Phänotyps durchgeführt, wie oben beschrieben.
In einem anderen Beispiel wird ein Semliki Forest-Virus-abgeleiteter Vektor, pSFV-1 (GIBCO/BRL), für die Insertion des Antibiotikum-Resistenzmarkers und die folgende Selektion des erwünschten Phänotyps verwendet. Das Gen, das die Neomycin (G418)-Resistenz codiert, wird durch Standard-drei-Zyklus-PCR-Amplifizierung mit 1,5 Minuten Extension vom Plasmid pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Ka.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer isoliert, die gestaltet sind, um flankierende BamHI-Restriktionsstellen zu enthalten:
Nach der Amplifizierung wird das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt, mit BamHI verdaut und in den Wildtyp oder eine vorher mutierte Population des pSFV-1-Vektors, der auch mit BamHI verdaut, mit intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN 11 gereinigt worden ist. Die Transkription der RNA-Vektoren und die Selektion auf Mutanten des erwünschten Phänotyps werden im Wesentlichen ausgeführt, wie oben für das Sindbis-Virus beschrieben.
BEISPIEL 3
HERSTELLUNG VON SIN-1-BASIERTEN RNA-VEKTOR-REPLIKONS
A. Konstruktion des SIN-1-Basisvektors
SIN-1-abstammende-Vektor-Gerüste wurden konstruiert und in eine Plasmid-DNA inseriert, die einen Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor enthielt, so dass die Transkription in vitro ein RNA-Molekül produzierte, das beim Einbringen in empfängliche Zellen als ein selbst-replizierendes Molekül (Replikon) wirkt. Das Basis-SIN-1-RNA-Vektor-Replikon umfasste die folgenden geordneten Elemente: SIN-1nsPs-Gene, eine subgenomische RNA-Promotorregion, eine Polylinkersequenz, die heterologe Sequenzinsertionen enthalten kann, die nicht translatierte SIN-1-3'-Region (NTR) und eine Polyadenylat-Sequenz. Nach der Transfektion in empfängliche Zellen erfolgt eine autonome Replikation des RNA-Vektor-Replikons wie für ein Virus, und die heterologen Sequenzen werden als hochgradig abundante subgenomische mRNA-Moleküle synthetisiert, die wiederum als die translationelle Matrize für das heterologe Genprodukt dienen.
Die 5'-Region des Vektors, der die SIN-1 nsP-Gene und den subgenomischen Promotor umfasst, erstreckt sich zwischen zwei Nucleotiden des translationellen Capsid-Gen-Initiationspunkts. Diese Region wurde zuerst in das pKSII+-Plasmid (Stratagene) zwischen die ApaI- und XhoI-Stellen inseriert. Die 5'-Region des Vektors wurde durch PCR vom pRSIN-1g-Plasmid in zwei überlappenden Fragmenten amplifiziert. Das erste Fragment wurde in einer PCR-Reaktion mit dem folgenden Primerpaar hergestellt:
Das zweite Fragment wurde in einer PCR-Reaktion mit dem folgenden Primerpaar hergestellt:
Die zwei PCR-Reaktionen wurden mit den oben gezeigten Primerpaaren unter Verwendung der hitzestabilen Thermalase- (Amresco, Solon, OH), Vent- (New England Biolabs, Beverly, MA) oder KlenTaq-DNA-Polymerasen durchgeführt. Zusätzlich enthielten die Reaktionen 5% DMSO und „HOT START WAX"-Perlen (Perkin-Elmer, Foster City, Ka.). Das unten gezeigte PCR-Amplifizierungsprotokoll wurde verwendet. Die Extensionsdauer war 5 Minuten oder 2,5 Minuten für Reaktionen mit den SP6-1F/SIN5160R- beziehungsweise 5079F/SIN7643R-Primerpaaren.

Temperatur (°C) Zeit (Min) Anzahl der Zyklen

95 2 1

95 55 72 0.5 0.5 5.0 or 2.5 35

72 10 10
Nach der PCR wurden die zwei amplifizierten Produkte von 5142 bp (SP6-1F/SIN5160R-Primerpaar) und 2532 bp (5079F/SIN7643R-Primerpaar) gereinigt (PCR-Reinigungskit, Qiagen, Chatsworth, Ka.) und mit ApaI und SfiI (5142 bp-Amplikonprodukt) oder SfiI und XhoI (2532 bp-Amplikonprodukt) verdaut. Die verdauten Produkte wurden mit GENECLEAN II (Bio 101, Vista, Ka.) gereinigt und mit pKS+-Plasmid (Stratagene, La Jolla, Ka.) zusammen ligiert, das durch Verdau mit ApaI und XhoI hergestellt wurde und mit CIAP Phosphatase behandelt wurde. Diese Konstruktion ist als pKSSIN-1-BV5' bekannt.
Die 3'-Region des Vektors, die das virale 3'-Ende umfasst, ein Polyadenylat-Bereich und eine einmalige Restriktions-Erkennungssequenz wurden zwischen die NotI- und SacI-Stellen des Plasmids pKSSIN-1-BV5' inseriert. Die 3'-Region des Vektors wurde durch PCR vom pRSIN-1g-Plasmid in einer Reaktion, die das folgende Primerpaar enthielt, amplifiziert:
Zusätzlich zu den oben gezeigten Primerpaaren enthielt die PCR-Reaktion die hitzestabilen Thermalase-, Vent- oder die KlenTaq-DNA-Polymerasen, 5% DMSO und „Hot Start Wax"-Perlen (Perkin-Elmer). Das Amplifizierungsprotokoll war, wie oben gezeigt, aber mit einer 72°C-Extensionsdauer von 30 Sekunden.
Das amplifizierte 377 bp-Produkt, das dem 3'-Vektorende entsprach, wurde gereinigt, mit NotI- und SacI verdaut, gereinigt und in pKSSIN-1-BV5' ligiert, das durch Verdau mit Not' und SacI und Behandlung mit CIAP hergestellt wurde. Dieses Plasmid ist als pKSSIN-1-BV bekannt.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken wurde das lacZ-Gen, das das β-Galactosidase-Reporterprotein codiert, mit BamHI und HindIII vom Plasmid pSV-β-Galactosidase (Promega Corp., Madison, WI) freigesetzt und in pKS+ an den entsprechenden Enzym-Erkennungsstellen inseriert. Das lacZ-Gen wurde aus diesem Plasmid, pKS-β-gal, mit XhoI und NotI verdaut und in pKSSIN-1-BV zwischen die XhoI- und NotI-Stellen inseriert. Dieses Plasmid ist als SINrep/SIN-1 nsP1-4/LacZ bekannt.
Alternativ wurde das Leuchtkäfer-Luciferasegen, das das Luciferase-Reporterprotein codiert, vom Plasmid pT3/T7-LUC (Clontech, Palo Alto, Ka.) durch Verdau mit HindIII freigesetzt und in pKS+ (Stratagene, La Jolla, Ka.) an den entsprechenden Enzym-Erkennungsstellen, die in der mehrfachen Clonierungssequenz enthalten sind, inseriert, um pKS-luc herzustellen. Das Luciferase-Gen wurde von pKS-luc durch Verdau mit XhoI und NotI freigesetzt und in XhoI/NotI-verdautes pKSSIN-1-BV inseriert. Dieses Plasmid ist als SINrep/SIN-1nsP1-4/luc bekannt.
Zusätzlich wurde das Gen, das die sezernierte Form der alkalischen Phosphatase (SEAP) codiert, in pKSSIN-1-BV inseriert. Kurz, das SEAP-Gen wurde vom Plasmid pCMV/SEAP (Tropix, Redford, MA) durch Verdau mit HindIII und XbaI freigesetzt und in pKS+ (Stratagene, La Jolla, Ka.) an den entsprechenden Erkennungsstellen, die in der mehrfachen Clonierungssequenz enthalten sind, inseriert, um pSK-SEAP herzustellen. Das SEAP-Gen wurde dann durch Verdau mit XhoI und NotI von pSK-SEAP freigesetzt und in die entsprechenden Enzym-Erkennungsstellen von pKSSIN-1-BV inseriert. Dieses Plasmid ist als SINrep/SIN-1nsP1-4/SEAP bekannt.

Die individuellen SIN-1 nsP-Gene werden in die entsprechende Wildtyp-Virusregion des Sindbis-Virus-basierenden lacZ-Replikons, das früher beschrieben wurde (Bredenbeek et al., J. Virol. 67: 6439-6446, 1993), substituiert, um die Expressionseigenschaften der SIN-1- und Wildtyp-Expressionsvektoren zu vergleichen. Die Substitution der SIN-1nsP-Gene in das Toto1101-abgeleitete lacZ-Replikon wurde erreicht, wie im Beispiel 1 beschrieben. Diese Vektoren wurden bezeichnet, wie in der Tabelle unten gezeigt.

	Ursprung der nsP-Gene
Replikon-Bezeichnung	Toto1101	SIN-1
SINrep/lacZ	nsP1-4
SINrep/SIN-1nsP2/lacZ	nsP1,3-4	nsP2
SINrep/SIN-1nsP3/lacZ	nsP1-2,4	nsP3
SINrep/SIN-1nsP1-4/lacZ		nsP1-4

Die SP6-Transkripte wurden von den in der obigen Tabelle gezeigten Replikons nach einer Linearisierung mit XhoI hergestellt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die RNA-Transkripte enthielten eine 5'-Sequenz, die zum Initiieren der Transkription des Sindbis-Virus in der Lage ist, die Sindbis-Virus-Nichtstrukturprotein-Gene 1-4, RNA-Sequenzen, die für das Verpacken benötigt werden, eine Sindbis-Virus-Verbindungsregion, das lacZ-Gen und die proximalen Sindbis-Virus-3'-End-Sequenzen, die für die Synthese der Minusstrang-RNA benötigt werden.
Die in vitro-Transkriptions-Reaktionsprodukte oder die gereinigte RNA wurden in Babyhamster-Nieren-21 (BHK-21)-Zellen durch Elektroporation eingebracht, wie früher beschrieben (Liljestrom und Garoff, Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991).
Alternativ wurde ein Komplex von BHK-21-Zellen mit einer kommerziellen kationischen Lipidverbindung gebildet, wie im Beispiel 1 beschrieben, und auf BHK-21-Zellen, die bei 75% Konfluenz gehalten wurden, aufgetragen. Die transfizierten Zellen wurden in 35 mm-Schalen vermehrt und bei 37°C inkubiert.
Die Wirksamkeit der Transfektion von BHK-21-Zellen mit SINrep/lacZ-RNAs wurde nach 9 Stunden durch zwei alternative Verfahren bestimmt. Im ersten Verfahren wurden die transfizierten Zellen, die β-Galactosidase exprimieren, durch direktes Färben mit X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactopyranosid) bestimmt, nachdem die Zellen zuerst mit 2% kaltem Methanol fixiert wurden, wie früher beschrieben (MacGregor et al., Cell Mol. Genet. 13: 253-265, 1987). Im zweiten Verfahren wurde die Expression von β-Galactosidase durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Kaninchen-anti-β-Galactosidase-Antikörpers bestimmt. Ein Teil der Zellen, die durch eines der oben beschriebenen Verfahren transfiziert wurden, wurde auf runden Deckgläsern vermehrt, die in 35 mm-Schalen enthalten waren. 9 Stunden nach der Transfektion (hpt) wurden die Medien durch Aspiration entfernt, und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und durch Inkubation mit Methanol über Nacht bei –20°C fixiert. Das Methanol wurde durch Aspiration entfernt, die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, dann mit 2% BSA (Fraktion V, Sigma, St. Louis, MO) für 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach der Inkubation mit BSA, um eine nicht-spezifische Antikörperbindung zu verhindern, wurden die Zellen mit dem primären anti-β-Galactosidase-Antikörper (1:800 in 0,1% BSA/PBS verdünnt) für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Überschüssiger primärer Antikörper wurde dann durch Aspiration und dreimaliges Spülen mit 0,1% BSA in PBS entfernt. Nach einer 1:100-Verdünnung in 2% BSA in PBS wurden 100 ml Ziege-anti-Kaninchen-FITC-konjugierter sekundärer Antikörper (Sigma, St. Louis, MO) zu den Deckgläsern zugefügt und für 45 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubiert. Überschüssiger sekundärer Antikörper wurde durch zweimaliges Abspülen der Deckgläser mit 0,1% BSA in PBS und einmal mit PBS entfernt. Die Deckgläser wurden dann mit der Zellseite nach unten auf einen Tropfen Cytoseal 60-Befestigungsmedium (Stephens Scientific, Riverdale, NJ), der auf einem Objektträger platziert wurde, befestigt. Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um die Frequenz der Zellen, die β-Galactosidase exprimieren, zu bestimmen, um die Transfektionswirksamkeit zu bestimmen.
Der Spiegel von β-Galactosidase in transfizierten Ganzzell-Lysaten wurde bei 9 hpt durch zwei alternative Verfahren bestimmt. Im ersten Verfahren wurden die transfizierten Zellen nach der Aspiration der Medien mit PBS gespült, und 250 μl Reporter-Lysepuffer (Promega, Madison, WI) wurden pro 10⁶ Zellen zu jeder Schale zugefügt. Die β-Galactosidase-Expressionsspiegel wurden durch Mischen der Überstandsfraktion von den Zelllysaten, die durch Mikrozentrifugation bei 14000 UpM für 1 Minute bei Zimmertemperatur verarbeitet wurden, mit einen kommerziell erhältlichen Substrat-Nachweissystem (Lumi-gal, Clontech, Palo Alto, Ka.), gefolgt von einer Luminometrie (Analytical Luminescence Laborstory, San Diego, Ka.), bestimmt. Im zweiten Verfahren wurde die Aktivität der β-Galactosidase bestimmt, wie früher durch Sambrook und Maniatis (1989, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laborstory Press, NY) beschrieben. Kurz, die transfizierten Zellen wurden nach Aspiration der Medien mit PBS gespült, und 200 μl TTE-Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0/1 mM EDTA/0,2% Triton X-100) wurden pro 10⁶ Zellen zu jeder Schale hinzugefügt. Nach Pelletieren des Zelltrümmer vom Zell-Lysat durch Mikrozentrifugation bei 14000 UpM für 1 Minuten bei Zimmertemperatur wurden 50 μl des Überstands zu 0,5 ml Z-Puffer, pH 7,0 (60 mM Na₂HPO₄/40 mM NaH₂PO₄/10 mM KCl/10 mM MgSO₄/50 mM 2-Mercaptoethanol), zugefügt und bei 37°C für 5 Minuten inkubiert. Die β-Galactosidase-Aktivität in den Proben wurde dann nach Zugabe von 0,2 ml einer Lösung, enthaltend 4 mg/ml des chromogenen Substrats o-Nitrophenyl-b-D-galactopyranosid (ONPG; SIGMA, St. Louis, MO) in Z-Puffer, durch Spektrophotometrie (420 nm) bestimmt. Die Proben wurden bei 37°C inkubiert, bis sich die gelbe Farbe entwickelte (ungefähr 5 Minuten), und die Reaktionen wurden durch Zugabe von 0,5 ml 0,5 M Na₂CO₃ gestoppt.

Der Spiegel der β-Galactosidase-Expression in transfizierten BHK-21-Zellen wurde gemäß den oben beschriebenen Verfahren bestimmt und ist in der unten gezeigten Tabelle illustriert. Die angezeigten Daten sind auf variierende Transfektionswirksamkeiten normalisiert, wie oben beschrieben.

Transfiziertes Replikon	Expression von β-Gal relativ zu SINrep/lacZ	Standardabweichung
SINrep/lacZ	1.0
SINrep/SIN-1nsP2/lacZ	3.2	±0.4
SINrep/SIN-1nsP3/lacZ	0.2	±0.0
SINrep/SIN-1nsP1-4/lacZ	5.2	±1.3

Die Ergebnisse zeigen, dass die Replikon-Vektoren, die von dem varianten SIN-1-Stamm abgeleitet sind, in der Tat funktionell sind. Wenn in BHK-21-Zellen transfiziert, ist der Spiegel des exprimierten Reporterproteins höher als jener, der in Wildtyp-Virus-abgeleiteten, Vektor-transfizierten Zellen beobachtet wird. Darüber hinaus kartierte der höhere Spiegel der β-Galactosidase-Expression in BHK-21-Zellen, die mit den SIN-1-abgeleiteten Replikon-Vektoren transfiziert wurden, wie der Phänotyp für die Etablierung einer produktiven persistenten Infektion vorwiegend auf das nsP2-Gen.
BEISPIEL 4
HERSTELLUNG VON SIN-1-BASIERTEN DNA-VEKTOREN
A. Konstruktion von Plasmid-DNA-SIN-1-abgeleiteten Expressionsvektoren
Eine wirksame Initiierung des infektiösen Sindbis-Virus-Zyklus kann in vivo von einem genomischen cDNA-Clon erfolgen, der in einer RNA-Polymerase II-Expressionskassette (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996) enthalten ist. Die Fähigkeit, funktionelle Alphavirus-Gene von einem DNA-Format zu exprimieren, hat ermöglicht, dass zwei neue Alphavirus-basierende Gen-Expressionssysteme entwickelt werden: (1) ein Plasmid DNA-basierter Vektor mit Anwendungen für eine genetische Immunisierung und (2) die Produktion von verpackten Alphaviruspartikeln in Zellen, die mit Vektor-Replikon- und DH-Plasmid-DNAs co-transfiziert wurden. Früher waren molekulare Ansätze, um infektiöse Sindbis-Virus-RNA und ihre abgeleiteten komplementären Vektoren zu produzieren, vorwiegend auf eine in vitro-Transkription von cDNA-Clonen von einem Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, gefolgt von Transfektion in permissive Zellen beschränkt.
Der Plasmid-DNA-basierte Alphavirus-abgeleitete Expressionsvektor ist als ELVS^TM (eukaryontisches geschichtetes Vektorsystem, „Eukaryotic Layered Vector System") bekannt. Der ELVS^TM-Plasmid-DNA-Vektor involviert die Konversion einer selbst-replizierenden Vektor-RNA (eines Replikons) in ein geschichtetes, DNA-basiertes Expressionssystem. In bestimmten Ausführungsformen hat die erste Schicht eine eukaryontische (z. B. RNA-Polymerase II) Expressionskassette, die die Transkription einer zweiten Schicht initiiert, die dem RNA-Vektor-Replikon entspricht. Nach dem Transport des Replikons, das von der ersten Schicht exprimiert wird, vom Nukleus in das Cytoplasma schreitet die autokatalytische Amplifizierung des Vektors gemäß dem viralen (z. B. Alphavirus) Replikationszyklus fort, was in der Expression des heterologen Gens resultiert.
Die Konstruktion von SIN-1-Virus-abgeleiteten Plasmid-DNA-Expressionsvektoren wurde mit Modifikationen der früher beschriebenen Verfahren (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996) durchgeführt. Der Expressionsvektor wurde auf dem Plasmidvektor pBGS131 (ATCC Nr. 37443) zusammengefügt, der ein Kanamycin-resistentes Analog von pUC9 ist (Spratt et al., Gene 41: 337-342, 1986). pBGS131 und seine abgeleiteten Plasmide wurden in LB-Medium, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, vermehrt.
Um die Insertion von heterologen Sequenzen in den Expressionsvektor zu ermöglichen, wurde die XhoI-Erkennungssequenz, die im translationellen Leserahmen des Kanamycin-Gens in pBGS131 gelegen ist, durch Inserieren eines teilweise komplementären 12-mer-Oligonucleotidpaars, das klebende XhoI-Enden enthielt, entfernt. Die XhoI-Erkennungsstelle wurde als ein Ergebnis der Insertion verloren, wie unten gezeigt:

XhoI-Stelle: CTCGAG) (SEQ. ID NOS. 33-36 und 104).

Das Oligonucleotid wird in gleichen molaren Konzentrationen in der Anwesenheit von 10 mM MgCl₂ im Gel aneliert, für 5 min auf 100°C aufgeheizt, langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt und mit Polynucleotidkinase phosphoryliert. Das Oligonucleotid wurde in einem 200:1-Verhältnis von Insertion:Plasmidvektor an pBGS131 ligiert, das durch XhoI-Verdau und CIAP- Behandlung hergestellt wurde. Das resultierende Plasmid wird pBGS131 dlXhoI genannt. Die Wachstumsraten von XL1-Blue (Stratagene), das mit den pBGS131- oder pBGS131 dlXhoI-Plasmiden in LB-Medium, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, transformiert wurde, war über einen Zeitraum zwischen 1,5 und 8 Stunden nicht unterscheidbar.
Das Rinder-Wachstumshormon (BGH)-Transkriptions-Terminierungs-/Polyadenylierungssignal wurde zwischen die SacI- und EcoRI-Stellen von pBGS131 dlXhoI inseriert. Die BGH-Transkriptions-Terminierungssequenzen wurden durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung des unten gezeigten Primerpaars und des pCDNA3-Plasmids (Invitrogen, San Diego, Ka.) als Matrize isoliert.
Die oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Reaktion mit einem drei-Temperatur-Zyklusprogramm unter Verwendung einer 30 Sek.-Extensionsdauer verwendet. Das amplifizierte 58 bp-Produkt wurde mit dem PCR-Reinigungskit (Qiagen, Chatsworth, Ka.) gereinigt, mit SacI und EcoRI verdaut, mit GENECLEAN II gereinigt und in SacI/EcoRI-verdautes, CIAP-behandeltes pBGS131 ligiert. Das Plasmid ist als pBGS131 dlXhoI-BGHTT bekannt.
Das 3-Ende des Sindbis-Virus-abgeleiteten Plasmid-DNA-Expressionsvektors wurde dann in das pBGS131 dlXhoI-BGHTT-Konstrukt inseriert. Diese Region des Vektors enthält die folgenden geordneten Elemente: die nicht translatierte Sindbis-Virus-3'-End-Region (3'-NTR); eine 40-mer poly(A)-Sequenz; das antigenomische Hepatitis Delta-Virus (HDV)-Ribozym; und eine SacI-Erkennungssequenz. Die Konstruktion dieser geordneten Elemente wurde durch geschachtelte PCR unter Verwendung der unten gezeigten Primer und des pKSSIN-1-BV-Plasmids (Beispiel 4) als Matrize erreicht.
Die oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Amplifizierung gemäß den Reaktionsbedingungen und dem drei-Temperatur-Zyklussystem, das im Beispiel 4 beschrieben ist, mit einer Extensionszeit von 30 Sek. verwendet. Das amplifizierte 422 bp-Produkt wurde mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen, Chatsworth, Ka.) gereinigt, mit NotI und SacI verdaut, mit GENECLEAN II gereinigt und in NotI/SacI-verdautes, CIAP-behandeltes pKSSIN-1-BV ligiert. Dieses Konstrukt ist als pKSSIN-1BV/HDVRBZ bekannt und enthält Sindbis-Virus-abgeleitete Plasmid-DNA-Expressionsvektorsequenzen von der BglII-Stelle bei Sindbis-nt. 2289, die sich durch das 3'-Ende des Vektors, einschließlich der HDV-Ribozymsequenz, ausdehnen.
Das Plasmid pKSSIN-1BV/HDVRBZ wurde dann mit BglII und SacI verdaut, das 5815 bp-Fragment wurde durch 1% Agarose/TBE-Gelelektrophorese isoliert, mit GENECLEAN II gereinigt und wurde in BglII/SacI-verdautes, CIAP-behandeltes pBGS131 dlXhoI-BGHTT inseriert, um das Plasmidkonstrukt herzustellen, das als pBG/SIN-1BglLF bekannt ist. Dieses Konstrukt enthält die Region des Sindbis-Virus-Expressionsvektors vom oben beschriebenen Plasmid pKSSIN-1BV/HDVRBZ, wobei das 3'-Ende an die BHG-Transkriptions-Terminierungssequenz auf dem pBGS131 dlXhoI-Plasmid fusioniert ist.
Der Zusammenbau des Sindbis-Virus-Plasmid-DNA-Vektors wurde durch Insertion des CMV-Promotors, nebeneinandergestellt mit den ersten 2289 nts. des Sindbis-Virusgenoms (das das virale 5'-Ende und einen Teil der nsPs-Gene einschließt), in das pBG/SIN-1BglLF-Plasmid vollendet. Unter Verwendung eines überlappenden PCR-Ansatzes wurde der CMV-Promotor am viralen 5'-Ende positioniert, so dass die Transkriptionsinitiierung in der Zugabe eines einzelnen, nicht-viralen Nucleotids am 5'-Ende der Sindbis-Virusvektor-Replikon-RNA resultierte. Der CMV-Promotor wurde in einer ersten PCR-Reaktion von pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, Ka.) unter Verwendung des folgenden Primerpaars amplifiziert:
Die oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Reaktion gemäß den Reaktionsbedingungen und dem drei-Temperatur-Zyklusprogramm, beschrieben in Beispiel 4, mit einer Extensionszeit von 1 min verwendet.
Das SIN-1-5'-Ende wurde in einer zweiten PCR-Reaktion vom pKSRSIN-1g-Clon (Beispiel 1) unter Verwendung des folgenden Primerpaars amplifiziert:
Die oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Reaktion mit einem drei-Temperatur-Zyklusprogramm unter Verwendung einer 3 min-Extensionsdauer verwendet.
Die amplifizierten 930 bp- und 3200 bp-Produkte wurden mit einem PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt und zusammen in einer PCR-Reaktion mit dem folgenden Primerpaar verwendet.
Die oben gezeigten Primer wurden in einer PCR-Reaktion mit einem drei-Temperatur-Zyklusprogramm unter Verwendung einer 3,5 min-Extensionsdauer verwendet.
Die 26 3'-terminalen Basen des amplifizierten ersten PCR-Produkts überlappen mit den 26 5'-terminalen Basen des amplifizierten zweiten PCR-Produkts; das resultierende, 3200 bp-überlappende, amplifizierte sekundäre PCR-Produkt wurde durch 1% Agarose/TBE-Elektrophorese gereinigt, mit BglII verdaut und in BglII-verdautes, CIAP-behandeltes pBG/SIN-1BglLF ligiert. Dieses Konstrukt wird pBG/SIN-1 ELVS 1.5 genannt.
Wie im Beispiel 1 diskutiert, resultieren relativ wenige Nucleotid-Punktänderungen in der nsP-Gensequenz des Wildtyp-Sindbis-Virus im Phänotyp, der charakteristisch für SIN-1 ist. Keine neuen Restriktionsenzym-Erkennungsstellen werden als ein Ergebnis dieser Nucleotidänderungen hergestellt, was es ermöglicht, Clone, die vom Wildtyp stammen, und SIN-1-Genotypen leicht zu unterscheiden. Ein PCR-basierter diagnostischer Test wurde daher als ein schnelles Verfahren für die Identifizierung von SIN-1-abgeleiteten Clonen entwickelt. Kurz, Vorwärtsprimer wurden gestaltet, so dass eine bestimmte Basenänderung zwischen SIN-1 und Wildtyp an der 3'-terminalen Base des Primers positioniert wurde. Ein Primer enthielt das SIN-1-Nucleotid, während ein anderer das Wildtyp-Nucleotid enthielt. Ein Rückwärtsprimer in einer stromabwärts liegenden Region, die zwischen beiden Genotypen konserviert war, wurde in Kombination mit jedem Vorwärtsprimer verwendet. Bei der korrekten Anlagerungstemperatur wurden die SIN-1-Matrizen nur in Reaktionen amplifiziert, die SIN-1-Vorwärtsprimer enthielten. Die Primersequenzen, die verwendet wurden, um zwischen Wildtyp- und SIN-1-Genotypen zu unterscheiden, sind unten angegeben. Die Reaktionsbedingungen waren, wie es im Verlauf der Beispiele, die hierin enthalten sind, beschrieben wird.
Primersatz 1:
Primersatz 2:
Primersatz 3:
Reporterprotein-Expressionsvektoren wurden durch Inserieren der lacZ-, SEAP- oder Luciferase-Reportergene in das pBG/SIN-1 ELVS 1.5-Vektorgerüst konstruiert. In getrennten Reaktionen wurden die pKS-β-gal-, pSK-SEAP- und pKS-luc-Plasmide (Beispiel 4) mit XhoI und NotI verdaut. Die Fragmente, die die lacZ-, SEAP- oder Luciferase-Gene enthielten, wurden durch 1% Agarose/TBE-Gelelektrophorese isoliert und danach mit GENECLEAN II gereinigt. Diese Reportergene wurden dann in getrennten Reaktionen mit XhoI/NotI-verdautem, CIAP-behandeltem pBG/SIN-1 ELVS 1.5-Plasmid ligiert. Diese Konstrukte sind als pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal, pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP und pBG/SIN-1-ELVS 1.5-luc bekannt.
B. Expression von heterologen Proteinen in Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP-, pBG/SIN-1 ELVS 1.5-luc- oder pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-Expressionsvektoren transfiziert wurden
Das Muster der sezernierten alkalischen Phosphatase-, Luciferase- und β-Galactosidase-Reportergenexpression in BHK-Zellen, die mit den pBG/SIN-1 ELVS 1.5- oder pBG/wt ELVS 1.5-Vektoren transfiziert wurden, wurde verglichen. Das pBG/wt ELVS 1.5-Plasmid enthält Sequenzen, die vielmehr vom Wildtyp-Sindbis-Virus stammen als von der SIN-1-Variante. Die Konstruktion der pBG/wt ELVS 1.5-Expressionsvektoren war genau, wie hierin für die pBG/SIN-1 ELVS 1.5-Expressionsvektoren beschrieben, mit der Ausnahme, dass genomische Volllängen-cDNA, die vom Wildtyp-Sindbis-Virus stammt (Dubensky et al., WO 95/07994 ), als die Matrize für die Vektorkonstruktion verwendet wurde. Die Konstruktion des pBG/wt ELVS 1.5-Expressionsvektors ist früher beschrieben worden (Dubensky, vorstehend); daher sind, obwohl die Stämme und daher die Sequenzen verschieden sind, die Sindbis-Virus-spezifischen Regionen, die in den pBG/wt ELVS 1.5- und pBG/SIN-1 ELVS 1.5-Expressionsvektoren enthalten sind, dieselben.
Babyhamster-Nieren-21 (BHK-21)-Zellen, die in 12 mm-Schalen bei einer Konfluenz von 75% gehalten wurden, wurden mit 1,0 μg pBG/SIN-1 ELVS 1.5- oder pBG/wt ELVS 1.5-Expressionsvektor-Plasmid-DNAs transfiziert, die mit 4,0 μl eines kommerziell erhältlichen Lipids (Lipofectamin, GIBCO-BRL) einen Komplex bildeten. Ansonsten waren die Transfektionsbedingungen, wie durch den Lipid-Hersteller vorgeschlagen. Minimales essenzielles Eagle-Medium, angereichert mit 5% fötalen Rinderseren, wurde 4 Stunden nach der Transfektion (hpt) zu den Zellen zugefügt, außer wenn es anderweitig angezeigt ist. Die transfizierten Zellen wurden bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion wurden, wie unten angezeigt, einige Tests durchgeführt, um die Vektor-spezifische RNA-Synthese und die Expression der sezernierten alkalischen Phosphatase-, Luciferase- oder β-Galactosidase-Reportergene in Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5- oder pBG/wt ELVS 1.5-Plasmid-DNAs transfiziert wurden, zu vergleichen.
Die Spiegel der alkalischen Phosphatase, die in das Kulturmedium von BHK-Zellen sezerniert wurden, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAP- oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNA transfiziert wurden, wurden verglichen. Das Zellkultur-Medium wurde auf das Vorliegen der alkalischen Phosphatase mit dem chemilumineszierenden Phospha-Light^TM Reportergen-Test gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tropix, Inc., Redford, MA) getestet. Kurz, 10 μl des Zellkultur-Überstands wurden mit 30 μl Verdünnungpuffer gemischt und für 30 Minuten bei 65°C inkubiert. Die Probe wurde vor dem Mischen mit 40 μl Testpuffer auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Die Probe wurde für fünf Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 40 μl Reaktionspuffer. Die Proben wurden für 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Gesamtluminiszenz wurde auf einem ML3000-Mikrotiterplatten-Luminometer (Dynatech, Inc., Chantilly, VA) in Zyklus-Betrieb gemessen; und die alkalische Phosphatase (AP) im Kulturmedium von BHK-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAP- oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNAs transfiziert wurden, wurde bei 48 hpt bestimmt, und die Ergebnisse sind in der Tabelle unten gezeigt.

Transfiziertes Plasmid RLU, 48 hpt

pBG/SIN-1 ELVS 1.5SEAP 18 ± 1.7

pBG/wt ELVS 1.5-SEAP 94 ± 10.7

pCDNA3 0.13 ± 0.04
Zusätzlich wurden die Spiegel der Vektor-spezifischen RNAs, die in BHK-21-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP- oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmiden transfiziert wurden, synthetisiert wurden, 48 Stunden nach der Transfektion durch Northern-Blot-Analyse bestimmt, genau wie früher beschrieben (Dubensky, vorstehend). Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 9A gezeigt. Die zelluläre Gesamt-RNA wurde von transfizierten BHK-Zellen mit Tri-Reagent isoliert, wie vom Hersteller (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) beschrieben.
Die zellulären Gesamt-RNA-Konzentrationen, die in Proben von transfizierten BHK-Zellen vorhanden waren, wurden spektrophotometrisch bestimmt. Zusätzlich wurde durch Elektrophorese von 0,5 μg zellulärer Gesamt-RNA auf 0,7% Agarose/TBE-Minigelen, die mit 10 μl/ml Ethidiumbromid gefärbt wurden, bestimmt, dass Material, das von transfizierten Zellen isoliert wurde, intakt war. Eine Northern-Blot-Analyse wurde gemäß Sambrook und Maniatis (1989, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, N. Y.) durchgeführt. Damit RNA von allen transfizierten Proben auf einem Autoradiogramm von einer einzelnen Northern-Blot-Analyse beobachtet werden konnte, wurden 2,5 μg und 30 μg RNA pro Spur von pBG/wt ELVS 1.5-SEAP- beziehungsweise pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP-transfizierten Zellen aufgetragen. Vier Proben der RNA von den individuellen Transfektionen mit beiden getesteten Plasmiden wurden durch 0,7% Formaldehyd-Agarosegele einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Zeta-probe Membran (Bio-Rad, Richmond, Ka.) transferiert. Der Blot wurde mit zufällig geprimten Sonden, die dem alkalischen Phosphatase-Gen entsprachen, hybridisiert. Die Ergebnisse dieses Experiments, in dem die Spiegel der Vektor-spezifischen RNA-Synthese und der AP-Expression in transfizierten BHK-Zellen bei 48 hpt verglichen wurden, zeigen, dass, während der Spiegel der Vektor-spezifischen RNA, die in Zellen synthetisiert wurde, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP-DNA transfiziert wurden, mindestens 100-fach niedriger war als in pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-transfizierten Zellen, die Spiegel von AP in Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAP-DNA im Vergleich zu pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-DNA transfiziert wurden, nur fünffach niedriger waren.
Die Spiegel der alkalischen Phosphatase, die in das Kulturmedium von BHK-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAP- oder pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid-DNA transfiziert wurden, sezerniert wurden, wurden auch über einen 7 Tage-Zeitablauf verglichen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung, die in 9B illustriert sind, zeigen, dass die Spiegel von AP, die im Kulturmedium zu den frühen Zeitpunkten vorhanden waren, in Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-SEAP-Plasmid im Vergleich zum pBG/wt ELVS 1.5-SEAP-Plasmid transfiziert wurden, viel niedriger waren. Dennoch stieg der Spiegel der AP, der in Zellen, die mit den von dem varianten SIN-1-Sindbis-Virus-Stamm abgeleiteten Vektoren transfiziert wurden, exprimiert wurde, schnell und war zum 96 hpt-Zeitpunkt höher als in Zellen, die mit Wildtyp-Virus-abgeleiteten Vektoren transfiziert wurden.
Die Luciferase-Spiegel, die in BHK-Zellen vorhanden waren, die mit pBG/SIN-1 ELVS-1 1.5-luc- oder pBG/wt ELVS 1.5-luc-Plasmid-DNA transfiziert wurden, wurden bei 24, 48 und 72 hpt verglichen. Die Luciferase-Expressionsspiegel wurden durch Zugeben von 250 μl Reporter-Lysepuffer (Promega, Madison, WI) pro 106 transfizierte Zellen, Zentrifugieren des Lysats bei 14000 UpM für 1 min und dann Mischen der Überstandsfraktion von den Zelllysaten mit einem kommerziell erhältlichen Substrat-Nachweissystem (Promega, Madison, WI), gefolgt von Luminometrie (Analytical Luminescence Laboratory, San Diego, Ka.) quantifiziert.

Die Ergebnisse dieses Experiments (gezeigt in der Tabelle unten), in 10 graphisch dargestellt, laufen parallel zu den Ergebnissen, die mit den alkalische Phosphatase-Expressionsvektoren beobachtet wurden. Zu frühen Zeitpunkten nach der Transfektion waren die Luciferase-Expressionsspiegel niedriger in BHK-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-luc-Plasmid im Vergleich zum pBG/wt ELVS 1.5-luc-Plasmid transfiziert wurden. Dennoch waren die Luciferase-Spiegel bei den 48 und 72 hpt-Zeitpunkten ähnlich in BHK-Zellen, die mit den von dem varianten Sindbis-Virus-SIN-1-Stamm und vom Wildtyp abgeleiteten Expressionsvektoren transfiziert wurden.

Transfiziertes Plasmid	H nach der Transfektion	Relative Lichteinheiten (Mittelw. ±SA)
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-luc	24	1.2 × 10⁹
pBG/wt ELVS 1.5-luc		2.1 × 10⁸
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-luc	48	3.3 × 10⁹
pBG/wt ELVS 1.5-luc		4.1 × 10⁹
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-luc	72	1.8 × 10⁹
pBG/wt ELVS 1.5-luc		5.8 × 10⁹
pCDNA3	48	482

Die Wirksamkeit der Transfektion der pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- und pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmide in BHK-Zellen bei 48 hpt wurde durch direkte X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactopyranosid)-Färbung der Zelleinzelschicht bestimmt (MacGregor, Cell Mol. Genet. 13: 253-265, 1987), um die Zahl der Zellen, die β-Galactosidase exprimieren, direkt zu messen. Die Transfektionswirksamkeiten waren äquivalent und sind in der Tabelle unten gezeigt.

Transfiziertes Plasmid Zahl blauer Zellen/100X Feld

pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal 24 ± 3

pBG/wt ELVS 1.5-β-gal 26 ± 7
Die Spiegel der Vektor-spezifischen RNAs, die in BHK-21-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- oder pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmiden transfiziert wurden, synthetisiert wurden, wurden 48 und 72 Stunden nach der Transfektion durch Northern-Blot-Analyse bestimmt, genau wie früher beschrieben (Dubensky, vorstehend). Die zelluläre Gesamt-RNA wurde von transfizierten BHK-Zellen mit Tri-Reagent isoliert, wie vom Hersteller (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) beschrieben. Die zellulären Gesamt-RNA-Konzentrationen, die in den Proben von BHK-Zellen vorhanden waren, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- oder pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmiden transfiziert wurden, wurden spektrophotometrisch bestimmt. Zusätzlich wurde durch Elektrophorese von 0,5 μg zellulärer Gesamt-RNA auf 0,7% Agarose/TBE-Minigelen, die mit 10 μl/ml Ethidiumbromid gefärbt wurden, bestimmt, dass Material, das von transfizierten Zellen isoliert wurde, intakt war. Eine Northern-Blot-Analyse wurde gemäß Sambrook und Maniatis (1989, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, N. Y.) durchgeführt. Damit RNA von allen transfizierten Proben auf einem Autoradiogramm von einer einzelnen Northern-Blot-Analyse visualisiert werden konnte, wurden 2,5 μg und 5 μg RNA von pBG/wt ELVS 1.5-β-gal- beziehungsweise pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-transfizierten Zellen pro Spur aufgetragen. Zwei Proben der RNA von individuellen Transfektionen mit beiden bei 48 und 72 hpt getesteten Plasmiden wurden auf 0,7% Formaldehyd-Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Zeta-probe-Membran (Bio-Rad, Richmond, Ka.) transferiert. Der Blot wurde mit zufällig geprimten Sonden, die dem β-Galactosidase-Gen entsprachen, hybridisiert. Die Ergebnisse dieses Experiments, gezeigt in 11A, zeigen, dass der Spiegel der Vektor-spezifischen RNA, der in Zellen synthetisiert wurde, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-DNA transfiziert wurden, 48 und 72 Stunden nach der Transfektion mindestens 100-fach niedriger war als der Spiegel der RNA, der in pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-transfizierten Zellen nachgewiesen wurde.

Zusätzlich wurden die β-Galactosidase-Expressionsspiegel in transfizierten Ganzzell-Lysaten durch Zugeben von 250 μl Reporter-Lysepuffer (Promega, Madison, WI) pro 10⁶ transfizierte Zellen, Zentrifugieren des Lysats bei 14000 UpM für 1 min und dann Mischen der Überstandsfraktion von den Zelllysaten mit einem kommerziell erhältlichen Substrat-Nachweissystem (Clontech, Palo Alto, Ka.), gefolgt von Luminometrie (Analytical Luminescence Laborstory, San Diego, Ka.), quantifiziert. Die Ergebnisse dieses Experiments (gezeigt in der Tabelle unten und graphisch in 19C) zeigen, das die β-Galactosidase-Expressionsspiegel zu frühen Zeitpunkten nach der Transfektion signifikant niedriger in BHK-Zellen, die mit pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-Plasmid transfiziert wurden, im Vergleich zum pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmid waren. Dennoch stieg die Reporterexpression im Zeitablauf schnell in pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-transfizierten Zellen, so dass die β-Galactosidase-Spiegel zum 120 h-Endzeitpunkt höher waren als in Wildtyp-Virus-transfizierten Zellen.

Transfiziertes Plasmid	H nach der Transfektion	Relative Lichteinheiten (Mittelw. ±SA)
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal	24	54030 ± 7348
pBG/wt ELVS 1.5-β-gal		4801590 ± 74,425
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal	48	310830 ± 31083
pBG/wt ELVS 1.5-β-gal		2214921 ± 248071
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal	72	1443474 ± 98156
pBG/wt ELVS 1.5-β-gal		3793524 ± 857336
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal	96	2232585 ± 299166
pBG/wt ELVS 1.5-β-gal		3514262 ± 548225
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal	120	3200910 ± 128036
pBG/wt ELVS 1.5-β-gal		1986537 ± 166869
pCDNA3		3637

Die Expression der β-Galactosidase in Zellen, die mit den pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- oder pBG/wt ELVS 1.5-β-gal-Plasmid-DNAs transfiziert wurden, wurde zum 120 hpt-Endzeitpunkt auch direkt durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch für das Reporterprotein ist (Boehringer Mannheim), gemessen. Parallel mit der Reporterprotein-Aktivität, die 120 hpt bestimmt wurde, war der Spiegel des β-Galactosidase-Proteins in BG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal-transfizierten BHK-Zellen im Vergleich zu pBG/wt ELVS 1.5-β-gal im selben Bereich oder höher und ist in 11C gezeigt.
Zusammengefasst zeigen die hierin beschriebenen Ergebnisse, dass der Spiegel von Vektor-spezifischer, synthetisierter RNA in pBG/SIN-1 ELVS-transfizierten Zellen mindestens 100-fach niedriger ist im Vergleich zu pBG/wt ELVS-transfizierten Zellen. Wichtig ist jedoch, dass die Spiegel der Reportergen-Expression nach einer 48-72 Stunden-Verzögerung in pBG/SIN-1 ELVS-transfizierten Zellen äquivalent oder höher sind im Vergleich zu pBG/wt ELVS-transfizierten Zellen. Der Phänotyp von pBG/SIN-1 ELVS, charakterisiert durch hohe Expressionsspiegel in Kombination mit niedriger Vektor-spezifischer RNA-Synthese in transfizierten Zellen, liegt wahrscheinlich aufgrund einer verminderten oder fehlenden Inhibition der Wirtszell-Proteinssynthese vor. Diese Eigenschaft von pBG/SIN-1 ELVS resultiert daher in viel höheren Spiegeln des exprimierten Reporterproteins pro subgenomischer mRNA-Translationsmatrize in transfizierten Zellen im Vergleich zu pBG/wt ELVS. Zusammengefasst folgt der Phänotyp der Plasmid-DNA-Expressionsvektoren, die von den varianten SIN-1-Stämmen abgeleitet sind, in Vergleich zu Wildtyp-Virus-abgeleiteten Vektoren dem Elternvirus in Bezug auf äquivalente Expressionsspiegel, kombiniert mit relativ niedrigen Spiegeln der RNA-Synthese. Da Vektoren keines der Sindbis-Virus-Strukturproteine enthalten, muss dieser Phänotyp auf die Nichtstrukturgene der SIN-1-Virusvariante kartieren.
BEISPIEL 5
MODIFIZIERUNGEN VON PLASMID-DNA-SIN-1-ABGELEITETEN EXPRESSIONSVEKTOREN
Die Expressionsspiegel der heterologen Gene in Zielzellen von Alphavirus-basierten Vektoren werden durch einige Faktoren beeinflusst, einschließlich der Wirtsgattung und der Vektorkonfiguration. Zum Beispiel sind die β-Galactosidase-Expressionsspiegel in BHK-Zellen 10- bis 100-fach höher im Vergleich zu manchen menschlichen Zellen wie HT1080, die mit pBG/ELVS-Vektoren transfiziert sind. Die Spiegel der Reportergen-Expression in BHK- und einigen menschlichen Zelllinien, die mit pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid-DNA transfiziert sind (siehe Beispiel 4), wurden verglichen, um den relativen Spiegel der Vektor-spezifischen Expression in Zelltypen, die von der beabsichtigten in vivo-Zielgattung stammen, zu etablieren. Die Spiegel der β-Galactosidase-Expression in BHK-Zellen und HT1080 (ATCC CCL 121)-Zellen, einer menschlichen Fibrosarkom-Linie, transfiziert mit dem pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid oder mit einem konventionellen Plasmid-Expressionsvektor, wurden bestimmt. Der konventionelle Plasmidvektor wurde durch Insertion des lacZ-Gens (Promega, Madison, WI) in die mehrfache Clonierungsstelle des CMV-Promotor-gelenkten pUC-abgeleiteten Expressionsplasmids (Invitrogen, San Diego, Ka.) konstruiert und ist als pCMV-β-gal bekannt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung, angegeben in 12A, zeigen, dass der Spiegel der β-Galactosidase-Expression in HT1080-Zellen, die mit der pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid-DNA transfiziert wurden, im Vergleich zu BHK-Zellen beinahe 100-fach niedriger war. Die Zellen wurden auch mit pCMV-β-gal transfiziert, um die RNA-Polymerase II-Expression von der Sindbis-Virusvektor-Replikonexpression zu trennen. Während die Expression in HT1080-Zellen, transfiziert mit pCMV-β-gal-Plasmid, im Vergleich zu BHK-Zellen 5- bis 10-fach abnahm, sank in diesem Experiment die Expression in HT 1080-Zellen, die mit der pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid-DNA transfiziert wurden, beinahe 100-fach. Daher weisen die Ergebnisse darauf hin, dass das dramatische Absinken der Reportergen-Expression in HT1080-Zellen, die mit pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid-DNA transfiziert wurden, zum Teil aufgrund der verminderten Aktivität des Sindbis-Virusvektor-Replikons in diesen menschlichen Zellen vorliegt.
In Anbetracht der Gesamtplastizität des alphaviralen RNA-Genoms und der Vermehrung des Virus in BHK-Zellen ist es nicht überraschend, dass die Expressionsspiegel der heterologen Gene in den Wirtszelllinien, von denen die Vektoren abgeleitet wurden, am höchsten sind. Daher kann die Selektion von Alphaviren mit dem SIN-1-Phänotyp (wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben), der durch vergleichbar niedrige virale RNA-Spiegel und äquivalente Virus-Produktionsspiegel, kombiniert mit einer verzögerten oder fehlenden Inhibition der Wirtszell-Proteinsynthese charakterisiert ist, in allen menschlichen primären oder diploiden oder polyploiden menschlichen Zellen durchgeführt werden.
Zusätzlich zum Selektieren von Alphaviren mit erwünschten Phänotypen in Zellen (z. B. menschlich), die in vivo mehr vergleichbar mit Zielzellen sind, können auch einige alternative Modifikationen der Prototyp-Plasmid-DNA-Expressionskassetten-Komponenten durchgeführt werden. Zum Beispiel verstärkt die Substitution des MoMLV-RNA-Polymerase II-Promotors mit dem stärkeren sehr frühen (IE) CMV-Promotor signifikant den Spiegel der heterologen Genexpression in transfizierten Zellen (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996, und Dubensky et al., WO 95/07994 ). Weiterhin kann die Nebeneinanderstellung von Introns, zum Beispiel des kleinen SV40-t-Antigens oder von CMV-Intron A, entweder stromaufwärts oder stromabwärts vom heterologen Gen den Spiegel der heterologen Genexpression in einigen transfizierten Zelltypen steigern (Dubensky et al., vorstehend).
Einige weitere alternative Modifikationen der Prototyp-Plasmid-DNA-Expressionskassetten-Komponenten können auch angewendet werden, um die Gesamtexpression in transfizierten Zellen in vitro oder in vivo zu verstärken. In einer Modifikation wurde das post-transkriptionelle Hepatitis B-Virus (HBV)-regulatorische Element (PRE) in die pBG/wt ELVS 1.5-βgal-Plasmid-DNA inseriert. Die PRE-Sequenz aktiviert den Transport der HBV-S-Transkripte in cis vom Nukleus zum Cytoplasma. Die PRE-Sequenz scheint unabhängig von Spleiß-Donor- und Akzeptorstellen zu wirken, und es ist gezeigt worden, dass sie die cytoplasmatische Expression eines β-Globin-Transkripts, das keine Introns enthält, aktiviert. Es ist vorgeschlagen worden, dass die PRE in cis wirkt, um den Export von nukleären Transkripten zu erlauben, die nicht wirksam mit dem Spleißweg interagieren und daher nicht gut aus dem Nukleus exportiert werden (Huang et al., Molecular and Cellular Biology 15: 3864-3869, 1995).
Die PRE-Sequenz wurde durch zuerst Isolieren eines PCR-hergestellten 564 bp-Fragments von HBV vom genomischen Volllängen-Clou des ADW-Virusstamms pAM6 (ATCC Nr. 39630) in pBG/SIN-1 ELVS 1.5-βgal cloniert. Das amplifizierte Fragment erstreckt sich von Base 1238-1802 des HBV-Genoms. Die Primersequenzen sind unten angegeben.
Die Primer bringen eine NotI-Erkennungsstelle am 5'-Ende des Fragments und eine EaeI-Erkennungsstelle am 3'-Ende ein. NotI und EaeI haben kompatible klebende Enden. Die EaeI-Erkennungsstelle liegt intern zur NotI-Stelle, daher schneidet EaeI beide Stellen.
Das PCR-Fragment wurde mit EaeI verdaut und in NotI-verdautes/CIAP-behandeltes pBG/wt ELVS 1.5-βgal cloniert. Der korrekte Clon bewahrt die NotI-Stelle am 5'-Terminus der PRE und wird pBG/wt ELVS/PRE 1.5-βgal bezeichnet.
Die mögliche Wirkung der PRE-Sequenz, die in den ELVS-Plasmiden enthalten ist, auf eine heterologe Genexpression in transfizierten Zellen wurde bestimmt. Kurz, BHK- und HT1080-Zellen wurden in 12 mm-Schalen zu 75% Konfluenz kultiviert und mit 500 ng pCMV-β-gal-, pBG/wt ELVS 1.5-βgal- oder pBG/wt ELVS/PRE 1.5-βgal-Plasmid-DNA im Komplex mit Lipofectamin (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) transfiziert, und der Spiegel der β-Galactosidase-Expression wurde 48 h später bestimmt. Die Transfektionswirksamkeiten wurden durch direkte X-Gal-Färbung der transfizierten Einzelzellschichten bestimmt, wie im Beispiel 4 beschrieben, und sind in der Tabelle unten gezeigt.

Zahl blauer Zellen/12 mm-Schale

Konstrukt BHK HT1080

pCMV-β-gal 549 42

pBG/wt ELVS 1.5-βgal 146 1

pBG/wt ELVS/PRE 1.5-βgal 334 33

Schein 0 0
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Zahl der BHK- oder HT1080-Zellen, die mit ELVS-Plasmiden, exprimierend β-Galactosidase, transfiziert wurden, durch den Einschluss der RNA-Transport-PRE-Sequenz in den Vektor dramatisch erhöht wurde. Weiterhin weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Ursache für die verminderten Expressionsspiegel heterologer Gene in HT1080-Zellen im Vergleich zu BHK-Zellen, die mit ELVS-Plasmid-DNA transfiziert wurden, der ineffiziente Transport des primären Transkripts aus dem Nukleus ist.
Parallel mit der höheren Frequenz der Reporterprotein-exprimierenden HT1080-Zellen, die mit den ELVS-Plasmiden, enthaltend die PRE-Sequenz, transfiziert sind, waren die Spiegel der β-Galactosidase in Lysaten von HT1080-Zellen, die mit ELVS-Vektoren, enthaltend die PRE-Sequenz, transfiziert sind, dramatisch höher. Diese Ergebnisse sind in 12B illustriert und zeigen zusammengefasst mit den Ergebnissen, die oben in der Tabelle gezeigt sind, dass funktionelle Vektor-Replikons in menschlichen Zellen, die mit ELVS-Plasmiden transfiziert sind, ineffizient aus dem Nukleus transportiert werden. Weiterhin erhöht der Einschluss der PRE-Sequenz im ELVS-Plasmidkonstrukt den Spiegel der heterologen Genexpression in allen getesteten Zellen, was eine deutliche Beziehung zwischen der Wirksamkeit des cytoplasmatischen Vektor-Replikontransports und dem Gesamt-Expressionsspiegel heterologer Gene zeigt.
Einige andere virale Sequenzelemente, die in cis wirken, um nicht-gespleißte RNA zu transportieren, sind auch identifiziert worden. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass eine 219 bp-Sequenz, die zwischen den nts. 8022 und 8240 nahe dem 3'-Ende des Mason-Pfizer-Affenvirus (MPMV)-Genoms liegt, eine Rev-unabhängige menschliche Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1)-Replikation ermöglicht (Brav et al., PNAS 91: 1256-1260, 1994). Das MPMV-RNA-Transportelement, bekannt als das konstitutive Transportelement (CTE), wird zuerst durch Isolieren eines PCR-erzeugten 219 bp-Fragments von MPSV von der genomischen Volllängen-Clon-Matrize (Sonigo et al., Cell 45: 375-385, 1985) oder dem subgenomischen MPSV-Clon pGEM7FZ(–)MPSV 8007-8240 (D. Rekosh, Ham-Rek Laborstories, SUNY in Buffalo, 304 Foster Hall, Buffalo, New York) in das pBG/SIN-1 ELVS 1.5-βgal-Plasmid inseriert. Das amplifizierte Fragment erstreckt sich von Base 8022-8240 des MPSV-Genoms. Die Primersequenzen sind unten angegeben.
Die Primer bringen eine NotI-Erkennungsstelle am 5'-Ende des Fragments und eine EaeI-Erkennungsstelle am 3'-Ende ein. NotI und EaeI haben kompatible klebende Enden. Die EaeI-Erkennungsstelle liegt intern zur NotI-Stelle, daher schneidet EaeI beide Stellen.
Das PCR-Fragment wird mit EaeI verdaut und in NotI-verdautes/CIAP-behandeltes pBG/wt ELVA 1.5-βgal cloniert. Der korrekte Clon bewahrt die NotI-Stelle am 5'-Terminus der PRE und wird pBG/wt ELVS/CTE 1.5-βgal genannt.
Zusätzlich zu den HBV-PRE- und MPSV-CTE-Sequenzen können einige RNA-Transportelemente von anderen viralen oder zellulären Quellen in die ELVS-Plasmidkonstrukte inseriert werden, wie oben beschrieben. Zum Beispiel schließen einige dieser Elemente das HIV-Rev-responsive Element (Malim et al., Nature, 338: 254-257, 1989), das HTLV 1-Rex-Element (Ahmed et al., Genes Dev. 4: 1014-1022, 1990) und eine andere cis-wirkende Sequenz vom Affen-Retrovirus Typ 1 (Zolotukhin et al., J. Virol. 68: 7944-7952, 1994) ein. Zusätzlich kann auch jedes der obigen RNA-Transportelemente in die Strukturprotein-Expressionskassetten, Verpackungszelllinien oder Hersteller-Zelllinien, die in den Beispielen 6 und 7 beschrieben sind, inkorporiert werden.
In noch einer anderen Modifikation der Prototyp-ELVS-Vektoren kann die Expression der Alphavirus-Replikons von einem RNA-Polymerase I-Promotor gelenkt werden. Kurz, weil die RNA-Polymerase I-Promotoren nicht gewebespezifisch sind und im Wesentlichen in allen menschlichen Zellen im Körper exprimiert werden, liefern sie eine attraktive Alternative für eine Plasmid-DNA-gelenkte Alphavirus-Replikon-Expression in transfizierten Zellen. Zum Beispiel ist der menschliche rDNA-Promotor (Plasmid prHU3, Learned und Tjian, J. Mol. Appl. Gen., 1: 575-584, 1982) verwendet worden, um einen Vektor für eine heterologe Genexpression zu konstruieren (Palmer et al., Nucl. Acids Res. 21: 3451-3457, 1993).
Daher kann in einer Ausführungsform der Erfindung ein RNA-Polymerase I-Promotor nebeneinandergestellt mit dem 5'-Ende der Replikon-cDNA sein, so dass das erste Nucleotid, das in transfizierten Zellen transkribiert wird, dem authentischen Alphavirus-5'-Ende entspricht. Die Identifizierung des RNA-Polymerase I-Promotor (z. B. Plasmid prHU3)-Nucleotids, an dem die Transkriptionsinitiierung erfolgt, wird bestimmt, wie früher beschrieben (Dubensky et al., WO 95/07994 ).
Alle hierin beschriebenen Modifikationen können mit ELVS-Konstrukten, enthaltend die Sindbis-Virus-Wildtyp- oder -SIN-1nsPs- oder -nsP-Gene von jedem Alphavirus, durchgeführt werden. Zum Beispiel können auch alle der in Beispiel 5 bereitgestellten Konstruktionen mit dem Plasmid pBG/SIN-1 ELVS 1.5-βgal, dessen Konstruktion in Beispiel 4 beschrieben ist, durchgeführt werden.
BEISPIEL 6
KONSTRUKTION VON ALPHAVIRUS-VERPACKUNGSZELLLINIEN
In der vorliegenden Offenbarung werden Alphavirus-Verpackungszelllinien (PCL) offenbart, wobei die Virus-abgeleiteten Strukturproteine, die für die RNA-Verpackung und die Bildung von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln notwendig sind, durch eine oder mehrere stabil transformierte Strukturprotein-Expressionskassetten codiert werden. Die Synthese dieser Proteine erfolgt vorzugsweise in einer induzierbaren Weise und in besonders bevorzugten Ausführungsformen durch Transkription von subgenomischer mRNA von ihren natürlichen „Verbindungsregion"-Promotoren. Eine induzierbare subgenomische Transkription wird durch die eingesetzte Alphavirus-Vektor-RNA selbst vermittelt (13). Nach einer primären Transkription der Strukturprotein-Expressionskassette(n) wird die cytoplasmatische Amplifizierung des RNA-Transkripts durch Vektor-codierte Nichtstrukturproteine initiiert und führt schlussendlich zur Transkription des Verbindungsregion-Promotors und zu einer Strukturprotein-Expression in hohem Spiegel. Die Strukturprotein-Expressionskassetten können jedes der vorher beschriebenen Elemente der vorliegenden Erfindung einschließen, einschließlich der RNA-Transportelemente (z. B. HBV-PRE und MPMV-CTE) und Spleißsequenzen. Solche PCL und ihre stabil transformierten Strukturprotein-Expressionskassetten können unter Verwendung der Verfahren, die in der PCT-Anmeldung WO 95/07994 beschrieben sind, oder unter Verwendung neuer Ansätze, die hierin beschrieben werden, abgeleitet werden. Die PCL können von beinahe jedem existierenden Eltern-Zelltyp, einschließlich sowohl Säuger- als auch nicht-Säugerzellen, abgeleitet werden. Bevorzugt für das Ableiten von PCL sind Zelllinien von menschlichem Ursprung.
A. Konstruktion von Vektor-induzierbaren Alphavirus-PCL
Zum Beispiel wurde eine Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette konstruiert, wobei die primäre Transkription von einem sehr frühen CMV-Promotor ein RNA-Molekül produziert, das zu einer wirksamen cytoplasmatischen Amplifizierung und Strukturprotein-Expression nur nach der Translation von nichtstrukturellen Replikase-Proteinen von der Vektor-RNA in der Lage ist. Genau wurde das Plasmid pDCMV-dlnsPSIN (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996), ein DNA-basierter defekter Sindbis-Helfer (DH)-Vektor, modifiziert, um sowohl eine antigenomische Hepatitis Delta-Virus (HDV)-Ribozym-Sequenz (Perotta und Been, Nature 350: 434-436, 1991) für die 3'-End-RNA-Prozessierung als auch ein kleines t-Antigen-Intron von SV40, inseriert in die Region der Nichtstrukturprotein-Gendeletion, zu enthalten. Aufgrund von Restriktionsstellen-Verdoppelungen, die mit der Insertion der HDV-Ribozymsequenz assoziiert sind, wurde ein zusätzliches Plasmid von Dubensky et al., (ebd.), pDLTRSINgHDV, als Ausgangsmaterial verwendet, um das modifizierte CMV-basierte DH-Konstrukt zu rekonstruieren. Das Plasmid pDLTRSINgHDV, ein LTR-basierter genomischer Sindbis-Clon, enthaltend das HDV-Ribozym, wurde mit BglII verdaut, um den existierenden LTR-Promotor und die Sindbis-Nucleotide 1-2289 (Nummerierung gemäß Strauss et al., Virology 133: 92-110, 1984) zu entfernen, mit intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II^TM (Bio101, San Diego, Ka.) gereinigt. Das entsprechende 5'-End-Fragment mit einem CMV-Promotor wurde durch BglII-Verdau des genomischen Sindbis-Clons pDCMVSINg (Dubensky et al., ebd.) und Reinigung von einem 1% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II erhalten und dann in den BglII-deletierten pDLTRSINgHDV-Vektor ligiert, um das Konstrukt pDCMVSINgHDV herzustellen. Es wurde gezeigt, dass dieses CMV-basierte genomische Plasmid mit einem HDV-Ribozym innerhalb von 24 h nach der Transfektion in BHK-Zellen infektiöses Sindbis-Virus und eine cytopathische Wirkung produziert. Das defekte Helferplasmid pDCMVdlnsPSINgHDV, enthaltend das HDV-Ribozym, wurde dann durch BspEI-Verdau und Re-Ligierung unter verdünnten Bedingungen konstruiert, um Nichtstrukturgen-Sequenzen zwischen den Nucleotiden 422 und 7054 zu entfernen. Danach wurde das SV40-Intron durch PCR synthetisiert und in die Region der Nichtstrukturprotein-Gendeletion inseriert. Die Amplifizierung der SV40-Intronsequenz wurde durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 30 Sekunden-Extensionsdauer unter Verwendung des Plasmids phBR322/SV40 (Stamm 776, ATCC #45019) als Matrize und der folgenden Oligonucleotidprimer, die gestaltet wurden, um flankierende BspEI- oder BamHI-Stellen zu enthalten, erreicht.
Nach der Amplifikation wurde das DNA-Fragment unter Verwendung eines QIAquickspin PCR-Reinigungskits (Qiagen, Chatsworth, Ka.) gereinigt, mit BspEI und BamHI verdaut, von einem 1,2% Agarosegel unter Verwendung von Mermaid^TM (Bio101, San Diego, Ka.) gereinigt und in das defekte Helferplasmid pDCMV-dlnsPSIN ligiert, das auch mit BspEI und BamHI verdaut, mit intestinaler alkalischer Kälber-Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt wurde, um das Konstrukt pDCMV-intSINrbz herzustellen (14). Das Plasmid pDCMV-intSINrbz, das auch einen selektierbaren, SV40-Promotor gelenkten Neomycin-Resistenzmarker auf einem anderen Teil des Plasmids enthält, wurde unter Verwendung von Lipofectamine^TM (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) in BHK-Zellen transfiziert, wie durch den Hersteller beschrieben. Ungefähr 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 600 μg/ml 0418 (Neomycin), re-plattiert. Die Medien wurden periodisch durch frische G418-enthaltende Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen wurden wachsen gelassen. Die Zellen wurden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Clone wurde gezüchtet und für das Screenen expandiert.
Eine positive Verpackungsaktivität für die individuellen Clone wurde durch Lipofectin^TM (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)-Transfektion mit Sindbis-Vektor-RNA, die ein Luciferase-Reportergen exprimiert (beschrieben in Dubensky et al., ebd.), Ernten der Kulturüberstände ungefähr 24 h nach der Transfektion und Testen auf das Vorliegen von verpackten Sindbis-Luciferase-Vektorpartikeln identifiziert. Zusätzlich wurden die anfänglichen Transfektionsspiegel durch Ernten der transfizierten Zelllysate unter Verwendung des Reporter-Lysepuffers (Promega, Madison, WI) und Testen auf das Vorliegen einer Luciferase-Aktivität durch Verwenden des Luciferin-Substrats (Promega), wie vom Hersteller beschrieben, bestimmt. Um auf verpackte Vektorpartikel in den Kulturüberständen zu testen, wurde 1 ml unverdünnter geklärter Überstand verwendet, um frische BHK-Zelleinzelschichten für ungefähr 18 h zu infizieren. Die Zellen wurden danach wie oben lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde bestimmt. Das Vorliegen der Luciferase-Aktivität in den infizierten BHK-Zellen war eine Bestätigung von verpackten Vektorpartikeln in den transfizierten Zell-Überständen. Einige positive Zellclone, die integrierte Kopien der pDCMV-intSINrbz-Strukturprotein-Expressionskassette beherbergen und als PCL wirken, wurden identifiziert. Verpackungsdaten für zwei der individuellen PCL-Clone (#10s-19 und #10s-22), die repräsentativ für die Gruppe waren, sind in 15 gezeigt. Zusätzlich wurde der Titer der verpackten Vektorpartikel, die produziert wurden, durch Transfizieren eines individuellen PCL-Clons (#10s-22) mit SIN-β-gal-Vektor-RNA (beschrieben in Dubensky et al., ebd.) bestimmt. Der Kulturüberstand wurde 48 h nach der Transfektion gewonnen, durch Passage durch einen 0,45 mm-Filter geklärt, und frische BHK-Einzelzellschichten wurden mit 10-fachen Verdünnungen des Überstands infiziert. Ungefähr 14 h nach der Infektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit 2% Formaldehyd fixiert, wieder mit PBS gewaschen und mit X-Gal gefärbt. Die Vektorpartikel-Einheiten wurden dann durch Zählen der individuellen blaugefärbten Zellen bestimmt. Die verpackten β-gal-Vektortiter von diesem PCL-Clon waren ungefähr 10⁶ infektiöse Einheiten/ml Überstand. Eine Vektor-kontrollierte Induzierbarkeit der Sindbis-Strukturprotein-Expression wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines polyclonalen Kaninchen-Antiserums, das spezifisch für die Strukturproteine ist, gezeigt. Positive 10s-22-PCL- und Negativkontroll-BHK-Zelllysate wurden in Lameli-Probenpuffer entweder vor (U; nicht-induziert) oder nach (I: induziert) der Transfektion mit der SIN-β-gal-Vektor-RNA erzeugt. Wie in 16 gezeigt, war das einzige Zell-Lysat, das eine Expression von Sindbis-Strukturproteinen zeigte, der 10s-22-PCL-Clon nach Transfektion mit der Vektor-RNA. Unterschiede in den ersichtlichen Spiegeln der Expression zwischen dem Capsidprotein und den Hüll-Glycoproteinen reflektieren nicht die tatsächlichen Mengen des Proteins, die hergestellt werden, sondern vielmehr die niedrigere Stabilität der Hüll-Glycoproteine während des Zell-Lysevorgangs, der in diesem bestimmten Experiment verwendet wurde.
Die Verpackungsaktivität des CMV-basierten DH-Konstrukts war in nicht-Säugerzellen, zum Beispiel C6/36-Stechmückenzellen, auch sehr wirksam. Die Verwendung eines solchen nicht-Säuger-Elternzelltyps für das Ableiten von PCL kann besonders vorteilhaft sein, wenn die PCL für eine folgende Verwendung als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Vektor-Hersteller-Zelllinien gedacht sind. Der Vorteil dieses Zelltyps ist die natürliche Fähigkeit von Alphaviren, eine persistente Infektion ohne den Säugerzell-assoziierten Phänotyp der Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese und die resultierende cytopathische Wirkung (CPE) zu etablieren. Daher kann ein DNA-basierter Alphavirus-Vektor (Beispiele 4 und 5) mit einem geeigneten selektierbaren Marker stabil in Stechmücken- oder andere nicht-Säugerzell-abgeleitete PCL transformiert werden. 17A zeigt, dass sowohl ein DNA-basierter Luciferase-Reportervektor als auch DH-Helfervektor, die Sindbis-Strukturproteine unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimieren, in C6/36-Zellen vollständig funktionell waren, wie durch Luciferase-Vektor-Verpackung gezeigt.
B. Konstruktion von PCL mit einem funktionell verknüpften Selektionsmarker
In anderen Aspekten dieser Offenbarung ist ein selektierbarer Marker funktionell mit der Transkription der Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette verknüpft. In bevorzugten Ausführungsformen wird diese funktionelle Verknüpfung entweder durch Insertion des Markers in die Region der Nichtstrukturprotein- Gendeletion als eine Fusion mit den verbleibenden nsP1-Aminosäuren oder durch Insertion stromabwärts der Strukturprotein-Gene unter der translationellen Kontrolle einer internen ribosomalen Eintrittsstellen (IRES)-Sequenz erreicht. Wieder wird die Amplifizierung des primären Strukturprotein-Gen-mRNA-Transkripts und die Induktion der Strukturprotein-Expression durch das eingesetzte Vektor-RNA-Molekül und seine synthetisierten Nichtstrukturproteine gesteuert.
Genau wurde für die Konstruktion der Strukturprotein-Expressionskassette das Plasmid pBGS131 (Spratt et al., Gene 41: 337-342, 1986; ATCC #37443) modifiziert, um irrelevante Sequenzen zu entfernen und um eine vorhandene XhoI-Stelle im Kanamycin-Resistenzgen nicht-funktionell zu machen. Das Plasmid pBGS131 wurde mit XhoI verdaut, und ein synthetischer doppelsträngiger Oligonucleotid-Linker mit XhoI-kompatiblen Enden wurde in die Stelle ligiert. Das synthetische 12-mer-Oligonucleotid, das unten gezeigt ist, wurde als ein teilweises Palindrom gestaltet, das an sich selbst anlagern würde, was klebende XhoI-Enden für die Ligierung herstellt und den offenen Leserahmen des Kanamycin-Resistenzgens durch Inserieren von vier Aminosäuren im Leserahmen bewahrt.
Die Insertion dieses Oligonucleotids resultierte in einem XhoI-Stelle-deletierten Plasmid, bezeichnet als pBGS131dlXhoI. Das Plasmid wurde als Nächstes mit BspHI verdaut und mit sich selbst unter verdünnten Bedingungen re-ligiert, um 829 bp der irrelevanten Sequenz zwischen dem ColE1-Replikon und dem Kanamycinresistenz-Marker zu entfernen, was das Plasmid pBGS131dlB herstellte. Als Nächstes wurde die BspHI-Stelle durch Verdauen von pBGS131dlB mit BspHI, Erzeugen von stumpfen Enden mit dem Klenow-Enzym und dNTPs und Ligieren mit einem Überschuss an PacI-Linker in eine PacI-Stelle geändert.
Dieses neue Konstrukt, bezeichnet als pBGS131dlB-P, wurde weiter durch Verdauen mit FspI und PvuII, um zusätzliche 472 bp, einschließlich der mehrfachen Clonierungsstelle (MCS), zu entfernen, und Reinigen des verbleibenden Vektors von einem 1% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II modifiziert. Eine Ersatz-MCS wurde in den modifizierten Vektor durch Aneinanderlagern von zwei komplementären Oligonucleotiden, PME.MCSI und PME.MCSII, und Ligieren mit dem linearen Plasmid inseriert.
Der neue, ungefähr 2475 bp lange Clonierungsvektor wurde pBGSVG bezeichnet und enthielt die folgende mehrfache Clonierungsstelle: <PmeI-BglII-XhoI-NotI-EcoRI-PmeI>. Die Insertion der Strukturprotein-Expressionskassette, die einen funktionell verknüpften selektierbaren Marker enthält, wurde schrittweise fortgeführt, wie folgt: Ein DNA-Fragment, umfassend das 3'-Ende von Sindbis-Virus, ein synthetischer A₄₀-Bereich, das antigenomische HDV-Ribozym und ein BGH-Transkriptions-Terminierungssignal, wurde durch Verdau mit NotI und EcoRI und Reinigung von einem 1% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II vom Plasmid pBG/SIN-1 ELVS 1.5 (Beispiel 5) entfernt. Das Plasmid pBGSVG wurde auch mit NotI und EcoRI verdaut, von einem 1% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN gereinigt und mit dem gereinigten 3'-Ende/A40/HDV/BGH-Fragment ligiert, um das Konstrukt pBGSV3' herzustellen. Als Nächstes wurde ein ungefähr 9250 bp-Sindbis-cDNA-Fragment, enthaltend die Strukturprotein-Gene und einen großen Teil der Nichtstrukturprotein-codierenden Region, von Plasmid pDLTRSINg (Dubensky et al., ebd.) durch Verdau mit BglII und FspI entfernt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt. Das Sindbis-cDNA-Fragment wurde dann in das Plasmid pBGSV3' ligiert, das auch mit BglII und FspI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt wurde. Das neue Konstrukt wurde pBGSV3'BF bezeichnet. In der Folge wurde dieses Konstrukt für die Insertion des verbleibenden 5'-Endes und der Nichtstrukturgen-Sequenzen zusammen mit einem CMV-IE-Promotor mit BglII verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit GENECLEAN II gereinigt. Die verbleibenden Sequenzen wurden durch Verdau des Plasmids pDCMVSINg (Dubensky et al., ebd.) mit BglII, Reinigung des Fragments von einem 1% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II und Ligierung mit dem linearen pBGSV3'BF-Vektor erhalten, um das CMV-gelenkte genomische Sindbis-Konstrukt pBGSVCMVgen zu bilden. Die Funktionalität dieses Konstrukts für die Initiierung des Sindbis-Virus-Replikationszyklus wurde durch Lipofectamin-vermittelte Transfektion des pBGSVCMVgen-Plasmids in BHK-Zellen und die Beobachtung eines CPE innerhalb von 24 h nach der Transfektion bestimmt.
Das Plasmid pBGSVCMVgen wurde danach verwendet, um eine DH-Strukturprotein-Expressionskassette durch Deletieren des Großteils der Nichtstrukturprotein-Gensequenzen und Inserieren eines Neomycin-Resistenzgens als eine Fusion im Leserahmen mit den verbleibenden Codons des offenen nsP1-Leserahmens zu konstruieren. Kurz, das Neomycin-Resistenzgen wurde durch Standard-drei-Zyklus-PCR vom pcDNA3-Vektor (Invitrogen, San Diego, Ka.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet wurden, um flankierende BspEI- und BamHI-Stellen zu enthalten.
Nach der Amplifizierung wurde das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt, mit BspEI und BamHI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt und in das Plasmid pBGSVCMVgen ligiert, das auch mit BspEI und BamHI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden war. Das resultierende Konstrukt wurde pBGSVCMVdlneo bezeichnet und ist schematisch in 14 gezeigt. Die Konfiguration von pBGSVCMVdlneo schließt als Teil der Strukturprotein- Expressionskassette und gesteuert durch denselben CMV-Promotor ein Fusionsprotein ein, umfassend das Initiator-Methionin und die 121 aminoterminalen Aminosäuren von nsP1 und das Neomycin-Resistenzgen, dem sein Methionin-Initiator-Codon und die nächsten zehn Aminosäuren fehlen.
Das Plasmid pBGSVCMVdlneo wurde unter Verwendung von Lipofectamin, wie vom Hersteller beschrieben, in BHK-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 600 μl/ml des Wirkstoffs G418 (Neomycin), re-plattiert. Die Medien wurden periodisch mit frischen G418-enhaltenden Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen wurde erlaubt, zu wachsen. Die Zellen wurden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone wurden gezüchtet und für ein Screenen expandiert. Eine positive Verpackungsaktivität für die individuellen Clone wurde durch Transfizieren mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA und Testen auf das Vorliegen von verpackten Sindbis-Luciferase-Vektorpartikeln, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, identifiziert. Einige positive Zellclone, die integrierte Kopien der pBGSVCMVdlneo-Strukturprotein-Genexpressionskassette beherbergten und als PCL wirkten, wurden identifiziert. SNBS^TM-Luciferase-Vektor-Verpackungsdaten für individuelle Clone (F11, F13, F15), die repräsentativ für die Gruppe sind, sowie der vorher beschriebenen 10s-22-PCL-Linie sind in 18 gezeigt.
Zusätzlich zum Zeigen der funktionellen Verpackungsaktivität mit Sindbis-Luciferase-Vektoren zeigten zusätzliche Experimente, die unter Verwendung derselben PCL durchgeführt wurden, auch, dass Vektoren, die von anderen Alphaviren stammten, auch verpackt werden konnten. Zum Beispiel wurden sowohl Sindbis- (Dubensky et al., ebd.) als auch Semliki Forest- (pSFV3-lacZ; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) Vektor-RNAs, die β-Galactosidase exprimieren, in die F15-Verpackungszelllinie transfiziert. Ungefähr 48 h nach der Transfektion wurden die Kulturüberstände geerntet, geklärt, reihen-verdünnt und verwendet, um frische BHK-Zelleinzelschichten für die Bestimmung der Vektorpartikel-Titer zu infizieren. 18 h nach der Infektion wurden die BHK-Zellen fixiert, mit X-Gal gefärbt, und die blaugefärbten Zellen wurden gezählt, wie früher beschrieben. Die für Sindbis-β-gal erhaltenden Vektortiter waren ungefähr 5 × 10⁶ IE/ml, während die Titer für SFV-β-gal ungefähr 4 × 10⁶ IE/ml waren. Diese Daten zeigen, dass die zwei verschiedenen Alphaviren und ihre entsprechenden Vektoren ähnliche Verpackungssignale haben und dass PCL, die von den hierin beschriebenen Sindbis-Systemen stammen, vollständig funktionell sind, wenn sie mit einem anderen Alphavirus verwendet werden.
Die Verpackungsaktivität des pBGSVCMVdlneo-Konstrukts war auch in Zellen von menschlichem Ursprung, zum Beispiel in 293-Zellen, sehr wirksam. Die Verwendung eines solchen menschlichen Elternzelltyps für die Ableitung von PCL kann in der Herstellung von Komplement-resistenten rekombinanten Alphaviruspartikeln besonders vorteilhaft sein. 17B zeigt, dass sowohl RNA- als auch DNA-basierte Luciferase-Reportervektoren nach einer Transfektion in G418-resistente, pBGSVCMVdlneo-transformierte 293-PCL wirksam verpackt wurden, gezeigt durch Überstandstransfer der Luciferase-Expression in BHK-Zellen.
Es ist auch gezeigt worden, dass ein weiterer selektierbarer Wirkstoff-Resistenzmarker in einer ähnlichen PCL-Konfiguration wie ein Fusionsprotein mit verbleibenden nsP1-Aminosäuren an seinem N-Terminus wirkt. Kurz, das Hygromycinphosphotransferase-Gen (Hygromycin-Resistenzmarker, hygro^r) wurde anstelle des existierenden Neomycin-Resistenzmarkers in das Plasmid pBGSVCMVdlneo substituiert. Das hygro^r-Gen wurde durch Standard-drei-Zyklus-PCR vom Plasmid p3'SS (Stratagene, La Jolla, Ka.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet wurden, um flankierende EcoRV- und BamHI-Stellen zu enthalten.
Nach der Amplifizierung wurde das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt, mit EcoRV und BamHI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN gereinigt und in das Plasmid pBGSVCMVdlneo ligiert, das mit BspEI verdaut, mit Klenow glattendig gemacht wurde, weiter mit BamHI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von Geneclean gereinigt worden war. Das resultierende Konstrukt wurde pBGSVCMVdlhyg bezeichnet.
Das Plasmid pBGSVCMVdlhyg wurde unter Verwendung von Lipofectamin, wie vom Hersteller beschrieben, in BHK-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 1,2 mg/ml des Wirkstoffs Hygromycin (Boehringer Mannheim), re-plattiert. Die Medien wurden periodisch durch frisches Hygromycin-enthaltende Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen wurde erlaubt, zu einem Pool zu wachsen. Die Funktionalität der selektierten Verpackungszellen wurde durch Transfizieren mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA und Testen auf das Vorliegen von verpackten Sindbis-Luciferase-Vektorpartikeln, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, gezeigt. Positive Ergebnisse von diesen Verpackungs-Experimenten sind in 39 gezeigt.
In einer alternativen Verpackungszelllinien-Strukturprotein-Expressionskassette wurde der selektierbare Marker (in diesem Fall Neomycin-Resistenz) stromabwärts der Sindbis-Strukturprotein-Gene und unter der translationellen Kontrolle einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) inseriert. Daher erfolgt die Transkription der mRNA, die die Neomycin-Resistenz codiert, sowohl auf der genomischen Ebene (vom RSV-Promotor) als auch vom subgenomischen Verbindungsregion-Promotor. Zusätzliche Eigenschaften, die einmalig für dieses Konstrukt sind, schließen den Rous-Sarkom-Virus (RSV)-LTR-Promotor für die primäre Transkription und eine tRNA^Asp 5'-End-Sequenz, die vom defekten-interferierenden Sindbis-RNA-Clon DI25 stammt (Monroe und Schlesinger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3279-3283, 1983), ein. Diese bestimmte PCL-Expressionskassetten-Konfiguration wurde 987DHBBNeo bezeichnet und ist schematisch in 14 gezeigt. Genau wird das Plasmid 987DHBBNeo schrittweise unter Verwendung des modifizierten Plasmidvektors pBGS131dlB-P (oben beschrieben) als Ausgangsmaterial konstruiert. Ein cDNA-Fragment, das den Verbindungsregion-Promotor, die Strukturprotein-Gensequenzen und die nicht-translatierte 3'-Region + polyA enthält, wird durch Verdau des Volllängen-Sindbis-cDNA-Clons pRSINg (Dubensky et al., ebd.) mit BamHI und XbaI und Reinigung von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II erhalten. Das Sindbis-cDNA-DNA-Fragment wird mit dem Plasmidvektor pBGS131dlB-P ligiert, der auch mit BamHI und XbaI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist, um das Konstrukt pBGSINsp herzustellen.
Als Nächstes wird das Transkriptions-Terminierungssignal von der frühen SV40-Region zwischen die SacI- und EcoRI-Stellen von pBGSINsp unmittelbar stromabwärts der Sindbis-Sequenz inseriert. Die viralen SV40-Nucleotide 2643 bis 2563, enthaltend die Transkriptions-Terminierungssequenzen der frühen Region, werden durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung des unten gezeigten Primerpaars und des pBR322/SV40-Plasmids (ATCC # 45019) als Matrize isoliert.
Die Primer werden in einer Standard-drei-Zyklus-PCR-Reaktion mit einer 30 Sekunden-Extensionsdauer verwendet. Die Amplifizierungsprodukte werden mit QIAquick-sein gereinigt, mit SacI und EcoRI verdaut, wieder mit dem Mermaid-Kit gereinigt, und das 90 bp-Fragment wird in das Plasmid pBGSINsp ligiert, das auch mit SacI und EcoRI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Dieses Konstrukt ist als pBGSINspSV bekannt.
Als Nächstes werden die RSV-Promotor- und Sindbis-5'-End-Sequenzen, einschließlich der DI-tRNA^Asp-Struktur, durch überlappende PCR zusammengefügt, und das gesamte Fragment wird in den Strukturprotein-Genvektor pBGSINspSV inseriert. In der PCR Reaktion #1 wird das RSV-Promotor-Fragment durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit 1 Minute Extension unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um auch eine flankierende BglII-Stelle in einem Primer und Sequenzen, die das tRNA-5'-Ende überlappen, im anderen zu enthalten. Das Sindbis-tRNA-5'-Ende ist unmittelbar angrenzend an die RSV-Promotor-Transkriptions-Startstelle positioniert.
In der PCR-Reaktion #2 wird das Sindbis-5'-Ende plus die tRNA-Sequenz durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit 1 Minute Extension vom Matrizenplasmid Toto1101 (5'tRNA^Asp) (Bredenbeek et al., J. Virol. 67: 6439-6446, 1993) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um auch eine flankierende BamHI-Stelle in einem Primer und Sequenzen, die den 3'RSVtR-Primer überlappen, im anderen zu enthalten.
Nach der Amplifizierung werden die DNA-Fragmente mit QIAquick-spin gereinigt und zusammen als Matrizen in einer nachfolgenden drei-Zyklus-PCR-Reaktion mit 2 Minuten Expansion unter Verwendung von zusätzlichen 5'RSVpro- und 3'SinBam-Primern verwendet. Das resultierende überlappende PCR-Amplikon wird unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt, mit BglII und BamHI verdaut und in das Plasmid pBGSINspSV ligiert, das auch mit BglII und BamHI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENFCLEAN II gereinigt worden ist. Das resultierende Strukturprotein, das den defekten Helfer exprimiert, wird 987DHBB bezeichnet.
Als Nächstes wird die IRES-Sequenz des Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) durch überlappende PCR unmittelbar stromaufwärts des Neomycinphosphotransferase-Gens als ein selektierbarer Marker positioniert, und das gesamte Amplikon wird in die NsiI-Stelle von 987DHBB inseriert. Die Insertion an der NsiI-Stelle wird den selektierbaren Marker unmittelbar stromabwärts des Strukturprotein-ORF positionieren. In der PCR-Reaktion #1 wird das EMCV-IRES-Fragment (Nucleotide 260-827) durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 30 Sekunden-Extension vom Matrizenplasmid pBS-ECAT (Jang et al., J. Virol. 63: 1651, 1989) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um auch eine flankierende NsiI-Stelle in einem Primer und Sequenzen, die das neo-Gen überlappen, im anderen zu enthalten.
In der PCR-Reaktion #2 wird der neo-Resistenzmarker durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 1,5 Minuten-Extension vom Matrizenplasmid pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Ka.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um auch eine flankierende NsiI-Stelle in einem Primer und Sequenzen, die den 3'EMCVIRES-Primer überlappen, im anderen zu enthalten.
Nach der Amplifizierung werden die DNA-Fragmente mit QIAquick-sein gereinigt und zusammen als Matrizen in einer nachfolgenden drei-Zyklus-PCR-Reaktion mit 2 Minuten Extension unter Verwendung von zusätzlichen 5'EMCVIRES- und 3'Neo/pcDNA-Primern verwendet. Das resultierende überlappende PCR-Amplikon wird unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt, mit NsiI verdaut und in das Plasmid 987DHBB ligiert, das auch mit NsiI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Das resultierende Strukturprotein-Expressionskonstrukt mit der IRES/neo-Insertion in der nicht translatierten Sindbis-3'-Region wird 987DHBBNeo bezeichnet.

Um stabile Verpackungszelllinien herzustellen, wurden BHK-Zellen mit 10 μg des Plasmids 987DHBBNeo unter Verwendung eines Calciumphosphat-Präzipitations-Standardprotokolls transfiziert. Ungefähr 24 h nach der Transfektion wurden die Medien durch frische Medien, enthaltend 1 mg/ml des Wirkstoffs G418 ersetzt. Nach einem weiteren Tag wurden die Zellen trypsinisiert und in einer 1/10-Dichte in Medien, enthaltend 500 μg/ml G418, re-plattiert. Nach einigen weiteren Passagen wurden die Zellen einer Verdünnungs-Clonierung unterzogen, und die individuellen Clone wurden expandiert. Die Fähigkeit von individuellen Clonen, als Verpackungszelllinien zu wirken, wurde durch Calciumphosphat-Transfektion des Plasmids RSV/Sinrep/LacZ, einem Sindbis-DNA-Vektor, der β-Gal exprimiert, und Testen auf das Vorliegen von verpackten Vektorpartikeln in den Überständen nach 48 h bestimmt. Die verpackten Vektor-Replikons wurden durch den CPE-Test, beschrieben in Frolov und Schlesinger (J. Virol. 68: 1721-1727, 1994), titriert, und eines, das hohe Titer von verpackten Partikeln ergab, genannt 987DH-BBNeo, wurde für eine weitere Charakterisierung verwendet. Die Titer des verpackten Vektors wurden nach der Transfektion von entweder RNA- oder DNA-basierten Sindbis-Vektoren, die β-Gal exprimieren, unter Verwendung von einigen unterschiedlichen Transfektionstechniken nach 48 h bestimmt. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Transfektions-Vorgehen	zugefügte Nucleinsäure	Titer (infektiöse Einheiten/ml)
Elektroporation	RSVSINrep/LacZ DNA (2.5 μg)	1.5 × 10⁹/ml
Elektroporation	SINrep/LacZ RNA (2.5 μg)	6 × 10⁹/ml
Lipofectamin	RSVSINrep/LacZ DNA (2 μg)	keine verpackten Partikel
Lipofectin	SINrep/LacZ RNA (2 μg)	5-6 × 10⁷/ml
Calciumphosphat	RSVSINrep/LacZ DNA (10 μg)	1.5 × 10⁹/ml

Zusätzlich wurden SINrep/LacZ-Partikel, die unter Verwendung von 987DH-BB-Zelllinien verpackt wurden, danach verwendet, um frische BHK- Zelleinzelschichten zu infizieren und sowohl RNA- als auch Proteinexpressionsmuster zu untersuchen. 19 zeigt das RNA-Muster, nachdem BHK-Zellen mit zwei verschiedenen Präparationen von Sinrep/LacZ-Partikeln bei einer MOI von 150 infektiösen Einheiten pro Zelle (Bahnen 1 und 2) oder Wildtyp-Sindbis-Virus (Bahn 3) als eine Kontrolle infiziert wurden. Sieben Stunden nach der Infektion wurden Dactinomycin (1 μg/ml) und [³H]Uridin (20 μCi/ml) zugefügt, gefolgt von Ernten und Analyse der RNA nach 4 h gemäß Bredenbeek et al. (J. Virol. 67: 6439-6446, 1993). Die hohe MOI wurde verwendet, um mögliche Rekombinanten nachzuweisen. Horizontale Linien rechts der Gelbahnen zeigen die Sindbis- und β-Gal-RNAs von Interesse an. Die Bande mit dem höchsten Molekulargewicht zeigt die genomische RNA des Replikons oder Virus an (Bahnen 1 und 2, SINrep/LacZ; Bahn 3 Sindbis-Virus). Die nächsten zwei angezeigten RNAs sind die genomische RNA der 987DH-BBNeo-PCL-Expressionskassette und die induzierbare subgenomische Strukturprotein-mRNA derselben 987DH-BBNeo-PCL-Kassette. Das Vorliegen der letzteren zwei Banden zeigt, dass die genomische Helfer-RNA, die von der Verpackungszelllinie stammt, auch mit verpackt wird. Die nächsten RNA-Banden, jene, die in der größten Menge vorliegen, sind die subgenomischen RNAs, die entweder von SINrep/LacZ (Bahnen 1 und 2) oder dem Sindbis-Virusgenom (Bahn 3) stammen.
Eine Proteinanalyse wurde nach der Infektion von BHK-21-Zellen mit verpackten SINrep/LacZ-Replikons bei einer MOI von 20 infektiösen Einheiten/Zelle durchgeführt. 15 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen mit [³⁵S]-Methionin für 30 Minuten markiert, Lysate gemacht und die Proteine durch SDS-PAGE analysiert. Wie in 20 (Bahnen 2 und 3) gezeigt, sind sowohl die beta-Galactosidase als auch das Sindbis-Virus-Capsidprotein in den Vektorpartikel-infizierten Zellen, aber nicht in nicht-infizierten Zellen (Bahn 1) markiert. Das Vorliegen des Capsids zeigt, dass manche der verpackten Partikel auch Strukturprotein-Gen-RNA-Transkripte von den PCL enthalten.
C. Konstruktion von PCL-Konfigurationen mit "gespaltenen Strukturgenen"
In anderen Aspekten dieser Offenbarung werden PCL offenbart, in denen die Alphavirus-Strukturproteine nicht als ein Polyprotein von einer einzelnen mRNA mit seiner natürlichen post-translationellen Prozessierung, sondern vielmehr als getrennte Proteine von unabhängigen mRNAs, die durch mehrere Kassetten transkribiert werden, exprimiert werden. Solch eine Konfiguration minimiert die Möglichkeit einer Rekombination oder von gemeinsamen Verpackungs-Ereignissen, die zur Bildung von Replikations-kompetentem oder infektiösem Virus führen, stark. In bevorzugten Aspekten wird das Caspidprotein von einer stabil transformierten Kassette exprimiert, und die Hüll-Glycoproteine werden zusammen von einer zweiten stabil transformierten Kassette exprimiert, und jedes wird in einer Vektor-induzierbaren Weise vom Verbindungsregion-Promotor (oben beschrieben) exprimiert.
Zum Beispiel wurde das Sindbis-Virus-Capsidprotein-Gen vom Plasmid pDLTRSINg (Dubensky et al., ebd.) durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 1,5 Minuten-Extension unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet wurden, um eine flankierende XhoI-Stelle und ein Capsidprotein-Gen-Startcodon oder eine flankierende NotI-Stelle und ein Translations-Stoppcodon zu enthalten.
Nach der Amplifizierung wurde das Capsid-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt, mit XhoI und NotI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt und in den DNA-basierten Sindbis-Expressionsvektor pDCMVSIN-luc (Dubensky et al., ebd.) ligiert, der auch mit XhoI und NotI verdaut, um seine Luciferase-Reportergen-Insertion zu entfernen, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN 11 gereinigt worden war. Das resultierende Capsidprotein-Expressionskonstrukt wurde pDCMVSIN-C bezeichnet. Das Plasmid pDCMVSIN-C wurde danach mit BspEI verdaut, um die meisten Nichtstrukturprotein-Gensequenzen zu entfernen, und mit sich selbst unter verdünnten Bedingungen re-ligiert, um das DH-Vektorkonstrukt pDCMVSINdl-C zu bilden.
Das Plasmid pDCMVSINdl-C, das auch eine Neomycin-Resistenzkassette enthält, wurde unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben, in BHK-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 600 μg/ml des Wirkstoffs G418 (Neomycin) re-plattiert. Die Medien wurden periodisch durch frische, G418-enthaltenden Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen wurde erlaubt, zu wachsen. Die Zellen wurden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone wurden gezüchtet und für das Screenen expandiert. Zellen, die das Caspidprotein induzierbar als Antwort auf den eingebrachten Vektor exprimierten, wurden durch Transfizieren mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA, Herstellen von Zelllysaten ungefähr 15 h nach der Transfektion und Durchführen einer Western-Blot-Analyse mit einem polyclonalen Kaninchen-anti-Sindbis-Antikörper identifiziert. Einige positive Zellclone, die integrierte Kopien der Capsidprotein-Genexpressionskassette beherbergten und das Protein induzierbar exprimierten, wurden identifiziert.
Um sowohl die Induzierbarkeit als auch die Funktionalität des exprimierten Capsids im Zusammenhang mit Kassetten mit „gespaltenen Strukturgenen" zu zeigen, wurde ein zusätzliches Konstrukt, das die Sindbis-Virus-Hüll-Glycoproteine exprimiert, von pDCMVSIN-luc hergestellt. Kurz, die Sindbis-Hüll-Glycoproteingene wurden vom Plasmid pDLTRSINg durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 2,5 Minuten-Extension und unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet werden, um eine flankierende XhoI-Stelle und ein Translations-Startcodon in gutem Kozak-Zusammenhang oder eine flankierende NotI-Stelle und das Translations-Stoppcodon zu enthalten.
Nach der Amplifizierung wurde das Glycoproteingen-DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt, mit XhoI und NotI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt und in den DNA-basierten Sindbis-Expressionsvektor pDCMVSIN-luc ligiert, das auch mit XhoI und NotI verdaut, um seine Luciferase-Reportergen-Insertion zu entfernen, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden war. Das resultierende Glycoprotein-Expressionskonstrukt wurde pDCMVSIN1.5PE bezeichnet.
21 ist ein Western-Blot, der die Vektor-kontrollierte Induzierbarkeit von zwei unterschiedlichen clonalen Capsidlinien (9-3 und 9-9)-Zelllinien zeigt, die unter Verwendung von Lipofectamin mit Sindbis-DNA-Vektoren, die die Hüll-Glycoproteine (1.5PE-Bahnen) oder einen β-Galactosidase-Reporter, pDCMVSIN-β-gal (Dubensky et al., ebd.; 1.5β-gal-Bahnen), exprimieren oder „Schein"-transfiziert wurden (M-Bahnen). Zelllysate wurden 48 h nach der Transfektion hergestellt, durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Membranen transferiert, wo sie mit einer Kombination von Antikörpern, die spezifisch für Sindbis-Strukturproteine und β-Galactosidase sind, sondiert wurden. Der Blot zeigt deutlich die Induzierbarkeit des Capsidproteins als Antwort auf die Nichtstrukturproteine, die durch einen Vektor bereitgestellt wurden, sowie die Expression von β-Galactosidase und der Hüll-Glycoproteine. Die Funktionalität der Capsid-Zelllinien mit „gespaltenen Strukturgenen" durch Komplementierung und Vektorpartikel-Verpackung wurde durch Co-Transfizieren der β-Galactosidase- und Hüll-Glycoprotein-Vektoren in eine Capsid-Zelllinie unter Verwendung von Lipofectamin und Testen auf verpackte Partikel in den Kulturüberständen gezeigt. Ungefähr 48 h nach der Transfektion wurden die Überstände geerntet und für die Verpackungs-Tests und die Vektortiter-Bestimmung geklärt. Zusätzlich wurden die Zellen unter Verwendung von Lameli-Probenpuffer lysiert und durch Western-Blot-Analyse mit polyclonalem anti-Sindbis-Antikörper untersucht, wobei die Expression sowohl des Capsidproteins als auch durch den Vektor- bereitgestellten Hüll-Glycoproteine gezeigt wurde. Die Überstände wurden dann auf das Vorliegen von verpackten Vektorpartikeln durch Infizieren von natürlichen BHK-Zellen für ungefähr 18 h und Färben auf β-gal-Reportergenexpression, wie vorher in diesem Beispiel beschrieben, getestet. Die Funktionalität der Zelllinien für eine Komplementierung und Verpackung wurde durch Beobachtung von blaugefärbten β-Gal-exprimierenden Zellen gezeigt.
Um stabile PCL mit „gespaltenen Strukturgenen" herzustellen, die getrennte Vektor-induzierbare Expressionskassetten für sowohl das Capsidprotein als auch die Hüllen-Glycoproteine haben, werden die oben beschriebenen Capsid-Zelllinien in Verbindung mit einem zusätzlichen Hüll-Glycoprotein-Expressionskonstrukt verwendet, das einen anderen selektierbaren Marker (zum Beispiel die Hygromycin B-Resistenz) enthält. Kurz, das Plasmid pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal (Beispiel 5) wird mit BamHI und FspI verdaut, um die Sequenzen, umfassend den Verbindungsregion-Promotor, das β-gal-Reportergen und manche 3'-End-Sequenzen, zu isolieren. Das erwünschte Fragment wird von einem 1% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt und wird in das Plasmid pBGSVCMVdlneo (siehe oben) ligiert, das auch mit BamHI und FspI verdaut, um alle Strukturprotein-Gensequenzen zu eliminieren, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Das resultierende Konstrukt wird als pBGSVCMVdlsP-luc bezeichnet. Das Plasmid pBGSVCMVdlsP-luc wird als Nächstes mit XhoI und NotI verdaut, um das Luciferase-Reportergen zu entfernen, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt, und das XhoI- und NotI-verdaute Hüll-Glycoprotein-PCR-Amplikon von oben wird danach in den verdauten pBGSVCMVdlsP-luc-Vektor ligiert, um das Hüll-Glycoprotein-exprimierende DH-Konstrukt pBGSVCMVdl-G herzustellen. Die Insertion einer Hygromycin-Resistenzmarker-Kassette sowie eines flankierenden HSV-TK-Promotors und von Polyadenylierungs-Sequenzen in dieses Plasmid wird durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung eines Standard-drei-Zyklus-Protokolls mit 2,5 Minuten Extension, des Plasmids pDR2 (Clontech, Palo Alto, Ka.) als Matrize und der folgenden Oligonucleotidprimer erreicht, die gestaltet werden, um flankierende PacI-Stellen zu enthalten.
Nach der Amplifizierung wurde das DNA-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt, mit PacI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt und in das Plasmid pBGSVCMVdl-G ligiert, das auch mit PacI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Das resultierende Konstrukt wird als pBGSVhygro-G bezeichnet.
Das Plasmid pBGSVhygro-G, das jetzt auch eine Hygromycin-Resistenzkassette enthält, wird unter Verwendung von Lipofectamin, wie vom Hersteller beschrieben, in die Capsid-Zelllinie transfiziert. Ungefähr 24 h nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 1200 μg/ml Hygromycin (Calbiochem, La Jolla, Ka.), re-plattiert. Die Medien werden periodisch mit frischen Hygromycin-enthaltenden Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone werden gezüchtet und für das Screenen expandiert. Zellen, die biologisch aktives Capsidprotein und Hüllen-Glycoproteine als Antwort auf den eingesetzten Vektor induzierbar exprimieren, werden auf zwei Wegen identifiziert: zuerst durch Lipofectin-vermittelte Transfektion mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA und Sondieren der Lysate 15 Stunden nach der Transfektion in Western-Blots, wie oben beschrieben; und zweitens durch ähnliche Sindbis-Luciferase-Vektor-Transfektion, aber Ernten der Überstände 24 h nach der Transfektion und Testen auf den Transfer der Luciferase-Expression auf frische BHK-Zellen durch Infektion mit den Überständen (siehe oben). PCT mit gespaltenen Strukturgenen, die auf diese Weise abgeleitet werden, werden C/GLYCO-PCL bezeichnet.
D. Konstruktion von PCL mit „Hybrid"-Strukturproteinen
Ein zusätzlicher Ansatz, der angewendet werden kann, um den Spiegel der gemeinsamen Verpackung oder Rekombination zwischen DH- und Vektor-RNA-Molekülen zu senken, um die Translation der Glycoproteingene zu verstärken oder um die Zell- oder Gewebespezifität der verpackten rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikel zu verändern, nutzt Strukturprotein-Gene, die von anderen Alphaviren oder Yogaviren stammen. Genauer, zahlreiche Kombinationen von Alphavirus- und Yogavirus-Strukturprotein-Genen für die Verwendung mit Sindbis-Virus- oder anderen Alphavirusvektoren können vorgesehen werden. Zum Beispiel kann das Capsidprotein-Gen des Ross River-Virus (RRV) in Verbindung mit den Hüll-Glycoproteingenen von Sindbis-Virus (exprimiert von demselben oder einem anderen Konstrukt) verwendet werden, um einen Sindbis-Virus-abgeleiteten Vektor, beschrieben in den Beispielen 3, 4 oder 5, zu verpacken. Zusätzlich kann eine deletierte Form des RRV-Capsidprotein-Gens unmittelbar stromaufwärts der Sindbis-Glycoprotein-Gensequenzen positioniert werden, um als translationelle Enhancer-Elemente zu dienen. Als ein anderes Beispiel können die Strukturproteine von Sindbis-Virus verwendet werden, um Semliki Forest-Virus-RNA-Vektoren zu verpacken.
Genau gesagt wurden defekte Helfer (DH)-Strukturprotein-Konstrukte, die eine intakte oder deletierte Form des RRV-Capsidgens (22) plus die Sindbis-Glycoprotein-Gene enthielten, durch PCR-Amplifizierung von Sindbis-Virus- oder Ross River-Virus-Sequenzen von den Plasmid-Matrizen Toto1101 (Rice et al., J. Virol. 61: 3809-3819, 1987) beziehungsweise RR6415 (Kuhn et al., Virology 182: 430-441, 1991) und Inkorporierung jener Sequenzen in die vorher beschriebenen DH-Konstrukte DH-BB oder DH-BB(5'SIN) (Bredenbeek et al., J. Virol. 67: 6439-6446, 1993) für die Transkription in vitro mit SP6-Polymerase konstruiert. Die DH-Konstrukte DH-BB oder DH-BB(5'SIN) unterscheiden sich durch das Vorliegen (DH-BB) oder Fehlen (DH-BB(5'SIN)) einer DI-abgeleiteten tRNA^Asp-Sequenz am Sindbis-5'-Ende. Die folgende Tabelle zeigt die spezifischen PCR-Primersequenzen und ihre entsprechenden Sindbis- oder Ross River-Nucleotidpositionen an, wobei Großbuchstaben virale Nucleotide anzeigen und Kleinbuchstaben zusätzliche Nucleotide von Restriktionsstellen, die in den Clonierungsschritten verwendet werden, oder spezifische Punktmutationen anzeigen. Punktmutationen im Primer 6 (RRV Bsp) änderten die resultierenden Aminosäuresequenzen nicht.
Primer, die für die PCR verwendet wurden:
Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der unten angezeigten Primerpaare in einem Standard-drei-Zyklus-Protokoll mit 30 Sek. Extension und Vent-Polymerase durchgeführt, um die entsprechenden DNA-Fragmente zu produzieren, die auch unten angezeigt sind.
PCR-Fragmente: Primerpaare, Plasmid-Matrizen

Fragment 1: pr1 + pr2, RRV6415-Plasmid
Fragment 2: pr3 + pr4, RRV6415-Plasmid
Fragment 3: pr5 + pr6, RRV6415-Plasmid
Fragment 4: pr3 + pr7, RRV6415-Plasmid
Fragment 5: vr4 + pr8, RRV6415-Plasmid
Fragment 6: pr9 + pr10, Toto1101-Plasmid
Fragment 7: pr11 + pr12, Toto1101-Plasmid

Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte mit den angezeigten Enzymen verdaut und in das pUC18-Plasmidanalog pRS2 ligiert, das zusätzliche Polylinkerstellen enthält und das auch mit denselben Enzymkombinationen verdaut worden war: Fragment 1 wurde mit EcoRI + HindIII geschnitten; Fragment 2 mit BamHI + HindIII; Fragment 3 mit BamHI + HindIII; Fragment 4 mit BamHI + AflII; Fragment 5 mit HindIII + AflII; Fragment 6 mit BamHI + HindIII; und Fragment 7 mit BamHI + Bsu361. Alle Insertionen wurden sequenziert, um zu bestätigen, dass keine Artefakte während der PCR erworben wurden.
Danach wurden die Fragmente unter Verwendung der unten angezeigten Enzyme von den pRS2-Plasmiden freigesetzt und ligiert, genau wie es angezeigt wurde, um den nächsten Satz von Konstrukten herzustellen. Um FR8 herzustellen, wurde das Fragment 6 (geschnitten durch BamHI und AvaII) mit dem Fragment 1 (geschnitten durch AvaII und NciI), Fragment 2 (geschnitten durch NciI und HindIII) und Plasmid pRS2 (geschnitten mit BamHI und HindIII) ligiert. Um FR9 herzustellen, wurde das Fragment 6 (geschnitten durch BamHI und AvaII) mit dem Fragment 1 (geschnitten durch AvaII und NciI), Fragment 4 (geschnitten durch NciI und AflI) und Plasmid pRS2 (geschnitten mit BamHI und AflII) ligiert. Um FR10 herzustellen, wurde das Fragment 5 (geschnitten durch AflII und ApaLI) mit dem Fragment 3 (geschnitten durch ApaLI und HindIII) und Plasmid pRS2 (geschnitten mit AflII und HindIII) ligiert. Nach der Transformierung von E. coli wurden die Plasmide durch Restriktionsanalyse analysiert, und ihre Insertionen wurden wieder durch Verdau isoliert und für die nächsten Schritte der Clonierung verwendet.
Die FR8-Insertion (geschnitten durch BamHI und ApaLI) wurde mit dem Fragment 3 (geschnitten durch ApaLI und BspMII), dem Fragment 7 (geschnitten durch BspMII und Bsu36I) und Plasmid DH-BB (geschnitten mit BamHI und Bsu36I ligiert. Dieselben Fragmente wurden auch verwendet, um das BamHI-Bsu36I-Fragment des Plasmids DH-BB(5'SIN) zu ersetzen. Die resultierenden Plasmide wurden DH-BB Crrv beziehungsweise DH-BB(5'SIN) Crrv bezeichnet (siehe 23). Die FR9-Insertion (geschnitten durch BamHI und AflII) wurde mit der FR10-Insertion (geschnitten durch AflII und BspMII), Fragment 7 (geschnitten durch BspMII und Bsu36I) und Plasmid DH-BB (geschnitten mit BamHI und Bsu36I) ligiert. Dieselben Fragmente wurden auch verwendet, um das BamHI-Bsu36I-Fragment von Plasmid DH-BB(5'-SIN) zu ersetzen. Die resultierenden Plasmide wurden DH-BB CΔrrv und DH-BB(5'SIN) CΔrrv bezeichnet (siehe 23).
Mehrere Verwendungen für DH-Konstrukte, die chimäre Strukturprotein-Gene enthalten, sind möglich, und zwei solche Ansätze sind in den 24 und 25 illustriert. In 24 ist das intakte Ross River-Capsidprotein mit den Sindbis-Glycoprotein-Gensequenzen (DH-BB Crrv oder DH-BB(5'SIN) Crrv) als Teil eines defekten Helferkonstrukts verknüpft und wird mit einem Sindbis-Reporter-RNA-Vektor-Replikon co-transfiziert, um die Verpackung in rekombinante Alphavirus-Partikel zu zeigen (26). In 25 wird die deletierte Form des Ross River Capsidprotein-Gens mit den Sindbis-Glycoprotein-Gensequenzen (DH-BB CΔrrv und DH-BB(5'SIN) CΔrrv) als ein translationeller Enhancer und Teil des DH-Konstrukts verknüpft, während das Sindbis-Capsidprotein-Gen von einem zweiten DH-Konstrukt exprimiert wird. Beide DH-Konstrukte werden mit einem Sindbis-Reporter-RNA-Vektor-Replikon co-transfiziert, um die Verpackung in rekombinante Alphaviruspartikel zu zeigen (26). Zusätzlich kann für die Verwendung in der Verpackung das Ross River-Capsidprotein-Gen alleine von einem DH-Konstrukt exprimiert werden, während die Sindbis-Glycoproteine von einem anderen exprimiert werden. Unter Verwendung dieses Wissens und der Verfügbarkeit von einigen anderen Alphaviren, von denen Strukturprotein-Gensequenzen abgeleitet werden sollen, kann in ähnlichen Ansätzen eine große Zahl von verschiedenen Proteinkombinationen hergestellt werden.
Alternativ kann das gesamte Komplement der Strukturprotein-Gene von einem Alphavirus oder anderen Mitgliedern der Togaviridae (z. B. Rubella-Virus) verwendet werden, um einen RNA-Vektor, der von einem anderen stammt, zu verpacken, wie oben für SFV-Vektoren und Sindbis-Strukturproteine gezeigt. In einer Alternative können die Strukturprotein-Gene des Venezuelanischen Pferde-Encephalitis (VEE)-Virus verwendet werden, um einen Sindbis-Virus-abgeleiteten Vektor (Wildtyp oder einen, der den Phänotyp zeigt, der in Beispiel 4 oder 5 beschrieben ist) zu verpacken. Solch ein Verfahren liefert rekombinante Alphaviruspartikel, enthaltend Vektor-RNAs, die die erwünschten Eigenschaften der vorliegenden Erfindung wie verzögerte, reduzierte oder keine Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese zeigen, plus Strukturproteine, die den Tropismus des rekombinanten Partikels umlenken. Das Venezuelanische Pferde-Encephalitisvirus (VEE) ist ein Alphavirus, das im Gegensatz zu seinem Sindbis-Virus-Gegenstück einen Tropismus für Zellen von lymphoidem Ursprung zeigt. Daher werden Sindbis-abgeleitete Vektorkonstrukte, die durch eine Zelllinie verpackt werden, die die VEE-Strukturproteine exprimiert, dieselben lymphotropen Eigenschaften wie das VEE-Elternvirus zeigen, von dem die Verpackungszelle-Strukturprotein-Genkassette erhalten wurde.
Genau gesagt wird der Trinidad-Eselstamm des VEE-Virus (ATCC #VR-69) in BHK-21-Zellen vermehrt, und Virion-RNA wird unter Verwendung von ähnlichen Vorgehensweisen wie jenen, die im Beispiel 1 beschrieben sind, extrahiert. Die gesamte Strukturprotein-codierende Region wird durch PCR mit einem Primerpaar, dessen 5'-Enden auf die authentische AUG-Translations-Startstelle einschließlich der umgebenden Kozak-Konsenssequenz bzw. die translationelle UAG-Stoppstelle kartieren, amplifiziert. Der Vorwärtsprimer ist komplementär zu den VEE-Nucleotiden 7553-7579, und der Rückwärtsprimer ist komplementär zu den VEE-Nucleotiden 11206-11186 (Sequenz von Kinney et al., Virology 170: 19-30, 1989). Die PCR-Amplifikation der VEE-cDNA, die den Strukturprotein-Genen entspricht, wird unter Verwendung eines reverse Transkriptase-PCR-Protokolls in zwei Schritten, wie oben beschrieben, der VEE-Genom-RNA als Matrize und des folgenden Oligonucleotidpaars, das flankierende XhoI- und NotI-Stellen enthält, erreicht:
Nach der PCR-Amplifizierung wurde das ungefähr 3800 bp-Fragment unter Verwendung von GENECLEAN II von einem 0,7% Agarosegel gereinigt und mit XhoI und NotI verdaut. Das resultierende Fragment wird dann in den DNA-basierten Sindbis-Expressionsvektor pDCMVSIN-luc (siehe oben) ligiert, der auch mit XhoI und NotI verdaut, um seine Liciferase-Reportergen-Insertion zu entfernen, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7%-Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Das resultierende VEE-Strukturprotein-Expressionskonstrukt wird pDCMV-VEEsp bezeichnet. Das Plasmid pDCMV-VEEsp wird danach unter limitierenden teilweisen Verdau-Bedingungen mit BspEI verdaut, um die meisten Nichtstrukturprotein-Gensequenzen zu entfernen, und re-ligiert, um das Strukturprotein-exprimierende DH-Vektorkonstrukt pDCMV-VEEdl zu bilden.
Das Plasmid pDCMV-VEEdl, das auch einen Neomycin-Resistenzmarker enthält, wird unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben, in BHK-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 h nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 600 μg/ml des Wirkstoffs G418 replattiert. Die Medien werden periodisch durch frische G418-enthaltenden Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone werden gezüchtet und für das Screenen expandiert. Zellen, die induzierbar VEE-Strukturproteine als Antwort auf den eingesetzten Vektor exprimieren, werden durch Transfizieren mit Sindbis-Luciferase-Vektor-RNA und Testen auf eine VEE-Strukturprotein-Expression in den Zelllysaten oder den verpackten Luciferase-Vektor in den Überständen identifiziert, wie vorher beschrieben. Strukturprotein-Gene, die von Varianten von VEE oder anderen Alphaviren und ihren Varianten, die sich im Gewebetropismus unterscheiden, erhalten wurden, sind auch nützlich, wenn dieser Ansatz befolgt wird.
Zusätzlich kann jede der verschiedenen Strukturproteingen-Expressionskassetten-Konfigurationen, die in diesem Beispiel beschrieben werden, verwendet werden.
E. Produktion von verpacken Alphavirusvektoren von PCL
Alphavirus-abgeleitete PCL, die im Verlauf dieses Beispiel beschrieben werden, können in einer Reihe von unterschiedlichen Arten verwendet werden, um rekombinante Alphavirus-Partikelbestände zu produzieren, und schließen das Einbringen des Vektors entweder durch Transfektion von RNA- oder DNA-Molekülen, Infektion mit vorher produzierten verpackten Vektor-enthaltenden Partikeln oder die intrazelluläre Produktion von Vektor von stabil transformierten Expressionskassetten ein. Die Nützlichkeit von Alphavirus-PCL für die Produktion von Vektorpartikeln wird zuerst mit einem Reportervektor-Konstrukt gezeigt und kann später auf alle anderen Vektorkonstrukte angewendet werden, die eine erwünschte heterologe Sequenz exprimieren. Zum Beispiel wird ein Bestand von verpackten Sindbis-β-gal-Vektorpartikeln durch Elektroporation von ungefähr 10⁷ Alphavirus C/GLCYO- oder anderen PCL-Zellen (siehe oben und zum Beispiel 15, 17, 18) mit 50 μg pKSSIN-1-BV-β-gal- oder -Luciferase-RNA (Beispiel 4) oder pBG/SIN-1 ELVS 1.5-β-gal- oder -Luciferase-DNA (Beispiel 5) unter Verwendung der Vorgehensweise, die in (Liljestrom und Garoff, Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991) beschrieben ist, erhalten. Die transfizierten PCL werden bei einer erwünschten Temperatur (z. B. 37°C) inkubiert, und ungefähr 48 h nach der Transfektion werden die Überstände geerntet und durch Passage durch einen 0,45 Mikron-Filter geklärt. Eine zusätzliche Präparation kann unter Verwendung der Parameter, die in der detaillierten Beschreibung hierin illustriert ist, durchgeführt werden.
Alternativ wird ein Bestand von verpackten rekombinanten Alphaviruspartikeln (erhalten unter Verwendung von PCL, wie oben, oder durch Co-Transfektion von Vektor und DH-Konstrukten) verwendet, um eine naive Kultur von PCL für eine weitere Amplifizierung zu infizieren. Zum Beispiel werden 5 × 10⁷ Alphavirus C/GLYCO- oder andere PCL-Zellen mit einem Bestand von verpacktem pKSSIN-1-BV-β-gal-Vektor bei einer ungefähren Multiplizität der Infektion (MOI) von 1 infektiösen Einheit/Zelle infiziert. Bei Erreichen des Zellcytoplasmas wird der Partikelabgeleitete RNA-Vektor autokatalytisch amplifiziert und in zusätzliche Nachkommenpartikel verpackt. Nach einer Inkubation bei der erwünschten Temperatur (z. B. 37°C) für ungefähr 48 h werden die Kulturüberstände geerntet, durch Passage durch einen 0,45 Mikron-Filter geklärt und präpariert, wie erwünscht.
In noch einem anderen Verfahren, das die Fähigkeit der PCL ausnutzt, um verpackte rekombinante Alphavirus-Vektorpartikel weiter zu amplifizieren, werden Bestände von verpackten Partikeln verwendet, um naive Kulturen von PCL zu infizieren, um eine Arbeits-Zellbank von Vektor-enthaltenden PCL (Vektor-produzierende Zellen, 27) zu bilden, die danach verwendet werden kann, um eine andere naive Kultur von PCL auszusäen. Zum Beispiel wird solch eine Arbeitszellbank durch Infektion von Alphavirus C/GLYCO- oder anderen PCL-Zellen mit dem verpackten Vektorbestand bei einer M. O. I. = 5 erreicht. Ungefähr 2–3 h nach der Infektion werden die Vektor-enthaltenden PCL sanft abgelöst, und die Zellzahl wird bestimmt. Die Vektor-enthaltenden PCL können jetzt direkt verwendet oder aliquotiert und in flüssigem N₂ als eine Vektor-produzierende Zellbank gelagert werden. Wenn erwünscht, werden die Zellen direkt in eine vorher wachsende Kultur von naiven Alphavirus C/GLYCO- oder anderen PCL in einem Verhältnis von ungefähr 1 Vektor-produzierenden Zelle pro 1000 frische PCL für die Produktion von großen Mengen an verpackten Vektorpartikeln mit hohem Titer ausgesät. Aliquots des Kulturüberstands werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der gemeinsamen Kultur geerntet, um den Zeitpunkt der maximalen rekombinanten Alphavirus-Partikelproduktion zu bestimmen, und jene Zeit wird für ein weiteres Ernten, Reinigen und Präparieren ausgewählt, wie oben beschrieben. Dieselbe sequenzielle Amplifizierungsmethodik unter Verwendung von Vektor-produzierenden Zellen ist auch für eine Produktion in großem Maßstab von jedem erwünschten rekombinanten Protein nützlich (27). Für die Produktion eines rekombinanten Proteins können abhängig vom Wesen des rekombinanten Proteins die Überstände oder Zelllysate geerntet werden.
In noch einem anderen Verfahren für das Produzieren von Beständen von verpackten rekombinanten Alphaviruspartikeln mit hohem Titer oder in großem Maßstab wird der erwünschte Expressionsvektor in 1–5% einer naiven Alphavirus-PCL-Kultur durch Transfektion von in vitro-transkribierter RNA oder eines Plasmid-DNA-Vektors unter Verwendung eines allgemein verträglichen Reagenzes oder Verfahrens (zum Beispiel Lipofectin beziehungsweise Lipofectamin oder Infektion mit Vektorpartikeln bei niedriger MOI [≤ 0,1]), wie hierin beschrieben eingebracht. Die rekombinanten Vektorpartikel, die durch die anfänglichen Zellen, in die der Vektor eingebracht wurde, produziert werden, infizieren danach andere naive Verpackungszellen in der Kultur, die wiederum noch mehr verpackte Partikel produzieren. Dieser Vorgang der zeitlichen Amplifizierung fährt fort, bis die verpackten rekombinanten Alphaviruspartikel in allen Zellen der PCL-Kultur produziert werden. Dieser Amplifikationsvorgang wird in 28 gezeigt. ELVS 1.5-β-gal-Plasmid-DNA wurde in 987DHBBNeo-Verpackungszellen oder in BHK-21-Zellen transfiziert, und die Spiegel der β-Galactosidase, die in den Zelllysaten vorhanden waren, wurden zu den angezeigten Zeitpunkten nach der Transfektion gemessen, wie vorher beschrieben. In BHK-21-Zellen erreichte der Spiegel der β-Galactosidase-Expression nach ungefähr 48 hpt ein Maximum und blieb gleich. Im Gegensatz dazu fuhr der Spiegel der β-Galactosidase-Expression in der ELVS 1.5-β-gal-transfizierten 987DHBBNeo-PCL-Kultur über einen längeren Zeitraum fort, anzusteigen, was den rekombinanten Vektorpartikel-Amplifizierungsvorgang und die schlussendliche Expression der β-Galactosidase in allen Zellen der Kultur reflektiert. In allen Fällen können Bestände von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln unter Verwendung jedes der hierin beschriebenen Verfahren so formuliert werden, dass sie pharmazeutisch verträglich sind.
BEISPIEL 7
KONSTRUKTION VON ALPHAVIRUS-HERSTELLER-ZELLLINIEN
Die Herstellung von Alphavirus-PCL, wie oben beschrieben, gekoppelt mit der Konstruktion von DNA-basierenden Alphavirus-Vektoren, die eine reduzierte, verzögerte oder keine Inhibition der Wirtszell-Makromolekülsynthese zeigen (Beispiele 1, 2, 4 und 5), liefert einen relativ geradlinigen Mechanismus, um Alphavirusvektor-Hersteller-Zelllinien abzuleiten. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten die Vektor-Hersteller-Zelllinien eine oder mehrere stabil transformierte Strukturprotein-Genexpressionskassetten und auch Alphavirus-RNA-Expressionsvektormoleküle mit dem obigen Phänotyp, die transfiziert, transduziert oder intrazellulär produziert werden, was zu der Produktion der verpackten Vektorpartikeln führt. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein RNA-Vektor-Replikon intrazellulär von einem stabil transformierten DNA-Molekül produziert (einem eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystem), das entweder in einer integrierten Form oder als eine episomale DNA vorliegt, wobei die Transkription der Vektor-RNAs induzierbar durch einen oder mehrere Stimuli, die zu einer erwünschten Zeit geliefert werden, kontrolliert wird. Dieser Typ einer Alphavirus-Hersteller-Zelllinienkonfiguration liefert im Wesentlichen eine Kaskade von Ereignissen, die einschließen: induzierbare Produktion von Vektor-RNA und resultierende autokatalytische cytoplasmatische Amplifizierung der RNA, die Induktion einer Strukturproteinexpression in hohem Spiegel durch Vektor-bereitgestellte Nichtstrukturproteine, die Verpackung der Vektor-RNA durch die exprimierten Strukturproteine und die Freisetzung der verpackten Vektorpartikel. Die eng regulierte, induzierbare Expression der Vektor-RNA von dem DNA-Molekül wird, sobald die Hersteller-Zellpopulation die erwünschte Zahl erreicht, aufgrund des Potenzials für eine geringe Cytotoxizität der Vektor-Replikation oder der Notwendigkeit, eine Nichtstrukturprotein-Synthese zu kontrollieren, da sie mit der Regulierung der Positivstrang- gegenüber der Negativstrang-Vektor-RNA-Verhältnisse in Beziehung steht, bevorzugt.
A. Alphavirus-DNA-Vektoren mit Regulierung auf einer Ebene
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein DNA-basierender Alphavirusvektor bereitgestellt, worin die in vivo-Transkription eines Alphavirusvektor-RNA-Moleküls, das zur autokatalytischen Amplifizierung in der Lage ist, von einem Promotor erfolgt, der durch Anwenden eines Stimulus zu einer gewünschten Zeit regulierbar ist. Solch ein DNA-basierter Alphavirusvektor kann danach stabil in eine Alphavirus-Verpackungszelllinie (PCL) transformiert werden, um eine induzierbare Alphavirus-Hersteller-Zelllinie zu kreieren. Die hierin beschriebene Hersteller-Zelllinienkonfiguration ist daher ein „Vorwärtsschub"-System, in dem: 1) ein Stimulus auf die Zelle angewendet wird, was in einer wirksamen Transkription von Alphavirusvektor-RNA resultiert; 2) die Vektor-RNA autokatalytisch repliziert und Nichtstrukturproteine produziert; 3) die Nichtstrukturproteine die Amplifizierung der Strukturprotein-Expressionskassetten-mRNAs und eine Strukturproteinexpression in hohem Spiegel stimulieren; und 4) die Strukturproteine mit der Vektor-RNA interagieren und in der nachfolgenden Verpackung von rekombinanten Alphaviruspartikeln resultieren, die in die Kulturmedien freigesetzt werden. Jede früher beschriebene Alphavirus-PCL, die stabil mit einer oder mehreren induzierbaren Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassetten transformiert ist, kann als die Elternlinie dienen, mit der die Hersteller-Zelllinie abgeleitet wird.
Zum Beispiel kann ein Tetracyclin-responsives Promotorsystem (Gossen und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5547-5551, 1992) für die induzierbare Transkription einer Alphavirusvektor-RNA angewendet werden, wie in 29 dargestellt. In diesem System stimuliert die Expression eines Tetracyclin-Repressors und der HSV-VP16-Transaktivator-Domäne als ein „Fusions"-Protein (rTA) die in vivo-Transkription der Alphavirusvektor-RNA durch spezifisches Binden an eine Tetracyclin-Operatorsequenz (tetO), die unmittelbar angrenzend an einen minimalen „Kern"-Promotor (zum Beispiel CMV) gelegen ist. Das Bindungs- und das Transaktivierungsereignis wird reversibel durch das Vorliegen von Tetracyclin blockiert und kann durch Entfernen von Tetracyclin aus den Kulturmedien „angeschaltet" werden. Da die nicht-induzierten Grundspiegel der Transkription unter verschiedenen Zelltypen variieren werden, können andere verschiedene minimale Kern-Promotoren (zum Beispiel HSV-tk) mit den Tetracyclin-Operator-Sequenzen verknüpft werden, vorausgesetzt, dass die Transkriptions-Startstelle bekannt ist, um eine Nebeneinanderstellung beim oder in der unmittelbaren Nähe des Alphavirusvektor-Nucleotid(s) 1 zu erlauben.
Der rTA-Transaktivator wird durch eine zusätzliche Expressionskassette geliefert, die auch stabil in dieselbe Zelllinie transformiert wird; und in bestimmten Ausführungsformen kann die rTA-Expressionskassette selbst autoregulatorisch sein. Die Verwendung einer autoregulatorischen rTA-Expressionskassette umgeht die potenziellen Toxizitätsprobleme, die mit einer konstitutiven Expression von rTA in hohem Spiegel assoziiert sind, durch Verknüpfen der Expression mit der transkriptionellen Kontrolle durch denselben tetO-verknüpften Promotor, an den rTA selbst bindet. Dieser Systemtyp kreiert einen negativen Rückkopplungszyklus, der sicherstellt, dass sehr wenig rTA in der Anwesenheit von Tetracyclin produziert wird, der aber sehr aktiv wird, wenn das Tetracyclin entfernt wird (29). Solch eine autoregulatorische rTA-Expressionskassette wird im Plasmid pTet-tTAk geliefert (Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522-6526, 1995).
Die Funktionalität eines solchen Tetracyclin-regulierten, DNA-basierenden Alphavirusvektors wird durch Konstruieren eines modifizierten SIN-1-abgeleiteten Luciferase-Plasmidvektors gezeigt, der durch einen Tetracyclin-Operator/CMV-Minimal-Promotor gelenkt wird. Unter Verwendung der Plasmide pBG/SIN-1 ELVS1.5-luc (Beispiel 4) und pBGSV3' (Beispiel 6) als Ausgangsmaterial wird ein ungefähr 7200 bp-Fragment, einschließlich eines Großteils der SIN-1-Nichtstruktur-codierenden Region, des Verbindungsregion-Promotors und Luciferase-Reportergens, und ein Teil der 3'-UTR durch Verdau von pBG/SIN-1 ELVS1.5-luc mit BglII und FspI und Reinigung von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II isoliert. Das 7200 bp-Fragment wird danach in das Plasmid pBGSV3' ligiert, das auch mit BglII und FspI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Das resultierende Konstrukt wird als pBGSVdlB/SIN1-luc bezeichnet. Die Insertion der verbleibenden Sequenzen, die den heptamerisierten Tetracyclin-Operator und den minimalen CMV-Promotor (tetO/CMV) verknüpft mit den Sindbis-Nucleotiden 1-2289 einschließen, so dass die Transkription mit einem zusätzlichen nicht-viralen Nucleotid 5' des Sindbis-Nucleotids 1 beginnen wird, wird durch überlappende PCR erreicht. In der PCR-Reaktion #1 wird der ungefähr 370 bp lange tetO/CMV-Teil der Sequenz durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 30 Sekunden-Extension von dem Matrizenplasmid pUHC13-3 (Gossen und Bujard, ebd.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um auch flankierende BglII- und AscI-Stellen auf einem Primer und Sequenzen, die 5'-Sindbis-Nucleotide überlappen, auf dem anderen zu enthalten.
In der PCR-Reaktion #2 wird der 2289 bp-Sindbis-5'-Endteil der Sequenz wird durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer drei Minuten-Extension von dem Matrizenplasmid pKSRSIN-1 (Beispiel 1) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um auch Sequenzen, die die CMV-Promotornucleotide überlappen, auf einem Primer zu enthalten.
Nach der Amplifizierung werden die DNA-Fragmente mit QIAquick-spin gereinigt und zusammen als Matrizen in einer nachfolgenden drei-Zyklus-PCR-Reaktion mit 3,5 Minuten Extension unter Verwendung von zusätzlichen 5'BAtetOF- und SIN2400R-Primern verwendet. Das resultierende überlappende PCR-Amplikon von ungefähr 2660 bp wird unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt, mit BglII verdaut und in das Plasmid pBGSVdlB/SIN1-luc ligiert, das auch mit BglII verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Das resultierende Konstrukt wird ptetSIN1-luc bezeichnet. Vektorkonstrukte, die andere heterologe Sequenzen von Interesse enthalten, werden unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes oder durch direktes Clonieren in die XhoI- und/oder NotI-Stellen hergestellt. Danach wird eine selektierbare E. coli-gpt-Gen (Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase)-Expressionskassette hergestellt und in die einmalige PacI-Stelle des Plasmids ptetSIN1-luc inseriert, um einen zusätzlichen selektierbaren Marker bereitzustellen. Zuerst wird ein Fragment, enthaltend den SV40-Promotor verknüpft mit einem offenen Leserahmen des gpt-Gens, von dem Plasmid pMAM (Clontech, Palo Alto, Ka.) durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 2 Minuten-Extension und unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um stromaufwärts flankierende SacI- und PacI-Stellen und eine stromabwärts-liegende SacI-Stelle zu enthalten.
Nach der Amplifizierung wird das SV40-Promotor/gpt-Gen-DNA-Fragment mit QIAquick-sein gereinigt, mit SacI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt und in das Plasmid pBGS131 dlXhoI-BGHTT (Beispiel 5) ligiert, das auch mit SacI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden war. Clone mit der korrekten Orientierung der Insertion werden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Diese Konfiguration positioniert den Promotor und das gpt-Gen unmittelbar benachbart zu einem Rinder-Wachstumshormon-Transkriptions-Terminierungssignal. Das resultierende gpt-Expressionskonstrukt wird pBG131 dlXhoI-gpt bezeichnet. Als Nächstes wird die gesamte Expressionskassette vom Plasmid pBGS131 dlXhoI-gpt durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 2 Minuten-Extension und unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um flankierende PacI-Stellen zu enthalten.
Nach der Amplifizierung wird das gpt-Gen-Expressionskassetten-Fragment mit QIAquick-spin gereinigt, mit PacI verdaut, unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt und in das tet-induzierbare Alphavirus-Vektorkonstrukt ptetSIN1-luc ligiert, das auch mit PacI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden war. Das resultierende Konstrukt wird ptetSIN1gpt-luc bezeichnet.
Für die Konstruktion einer anfänglichen Tetracyclin-induzierbaren Alphavirus-Vektor-Hersteller-Zelllinie werden das ptetSIN1gpt-luc-Konstrukt und eine Tetracyclin-Repressor/VP16-Transaktivator (rTA)-Expressionskassette stabil in die erwünschte Alphavirus-PCL transformiert. Zum Beispiel werden Alphavirus C/GLYCO-PCL-Zellen (von oben) durch Co-Transfektion mit einem anderen Plasmid, das einen selektierbaren Marker codiert, stabil mit dem Plasmid pTet-tTAk (siehe oben) transformiert. Die Plasmide pTet-tTAk und pSV2-His, das einen Histidinoldehydrogenase-Marker codiert (Schatz et al., 1989, Cell 59: 1035-1048), werden in einem molaren Verhältnis von 40:1 unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben, in C/GLYCO-PCL-Zellen (oder andere PCL) transfiziert. Ungefähr 24 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend Histidinol und 0,5 μg/ml Tetracyclin, re-plattiert. Die Medien werden periodisch durch frische Wirkstoff-enthaltenden Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone werden gezüchtet und werden für das Screenen expandiert. Positive pTet-tTAk-enthaltende Verpackungszellclone, bezeichnet als C/GLYCO/TAk-Zellen, werden durch Transfizieren des Luciferase-Reporterplasmids pUHC13-3 (Gossen und Bujard, ebd.) unter der Kontrolle eines tetO/Promotors sowohl in der Anwesenheit als auch in der Abwesenheit von Tetracyclin identifiziert. In der Abwesenheit von Tetracyclin werden positive C/GLYCO/TAk-PCL-Zellen eine Induktion vom tetO/Promotor und induzierbare hohe Spiegel der Luciferase liefern.
Danach wird das DNA-basierte Alphavirus-Vektorkonstrukt ptetSIN1gpt-luc unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben, stabil in die C/GLYCO/TAk-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und in Selektionsmedien, die für den bestimmten Zelltyp optimiert sind (DMEM + 10% dialysiertes fötales Kälberserum; 250 μg/ml Xanthin; 15 μg/ml Hypoxanthin; 10 μg/ml Thymidin; 2 μg/ml Aminopterin; 25 μg/ml Mycophenolsäure) und 0,5 μg/ml Tetracyclin enthalten, re-plattiert. Die Medien werden periodisch durch frische Selektionsmedien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone werden gezüchtet und werden für das Screenen expandiert. Positive Hersteller-Zelllinien, die stabil mit ptetSIN1gpt-luc transformiert wurden, werden durch Entfernen des Tetracyclins für mindestens 24 h aus den Medien und Testen auf Luciferase in den Zelllysaten und auch Testen auf den verpackten Luciferase-Vektor in den Kulturüberständen, wie vorher beschrieben, identifiziert.
B. Alphavirus-DNA-Vektoren mit einer Regulierung auf zwei Ebenen
In bevorzugten Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, einen DNA-basierten Alphavirus-Vektor (Wildtyp oder mit dem erwünschten Phänotyp der reduzierten, verzögerten oder ohne Inhibition der Wirts-Makromolekülsynthese) zu konstruieren, worin die Transkription des RNA-Vektormoleküls, das zur autokatalytischen Amplifizierung in der Lage ist, von einem Promotor erfolgt, der durch zwei Ebenen der Regulierung streng kontrolliert wird, um alle Grundspiegel der Transkription zu eliminieren. Solch ein Ansatz kann eine induzierbare Komponente (z. B. das tet-System von oben) mit einer reversiblen transkriptionellen Silencing-Komponente kombinieren. Zum Beispiel kann die KRAB-Expressionsdomäne eines bestimmten Zinkfinger-Proteins verwendet werden.
Kurz, KRAB (Krüppel-assoziierte Box)-Domänen sind hochkonservierte Sequenzen, die in den aminoterminalen Regionen von mehr als einem Drittel aller Krüppel-Klasse-Cys₂His₂-Zinkfinger-Proteine vorhanden sind. Die Domänen enthalten zwei vorhergesagte amphipathische α-Helices, und es ist gezeigt worden, dass sie als DNA-Bindungs-abhängige, RNA-Polymerase II-transkriptionelle Repressoren wirken (zum Beispiel Licht et al., Nature 346: 76-79, 1990). Wie andere Transkriptionsfaktoren sind die aktive Repressionsdomäne und die DNA-Bindungsdomäne ausgeprägt und trennbar. Daher kann die Repressionsdomäne als ein Fusionsprotein für ein Targeting mit jedem sequenzspezifischen DNA-Bindungsprotein verknüpft werden. Idealerweise kann die DNA-Bindungsprotein-Komponente in einer regulatorischen Weise reversibel von der Bindung abgehalten werden, wodurch das transkriptionelle Silencing „ab" geschaltet wird. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform die KRAB-Domäne von menschlichem Kox1 (Thiesen, New Biol. 2: 363-374, 1990) an das DNA-bindende Lactose (lac)-Repressorprotein fusioniert, was einen transkriptionellen Hybrid-Silencer mit reversibler, sequenzspezifischer Bindung an eine lac-Operator-Sequenz bildet, der unmittelbar benachbart zum tet-responsiven Promotor konstruiert wird (30). In dieser Konfiguration wird die konstitutive Expression der lac-Repressor/KRAB-Domänen-Fusion (rKR) in der Bindung an die lac-Operator-Sequenz und der Eliminierung jeglicher durchlässigen („leaky") Grundtranskription vom nicht-induzierten tet-responsiven Promotor resultieren. Wenn die Vektorexpression erwünscht wird und Tetracyclin aus dem System entfernt wird, wird IPTG zugefügt, um ein rKR-vermitteltes transkriptionelles Silencing zu verhindern.
Zusätzlich werden die KRAB-Domänen von anderen Zinkfinger-Proteinen, zum Beispiel ZNF133 (Tommerup et al., Hum. Mol. Genet. 2: 1571-1575, 1993), ZNF91 (Bellefroid et al., EMBO J. 12: 1363-1374, 1993), ZNF2 (Rosati et al., Nucleic Acids Res. 19: 5661-5667, 1991) und anderen, sowie andere transferierbare Repressor-Domänen, zum Beispiel Drosophila en- oder eve-Gene (Jaynes und O'Farrell, EMBO J. 10: 1427-1433, 1991; Han und Manley, Genes Dev. 7: 491-503, 1993), menschliches Zinkfinger-Protein YY1 (Shi et al., Cell 67: 377-388, 1991), das Wilms-Tumor-Suppressor-Protein WT1 (Madden et al., Science 253: 1550-1553, 1991), der Schilddrüsenhormon-Rezeptor (Baniahmad et al., EMBO J. 11: 1015-1023, 1992), der Retinsäure-Rezeptor (Baniahmad et al., ebd.), Kid-1 (Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4514-4518, 1994), leicht in solch einem System verwendet. Darüber hinaus kann die lac-Repressor/lac-Operator-Komponente dieses Systems durch jede Zahl von anderen regulierbaren Systemen, die von anderen Quellen abstammen, substituiert werden, zum Beispiel die Tryptophan- und Maltose-Operons, GAL4 usw.
Genau gesagt wird eine Expressionskassette, die das lac-Repressor (lacI)-Protein, fusioniert an die KRAB-Domäne von menschlichem Kox1, mit einer verknüpften nuklearen Lokalisationssequenz (NLS; Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys (SEQ. ID. NO. 100); Kalderon et al., Cell 39: 499-509, 1984) enthält, um das Protein wirksamer zurück in den Nukleus zu leiten, durch überlappende PCR konstruiert. In der PCR-Reaktion #1 wird die ungefähr 1100 bp lange lacI-Sequenz durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer 1,5 Minuten-Extension von dem Matrizenplasmid p3'SS (Stratagene, La Jolla, Ka.) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um auch eine flankierende XhoI-Stelle und ein AUG-Startcodon in gutem Translationsinitiation- Zusammenhang auf dem Stromaufwärts-Primer und die große T-Antigen-nukleäre Lokalisierungssequenz von SV40 auf dem anderen zu enthalten.
In der PCR-Reaktion #2 wird ein ungefähr 400 bp langes Amplikon, umfassend die aminoterminale KRAB-Domäne mit 121 Resten von menschlichem Kox1, durch Standard-drei-Zyklus-PCR mit einer Ein-Minuten-Extension von dem Matrizenplasmid pKox1 (Thiesen, New Biol. 2: 363-374, 1990) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert, die gestaltet sind, um auch Sequenzen, die NLS und lacI überlappen, auf einem Primer und eine SacI-/-Restriktionsstelle und ein Stoppcodon auf dem anderen zu enthalten.
Nach der Amplifizierung werden die DNA-Fragmente mit QIAquick-spin gereinigt und zusammen als Matrizen in einer nachfolgenden drei-Zyklus-PCR-Reaktion mit 2,5 Minuten Extension unter Verwendung von zusätzlichen LacI5'F- und KRAB3'R-Primern verwendet. Das resultierende überlappende PCR-Amplikon von ungefähr 1500 bp wird unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt, mit XhoI und SacI verdaut und in das eukaryontische Expressionsvektor-Plasmid pEUK-C1 (Clontech, Palo Alto, Ka.) ligiert, das auch mit XhoI und SacI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Agarosegel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Das resultierende lacI/KRAB-Expressionskonstrukt wird pEUK-rKR bezeichnet.
Um stabile PCL-Transformanten, enthaltend die lacI/KRAB-Expressionskassette, herzustellen, wird eine Alphavirus-PCL, die bereits auf die Transformation mit einer rTA tet/Transaktivator-Fusionsprotein-Kassette selektiert worden ist, als Ausgangsmaterial verwendet. Zum Beispiel werden Alphavirus C/GLYCO/TAk-PCL-Zellen (von oben) durch Co-Transfektion mit einem anderen Plasmid, codierend einen selektierbaren Marker, mit dem Plasmid pEUK-rKR stabil transformiert. Die Plasmide pEUK-rKR und pPUR, codierend einen selektierbaren Puromycin-Acetyltransferase-Marker (Clontech), werden in C/GLYCO/TAk-PCL-Zellen (oder andere PCL) in einem molaren Verhältnis von 40:1 unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben, co-transfiziert. Ungefähr 24 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und in Medien, enthaltend 0,5 μg/ml Puromycin und 0,5 μg/ml Tetracyclin, re-plattiert. Die Medien werden periodisch durch frische, Wirkstoff-enthaltende Medien ausgetauscht, und Foci von resistenten Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone werden gezüchtet und werden für das Screenen expandiert. Positive pEUK-rKR-enthaltende Verpackungszellclone, bezeichnet als C/G/TAk/rKR-Zellen, werden durch Immunfärben mit einem polyclonalen Antiserum, das spezifisch für lacI ist (Stratagene, La Jolla, Ka.), identifiziert.
Als Nächstes müssen spezifische lac-Operator (lacO)-Sequenzen in den erwünschten ptet-basierenden Alphavirusvektor (siehe oben) inseriert werden. Zum Beispiel wird das Vektorkonstrukt ptetSIN1gpt-luc durch Verwenden eines synthetischen Oligonucleotid-Linkers modifiziert, um mehrere Kopien von lacO zu enthalten. Das lacO-Oligonucleotid ist gestaltet, um eine symmetrische lacO-Sequenz, einschließlich der vollständigen 22 bp-Palindrom-Operatorsequenz (Simons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1624-1628, 1984; Sadler et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 6785-6789, 1983), und flankierende AscI-Stellen zu enthalten, wenn es sich selbst zu einem doppelsträngigen Molekül aneinanderlagert.
Das LacOsymA-Oligo ist an sich selbst angelagert, um ein „klebrig-endendes" AscI-DNA-Fragment zu bilden, und wird dann in das Plasmid ptetSIN1gpt-luc ligiert, das mit AscI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und von einem 0,7% Gel unter Verwendung von GENECLEAN II gereinigt worden ist. Clone, die eine, zwei, drei oder mehrere Tandem-Kopien der lacO-Sequenz enthalten, werden durch Sequenzanalyse identifiziert, und es wird ihnen die Bezeichnung pOItetSIN1gpt-luc, pOIltetSIN1gpt-luc, pOIIltetSIN1gpt-luc, usw. gegeben. Individuelle Clone mit verschiedenen lacO-Kopienzahlen werden dann transfiziert, wie unten im Detail beschrieben, und auf die engste Ebene der transkriptionellen Regulierung getestet.
Um eine Alphavirusvektor-Hersteller-Zelllinie herzustellen, werden die DNA-basierten pOtetSIN1gpt-luc-Vektorkonstrukte unter Verwendung von Lipofectamin, wie durch den Hersteller beschrieben, stabil in C/G/TAk/rKR-Zellen transfiziert. Ungefähr 24 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und in Selektionsmedien, die für den bestimmten Zelltyp optimiert sind (DMEM + 10% dialysiertes fötales Kälberserum; 250 μg/ml Xanthin; 15 μg/ml Hypoxanthin; 10 μg/ml Thymidin; 2 μg/ml Aminopterin; 25 μg/ml Mycophenolsäure) und 0,5 μg/ml Tetracyclin enthalten, re-plattiert. Die Medien werden periodisch durch frische Selektionsmedien ersetzt, und Foci von resistenten Zellen werden wachsen gelassen. Die Zellen werden trypsinisiert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen cloniert, und individuelle Zellclone werden gezüchtet und werden für ein Screenen expandiert. Positive Hersteller-Zelllinien, die stabil mit den pOtetSIN1gpt-luc-Konstrukten transformiert sind, werden durch die Expression der Luciferase (vorher beschrieben) mindestens 24 h nach dem Entfernen von Tetracyclin aus den Medien und der Zugabe von 20 mM IPTG für die Induktion identifiziert. Die Luciferase-Aktivität wird sowohl an Hersteller-Zelllysaten als auch nach Experimenten zur Übertragung der Expression unter Verwendung der Kulturüberstände bestimmt.
Zusätzliche Ebenen der Kontrolle können durch Zufügen einer dritten oder sogar vierten Ebene der Regulation des Promotors, der für die Transkription des Alphavirus-Vektormoleküls verantwortlich ist, inkorporiert werden. Solch eine zusätzliche Ebene der Regulation kann in den minimalen Promotor inkorporiert werden und kann andere induzierbare Systeme und/oder eine Zelldifferenzierungs-Kontrolle involvieren. In jedem der obigen Fälle kann eine stabile Transformierung als eine Integration in das Wirtszell-Chromosom oder als ein extrachromosomales Episom unter Verwendung zum Beispiel des episomal-basierten EBV-Vektorpromotors (für nicht-integrierte) erreicht werden.
BEISPIEL 8
VERFAHREN FÜR DIE HERSTELLUNG VON ALPHAVIRUS-ABGELEITETEN LEEREN ODER CHIMÄREN VIRALEN PARTIKELN
Wie im Beispiel 6 illustriert, können individuelle defekte Helfer (DH)-Expressionskassetten konstruiert werden, um Elemente von mehreren Alphaviren oder ihren Varianten zu enthalten. Daher können, wie im Beispiel 6 beschrieben, DH-Kassetten mit gespaltenen Strukturgenen für die Expression der viralen Glycoproteine konstruiert werden, um die Capsid- und Glycoproteingene von anderen Alphavirusspezies zu enthalten. Zum Beispiel könnte eine solche heterologe Alphavirus-Glycoprotein-DH-Kassette das Capsidgen des Ross River-Virus (RRV) und die Glycoprotein-Gene des Sindbis-Virus enthalten. In dieser Konfiguration dient das RRV-Capsidgen, um den Spiegel der Translation der Glycoprotein-Gene zu verstärken.
Die hierin beschriebenen Konfigurationen für die heterologen Alphavirus-Glycoprotein-DH-Kassetten sind gestaltet, um die Verpackung von Vektor-Replikons in Alphaviruspartikel zu verbessern, verringern jedoch die Möglichkeit der Rekombination, was in der Bildung eines replikationskompetenten Alphavirus resultiert. Die heterologe Alphavirus-Glycoprotein-DH-Expressionskassette ist ein Ersatz des Sindbis-Virus-Capsidgens in den DH-Expressionskassetten, die im Beispiel 6 beschrieben sind („genomische” Strukturprotein-Gen-PCL), mit einem heterologen Alphavirus-Capsidgen (z. B. RRV). Die zweite DH-Expressionskassette in der PCL mit gespaltenen Strukturgenen enthält zum Beispiel das Sindbis-Virus-Capsidgen. Daher kann eine PCL mit gespaltenen Strukturgenen für die Herstellung von rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikeln, die Sindbis-Virus-Strukturproteine aufweisen, abgeleitet werden, zum Beispiel mit den Sindbis-Virus-Glycoproteingenen und den Capsidgenen auf individuellen DH-Expressionskassetten.
Es ist kürzlich gezeigt worden, dass chimäre Viren, die alle Gene von RRV, aber mit dem Capsidgen des Sindbis-Virus oder des reziproken chimären Virus enthalten, sich nicht zu infektiösen Viruspartikeln zusammenlagern (Lopez et al., J. Virol. 68: 1316-1323, 1994). Die Autoren schlossen in diesem Bericht, dass die Interaktion zwischen dem Carboxyterminus des Glycoproteins E2 und dem Capsidprotein in der Viruszusammenlagerung nicht zwischen den Strukturproteinen von heterologen Alphaviren erfolgen kann. Daher sollten rekombinante Genome, die aus den Alphavirus-PCLs mit gespaltenen Strukturgenen, die in Beispiel 6 beschrieben sind, hervorgehen, bestehend aus den Sindbis-Virus-Nichtstrukturprotein-Genen (die vom Vektor-Replikon stammen), dem RRV-Capsidgen und den Sindbis-Virus-Glycoprotein-Genen, nicht replikationskompetent sein, was in der Vermehrung des Virus resultiert (replikationskompetentes Sindbis-Virus, RCSV). Die Verpackungs-Einschränkung zwischen heterologen Alphavirus-Spezies erlaubt die Konstruktion von DH-Kassetten, die das Capsidgen, einschließlich des translationellen Enhancer-Elements, von einem Alphavirus und die Glycoprotein-Gene von einem anderen Alphavirus umfassen.
Wie jedoch in 31 gezeigt, ist die Beobachtung von Lopez et al. (ebd.), dass zwischen den Strukturproteinen von heterologen Alphaviren keine Zusammenlagerung erfolgen kann, nicht korrekt. In der Tat produziert eine DH-Kassette, bestehend aus dem RRV-Capsidgen und dem Sindbis-Virus-Glycoprotein-Gen, infektiöse Viruspartikel. Kurz, in BHK-Zellen wurden SINrep/LacZ-Replikon (Bredenbeek et al., J. Virol., 67: 6439-6446, 1993) und DH-BB (5' tRNA/SIN) Crrv (Beispiel 6 und 24; RRV-Capsid/Sindbis-Virus-Glycoproteine) in vitro-transkribierten RNAs durch Elektroporation gemeinsam eingeführt. Die Elektroporation und in vitro-Transkriptionen wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Nach der Elektroporation wurden die BHK-Zellen mit Dactinomycin behandelt und mit [³H]Uridin markiert, genau wie im Beispiel 1 beschrieben. 18 Stunden nach der Elektroporation wurde das Kulturmedium gewonnen und durch Zentrifugation bei 6000 UpM für 10 min geklärt. Die Vektorpartikel, die im Überstand verblieben, wurden nach vorherigem Überschichten über ein Saccharose-Polster durch Ultrazentrifugation pelletiert. Die RNA wurde 18 Stunden nach der Elektroporation von den BHK-Zellen und vom Viruspellet isoliert, auf denaturierenden Glyoxal-Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen und durch Autoradiographie sichtbar gemacht, genau wie im Beispiel 1 beschrieben. Die viralen RNAs, die in den BHK-Zellen, die mit SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs durch Elektroporation behandelt wurden, und in Viruspartikeln vorhanden sind, sind in 31 gezeigt (Bahn 1, Feld A und Bahn 1, Feld B). Die RNAs, die den genomischen und subgenomischen replikativen Spezies für SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs entsprachen, waren sowohl in durch Elektroporation behandelten BHK-Zellen als auch den produzierten Viruspartikeln vorhanden. Die Ergebnisse zeigen im Gegensatz zu Lopez et al. (ebd.) die Bildung von chimären Alphaviruspartikeln, die aus einem RRV-Capsidprotein und Sindbis-Virus-Glycoproteinen bestehen. Weiterhin weist die unterschiedslose Verpackung von genomischen und subgenomischen SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs in chimären Alphaviruspartikeln auf die Unfähigkeit des Ross River-Capsidproteins hin, spezifisch die Sindbis-Virus-Verpackungssequenz, die im nsP1-Gen des SINrep/LacZ-Vektor-Replikons vorhanden ist, zu erkennen.
Die viralen Proteine, die in BHK-Zellen vorhanden sind, die mit SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs durch Elektroporation behandelt wurden, 18 Stunden nach der Elektroporation und die produzierten Viruspartikel sind in 32 (Bahn 1, Feld A, und Bahn 1, Feld B) angegeben. Die viral-spezifischen Strukturproteine in durch Elektroporation behandelten Zellen und die produzierten chimären Alphaviruspartikel waren nicht unterscheidbar. Das heißt, 32 zeigt deutlich, dass Viruspartikel, die von BHK-Zellen produziert werden, die mit SINrep/LacZ- und DH-BB Crrv-RNAs durch Elektroporation behandelt wurden, das RRV-Capsid und die Sindbis-Virus-Glycoproteine E1 und E2 enthielten. Dieses Ergebnis liefert einen unumstrittenen Hinweis, dass es im Gegensatz zu Lopez et al. (ebd.) keine Einschränkung in der Zusammenlagerung zwischen heterologen Alphavirus-Capsid- und Glycoproteinen gibt, die die Bildung von chimären viralen Partikeln verhindert.
Daher ist der Aminoterminus des RRV-Capsidproteins in starkem Kontrast zu den Ergebnissen und der Diskussion von Lopez et al. in der Lage, mit dem heterologen Sindbis-Virusgenom zu binden und infektiöse chimäre Alphaviruspartikel zu bilden. Wichtig ist, dass die frühere Schlussfolgerung, dass es eine Einschränkung der Viruszusammenlagerung zwischen heterologen Alphavirus- Capsidproteinen und Glycoproteinen gibt, nicht korrekt ist. Die Herstellung von chimären Alphaviruspartikeln, wie hier beschrieben, würde dann auch in der Bildung von RCSV in den oben beschriebenen PCLs mit gespaltenen Strukturgenen resultieren, da ein rekombinantes Genom, das aus den Sindbis-Virus-Nichtstrukturprotein-Genen (die vom Vektor-Replikon stammen), dem RRV-Capsidgen und den Sindbis-Virus-Glycoprotein-Genen besteht, infektiöses Virus erstellen würde. Alternativ erlaubt dieses Fehlen der Einschränkung der Verpackung zwischen verschiedenen Alphavirus-Strukturproteinen und Vektor-Replikons, dass der Tropismus der Vektorpartikel modifiziert wird. Zum Beispiel können Sindbis-Virus-Replikons mit den Venezuelanischen Pferde-Encephalitis-Virus-Strukturproteinen verpackt werden, um ein lymphotropes rekombinantes Vektorpartikel herzustellen.
Die in zwei getrennten, früheren Untersuchungen beschriebenen Ergebnisse haben gezeigt, dass eine in vitro-Verminderung der Interaktion zwischen dem Capsidprotein und dem positiven RNA-strängigen Genom von zwei ikosaederförmigen Viren, die die Triangulationsnummern (T) = 3 haben, Rüben-Knittervirus (turnip crinkle virus, TCV) und südliches Bohnen-Mosaikvirus (SBMV), in der Disassoziierung der Viruspartikel und der Bildung von Nucleinsäure-freien T = 1-Partikeln resultierte (Sorger et al. J. Mol. Biol., 191: 639-656, 1986, und Erickson und Rossmann, Virology 116: 128-136, 1982). In der Abwesenheit einer Nucleinsäure wurden in vitro keine T = 3-Partikel, die ähnlich zum Wildtyp-Virus sind, gebildet. Owen und Kuhn (J. Virol., 70: 2757-2763, 1996) untersuchten die Verpackungseigenschaften von Sindbis-Virusgenomen, die Deletionen im Capsid enthielten, um die Region des Capsidproteins zu identifizieren, die für das Bestimmen der Spezifität der Verkapselungsreaktion in vivo benötigt wird. Ein mutiertes Virus [CD(97-106)], das eine Deletion enthält, die den Resten 97-106 des Capsids entspricht, verkapselte sowohl genomische als auch subgenomische RNAs, was die Domäne des Capsidproteins anzeigte, die für die spezifische Erkennung des genomischen RNA-Verpackungssignals erforderlich war. In noch einem anderen Bericht wurden die Verpackungseigenschaften von Aura-Alphavirus untersucht (Rumenapf et al. J. Virol., 69: 1741-1746, 1995). In dieser Untersuchung wurde ein Mechanismus für die Alphavirus-Verpackung vorgeschlagen, der einen Capsidprotein-Verkapselungssequenz-Interaktions-Initiierungskomplex involviert.
Dieser vorgeschlagene Mechanismus basiert auf Beobachtungen durch die Autoren und andere (einschließlich Owen und Kuhn, ebd.), in denen 26S- und 49S-Alphavirus-RNAs in T = 1-, T = 3-, T = 4- und T = 7-Viruspartikel verpackt werden, wobei über leere Capside, die während der Infektion mit Alphaviren entstehen, nicht berichtet worden ist.
Basierend auf der oben präsentierten Literatur und den darin enthaltenen Diskussionen sollte ein RRV-Capsidgen, von dem die Region, die der Capsidprotein-Domäne entspricht, die für das Bestimmen der Spezifität der Verkapselungsreaktion benötigt wird, und zusätzlich umgebende basische Reste, die elektrostatisch mit viraler RNA binden, deletiert wurden, nicht in der Lage sein, stabile Capsidpartikel zu bilden, die virale RNAs enthalten. Daher sollten sich die Alphavirus-Strukturproteine, die von einer heterologen Alphavirus-DH-Kassette exprimiert werden, die aus diesem deletierten RRV-Capsidgen und den Sindbis-Virus-Glycoprotein-Genen besteht, nicht zu stabilen chimären Alphaviruspartikeln zusammenlagern. Daher konnte in der PCL mit gespaltenen Strukturgenen, die oben und im Beispiel 6 diskutiert wurde, ein rekombinantes Genom, das aus den Sindbis-Virus-Nichtstrukturprotein-Genen, dem RRV-Capsidgen (von dem die Region, die der Verpackungsspezifität entspricht, und die umgebenden basischen Reste deletiert wurden) und den Sindbis-Virus-Glycoprotein-Genen besteht, kein infektiöses Virus herstellen. Wie im Beispiel 6 beschrieben, wird das Sindbis-Virus-Capsidprotein von einer getrennten DH-Expressionskassette exprimiert; daher werden die drei Sindbis-Virus-Strukturproteine in toto exprimiert, was in der Produktion von rekombinanten Vektorpartikeln resultiert.
Die Nucleotide des RRV-Capsidgens, die den vorhergesagten Regionen des exprimierten Proteins entsprechen, das an die Sindbis-Virus-Verpackungssequenz bindet (Weiss et al., Nuc. Acids Res., 22: 780-786, 1994, und Lopez et al., ebd.), einschließlich der basischen Reste, die elektrostatisch mit der viralen RNA binden, wurden deletiert, um ein heterologes Alphavirus-Capsid-Glycoprotein-DH zu konstruieren, das eine translationelle Steigerung und korrekte pE2-6K-E1-Polyprotein-Prozessierung durch post-translationelle Spaltung lieferte, jedoch keine stabilen chimären RRV/Sindbis-Viruspartikel zusammenlagern konnte. 33 illustriert die Hydrophobieprofile (Kyte-Dolittle) des RRV-Capsidproteins und des Capsidproteins, das von 3 individuellen RRV-Capsid-Genmutanten (CΔ1rrv, CΔ2rrv und CΔ3rrv) exprimiert wird, in dem variierende Mengen des Capsidgens, das ein Lysin-reiches Protein codiert, das mit der viralen Verpackungssequenz-RNA interagiert, deletiert wurden. Die Lysin-reiche basische Region des RRV-Capsidproteins ist in 33 gezeigt. Weiterhin zeigen die Hydrophobieprofile, dass diese Lysin-reiche basische Region in den 3 individuellen RRV-Capsid-Genmutanten CΔ1rrv, CΔ2rrv und CΔ3rrv fortscheitend eliminiert wird. 34 zeigt die Lysin-Reste, die im exprimierten RRV-Capsidprotein als ein Ergebnis der Deletionen in den Mutanten CΔ1rrv, CΔ2rrv und CΔ3rrrv eliminiert wurden. Die unten gezeigte Tabelle gibt die Nucleotide an, die im RRV-Genom der Konstrukte CΔ1rrv, CΔ2rrv und CΔ3rrv deletiert wurden.

Konstrukt Deletierte RRV-Genom-Nts.

CΔ1rrv 7841-7891

CΔ2rrv 7796-7891

CΔ3rrv 7760-7891
Die RRV-Capsidgen-Deletionen wurden auf der DH-BB Crrv-Plasmid-DNA, illustriert in 23, konstruiert und im Beispiel 6 beschrieben. Die angezeigten RRV-Capsidgen-Sequenzen wurden durch PCR unter Verwendung der Primer und anderer Clonierungsschritte, die im Beispiel 6 angegeben sind, deletiert.
Die oben diskutierten 31 und 32 illustrieren die virusspezifischen RNAs (31) und Proteine (32), die in BHK-Zellen synthetisiert wurden, die mit SINrep/LacZ und den DH-BB CΔ1rrv-, CΔ2rrv- oder CΔ3rrv-RNAs durch Elektroporation behandelt wurden, und in viralen Partikeln vorliegen, die in den Kulturflüssigkeiten dieser Zellen enthalten sind. Die genomischen und subgenomischen Spezies wurden in den durch Elektroporation behandelten Zellen für sowohl das SINrep/LacZ-Replikon als auch alle drei DH-BB CΔ1rrv-, CΔ2rrv- oder CΔ3rrv-DH-RNAs nachgewiesen (31, Feld A). Dennoch wurde das SINrep/lacZ-Replikon in Zellen, die mit den DH-RNA-enthaltenden Deletionen im RRV-Capsidgen durch Elektroporation behandelt wurden, nicht in Vektorpartikel verpackt, gezeigt durch das Fehlen von genomischer Replikon-RNA in den Viruspartikeln (31, Feld B). Weiterhin wurden genomische und subgenomische Helfer-RNAs sehr unwirksam verpackt und waren in den Autoradiogrammen der denaturierenden Gele kaum sichtbar (31, Feld B, Bahnen 3 und 4), wenn die Zellen mit den DH-Molekülen durch Elektroporation behandelt wurden, die größere Deletionen des RRV-Capsid enthielten (CΔ2rrv oder CΔ3rrv). Während genomische SINrep/lacZ-RNA (und DH-RNA in den Elektroporationen mit CΔ2rrv oder CΔ3rrv) nicht in den viralen Partikeln von BHK-Zellen nachgewiesen wurde, die mit den DHs, die Deletionen im RRV-Capsidgen enthielten, durch Elektroporation behandelt wurden, wurden im Gegensatz dazu äquivalente RRV-Capsidprotein- und Sindbis-Virus-Glycoprotein-Spiegel in Viruspartikeln von Zellen beobachtet, die mit allen DH-RNAs durch Elektroporation behandelt wurden, unabhängig davon, ob das RRV-Capsidgen Deletionen enthielt (32, Felder A und B). Dieses Ergebnis zeigt, dass stabile chimäre Viruspartikel, die kein Vektor-Replikon oder andere viralspezifische RNAs enthielten, in BHK-Zellen gebildet wurden, die mit genomischer SINrep/lacZ-RNA und DH-RNA durch Elektroporation behandelt wurden, wovon das Capsidprotein, das nicht in der Lage war, an die genomische RNA zu binden, exprimiert wurde. Die Bildung von stabilen leeren heterologen Alphaviruspartikeln ist basierend auf den Ergebnissen und Diskussionen von früheren Untersuchern (Lopez et al., J. Virol. 68: 1316-1323, 1994, Sorger et al. J. Mol. Biol., 191: 639-656, 1986, Erickson und Rossmann, Virology 116: 128-136, 1982 und Rumenapf et al. J. Virol., 69: 1741-1746, 1995) unerwartet und nicht vorhergesagt.
Um die Zusammensetzung der produzierten Viruspartikel zu bestimmen, wurden BHK-Zellen mit SINrep lacZ- und den DH-RNAs, die verschiedene RRV-Capsidgen-Konfigurationen enthielten, wie hierin beschrieben, durch Elektroporation behandelt und wurden danach mit Dactinomycin behandelt und mit [³⁵S]Methionin und [³H]Uridin markiert, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Konfiguration der produzierten viralen Partikel wurde durch Ultrazentrifugation der geklärten Zellkulturmedien für 2 h bei 35000 UpM in einem SW-41-Rotor über einen 20%–40% (Gew./Gew.)-Saccharosegradienten bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in den 35–37 gezeigt und demonstrieren wieder die Bildung von stabilen, leeren heterologen Alphaviruspartikeln. 35 zeigt die relativen Spiegel von [³⁵S]Methionin und [³H]Uridin, die in Partikel inkorporiert wurden, die in BHK-Zellen, die bei hoher MOI (5) mit dem Wildtyp-Virus Toto1101 infiziert wurden, synthetisiert wurden. 36 zeigt, dass die relativen Spiegel von [³⁵S]Methionin und [³H]Uridin, die in die Partikel inkorporiert wurden, die in BHK-Zellen, die mit SINrep/lacZ- und DH-BB (5' tRNA) Crrv(23)-RNAs durch Elektroporation behandelt wurden, synthetisiert wurden, dieselben waren wie in Zellen, die mit dem Wildtyp-Virus infiziert wurden. Im Gegensatz dazu zeigt 37, dass die Partikel, die in BHK-Zellen, die mit SINrep/lacZ und DH-BB (5' tRNA) CΔ3rrv durch Elektroporation behandelt wurden, produziert wurden, sehr niedrige Spiegel an inkorporiertem [³H]Uridin enthielten. 38 ist eine Zusammenstellung der 35–37 und illustriert deutlich, dass, während die relativen Spiegel von [³⁵S]Methionin und [³H]Uridin, die in die Partikel inkorporiert wurden, in BHK-Zellen, die mit RNAs infiziert oder durch Elektroporation behandelt wurden, die Wildtyp-Alphavirus-Capsidgene enthielten, ähnlich waren, BHK-Zellen, die mit DH-RNA durch Elektroporation behandelt wurden, die Deletionen der nts. 7760-7891 des RRV-Capsidgens enthielten, stabile, chimäre, leere Alphaviruspartikel bildeten, denen SINrep/LacZ-RNA fehlte. Die Titer der leeren Alphaviruspartikel, produziert in den Zelllinien, die mit in vitro-transkribierten SINrep/LacZ-RNA und DH-BB CD3rrv-RNAs durch Elektroporation behandelt und mit [³⁵S]Methionin markiert wurden, wurden durch Vergleich mit BHK-Zellen, die mit dem Toto 1101-Wildtyp-Virus infiziert und mit [³⁵S]Methionin markiert wurden, bestimmt. Der Spiegel der Radioaktivität, der in den Virus-enthaltenden Saccharosegradienten-Fraktionen von Toto 1101-infizierten Zellen vorhanden war, wurde quantifiziert und zu dem Virustiter, der in diesen selben Fraktionen vorhanden war, bestimmt durch Plaque-Test gemäß den Verfahren, die im Beispiel 1 beschrieben sind, in Beziehung gestellt. Für Titerbestimmungen leerer Alphaviruspartikel wurde der Spiegel der Radioaktivität, die in Viruspartikel-enthaltenden Saccharosegradienten-Fraktionen von BHK-Zellen vorhanden war, die mit in vitro-transkribierten SINrep/LacZ-RNA und DH-BB CD3rrv-RNAs durch Elektroporation behandelt wurden, quantifiziert und zu dem [³⁵S]Methionin/Virustiter von Toto 1101-infizierten Zellen in Beziehung gestellt. Der Titer der leeren, chimären Viruspartikel, enthaltend das deletierte Ross River-Virus-Capsid und die Sindbis-Virus-Glycoproteine, die in Zellen produziert wurden, die mit in vitro-transkribierter SINrep/LacZ-RNA- und DH-BB CD3rrv-RNA durch Elektroporation behandelt wurden, war 1 × 10⁹ Partikel/ml.
Während die vorliegende Erfindung oben sowohl allgemein als auch durch bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird verstanden, dass Variationen und Modifikationen für Fachleute angesichts der vorstehenden Beschreibung auftreten werden. Daher sollen die angefügten Ansprüche alle solchen Variationen abdecken, die innerhalb des Rahmens der Ansprüche liegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Alphavirusvektor, umfassend ein verändertes Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen, welches, wenn es in eine Wirtszelle eingeführt wird, die Zeit erhöht, welche benötigt wird, um 50% Hemmung der wirtszellgerichteten Makromolekülsynthese zu erreichen, im Vergleich zu einem Vektor, welcher ein Wildtyp-Alphavirus-nsP2-Gen besitzt, wobei daraus Expressionsspiegel von heterologen Genen resultieren, welche gleich oder höher sind im Vergleich zu Expressionsspiegeln eines Vektors, welcher ein Wildtyp-Alphavirus-nsP2-Gen besitzt, wobei das veränderte Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen eine oder mehrere Nucleotid-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen aufweist, welche die Nucleotidsequenz von der des Wildtyp-Alphavirus-nsP2-Gens abwandeln, wobei das veränderte Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen ein biologisch aktives nsP2-Protein bereitstellt.
Alphavirusvektor nach Anspruch 1, welcher ein Alphavirus-Vektorkonstrukt ist und einen 5'-Promotor umfasst, welcher die Synthese viraler RNA in vitro aus cDNA initiiert, eine 5'-Sequenz, welche die Transkription von Alphavirus-RNA, welche dem 5'-Promotor folgt, initiiert, sowie ein Nucleinsäuremolekül, welches funktionell alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine codiert, einschließlich eines veränderten Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gens, einer Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz, eines 3'-Polyadenylat-Bereichs und einer ausgewählten heterologen Sequenz stromabwärts davon, welche funktionell mit einer viralen Verbindungsregion verknüpft ist.
Alphavirusvektor nach Anspruch 1, welcher ein Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon ist, welches in der Lage ist, in einem eukaryontischen System translatiert zu werden, umfassend eine 5'-Sequenz, welche die Transkription von Alphavirus-RNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, welches funktionell alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine codiert, einschließlich eines veränderten Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gens, einer Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz, eines 3'-Polyadenylat-Bereichs und einer ausgewählten heterologen Sequenz stromabwärts davon, welche funktionell mit einer viralen Verbindungsregion verknüpft ist.
Arzneimittel, umfassend ein Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon nach Anspruch 3 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Rekombinantes Alphavirus-Partikel, umfassend ein oder mehrere Alphavirus-Strukturproteine, eine Lipidhülle und ein RNA-Vektor-Replikon nach Anspruch 3.
Rekombinantes Alphavirus-Partikel nach Anspruch 5, wobei ein oder mehrere Alphavirus-Strukturproteine aus einem Alphavirus abgeleitet sind, das unterschiedlich ist von dem Alphavirus, von dem das RNA-Vektor-Replikon abgeleitet ist.
Arzneimittel, umfassend ein rekombinantes Alphavirus-Partikel nach Anspruch 5 oder 6 und einen pharmazeutisch verträglicher Träger oder Verdünnungsmittel.
Wirtszelle, infiziert mit einem rekombinanten Alphavirus-Partikel nach Anspruch 5 oder 6.
Eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem, umfassend: einen 5'-Promotor, welcher in der Lage ist, in vivo die 5'-Synthese von Alphavirus-RNA aus cDNA zu initiieren; eine Sequenz, welche die Transkription von Alphavirus-RNA, welche dem 5'-Promotor folgt, initiiert; ein Nucleinsäuremolekül, welches funktionell alle vier alphaviralen Nichtstrukturproteine codiert, einschließlich eines veränderten Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gens, wobei das veränderte Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen eine oder mehrere Nucleotid-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen aufweist, welche die Nucleotidsequenz von der des Wildtyp-Alphavirus nsP2-Gens abwandeln, wobei das veränderte Alphavirus-Nichtstrukturprotein 2 (nsP2)-Gen ein biologisch aktives nsP2 Protein bereitstellt; eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz; eine 3'-Polyadenylat-Region; und eine heterologe Sequenz, welche funktionell mit einer viralen Verbindungsregion verknüpft ist, wobei das Alphavirus-RNA-Replikonmolekül, welches aus der Transkription des eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems entsteht, die Zeit erhöht, welche benötigt wird, um 50% Hemmung von wirtszellvermittelter Makromolekülsynthese zu erreichen, im Vergleich zu einem Alphavirus-RNA-Replikonmolekül, welches ein Wildtyp-Alphavirus nsP2-Gen besitzt.
Wirtszelle, welche ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem nach Anspruch 9 enthält.
Alphavirus-Hersteller-Zelllinie, umfassend eine Zelle, welche eine stabil transformierte Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette enthält, und einen Vektor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem RNA-Vektor-Replikon nach Anspruch 3, einem Alphavirus-Vektorkonstrukt nach Anspruch 2 und einem eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystem nach Anspruch 9.
Arzneimittel, umfassend ein eukaryontisches geschichtetes Vektorinitiationssystem nach Anspruch 9 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Verfahren zur Herstellung rekombinanter Alphavirus-Partikel, umfassend: (a) Einführung eines Vektors, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystem nach Anspruch 9, einem RNA-Vektor-Replikon nach Anspruch 3 und einem rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikel nach Anspruch 5, in eine Population von Alphavirus-Verpackungszellen, wobei die Alphavirus-Verpackungszellen eine Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette enthalten, umfassend einen 5'-Promotor, welcher die Synthese von RNA aus DNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, welches ein oder mehrere funktionelle Alphavirus-Strukturproteine codiert, einen Selektionsmarker, welcher funktionell verknüpft ist mit der Expressionskassette, und eine 3'-Sequenz, welche die Transkriptionstermination kontrolliert, unter Bedingungen und für eine Zeit, welche ausreichend sind, um die Produktion der rekombinanten Alphavirus-Partikel zu ermöglichen; und (b) Gewinnung rekombinanter Alphaviruspartikel.
Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten Proteins umfassend: (a) Einführung eines Vektors, welcher ein ausgewähltes heterologes Protein codiert und welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystem nach Anspruch 9, einem Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon nach Anspruch 3 und einem rekombinanten Alphavirus-Vektorpartikel nach Anspruch 5, in eine Population von Alphavirus-Verpackungszellen, wobei die Alphavirus-Verpackungszellen eine Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette enthalten, umfassend einen 5'-Promotor, welcher die Synthese von RNA aus DNA initiiert, ein Nucleinsäuremolekül, welches ein oder mehrere funktionelle Alphavirus-Strukturproteine codiert, einen Selektionsmarker, welcher funktionell verknüpft ist mit der Expressionskassette, und eine 3'-Sequenz, welche die Transkriptionstermination kontrolliert, unter Bedingungen und für eine Zeit, welche ausreichend sind, um die Produktion des ausgewählten Proteins zu ermöglichen, und (b) Gewinnung des Proteins, welches von den Verpackungszellen produziert wird.
Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten Proteins, umfassend die Einführung eines eukaryontischen geschichteten Vektorinitiationssystems nach Anspruch 9 in eine Wirtszelle unter Bedingungen und für eine Zeit, welche ausreichend sind, um die Expression des ausgewählten Proteins zu ermöglichen.
Wirtszelllinie, welche ein Alphavirus-RNA-Vektor-Replikon nach Anspruch 3 enthält.