DE69332879T2 - TECHNETIUM-99-MARKED PEPTIDES FOR VISUALIZATION OF INFLAMMATION - Google Patents
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Abstract
Description
1. Gebiet der Erfindung1. Area of invention
Die vorliegende Erfindung betrifft radiodiagnostische Mittel und Reagenzien zur Herstellung solcher Mittel, sowie Methoden zur Herstellung von radioaktiv markierten radiodiagnostischen Mitteln. Insbesondere betrifft die Erfindung mit Technetium-99m (Tc-99m) markierte Mittel, Verfahren und Kits zur Anfertigung solcher Mittel, und die Verwendung solcher Mittel zur Abbildung von Infektionsherden und Entzündungsherden im Körper eines Säugetiers.The present invention relates to radiodiagnostic agents and reagents for the manufacture of such agents, as well as methods for the production of radio-labeled radiodiagnostic Means. In particular, the invention relates to technetium-99m (Tc-99m) labeled agents, methods and kits for making such agents, and the use of such agents for imaging foci of infection and foci of inflammation in the body of a mammal.
2. Stand der Technik2. State of the technology
Eine Vielzahl verschiedener Radionukleide einschließlich 67Ga, 99mTc (Tc-99m), 111In, 123I, 125I, 169Yb oder 186Re sind als für das Radioimaging geeignet bekannt. Die Empfindlichkeit von Verfahren zur Bilddarstellung, bei denen radioaktiv markierte Peptide zur Anwendung kommen, ist wesentlich höher als bei anderen im Stand der Technik bekannten Verfahren, da durch die spezifische Bindung des radioaktiven Peptids das radioaktive Signal an der Stelle von Interesse, beispielsweise einem Entzündungsherd, konzentriert wird.A variety of different radionucleids including 67 Ga, 99m Tc (Tc-99m), 111 In, 123 I, 125 I, 169 Yb or 186 Re are known to be suitable for radio imaging. The sensitivity of methods for imaging, in which radioactively labeled peptides are used, is significantly higher than in other methods known in the prior art, since the radioactive signal at the point of interest, for example an inflammatory focus, is due to the specific binding of the radioactive peptide. is concentrated.
Es besteht ein klinischer Bedarf, den Ort und/oder das Ausmaß von fokalen bzw. lokalisierten Infektionsherden bestimmen zu können. Bei einer beträchtlichen Anzahl von Fällen können solche Herde (z. B. ein Abszess) durch herkömmliche Diagnosemethoden (wie körperliche Untersuchung, Röntgenbilder, CT und Ultraschall) nicht identifiziert werden. In einigen Fällen kann man auf eine Biopsie zurückgreifen, doch wird dies vorzugsweise vermieden, wenigstens bis zu dem Zeitpunkt, wo es notwendig ist, um das für einen Abszess an einem bekannten Ort verantwortliche Pathogen zu identifizieren. Die Identifikation einer Stelle einer solchen „okkulten" Infektion ist wichtig, da eine schnelle Lokalisierung des Problems für effektive therapeutische Eingriffe kritisch ist.There is a clinical need the location and / or extent of to determine focal or localized foci of infection. at a considerable one Number of cases can such foci (e.g. an abscess) by conventional diagnostic methods (such as physical Examination, x-rays, CT and ultrasound) could not be identified. In some cases to resort to a biopsy, but this is preferably avoided, at least until the time where it is necessary to do that for pathogen responsible for an abscess in a known place identify. The identification of a place of such an "occult" Infection is important because the problem can be localized quickly for effective therapeutic intervention is critical.
Auf dem Gebiet der Nuklearmedizin lassen sich gewisse pathologische Zustände durch die Abbildung der internen Verteilung von verabreichten, radioaktiv markierten Tracer-Verbindungen (d. h. Radiotracern bzw. Radiopharmazeutika), die sich spezifisch am Krankheitsherd ansammeln, lokalisieren, bzw. das Ausmaß solcher Zustände kann bestimmt werden. Ein Abszess kann jedoch durch eines von vielen möglichen Pathogenen verursacht werden, so daß ein für ein bestimmtes Pathogen spezifischer, Radiotracer nur beschränkt einsetzbar wäre. Andererseits sind Infektionen fast ausnahmslos von Entzündungen begleitet, bei denen es sich um eine allgemeine Antwort des Körpers auf eine Gewebsverletzung handelt. Daher kann man erwarten, daß sich ein für Entzündungsherde spezifischer Radiotracer bei der Lokalisierung von durch ein beliebiges Pathogen verursachten Infektionsherden als nützlich erweisen würde.In the field of nuclear medicine certain pathological conditions can be identified by mapping the internal distribution of administered, radioactively labeled tracer compounds (i.e. radiotracers or radiopharmaceuticals) that are specific accumulate at the focus of the disease, localize, or the extent of such conditions can be determined. However, an abscess can be caused by one of many potential Pathogens are caused, so that a specific for a particular pathogen, Radiotracer only limited would be applicable. On the other hand, infections are almost all of inflammation accompanied, which is a general response of the body to is a tissue injury. Therefore one can expect that one for foci of inflammation specific radiotracer in the localization of any Foci of infection caused by pathogen would prove useful.
Eines der mit Entzündungen verbundenen Hauptphänomene ist die Ansammlung von Leukozyten (weißen Blutkörperchen), normalerweise Monozyten und neutrophilen Zellen, am Entzündungsherd. Ein für Leukozyten spezifischer Radiotracer würde sich bei dem Nachweis von Leukozyten, an der Stelle einer lokalisierten Infektion als nützlich erweisen. Bei den gegenwärtig zugelassenen nuklearmedizinischen Verfahren zur Abbildung von Infektionsherden werden entweder mit Indium-111 markierte Leukozyten (111In-WBC) (siehe z. B. Peters, 1992, J. Nucl. Med. 33: 65–67) oder Gallium-67-(67Ga-)Citrat (siehe z. B. Ebright et al., 1982, Arch. Int. Med. 142: 246–254) verwendet.One of the main phenomena associated with inflammation is the accumulation of leukocytes (white blood cells), usually monocytes and neutrophils, on the focus of inflammation. A leukocyte specific radiotracer would prove useful in the detection of leukocytes at the site of a localized infection. The currently approved nuclear medicine methods for imaging foci of infection either use indium-111 labeled leukocytes ( 111 In-WBC) (see, for example, Peters, 1992, J. Nucl. Med. 33: 65-67) or Gallium-67 - ( 67 Ga) citrate (see e.g. Ebright et al., 1982, Arch. Int. Med. 142: 246-254).
Bei der Verwendung von mit 111In markierten weißen Blutkörperchen besteht ein Hauptnachteil darin, daß die Herstellung des Radiotracers die sterile Entnahme von autologem Blut, die sterile Isolierung der Leukozyten aus dem Blut, das sterile Markieren der Leukozyten unter Bedingungen, bei denen die Zellen nicht beschädigt werden (da beschädigte weiße Blutkörperchen bei der Reinjektion durch das reticuloendotheliale System, aufgenommen werden), und die Rückführung (Reinjektion) der (jetzt markierten) Leukozyten in dem Patienten erfordert. Darüberhinaus kann es sein, daß für eine optimale Abbildung eine Wartezeit von 12 bis 48 Stunden zwischen Injektion und Abbildung eingehalten werden muß. Durch Tc-99m markierte Leukozyten lässt sich diese Wartezeit zwar verkürzen (siehe z. B. Vorne et al., 1989, J. Nucl. Med. 30: 1332–1336), es ist jedoch immer noch erforderlich, die Leukozyten außerhalb des Körpers zu markieren. Bei bevorzugten Radiotracern würde es nicht nötig sein, autologe Blutkomponenten zu entnehmen und zu manipulieren.A major disadvantage of using white blood cells labeled with 111 In is that the manufacture of the radiotracer involves the sterile extraction of autologous blood, the sterile isolation of the leukocytes from the blood, the sterile labeling of the leukocytes under conditions in which the cells are not damaged (since damaged white blood cells are taken up by the reticuloendothelial system when re-injected), and the return (re-injection) of the (now labeled) leukocytes in the patient is required. In addition, it may be necessary to wait 12 to 48 hours between injection and imaging for optimal imaging. Although this waiting time can be shortened by Tc-99m-labeled leukocytes (see, for example, Vorne et al., 1989, J. Nucl. Med. 30: 1332-1336), the leukocytes outside the body are still required to mark. With preferred radio tracers, it would not be necessary to remove and manipulate autologous blood components.
67Ga-Citrat lässt sich durch intravenöse Injektion verabreichen. Diese Verbindung ist jedoch nicht für Infektions- bzw. Entzündungsherde spezifisch. Außerdem muß häufig eine Wartezeit von bis zu 72 Stunden zwischen der Injektion des Radiotracers und der Abbildung eingehalten werden. Zusätzlich sind die γ-(gamma)-Emissionsenergien von 6 7Ga für herkömmliche Gammakameras nicht besonders gut geeignet. 67 Ga citrate can be administered by intravenous injection. However, this connection is not specific for foci of infection or inflammation. In addition, a waiting period of up to 72 hours between the injection of the radiotracer and the imaging must often be observed. In addition, the γ- (gamma) emission energies of 6 7 Ga are not particularly suitable for conventional gamma cameras.
Radiomarkierte monoklonale und polyklonale Antikörper gegen menschliche Leukozyten (einschließlich Monozyten, neutrophileh Zellen, Granulozyten und anderen) sind bereits entwickelt worden. Mit Tc-99m markierte monoklonale Antikörper gegen Granulozyten (siehe z. B. Lind et al., 1990, J. Nucl. Med. 31: 417–473) und mit 111In markiertes, nicht spezifisches humanes Immunoglobulin (siehe z. B. LaMuraglia et al., 1989, J.Radiolabeled monoclonal and polyclonal antibodies to human leukocytes (including monocytes, neutrophil cells, granulocytes and others) have been developed. Monoclonal antibodies to granulocytes labeled with Tc-99m (see e.g. Lind et al., 1990, J. Nucl. Med. 31: 417-473) and non-specific human immunoglobulin labeled with 111 In (see e.g. LaMuraglia et al., 1989, J.
Vasc. Surg. 10: 20–28) sind für den Nachweis von Entzündungen als Sekundärreaktion auf eine Infektion getestet worden. Mit 111In markiertes IgG hat die gleichen Nachteile wie mit 111In markierte weiße Blutkörperchen, da jeweils 24–48 Stunden zwischen der Injektion und einer optimalen Abbildung verstreichen müssen. Darüber hinaus sind alle radioaktiv markierten Antikörper schwierig herzustellen und müssen als biologische Produkte langwierige Genehmigungsverfahren der Zulassungsbehörden durchlaufen.Vasc. Surg. 10: 20-28) have been tested for the detection of inflammation as a secondary response to infection. IgG labeled with 111 In has the same disadvantages as white blood cells labeled with 111 In, since 24–48 hours must elapse between the injection and an optimal image. In addition, all radioactively labeled antibodies are difficult to produce and, as biological products, have to go through lengthy approval procedures by the regulatory authorities.
Als routinemäßig verwendete Radiopharmazeutika werden kleine, leicht zu synthetisierende Moleküle bevorzugt. Es besteht ein eindeutiger Bedarf an kleinen synthetischen Molekülen, die einem Patienten direkt injiziert werden können und die Infektions- und Entzündungsherde abbilden, indem sie sich an Stellen lokalisierenden, an denen sich Leukozyten angesammelt haben.As routinely used radiopharmaceuticals small, easy-to-synthesize molecules are preferred. There is one clear need for small synthetic molecules that can be injected directly into a patient and the infection and inflammation map by localizing themselves in places where Have accumulated leukocytes.
Eine Klasse von Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie sich an Leukozyten binden, sind chemotaktische Peptide, die Leukozyten dazu anregen, einen Peptid-Konzentrationsgradienten hinaufzuwandern (siehe Wilkinson, 1988, Meth. Enzymol. 162: 127–132). Diese Verbindungen binden sich mit hoher Affinität an Rezeptoren auf der Oberfläche von Leukozyten. Diese Peptide stammen aus einer Reihe von Quellen einschließlich Komplementfaktoren, Bakterien, Tuftsin, Elastin, Fibrinopeptid B, Fibrinogen Bβ, Blutplättehenfaktor 4 und anderen. Von diesen chemotaktischen Verbindungen abgeleitete kleine synthetische Peptide würden als Radiotracer zur Abbildung von Entzündungsherden in vivo von großem Nutzen sein.A class of connections, of who are known to be bind to leukocytes are chemotactic peptides called leukocytes to stimulate a peptide concentration gradient migrate up (see Wilkinson, 1988, Meth. Enzymol. 162: 127-132). This Compounds bind with high affinity to receptors on the surface of Leukocytes. These peptides come from a number of sources including complement factors, Bacteria, Tuftsin, Elastin, Fibrinopeptide B, Fibrinogen Bβ, platelet factor 4 and others. Derived from these chemotactic compounds small synthetic peptides would be considered Radiotracer for imaging inflammation foci in vivo of great use his.
Radioaktiv markierte Peptide sind aus dem Stand der Technik bekannt.Radioactive labeled peptides are known from the prior art.
Das US-Patent Nr. 4,986,979 betrifft die Verwendung von radioaktiv markierten, chemotaktischen Formylpeptiden zur radioaktiven Markierung von Leukozyten außerhalb des Körpers über ein Photoaffinity-Label.U.S. Patent No. 4,986,979 relates the use of radiolabelled chemotactic formyl peptides for radioactive labeling of leukocytes outside the body via a Photoaffinity label.
EPC 90108734.6 betrifft Konjugate aus chemotaktischen Peptiden und mit 111In markiertem DTPA.EPC 90108734.6 relates to conjugates of chemotactic peptides and 111 In labeled DTPA.
PCT WO90/10463 betrifft die Verwendung von radioaktiv markierten, chemotaktischen Formylpeptiden zur radioaktiven Markierung von Leukozyten außerhalb des Körpers über ein Photoaffinity-Label.PCT WO90 / 10463 relates to the use from radioactively labeled, chemotactic formyl peptides to radioactive Labeling of leukocytes outside of the body over a Photoaffinity label.
Zoghbi et al. offenbaren in J. Nucl. Med. 22: 32 (Abst) von Bakterien abgeleitete, chemotaktische Formylpeptidfaktoren, die an mit 111In markiertes Transferrin gekoppelt sind.Zoghbi et al. disclose in J. Nucl. Med. 22:32 (Abst) Bacterial derived chemotactic formyl peptide factors coupled to transferrin labeled with 111 In.
Jiang et al., 1982, offenbaren in Nuklearmedizin 21: 110–113 ein chemotaktisches, formyliertes Peptid, das mit 125I radioaktiv markiert ist.Jiang et al., 1982, in Nuclear Medicine 21: 110-113 disclose a chemotactic, formylated peptide that is radiolabeled with 125 I.
Fischman et al., 1991, J. Nucl. Med. 32: 482–491 betrifft Konjugate aus chemotaktischem Formylpeptyd und mit 111In markiertem DTPA.Fischman et al., 1991, J. Nucl. Med. 32: 482-491 relates to conjugates of chemotactic formyl peptide and DTPA labeled with 111 In.
Die Verwendung von Chelatoren für die radioaktive Markierung von Polypeptiden sowie Verfahren zur Markierung von Peptiden und Polypeptiden mit Tc-99m sind im Stand der Technik bekannt und in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung mit den Seriennummern 07/653,012, 07/807,062, 07/871,282 und 07/893,981 offenbart, die hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung sind.The use of chelators for radioactive Labeling of polypeptides and method for labeling peptides and Tc-99m polypeptides are known in the art and in the also pending US patent application with serial numbers 07 / 653,012, 07 / 807,062, 07 / 871,282 and 07 / 893,981, which are hereby incorporated by reference of the present application.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNGBRIEF PRESENTATION THE INVENTION
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur szintigraphischen Abbildung zur Verfügung, bei denen es sich um mit Tc-99m radioaktiv markierte Peptidreagenzien handelt. Die erfindungsgemäßen Peptidreagenzien umfassen spezifisch bindende Peptide, die Leukozyten binden, kovalent gebunden an eine einen radioaktiven Tc-99m-Marker bindende Komponente.The present invention provides Means of scintigraphic imaging are available, which are peptide reagents radiolabelled with Tc-99m. The peptide reagents of the invention include specifically binding peptides that bind leukocytes are covalently bound to a component that binds a radioactive Tc-99m marker.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung werden Reagenzien zur Herstellung von szintigraphischen bilderzeugenden Mitteln zur Abbildung von Entzündungsherden im Körper eines Säugetieres, umfassend ein Peptid, das sich an Leukozyten bindet und eine zwischen 3 und 100 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz und eine einen radioaktiven Tc-99m-Marker bindenden Einheit aufweist, bereitgestellt.According to a first aspect of the invention become reagents for making scintigraphic imaging Means for imaging foci of inflammation in the body of a mammal, comprising a peptide that binds to leukocytes and an intermediate 3 and 100 amino acids comprehensive amino acid sequence and has a radioactive Tc-99m marker binding unit.
Die erfindungsgemäßen radioaktiv markierten Peptidreagenzien
umfassen ein spezifisch bindendes Peptid, das sich an Leukozyten
bindet, und eine einen radioaktiven Te-99m-Marker bindenden Einheit
der Formel:
I.
wobei
Cp für
ein geschütztes
Cystein und (aa) für
eine Aminosäure
steht, und wobei die den radioaktiven Macker bindende Einheit kovalent
mit dem spezifisch bindenden Peptid verbunden ist. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform
handelt es sich bei der Aminosäure
um Glycin. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die den radioaktiven
Marker bindende Einheit über
eine oder mehrere Am nosäuren
mit dem spezifischen Peptid verbunden.The radioactively labeled peptide reagents according to the invention comprise a specifically binding peptide which binds to leukocytes and a unit of the formula which binds a radioactive Te-99m marker:
I.
where Cp stands for protected cysteine and (aa) for an amino acid, and wherein the unit that binds the radioactive marker is covalently linked to the specific binding peptide. In a preferred embodiment, the amino acid is glycine. In another preferred embodiment, the unit which binds the radioactive marker is linked to the specific peptide via one or more amino acids.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt
die Erfindung Peptidreagenzien bereit, die eine einen radioaktiven
Tc-99m-Macker bindende Einheit der folgenden Struktur aufweisen:
II.
wobei
A für H,
HOOC, H2NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC
oder R4 steht; B für N, SH, -NHR3,
-N(R3) – (Peptid)
oder R4 steht; Z für H oder R4 steht;
X für H,
SH, -NHR3, – N(R3) – (Peptid)
oder R4 steht; R1,
R2, R3 und R4 unabhängig
voneinander für
H oder niederes geradkettiges oder verzweigtes oder cyclisches Alkyl
stehen; n für
0,1 oder 2 steht; und: (1) wenn B für – NHR3 oder
-N(R3) – (Peptid)
steht, X für
SH und. n für
1 oder 2 steht; (2) wenn X für
-NHR3 oder -N(R3) – (Peptid)
steht, B für
SH und n für
1 oder 2 steht; (3) wenn B für
H oder R4 steht, A für HOOC, H2NOC,
(Peptid)-NHOC oder (-Peptid)-OOC, X für SH und n für 0 oder
1 steht; (4) wenn A für
H oder R4 steht, im Fall, daß B für SH steht,
X für -NHR3 oder -N(R3)-(Peptid)
steht, und, im Fall, daß X
für SH
steht, B für
-NHR3 oder -N(R3)(Peptid)
steht; (5) wenn X für
H oder R9 steht, A für HOOC, H2NOC, (Peptid)-NHOC
oder (Peptid)-OOC und B für
SH steht; (6) wenn Z für
Methyl steht, X für
Methyl, A für
HOOC, H2NOC, (Peptid)-NHOC oder (Peptid)-OOC,
B für SH
und n für
0 steht; und (7) wenn B für
SH und X für
SH steht, n nicht für
0 steht; und wobei die Thioleinheit in reduzierter Form vorliegt.According to a further aspect, the invention provides peptide reagents which have a radioactive Tc-99m marker binding unit of the following structure:
II.
where A is H, HOOC, H 2 NOC, (peptide) -NHOC, (peptide) -OOC or R 4 ; B represents N, SH, -NHR 3 , -N (R 3 ) - (peptide) or R 4 ; Z represents H or R 4 ; X represents H, SH, -NHR 3 , - N (R 3 ) - (peptide) or R 4 ; R 1 , R 2 , R 3 and R 4 independently of one another represent H or lower straight-chain or branched or cyclic alkyl; n represents 0.1 or 2; and: (1) when B is - NHR 3 or -N (R 3 ) - (peptide), X is SH and. n represents 1 or 2; (2) when X is -NHR 3 or -N (R 3 ) - (peptide), B is SH and n is 1 or 2; (3) when B is H or R 4 , A is HOOC, H 2 NOC, (peptide) -NHOC or (-peptide) -OOC, X is SH and n is 0 or 1; (4) when A is H or R 4 , in the case that B is SH, X is -NHR 3 or -N (R 3 ) - (peptide) and, in the case that X is SH, B represents -NHR 3 or -N (R 3 ) (peptide); (5) when X is H or R 9 , A is HOOC, H2NOC, (peptide) -NHOC or (peptide) -OOC and B is SH; (6) when Z is methyl, X is methyl, A is HOOC, H 2 NOC, (peptide) -NHOC or (peptide) -OOC, B is SH and n is 0; and (7) when B is SH and X is SH, n is not 0; and wherein the thiol unit is in a reduced form.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Reagenzien zur Herstellung von szintigraphischen bilderzeugenden Mitteln zur Abbildung von Entzündungsherden im Körper eines Säugetieres bereitgestellt, die ein Peptid umfassen, das sich an Leukozyten bindet und eine zwischen 3 und 100 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz und eine einen radioaktiven Tc-99m-Marker bindende Einheit, die einen elektrochemisch neutralen Tc-99m-Komplex bildet, aufweist.According to another aspect of Invention will be reagents for the production of scintigraphic imaging agents for imaging foci of inflammation in the body of a mammal provided which comprise a peptide attached to leukocytes binds and an amino acid sequence comprising between 3 and 100 amino acids and a radioactive Tc-99m marker binding unit, the forms an electrochemically neutral Tc-99m complex.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt
stellt die vorliegende Erfindung Reagenzien bereit, die Peptide umfassen,
die sich an Leukozyten binden und kovalent mit einer einen radioaktiven
Te-99m-Marker bindenden Einheit der folgenden Struktur: 
oder 
or
Bei noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden Reagenzien zur Herstellung von szintigraphischen
bilderzeugenden Mitteln zur Abbildung von Stellen im Körper eines
Säugetieres
bereitgestellt, die ein spezifisch bindendes Peptid und eine kovalent
mit dem Peptid verbundene, einen radioaktiven Tc-99m-Marker bindende
Bisaminobisthiol-Einheit umfassen. Die einen radioaktiven Tc-99m-Marker
bindende Bisaminobisthiol-Einheit
bei dieser Ausführungsform
der Erfindung hat eine aus der aus den folgenden Formeln bestehenden
Gruppe ausgewählte
Formel: 
VI.
VI.
Die erfindungsgemäßen spezifisch bindenden Peptide können weiterhin mit einer polyvalenten Verbindungseinheit kovalent verbunden sein. Erfindungsgemäße polyvalente Verbindungseinheiten bestehen aus wenigstens 2 identischen Gruppen mit Verbindungsfunktion, die dazu in der Lage sind, kovalent an spezifisch bindende Peptide oder Tc-99m-bindende Einheiten zu binden. Bevorzugte Gruppen mit Verbindungsfunktion sind primäre oder sekundäre Amine, Hydroxylgruppen, Carbonsäuregruppen oder thiolreaktive Gruppen. Bei bevorzugten Ausführungsformen bestehen die polyvalenten Verbindungseinheiten aus Bissuccinimdylmethylether (BSME), 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure (DMAB) und Tris(succinimidylethyl)amin (TSEA).The specifically binding peptides according to the invention can further covalently connected to a polyvalent connection unit his. Polyvalent according to the invention Connection units consist of at least 2 identical groups with connection function that are able to covalently bind specific binding peptides or Tc-99m binding units. Preferred groups with a connection function are primary or secondary Amines, hydroxyl groups, carboxylic acid groups or thiol reactive groups. In preferred embodiments, the polyvalent ones exist Bissuccinimdyl methyl ether (BSME), 4- (2,2-dimethylacetyl) benzoic acid (DMAB) connecting units and tris (succinimidylethyl) amine (TSEA).
Die Erfindung umfaßt Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung, bei denen es sich um Komplexe aus den erfindungsgemäßen Reagenzien und Tc-99m handelt, und Verfahren zur radioaktiven Markierung der erfindunggemäßen Reagenzien mit Tc-99m. Die durch die Erfindung bereitgestellten radioaktiv markieren Komplexe werden gebildet, indem man die erfindungsgemäßen Reagenzien in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit Tc-99m umsetzt. Zu den bevorzugten Reduktionsmitteln gehören das Dithionition, das Zinn-(II)-ion und das Eisen-(II)-ion, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Erfindungsgemäße Komplexe werden weiterhin bei der Markierung der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99m durch Ligandenaustausch eines zuvor reduzierten Tc-99m-Komplexes gebildet.The invention includes means for scintigraphic imaging, which are complexes from the reagents according to the invention and Tc-99m, and methods for radiolabelling the reagents according to the invention with Tc-99m. The radioactive provided by the invention mark complexes are formed by using the reagents of the invention reacted with Tc-99m in the presence of a reducing agent. To the preferred reducing agents include the dithion ion, the tin (II) ion and the iron (II) ion, but this list is not limited to this. Complexes according to the invention are still in the labeling of the reagents according to the invention with Tc-99m by ligand exchange of a previously reduced Tc-99m complex.
Die Erfindung stellt weiterhin Kits zur Herstellung von Mitteln für die szintigraphische Bilddarstellung bereit, bei denen es sich um die mit Tc-99m radioaktiv markierten erfindungsgemäßen, Reagenzien handelt. Die Kits zur Markierung der durch die Erfindung bereitgestellten Reagenzien bestehen aus einem verschlossenen Fläschchen, das eine vorgegebene Menge eines erfindungsgemäßen Reagens und eine für die Markierung des Reagens mit Tc-99m ausreichende Menge an Reduktionsmittel enthält.The invention further provides kits for the production of agents for scintigraphic imaging, which are the reagents according to the invention radiolabelled with Tc-99m. The kits for labeling the reagents provided by the invention consist of a closed his vial, which contains a predetermined amount of a reagent according to the invention and a sufficient amount of reducing agent for labeling the reagent with Tc-99m.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Peptidreagenzien durch chemische in-vitro-Synthese bereit. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide durch Festphasenpeptidsynthese synthetisiert.The present invention provides Process for the preparation of peptide reagents according to the invention chemical in vitro synthesis ready. In a preferred embodiment the peptides are synthesized by solid phase peptide synthesis.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Mitteln zur szintigraphischen Bilddarstellung, bei denen es sich um mit Tc-99m markierte Reagenzien handelt, zur Abbildung von Entzündungsherden im Körper eines Säugetieres, durch die in-vivo-Aufnahme von gammaszintigraphischen Bildern bereit. Bei diesen Verfahren verabreicht man eine diagnostisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen, mit Tc-99m markierten Reagens und weist die durch den am Entzündungsherd im Körper des Säugetiers angereicherten Tc-99m-Marker emittierte Gammastrahlung nach.The present invention provides the use of means for scintigraphic imaging, which are reagents labeled with Tc-99m for Illustration of focus of inflammation in the body of a mammal, through the in vivo recording of gamma scintigraphic images. In these procedures, one administers a diagnostically effective one Amount of the invention, with Tc-99m labeled reagent and points through the at the focus of inflammation in the body of the mammal enriched Tc-99m marker after emitted gamma radiation.
Besondere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden, ausführlicheren Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und den Ansprüchen ersichtlich.Particular preferred embodiments of the present invention are from the following, more detailed Description of certain preferred embodiments and the claims can be seen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENSHORT DESCRIPTION THE DRAWINGS
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien zur Herstellung: von mit Tc-99m radioaktiv markierten Mitteln zur szintigraphischen Bilddarstellung für die Abbildung von Targetstellen im Säugetierkörper bereit. Die Reagenzien umfassen ein spezifisch bindendes Peptid, das sich an Leukozyten bindet und kovalent mit einer "einen radioaktiven Tc-99m-Marker komplexierenden Gruppe verbunden ist.The present invention provides Reagents for the preparation: of radioactively labeled with Tc-99m Means for scintigraphic image display for the imaging of target sites ready in the mammalian body. The reagents comprise a specific binding peptide, which is binds to leukocytes and covalently with a "one radioactive Tc-99m marker complexing group is linked.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung binden sich an Leukozyten, vorzugsweise an Monozyten und neutrophile Zellen und ganz besonders bevorzugt an neutrophile Zellen. Im Rahmen der Erfindung sind unter dem Ausdruck „bindet sich an Leukozyten" zu verstehen, daß die Peptide der vorliegenden Erfindung dazu in der Lage sind, sich an Infektions- bzw. Entzündungsherden im Körper eines Säugetiers anzureichern, wodurch der Nachweis solcher Herde durch Gammaszintigraphie ermöglicht wird.The peptides of the present invention bind to leukocytes, preferably to monocytes and neutrophils Cells and very particularly preferably on neutrophils. As part of of the invention are under the expression "binds to leukocytes" to understand that the Peptides of the present invention are capable of being Foci of infection or inflammation in the body of a mammal enrich, thereby detecting such foci by gamma scintigraphy allows becomes.
Bei den Cp(aa)Cp-enthaltenden Peptiden
ist Cp ein geschütztes
Cystein, wobei die S-Schutzgruppen gleich oder verschieden sind
und beispielsweise aus der folgenden Gruppe ausgewählt (jedoch
nicht darauf beschränkt)
sind:
-CH2-Aryl (Aryl ist Phenyl oder
Alkyl- oder Alkyloxysubstituiertes Phenyl);
CH-(Aryl)2, (Aryl ist Phenyl oder Alkyl- oder Alkyloxysubstituiertes
Phenyl);
C-(Aryl)3, (Aryl ist Phenyl
oder Alkyl- oder Alkyloxysubstituiertes Phenyl);
-CH2-(4-Methoxyphenyl);
-CH-(4-Pyridyl)(phenyl)2;
-C(CH3)3;
-9-Phenylfluorenyl;
-CH2NHCOR (R ist unsubstituiertes oder substituiertes
Alkyl oder Aryl);
-CH2-NHCOOR (R ist
unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CONHR
(R ist unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CH2-S-CH2-Phenyl Die
bevorzugte Schutzgruppe weist die Formel -CH2NHCOR
auf, wobei R für
kurzkettiges Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Phenyl
substituiert mit kurzkettigem Alkyl, Hydroxyl, kurzkettigem Alkoxy,
Carboxy, oder kurzkettigem Alkoxycarbonyl substituiertes Phenyl
steht.In the Cp (aa) Cp-containing peptides, Cp is a protected cysteine, the S protecting groups being the same or different and being selected, for example, from the following group (but not limited to):
-CH 2 aryl (aryl is phenyl or alkyl or alkyloxy substituted phenyl);
CH- (aryl) 2 , (aryl is phenyl or alkyl or alkyloxy substituted phenyl);
C- (aryl) 3 , (aryl is phenyl or alkyl or alkyloxy substituted phenyl);
-CH 2 - (4-methoxyphenyl);
-CH- (4-pyridyl) (phenyl) 2 ;
-C (CH 3 ) 3 ;
-9-phenylfluorenyl;
-CH 2 NHCOR (R is unsubstituted or substituted alkyl or aryl);
-CH 2 -NHCOOR (R is unsubstituted or substituted alkyl or aryl);
-CONHR (R is unsubstituted or substituted alkyl or aryl);
-CH 2 -S-CH 2 -phenyl The preferred protecting group has the formula -CH 2 NHCOR, where R for short-chain alkyl having 1 to 8 carbon atoms, phenyl or phenyl substituted with short-chain alkyl, hydroxyl, short-chain alkoxy, carboxy, or short-chain Alkoxycarbonyl substituted phenyl.
Bei der Markierung mit Tc-99m handelt es sich um einen Vorteil der vorliegenden Erfindung, da dieses Isotop dank seiner nuklearen und radioaktiven Eigenschaften ein ideales Mittel für die szintigraphische Bilddarstellung ist. Das Isotop weist eine Einzelphotonenenergie von 140 keV und eine radioaktive Halbwertszeit von ungefähr 6 Stunden auf und ist leicht über einen 99Mo-999mTc-Generator verfügbar. Andere im Stand der Technik bekannte Radionukleide haben wesentlich längere Halbwertszeiten (beispielsweise 111In mit einer Halbwertszeit von 67,4 Stunden) oder sind toxisch (beispielsweise 125I ).Marks with Tc-99m it is an advantage of the present invention because this isotope an ideal one thanks to its nuclear and radioactive properties Funds for is the scintigraphic image representation. The isotope has one Single photon energy of 140 keV and a radioactive half-life of approximately 6 hours on and is slightly over one99Mo-999mTc generator available. Other radionucleids known in the art have substantial longer Half-lives (for example111In with a half-life of 67.4 hours) or are toxic (e.g.125I ).
Die spezifisch bindenden, peptidhaltigen Ausführungsformen der Erfindung bestehen jeweils aus einer Abfolge von Aminosäuren. Bei den jeweiligen in den erfindungsgemäßen Peptiden enthaltenen Aminosäuren kann es sich um natürliche oder andere L- oder D-Aminosäuren handeln, wobei D-Aminosäuren mit einem tiefgestellten D gekennzeichnet sind. Zu den durch die vorliegende Erfindungen bereitgestellten Reagenzien gehören die folgenden Verbindungen, wobei diese Aufzählung jedoch nicht hierauf beschränkt ist.The specifically binding, peptide-containing embodiments the invention each consist of a sequence of amino acids. at the respective amino acids contained in the peptides according to the invention it is natural or other L or D amino acids act where D-amino acids are marked with a subscript D. To the through the Reagents provided by present inventions include following connections, but this list does not follow limited is.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können in vitro chemisch synthetisiert werden. Im allgemeinen lassen sich die Peptide der vorliegenden Erfindung vorteilhaft in einem Aminosäuresynthesizer darstellen. Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich darstellen, indem man bei der chemischen in-vitro-Synthese unter Anwendung von dem Fachmann gut bekannten Vorschriften die komplexierende Gruppe kovalent mit dem Peptid verbindet. Solche bei der Synthese kovalent mit der komplexierenden Gruppe verbundenen Peptide sind vorteilhaft, da sieh in ihnen spezifische Stellen für eine kovalente Anbindung festlegen lassen.The peptides of the present invention can can be chemically synthesized in vitro. In general, the peptides of the present invention advantageously in an amino acid synthesizer represent. The peptides according to the invention can be represented by chemical in vitro synthesis using rules well known to those skilled in the art complexing group covalently connects to the peptide. Such in the synthesis covalently linked to the complexing group Peptides are advantageous because they see specific sites for a covalent one Have the connection determined.
Die erfindungsgemäßen, den radioaktiven Macker bindenden Einheiten lassen sich während der Peptidsynthese in das target-spezifische Peptid einführen. Bei Ausführungsformen, die Picolinsäure [(Pic); z. B. Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)-] enthalten, kann die den radioaktiven Marker bindende Einheit als letzter (d. h. aminoterminaier) Rest in der Synthese synthetisiert werden. Darüber hinaus kann die picolinsäurehaltige, den, radioaktiven Macker bindende Einheit zweckmäßigerweise kovalent mit der ε-Aminogruppe von Lysin verbunden werden, wodurch man. zum Beispiel αN(Fmoc)-Lys-εN[Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)] erhält, welches in einer beliebigen Position in die Peptidkette eingebaut werden kann. Die Sequenz ist besonders vorteilhaft, da sie auf einfache Weise den Einbau in das targetbindende Peptid ermöglicht.The radioactive maker according to the invention binding units can be in during peptide synthesis introduce the target-specific peptide. In embodiments, picolinic acid [(Pic); z. B. Pic-Gly-Cys (protecting group) -], the can radioactive marker binding unit last (i.e. amino terminate) Rest can be synthesized in synthesis. In addition, the picolinic acid, the radioactive marker binding unit expediently covalently with the ε-amino group of lysine be connected by which one. for example αN (Fmoc) -Lys-εN [Pic-Gly-Cys (protecting group)] gets which is incorporated in any position in the peptide chain can be. The sequence is particularly advantageous because it is simple This enables incorporation into the target-binding peptide.
In ähnlicher Weise läßt sich während der Synthese die picolylamin- (Pica-)haltige, den radioaktiven Macker bindende Einheit [-Cys(Schutzgruppe)-Gly-Pica] darstellen, indem man die Sequenz [-Cys(Schutzgruppe)-Gly-] in den Carboxyterminus der Peptidkette einbaut. Nach der Abspaltung des Peptids vom Harz wird der Carboxyterminus aktiviert und an Picolylamin gekuppelt. Bei diesem Syntheseweg ist es erforderlich, daß reaktive Seitenkettenfunktionalitäten maskiert (geschützt) bleiben und während der Konjugation des Picolylamins nicht reagieren.In a similar way let yourself while the synthesis, the picolylamine (Pica) containing, the radioactive Macker binding unit [-Cys (protecting group) -Gly-Pica] represent by the sequence [-Cys (protecting group) -Gly-] in the carboxy terminus of the peptide chain installs. After cleavage of the peptide from the resin, the carboxy terminus activated and coupled to picolylamine. With this synthetic route is it requires reactive Side chain functionalities masked (protected) stay and during the conjugation of picolylamine do not react.
Beispiele kleiner synthetischer Peptide, die die Pic-Gly-Cys- und Cys-Gly-Pica-Chelatoren enthalten, sind in den Beispielen unten angeführt. Die vorliegende Erfindung stellt den Einbau dieser Chelatoren in praktisch alle beliebigen Peptide bereit, die sich in vivo spezifisch an Leukozyten binden, was ein radioaktiv markiertes Peptid gibt, in dem Tc-99m als neutraler Komplex gehalten wird.Examples of small synthetic peptides, which the Pic-Gly-Cys- and Cys-Gly-Pica chelators are included in the examples below cited. The present invention provides for the installation of these chelators in practically any peptides ready that are specific in vivo bind to leukocytes, which gives a radiolabeled peptide, in which Tc-99m is kept as a neutral complex.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin spezifisch bindende, kleine synthetische Peptide bereit, in die Bisaminbisthiol- (BAT- oder BAM-)Chelatoren eingebaut sind, die mit Tc-99m markiert werden können. Die vorliegende Erfindung stellt den Einbau dieser Chelatoren in praktisch alle beliebigen Peptide bereit, die sich in vivo spezifisch an Leukozyten binden, was ein radioaktiv markiertes Peptid gibt, in dem Tc-99m als neutraler Komplex gehalten wird. Ein Beispiel eines kleinen synthetischen Peptids, das einen BAT-Chelator als eine einen radioaktiven Marker bindende Einheit enthält, ist unten in den Beispielen angeführt.The present invention provides continue to provide specific binding, small synthetic peptides, in which bisaminbisthiol (BAT or BAM) chelators are built, that can be marked with Tc-99m. The present invention provides for the installation of these chelators in practically any peptides ready that are specific in vivo bind to leukocytes, which gives a radiolabeled peptide, in which Tc-99m is kept as a neutral complex. An example a small synthetic peptide called a BAT chelator contains a unit that binds a radioactive marker listed below in the examples.
Die erfindungsgemäßen spezifisch bindenden Peptide können auch kovalent an eine polyvalente Verbindungseinheit gebunden werden. Die von der Erfindung bereitgestellten polyvalenten Verbindungseinheiten bestehen aus wenigstens 2 verbindungsfunktionellen Gruppen, die dazu in der Lage sind, sich kovalent an thrombozytenspezifische Einheiten zu binden, einschließlich geradkettiger und cyclischer Pept de. Zu diesen funktionellen Gruppen gehören primäre und sekundäre Amine, Hydroxylgruppen, Carbonsäuregruppen und thiolreaktive Gruppen, jedoch ist diese Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Polyvalente Verbindungseinheiten bestehen aus vorzugsweise wenigstens 3 funktionellen Gruppen, die dazu in der Lage sind, sich kovalent an thrombozytenspezifische Einheiten zu binden, einschließlich geradkettiger und cyclischer Peptide. Zu den bevorzugten polyvalenten Verbindungseinheiten gehören Am nosäuren wie Lysin, Homolysin, Ornithin, Asparaginsäure und Glutaminsäure; geradkettige und cyclische Amine und Polyamine; Polycarbonsäuren; aktivierte Thiole; und thiolreaktive Reagenzien wie Diund Trimaleimide. Weiterhin sind Ausführungsformen bevorzugt, bei denen. die polyvalenten Verbindungseinheiten aus einer Vielzahl von polyvalenten Verbindungseinheiten bestehen, die unter Bildung einer verzweigten polyvalenten Verbindungseinheit kovalent miteinander verbunden sind. Zu den ganz besonders bevorzugten Verbindungseinheiten gehören Bissuccinimidylmethylether, Tris(succinimidylethyl)amin, 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure (DMBA) und deren Derivate.The specifically binding peptides according to the invention can also be covalently bound to a polyvalent connecting unit. The polyvalent linkage units provided by the invention consist of at least 2 linkage functional groups which are capable of covalently binding to platelet-specific units, including straight-chain and cyclic peptides. These functional groups include primary and secondary amines, hydroxyl groups, carboxylic acid groups and thiol-reactive groups, but this list is not limited to these. Polyvalent linking units preferably consist of at least 3 functional groups that are capable of covalently binding to platelet-specific units, including straight-chain and cyclic peptides. To the be preferred polyvalent connecting units include amino acids such as lysine, homolysin, ornithine, aspartic acid and glutamic acid; straight chain and cyclic amines and polyamines; polycarboxylic acids; activated thiols; and thiol-reactive reagents such as di and trimaleimides. Embodiments are also preferred in which. the polyvalent connection units consist of a multiplicity of polyvalent connection units which are covalently connected to one another to form a branched polyvalent connection unit. The most particularly preferred connecting units include bissuccinimidyl methyl ether, tris (succinimidylethyl) amine, 4- (2,2-dimethylacetyl) benzoic acid (DMBA) and their derivatives.
Bei der Bildung eines Komplexes von radioaktivem Technetium mit den Reagentien der vorliegenden Erfindung wird der Technetiumkomplex, vorzugsweise ein Salz von Tc-99m-Pertechnetat, in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit dem erfindungsgemäßen Reagens umgesetzt. Bevorzugte Reduktionsmittel sind Dithionitionen, Zinn(II)-Ionen und Eisen(II)-Ionen; das am meisten bevorzugte Reduktionsmittel ist Zinn(II)chlorid. Die zur Herstellung solcher Komplexe erforderlichen Mittel werden zweckmäßigerweise in einem Kit zur Verfügung gestellt, das ein verschlossenes Vial umfaßt, das eine vorbestimmte Menge eines zu markierenden, erfindungsgemäßen Reagens und eine zur Markierung des Reagens mit Tc-99m ausreichende Menge an Reduktionsmittel enthält.When forming a complex of radioactive technetium with the reagents of the present invention the technetium complex, preferably a salt of Tc-99m pertechnetate, in the presence of a reducing agent with the reagent according to the invention implemented. Preferred reducing agents are dithion ions, tin (II) ions and iron (II) ions; the most preferred reducing agent is tin (II) chloride. The necessary for the preparation of such complexes Means are expedient available in a kit which includes a sealed vial containing a predetermined amount of a reagent to be labeled and one for labeling of the reagent with Tc-99m contains a sufficient amount of reducing agent.
Alternativ dazu kann man den Komplex auch durch Umsetzung eines erfindungsgemäßen Reagens mit einem zuvor gebildeten, labilen Komplex von Technetium und einer anderen, als Transferligand bezeichneten Verbindung bilden. Dieses Verfahren wird als Ligandenaustausch bezeichnet und ist dem Fachmann wohlbekannt. Der labile Komplex kann zum Beispiel unter Verwendung von Transferliganden wie Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit gebildet werden. Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung brauchbaren Tc-99m-Pertechnetatsalze schließen die Alkalisalze wie z. B. das Natriumsalz, und die Ammoniumsalze und niederen Alkylammoniumsalze ein.Alternatively, you can use the complex also by reacting a reagent according to the invention with a previously formed, unstable complex of technetium and another than Form the designated transfer ligand. This method is referred to as ligand exchange and is well known to those skilled in the art. The labile complex can, for example, use transfer ligands such as tartrate, citrate, gluconate or mannitol. The in Tc-99m pertechnetate salts useful in the present invention conclude the alkali salts such as B. the sodium salt, and the ammonium salts and lower alkyl ammonium salts.
Die Umsetzung der Peptide der vorliegenden Erfindung mit Tc-pertechnetate bzw. dem zuvor gebildeten labilen Tc-99m-Komplex läßt sich in wäßrigem Medium bei Raumtemperatur durchführen. Wird ein an anionischer Komplex mit einer Ladung von [–1] in dem wäßrigen Medium in Form eines Salzes mit einem geeigneten Kation wie einem Natriumkation, Ammoniumkation, niederen Mono-, Di- oder Trialkylaminkation usw. gebildet. Erfindungsgemäß läßt sich ein beliebiges herkömmliches Salz mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Kation verwenden.Implementation of the peptides of the present Invention with Tc-pertechnetate or the previously formed unstable Tc-99m complex can be in aqueous medium perform at room temperature. If an anionic complex with a charge of [-1] in the aqueous medium in the form of a salt with a suitable cation such as a sodium cation, Ammonium cation, lower mono-, di- or trialkylamine cation etc. educated. According to the invention any conventional Use salt with a pharmaceutically acceptable cation.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit zur Darstellung von mit Technetium-99m markierten Peptiden zur Verfügung gestellt. Die erfindungsgemäßen Peptide können unter Anwendung von dem Fachmann wohlbekannten Methoden und Mitteln, die unten beschrieben sind, chemisch synthetisiert werden. Ruf diese Weise hergestellte Peptide umfassen zwischen 3 und 100 Aminosäurereste und sind kovalent mit einer einen radio sotopen komplexfierenden Einheit verbunden, wobei die komplexfierende Gruppe ein Radioisotop bindet. Eine geeignete Menge Peptid wird in ein Vial gegeben, das ein Reduktionsmittel wie z. B. Zinn(II)-Chlorid in einer Menge enthält, die zur Markierung des Peptids mit Tc-99m ausreichend ist. Dabei kann auch eine geeignete Menge eines der beschriebenen Transferliganden (wie z. B. Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit) vorliegen. Erfindungsgemäße, mit Technetium-99m markierte Peptide können durch Zugabe einer geeigneten Menge an Tc-99m oder Tc-99m-Komplex in die Vials und Umsetzung unter den nachfolgend in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen hergestellt werden.In a preferred embodiment The invention is a kit for the representation of with Technetium-99m labeled peptides posed. The peptides according to the invention can using methods and means well known to those skilled in the art, described below can be chemically synthesized. Call this Peptides made in this way comprise between 3 and 100 amino acid residues and are covalent with a radio sotopic complex Unit connected, the complexing group being a radioisotope binds. An appropriate amount of peptide is placed in a vial that a reducing agent such. B. contains tin (II) chloride in an amount that is sufficient to label the peptide with Tc-99m. It can also a suitable amount of one of the transfer ligands described (such as tartrate, citrate, gluconate or mannitol). According to the invention Technetium-99m labeled peptides can be added by adding an appropriate one Amount of Tc-99m or Tc-99m complex in the vials and implementation below the conditions described in Example 2 below become.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten radioaktiv markierten Peptide weisen eine geeignete Menge Radioaktivität auf. Bei der Darstellung von radioaktiven anionischen TC-99m-Komplexen werden im allgemeinen bevorzugt radioaktive Komplexe in Lösungen gebildet, die Radioaktivität in Konzentrationen von ungefähr 0,01 M Millcurie (mCi) bis 100 mCi pro ml enthalten.The by the present invention The radioactively labeled peptides provided have a suitable one Amount of radioactivity on. When displaying radioactive anionic TC-99m complexes radioactive complexes are generally preferably formed in solutions, the radioactivity in concentrations of approximately Contain 0.01 M Millcurie (mCi) to 100 mCi per ml.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten, mit Technetium markierten Peptide können zur Abbildung von Entzündungsherden einschließlich Geschwüren und okkulten Infektionsherden verwendet. werden. Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten, mit Tc-99m markierten Peptide lassen sich auch zum Sichtbarmachen von durch Gewebeischämie verursachten Entzündungsherden, einschließlich Erkrankungen wie Reizkolon und Arthritis, anwenden. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die mit Technetium-99m markierten Pept de bzw. anionischen Komplexe entweder als Komplex oder als Salz mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Kation als injizierbare Einzeldosis verabreicht. Erfindungsgemäß kann man nach der radioaktiven Markierung zur Herstellung der injizierbaren Lösung zur diagnostischen Abbildung verschiedener Organe, Tumore und dergleichen einen beliebigen der dem Fachmann bekannten herkömmlichen Träger wie sterile Kochsalzlösung oder Plasma verwenden. Im allgemeinen weist die zu verabreichende Einzeldosis. eine Radioaktivität von ungefähr 0,01 mCi bis ungefähr 100 mCi, vorzugsweise von 1 mCi bis 20 mCi, auf. Die als Einzeldosis zu injizierende Lösung hat ein Volumen von ungefähr 0,01 ml bis ungefähr 10 ml. Nach der intravenösen Verabreichung kann die Abbildung des Organs bzw. Tumors in vivo innerhalb von wenigen Minuten durchgeführt werden. Falls gewünscht, kann die Abbildung jedoch auch erst nach einigen Stunden oder noch länger nach Injektion des radioaktiv markierten Reagens in den Patienten durchgeführt werden. In den meisten Fällen wird sich eine zur Aufnahme von Szintiphotos ausreichende Menge der verabreichten Dosis innerhalb von ungefähr 0,1 Stunden in der abzubildenden Gegend angereichert haben. Erfindungsgemäß kann man jede herkömmliche Methode zur szintigraphischen Abbildung für diagnostische Zwecke einsetzen.The technetium-labeled peptides provided by the present invention can be used to image foci of inflammation, including ulcers and occult foci of infection. become. The peptides labeled with Tc-99m provided by the present invention can also be used to visualize areas of inflammation caused by tissue ischemia, including diseases such as irritable bowel syndrome and arthritis. According to the present invention, the peptides or anionic complexes labeled with technetium-99m are administered either as a complex or as a salt with a pharmaceutically acceptable cation as an injectable single dose. According to the invention, after the radioactive labeling for producing the injectable solution for the diagnostic imaging of various organs, tumors and the like, any of the conventional carriers known to the person skilled in the art, such as sterile saline or plasma, can be used. In general, the single dose to be administered. radioactivity from about 0.01 mCi to about 100 mCi, preferably from 1 mCi to 20 mCi. The solution to be injected as a single dose has a volume of approximately 0.01 ml to approximately 10 ml. After intravenous administration, the imaging of the organ or tumor can be carried out in vivo within a few minutes. If desired, however, the imaging can only be carried out after a few hours or even longer after the injection of the radiolabelled reagent into the patient. In most cases, a sufficient amount of the dose administered to take scintiphotos will have accumulated in the area to be imaged within approximately 0.1 hours. According to the invention, any one can Use a conventional method for scintigraphic imaging for diagnostic purposes.
Die von der Erfindung bereitgestellten, mit Technetium markierten Peptide und Komplexe können intravenös in einem beliebigen herkömmlichen Medium zur intravenösen Injektion, wie z. B. einem wäßrigen Kochsalzmedium, oder im Blutplasmamedium, verabreicht werden. Ein solches Medium kann weiterhin herkömmliche pharmazeutische Adjuvantien enthalten, wie beispielsweise pharmazeutisch unbedenkliche Salze zum Einstellen des osmotischen Drucks, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen. Zu den bevorzugten Medien gehören normale Kochsalzlösung und Plasma.The provided by the invention Technetium-labeled peptides and complexes can be administered intravenously in one any conventional Medium for intravenous Injection such as B. an aqueous common salt medium, or in the blood plasma medium. Such a medium can continue conventional contain pharmaceutical adjuvants, such as pharmaceutical harmless salts to adjust the osmotic pressure, buffers, Preservatives and the like. The preferred media belong normal saline and plasma.
Die Verfahren zur Herstellung und Markierung dieser Verbindungen sind ausführlicher in den folgenden Beispielen dargestellt. In diesen Beispielen werden gewisse Aspekte des oben beschriebenen Verfahrens und vorteilhafte Ergebnisse erläutert. Diese Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung und stellen keine Einschränkung der Erfindung dar.The manufacturing process and Labeling of these compounds are more detailed in the following examples shown. These examples cover certain aspects of the above described method and advantageous results explained. This Examples are for illustration only and do not limit the Invention.
BEISPIEL 1EXAMPLE 1
Festphasen-PeptidsyntheseSolid phase peptide synthesis
Die Festphasen-Peptidsynthese (FPPS) wurde im 0,25-Millimol(mMol)-Maßstab mit einem Applied Biosystems Model 431A-Peptidsynthesizer durchgeführt, wobei das Amino-Ende mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) geschützt wurde, die Kupplung mit Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol oder 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat/Hydroxybenzotriazol (HBTU/HOBT) durchgeführt wurde und ein p-Hydroxymethylphenoxy-methylpolystyrol(HMP)-Harz für Säuren am Carboxylende bzw. ein Rink-Amidharz für Amide am Carboxyl-Ende eingesetzt wurde. Harzgebundene Produkte wurden routinemäßig mittels 1,5-3 h langer Behandlung mit einer aus Trifluoressigsäure Wasser, Thioanisol, Ethandithiol und Triethylsilan im Verhältnis von 100 : 5 : 5 : 2,5 : 2 bestehenden Lösung bei Raumtemperatur abgespalten. N-α-Formylgruppen wurden gegebenenfalls entweder durch 2stündige Behandlung des freien N-Terminus eines an das Harz gebundenen Peptids mit Ameisensäureanhydrid in Dichlormethan bei 0°C oder durch Behandeln des abgespaltenen, entschützten Peptids mit Essigsäureanhydrid in 98%iger Ameisensäure eingeführt. N-α-Acetylgruppen wurden gegebenenfalls durch 30minütige Behandlung der freien N-terminalen Aminosäure des harzgebundenen Peptids mit 20% (v/v) Essigsäureanhydrid in NMP eingeführt. Die „Pica"-Gruppe wurde gegebenenfallsdurch Konjugieren von Picolylamin mit einer Peptidvorstufe unter Anwendung von Diisopropylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid eingeführt. N-terminale [BAT]-Gruppen wurden gegebenenfalls durch Behandlung der freien N-terminalen Aminogruppen des Peptids mit N6,N9-Bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-N6-(t-butoxycarbonyl)-6,9-diazanonansäure-Nhydroxysuccinimidester eingeführt.Solid phase peptide synthesis (FPPS) was performed on a 0.25 millimole (mmol) scale with an Applied Biosystems Model 431A peptide synthesizer, protecting the amino end with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), coupling with dicyclohexylcarbodiimide / hydroxybenzotriazole or 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate / hydroxybenzotriazole (HBTU / HOBT) and a p-hydroxymethylphenoxy-methylpolystyrene (HMP) resin for acids at the carboxyl end or a Rink amide resin for amides at the carboxyl end was used. Resin-bound products were routinely cleaved at room temperature by treatment for 1.5-3 hours with a solution consisting of trifluoroacetic acid water, thioanisole, ethanedithiol and triethylsilane in a ratio of 100: 5: 5: 2.5: 2. N-α-formyl groups were optionally introduced either by treating the free N-terminus of a peptide bound to the resin with formic anhydride in dichloromethane at 0 ° C. for 2 hours or by treating the cleaved, deprotected peptide with acetic anhydride in 98% formic acid. N-α-acetyl groups were optionally introduced into NMP by treating the free N-terminal amino acid of the resin bound peptide with 20% (v / v) acetic anhydride for 30 minutes. The "pica" group was optionally introduced by conjugating picolylamine to a peptide precursor using diisopropylcarbodiimide and N-hydroxysuccinimide. N-terminal [BAT] groups were optionally introduced by treating the free N-terminal amino groups of the peptide with N 6 , N 9 -Bis (2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl) -N 6 - (t-butoxycarbonyl) -6,9-diazanonanoic acid-nhydroxysuccinimide ester introduced.
BSME-Addukte wurden gegebenenfalls durch Umsetzung von Pept den, die einen einzelnen Thiol enthielten (5 bis 50 mg/ml in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8) mit 0,5 Moläquivalenten BMME (Bismaleimidomethylether), vorgelöst bei Raumtemperatur in Acetonitril, über ungefähr 1 bis 18 Stunden, dargestellt. Die Lösung wurde eingeengt und das Produkt wurde durch HPLC gereinigt.BSME adducts were optionally by reacting peptides containing a single thiol (5 to 50 mg / ml in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8) with 0.5 molar equivalents BMME (bismaleimidomethyl ether), pre-dissolved at room temperature in acetonitrile, for about 1 to 18 hours. The solution was concentrated and the product was purified by HPLC.
Die rohen Peptide wurden durch präparative Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Waters Delta-Pak C18-Säule und Gradientenelution mit 0,1% TFR in Wasser, modifiziert mit Acetonitril, gereinigt. Nach der Elution von der Säule wurde das Acetonitril aus den eluierten Fraktionen abgedampft, und die Fraktionen wurden dann lyophilisiert. Die Identität des jeweiligen Produktes wurde durch Fast Atom Bombardment-Massenspektroskopie (FABMS) oder Elektrospray-Massenspektroskopie (ESMS) bestätigt.The crude peptides were prepared by High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) using a Waters Delta-Pak C18 column and Gradient elution with 0.1% TFR in water, modified with acetonitrile, cleaned. After elution from the column, the acetonitrile became out the eluted fractions evaporated and the fractions were then lyophilized. The identity of each product was determined by fast atom bombardment mass spectroscopy (FABMS) or electrospray mass spectroscopy (ESMS) confirmed.
BEISPIEL 2EXAMPLE 2
Allgemeines Verfahren zur radioaktiven Markierung mit Tc-99mGeneral procedure for radioactive labeling with Tc-99m
0,1 mg eines wie in Beispiel 1 hergestellten Peptids wurden in 0,1 ml 0,05 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) gelöst. Tc-99m-Gluceptät wurde durch Rekonstitution eines Glucoscan-Vials (E.I. DuPont de Nemours, Inc.) mit 1,0 ml Tc-99m-Natriumpertechnetat, enthaltend bis zu 200 mCi, und anschließendes Stehenlassen bei Raumtemperatur für 15 Minuten dargestellt. 25 μl Tc-99m-Gluceptat wurden dann zum Peptid gegeben, und nach 15-bis 30minütiger Reaktion bei Raumtemperatur oder 100°C wurde die Mischung über einen 0,2-μm-Filter filtriert.0.1 mg of one prepared as in Example 1 Peptides were dissolved in 0.1 ml of 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.4). Tc-99m Gluceptät was by reconstitution of a glucoscan vial (E.I. DuPont de Nemours, Inc.) with 1.0 ml Tc-99m sodium pertechnetate containing up to 200 mCi, and subsequent Let stand at room temperature for 15 minutes. 25 µl of Tc-99m gluceptate were added then added to the peptide and after 15 to 30 minutes of reaction at room temperature or 100 ° C the mixture was over a 0.2 μm filter filtered.
Die Reinheit des mit Tc-99m markierten Peptids wurde durch HPLC unter Anwendung einer analytischen Vydak 218TP54- (RP-18, 5 Mikron, 220 × 4,6 mm) oder Waters Delta-Pak- (RP-18, 5 Mikron, 150 × 3,9 mm) Säule und Elution wie in der Fußnote zu Tabelle 1 beschrieben bestimmt. Radioaktive Komponente wurden durch einen radiometrischen in-line-Detektor, der mit einem integrierenden Rekorder verbunden war, nachgewiesen. Unter diesen Bedingungen eluieren Tc-99m-Gluceptat und Tc-99m-Natriumpertechnetat zwischen 1 und 4 Minuten, während das mit Tc-99m markierte Peptid erst sehr viel später eluiert.The purity of the Tc-99m labeled peptide was determined by HPLC using an analytical Vydak 218TP54- (RP-18, 5 micron, 220 × 4.6 mm) or Waters Delta-Pak- (RP-18, 5 micron, 150 × 3.9 mm) column and elution as described in the footnote to Table 1. Radioactive components were detected by an in-line radiometric detector connected to an integrating recorder. Under these conditions, Tc-99m gluceptate and Tc-99m sodium pertechnetate elute between 1 and 4 minutes, while the peptide labeled with Tc-99m elutes much later.
Die folgende Tabelle veranschaulicht
gelungene Tc-99m-Markierungen
von nach Beispiel 1 dargestellten Peptiden unter Verwendung des
hier beschriebenen Verfahrens. Besondere Anwendungen der Methode sind
wie folgt: HPLC-Methoden (in der folgenden Tabelle durch hochgestellte
Zahlen nach Rt angegeben):
Methode
1: Brownlee-Säule
100% A bis 100% B70 in 10 min
Methode
2: Vydak-Säule
100% A bis 100% B90 in 10 min
Methode
3: Vydak-Säule
100% A bis 100% B70 in 10 min
Methode
4: Waters-Säule
100% A bis 100% B90 in 10 min
Methode
5: Waters-Säule
100% A bis 100% B90 in 20 min
wobei:
Lösungsmittel
A = 0,1% CF3COOH/H2O
Lösungsmittel
B70 = 0,1% CF3COOH/70%
CH3CN/H2O
Lösungsmittel
B90 = 0,1% CF3COOH/90%
CH3CN/H2O
Lösungsmittel-Fließgeschwindigkeit
= 1 ml/minThe following table illustrates successful Tc-99m labels of peptides shown in Example 1 using the method described here. Special uses of the method are as follows: HPLC methods (indicated in the following table by superscript numbers after R t ):
Method 1: Brownlee column 100% A to 100% B 70 in 10 min
Method 2: Vydak column 100% A to 100% B 90 in 10 min
Method 3: Vydak column 100% A to 100% B 70 in 10 min
Method 4: Waters column 100% A to 100% B 90 in 10 min
Method 5: Waters column 100% A to 100% B 90 in 20 min
where: Solvent A = 0.1% CF 3 COOH / H 2 O
Solvent B 70 = 0.1% CF 3 COOH / 70% CH 3 CN / H 2 O
Solvent B 90 = 0.1% CF 3 COOH / 90% CH 3 CN / H 2 O
Solvent flow rate = 1 ml / min
Vydak-Säule = 218TP54 RP-18, 5 μ, 220 mm × 4,6 mm
analytische Säule
Brownlee-Säule = Spheri-5,
RP-18, 5 μ,
220 mm × 4,6
mm Säule
Waters-Säule = DeltaPak
RP-18, 5 μ,
150 mm × 3,9
mm analytische Säule
Brownlee column = Spheri-5, RP-18, 5μ, 220mm x 4.6mm column
Waters column = DeltaPak RP-18, 5 μ, 150 mm × 3.9 mm analytical column
BEISPIEL 3EXAMPLE 3
Szintigraphische Bilderzeugung und biologische Verteilung von Tc-99m-markierten PeptidenScintigraphic imaging and biodistribution of Tc-99m labeled peptides
Zum Nachweis der Wirksamkeit der wie oben zur Verfügung gestellten Tc-99m-markierten Peptidreagenzien wurden weiße Neuseelandkaninchen intramuskulär in der linken Wade mit einem wirksamen E. coli-Stamm injiziert. Nach 24 h wurden die Tiere durch i. m. Injektion von Ketamin und Xylazin beruhigt und dann i. v. mit Tc-99mmarkiertem Peptid (≤ 150 μg, 2–10 mCi) injiziert, Die Tiere wurden auf dem Rücken in das Gesichtsfeld einer Gammakamera (LEAP-Kollimator/auf den Photopeak von Tc-99m eingestellt) gelegt und über die erste Stunde nach der Injektion abgebildet, und dann über die nächsten drei Stunden nach der Injektion jeweils in Abständen von, ungefähr 1 h. Zwischen den Bildaufnahmen konnten sich die Tiere erholen und wurden dann gegebenenfalls wieder betäubt.To demonstrate the effectiveness of the as available above Tc-99m labeled peptide reagents became New Zealand white rabbits intramuscularly injected into the left calf with an effective E. coli strain. After 24 hours, the animals were m. Injection of ketamine and Xylazin calms down and then i. v. peptide labeled with Tc-99m (≤ 150 μg, 2-10 mCi) injected, the animals were placed on their backs in the visual field Gamma camera (LEAP collimator / adjusted to the photopeak of Tc-99m) laid and over the mapped first hour after injection, and then over the next three hours after the injection at intervals of approximately 1 hour. Between the pictures, the animals were able to recover and become then anesthetized if necessary.
Nach Aufnahme des letzten Bildes
wurden die Tiere jeweils durch eine Überdosis von Phenobarbital i.v.
getötet
und zur Entnahme von Blutproben und Proben von infiziertem Muskelgewebe
und Kontrollmuskelgewebe seziert. Die Gewebeproben wurden gewogen
und zusammen mit einer standardisierten Menge der injizierten Dosis
in einem Gammazähler
gemessen, und die in den Geweben verbliebene prozentuale injizierte Dosis
(pro Gramm Gewebe) wurde bestimmt. Für jedes Peptid wurden die prozentualen
Verhältnisse
von injizierter Dosis pro Gramm infiziertem Muskelgewebe im Vergleich
zu nicht infiziertem Muskelgewebe und von infiziertem Muskelgewebe
im Vergleich zu Blut berechnet. Diese Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle aufgeführt.
Szntigraphische Photos des gesamten Körpers und Bilder der Läufe eines
mit einem erfindungsgemäßen, mit
Tc-99m markierten Reagens mit der Formel
acetylKKKKKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES
injizierten
Kaninchens sind in
acetylKKKKKC Acm GC Acm GGPLYKKIIKKLLES
injected rabbits are in
Es versteht sich, daß in der vorhergehenden Offenbarung bestimmte spezifische Ausführungsformen der Erfindung hervorgehoben werden, und daß alle entsprechenden Modifikationen bzw. Alternativen dem Sinn der Erfindung entsprechen und in deren Schutzbereich der Erfindung, so wie er in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, fallen.It is to be understood that certain specific embodiments of the invention are emphasized in the foregoing disclosure, and that all corresponding modifications or alternatives are in accordance with the spirit and scope of the invention, as set forth in the appended claims is defined, fall.
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