DE69635121T2

DE69635121T2 - Mutiertes Gen, das einen Fehler in der Mitochondrienrekombination verursacht, Verfahren für seinen Nachweis

Info

Publication number: DE69635121T2
Application number: DE69635121T
Authority: DE
Inventors: Takehiko Wako-shi Shibata; Feng Wako-shi Ling; Fusao Higashimurayama-shi Makishima
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1996-06-24
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2016-06-25
Also published as: EP0750038A2; EP0750038A3; DE69635121D1; US5908747A; EP0750038B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein mutiertes Gen (mhr1) in einem Zellkernchromosom, das einen Fehler in der homologen Mitochondrienrekombination verursacht, sowie ein Verfahren zum Nachweis des Gens.
Mitochondrien sind Organellen, die in eukaryontischen Zellen vorliegen, und sie spielen eine Rolle bei der Synthese von ATP, das eine Energieform ist, die über ein Elektronentransportsystem durch oxidative Phosphorylierung von Substanzen erzeugt wird.
Mitochondrien produzieren als Nebenprodukte der Sauerstoffatmung aktive Sauerstoffspezies mit einem hohen Spiegel. Diese aktiven Sauerstoffspezies schädigen ständig die Mitochondrien-DNA. Um ihre DNA und ihre Funktionen als Organellen aufrechtzuerhalten, müssen Mitochondrien einen Mechanismus zur Reparatur derartiger Schäden an der DNA aufweisen und Anomalien der Mitochondrien-DNA unterdrücken. Eine der angenommenen wichtigen Funktionen dieses Mechanismus ist die homologe Rekombination, von der man glaubt, dass sie bei der Reparatur von eukaryontischer Zellkern-DNA sowie von bakterieller und viraler DNA unentbehrlich ist.
Die homologe Rekombination ist ein Phänomen, das universell in der Organismenwelt beobachtet wird. D.h. wenn ein DNA-Molekül einen Bereich besitzt, der über mehrere hundert Basenpaare eine fast identische Basensequenz mit einer Basensequenz eines Bereiches eines weiteren paarenden DNA-Moleküls aufweist, werden die DNA-Ketten der beiden Moleküle gespalten und mit einer Kette, die sich von der Ausgangskette unterscheidet, an einer Stelle wiederverbunden, die sich in jenen Bereichen genau mit der jeweils anderen Stelle deckt. Aufgrund der homologen Rekombination wird die Schädigung an einer DNA durch die andere DNA komplementiert. Auf diese Weise wird eine Funktion erhalten, um die normalen Funktionen der DNA aufrechtzuerhalten.
Wenn die Funktion eines Gens nachlässt, das die homologe Rekombination induziert (hier nachstehend als „homologes Rekombinationsgen bezeichnet"), wird es unmöglich, die geschädigte DNA zu reparieren, und die DNA-Anomalien nehmen zu. Wenn ein homologes Rekombinationsgen anomal funktioniert, tritt ferner ein anomales ungleiches Crossover zwischen einem Paar von Wiederholungssequenzen auf, die an Stellen lokalisiert sind, die nicht allelisch sind. Demzufolge werden DNA-Anomalien wie Deletion induziert. Es wurde darauf hingewiesen, dass dieser Deletionstyp in der Mitochondrien-DNA mit Mitochondrienerkrankungen (z.B. Mitochondrienmyopathie, die durch einen Enzymmangel im energieproduzierenden System der Mitochondrien verursacht wird), Altern und dergleichen assoziiert ist [Holt, I. J. et al., Nature (London), 331: 717–719 (1988)].
Deshalb wird es möglich, den Nachweis und die Modifikation eines derartigen mutierten Gens bei der Diagnose oder der Behandlung von mit Mitochondrien im Zusammenhang stehenden Erkrankungen sowie der Alterungsprävention und dergleichen zu verwenden, indem ein mutiertes Gen isoliert wird, das an jenen Anomalien in der vorstehend beschriebenen homologen Rekombination beteiligt ist, und indem man die Rolle eines derartigen Gens herausfindet.
Die meisten Mitochondrienproteine werden von DNAs codiert, die auf den Zellkernchromosomen lokalisiert sind, und man erwartet, dass die homologe Rekombination von Mitochondrien nur von der genetischen Information abhängt, die in den Zellkernen enthalten ist.
Deshalb ist es notwendig, als ersten Schritt zur Aufklärung der Rolle und des Mechanismus der homologen Mitochondrienrekombination ein Gen mit einer Mutation, die einen Fehler in der homologen Mitochondrienrekombination verursacht, d.h. ein mutiertes Gen in Zellkernen, zu isolieren.
Herkömmlicherweise wurde Hefe als das geeignetste System angesehen, um genetische Informationen hinsichtlich der Mitochondrien (Informationen über die Rolle der homologen Mitochondrienrekombination) zu erhalten.
Sogar bei der Hefe war es jedoch äußerst schwierig, eine große Anzahl an Clonen für ein mutiertes Gen zu untersuchen, insbesondere ein rezessives mutiertes Gen in einem Zellkernchromosom, das an der homologen Mitochondrienrekombination beteiligt ist. Mit anderen Worten ist es notwendig, ein Paarungexperiment zum Nachweis der Mitochondrienrekombination durchzuführen, aber wenn Zellen mit einem rezessiven mutierten Gen für die homologe Mitochondrienrekombination mit Zellen gepaart werden, die ein normales Gen für die Rekombination besitzen, ist das rezessive Gen durch die Funktion des normalen Gens verdeckt, und daher kann das rezessive mutierte Gen nicht nachgewiesen werden.
Deshalb sind beim herkömmlichen Verfahren zur Isolierung eines rezessiven mutierten Gens in einem Zellkernchromosom die folgenden Arbeitsgänge zur Isolierung erforderlich; i) Konstruktion monoploider Zellen mit beiden allelen Paarungstypen (a und α), wobei jeder denselben Zellkerngenotyp besitzt, wie derjenige der jeweiligen mutierten monoploiden Zellen; ii) Einführen von Mitochondrien mit verschiedenen Genmarkern entweder in ein a- oder α-Derivat durch Isolierungs- und Zellfusionsexperimente eines p⁰-Derivats (Derivate, die kein Mitochondriengen besitzen); und iii) Durchführung eines Paarungsexperiments zwischen a-Monoploiden und α-Monoploiden, um die Rekombinationshäufigkeit des Mitochondriengenmarkers zu bestimmen. Außerdem sind diese Arbeitsgänge kompliziert und zeitraubend, und es war bisher äußerst schwierig, eine große Anzahl an Kandidatenzellen gleichzeitig zu untersuchen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Gen in einem Zellkernchromosom, das die homologe Mitochondrienrekombination induziert, ein mutiertes Gen davon sowie ein Verfahren zum Nachweis des mutierten Gens bereitzustellen.
Durch intensive und ausgiebige Forschungen zur Lösung der vorstehenden Aufgabe hat der hier genannte Erfinder ein Verfahren gefunden, das ein mutiertes Gen in einem Zellkern nachweisen kann, das an der homologen Mitochondrienrekombination beteiligt ist, indem zellkernenthaltende Zellen mit Zellen, deren Zellkern entfernt wurde, fusioniert werden. Ferner war der Erfinder bei der Clonierung des mutierten Gens erfolgreich und daher wurde das Ziel der vorliegenden Erfindung erreicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines mutierten Gens in einem Zellkernchromosom, das an der homologen Mitochondrienrekombi nation beteiligt ist, umfassend die Fusion von zellkernenthaltenden Zellen, die Mitochondrien mit einem Markergen (I) enthalten, mit Zellen, deren Zellkern entfernt wurde und die Mitochondrien mit einem Markergen (II) enthalten, das sich vom Markergen (I) unterscheidet, die Selektion aus den sich ergebenden fusionierten Zellen derjenigen Zellen, die rekombinante Mitochondrien enthalten, die sowohl das Markergen (I) als auch (II) besitzen, sowie die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit des mutierten Gens, basierend auf einer Abnahme der Häufigkeit des Auftretens von denjenigen fusionierten Zellen, die rekombinante Mitochondrien enthalten.
Als mutiertes Gen kann ein rezessives mutiertes Gen wie das mhr1-Gen in Betracht gezogen werden. Als Markergen (I) oder (II) können das Chloramphenicol-Resistenzgen, das Oligomycin-Resistenzgen oder das Antimycin-Resistenzgen aufgezählt werden. Hier sollte angemerkt werden, dass das Markergen (I) und das Markergen (II) zwei verschiedene Gene sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein mhr1-Gen, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz für das in SEQ ID NR. 1 dargestellte Wildtyp-MHR1-Protein umfasst, wobei die Sequenz eine Mutation in mindestens einem Aminosäurerest an Position 99 besitzt. Als die Sequenz mit einer Mutation kann die in SEQ ID NR. 2 dargestellte Sequenz angegeben werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Gene und/oder mutierte Gene, die mit dem vorstehend erwähnten Gen hybridisieren und die ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität, eine homologe Mitochondrienrekombination zu induzieren, codieren. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Hybridisierung" auf herkömmliche Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen.
Das hier verwendete „MHR1-Protein" bedeutet ein Protein, das durch Expression des MHR1-Gens (ein Wildtypgen in einem Zellkern, der die homologe Mitochondrienrekombination induziert) erhältlich ist. Ein hier verwendetes „mhr1-Gen" bedeutet ein mutiertes MHR1-Gen, d.h. ein mutiertes Gen in einem Zellkern, das einen Fehler in der homologen Mitochondrienrekombination induziert.
Eine hier verwendete „Aminosäuresequenz mit einer Mutation" bedeutet eine Aminosäuresequenz, die von einem Gen codiert wird, das die Funktion besitzt, einen Fehler in der homologen Mitochondrienrekombination zu verursachen, und die die in SEQ ID NR. 1 dargestellte Aminosäuresequenz ist, die eine Substitution, Addition oder Deletion von mindestens einer Aminosäure aufweist. D.h. dass die Aminosäuresequenz andere Substitutionen, Additionen oder Deletionen von Aminosäureresten an anderen Positionen als Position 99 aufweisen kann, solange die Aminosäuresequenz die Funktion besitzt, einen Fehler in der homologen Mitochondrienrekombination zu verursachen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes Plasmid, umfassend ein erfindungsgemäßes Gen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptide, die von irgendeinem der vorstehend erwähnten Gene oder den erfindungsgemäßen mutierten Genen codiert werden. Sie betrifft auch Verfahren zur Herstellung der Polypeptide, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle, die irgendeines der Gene oder erfindungsgemäßen mutierten Gene enthält, und Isolierung des Polypeptids aus der Kultur. Die Gene sind gegebenenfalls funktional mit regulatorischen Elementen verbunden, die ihre Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen zulassen. Prokaryontische Wirtszellen sind die Wirtszellen, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden.
Die vorliegende Erfindung wird hier nachstehend im Detail beschrieben.
Für die Clonierung des erfindungsgemäßen Gens wird zuerst das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines mutierten Gens bestimmt, das einen Fehler in der homologen Mitochondrienrekombination verursacht. Anschließend wird in diejenigen Zellen, bei denen man durch den vorstehenden Nachweis herausfand, dass sie ein mutiertes Gen von Interesse besitzen, eine Hefe-Genbank eingeführt, die Wildtypgene enthält, und dann wird das Zielwildtypgen cloniert. Diese Clonierung wird erreicht, indem nach einem Gen, das die Mutation komplementiert, die spezifische, in mutierten Zellen unterschiedliche Eigenschaften betrifft (z.B. Fehler bei der Reparatur von DNA-Schäden, Fehler in der Rekombination oder die Mutation der Temperatursensitivität etc.), gesucht wird. Mit anderen Worten wird die Clonierung erreicht, indem das Wildtypgen, das dem mutierten Gen entspricht, gesucht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner sequenzspezifische Oligonucleotide, die von einem Gen oder mutierten Gen der vorliegenden Erfindung stammen. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „sequenzspezifisch" auf Oligonucleotide, die in einer Hybridisierung spezifisch mit Genen oder mutierten Genen der vorliegenden Erfindung hybridisieren würden. Derartige Oligonucleotide können z.B. als spezifische Sonde oder als spezifische Primer für die sequenzspezifische Amplifikation durch z.B. die Polymerasekettenreaktion oder Ligasekettenreaktion verwendet werden.
Anschließend werden auf der Nucleotidsequenz für das Wildtypgen basierende Primer konstruiert, um das erfindungsgemäße mutierte Gen zu clonieren. Dann erfolgt eine PCR unter Verwendung der genomischen Gesamt-DNA der mutierten Zelle als Matrize. Schließlich wird die Nucleotidsequenz des erhaltenen mutierten Gens bestimmt und ein Mutationsort ermittelt, indem die sich ergebende Sequenz mit der Nucleotidsequenz für das Wildtypgen verglichen wird. Somit kann das erfindungsgemäße Gen cloniert werden.
1. Nachweis eines mutierten Gens
Der Nachweis eines mutierten Gens von Interesse erfolgt durch Fusionieren von zellkernenthaltenden Zellen, die Mitochondrien mit einem spezifischen Markergen (z.B. einem Antibiotikaresistenzgen) enthalten, mit Zellen, deren Zellkern entfernt wurde und die Mitochondrien mit einem sich von dem vorstehenden Markergen unterscheidenden Markergen besitzen, Messung der Häufigkeit der homologen Mitochondrienrekombination, wobei aus den sich ergebenden fusionierten Zellen diejenigen Zellen ausgewählt werden, die rekombinante Mitochondrien enthalten, basierend auf einer individuellen Resistenz gegen ein spezifisches Antibiotikum, das dem Markergen entspricht, und Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Mutation in einem Gen, das an der homologen Mitochondrienrekombination beteiligt ist, anhand einer Abnahme der Häufigkeit. Hier kann das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines mutierten Gens bestimmt werden, ungeachtet dessen, ob das Gen dominant oder rezessiv ist.
Die Verfahren für den Nachweis sind wie folgt und 1 zeigt einen Abriss davon.
In 1 werden zuerst zwei Arten von Zellen hergestellt, die bei der Zellfusion verwendet werden.
Eine wird als Empfängerzelle 1 und die andere als Spenderzelle 2 hergestellt.
Die Empfängerzelle 1 ist die Zelle, die das Ziel für den Nachweis ist und einen Zellkern 5 sowie Mitochondrien 3 in jeder der Zellen besitzt. Im Zellkern 5 liegt irgendeines der folgenden drei Gene vor: ein normales homologes Mitochondrienrekombinationsgen, ein rezessives mutiertes Gen davon oder ein dominantes mutiertes Gen davon. Als Beispiele von Empfängerzellen 1 können Hefezellen oder gezüchtete Tier- oder Pflanzenzellen aufgezählt werden.
Andererseits ist die Spenderzelle 2 die Zelle, die der Empfängerzelle 1 die in ihr enthaltenen Mitochondrien 4 liefert. Der Spenderzelle 2 wurde vorher ein Zellkern 6 durch Behandlung mit einer Chemikalie (z.B. Nocodazol) entfernt. Daher ist sie eine Zelle, deren Zellkern entfernt wurde und die Mitochondrien 4, jedoch nicht den Zellkern 6 enthält. Demzufolge hat es nichts mit der im Zellkern 6 enthaltenen genetischen Information zu tun, ob die Mitochondrien in der Empfängerzelle 1 eine homologe Rekombination durchlaufen oder nicht. Als Spenderzelle 2 kann eine Zelle derselben Organismusart verwendet werden, wie diejenige der Empfängerzelle 1.
Die Herstellung der Zellen, die Passage der Zellen, die Subkultur und dergleichen können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erfolgen.
Die DNA in den Mitochondrien 3 in der Empfängerzelle 1 bzw. die DNA in den Mitochondrien 4 in der Spenderzelle 2 enthalten ein unterschiedliches Markergen. Ein Resistenzgen in den Mitochondrien 3 wird als Markergen (I) und das andere Resistenzgen in den Mitochondrien 4 als Markergen (II) bezeichnet. Diese Markergene werden beim Vorgang der Selektion spezifischer fusionierter Zellen notwendig, wie später beschrieben. Wenn beispielsweise das Markergen (I) das Chloramphenicol-Resistenzgen ist, ist dieses Gen erforderlich, falls die Selektion unter Verwendung von Chloramphenicol erfolgt und wenn ein Markergen (II) das Oligomycinresistenzgen ist, ist dieses Gen erforderlich, falls die Selektion unter Verwendung von Oligomycin erfolgt.
Die Markergene (I) und (II) sind zwei verschiedene Gene und es gibt keine spezifische Einschränkung für ihre Arten. Beispielsweise können das Chloramphenicol-Resistenzgen, das Oligomycin-Resistenzgen oder das Antimycin-Resistenzgen in einer geeigneten Kombination verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung wird zu Erklärungszwecken das Chloramphenicol-Resistenzgen (hier nachstehend als „Chl^R" bezeichnet) als Markergen (I) in den Mitochondrien 3 in der Empfängerzelle 1 und das Oligomycin-Resistenzgen (hier nachstehend als „Oli₁ ^R" bezeichnet) als Markergen (II) in den Mitochondrien 4 in der Spenderzelle 2 als eine Darstellung verwendet.
Anschließend wird die Empfängerzelle 1 mit der Spenderzelle 2 durch ein Zellfusionsverfahren fusioniert. Die Zellfusion kann durch ein herkömmliches Zellfusionsverfahren unter Verwendung von Polyethylenglycol nach der Entfernung der Zellwände beider Zellen mit einer geeigneten Chemikalie (z.B. Lyticase) erfolgen. Herkömmliche Verfahren können ebenfalls zur Regeneration der Zellwände verwendet werden.
Wenn die Zellfusion normal durchgeführt wurde, sind die Mitochondrien 3 und Mitochondrien 4 im Gemisch in der neuen Empfängerzelle (d.h. fusionierte Zelle 7) enthalten. Nach der Zellfusion ist/wird die homologe Mitochondrienrekombination der Mitochondrien-DNA ausschließlich abhängig von/bestimmt von der genetischen Information, die im Zellkern 5 aus der Empfängerzelle 1 enthalten ist. In diesem Stadium ist jedoch noch nicht bekannt, ob das homologe Mitochondrienrekombinationsgen im Zellkern 5 ein normales Gen, eine rezessive Mutante oder eine dominante Mutante ist.
Dann werden ausschließlich diejenigen Zellen mit dem Zellkern 5 selektiert, indem Zellen auf einem Medium gezüchtet werden, dem Canavanin [2-Amino-4-(guanidinoxy)buttersäure] zugesetzt wurde. Für diesen Zweck wurden die Chromosomen von Zellkern 5 so verändert, dass sie ein rezessives mutiertes Canavanin-Resistenzgen wie „can1" enthalten. Folglich werden Zellen mit dem Zellkern 6, die zwangsläufig in den Spenderzellen vermischt werden, oder diploide Zellen, die aufgrund der Fusion mit den Zellen, die den Zellkern 6 besitzen, erzeugt werden, vollständig entfernt. Im Verlauf dieser Kultur beginnen einzelne Zellen damit, entweder die Mitochondrien 3, die Mitochondrien 4 oder rekombinante Mitochondrien 8 allein zu enthalten.
Anschließend werden aus den sich ergebenden fusionierten Zellen diejenigen fusionierten Zellen, die Mitochondrien enthalten, die Oli₁ ^R (das Markergen aus den Empfängerzellen 1) übernehmen, durch Züchtung der Zellen auf einem Medium, dem Olgomycin zugesetzt wurde, selektiert. Dann werden diejenigen Zellen, die rekombinante Mitochondrien enthalten, die Chl^R (das Markergen aus den Spenderzellen 2) übernehmen, durch Züchtung der Zellen auf einem Medium, dem Chloramphenicol zugesetzt wurde, selektiert.
Wenn das homologe Rekombinationsgen im Zellkern 5 ein mutiertes Gen ist, kann dieses Gen bei der homologen Mitochondrienrekombination nicht richtig funktionieren, und aufgrund der Zellfusion und der anschließenden Kultur liegen die Mitochondrien 3 oder die Mitochondrien 4 allein in den fusionierten Zellen 7 vor. Die Zellen, die die Mitochondrien 3 enthalten, und Zellen, die die Mitochondrien 4 enthalten, werden demzufolge durch Oligomycin bzw. Chloramphenicol entfernt, und schließlich werden keine Zellen erhalten, die rekombinante Mitochondrien enthalten.
Andererseits, wenn das homologe Rekombinationsgen im Zellkern 5 ein normales Gen ist, funktioniert dieses Gen bei der homologen DNA-Rekombination der Mitochondrien 3 mit der DNA der Mitochondrien 4 richtig, und folglich werden die Mitochondrien 8 erhalten, bei denen zwei Arten von Mitochondrien, die von der Empfängerzelle 1 und der Spenderzelle 2 stammen, rekombiniert sind (d.h. rekombinante Mitochondrien, die sowohl das Markergen Chl^R als auch Oli₁ ^R in einer Mitochondrien-DNA besitzen). Folglich können nur diejenigen Zellen, die die Mitochondrien 8 enthalten, durch die Selektion mit Oligomycin und Chloramphenicol überleben und werden als sich ergebendes Produkt erhalten.
Wenn schließlich die Zellen, die rekombinante Mitochondrien enthalten, erhalten wurden, kann beurteilt werden, ob der Zellkern 5 in der Empfängerzelle 1 ein normales Gen für die homologe Mitochondrienrekombination enthält. Andererseits, wenn keine Zellen, die rekombinante Mitochondrien enthalten, erhalten wurden, kann beurteilt werden, ob der Zellkern 5 in der Empfängerzelle 1 ein rezessives oder dominantes mutiertes Gen für die Rekombination besitzt.
Die Beurteilung, ob das mutierte Gen ein dominantes Gen oder ein rezessives Gen ist, kann erfolgen, indem die Häufigkeit des Auftretens der Rekombinanten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden, mit der Häufigkeit des Auftretens der Rekombinanten, die durch das herkömmliche Verfahren erhalten werden (ein Verfahren, bei dem die zellkernenthaltenden Spenderzellen mit Empfängerzellen fusioniert werden) verglichen wird. Kurz gesagt werden die mutierten genenthaltenden monoploiden Zellen mit normalen genenthaltenden monoploiden Zellen durch das herkömmliche Verfahren gepaart. Demzufolge wird das mutierte Gen als rezessives mutiertes Gen beurteilt, falls diploide Zellen, die rekombinante Mitochondrien enthalten, mit derselben Häufigkeit aufgetreten sind, wie diejenige, die im Falle der Paarung von normalen genenthaltenden monoploiden Zellen miteinan der beobachtet wurde. Andererseits wird das mutierte Gen als dominantes Gen beurteilt, wenn keine diploiden Zellen aufgetreten sind, die rekombinante Mitochondrien enthalten.
2. Die Clonierung des Gens
Das verursachende Gen, das entweder dominant oder rezessiv ist und das von den vorstehenden Verfahren nachgewiesen wird, wird durch Verfahren der Molekularbiologie cloniert.
Bei der vorliegenden Erfindung wird MHR1, das eine Wildtyp-Hefe-DNA ist, zuerst cloniert, um ein rezessives mutiertes Gen (mhr1) in einem Zellkernchromosom zu erhalten, das die homologe Rekombination der Mitochondrien-DNA hemmt. Dann erfolgt die PCR, wobei als Primer die Basensequenzen der flankierenden Bereiche verwendet werden, die an den offenen Leserahmen des erhaltenen Wildtyp-MHR1-Gens angrenzen, und als Matrize die Gesamt-DNA derjenigen Zellen verwendet wird, die das mutierte Gen von Interesse enthalten. Das mutierte Gen kann durch diese Verfahren cloniert werden.
(1) Herstellung einer Wiltyp-Hefe-DNA-Genbank
Die Extraktion chromosomaler DNA aus den Wildtypzellen, wie durch die vorstehend beschriebenen Verfahren nachgewiesen, kann durch jegliches herkömmliches Verfahren erfolgen.
Anschließend wird die erhaltene chromosomale DNA vollständig mit dem Restriktionsenzym Sau3Al gespalten, so dass man Sau3Al-Fragmente der chromosomalen DNA erhält. Die Sau3Al-Fragmente werden dann der herkömmlichen Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein Gelstück, das ein Fragment mit der gewünschten Kettenlänge enthält, wird ausgeschnitten.
Das DNA-Fragment in dem herausgeschnittenen Gel wird mit Phenol/Chloroform oder dergleichen gereinigt und dann mittels Ethanolpräzipitation oder dergleichen konzentriert, so dass man ein gereinigtes Fragment erhält.
Das gereinigte Sau3Al-Fragment wird in einen geeigneten Vektor an seiner BamHI-Restriktionsstelle eingebaut, so dass eine rekombinante DNA hergestellt wird. Eine DNA-Genbank kann hergestellt werden, indem eine Wirtszelle unter Verwendung dieser rekombinanten DNA transformiert oder transduziert wird.
Als Wirtszelle kann E. coli DH5α oder JM109 verwendet werden.
(2) Extraktion von Plasmid-DNA
Die erhaltene Genbank wird in eine Mutante eingeführt. Das Verfahren zur Transformation von Hefe erfolgt, wie nachstehend beschrieben [N. Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 163].
Mutierte Zellen, die bei 30°C in flüssigem YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Polypepton und 2% Glucose) gezüchtet wurden, werden mit 1 mM Lithiumchlorid in Gegenwart von 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) behandelt. Anschließend wird die Genbank mit Lithiumchlorid in Gegenwart von etwa 75 mg Lachssperma, gelöst in 1 ml TE [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8,0)] und 40% Polyethylenglycol 4000, behandelt und dann in die mutierten Zellen eingeführt.
Die so transformierten mutierten Zellen werden auf Histidin- und Tryptophan-enthaltendes SD-Agarmedium (ein Medium, enthaltend 2% Glucose, 0,67% aminosäurefreien Hefeextrakt und 2% Agar) ausgesät und man erhält wachsende Kolonien. Die erhaltenen Kolonien werden auf einem Glycerin-enthaltenden Agarmedium repliziert und man erhält diejenigen Kolonien, die bei 37°C wachsen.
Die erhaltenen Kolonien werden in flüssigem, Histidin- und Tryptophan-enthaltendem SD-Medium gezüchtet (2% Glucose, 0,67% aminosäurefreier Hefeextrakt), so dass man gezüchtete Zellen erhält. Die erhaltenen Hefezellen werden mit Glaskügelchen aufschlossen und der sich ergebende zellfreie Extrakt wird in E. coli (z.B. DH5α) eingeführt, der dann auf Ampicillin-enthaltendes LB-Agarmedium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 2% Agar, pH 7,2) ausplattiert wird. Durch weiteres Züchten gewachsener Kolonien in flüssigem, Ampicillin-enthaltendem LB-Agarmedium kann Plasmid-DNA extrahiert werden.
(3) Subclonierung der DNA und Bestimmung der Basensequenz davon
Die vorstehend erhaltene Plasmid-DNA wird mit Restriktionsenzymen wie ClaI, BamHI und MluI gespalten, so dass DNA-Fragmente herausgeschnitten werden. Aus diesen Fragmenten werden diejenigen DNA-Fragmente subcloniert, die die Komplemetation für den Fehler in der Rekombination, die Mutation der Temperatursensitivität, den Fehler bei der Reparatur von durch UV-Strahlung verursachten DNA-Schäden und dergleichen der mhr1-Mutante zeigen. Diese Subclonierung erfolgt durch Insertion von jeweils kurzen DNA-Fragmenten in das Plasmid YCp50 und Einführung dieser DNA-Fragmente in mutierte Zellen nach dem Verfahren zur Transformation von Hefe, wie vorstehend beschrieben [(H. Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 163)]. Das kürzeste erhaltene DNA-Fragment wird ferner in das Plasmid pUC118 eingebaut. Dann wird die Basensequenz des Fragments durch ein bekanntes Verfahren (beispielsweise die Didesoxyribonucleotid-Sequenzierung, das Maxam-Gilbert-Verfahren und dergleichen) bestimmt.
Zusätzlich kann die Lokalisierung dieses Gens im Hefechromosom ermittelt werden, indem bei 16 Hefechromosomen eine Southern-Hybridisierung durchgeführt wird, die durch Pulsfeldgelelektrophorese unter Verwendung eines Fragments dieses Gens als Sonde aufgetrennt werden.
(4) Die Clonierung des mhr1-Gens und Bestimmung des Mutationsorts
Das mhr1-Gen in der Mutante wird cloniert und ferner der Mutationsort im Gen ermittelt.
Zuerst wird die genomische Gesamt-DNA aus der mhr1-Mutante hergestellt. Kurz gesagt werden mutierte mhr1-Zellen, die 48 Stunden bei 30°C in flüssigem YPD-Medium gezüchtet wurden, mit Zymolyase-100T (Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan) behandelt, so dass die Zellwände entfernt werden. Dann werden die sich ergebenden Zellen in Gegenwart von 1% SDS (Natriumlaurylsulfat) aufgeschlossen. Aus dem sich ergebenden Extrakt wird die genomische Gesamt-DNA der mhr1-Mutante nach herkömmlichen Verfahren zur DNA-Abtrennung und Reinigung (C. Guthrie und G. R. Fink, Molecular Biology, Academic Press Inc., San Diego, Kalifornien, 1991) hergestellt.
Die PCR wird mit der genomischen Gesamt-DNA durchgeführt, die aus der mhr1-Mutante erhalten wurde. Für diese PCR werden die Basensequenzen für die peripheren Bereiche des offenen Leserahmens des vorstehend beschriebenen clonierten MHR1-Gens als Primer verwendet (Primer können durch chemische Synthese erhalten werden). Diese PCR kann unter Verwendung einer Reaktionslösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, jeweils 0,125 mM dNTP, 1 pMol Primer und 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim), erfolgen.
Anschließend wird das erhaltene mhr1-Gen in pUC118 an der HincII-Schnittstelle eingebaut und die Basensequenz davon wird bestimmt. Das Sequenzierverfahren ist dasselbe, wie vorstehend beschrieben.
1 zeigt einen Abriss des Verfahrens zum Nachweis eines mutierten Gens, das an der homologen Mitochondrienrekombination beteiligt ist:
Empfängerzelle (1); Spenderzelle (2); Mitochondrium (3); Mitochondrium (4); Zellkern (5); Zellkern (6); Fusionierte Zelle (7); rekombinante DNA-enthaltendes Mitochondrium (8)
Die vorliegende Erfindung wird hier nachstehend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele detaillierter beschrieben. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele begrenzt.
Beispiel 1 Nachweis eines mutierten Gens
(1) Herstellung von Spenderzellen
Um Spenderzellen herzustellen, die den Mitochondriengenotyp von ω^–-Oli₁ ^R zeigen („ω^–" bedeutet, es gibt kein ω-Intron in den Mitochondriengenen und „ω⁺" bedeutet, es gibt ω-Introns in den Mitochondriengenen), wurden OP11c-55R5-Zellen (stammend von der Hefe Saccharomyces cerevisiae) in einem 50 ml-Falconröhrchen bei einer Dichte von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml in 10 ml YPGly-Medium suspendiert, dem 15 μg/ml Nocodazol (das den Transfer von Zellkernen hemmt, wenn Tochterzellen neu gebildet werden; vgl. Jacobs, C. W. et al., J. Cell Biol., 107, 1409–1426 (1988); hergestellt von Sigma), enthaltend 1% DMSO, zugegeben wurden.
Nach 20-stündiger Inkubation bei 18°C wurden 4 Röhrchen (enthaltend jeweils etwa 2,2 × 10⁶ Zellen/ml) zentrifugiert (1.400 × g, 5 min bei 4°C) und dann einmal mit 20 ml KPS-Puffer (1,2 M Sorbit, 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5) jeweils pro Röhrchen gewaschen. Dann wurden die Zellen in einem 50 ml-Röhrchen (Falcon) gewonnen. Um Zellen, deren Zellkern entfernt wurde, von den Mutterzellen zu trennen, wurden die gewonnenen Zellen in 10 ml KPS-Puffer resuspendiert und 3 Minuten bei 0°C mit einem Ultraschallgerät (Modell UR-200P, Tommy Seiko) (Intensität 4/11) aufgeschlossen.
Der hier genannte Erfinder bestätigte, dass Zellen, deren Zellkern vollständig entfernt wurde, in der Suspension gebildet worden waren, indem die Zellen nach der DAPI-Färbung mit einem Fluoreszenzmikroskop und einem Phasenkontrastmikroskop untersucht wurden. Die behandelte Suspension wurde zentrifugiert (1.400 × g, 5 min bei 4°C) und das sich ergebende Präzipitat in 200 μl KPS-Puffer resuspendiert. Diese Suspension wurde einer Dichtegradientzentrifugation in einem Glasröhrchen (12,5 mm Durchm. × 105 mm Länge) unter Verwendung von 1 ml 10%, 15%, 20%, 25% und 30% Ficoll 400 (Pharmacia Bioprocess Technology AB) unterzogen. Nachdem die Suspension bei 30°C einer 30-minütigen Gradientzentrifugation bei 150 × g unterzogen wurde, enthielt die 15%-ige Ficoll-Fraktion nach der DAPI-Färbung in etwa 70% der mikroskopischen Beobachtungen Zellen, deren Zellkern entfernt wurde. Demzufolge wurde die 15% Ficoll-Fraktion gewonnen und zweifach mit KPS-Puffer verdünnt. Dann wurde die sich ergebende Lösung 5 Minuten bei 1.400 × g bei 30°C zentrifugiert, so dass Zellen gewonnen wurden. Nachdem die Zellen mit 3 ml KPS-Puffer einmal gewaschen wurden, wurde das Gemisch der Mutterzellen und der Zellen, deren Zellkern entfernt wurde, 5 Minuten bei 1.400 × g bei 30°C zentrifugiert und dann in 1 ml KPS-Puffer resuspendiert.
Die vorstehend beschriebenen OP11c-55R5-Zellen werden als Saccharomyces cerevisiae OP11-55R5 bezeichnet und wurden beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnr. FERM BP-5551 hinterlegt.
(2) Herstellung der Empfängerzellen
IL166-187-Zellen, eine Mutante davon und UV11-Zellen wurden als Empfängerzellen hergestellt. IL166-187-Zellen, die ein Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind, enthalten „MHR1" (ein normales Gen) in ihren Zellkernen und sind Wiltypzellen, die den Mitochondriengenotyp „ω⁺Chl^R" zeigen. FL67-Zellen, die eine Mutante des IL166-187-Zellstammes sind, wurden erhalten, indem eine Mutation in IL166-187-Zellen durch eine Ethylmethansulfonat-Behandlung eingeführt wurde.
FL67-Zellen besitzen das mutierte Gen „mhr1" in ihren Zellkernen und zeigen den Mitochondriengenotyp „ω⁺Chl^R". UV11-Zellen wurden ebenfalls durch Behandlung von IL166-187-Zellen auf ähnlich Weise wie diejenige hergestellt, die bei der Herstellung von FL67-Zellen verwendet wurde.
UV11-Zellen besaßen in ihrem Zellkern ein homologes Mitochondrienrekombinationsgen, von dem nicht bekannt war, ob es normal, eine rezessive Mutante oder eine dominante Mutante war. UV11-Zellen zeigen den Mitochondriengenotyp „ω Chl^R".
IL166-187-Zellen werden als Saccharomyces cerevisiae IL166-187 und FL67-Zellen werden als Saccharomyces cerevisiae FL67 bezeichnet. Die Ersteren und Letzteren wurden beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology unter den Hinterlegungsnr. FERM BP-5552 bzw. FERM BP-5550 hinterlegt.
(3) Zellfusion
Die Suspension von Zellen, deren Zellkern entfernt wurde, und Mutterzellen (d.h. die Spenderzelle, die vorstehend bei (1) hergestellt wurde) und jede der drei Empfängerzellen, die vorstehend bei (2) hergestellt wurden, wurden in einem Verhältnis von 3:1 (3 × 10⁶ Zellen: 1 × 10⁶ Zellen) in 100 μl KPS-Puffer gemischt. Dem sich ergebenden Gemisch wurden 50 Einheiten Lyticase (Boehinger Mannheim GmbH, 10.000 Einheiten/ml) zugegeben und 30 Minuten bei 30°C gehalten, so dass sich Sphäroblasten (Zellen, deren Zellwand entfernt wurde) bildeten. Die Sphäroblasten wurden bei 30°C durch 5-minütige Zentrifugation des Gemisches bei 1.000 × g gewonnen. Die gewonnenen Sphäroblasten wurden zweimal mit 1 ml KPS-Puffer gewaschen, 5 Minuten bei 1.000 × g bei 30°C zentrifugiert und dann gewonnen. Um die Zellfusion unter Verwendung der Sphäroblasten durchzuführen, wurde das Pellet in 250 μl 35%-igem Polyethylenglycol 4000 (gelöst in KPS-Puffer) suspendiert, 15 Minuten bei 30°C gehalten und 5 Minuten bei 1.000 × g bei 30°C zentrifugiert, so dass die Sphäroblasten präzipitierten. Die Sphäroblasten wurden einmal mit 1 ml KPS-Puffer gewaschen und dann in 2 ml SD-Medium suspendiert, dem die erforderlichen Aminosäuren und Canavanin (1,5 μg/ml) zugegeben worden waren (in einem Glasröhrchen mit 12,5 mm Durchm. × 105 mm Länge). Die Suspension wurde bei 30°C unter Verwendung eines Rotationsschüttlers (3 Tage bei 93 UpM) inkubiert. Anschließend wurde die Kultur 100-fach verdünnt und weitere 3 Tage unter denselben Bedingungen inkubiert, wie vorstehend beschrieben. Folglich wurden fusionierte Zellen erhalten, die einen Zellkern enthalten, der aus der Empfängerzelle stammt.
(4) Behandlung mit Antibiotika (Selektion der Zellen)
Anschließend wurden die vorstehend beschriebenen fusionierten Zellen auf YPGly-Platten, enthaltend Oligomycin (3 μg/ml), ausgesät, so dass diejenigen Zellen selektiert wurden, die den Oli₁ ^R-Mitochondrienmarker aus der Spenderzelle erhalten hatten. Die Kolonien, die die Resistenz gegen Oligomycin (Oli₁ ^R) zeigten, wurden auf YPG-Platten, enthaltend Chloramphenicol (4 mg/ml) und Oligomycin, gezüchtet. Der Prozentsatz (%) der Chloramphenicol-resistenten (Chl^R) Kolonien bei Oli₁ ^R-Kolonien wurde als Genkonversionshäufigkeit an Position ω berechnet. Die Genkonversion ist eine Art der genetischen Rekombination.
(5) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. In Tabelle 1 bedeutet die Angabe von Großbuchstaben (z.B. MHR1) in einer Klammer, die unter dem Namen der Empfängerzelle steht, dass das Gen von Interesse im Zellkern dieser Zelle ein normales Gen ist. Die Angabe von Kleinbuchstaben (z.B. mhr1) in einer Klammer, die unter dem Namen einer Empfängerzelle steht, bedeutet, dass das Gen von Interesse im Zellkern dieser Zelle ein mutiertes Gen ist. Was in Klammern angegeben ist, sind Genotypen von Mitochondrien. Die Bedeutungen von ω⁺, ω^–Chl^R und Oli₁ ^R sind dieselben, wie vorstehend beschrieben. (Diese Erklärungen treffen auch auf Tabelle 2 zu).
Tabelle 1
Anhand von Tabelle 1 fand man heraus, dass die IL166-187-Empfängerzellen kein mutiertes Gen von Interesse besitzen, da die Gene in ihren Zellkernen die homologe Mitochondrienrekombination induzierten (98,2% der Rekombinanten wurden erhalten). Andererseits fand man heraus, dass FL67-Zellen ein mutiertes Gen von Interesse besitzen, da die Gene in ihren Zellkernen die homologe Mitochondrienrekombination nicht induzierten (nur 4% der Rekombinanten wurden erhalten). Ferner fand man heraus, dass UV11-Zellen kein mutiertes Gen besitzen, das an der homologen Rekombination beteiligt ist.
Vergleichsbeispiel 1
Es wurde ein Test durchgeführt, um durch das herkömmliche Verfahren, bei dem eine Spenderzelle ohne die Entfernung ihres Zellkerns verwendet wird (d.h. ein Verfahren, bei dem zwei monoploide Zellen mit zwei verschiedenen Paarungstypen (α und a) miteinander gepaart werden), zu bestimmen, ob das in den FL67-Zellen enthaltene mutierte Gen rezessiv oder dominant ist. Die für diesen Test verwendeten Empfänger- und Spenderzellen waren IL166-187 und ihr Derivat, Derivate von FL67 und Derivate von UV11. Alle diese Zellen wurden vom Erfinder durch Behandlung mit Ethylmethansulfonat hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, induziert, wenn eine der beiden monoploiden gepaarten Zellen ein normales Gen von Interesse in seinem Zellkern besitzt (vgl. beispielsweise Nr. 6), dieses normale Gen die homologe Mitochondrienrekombination, ungeachtet dessen, ob ein Gen von Interesse im Zellkern der anderen Zelle eine Mutation aufweist oder nicht. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zum Ergebnis von Nr. 2 in Tabelle 1.
Deshalb wurde das mutierte Gen (mhr1) im Zellkern von FL67-Zellen als rezessives mutiertes Gen befunden, das durch ein entsprechendes normales Gen in der Spenderzelle verdeckt wird und schließlich zulässt, dass eine homologe Mitochondrienrekombination auftritt.
Wie bisher beschrieben, kann sogar ein rezessives mutiertes Gen durch das erfindungsgemäße Nachweisverfahren nachgewiesen werden.
Beispiel 2: Clonierung des MHR1-Gens
Um diejenigen Gene zu erhalten, die die Phänotypen der Mutante FL67 (mhr1) (ein Fehler bei der Reparatur von DNA-Schäden, die durch UV-Strahlung verursacht werden, ein Fehler in der Rekombination und eine Mutation der Temperatursensitivität) bestimmen, wurde die Clonierung des MHR1-Gens durchgeführt, indem man sich auf ein Gen konzentrierte, das die Mutation der Temperatursensitivität komplementiert.
(1) Konstruktion einer Genbank
Unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Wildtyphefezelle IL166-187 (FERM BP-5552) wurde eine Genbank für das MHR1-Gen durch herkömmliche Verfahren konstruiert. Für die Konstruktion wurde YCp50 verwendet, das ein Einzelkopievektor ist.
Anschließend wurde die Hefe-Genbank, die mit YCp5 konstruiert wurde, in die mhr1-FL67-Mutante (FERM BP-5550; METα, ura3, his1, trp1) eingeführt, wie nachstehend beschrieben.
Mutierte Zellen, die bei 30°C in flüssigem YPD-Medium gezüchtet wurden (1% Hefeextrakt, 2% Polypepton und 2% Glucose), wurden mit 1 mM Lithiumchlorid in Gegenwart von 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) behandelt. Anschließend wurde die Genbank mit Lithiumchlorid in Gegenwart von etwa 75 mg Lachssperma, gelöst in 1 ml TE [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8,0)] und 45% Polyethylenglycol 4000, behandelt und dann in die mutierten Zellen eingeführt.
Die so transformierte Mutante wurde auf Histidin- und Tryptophan-enthaltendem SD-Agarmedium (ein Medium, enthaltend 2% Glucose, 0,67% aminosäurefreien Hefeextrakt und 2% Agar) angesetzt und man erhielt wachsende Kolonien. Die erhaltenen Kolonien wurden in einem Glycerin-enthaltenden Agarmedium repliziert und diejenigen Kolonien, die bei 37°C wuchsen, wurden erhalten.
Die erhaltenen Kolonien wurden in flüssigem, Histidin- und Tryptophan-enthaltendem SD-Medium (2% Glucose, 0,67% aminosäurefreier Hefeextrakt) gezüchtet, so dass man gezüchtete Zellen erhielt. Die erhaltenen Hefezellen wurden mit Glaskügelchen aufgeschlossen und der sich ergebende zellfreie Extrakt wurde in E. coli DH5α eingeführt, der dann auf Ampicillin-enthaltendem LB-Agarmedium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 2% Agar, pH 7,2) ausplattiert wurde. Die Plasmid-DNA wurde durch weitere Züchtung gewachsener Kolonien in flüssigem Ampicillin-enthaltendem LB-Medium extrahiert.
Genauer gesagt, wurden die vorstehend beschriebenen transformierten mutierten Zellen auf SD-Agarmedium (2% Glucose, 0,67% aminosäurefreier Hefeextrakt, 2% Agar), enthaltend Histidin (8 mg/20 ml Platte) und Tryptophan (8 mg/20 ml Platte), 5 Tage bei 30°C gezüchtet und wachsende Kolonien wurden auf einem Glycerin-enthaltenden Agarmedium repliziert. Von diesen Kolonien wurde eine Kolonie, die bei 37°C auf dem Glycerin-enthaltenden Agarmedium wachsen kann, ausgewählt, so dass man einen Kandidaten erhält.
Dieser Kandidat (Kolonie) wurde in flüssigem SD-Medium (2% Glucose, 0,67% aminosäurefreier Hefeextrakt), enthaltend 2 ml Histidin (8 mg/20 ml Platte) und Tryptophan (8 mg/20 ml Platte), über Nacht bei 30°C gezüchtet, und dann wurden die Hefezellen mit Glaskügelchen mit einer Größe von 0,5 mm aufgeschlossen.
Der erhaltene zellfreie Extrakt wurde in E. coli DH5α nach dem Verfahren von D. Hanahan [J. Mol. Biol., 166 (1983), 557–580] eingeführt. Die sich ergebenden E. coli-Zellen wurden auf LB-Agarmedium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 2% Agar, pH 7,2), enthaltend Ampicillin (50 μg/ml), ausplattiert.
Nachdem die Zellen einen Tag bei 37°C gezüchtet wurden, wurde eine Kolonie aus den gewachsenen Kolonien ausgewählt und weiter in flüssigem LB-Medium, enthaltend Ampicillin (50 μg/ml), gezüchtet (einen Tag bei 37°C).
Aus diesen Zellen wurde Plasmid-DNA durch das Alkaliverfahren (Nucleic Acid Res., 7, 1513) extrahiert. Ein 9,6 kbp-DNA-Fragment war an der BamHI-Schnittstelle des erhaltenen Plasmids enthalten.
Dieses 9,6 kbp-DNA-Fragment wurde mit Restriktionsenzymen wie ClaI, BamHI und MluI gespalten. Die sich ergebenden DNA-Fragmente wurden weiter subcloniert, bis ein DNA-Fragment von etwa 0,7 kbp erhalten wurde, das eine Komplementation für die Rekombination und Temperatursensitivität der mhr1-Mutante zeigte. Dieses Fragment wurde in pUC118 an der HincII-Schnittstelle eingebaut und die Basensequenz davon wurde mit einem A.L.F.-DNA-Sequenziergerät (Pharmacia) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in SEQ ID NR. 3 dargestellt. Die Basensequenz, die von SEQ ID NR. 3 repräsentiert wird, wurde durch Clonierung eines Gens erhalten, das die Merkmale der Mutation komplementierte und diese Sequenz ist eine Basensequenz für das Wildtypgen von Interesse. In der SEQ ID NR. 3 gab es einen offenen Leserahmen von 459 bp, der vermutlich 153 Aminosäuren codiert. Die Aminosäuresequenz in diesem offenen Leserahmen ist in SEQ ID NR. 1 dargestellt.
Die Southern-Hybridisierung dieses Gens erfolgte auf 16 Hefechromosomen, die durch Pulsfeldgelelektrophorese unter Verwendung eines Fragments dieses Gens als Sonde verwendet wurde. Demzufolge wurde deutlich, dass dieses Gen auf Chromosom XII lokalisiert ist.
In Anbetracht dessen, dass alle Phänotypen, die die Mutante besaß, vom Wildtypgen MHR1 komplementiert wurden, beurteilte der Erfinder, dass dieses Gen wirklich das Gen von Interesse ist.
Beispiel 3: Die Clonierung des mhr1-Gens und die Bestimmung des Mutationsortes
Das mhr1-Gen einer Mutante wurde cloniert und der Mutationsort des Gens wurde ermittelt.
Die genomische Gesamt-DNA wurde aus einer mhr1-Mutante (FL67; FERM BP-5550) durch die nachstehend beschriebenen Verfahren erhalten.
Die Zellwände der mutierten mhr1-Zellen, die 48 Stunden bei 30°C in flüssigem YPD-Medium gezüchtet wurden, wurden mit Zymolyase-100T (Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan) entfernt. Anschließend wurden die Zellen in Gegenwart von 1% SDS (Natriumlaurylsulfat) aufgeschlossen. Aus dem erhaltenen Extrakt wurde DNA durch herkömmliche DNA-Trennungs-/Reinigungverfahren (C. Guthrie und G. R. Fink, Molecular Biology, Academic Press Inc., San Diego, Kalifornien, 1991) getrennt und gereinigt, so dass die genomische Gesamt-DNA der mhr1-Mutante hergestellt wurde.
Eine PCR erfolgte mit 100 ng der erhaltenen genomischen Gesamt-DNA in einer Reaktionslösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, jeweils 0,125 mM dNTP, 1 pMol Primer und 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim). Eine 25-sekündige Inkubation bei 94°C, anschließendes 30-sekündiges Anlagern bei 55°C und 1-minütige Polymerasereaktion bei 68°C machten einen Zyklus aus, und 35 Zyklen wurden durchgeführt.
Danach wurde der Zeitraum der Polymerasereaktion, die bei 68°C durchgeführt wurde, auf 7 Minuten erweitert. Als Primer wurden ein Vorwärtsprimer (SEQ ID NR. 5) und ein Rückwärtsprimer (SEQ ID NR. 6) verwendet.
Das erhaltene mhr1-Gen wurde an der HincII-Schnittstelle in pUC118 eingebaut und die Basensequenz davon wurde bestimmt.
Die Ergebnisse sind in SEQ ID NR. 4 dargestellt.
In SEQ ID NR. 4 fand man eine Mutation (Substitution von G mit A) an Position 296 im offenen Leserahmen, die in SEQ ID NR. 3 (d.h. an Position 421 in der Basensequenz von SEQ ID NR. 3) dargestellt ist. Aufgrund dieser Mutation wird angenommen, dass auf der Proteinebene eine Änderung der Aminosäure an Po sition 99 von Glycin in Asparaginsäure erfolgte. Die so geänderte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR. 2 dargestellt.
Nach der vorliegenden Erfindung werden ein mutiertes Gen, das einen Fehler in der homologen Mitochodrienrekombination induziert, und ein rekombinantes Plasmid, das ein derartiges Gen umfasst, bereitgestellt.
Da das Wildtypgen, das dem erfindungsgemäßen Gen entspricht, für die Stabilisierung und Erhaltung der Mitochondrien-DNA wesentlich ist, die für die Erhaltung der zellrespiratorischen Funktionen bei Eukaryonten unerlässlich ist, ist das erfindungsgemäße Gen nützlich, die Abnahme der respiratorischen Funktionen nachzuweisen, die mit dem Altern der Menschen assoziiert ist, und um einen starken Hefestamm zu züchten, der für die Fermentationsproduktion einsetzbar ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis eines mutierten Gens in einem Kern-Chromosom, welches an der mitochondrialen homologen Rekombination beteiligt ist, umfassend die folgenden Schritte: (a) Fusionierung kernhaltiger, Mitochondrien enthaltender Zellen, die ein Markergen (I) besitzen, mit Mitochondrien enthaltenden Zellen, deren Kern entfernt wurde, welche ein Markergen (II) besitzen, das sich vom Markergen (I) unterscheidet; (b) Auswahl von fusionierten Zellen, welche rekombinante Mitochondrien enthalten, die beide Markergene (I) und (II) besitzen, aus den resultierenden fusionierten Zellen; und (c) Nachweis der Anwesenheit des mutierten Gens aufgrund der Abnahme der Häufigkeit des Auftretens von fusionierten Zellen, welche rekombinante Mitochondrien enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen Hefe-, Tier- oder Pflanzenzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Markergen (I) oder (II) das Chloramphenicol-Resistenzgen, das Oligomycin-Resistenzgen oder das Antimycin-Resistenzgen ist, wobei das Markergen (I) und das Markergen (II) unterschiedliche Gene sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das mutierte Gen ein rezessiv mutiertes Gen ist.
Gen, welches ein Polypeptid codiert, das die in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Gen, umfassend die Nucleotidsequenz wie in SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 gezeigt.
Rekombinantes Plasmid, umfassend ein Gen nach Anspruch 5 oder 6.
Oligonucleotid, welches spezifisch an ein Gen nach Anspruch 5 oder 6 hybridisiert.
Saccharomyces cerevisiae FL67(FERM BP-5550).
Verwendung des Oligonucleotids nach Anspruch 8 zur Diagnose und/oder zur Clonierung eines Gens nach Anspruch 5 oder 6.
Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 1 oder 2 gezeigt.
Wirtszelle, umfassend ein Gen nach Anspruch 5 oder 6 oder ein rekombinantes Plasmid nach Anspruch 7.
Wirtszelle nach Anspruch 12, welche eine prokaryontische Wirtszelle, vorzugsweise E. coli, ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle nach Anspruch 12 oder 13 und die Isolierung des Proteins aus der Kultur.