DE69324596T2

DE69324596T2 - Rekombinante humanisierte anti-cytomegalovirus antikörper

Info

Publication number: DE69324596T2
Application number: DE69324596T
Authority: DE
Inventors: Francis Joseph Carr; Anita Hamilton; William Joseph Harris
Original assignee: SCOTGEN Ltd
Current assignee: SCOTGEN Ltd
Priority date: 1992-10-15
Filing date: 1993-10-15
Publication date: 1999-12-23
Anticipated expiration: 2013-10-16
Also published as: EP0664834A1; GB2286399A; EP0664834B1; JPH08502403A; GB9221654D0; DE69324596D1; WO1994009136A1; AU5283893A; GB9507420D0; CA2146855A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Immunglobuline, die menschliches Zytomegalovirus (HCMV) spezifisch neutralisieren. Diese Immunglobuline wurden durch Kombination der komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) von einem nicht-menschlichen Antikörper mit Gerüstregionen der variablen Region und konstanten Regionen von einem menschlichen Antikörper hergestellt. Die Erfindung offenbart auch Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Immunglobulinen gegen HCMV. Die Erfindung offenbart auch einen Bereich auf dem HCMV-Glycoprotein gH, der ein Ziel für neutralisierende Antikörper ist und bei verschiedenen Isolaten von HCMV aus Patienten hoch konserviert ist.
Das menschliche Zytomegalovirus ist ein DNA-Virus, ein Mitglied der Gruppe der Herpesviren, das in normalen Personen eine ubiquitäre, leichte oder nicht auffallende Erkrankung bewirkt. Das Virus wird nach einer Primärinfektion nicht aus dem Körper eliminiert sondern persistiert in Form einer geringgradigen chronischen Infektion oder verbleibt in einem latenten Stadium, so daß die Reaktivierung in einem späteren Stadium eintreten kann. HCMV kann jedoch bei Personen mit Immunschwäche oder mit unreifem Immunsystem schwere Erkrankungen bewirken, beispielsweise eine, oft letale, Pneumonitis bei Transplantatempfängern, eine das Sehvermögen bedrohende Netzhautentzündung bei AIDS-Patienten oder eine geistige Entwicklungsverzögerung bei Neugeborenen. HCMV kann auch die Plazenta durchdringen und den sich entwickelnden Fötus infizieren. Dabei kann sich ein Syndrom ergeben, das dem durch vererbten Rubella bewirkten ähnelt, insbesondere dann, wenn die Infektion in dem ersten Trimester stattfindet.
Es wurden zwar Laborstämme des Virus entwickelt, aufgrund der Möglichkeit der Latenz und der Reaktivierung des Virus und auch der möglichen Onkogenität von Herpesviren wird jedoch nicht davon ausgegangen, daß diese das Potential als Impfstoff aufweisen. Hyperimmunes Gammaglobulin wurde erfolgreich zur Prophylaxe und der Behandlung von HCMV-Infektionen bei Transplantatpatienten verwendet (D.R. Snydman et al. (1987), N. Engl. J. Med. 317, 1049-1054). Die Versorgung mit aktivem hyperimmunen Globulin ist jedoch begrenzt, die Kosten solcher Präparationen sind sehr hoch und es besteht die Möglichkeit, daß menschliche Pathogene in den Präparationen verbleiben. Es wird davon ausgegangen, daß die Verabreichung eines reinen Antikörpers gegen das Virus sogar günstiger ist, da die Zusammensetzung der Präparation definiert ist, Probleme hinsichtlich der Variabilität zwischen verschiedenen Gammaglobulinzubereitungen vermieden werden und der Gehalt an spezifischem antiviralen Antikörper höher ist. Murine monoklonale Antikörper stellen eine Quelle für spezifische Antikörper dar, die in großen Mengen gereinigt werden können und garantiert frei von einer Kontamination mit menschlichen Pathogenen sind, beispielsweise den Hepatitis- oder HIV-Viren. Murine monoklonale Antikörper wurden zwar bei einigen Therapien am Menschen verwendet, diese sind jedoch aufgrund der Entwicklung einer Immunantwort gegen die "fremden" Mausproteine, die als "HAMA-Reaktion" ("human anti-mouse antibody response") bezeichnet wird, nicht ideal (R. Schroff et al. (1985), Cancer Res., 45, 879-885). Diese HAMA-Reaktion bewirkt in einigen Fällen einen anaphylaktischen Schock und führt zu einer schnellen Clearence der murinen Antikörper aus der Blutbahn. Es konnte gezeigt werden, daß diese Immunantworten im Menschen sowohl gegen die variablen als auch die konstanten Regionen der murinen Immunglobuline gerichtet sind. DNA- Rekombinationstechniken erlauben die Veränderung von Antikörpern, um so spezifische Immunglobulin(Ig)-Regionen einer Spezies gegen Regionen einer anderen auszutauschen. Die PCT-Anmeldung Nr. PCT/GB85/00392 (Neuberger et al. und Celltech Ltd.) beschreibt ein Verfahren, bei dem die komplementären variablen Domänen der schweren und leichten Kette eines Ig-Moleküls von einer Spezies mit den komplementären konstanten Ig-Domänen der schweren und leichten Kette einer anderen Spezies kombiniert werden können. Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, um die murinen Domänen der konstanten Region eines monoklonalen Antikörpers gegen menschliche IgG-Domänen der konstanten Region auszutauschen, um so einen "chimären" Antikörper zu erzeugen, der in der Humantherapie verwendet werden kann. Ein solcher chimärer Antikörper hat den Vorteil, daß er die menschliche Fc-Region für die effiziente Stimulation der Antikörper-vermittelten Effektorfunktionen, beispielsweise Komplementbindung, aufweist, jedoch immer noch das Potential besitzt, eine Immunantwort im Menschen gegen die murinen ("fremden") variablen Regionen auszulösen.
Die britische Patentanmeldung Nr. GB2188638A (Winter) beschreibt ein Verfahren, bei dem Antikörper durch Substitution ihrer komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) gegen solche von anderen Spezies verändert werden. Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, um in Ig-Domänen der schweren und leichten Kette der menschlichen variablen Region CDRs gegen CDRs von den Domänen der variablen Region eines murinen monoklonalen Antikörpers mit wünschenswerten Bindungseigenschaften (beispielsweise gegen ein menschliches Pathogen) zu ersetzen. Diese veränderten variablen Ig-Regionen können dann mit menschlichen konstanten Ig-Regionen kombiniert werden, wobei Antikörper erzeugt werden, die hinsichtlich ihrer Zusammensetzung vollständig menschlich sind bis auf die substituierten murinen CDRs. Solche "umgeformten" oder "humanisierten" Antikörper sollten eine beträchtlich verringerte Immunantwort im Menschen im Vergleich zu chimären Antikörpern auslösen, da sie beträchtlich weniger murine Bestandteile enthalten, und ihre Halbwertszeit in der Blutbahn sollte der von natürlichen menschlichen Antikörpern nahekommen. Es wurde jedoch in der britischen Patentanmeldung Nr. GB2188638A festgestellt, daß der bloße Austausch der CDRs gegen komplementäre CDRs von einem anderen Antikörper, der spezifisch für ein Antigen ist, beispielsweise ein virales oder bakterielles Protein, nicht immer zu einem veränderten Antikörper führt, der die gewünschte Bindungskapazität beibehält. In der Praxis interagieren einige Aminosäuren in der variablen Gerüstregion des Antikörpers mit den Aminosäureresten, die die CDRs bilden, so daß es wahrscheinlich ist, daß Aminosäureaustausche in den den menschlichen Ig-Gerüstregionen zur Wiederherstellung der Antigenbindung erforderlich sind. Die britische Patentanmeldung Nr. 9019812.8 beschreibt ein Verfahren zum Auffinden einer minimalen Anzahl von Substitutionen fremder Reste - entsprechend der effizienten Bindung an das Antigen.
Es wurden monoklonale Antikörper gegen verschiedene HCMV-Glycoproteine entwickelt, die sowohl in der Virushülle als auch in den Membranen infizierter Zellen anzutreffen sind und die wichtige Ziele für das menschliche Immunsystem sind. Von besonderer Bedeutung sind dabei Antikörper gegen ein virales 86 Kilodalton Glycoprotein mit der Bezeichnung gH (M.P. Cranage et al. (1988), Journal of Virology, 62, 1416-1422). Man nimmt an, daß das Glycoprotein gH an der viralen Penetration und dem Ausbreiten von Zelle von Zelle beteiligt ist. Es wurde ein Zelloberflächenrezeptor für dieses Glycoprotein identifiziert (S. Keay et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 10100-10103). Somit wurde das Glycoprotein gH als ein Ziel für neutralisierende Antikörper erkannt, die die Penetration des Virus und die Ausbreitung von Zelle zu Zelle blockieren.
Es besteht ein Bedarf für die Entwicklung neuer Therapien für die Prävention und die Behandlung von HCMV-Infektionen, insbesondere bei Patienten mit Immunschwäche. Ein monoklonaler Antikörper, der für ein neutralisierendes Epitop von HCMV spezifisch ist, würde solch eine neue Therapie bereitstellen. Die vorliegende Erfindung stellt einen für gH von HCMV spezifischen monoklonalen Antikörper bereit, der unter Verwendung der "reshaping"-Technik in einen "menschlichen" Antikörper umgewandelt wurde, um so alle Vorteile hinsichtlich geringer Immunogenität, langer Halbwertszeit und menschlicher Effektorfunktionen menschlicher Antikörper mit der Spezifität und der Möglichkeit, murine monoklonale Antikörper leicht herzustellen und zu reinigen, zu verbinden, wobei dieser Antikörper bei der Behandlung von HCMV-Infektionen verwendet werden kann.
Somit betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einen in Anspruch 16 dargestellten monoklonalen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon. Diese Antikörper und Fragmente können nach dem in Anspruch 1 dargestellten Verfahren hergestellt werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der variablen Region (VH) der schweren Kette von HCMV16. Die CDR-Sequenzen sind eingerahmt. Die ersten acht und die letzten elf Aminosäuren (unterstrichen) entsprechen den Sequenzen der verwendeten Oligonukleotidprimer.
Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der variablen Region (VK) der leichten Kette von HCMV16. Die CDR-Sequenzen sind eingerahmt. Die ersten acht und die letzten sechs Aminosäuren (unterstrichen) entsprechen den Sequenzen der verwendeten Oligonukleotidprimer.
Fig. 3 zeigt den Vektor pSVgpt zur Expression von umgeformten ("reshaped") oder chimären schweren Ketten in Säugerzellen.
Fig. 4 zeigt den Vektor pSHhyg zur Expression von umgeformten oder chimären leichten Ketten in Säugerzellen.
Fig. 5 zeigt die Aminosäuresequenzen der variablen Region von HCMV16VH, 16HuVH, die modifizierten HuVH, 16HuVH ATAF, 16HuVH ATAFSTAY, 16HuVH ATAFFAFSL, 16HuVH ATAFKNE und 16HuEUVH YTR, HCMV16VK und 16HuVK, Die geänderten Gerüstregionreste sind als Kleinbuchstaben gezeigt.
Fig. 6 zeigt die Nukleotidsequenzen der variablen Region von 16HuVH, 16HuVH ATAF, 16HuVH ATAFSTAY, 16HuVH ATAFAFSL, 16HuVH ATAFKNE, 16HuEUVH YTR und 16HuVK.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Der Ausdruck "umgeformter" ("reshaped") Antikörper, so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, bei dem die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) von einem Immunglobulin von einer nicht-menschlichen Spezies stammen und die übrigen Teile des Antikörpermoleküls hauptsächlich von menschlichem Immunglobulin.
Die vorliegende Erfindung betrifft veränderte Antikörper, bei denen zumindest Teile der komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) in den variablen Domänen der leichten und/oder schweren Kette eines menschlichen Akzeptorantikörpers gegen analoge Teile von CDRs von einem oder mehreren monoklonalen Donorantikörpern ausgetauscht wurden, wobei nur eine minimale Veränderung der Gerüstregion der variablen Domäne der schweren und/oder leichten Kette des Akzeptorantikörpers vorliegt, um so die Bindungsspezifität des monoklonalen Donorantikörpers beizubehalten, wobei der monoklonale Donorantikörper Spezifität für das gH-Glycoprotein des menschlichen Zytomegalovirus (HCMV) aufweist. Die Erfindung betrifft auch einen von den veränderten Antikörpern erkannten Bereich auf gH, der bei klinischen Stämmen des Virus hoch konserviert ist. Natürlich ist es möglich, den murinen HCMV16-Antikörper oder die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper zur Identifizierung dieses Bereichs innerhalb von gH zu verwenden, wobei Verfahren zur weiteren Unterteilung oder Modifizierung der gH-Sequenzen und zur Untersuchung der Wirkung dieser weiteren Unterteilungen oder Modifikationen hinsichtlich der Erkennung durch den Antikörper zur Anwendung kommen. Zu solchen Verfahren zählen definierte Aminosäuresubstitutionen und/oder Deletionen und/oder Insertionen in die gH-Sequenz (siehe beispielsweise I. Quadri et al. (1992), J. Gen. Immunol., 73, 2913-2921), die Verwendung einer Peptidsynthese oder Genexpression von Teilsequenzen des gH-Gens in einem geeigneten Wirt zum Erhalt von Sätzen von definierten Peptiden oder Zufallspeptiden, die die gH-Proteinsequenz umfassen (siehe beispielsweise H.M. Geysen et al. (1987), J. Immunol. Methods, 102, 259-274, und J.K. Scott und G.P. Smith (1990), Science, 249, 386-390.
Alternativ oder in Verbindung mit dem vorstehend Beschriebenen ist es möglich, die gH-Gensequenz oder -Proteinsequenz von solchen Viren zu bestimmen, die die Eigenschaft verloren haben, von dem murinen HCMV16-Antikörper oder dem erfindungsgemäßen veränderten Antikörper erkannt zu werden. Mit solchen Sequenzen können gH-Bereiche identifiziert werden, die an dem Epitop beteiligt sind, das von den Antikörpern erkannt wird; siehe beispielsweise P.E. Pellett et al. (1985), J. Virology 53, 243-253.
Vorzugsweise werden die veränderten Antikörper durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die solche Antikörper kodierende DNA-Sequenz und Proteinsequenz. Diese Antikörpergene umfassen DNA, die die menschliche konstante Ig-Region und die variablen Domänen der Gerüstregion sowie eine oder mehrere CDRs anderen Ursprungs kodiert. Darüberhinaus werden Aminosäureaustausche in den menschlichen variablen Gerüstregionen beschrieben, die kritisch für die Affinität hinsichtlich der Antigenbindung sind. Es wird die minimale Anzahl von Substitutionen durchgeführt, so daß eine Einführung von nicht-menschlichen Gerüstregion- Resten in großem Umfang vermieden wird. Die Erfindung stellt auch Vektoren für die Herstellung der veränderten Antikörpern in Säugerzellwirten bereit.
Die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper können durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
(a) Konstruktion eines Expressionsvektors mittels üblicher Verfahren, der ein Operon mit einer DNA-Sequenz enthält, die die schwere Kette eines Antikörpers kodiert, in der die CDRs und solche minimalen Anteile der variablen Domäne der Gerüstregion, die zur Beibehaltung der Bindungsspezifität des Donorantikörpers benötigt werden, von einem nichtmenschlichen Immunglobulin stammen, beispielsweise dem von HCMV16 hergestellten, und die übrigen Teile der Antikörperkette von einem menschlichen Immunglobulin, was zur Herstellung des erfindungsgemässen Vektors führt;
(b) Konstruktion eines Expressionsvektors mittels üblicher Verfahren, der ein Operon mit einer DNA-Sequenz enthält, die eine komplementäre leichte Kette eines Antikörpers kodiert, in der die CDRs und solche minimalen Anteile der Gerüstregion der variablen Domäne, die zur Beibehaltung der Bindungsspezifität des Donorantikörpers erforderlich sind, von einem nicht-menschlichen Immunglobulin stammen, beispielsweise dem von HCMV 16 hergestellten, und die übrigen Teile des Antikörpers von einem menschlichen Immunglobulin, was zur Herstellung des erfindungsgemäßen Vektors führt;
(c) Einschleusung der Expressionsvektoren in eine Wirtszelle mittels üblicher Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transfizierten Wirtszelle;
(d) Züchtung der transfizierten Zelle mittels üblicher Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen veränderten Antikörpers.
Die Wirtszelle kann mit den beiden erfindungsgemäßen Vektoren gleichzeitig transfiziert werden, die Transfektion kann aber auch sequentiell erfolgen, wobei der erste Vektor ein Operon enthält, das ein von einer leichten Kette stammendes Polypeptid kodiert und der zweite Vektor ein Operon, das ein von einer schweren Kette stammendes Polypeptid kodiert. Die beiden Vektoren enthalten unterschiedliche selektierbare Marker, sind jedoch, sieht man von den die schwere und leichte Kette des Antikörpers kodierenden Sequenzen ab, vorzugsweise identisch, um so weit wie möglich die gleiche Expression der Polypeptide der schweren und der leichten Kette zu gewährleisten. In einer alternativen Ausführungsform kann ein einzelner Vektor verwendet werden, wobei der Vektor die Sequenzen enthält, die sowohl die Polypeptide der leichten als auch der schweren Kette kodieren. Die die leichten und schweren Ketten kodierenden Sequenzen können cDNA umfassen, genomische DNA oder beides.
Die zur Expression des erfindungsgemäßen veränderten Antikörpers verwendete Wirtszelle kann entweder eine bakterielle Zelle sein, beispielsweise Escherichia coli, oder vorzugsweise eine eukaryotische Zelle. Zu diesem Zweck kann ins besondere eine Säugerzelle eines gut definierten Typs verwendet werden, beispielsweise eine Myelomzelle oder eine CHO-Zelle.
Bei den allgemeinen Verfahren, mittels denen die erfindungsgemäßen Vektoren konstruiert werden können, bei den zur Herstellung der erfindungsgemäßen Wirtszelle erforderlichen Transfektionsverfahren und den zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers aus solchen Wirtszellen erforderlichen Züchtungsverfahren handelt es sich um übliche Verfahren. Die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper können nach deren Herstellung gleichermaßen entsprechend auf dem Fachgebiet bekannten Standardverfahren gereinigt werden, dazu zählen beispielsweise Kreuzflußfiltration, Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulenchromatographie, Gelelektrophorese etc..
Die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper können ein vollständiges Antikörpermolekül mit schweren und leichten Ketten vollständiger Länge umfassen oder ein beliebiges Fragment davon, beispielsweise das Fab- oder (Fab')&sub2;-Fragment, ein Dimer aus einer leichten Kette oder schweren Kette oder ein beliebiges minimales Fragment davon, beispielsweise ein Fv oder einen "SCA" (Einzelkettenantikörper) oder jedes andere Molekül mit der gleichen Spezifität wie der erfindungsgemäße veränderte Antikörper. In einer alternativen Ausführungsform kann an den erfindungsgemäßen veränderten Antikörper ein Effektor oder ein Reportermolekül angeknüpft sein, beispielsweise ein Toxin wie z. B. Rizin. In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann ein Paar aus einer schweren und leichten Kette des veränderten Antikörpers mit einem Paar aus einer schweren/leichten Kette eines anderen Antikörpers zur Bildung eines "bispezifischen" Antikörpers assoziiert sein. Die konstante Region des veränderten Antikörpers kann von jedem beliebigen menschlichen Immunglobulin-Isotyp stammen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung solcher veränderter Antikörper und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutische, nicht-toxische Menge des veränderten Antikörpers und einen pharmazeutisch verträglichen Träger bzw. Diluens umfaßt. Beispiele für die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper sind umgeformte ("reshaped") Antikörper, die von dem murinen monoklonalen Antikörper HCMV 16 stammen, beispielsweise von dem "reshaped" HCMV16 ATAFSTAY oder dem "reshaped" HCMV16 EuYTR, die in den Beispielen beschrieben sind. Solche Antikörper sind sowohl bei der therapeutischen als auch prophylaktischen Behandlung von HCMV-Infektionen von Nutzen. Somit betrifft diese Erfindung sowohl ein therapeutisches als auch prophylaktisches Behandlungsverfahren einer HCMV-Infektion bei einem Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf, das die Verabreichung einer wirksamen Dosis solcher veränderter Antikörper an diesen Menschen umfaßt.
Die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper können in Verbindung mit anderen Antikörpern verwendet werden, insbesondere menschlichen oder umgeformten Antikörpern, die mit anderen Markern oder Epitopen des HCMV-Virus reaktiv sind. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper in Verbindung mit Mitteln für Chemotherapie, beispielsweise dem antiviralen Wirkstoff Gancyclovir für die Behandlung oder Prävention von HCMV-Infektionen verabreicht werden.
Es sollte darüberhinaus erwähnt werden, daß die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper auch für den Entwurf und die Synthese von Peptidverbindungen oder Nicht-Peptidverbindungen (Nachahmer; "mimetics") verwendet werden können, die für die gleiche Therapie wie der Antikörper von Nutzen sind (H.U. Saragovi et al. (1991), Science 253, 792-795).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Bereitstellung von veränderten Antikörpern mit der Kombination von Eigenschaften für die Behandlung von HCMV-Infektionen beim Menschen. Insbesondere stellt die Erfindung "humanisierte" oder umgeformte ("reshaped") Antikörper bereit, die eine minimale Immunantwort im Menschen auslösen, wobei diese von einem nichtmenschlichen Antikörper stammen, die spezifisch für HCMV sind und für die gezeigt werden konnte, daß sie das Virus neutralisieren.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, stellen jedoch keine Einschränkung dar.

Beispiele

Alle für die folgenden Beispiele benötigten Restriktionsenzyme und Modifikationsenzyme, Plasmide sowie die weiteren Reagenzien und Substanzen waren kommerziell erhältlich, soweit nicht anders angegeben. Soweit nicht anders angegeben, wurden in den folgenden Beispielen alle allgemeinen DNA-Rekombinationsverfahren so durchgeführt, wie sie in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (1982), Hrsg. T. Maniatis et al. (veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben sind.
In den folgenden Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
dCTP Desoxycytidintriphosphat
dATP Desoxyadenosintriphosphat
dGTP Desoxyguanosintriphosphat
dTTP Desoxythymidintriphosphat
DTT Dithiothreitol
C Cytosin
A Adenin
G Guanin
T Thymin
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PBST Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die 0,05% Tween 20 enthält (pH-Wert 7,5).

Beispiel 1: Herstellung eines für HCMV spezifischen veränderten Antikörpers

Die zur Herstellung dieser veränderten Antikörper verwendeten Donor-CDRs stammten von dem murinen monoklonalen Antikörper HCMV16, der für das 86 Kilodalton Glycoprotein gH von HCMV spezifisch ist. Die HCMV16-Hybridomzelllinie wurde von Bioscot Ltd., Edinburgh, U.K., erhalten. Diese wurde durch Immunisierung von Mäusen mit dem partiell gereinigten HCMV-Virusstamm AD 169 und der darauffolgenden Herstellung und dem Screenen von Hybridomzellen erhalten.
Cytoplasmatische RNA wurde aus der HCMV16-Zelllinie mittels des Verfahrens von J. Favoloro et al. (1980), Methods in Enzymology 65, 718-749, hergestellt. cDNA wurde unter Verwendung von Primern für die variable Ig-Region wie folgt synthetisiert: für die variable Ig-Region der schweren Kette (VH) wurde der Primer VH1FOR (5'TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG3') verwendet und für die variable Region der leichten Kette (VK) der Primer VK1FOR (5'GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC3'). Die cDNA-Synthesereaktionen enthielten 10 ug RNA, 20 umol VH1FOR oder VK1FOR, jeweils 250 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 100 mM TrisHCl (pH-Wert 8,3), 140 mM KCl, 10 mM DTT, 10mM MgCl&sub2; und 27 Einheiten RNase-Inhibitor (Pharmacia, Milton Keynes, U.K.) in einem Gesamtvolumen von 50 ul. Die Proben wurden 10 min auf 70ºC erhitzt und dann über einen Zeitraum von 30 min langsam auf 42ºC abgekühlt. 46 Einheiten von "Moloney Murine Leukaemia virus" (MMLV) Reverse Transkriptase (Anglian Biotec, Colchester, U.K.) wurden zugegeben und danach wurde die Inkubation bei 42ºC 1 h lang fortgesetzt.
Danach wurden VH- und VK-cDNAs unter der Verwendung der von R.K. Saiki et al. (1988), Science 139, 487-491, beschriebenen Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die verwendeten Primer waren:
VH1FOR;
VK1FOR;
VH1BACK(5'AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG3')
VK1BACK(5'GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA3'), mit M = C oder A, S = C oder G und W = A oder T. Diese Primer und deren Verwendung bei der PCR-Amplifikation von Maus-Ig-DNA sind in R. Orlandi et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837, beschrieben. Für die PCR-Amplifikation von VH wurden 5 ul RNA/cDNA-Hybride mit 25 umol VH1FOR- und VH1BACK-Primern gemischt. Für die PCR-Amplifikation von VK wurden 5 ul RNA/cDNA-Hybride mit 25 umol VK1FOR- und VK1BACK-Primern gemischt. Zu diesen Gemischen wurden jeweils 200 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 67 mM TrisHCl (pH-Wert 8, 8), 17 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 mM MgCl&sub2;, 0,02% (Gew./Vol.) Gelatine und 2 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin Eimer Ltd., Beaconsfield, U.K.) gegeben. Mit diesen Gemischen wurden dann 25 PCR-Wärmezyklen durchgeführt; 1 min bei 94ºC, 1 min bei 40ºC, 2 min bei 72ºC, wobei zum Abschluß 5 min auf 72ºC erhitzt wurde. Zur Klonierung und Sequenzierung wurde die amplifizierte DNA durch Elektrophorese in einem Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und durch "Elutip-d"-Säulenchromatographie (Schleicher und Schuell, Düsseldorf, Deutschland) gereinigt. Die amplifizierte VH-DNA wurde mit PstI und BstEII geschnitten und in M13mp18 oder M13mp19 kloniert, die mit PstI und SmaI geschnitten waren (Life Technologies, Paisley, U.K.). Die amplifizierte VK-DNA wurde mit PvuII und BgIII geschnitten und in PvuII- und BcII- geschnittenen M13mp18 oder M13mp19 (Life Technologies, Paisley, U.K.) kloniert.
Die erhaltenen Klone wurden unter Verwendung von Sequenase (United States Biochemicals, Cleveland, Ohio, USA) nach dem Didesoxy-Verfahren (F. Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) sequenziert. Die DNA- und Proteinsequenzen der VH- und VK-Domänen von HCMV16 sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt. Die Lokalisation der CDRs wurde unter Bezugnahme auf E.A. Kabat et al. (1987), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office, und unter Verwendung der Computergestützten Ausrichtung gegenüber anderen VH- und VK-Sequenzen bestimmt.
Der Transfer der murinen CDRs in menschliche Gerüstregionen wurde durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese erzielt, die auf dem Verfahren von K. Nakamaye und F. Eckstein (1986), Nucleic Acids Res. 14, 9679-9678, basiert. Folgende Primer wurden verwendet:
VHCDR1 5'CTGTCTCACCCACTGCATTCCAGCAGTGCTGAAGGTGTAGCCAGACAC GGT3'
VHCDR2 5'CATTGTCACTCTTCCCTTGAAGTCTTCTGCATATTTTGGCACTCCAGA GTGGGTGTTTATCCATCCAATCCACTC3'
VHCDR3 5'CCCTTGGCCCCAGACATCGAAGTACCAGCCGTAGTTTCTTGCACAAT AAT3'
VKCDR1 5'CTGCTGGTACCAGTGCATAAAACTCTTGCCATAACTATCAACACTTT CACTGGTTCTACAGGTGATGGTCACTCTG3'
VKCDR2 5'GCTTGCACACCAGATTCTAGGTTGGATGCAAGGTAGATCAGCAG3'
VKCDR3 5'CCCTTGGCCGAACGTCCACGGATCCTCATTATTTTGCTGGCAGTA GTAGGT3'
Die zur Aufnahme der transplantierten CDRs gewählten menschlichen Gerüstregionen waren NEWM und REI für die schwere bzw. leichte Kette. Die Strukturen dieser Proteine wurden kristallographisch aufgelöst. Die Matritzen für die Mutagenese waren Gene für die menschliche Gerüstregion, die irrelevante CDRs enthielten und aus synthetischen DNAs bestanden, die in einen M13-Phagen kloniert waren (L. Riechmann et al. (1988), Nature 332, 323-327). Der Primer für den Transfer von VHCDR1 wurde so erweitert, daß er eine zusätzliche Veränderung an Position 27 beinhaltete. Serin, die an dieser in NEWM gefundenen Position eine ungewöhnliche Aminosäure darstellt (siehe Riechmann et al., (1988), wurde durch Tyrosin ersetzt.
Für die ortsgerichtete Mutagenese wurden die die murinen CDRs kodierenden VH- und VK-Oligonukleotide mit T4-Kinase (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.) phosphoryliert. Ein zweifacher molarer Überschuß von jedem der drei VH- oder VK-Primer wurde zu 5 ug einzelsträngiger VH- oder VK-Matritzen-DNA in M13 (M13VHPCR1 oder M13VKPCR2) gegeben und die Anlagerung wurde durch Erhitzen auf 70ºC für einige Minuten und langsames Abkühlen auf 37ºC durchgeführt. Die zusammengelagerte DNA wurde mit 6 Einheiten "Klenow-Fragment" der DNA-Polymerase I (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.) in einem Reaktionsgemisch verlängert, das 6 Einheiten DNA-Ligase (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.), jeweils 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP und 2'-Desoxycytidin-5'-0-(1- thiotriphosphat) (ThiodCTP) (Pharmacia, Milton Keynes, U.K.), 60 mM TrisHCl (pH-Wert 8,0), 6 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 10 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 50 ul enthielt. Das Gemisch wurde 16 h bei 16ºC inkubiert und danach wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert, erneut gelöst und mit 5 Einheiten Ncil (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.) 90 min geschnitten. Dieses Enzym führt Brüche in den parentalen DNA-Strang ein, läßt jedoch den neu synthetisierten, das ThiodCTP enthaltenden Strang intakt. Der parentale Strang wurde durch Spaltung mit 100 Einheiten Exonuklease III (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.) für einen Zeitraum von 30 min in 50 ul 60 mM TrisHCl (pH-Wert 8,0), 0,66 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT entfernt und im Anschluß daran wurde die DNA mit 3 Einheiten DNA-Polymerase I (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.) und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase in 50 ul 60 mM TrisHCl (pH-Wert 8,0), 6 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 10 mM ATP und jeweils 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP für 180 min bei 16ºC "repariert". Mit dieser DNA wurde E. coli TG1 (Amersham International plc, Amersham, U.K.) transformiert, der mittels dem Verfahren von Simanis (beschrieben von D. Hanahan, (1985), in "DNA Cloning Volume 1", 109-135, D.M. Glover (Hrsg.), IRL Press) kompetent gemacht worden war. Von individuellen Plaques wurde einzelsträngige DNA präpariert und mittels des Didesoxy-Verfahrens (siehe Maniatis et al., (1982), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual") sequenziert. Falls nur Einzelmutanten oder Doppelmutanten erhalten wurden, wurden diese weiteren Mutageneserunden mit den geeigneten Oligonukleotiden solange unterworfen, bis die erforderlichen Dreifach-CDR- Mutanten erhalten wurden, die die umgeformten VH- und VK-Gene bilden. Eine HindIII-Stelle in CDR3 von VK wurde durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des Primers 5'CACGGATCTTCATTATT3' entfernt. Die Aminosäuresequenz wurde nicht verändert.
Die Expressionsvektoren für die umgeformten VH- und VK-Gene (pSVgpt und pSVhyg) sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Das umgeformte VH-Gen wurde zusammen mit dem Promotor für die schwere Immunglobulinkette, geeigneten Splicestellen und Signalpeptidsequenzen aus M13 mit HindIII und BamHI (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.) aus M13 geschnitten und in den Expressionsvektor für die schwere Kette (pSVgpt) kloniert, der den Enhancer für die murine schwere Immunglobinkette enthält, das gpt-Gen unter der Kontrolle des SV40- Promotors/Enhancers zur Selektion in Säugerzellen und Sequenzen für die Replikation und Selektion in E. coli. Eine Domäne der menschlichen konstanten IgG1-Region wurde als BamHI-Fragment zugefügt und die richtige Orientierung ausgewählt. Das umgeformte VK-Gen wurde auf die gleiche Weise in den Expressionsvektor für die leichte Kette (pSVhyg) kloniert, hier ist jedoch das gpt- Gen durch das Gen für Hygromycinresistenz (hyg) ersetzt und eine menschliche konstante Kappa-Region in dem Plasmid enthalten.
Zur Transfektion in Säugerzellen wurden 10 ug DNA des Expressionsvektors für die schwere Kette und 20 ug DNA des Vektors für die leichte Kette mit Pvul (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.) zur Linearisierung geschnitten, im Anschluß daran wurde mit Ethanol präzipitiert und in 25 ul Wasser erneut gelöst. Die Empfängerzelllinie war NSO, ein Immunglobulin nicht-produzierendes Mausmyelom, das von der "European Collection of Animal Cell Cultures", Porton, U.K., ECACC Nr. 85110505 erhalten wurde, oder YB2/0, ein Immunglobulin nicht-produzierendes Rattenmyelom, das von der "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, USA, ATCC Nr. CRL 1662, erhalten worden war. Die Zellen wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium gezüchtet, das mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika supplementiert war (DMEM) (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.). Ungefähr 10&sup7; NSO-Zellen oder YB2/0-Zellen wurden mittels Zentrifugation geerntet und in 0,5 ml DMEM resuspendiert. Die geschnittene DNA wurde zugegeben und die Zellen wurden in eine Küvette transferiert und 5 min auf Eis gestellt. Es wurde ein einzelner Puls von 170 Volt und 960 Ufarad verabreicht (Genepulser, BioRad, Richmond, California, USA). Die Zellen wurden dann weitere 20 min auf Eis gehalten, danach in eine Flasche in 20 ml DMEM gegeben und dort zur Regeneration 48 h gelassen. Dann wurden die Zellen auf Platten mit 24 Vertiefungen in Selektivmedium (DMEM mit 0,8 ug/ml Mycophenolsäure und 250 ug/ml Xanthin) verteilt. Nach 3 bis 4 Tagen wurde das Medium gegen frisches Selektivmedium ausgetauscht, so daß tote Zellen entfernt wurden. Kolonien transfizierter Zellen waren nach 10 bis 14 Tagen sichtbar.
Die Produktion von menschlichen Antikörpern in den Vertiefungen mit den transfizierten Klonen wurde mittels ELISA gemessen. Der "Einfang"-Antikörper, gammakettenspezifisches Ziege-anti-Mensch-IgG (Sera-Lab Ltd., Crawley Down, U.K.) wurde auf 5 ug/ml in 50 mM Carbonat-Puffer (pH-Wert 9,6) verdünnt und zur Beschichtung von Polystyrol-ELISA-Platten (Dynatech Immulon 1) (200 ul pro Vertiefung) über Nacht bei 4ºC verwendet. Nach dreimaligem Waschen mit PBST, 50-100 A wurden 25 ul des zu screenenden Kulturmediums zu den Vertiefungen gegeben und 60 min bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden erneut mit PBST gewaschen, pro Vertiefung wurde der "Reporter"-Antikörper (Peroxidase-konjugiertes, gammakettenspezifisches Ziegen-anti-Mensch-IgG; Sera Lab Ltd., Crawley Down, U.K., oder Peroxidase-konjugierte Ziege-anti- Mensch-Kappakette; Sera Lab Ltd., Crawley Down, U.K.) zu einer Konzentration von 100 ng gegeben und die Platte wurde weitere 16 min inkubiert. Die Platte wurde wie vorstehend beschrieben gewaschen, worauf die Farbe entwickelt wurde. Substratpuffer wurde durch Mischen von 100 mM Zitronensäure mit 100 mM Dinatriumhydrogenphosphat zu einem pH-Wert von 5,0 hergestellt. 25 mg o-Phenylendiamin wurden in 50 ml gelöst und kurz vor der Verwendung wurden dazu 5 ul 30% Wasserstoffperoxid gegeben. 200 ul wurden auf jede Vertiefung verteilt und im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 12,5% Schwefelsäure (50 ul pro Vertiefung) gestoppt und die Absorptionen wurden bei 492 nm abgelesen.
Positive Zellklone wurden zur Antikörperreinigung weitergezüchtet. Zur Reinigung in kleinem Maßstab wurden 500 ml konditioniertes Medium von statischen Flaschen oder Spinner-Kulturen durch Zentrifugation geerntet. Dazu wurden 0,1 Volumina 1,0 M TrisHCl (pH-Wert 8,0) und 0,5 bis 1,0 ml Protein A-Agarose (Boehringer Mannheim, Lewes, U.K.) gegeben. Das Ganze wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und danach über eine Einmalsäule gewonnen. Diese wurde mit 10 Säulenvolumina 0,1 M TrisHCl (pH-Wert 8,0) und 10 Säulenvolumina 0,01 M TrisHCl (pH-Wert 8,0) gewaschen und mit 0,1 M Glycinpuffer (pH- Wert 3,0) eluiert. Fraktionen von jeweils 1,0 ml wurden in Röhrchen mit 100 ul 1,0 M TrisHCl (pH-Wert 8,0) gesammelt. Antikörper-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und gegen PBS dialysiert. Die Konzentration der Antikörperpräparationen wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt. Die Proben wurden mittels eines Laufs auf 10% SDS/Polyacrylamid-Gelen überprüft.
Zur Verbesserung der Affinität des umgeformten Antikörpers 16HuVH/HuVK wurde das in dem britischen Patent Nr. 9019812.8 beschriebene Verfahren übernommen. Der chimäre Antikörper HCMV16, bei dem die Domänen der konstanten Region der schweren und leichten murinen Ketten durch die in dem umgeformten Antikörper verwendeten menschlichen konstanten Regionen ausgetauscht worden waren, wurde wie in Orlandi et al., (1989), beschrieben, konstruiert. Die HindIII-Stelle in CDR3 der VK wurde durch ortsgerichtete Mutagenese wie vorstehend beschrieben entfernt. Zwei hybride chimäre/umgeformte Antikörper wurden konstruiert, die aus der chimären schweren Kette mit der umgeformten leichten Kette und der umgeformten schweren Kette mit der chimären leichten Kette bestanden. Der erste dieser beiden Antikörper zeigte Bindung und Neutralisierung von HCMV mit einer Wirksamkeit, die der des chimären Antikörpers oder ursprünglichen murinen Antikörpers äquivalent war. Deshalb wurde die Aufmerksamkeit hinsichtlich der Verbesserung der Affinität des umgeformten Antikörpers auf die umgeformte schwere Kette gerichtet.
Es wurden neue Versionen der umgeformten schweren Kette (16HuVH) entworfen. Die Aminosäuresequenzen dieser VH-Domänen und der ursprünglichen murinen HCMV VH sind in Fig. 5 gezeigt. Die erste Version (16HuVH ATAF) hatte vier Änderungen: Valin zu Alanin an Position 24, Serin zu Threonin an Position 30, Lysin zu Alanin an Position 75 und Tyrosin zu Phenylalanin an Position 91 (Nummerierung entsprechend Kabat et al., a.a.O.). Drei Versionen hatten noch zusätzliche Substitutionen: bei 16HuVH ATAFSTAY wurden Asparagin, Glutamin, Phenylalanin und Serin an den Positionen 76 bis 79 durch Serin, Threonin, Alanin und Tyrosin ersetzt; bei 16HuVH ATAFFAFSL wurden Valin, Threonin, Methionin, Leucin und Valin an den Positionen 67 bis 71 durch Phenylalanin, Alanin, Phenylalanin, Serin und Leucin ersetzt; bei 16HuVH ATAFKNE wurden Threonin, Alanin und Alanin an den Positionen 83 bis 85 durch Lysin, Asparagin und Glutaminsäure ersetzt. Schließlich wurde eine auf der menschlichen schweren Kette EU basierende Version konstruiert. EU VH gehört zu der Untergruppe 1 der menschlichen schweren Kette (Kabat et al., a.a.O.) und weist eine größere Homologie zu der murinen HCMV16 VH auf als NEWM. Zusätzlich zu der Aufnahme der HCMV16-CDRs anstelle der EU-CDRs wurden drei einzelne Aminosäurereste verändert: Glycin zu Tyrosin an der Position 27, Serin zu Threonin an der Position 30 und Glycin zu Arginin an der Position 94. Dadurch entsprachen die Reste unmittelbar vor CDR1 und CDR3 denen in der murinen VH. Die Gerüstregion 4 wurde wie in der NEWM-Gerüstregion gelassen, da die für EU angegebene Sequenz ziemlich ungewöhnlich ist.
Diese neuen Versionen wurden durch Mutagenese der ursprünglichen umgeformten schweren Kette in M13-Phagen konstruiert. Es wurde das Verfahren von R. Higuchi et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 7351-7367 angewandt, wobei überlappende PCR-Amplifikationen mit mutagenen Primern verwendet werden. Folgende Primer wurden zur Konstruktion von 16HuVH ATAF verwendet: für die Änderung des Rests 24 von Valin zu Alanin und des Rests 30 von Serin zu Threonin 5'TCTGGCTACACCTTCACCACTGCTGGAATG3' und 5'GAAGGTGTAGCCAGACGCGGTGCAGGTCAG3'; für die Änderung an Rest 75 von Lysin zu Alanin 5'GACACCAGCGCCAACCAGTTCAGCC3' und 5'GGCTGA- ACTGGTTGGCGCTGGTGTC3'; für die Änderung an Rest 91 von Tyrosin zu Phenylalanin 5'GACACCGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAACTAC3' und 5'GTA- GTTTCTTGCACAGAAATAGACCGCGGTGTC3'. Die hergestellte 16HuVH ATAF- DNA wurde als Matritze für die Konstruktion von 16HuVH ATAFSTAY, 16HuVH ATAFFAFSL und 16HuVH ATAFKNE verwendet. Die zur Konstruktion von 16HuVH ATAFSTAY verwendeten Primer waren 5'GCTGGTAGACACCAGGCC- AGCACTGCCTATCTGAGACTCAGCAGCG3' und 5'CGCTGCTGATCTCAGA- TAGGCAGTGCTGGCGCTGGTGTCTACCAGC3'. Die für die Konstruktion von 16HuVH ATAFFAFSL verwendeten Primer waren 5'GACACCAGCGCCAAC- CAGTTCAGCC3' und 5'GGCGCTGGTGTCCAAAGAAAAGGCAAATCTCCCTT- GA3'. Die zur Konstruktion von 16HuVH ATAFKNE verwendeten Primer waren 5'GACACCGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAACTAC3' und 5'ATAGACCGCGGT- GTCCTCGTTTTTCACGCTGCTGAGTCT3'. Die humanisierte schwere Kette in der EU-Gerüstregion 16HuEUVH YTR wurde durch Mutagenese der Gerüstregionen 1, 2 und 3 von 16HuVH in der NEWM-Gerüstregion konstruiert. Die für die Gerüstregion 1 verwendeten Primer waren 5'TCTGGCTACACCTTCACCACTGC- TGGAATG3' und 5'GAAGGTGTAGCCAGACGCCTTGCAGCTCACTTTCACGCT- GCTGCCAGGTTTCTTCACCTCTGCACCGCTCTGCTGCAGTTGGAC3'. Die für die Gerüstregion 2 verwendeten Primer waren 5'AGGTCTTGAGTGGATGGGATGGA- TAAAC3' und 5'ATCCACTCAAGACCTTGTCCAGGTGCCTGTCTCACCCA3'. Die Mutagenese der Gerüstregion 3 erfolgte in zwei Stufen. Die verwendeten Primer waren 5'GACACCGCGTTCTATTTTTGTGCAAGAAACTAC3' und 5'ATAGAACG- CGGTGTCCTCGGATCTCAGGCTGCTGAGTTCCATGTACAACTGGTTCTTGC- TG3', 5'GTACATGGAACTCAGCAGCCT3' und 5'CTGAGTTCCATGTACGCCGT- GTTCGTGCTCTCGTCTGCCGTAATTGTCACTCTTCCC3'. Die Nukleotidsequenzen der umgeformten leichten Kette und der unterschiedlichen umgeformten schweren Ketten sind in Fig. 6 gezeigt.
Die modifizierten variablen Regionen wurden wie vorstehend beschrieben in den Expressionsvektor pSVgpt kloniert. Einzelne Plasmide für die schwere Kette wurden mit dem Plasmid für die ursprüngliche umgeformte leichte Kette in NSO- Zellen gemeinsam transfiziert. Antikörper-herstellende Zellklone wurden selektiert und weitergezüchtet. Die gereinigten umgeformten Antikörper waren "Reshaped HCMV16 ATAF", "Reshaped HCMV16 ATAFSTAY", "Reshaped HCMV16 ATAFFAFSL", "Reshaped HCMV16 ATAFKNE" und "Reshaped HCMV16 YTR".

Beispiel 2: HCMV-spezifische Neutralisierung durch umgeformte Antikörper

Die umgeformten HCMV16-Antikörper, der chimäre HCMV16-Antikörper und der hybride HCMV16 MuVH/HuVK-Antikörper wurden in einem Neutralisierungsassay gegen den HCMV-Stamm AD169 (American Type Culture Collection, Rockwell, Maryland, USA) getestet, der in menschlichen Embryo-Lungenfibroblasten gezüchtet wurde. Die Zellen wurden in Platten mit 48 Vertiefungen (Costar) bis zur Bildung eines konfluenten Monolayers gezüchtet. Die Antikörperpräparationen wurden in "Minimal Essential Medium" (MEM) zweifach seriell verdünnt, das mit 2% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (HFCS), HEPES und Antibiotika (MEM/2/D) (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.) supplementiert worden war, wobei Konzentrationen von 100 ug/ml bis 0,8 ug/ml erhalten wurden. In MEM/2/D verdünntes Virus (entsprechend 50 Plaque-formende Einheiten (pfu) pro Vertiefung) wurde zu den verdünnten Antikörperpräparationen gegeben, wobei Antikörper-Endkonzentrationen von 50 ug/ml bis 0,4 ug/ml erhalten wurden. Nach 60minütiger Inkubation bei 37ºC in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre wurden in dreifacher Ausfertigung pro Verdünnung 100 ul der Antikörper/Virus- Gemische zu jeder Plattenvertiefung gegeben. Die Platten wurden 60 min bei 37ºC in 5% CO&sub2; bei gelegentlichem Schütteln inkubiert. Jede Plattenvertiefung wurde danach einmal mit MEM/2/D gewaschen und mit 1 ml 1% Methylcellulose in MEM überschichtet, das mit 30% "Lebovitz's L-15" Medium, 5% HFCS, Natriumbicarbonat, L-Glutamin und Antibiotika (Life Technologies Ltd., Paisley, U.K.) supplementiert war. Die Platten wurden 14 Tage bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Zur Fixierung der Zellen wurde zu jeder Plattenvertiefung 1 ml 75% Methanol/25% Essigsäure gegeben. Die Platten wurden 30 min bei Raumtemperatur liegen gelassen und dann dreimal mit Leitungswasser gewaschen. 1 ml Färbelösung (0,5% Kristallviolett, 50% Ethanol, 13,5% Formalin in PBS) wurde zu jeder Plattenvertiefung zugegeben. Die Platten wurden 30 min bei Raumtemperatur liegen gelassen und danach wurden sie solange mit Leitungswasser gewaschen, bis kein Farbstoff übrig blieb.
Die Anzahl an Plaques pro Plattenvertiefung wurde bestimmt und es wurde für jede Verdünnung der Antikörperpräparationen der Mittelwert an Plaque-formenden Einheiten (pfu) pro Plattenvertiefung berechnet. Dabei wurden Proben von einem menschlichen serumnegativen Serumpool und einem menschlichen serumpositiven Serumpool als Kontrollen miteinbezogen. Die menschlichen serumnegativen Serumpoolkontrollen neutralisierten Virusinfektiosität bei keiner Verdünnung, während die menschlichen serumpositiven Serumpoolkontrollen Infektiosität gut neutralisierten, wobei sich eine signifikante Plaqueverringerung bis zu einer 1/80 bis 1/160-Verdünnung zeigte. Der neutralisierende Titer wurde als die Antikörperkonzentration definiert, bei der eine 50%ige Plaqueverringerung erhalten wurde und dieser wurde graphisch bestimmt. Die aus zwei getrennten Experimenten erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.

Tabelle 1

Anti-HCMV-neutralisierender Titer von HCMV16-Antikörpern

Antikörper Titer (Antikörperkonzentration bei 50% Neutralisierung)

HCMV 16, chimär 1,1 ug/ml
Hybrider HCMV16 MuVH/HuVK 1,1 ug/ml
"Reshaped HCMV16 ATAF" 5,0 ug/ml
"Reshaped HCMV16 ATAFSTAY" 1,0 ug/ml
"Reshaped HCMV16 ATAFFAFSL" 18 ug/ml
"Reshaped HCMV16 ATAFKNE" 7,5 ug/ml
"Reshaped HCMV16 YTR" 1,5 ug/ml

Tabelle 2

Anti-HCMV-neutralisierender Titer von HCMV16-Antikörpern

Antikörper Titer (Antikörperkonzentration bei 50% Neutralisierung)

Muriner HCMV16 5,2 ug/ml
HCMV16, chimär 1,8 ug/ml
Hybrider HCMV16 MuVH/HuVK 1,8 ug/ml
"Reshaped HCMV 16 ATAF" 47 ug/ml
"Reshaped HCMV16 ATAFSTAY" 3,0 ug/ml
"Reshaped HCMV16 ATAFFAFSL" 38 ug/ml
"Reshaped HCMV16 ATAFKNE" 12 ug/ml
"Reshaped HCMV16 YTR" 2,2 ug/ml
Zwei der umgeformten Antikörper ("Reshaped HCMV16 ATAFSTAY" und "Reshaped HCMV16 YTR") neutralisierten das HCMV-Virus mit einer im Vergleich zu dem chimären Kontrollantikörper ähnlichen Wirksamkeit. Diese wurden hinsichtlich der Spezifität weiter untersucht.

Beispiel 3: Spezifität der veränderten Antikörper gegenüber HCMV

Die beiden umgeformten Antikörper ("Reshaped HCMV 16 ATAFSTAY" und "Reshaped HCMV16 YTR") wurden in einem Immunfluoreszenzassay hinsichtlich der Bindung an klinische HCMV-Stämme getestet. Klinische Isolate von 5 Nierentransplantatempfängern und 8 AIDS-Patienten wurden in menschlichen Embryo- Lungenfibroblastenzellen über drei bis fünf Passagen vermehrt. Bei Beobachtung eines cytopathischen Effekts wurde die den HCMV enthaltende Überstands flüssigkeit geerntet und 30 min bei 500 g zur Entfernung zellulärer Debris abgeschleudert. Das geklärte Virus wurde zu frischen Monolayern aus Fibroblastzellen zugegeben, die in Trägern mit 8 Kammervertiefungen ("8 weil chamber slides"; Labtek) gezüchtet worden waren. Um das Virus adsorbieren zu lassen, wurde 60 min bei 37ºC inkubiert. Das Inoculum wurde entfernt, gegen neues Medium ausgetauscht und die Zellen wurden bei 37ºC in einer 5% CO&sub2; Atmosphäre solange inkubiert, bis ein cytopathischer Effekt beobachtet wurde. Die Zellen wurden im Anschluß daran dreimal in PBS gewaschen und vor der 5minütigen Fixierung in Aceton bei -20ºC ließ man sie an der Luft trocknen. Man ließ die Träger an der Luft trocknen, danach wurden sie in Frischhaltefolie eingewickelt und bei -20ºC aufbewahrt.
Die Antikörper "Reshaped HCMV16 ATAFSTAY" (192 ug/ml) und "Reshaped HCMV16 YTR" (240 ug/ml) wurden in Immunfluoreszenz gegen AD169, den Laborstamm von HCMV, titriert. Es stellte sich heraus, daß die optimalen Verdünnungen 1/100 bzw. 1/25 waren. Diese Verdünnungen wurden für die Analyse von klinischen Stämmen verwendet.
Die Träger wurden aufgetaut und mit PBS gewaschen. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch die Zugabe einer 1/5-Verdünnung von normalem Kaninchenserum 60 min bei 37ºC blockiert. Die Träger wurden 5 min zweimal mit PBS gewaschen und danach mit der geeigneten Verdünnung des umgeformten Antikörpers 60 min bei 37ºC inkubiert. Nach dem Waschen in PBS wie vorstehend beschrieben, wurde eine 1/40-Verdünnung eines Fab&sub2;-Ziege-anti- Mensch-IgG-Gammakette-FITC-Konjugats (Sigma Chemical Co. Ltd., Poole, U.K.) 60 min lang bei 37ºC zu den Trägern gegeben. Die Träger wurden zweimal mit PBS gewaschen und danach an der Luft getrocknet. Nach Fixieren mit "Citifluor" wurden die Träger mit einem Olympus-Epifluoreszenzmikroskop untersucht, mittels eines "T-max"-Films photographiert und die Fluoreszenz wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Immunfluoreszenz von umgeformten Antikörpern mit klinischen Stämmen
Sowohl der Antikörper "Reshaped HCMV16 ATAFSTAY" als auch der Antikörper "Reshaped HCMV16 YTR" zeigten Bindung an die HCMV-Isolate von AIDS- Patienten und Transplantatempfängern. Somit ist das von diesen veränderten Antikörpern erkannte neutralisierende Epitop auf dem HCMV-Glycoprotein gH zwischen verschiedenen klinischen HCMV-Stämmen konserviert. Daher stellen diese veränderten Antikörper ein allgemein verabreichbares Reagens für die Therapie und Prophylaxe von HCMV in einer klinischen Situation bereit.

Beispiel 4: Neutralisierende Aktivität von veränderten Antikörpern gegen klinische HCMV-Stämme

Die beiden umgeformten Antikörper wurden hinsichtlich der Neutralisierung von klinischen Isolaten von 4 AIDS-Patienten und 5 Nierentransplantat-Empfängern, zusammen mit den Laborstämmen AD 169 und "Towne" als Kontrollen, getestet. Die ED&sub5;&sub0;-Werte wurden mittels des "Reed-Muench"-Verfahrens (Thorpe et al., 1987) berechnet und sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Neutralisierung verschiedener HCMV-Stämme durch die Antikörper "Reshaped HCMV16 ATAFSTAY" und "Reshaped HCMV16 YTR"
Die umgeformten Antikörper neutralisierten die Isolate von AIDS-Patienten und Nierentransplantat-Patienten bei Konzentrationen, die zu denen der Laborstämme AD169 und "Towne" äquivalent waren mit Ausnahme eines Nierentransplantatstammes, der die 40fache Antikörpermenge benötigte. Somit ist das von den umgeformten Antikörpern erkannte neutralisierende Epitop auf dem HCMV- Glycoprotein gH zwischen einer Vielzahl von unterschiedlichen klinischen HCMV- Stämmen konserviert.
Alle vorstehend erwähnten Literaturhinweise sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers oder Antigenbindenden Fragments davon mit der HCMV-neutralisierenden Spezifität des Antikörpers HCMV16, das die Verpflanzung von von einem nichtmenschlichen Antikörper mit dieser Spezifität stammenden komplementaritätsbestimmenden Bereichen (CDRs) in die von einem oder mehreren menschlichen Antikörpern stammenden Gerüstregion (FRs) umfaßt, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment eine Aminosäuresequenz der schweren Kette des variablen Bereichs von 16HuVH ATAFSTAY oder 16HuVH EUYTR wie in Fig. 5 aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die CDRs von den in Fig. 1 und/oder Fig. 2 gezeigten Sequenzen stammen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenzen der Gerüstregion der schweren Kette von NEWM und/oder EU stammen und/oder die Sequenzen der Gerüstregion der leichten Kette von REI.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei FR1, FR2 und FR3 der schweren Kette von EU stammen und FR4 von NEWM.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die CDRs und FRs der leichten Kette wie in Fig. 5 für 16HuVK dargestellt sind.

6. Monoklonaler Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon mit der HCMV-neutralisierenden Spezifität des Antikörpers HCMV16, mit von einem nicht-menschlichen Antikörper stammenden CDRs und von einem oder mehreren menschlichen Antikörpern stammenden FRs, wobei die FRs der schweren Kette von den menschlichen Antikörpern NEWM und/oder EU stammen und wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment eine Aminosäuresequenz des variablen Bereichs einer schweren Kette von 16HuVH ATASTAY oder 16HuVH EUYTR, wie in Fig. 5 gezeigt, aufweist.

7. Monoklonaler Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 6 mit CDRs, die von den in Fig. 1 und/oder Fig. 2 gezeigten Sequenzen stammen.

8. Monoklonaler Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 6 oder 7, wobei die FR1, FR2 und FR3 der schweren Kette von EU stammen und FR4 von NEWM.

9. Monoklonaler Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die FR-Sequenzen der leichten Kette von dem menschlichen Antikörper REI stammen.

10. Monoklonaler Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für eine pharmazeutische Verwendung.

11. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder Antigen-bindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung eines Medikaments zur Therapie oder Prophylaxe von HCMV.

12. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder Antigen-bindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung eines Medikaments zur Neutralisierung von HCMV.

13. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder Antigen-bindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für den Entwurf und die Synthese von Peptidverbindungen oder Nicht-Peptidverbindungen, die funktionelle Nachahmer des Antikörpers sind.

14. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder Antigen-bindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments, wobei der Antikörper in Verbindung mit einem weiteren Antikörper oder Arzneimittel ist.

15. Monoklonaler Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Antikörper an einen Effektor oder ein Reportermolekül angeknüpft ist.

16. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers oder Antigenbindenden Fragments davon mit der HCMV-neutralisierenden Spezifität des Antikörpers HCMV16, wobei das Verfahren das Züchten einer Zelle umfaßt, die die den Antikörper exprimierenden rekombinante DNA enthält, wobei die DNA einen Antikörper nach einem der Ansprüche 6 bis 8 kodiert oder als Teil des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 hergestellt wurde.