DE69231794T2

DE69231794T2 - Verbesserungen an oder für kontrastmitteln

Info

Publication number: DE69231794T2
Application number: DE69231794T
Authority: DE
Inventors: Klaveness; Hanno Priebe; Pal Rongved; Lars Stubberud
Original assignee: Nycomed Imaging AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1991-03-28
Filing date: 1992-03-28
Publication date: 2001-11-22
Anticipated expiration: 2012-03-29
Also published as: GB9106673D0; US20020172643A1; GR3035829T3; WO1992017212A1; EP0576519B1; JP3424927B2; EP0576519A1; AU1425392A; NO933431L; SG43907A1; FI934226A; FI934226A0; HK1004980A1; US5536490A; CA2107108A1; NO324068B1; DK0576519T3; AU667033B2; ES2156109T3; CA2107108C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Kontrastmittel, insbesondere neue Gas enthaltende oder Gas erzeugende Kontrastmittel zur Verwendung in der diagnostischen Ultraschall-Bildgebung.
Bekanntlich zählt die Ultraschall-Bildgebung zu den potentiell wertvollen diagnostischen Methoden, beispielsweise bei Untersuchungen des Vasculärsystems, insbesondere in der Kardiographie und des Gewebemikrogefäßsystems. Zur Verbesserung der auf diese Weise erhaltenen akustischen Bilder sind eine Vielzahl von Kontrastmitteln vorgeschlagen worden, einschließlich Suspensionen fester Teilchen, emulgierter Flüssigkeitströpfchen, Gasbläschen und eingekapselter Gase oder Flüssigkeiten. Es ist allgemein anerkannt, dass leicht komprimierbare Kontrastmittel von geringer Dichte hinsichtlich der akustischen Rückstreuung, die sie erzeugen, besonders wirksam sind, und daher besteht ein beträchtliches Interesse an der Herstellung von Gas enthaltenden und Gas erzeugenden Systemen.
Anfängliche Untersuchungen mit freien Gasbläschen, die in vivo durch intrakardiale Injektion physiologisch verträglicher Substanzen erzeugt wurden, belegen die potentielle Wirksamkeit dieser Bläschen als Kontrastmittel in der Echokardiographie; diese Techniken sind jedoch in der Praxis aufgrund der kurzen Lebenszeit der freien Bläschen stark begrenzt. Folglich zeigte man ein Interesse an Verfahren zur Stabilisierung von Gasbläschen bei der Echokardiographie und anderen Ultraschalluntersuchungen, zum Beispiel unter Verwendung von Emulgatoren, Ölen, Verdickungsmitteln oder Zuckern.
Die WO 80/02365 offenbart die Verwendung von mit Gelatine eingekapselten Gasmikrobläschen zur Verbesserung von Ultraschallabbildungen. Diese Mikrobläschen weisen jedoch bei den zur Anwendung in der Echokardiographie bevorzugten Größen (1 bis 10 um) angesichts der extremen Dünne der eingekapselnden Hülle keine ausreichende Stabilität auf.
Die US-A-4774958 offenbart die Verwendung von Mikrobläschendispersionen, die durch Einkapseln in denaturiertem Protein, z. B. humanem Serumalbumin, stabilisiert sind. Diese Systeme erlauben die Herstellung von Mikrobläschensystemen mit einer Größe von beispielsWeise 2 bis 5 um, aber sie ermöglichen keine brauchbare Abbildung des linken Herzens und des Myokardiums.
Die EP-A-0327490 offenbart unter anderem Ultraschallkontrastmittel, die ein mikropartikuläres synthetisches, biologisch abbaubares Polymer (z. B. ein Polyester einer Hydroxycarbonsäure, ein Polyalkylcyanoacrylat, eine Polyaminosäure, ein Polyamid, ein Ester der Polyacrylsäure mit Sacchariden oder ein Polyorthoester) umfassen, das ein Gas oder ein flüchtiges Fluidum (d. h. mit einem Siedepunkt von weniger als 60ºC) in freier oder gebundener Form enthält. Emulgatoren können als Stabilisatoren zur Herstellung solcher Mittel verwendet werden, aber solche Emulgatoren wechselwirken nicht chemisch mit dem Polymer.
Wir fanden nun, dass man besonders wirksame Ultraschallkontrastmittel durch Einkapseln von Gasbläschen oder Gas erzeugenden Systemen mit Polymeren, die chemisch gebundene grenzflächenaktive, d. h. amphiphile Molekülteile enthalten, erhalten kann. Auf diese Weise stabilisieren die grenzflächenaktiven Eigenschaften der amphiphilen Gruppen durch Herabsetzen der Oberflächenspannung an den Gas- Flüssig-Grenzflächen das Mikrobläschen-System, beispielsweise durch Bildung von Monoschichten oder einer oder mehrerer Doppelschichten (alternativ mit den Begriffen Mizellen, Vesikel, Liposome und Niosome bezeichnet) an den Grenzflächen, während die Verknüpfung der Gruppen durch das Polymersystem eine weitere Stabilität erzeugt. Die Flexibilität der einkapselnden Materialien erhöht ebenfalls die von solchen Kontrastmitteln geleistete Bilddichte. Der Einfachheit halber bezeichnet der im Folgenden verwendete Begriff "Vesikel" alle Mikrobläschenstrukturen vor oder nach der Vernetzung oder der Polymerisation. Es sei angemerkt, dass unter einigen Bedingungen unregelmäßig geformte Strukturen gebildet werden können, z. B. Mikroröhrchen, die mit sphärische Strukturen verbunden sein können oder diese sogar einschließen können.
EP-A-0441468, die nach Artikel 54(3) EPC Stand der Technik ist, offenbart Ultraschallkontrastmittel, die Polyaldehyd-Mikropartikel enthalten. Die beschriebenen Herstellungsverfahren basieren nicht auf Vesikel-Bildung.
Die EP-A-0458745, die nach Artikel 54(3) EPC ebenfalls Stand der Technik ist, offenbart Ultraschallkontrastmittel in Form luft- oder gasgefüllter Mikrobläschen, die von einer grenzflächig aufgetragenen Polymermembrane begrenzt werden. Die Verwendung von grenzflächig abscheidbaren Polymeren mit amphiphilen Eigenschaften oder die Bildung von Mikrobläschen, die von Monoschichten oder von einer oder mehreren Doppelschichten chemisch verknüpfter amphiphiler Molekülteile begrenzt werden, wird nicht vorgeschlagen.
Die WO-A-9211873 und die EP-A-0494615 sind ebenfalls nach Artikel 54(3) EPC Stand der Technik und offenbaren zur Absorbtion und Stabilisierung von Mikrobläschen konzipierte, wässrige Zubereitungen, die als Ultraschallkontrastmittel verwendet werden und die Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polymere und negativ geladene Phospholipide enthalten.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Kontrastmitteln zur Verwendung in diagnostischen Ultraschalluntersuchungen, umfassend gasgefüllte Mikrobläschen, die in Monoschichten oder einer oder mehreren Doppelschichten nichtproteinhaltiger vernetzter oder polymerisierter amphiphiler Molekülteile eingekapselte Gasmikrobläschen enthalten, mit der Maßgabe, dass (i) die vernetzten oder polymerisierten amphiphilen Molekülteile kein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polymer bilden und (ii) das Kontrastmittel keine Polyaldehyd-Mikropartikel enthalten.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind in den Ansprüchen dargelegt.
Unter dem im Folgenden verwendeten Ausdruck "vernetzt" versteht man die Verknüpfung amphiphiler Molekülteile untereinander unter Bildung einer Polymerstruktur, die ein oder mehrere Polymersystem(e) (einschließlich Copolymere) einschließen kann.
Es ist ein bedeutender Vorteil der erfindungsgemäßen Kontrastmittel, dass man sie unter dem Gesichtspunkt eines bestimmten erwünschten Grades biologischer Abbaubarkeit in vivo konzipieren kann, indem man geeignete biologisch abbaubare Bindungen in geeigneten Positionen wählt. Vorzugsweise müssen die Kontrastmittel während der Ultraschalluntersuchung stabil sein, um wirksam zu sein, werden kurz danach aber vorzugsweise metabolisiert oder problemlos aus dem Kreislaufsystem entfernt. Die erfindungsgemäßen Kontrastmittel sollten daher vorzugsweise eine in vivo Halbwertzeit von weniger als 48 Stunden, zum Beispiel von 1 bis 12 Stunden haben.
Zu den biologisch abbaubaren Bindungen, die in den erfindungsgemäßen Kontrastmitteln vorhanden sein können, zählen Amid-, Imid-, Imin-, Ester-, Anhydrid-, Acetal-, Carbamat-, Carbonat-, Kohlensäureester- und Disulfidgruppen. Wenigstens eine solche Gruppe sollte vorzugsweise in dem amphiphilen Molekülteil, in dem hydrophilen und/oder lipophilen Anteil vorhanden sein; es kann vorteilhaft sein, die Gruppe im hydrophilen Teil zu platzieren, um eine enzymatische Wechselwirkung in vivo zu erleichtern. Zur Gewährleistung einer erheblichen Aufspaltung des Polymers im Körper weist vorzugsweise auch das Polymergerüst biologisch abbaubare Bindungen auf.
Jedes biokompatible Gas kann in den erfindungsgemäßen Kontrastmitteln verwendet werden, der Begriff "Gas", wie er im Folgenden verwendet wird, umfasst jegliche, bei 37ºC gasförmige Substanzen, beispielsweise Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Wasserstoff, Lachgas, Kohlendioxid, Helium, Argon, Schwefelhexafluorid und gegebenenfalls fluorierte bei 37ºC gasförmige Kohlenwasserstoffe, wie Methan, Acetylen oder Tetrafluorkohlenstoff. Die erfindungsgemäßen gasgefüllten Mikrobläschen zeigen auf Grund ihrer relativ flexiblen Beschaffenheit günstige Eigenschaften in der Echographie.
Für Anwendungen in der Echokardiographie kann es günstig sein Mikrobläschen mit einer durchschnittlichen Größe von 0,1 bis 10 um, z. B. 1 bis 7 um zu verwenden, um eine ungehinderte Passage durch das pulmonale System zu ermöglichen und um die Resonanz mit der bevorzugten Abbildungsfrequenz zu erzielen. Wesentlich größere Bläschen, z. B. mit durchschnittlichen Größen bis zu 500 um, können jedoch für andere Anwendungen, zum Beispiel gastrointestinale Bildgebung oder Untersuchungen des Uterus oder der Eileiter brauchbar sein.
Gegebenenfalls können die Mikrobläschen teilchenförmige Stabilisatoren, zum Beispiel anorganische Materialien wie Siliciumdioxid oder Eisenoxid, die nur teilweise durch das verwendete Lösungsmittelsystem benetzt werden, einschließen und haben beispielsweise eine Partikelgröße von 1 bis 500 nm. Hierfür verwendet man vorteilhafterweise kolloidales Siliciumdioxid mit einer Partikelgröße von 5 bis 50 nm.
Zu den Polymersystemen, die in den erfindungsgemäßen Kontrastmitteln verwendet werden können, gehören Kohlenhydrate wie Dextrane und Stärken, Chitin, Chitosan, Carboxymethylchitosan, Alginat, Hyaluronsäure, Polyacrylamide, Polycyanoacrylate, Hydroxyalkylpolycyanoacrylate, Polyhydroxysäuren wie Polymilchsäuren, Polyhydroxybutyrate, Polyglycolsäuren, Polylactid-Glycolide, Polyorthoester, Polyanhydride, Polyurethane, Polyesterimide, Polyimide, Polyacetale, Poly-epsilon-caprolactone, Polydioxanone, Polyaminotriazole, Poly(amid-enamine), Poly(amid-urethane), Polyphosphazene, Polyvinylalkohole, Organopolysiloxane, Poly(enol-ketone) und Copolymere dieser Materialien, die erforderlichenfalls zur Einführung hydrophiler oder lipophiler Molekülteile modifiziert sind.
Die erfindungsgemäßen Mikrobläschen lassen sich herstellen, indem man eine fluide Dispersion von Vesikeln bildet, die ein in Monoschichten oder in ein oder mehreren Doppelschichten des nicht proteinhaltigen, amphiphilen Materials eingekapseltes Gas oder einen Vorläufer dafür enthalten, und anschließend das amphiphile Material vernetzt oder polymerisiert. Der Begriff "Gasvorläufer", wie er im Folgenden verwendet wird, umfasst Substanzen wie flüchtige Kohlenwasserstoffe, die anfänglich eingekapselt sein können, aber später teilweise oder vollständig aus den Vesikeln, z. B. durch Evaporieren oder Gefriertrocknung, entfernt werden, um gegen Gas ersetzt zu werden.
Die Vesikel umfassen in der Regel eine im Wesentlichen spärische Monoschicht oder Mehrfachschicht des amphiphilen Materials. Die hydrophilen Molekülteile der Amphiphile sind physikalisch unter Bildung einer angrenzenden Schicht assoziiert, während die lipophilen Molekülteile ebenfalls eine Schicht bilden, die innerhalb oder außerhalb der hydrophilen Schicht sein kann. In Doppelschichten können zwei Schichten des amphiphilen Materials überlagert sein; so kann sich zum Beispiel eine erste Schicht des amphiphilen Materials mit lipophilen Gruppen an der Außenseite bilden. Eine zweite Schicht des amphiphilen Materials kann dann die erste Schicht überlagern, wobei die lipophilen Gruppen an die lipophilen Gruppen der ersten Schicht angrenzen, und die hydrophilen Gruppen an der Außenseite sind. In ähnlicher Weise kann eine Doppelschicht die lipophilen Gruppen an der Außen- und Innenseite aufweisen, wobei die hydrophilen Gruppen sandwichartig dazwischen angeordnet sind.
Sofern die Flüssigkeit, in der die Vesikel fein verteilt sind, polar ist, zum Beispiel wässrig, tendieren die hydrophilen Gruppen der Vesikel dazu, an der Außenseite der Mizellen zu sein, und die lipophilen Gruppen befinden sich unter Bildung einer Monoschicht an der Innenseite. Andererseits sofern die dispergierende Flüssigkeit apolar ist, befinden sich die lipophilen Gruppen an der Außenseite, insbesondere, wenn das eingekapselte Material hydrophil ist, z. B. ein Gasvorläufer, eventuell in Verbindung mit einer polaren Flüssigkeit. Doppelschichten können entstehen, wenn das eingekapselte Material von der gleichen Art, d. h. hydrophil oder lipophil wie die dispergierende Flüssigkeit ist.
Die erfindungsgemäß verwendeten Amphiphile tragen funktionelle Gruppen, die eine Vernetzung oder Polymerisation erlauben. In einigen Fällen können dies Gruppen sein, die einen hydrophilen oder lipophilen Charakter verleihen oder sie können unabhängig von den amphiphilen Gruppierungen sein.
Man kann die Amphiphile in drei Gruppen einteilen:
1. Die Amphiphile tragen wenigstens zwei einfache reaktive Gruppen wie Hydroxyl-, Amino- oder Carboxylgruppen, die mit dem mehrwertigen reaktiven Monomeren oder vorgeformten Polymeren zu reagieren vermögen. Wenn zum Beispiel das Amphiphil zwei Hydroxylgruppen (in dem hydrophilen Molekülteil) trägt, kann man eine Dicarbonsäure wie Suberinsäure mit den Vesikel nach dem Einkapseln des Gases oder des Vorläufer dafür unter Bildung einer vernetzten oder polymerisierten Struktur umsetzen. Man kann Diamino-Amphiphile auf ähnliche Weise mit Dicarbonsäuren umgesetzen, während man Dicarboxyl-Amphiphile mit Diaminen oder Diolen umsetzen kann. Eine zusätzliche Vernetzung lässt sich mit trifunktionellen Reagenzien erzielen. In der Regel ist ein Katalysator zur Unterstützung der Reaktion vorhanden.
Das Vernetzungsmittel kann an sich amphiphil sein, so dass sich das Vesikel in Ausrichtung auf die lipophilen und hydrophilen Gruppen des ersten Amphiphils und dem amphiphilen Vernetzungsmittel bildet, worauf sich die Vernetzung zwischen den reaktiven funktionellen Gruppen starten lässt.
Wie zuvor erwähnt ist es besonders günstig, wenn das polymerisierte oder vernetzte Amphiphil biologisch abbaubar ist, insbesondere zu relativ einfachen wasserlöslichen Einheiten. Im Falle der zuvor genannten Ester- und Amidbindungen sind im Gefäßsystem in der Regel Esterase- und Amidase-Enzyme vorhanden und können das einkapselnde Material wieder zu separaten amphiphilen Molekülen und den Diamin-, Diol- oder Disäurereagenzien abbauen, die unter den physiologischen Bedingungen nicht rekombinieren.
Gewünschtenfalls können sogar biologisch labilere vernetzende Gruppen wie Kohlensäureestergruppen eingeführt werden, z. B. durch Verwendung von Orthoester als Vernetzungsmittel. Eine weitere brauchbare Klasse von Vernetzungsmitteln hat die Formel (I)
A¹-R&sup8;-(Y)n-CO-O-C(R¹R²)-O-CO-(Z)n-R&sup9;-A² (I)
(worin Y und Z, die gleich oder verschieden sein können, für -O-, -S- oder -NR³- stehen;
R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, für Wasserstoff oder kohlenstoffgebundene, monovalente, organische Gruppen stehen oder zusammen eine kohlenstoffgebundene, divalente organische Gruppe bilden;
R³ ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe bedeutet; die Symbole n, die gleich oder verschieden sein können, null oder eins sind;
R&sup8; und R&sup9;, die gleich oder verschieden sein können, für divalente organische Gruppen, zum Beispiel für Alkylen- oder Alkylidengruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen stehen; und A¹ und A² funktionelle Gruppen sind, die zum Beispiel mit Hydroxyl-, Amino- oder Carboxylgruppen reagieren), da die auf diese Weise eingeführten vernetzenden Gruppen Einheiten der Formel
-(Y)n-CO-O-C(R¹R²)-O-CO-(Z)n
enthalten (worin Y, Z, jedes n, R¹ und R² die zuvor genannten Bedeutungen haben), die relativ rasch durch übliche Esterasen abgebaut werden, während sie in Abwesenheit der Enzyme stabil sind.
R¹, R² und R³ können jeweils eine Kohlenwasserstoffgruppe oder eine heterocylische Gruppe mit beispielsweise 1 bis 20 Kohlenstoffatomen sein, z. B. eine Alkyl- oder eine Alkenylgruppe (vorzugsweise mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen), eine Cycloalkylgruppe (vorzugsweise mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen), eine Aralkylgruppe (vorzugsweise mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen), eine Acylgruppe (vorzugsweise mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen) oder eine heterocyclische Gruppe mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen und einem oder mehreren unter O, S und N ausgewählten Heteroatom(en); eine solche Kohlenwasserstoffgruppierung oder eine heterocylische Gruppierung kann eine oder mehrere funktionelle Gruppen wie Halogenatome oder Gruppen der Formeln -NR&sup4;R&sup5;, -CONR&sup4;R&sup5;, -OR&sup6;, -SR&sup6; und -COOR&sup7; tragen, worin R&sup4; und R&sup5;, die gleich oder verschieden sein können, für Wasserstoffatome, Acylgruppen oder Kohlenwasserstoffgruppen wie bei R¹ und R² genannt, stehen; R&sup6; ist ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe oder eine der bei R¹ oder R² genannten Gruppen und R&sup7; ist ein Wasserstoffatom oder eine der bei R¹ und R² genannten Gruppen; sofern R¹ und R² für eine divalente Gruppierung stehen, kann dies zum Beispiel eine Alkylen- oder Alkenylengruppe (vorzugsweise mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen) sein, die eine oder mehrere der zuvor genannten funktionellen Gruppen tragen kann. In der Regel stehen R¹ und R² vorzugsweise für Wasserstoff oder kleine Gruppen wie C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppen.
2. Das Amphiphil kann polymerisierbare Gruppierungen enthalten, die sich nach der Vesikelbildung polymerisieren lassen. Zu solchen polymerisierbaren Gruppierungen zählen zum Beispiel ungesättigte lipophile Ketten, z. B. Alkenyl- oder Alkinylgruppierungen mit bis zu 50 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel 10 bis 30 Kohlenstoffatome, wie Oleyl- oder Linoleylgruppen oder Gruppen mit Diacetylen-, Acryloyl- oder Methacrylolgruppierungen. Die Polymerisation dieser Gruppierungen ergibt im Allgemeinen Polymere mit einem Kohlenwasserstoffgrundgerüst, deren Grundgerüste nicht ohne weiteres biologisch abbaubar sind, obgleich diese Polymere so konzipiert werden können, dass der aus dem biologischen Abbau resultierende Rest des Grundgerüsts zur Verbesserung seiner Disperigierbarkeit wasserlöslich ist, z. B. auf Grund der vorhandenen hydrophilen Substituenten wie Carboxyl- oder Hydroxylgruppen. Im Allgemeinen wählt man die Kettenlänge dieser Polymere vorzugsweise so, dass das Molekulargewicht 40000 nicht überschreitet.
Sofern ein höherer Grad der biologischen Abbaubarkeit erforderlich ist, kann es besser sein, auf die Bildung von polymeren Kohlenwasserstoffketten, die nicht ohne weiteres abgebaut werden können, zu verzichten und Polymerisation oder Vernetzung ausschließlich mit biologisch abbaubaren Gruppen wie Ester-, Carbonat-, Carbamat-, Amid- oder Imidbindungen der zuvor erwähnten Art zu erzielen. Im Allgemeinen sind die zu diesen Bindungen führenden, funktionellen Gruppen, hydrophil und bewirken somit die Vernetzung zwischen den hydrophilen Teilen der Amphiphile.
Jedoch kann man ein biologisch abbaubares Polymer durch Polymerisation lipophiler Kohlenwasserstoffketten erhalten, sofern das Amphiphil einen biologisch abbaubaren hydrophilen Molekülteil mit zwei dieser Ketten enthält; werden die lipophilen Ketten benachbarter Moleküle z. B. über ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen vernetzt, so werden die so gebildeten, verlängerten lipophilen Grupppierungen durch die biologisch abbaubaren hydrophilen Gruppen getrennt; beim biologischen Abbau zerfällt somit die polymere Struktur in relativ kleine lipophile Moleküle, welche die Reste der abbaubaren hydrophilen Molekülteile tragen.
3. Man kann ein lösliches amphiphiles Polymer mit geeigneten funktionellen Gruppen außerdem nach der Vesikelbildung polymerisieren oder vernetzen. Zu diesen Substanzen zählen Polyaminosäuren und Kohlenhydrate mit lipophilen Gruppen ebenso wie niedermolekulare Polyester, Polyamide usw., die geeignete Gruppen tragen, die für den amphiphilen Charakter sorgen. Zur Bereitstellung geeigneter Amphiphile zur erfindungsgemäßen Verwendung kann man somit zum Beispiel hydrophile Polymere wie die zuvor genannten mit lipophilen Ketten versehen, z. B. C&sub1;&sub0;-C&sub3;&sub0;-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylgruppen. Zu den chemischen Methoden zur Anknüpfung dieser lipophilen Ketten gehören die partielle Veresterung der Hydroxylgruppen von Polyhydroxysäuren, die Salzbildung von anionischen oberflächenaktiven Stoffen an die Aminogruppen des Chitosans oder die kovalente Derivatisierung dieser Gruppen und die Bindung der hydrophoben Gruppen an Kohlenhydrate oder Cyclodextrine über Esterbindungen.
Das lösliche Polymer für die weitere Polymerisation kann auch ein Amphiphil sein, das entsprechend obigen (1) oder (2) polymerisiert oder vernetzt wurde.
Zu den polymerisierbaren oder vernetzbaren Amphiphilen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, zählen Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
[(X)p(R¹&sup0;)q]Br (II),
worin X ein anionischer, kationischer oder nicht-ionischer hydrophiler Molekülteil ist;
R¹&sup0; eine lipophile Gruppe ist;
B eine polymerisierbare oder vernetzbare Gruppe ist;
p und q ganze Zahlen sind; und
r für null oder, sofern weder X noch R¹&sup0; polymerisierbar oder vernetzbar sind, für eine ganze Zahl steht.
Die Gruppen X und R¹ können unterschiedlich verbunden sein. So kann zum Beispiel eine hydrophile Gruppe X eine oder mehrere lipophile Gruppen R¹&sup0; tragen oder eine lipophile Gruppe R¹&sup0; kann eine oder mehrere hydrophile Gruppen X tragen. Eine oder mehrere hydrophile Gruppen X können auch einzelne lipophile Gruppen R¹&sup0; verbinden, sofern das Amphiphil eine Konfiguration annehmen kann, in der die hydrophilen und lipophilen Molekülteile benachbarter Moleküle in Reihe ausgerichtet sind.
In ähnlicher Weise kann (können) die Gruppe(n) B (sofern vorhanden) an eine oder mehrere Gruppen X und R¹&sup0; gebunden sein.
Zum Bereitstellen oder Verbesseren der biologischen Abbaubarkeit können eine oder mehrere biologisch abbaubare Gruppen W die Gruppen X, R¹&sup0; und B verbinden.
Die Gruppe X kann zum Beispiel eine quartäre Ammoniumgruppierung -N(R¹¹)&sub3; V sein, worin die Gruppen R¹¹ (die gleich oder verschieden sein können) beispielsweise Alkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppen mit beispielsweise bis zu 20 Kohlenstoffatomen sein können, und V für ein Anion steht. Vorzugsweise stehen eine oder mehrere Gruppen R¹¹ für eine lipophile Gruppe R¹&sup0;.
Zu den weiteren geeigneten hydrophilen Gruppen X gehören Hydroxyl-, Carboxylat-, Amid-, Phosphat-, Sulfat- und Sulfonatgruppen. Weiter Beispiele hydrophiler Gruppen X sind:
- O-CH&sub2;-CH&sub2;-N&spplus; (CH&sub3;)&sub3; (Cholin)
- O-CH&sub2;-CH&sub2;-N&spplus;H&sub3; (Ethanolamin)
- O-CH-(NH&sub3;&spplus;)-COO&supmin; (Serin)
- O-CH&sub2;-CH(OH)-CH&sub2;OH (Glycerin)
- Hexosen und Pentosen wie Inositol.
Die Gruppe R¹&sup0; kann zum Beispiel eine gesättigte oder ungesättigte, geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette sein, die zum Beispiel 6 bis 50 Kohlenstoffatome enthalten kann und durch eine oder mehrere biologisch abbaubare Gruppen W unterbrochen sein kann und eine oder mehrere funktionelle Gruppen tragen kann, so dass Ketten R¹&sup0; an benachbarten Amphiphilen unter Bildung einer biologisch abbaubaren Gruppe vernetzen können. Zu den brauchbaren Gruppen R¹&sup0; zählen Oleyl- und Linoleylgruppen und Ketten mit Diacetylengruppierungen.
Die Gruppe(n) B kann (können) zum Beispiel Orthoestergruppen, die mit Hydroxylgruppen Kohlensäureesterbindungen bilden, oder Hydroxysäuregruppen (oder getrennte Hydroxyl- und Carboxylgruppen) sein, die Esterbindungen bilden.
Vorzugsweise kann die hydrophile Gruppe X einen Molekülteil enthalten, der nicht selbst unmittelbar für die hydrophilen Eigenschaften verantwortlich ist, wie im Falle einer der zuvor definierten Gruppen R¹¹ einer quartären Ammoniumgruppierung, die zum Beispiel eine niedere Alkylgruppe sein kann, die zum Vermitteln eines lipophilen Charakters zu klein ist; diese Gruppen können auch Teil der Verbindung zwischen den Gruppen X und R¹&sup0; sein. Mit anderen Worten, sie können Übergangsbereiche zwischen Gruppen X und R¹&sup0; sein, die genaugenommen an sich weder lipophil noch hydrophil sind, sondern als Teil von entweder X oder R¹&sup0; angesehen werden können.
In einem Spezialfall der Amphiphile der Formel (II) können somit die Gruppen X, R¹&sup0; und B an ein vorgeformtes Polymer gebunden sein, das entsprechend seiner chemischen oder physikalischen Beschaffenheit als Teil von X oder von R¹&sup0; betrachtet werden kann. Ein solches Polymer kann ein bekanntes hydrophiles Polymer, an das lipophile Gruppen (wie zuvor erörtert) gebunden sind oder ein lipophiles Polymer, z. B. eine Polyolefin mit hydrophilen Gruppen, sein. Alternativ kann man ein solches Polymer durch partielle Polymerisation eines Amphiphils der Formel (II) erhalten. Stets sollte das vorgeformte Polymer ausreichend löslich sein, um die Vesikelbildung zu ermöglichen, und sollte zur Stabilisierung der Vesikel Funktionalitäten haben, die eine kovalente, ionische oder koordinative Vernetzung erlauben.
Zu den besonders brauchbaren monomeren Amphiphilen zählen Cyanoacrylatester mit lipophilen, veresterbaren Gruppen (die auch hydrophile Molekülteile haben können). So beschreibt beispielsweise die US 4329332 die Mikroemulsionspolymerisation von niederen Alkylcyanoacrylaten, ein Verfahren, das auf die Polymerisation von Acrylaten der Formel CH&sub2;=C(CN)-C(O)-O-(C&sub6;-C&sub2;&sub0;-aliphatisch) übertragen werden kann. In ähnlicher Weise benutzten Ping et al. (Int. J. Pharm, 61 (1990) 79-84) ein Diacrylat der Formel
CH&sub2;=CH-CO-O-(CH&sub2;-CH&sub2;-O)&sub9;&sub8;-(CH&sub2;-CH(Me)-O)&sub6;&sub7;-(CH&sub2;-CH&sub2;-O)&sub9;&sub8;-CO-CH=CH&sub2;.
Entsprechende Cyanoacrylate können verwendet werden.
Zu den erfindungsgemäß brauchbaren amphipilen Substanzen gehören die folgenden Substanzklassen, die mit lipophilen Gruppen derivatisiert sind:
Lecithinderivate,
Polyglycerin,
Polyoxyethylenglycol und dessen Ether,
Polyoxyethylenderivate von Steroiden,
Glycoside,
Galaktoside,
Hydroxysäuren oder Polyhydroxysäuren (einschließlich Carbon-, Phosphon-, Sulfon- und Sulfinsäuren)
Kohlenhydrate und Derivate davon,
Aminoalkohole und Derivate davon,
Cyanoacrylate,
Acrylamide und
Hydroxyamide.

Polymerisierbare Amphiphile

Mehrere Klassen brauchbarer polymerisierbarer Amphiphile sind nachfolgend aufgelistet:
1. CH&sub2;(OB&sub1;)-CH(OB&sub2;)-CH&sub2;-O-PO(O&supmin;)O(CH&sub2;)&sub2;N&spplus;(CH&sub3;)&sub3;
worin B&sub1; und B&sub2; für
-CO-(CH&sub2;)&sub8;-C C-C C(CH&sub2;)n-CH&sub3;
(worin n eine ganze Zahl z. B. 9, 12 oder 13 ist) stehen können, wie es in der WO 85/04326 beschrieben ist. Solche Verbindungen lassen sich durch übliche Phospholipidchemie herstellen, wie sie Hirth et al. (Helv. Chem. Acta 40, 1957, 1928) und Pfeiffer et al. (J. Org. Chem. 35, 1979, 221) beschreiben.
Solche Verbindungen lassen sich somit nach den in der EP-A- 0032622 beschriebenen Verfahren herstellen. Die zwitterionische Gruppe lässt sich durch Umsetzen der geeigneten Phosphon- oder Phosphinsäure oder eines veresterbaren Derivates davon mit Glycerin oder einem veresterbaren Derivat davon einführen. Die Gruppen B&sub1; und B&sub2; lassen sich in das Molekül durch Esterbildung unter Verwendung der Carbonsäure von B&sub1; und B&sub2; oder eines Ester bildenden Derivates davon einführen. Diese Umsetzungen zwischen Glycerin oder Derivaten davon mit der Carbonsäure einerseits und dem Phosphorsäureester andererseits können entweder gleichzeitig oder gegebenenfalls schrittweise erfolgen. Für die Synthese können ebenso gut andere bekannte Verfahren angewandt werden.
Nach Bildung der Gas enthaltenden Liposome oder Bildung von Monoschichten der Amphiphile an der Gas/Flüssig-Grenzfläche lässt sich die Polymerisation dieser Verbindungen zum Beispiel durch Bestrahlen bei 254 nm unter Verwendung einer Xenonlampe erreichen.
2. Phospholide wie Phosphodiglyceride und Sphingolipide mit polymerisierbaren Gruppen.
3. Ungesättigte Öle mit hydrophilen Gruppen wie Maisöl, Sonnenblumenkernöl, Sojabohnenöl, Färberdistelöl, Erdnussöl, Baumwollkernöl und Olivenöl.
4. Gesättigte und ungesättigte Fettsäurederivate mit Hydroxylgruppen, zum Beispiel Rizinusöl und Mutterkornöl, die Triglyceride der d-12-Hydroxyölsäure sind.
5. Verbindungen, wie sie in "Polymerised Liposome" (Technical Insights Inc 1988) und von Hub et al (J. Macromol. Sci. Chem. A15, (5), 1981, 701-715) beschrieben sind. Diese können folgende Strukturen haben:
6. Verbindungen der Formel:
[CH&sub3;-(CH&sub2;)&sub1;&sub2;-C C-C C(CH&sub2;)&sub8;-CO-L-(CH&sub2;)&sub2;]&sub2;M
worin L und M für -O-, -S- oder -NR¹²- (worin R¹² H oder eine Alkylgruppe ist) stehen, zum Beispiel die Verbindungen mit
L = M = -O-; L = -O-, M = -N(CH&sub3;)-; L = -NH-, M = -o-;
L = -O-, 14 = -N&spplus;(CH&sub3;)&sub2;- Br und
L = -O-, M = -N(CH&sub2;.CH&sub2;.SO&sub3;H)-
Solche Verbindungen lassen sich durch Umsetzen eines reaktiven Derviates der Hexacosan-10,12-diinsäure (z. B. das Säurechlorid) mit der geeigneten Verbindung (HLCH&sub2;CH&sub2;)&sub2;M in trockenem Chloroform bei 0ºC in Gegenwart von Pyridin herstellen, gegebenenfalls mit anschließender Quaternisierung.
Singh et al (Polym. Prep.: Am. Chem. Soc. Div. Polym. Chem 26 (2), 1985, 184-5) beschreiben die Synthese der Hexacosan-10,12- diinsäure. Das Säurechlorid lässt sich durch Umsetzung mit Oxalylchlorid herstellen.
7. Verbindungen, wie sie von Paleos (Chem. Soc. Rev. 14, 1985, 45- 67) beschrieben werden, zum Beispiel die folgenden Strukturen:
8. Ester von α-Aminofettsäuren, die selbst kondensieren können, wie von Folda et al (in Rapid. Commun. 3, 1982, 167-174) beschrieben, z. B. Methyl-2-aminooctadecanoat, Docosanyl-2-aminooctadecanoat, Methyl-2-aminohexcosanoat und Docosanyl-2-aminohexacosanoat.
Diese Ester langkettiger Aminosäuren lassen sich aus gesättigten Carbonsäuren durch α-Bromierung mit Hilfe der Hell-Vollhard- Zelinsky-Reaktion synthetisieren. Die Überführung der erhaltenen α-Bromcarbonsäuren in die entsprechenden Aminosäuren gelingt nach dem Verfahren von Cheronis et al (J. Org. Chem. 6 (1949) 349). Zur Herstellung der Methylester der Aminosäurehydrochloride leitet man trockenes HCl-Gas durch eine unter Rückfluss erhitzte Suspension der Aminosäure in Methanol. Die Docosanylester der Aminosäurehydrochloride lassen sich durch Durchleiten von trockenem HCl-Gas durch ein 1 : 1-Gemisch von Aminosäure und Docosanol bei 110ºC synthetisieren. Anschließend suspendiert man die Esterhydrochloride in trockenem Chloroform und überführt sie in das freie Amin, indem man trockenen Ammoniak durch die Suspension leitet.
9. Langkettige Ester der Sulfobernsteinsäure mit polymerisierbaren Funktionen.
10. Langkettige Ester der Pyridiniumdicarbonsäuren (z. B. 3,5- Dicarboxy-1-methylpyridiniumiodid) mit polymerisierbaren Funktionen.
11. Iodierte Röntgenkontrastmittel mit langkettigen Ether- oder Estergruppen mit polymerisierbaren Funktionen. So kann zum Beispiel ein Röntgenkontrastmittel, das sich von der Iothalamsäure herleitet, mehrere N-Dihydroxyalkylgruppen haben, von denen eine oder zwei mit langkettigen Fettsäuren verestert sein können. So kann man zum Beispiel 1ohexol teilweise schützen, indem man ein Acetonidderivat von zwei der drei Dihydroxyalkylgruppen bildet, das man anschließend mit einer aktivierten Fettsäure, z. B. das Säurechlorid, umsetzt und dann die Acetonidschutzgruppen entfernt. Diese Amphiphile lassen sich durch Umsetzung mit einer Dicarbonsäure nach der Vesikelbildung ohne weiteres vernetzen.
12. Difettsäureester des Sorbits. Die vielen freien vorhandenen Hydroxylgruppen erlauben die Vernetzung durch Dicarbonsäuren. Alternativ können die veresternden Fettsäuregruppen für eine olefinische Additionspolymerisation ungesättigt sein.
13. Diester der Formel
R¹³-CO-O-CH(R¹&sup4;)-O-CO-R¹³,
worin R¹&sup4; eine hydrophile Gruppe ist und R¹³ jeweils für eine lipophile Gruppe steht und wenigstens eine der Gruppen R¹³ und R¹&sup4; eine polymerisierbare Gruppe und/oder funktionelle Gruppen zur Vernetzung trägt. Diese Verbindungen lassen sich durch Umsetzung eines Dihalogenids der Formel R¹&sup4;-CH-Hal&sub2; mit einem Salz einer Säure R¹³-COOH herstellen. Sie sind besonders leicht biologisch abbaubar.
Es kann auch vorteilhaft sein, wenn das einkapselnde Material ein oder mehrere weitere Amphiphile wie Cholesterol umfasst, die weder gebunden noch polymerisiert sind, aber die Stabilität und/oder Flexibilität der Mikrobläschen verbessern.
Wie zuvor erwähnt können die Mikrobläschen durch Einbau teilchenförmigen Materials zusammen mit dem eingekapseltem Gas stabilisiert werden. Zu solchen Teilchen gehören zum Beispiel Siliciumdioxid und Eisenoxid. Die bevorzugte Teilchengröße für diese stabilisierenden Teilchen liegt je nach Größe der Mikrobläschen im Bereich von 1 bis 500 nm. Die Partikel sollten nur teilweise durch die zum Dispergieren der Mizellen verwendete Flüssigkeit benetzt werden, d. h. der Benetzungswinkel sollte etwa 90 Grad betragen.
Die stabilisierenden Partikel können funktionelle Gruppen tragen, die mit dem Amphiphilen unter Bildung kovalenter oder anderer Bindungen wechselwirken. Partikel der polymerisierten Amphiphile der Formel (II) können in diesem Zusammenhang brauchbar sein. Kolloidale Siliciumdioxidpartikel können eine Partikelgröße im Bereich von 5 bis 50 nm haben und können Silanolgruppen an der Oberfläche tragen, die mit dem Amphiphil über Wasserstoffbrückenbindung oder durch Bildung kovalenter Bindungen wechselwirken können.
Die Amphiphile können das Gas oder einen Gasvorläufer durch Bildung einer Monoschicht an der Grenzfläche zwischen dem flüssigen Medium und dem Gas- oder Gasvorläufersystem, oder durch Bildung von Vesikeln, die aus einer oder mehreren das Gas oder den Gasvorläufer enthaltenden Schicht bestehen, stabilisieren. Das flüssige Medium kann Wasser oder eine nicht-wässrige Flüssigkeit mit polaren, protischen, aprotischen oder apolaren Eigenschaften sein.
Wie in der Literatur ausführlich beschrieben ist, lässt sich die Stabilisierung des Systems durch Monoschichten oder Mehrfachschichten oder die Bildung von Vesikeln durch Beschallen oder sogar durch Schütteln des amphiphilen Materialgemischs in einem geeigneten Medium aktivieren oder die Vesikel können nach üblichen Liposom/Vesikel-Bildungsverfahren hergestellt werden.
Die Amphiphile können übliche Mizellen oder inverse Mizellen bei Verwendung eines apolaren nicht-wässrigen Mediums bilden. Man kann die stabilisierten Systeme trocknen oder gefriertrocknen oder die nicht-wässrige Phase abdampfen. Man kann das erhaltene getrocknete System in einem beliebigen physiologisch verträglichen Lösungsmittel wie Kochsalzlösung oder Phosphatpuffer erneut suspendieren, gegebenenfalls unter Verwendung eines Suspensions- oder Emulgiermittels.
Die zur Stabilisierung der Vesikel angewandten Polymerisationsverfahren sind bekannte Verfahren der Polymerchemie, d. h. wie beschrieben in "Comprehensive Polymer Science", Bd. 1-7, Pergamon Press, Oxford 1989, oder "Methoden der Organischen Chemie, Houben- Weyl, Makromolekulare Stoffe, Band E20/1-3, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1987. Beispiele für geeignete Verfahren sind Kettenpolymerisationsverfahren wie ionische oder radikalische Polymerisation oder metallkatalysierte Polymerisation oder die Systeme polymerisieren spontan bei Bildung von Monoschichten oder Vesikeln durch Stufenwachstum-Polymerisation. Die Initiierung kann durch UV-Bestrahlung oder einfachen pH-Wechsel oder Radikalstarter erfolgen. Besonders interessant kann die Einkapselung einer Substanz sein, die bei geringfügiger Temperaturerhöhung ein Gas und gleichzeitig Radikale erzeugt, welche die Polymerisation der umgebenden Schale starten. Eine solche Substanz ist in "Comprehensive Polymer Science", Band 3, Pergamon Press, Oxford 1989, S. 99f beschrieben, d. h. Azobisisobutyronitril (AIBN), das bei UV-Bestrahlung oder bei Erwärmen auf 40ºC N&sub2; freizusetzen beginnt, während gleichzeitig zwei Moleküle des Cyanoisopropyl-Radikals entstehen, welche die Polymerisation auslösen können oder sich paaren. Die Polymerisation von Amphiphilen mit ungesättigten Gruppen kann auch durch Beschallung (siehe Price et al., Brit. Polym. J. 23 (1990), 63-66) gestartet werden, z. B. wenn diese Maßnahme zur Bildung einer Gas-in-Flüssigkeit-Emulsion genutzt wird, wie sie ausführlicher nachfolgend beschrieben wird.
Ein System mit eingeschlossenem Gas lässt sich sowohl unter Verwendung eines Gasvorläufers erhalten als auch durch Einschließen des Gases selber. Das Gas kann in das amphiphile Gemisch einfach durch kräftiges Schütteln des Gemisches in Gegenwart von Luft eingeschlossen werden, d. h. man erzeugt Gas-in-Flüssigkeit-Emulsion wie in der US 4684479 beschrieben. Ein weiteres übliches Verfahren zur Erzeugung eines Bläschen enthaltenden Gases ist die Beschallung eines Gemisches in Gegenwart von Luft, wie es z. B. in der US 4774958 beschrieben wird. Ein weiteres bekanntes Verfahren umfasst das Einleiten von Gas mit einer Spritze in ein Gemisch von Amphiphil und Flüssigkeit. Wie in der US 3900420 beschrieben, lässt sich die Mikrogasemulsion unter Verwendung eines Apparates zum raschen Einführen von Gas in eine schnell fließende Flüssigkeit erzeugen. Man erzeugt einen Niederdruckbereich in einer Flüssigkeit, die das Amphiphil enthält. Man leitet das Gas dann in das Niederdruckgebiet ein und erhält durch Pumpen der Flüssigkeit durch das System das Gas-in- Flüssigkeit-System.
Durch Anwendung des Elektrolyseprinzips ist es möglich, das einzuschließende Gas direkt in einem Behälter, der die Amphiphile enthält, zu erzeugen. Die für die Elektrolyse notwendigen Elektrolyte können sogar bei einer weiteren Stabilisierung der Amphiphile mitwirken, um die Polymerisation zu ermöglichen. Eine wässrige, Elektrolyte enthaltende Lösung kann Wasserstoffgas an der Kathode und Sauerstoff an der Anode erzeugen. Die Elektroden können über eine Salzbrücke getrennt sein. Bei Zugabe von Hydrazin kann Stickstoffgas an der Anode erzeugt werden. Unter Anwendung der Kolbe- Reaktion lässt sich durch Elektrolyse auch CO&sub2; aus Carbonsäuren freisetzen.
Wie zuvor beschrieben lassen sich Vesikel mit eingeschlossenem Gas durch Bildung von Liposomen oder Vesikel, die aus einer oder mehreren Doppelschichten bestehen, erhalten. Diese Vesikel können unter erhöhten Druckbedingungen so hergestellt werden, dass das Gas in den Vesikel eingeschlossen ist.
Es ist auch möglich eine flüssig-flüssig (z. B. Öl-in-Wasser) Emulsion in Gegenwart der zuvor beschriebenen amphiphilen Systeme z. B. durch Beschallung zu bilden, wobei Flüssigkeit enthaltende Vesikel gebildet werden, die dann polymerisiert werden können. Anschließend kann man aus den polymerisierten Vesikel die Flüssigkeit (in der Regel ein flüchtiger Kohlenwasserstoff) durch Abdampfen, falls der Siedepunkt der Flüssigkeit relativ niedrig ist, oder durch Extraktion mit einem niedrig siedenden Lösungsmittel, das seinerseits durch Abdampfen entfernt werden kann, entfernen. Die Verflüchtigung der niedrig siedenden flüssigen Kerne kann auch spontan während der Beschallung erfolgen. Wenn die Flüssigkeit in den Vesikel Wasser ist, so lässt sie sich durch Gefriertrocknung entfernen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Bis-Linoleyl-Lecithin kann von der Firma Lipids Products, Surrey, UK käuflich erworben werden.

Beispiel 1

Zur Herstellung einer gesättigten Lösung des Bis-Linoleyl- Lecithins in einem wässrigen Medium mischt man 100 mg des Amphiphils in 100 mL sterilem, pyrogenfreiem Wasser. Man filtert die gesättigte Lösung durch einen 0,45 um Filter und beschallt die erhaltene Lösung 1 bis 10 Minuten in Gegenwart von Luft. Während der Beschallung wird Luft in die Lösung eingeschlossen und man erhält eine Gas-in-Flüssigkeit-Emulsion. Die Polymerisation der Monoschicht des Amphiphils an der Gas-flüssig-Grenzfläche erfolgt durch UV-Bestrahlung der Lösung bei 254 nm mit einer Xenon-Lampe oder durch Zugabe eines Radikalstarters.
Das erhaltene Produkt enthält Mikrokugeln mit eingeschlossenem Gas. Die Mikrokugeln werden vom überschüssigen polymerisierten Amphiphil mit Hilfe eines Scheidetrichters abgetrennt. Die erhaltenen Mikrokugeln werden in steriler, pyrogenfreier Kochsalzlösiung erneut suspendiert und in 10 mL Phiolen abgefüllt. Das Produkt wird unter Anwendung aseptischer Verfahren in einem "Reinraum" (LAF-Station) hergestellt und man erhält ein steriles, pyrogenfreies Produkt. Die Partikelgrößen der Mikrokugeln liegen im Bereich von 0,5 bis 10 um.

Beispiel 2

Man wiederholt Beispiel 1 und verwendet als polymerisierbares Amphiphil die Verbindung Bis-(trieicoso-10,12-diinoyl)phosphatidylcholin (Hirt et al.; Helv. Chim. Acta 40, 957, 1928).

Beispiel 3

100 mg Bis-Linoleyl-Lecithin werden in einem Gemisch aus Chloroform/Methanol gelöst. Man gießt das Gemisch in einen Rundhalskolben und dampft die organische Phase mit einem Rotationsverdampfer so ab, dass sich ein dünner Film des Lecithin-Derivates an der inneren Oberfläche des Kolbens bildet. Man fügt 10 ml steriles, pyrogenfreies Wasser hinzu und dispergiert die Lipide in der Lösung, indem man 5 bis 15 Minuten an der Luft/Flüssigkeit-Phasengrenzfläche beschallt. Es bilden sich Vesikel mit eingeschlossenem Gas und die Gas enthaltenden Mikrokugeln werden durch UV-Bestrahlung der Lösung bei 254 nm unter Verwendung einer Xenonlampe oder durch Zugabe eines Radikalstarters unter kontinuierlichem Rühren polymerisiert. Man trennt die polymerisierten Vesikel mit eingeschlossenem Gas von überschüssigen polymerisierten Amphiphilen mit Hilfe eines Scheidetrichters ab. Die erhaltenen Vesikel werden in steriler, pyrogenfreier Kochsalzlösung suspendiert und filtriert, wobei man ein Produkt erhält, das Mikrokugeln im Bereich von 0,5 bis 5 um enthält. Das Produkt wird unter Anwendung aseptischer Verfahren in einem "Reinraum" (LAF-Station) hergestellt und man erhält ein steriles, pyrogenfreies Produkt. Das Endprodukt wird in 10 mL Phiolen abgefüllt.

Beispiel 4

Man wiederholt Beispiel 3 und verwendet als polymerisierbares Amphiphil die Verbindung Bis-(trieicoso-10,12-diinoyl)phosphatidylcholin (Hirt et al.; Helv. Chim. Acta 40, 957, 1928).

Herstellung der polymerisierbaren Amphiphile

Beispiel 5

Tetraethylenglycolmono-12-(methacryloyloxy)dodecanoat

12-(Methacryloyloxy)dodecansäure (Regen et al., J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 795) (2,75 g, 9,65 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (45 mL) gelöst und anschließend tropfte man eine Lösung von Oxalylchlorid (2,1 mL, 24,2 mmol) in Tetrahydrofuran (5 mL) zu. Man rührte das Gemisch 24 Stunden bei Raumtemperatur und dampfte anschließend das Lösungsmittel bei vermindertem Druck ab. Der Rückstand wurde in Tetrahydrofuran (25 mL) gelöst und tropfenweise zu einer Lösung von Tetraethylenglycol (1,88 g, 9,65 mmol) und Pyridin (0,92 g, 11,7 mmol) in Tetrahydrofuran (35 mL) gegeben. Man rührte das Gemisch 24 Stunden bei Raumtemperatur. Das ausgefallene Pyridiniumsalz wurde abfiltriert und das Lösungsmittel abgedampft. Die chromatographische Reinigung an einer Kieselgelsäule (Ethylacetat) ergab 1,67 g (38%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,3 (br s, 18 H, (CH&sub2;)&sub9;), 1,95 (m, 3H, C=CCH&sub3;), 2,1-2,6 (m, 2H, CH&sub2;COO), 3,5-3,8 (m, 14H, 3xCH&sub2;OCH&sub2;CH&sub2; + COOCH&sub2;CH&sub2;), 4,0-4,4 (m, 4H, COOCH&sub2;), 5,52 (m, 1H, Vinyl), 6,10 (m, 1H, Vinyl).

Beispiel 6

Polyethylenglycol(550)methylether-12-(methacryloyloxy)dodecanoat

12-(Methacryloyloxy)dodecansäure (1,90 g, 6,69 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (20 mL) gelöst und anschließend gab man tropfenweise eine Lösung von Oxalylchlorid (2,12 g, 16,7 mmol) in Tetrahydrofuran (10 mL) hinzu. Man rührte das Gemisch 24 Stunden bei Raumtemperatur und dampfte anschließend das Lösungsmittel bei vermindertem Druck ab. Der Rückstand wurde in Tetrahydrofuran (10 mL) gelöst und tropfenweise zu einer Lösung von Polyethylenglycol(550)monomethylether (3,68 g, 6,69 mmol) und Pyridin (0,53 g, 6,69 mmol) in Tetrahydrofuran (25 mL) gegeben. Man rührte das Gemisch 24 Stunden bei Raumtemperatur. Das ausgefallene Pyridiniumsalz wurde abfiltriert und das Lösungsmittel abgedampft. Die chromatographische Reinigung an einer Kieselgelsäule (Chloroform) ergab 2,31 g (42,3%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,3 (br s, 18 H, (CH&sub2;)&sub9;), 1,95 (m, 3H, C=CCH&sub3;), 2,1-2,5 (m, 2H, CH&sub2;COO), 3,11 (s, 3H, CH&sub3;O), 3,5-3,8 (m, 25H (im Durchschnitt), CH&sub2;OCH&sub2;CH&sub2; + COOCH&sub2;CH&sub2;), 3,9-4,4 (m, 4H, COOCH&sub2;), 5,52 (m, 1H, Vinyl), 6,10 (m, 1H, Vinyl).

Beispiel 7

Polyethylenglycol(2000)methylether-12-(methacryloyloxy)dodecanoat

12-(Methacryloyloxy)dodecansäure (2,84 g, 0,01 mol) in Tetrahydrofuran (20 mL) wurde mit Oxalylchlorid (3,0 g, 0,024 mol) zum entsprechenden Säurechlorid umgesetzt. Dieses Säurechlorid (3,0 g, 0,01 mol) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (10 mL) gelöst und tropfenweise zu einem Gemisch von Polyethylenglycol(2000)monomethylether (20,0 g, 0,01 mol) und wasserfreiem Pyridin (0,83 g, 0,01 mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (300 mL) gegeben. Man rührte das Gemisch 48 Stunden bei Raumtemperatur. Die erhaltene Flüssigkeit wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselgel/Ethylacetat) gereinigt und man erhielt 16,5 g (75%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,20 (s, 18 H, CH&sub2;), 2,15 (m, 2H, CH&sub2;COOH), 3,5 (s, 3H, CH&sub3;O), 3,6 (s, 18 OH, 90xCH&sub2;O), 4,0 (m, 4H, COOCH&sub2;), 5,7- 6,0 (m, 3H, CH&sub2;= und =CH).

Beispiel 8

a) 16-(Methacryloyloxy)hexadecansäure

16-Hydroxyhexadecansäure (6,81 g, 25,0 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (150 mL) gelöst und die Lösung vor der Zugabe von Pyridin (2,73 g, 34,5 mmol) auf 0ºC gekühlt. Man löste Methacryloylchlorid (2,61 g, 25 mmol) in Tetrahydrofuran (75 mL) und tropfte zu. Man rührte das Gemisch 1 Stunde bei 0ºC und anschließend 24 Stunden bei Raumtemperatur. Man entfernte das Lösungsmittel unter vermindertem Druck (Raumtemperatur), suspendierte den Rückstand in Ether (100 mL) und wusch das Gemisch mit destilliertem Wasser. Die Etherphase wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und der Ether abgedampft. Die chromatographische Reinigung an einer Kieselgelsäule (1 : 2 Ethylacetat/Hexan) ergab 5,0 g (64 s) der Titelverbindung.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,3 (br s, 26 H, (CH&sub2;)&sub1;&sub3;), 1,95 (m, 3H, C=CCH&sub3;), 2,1-2,6 (m, 2H, CH&sub2;COO), 4,0-4,4 (m, 2H, COOCH&sub2;), 5,52 (m, 1H, Vinyl), 6,10 (m, 1H, Vinyl).

b) Tetraethylenglycolmono-16-(methacryloyloxy)hexadecanoat

16-(Methacryloyloxy)hexadecansäure (2,05 g, 6,57 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (25 mL) gelöst und eine Lösung von Oxalylchlorid (1,4 mL, 16,5 mmol) in Tetrahydrofuran (10 mL) zugetropft. Man rührte das Gemisch 24 Stunde bei Raumtemperatur und entfernte anschließend das Lösungsmittel unter vermindertem Druck. Der Rückstand wurde in Tetrahydofuran (10 mL) gelöst und zu einer Lösung von Tetraethylenglycol (1,07 g, 5,50 mmol) und Pyridin (0,44 g, 5,50 mmol) in Tetrahydrofuran (25 mL) getropft. Man rührte das Gemisch 24 Stunden bei Raumtemperatur. Das ausgefallene Pyridiniumsalz wurde abfiltriert und das Lösungsmittel verdampft. Die chromatographische Reinigung an einer Kieselgelsäule (2 : 1 Ethylacetat/Hexan) ergab 0,84 g (30%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,3 (br s, 26 H, (CH&sub2;)&sub1;&sub3;), 1,95 (m, 3H, C=CCH&sub3;), 2,1-2,6 (m, 2H, CH&sub2;COO), 3,5-3,8 (m, 14H, 3xCH&sub2;OCH&sub2;CH&sub2; + COOCH&sub2;CH&sub2;), 4,0-4,4 (m, 4H, COOCH&sub2;), 5,52 (m, 1H, Vinyl), 6,10 (m, 1H, Vinyl).

Beispiel 9

Poylethylenglycol(350)methylether-16-(methacrylolyoxy)hexadecanoat

Nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren erhielt man ausgehend von 16-(Methacryloyloxy)hexadecansäure (aus Beispiel 8(a)) und Polyethylenglycol(350)monoethylether das Produkt.

Beispiel 10

a) 12-(Acryloyloxy)dodecansäure

12-Hydroxydodecansäure (5,0 g, 0,023 mol) wurde in Tetrahydrofuran (100 mL) und Pyridin (2,16 g, 0,027 mol) gelöst und auf 0ºC gekühlt. Anschließend tropfte man Acryloylchlorid (3,15 g, 0,023 mol) in Tetrahydrofuran (75 mL) zu. Man rührte das Gemisch 5 Stunde bei 0ºC und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Das ausgefallenen Pyridiniumsalz wurde abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die erhaltene Flüssigkeit wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselgel/Chloroform) gereinigt und man erhielt 2,5 g (40 %) der Titelverbindung.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,20 (s, 18 H, CH&sub2;), 2,15 (m, 2H, CH&sub2;COOH) 4,0 (m, 2H, COOCH&sub2;), 5,7-6,0 (m, 3H, CH&sub2;= und =CH).

b) Tetraethylenglycolmono-12-(acryloyloxy)dodecanoat

12-Acryloyloxydodecansäure (2,00 g, 0,007 mol) in Diethylether (20 mL) wurde mit Oxalylchlorid (2,40 g, 0,019 mol) zum entsprechenden Säurechlorid umgesetzt. Das Säurechlorid (1,80 g, 0,006 mol) wurde in wasserfreiem Chloroform (10 mL) gelöst und zu einem Gemisch von Tetraethylenglycol (1,20 g, 0,006 mol) und wasserfreiem Pyridin (0,50 g, 0,006 mol) in wasserfreiem Chloroform (30 tut) getropft. Man rührte das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Flüssigkeit wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselgel/Ethylacetat) gereinigt und man erhielt 1,10 g (40%) der Titelverbindung als farbloses Öl.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,20 (s, 18H, CH&sub2;), 2,15 (m, 2H, CH&sub2;COOH), 3,50 (s, 3H, CH&sub3;O), 3,6 (s, 14H, 7xCH&sub2;O), 4,0 (m, 5H, 2xCOOCH&sub2; und OH), 5,7-6,0 (m, 3H, CH&sub2;= und =CH).

Beispiel 11

Tetraethylenglycolmono-10,12-tricosadiinoat

10,12-Tricosadiinsäure (2,50 g, 0,007 mol) in Tetrahydrofuran (30 mL) wurde mit Oxalylchlorid (2,25 g, 0,017 mol) zum entsprechenden Säurechlorid umgesetzt. Dieses Säurechlorid (2,45 g, 0,007 mol) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (10 tut) gelöst und tropfenweise zu einem Gemisch von Tetraethylenglycol (1,32 g, 0,007 mol) und wasserfreiem Pyridin (0,83 g, 0,01 mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (40 mL) getropft. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Pyridiniumsalz wurde abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die erhaltene Flüssigkeit wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselgel/Ethylacetat) gereinigt und man erhielt 1,50 g (41%) der Titelverbindung als farbloses Öl.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 0,88 (m, 3H, CH&sub3;CH&sub2;), 1,30 (m, 28H, CH&sub2;), 2,20 (m, 6H, CH&sub2;), 3,65 (s, 14H, 7xCH&sub2;O), 4,20 (m, 2H, CH&sub2;CO).

Beispiel 12

Polyethylenglycol(550)methylether-10,12-tricosadiinoat

10,12-Tricosadiinsäure (2,50 g, 0,007 mol) in Tetrahydrofuran (30 mL) wurde mit Oxalylchlorid (2,25 g, 0,017 mol) zum entsprechenden Säurechlorid umgesetzt. Dieses Säurechlorid (2,45 g, 0,007 mol) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (10 mL) gelöst und tropfenweise zu einem Gemisch von Polyethylenglycol(550)monomethylether (3,85 g, 0,007 mol) und wasserfreiem Pyridin (0,83 g, 0,01 mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (30 mL) getropft. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Pyridiniumsalz wurde abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die erhaltene Flüssigkeit wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselgel/Ethylacetat) gereinigt und man erhielt 2,72 g (41%) der Titelverbindung als farbloses Öl.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;) δ 0,88 (m, 3H, CH&sub3;CH&sub2;), 1,30 (m, 28H, CH&sub2;), 2,20 (m, 6H, CH&sub2;), 3,65 (s, 48H, 24xCH&sub2;O), 3,50 (s, 3H, CH&sub3;O), 4,20 (m, 2H, CH&sub2;O).

Beispiel 13

a) Methyl-10,12-tricosadiinoat

10,12-Tricosadiinsäure (3,0 g, 0,0084 mol), Methanol (15 mL) und konzentrierte Schwefelsäure (0,8 tut) wurden unter Rühren 1 Stunde zum Rückfluss erhitzt. Man nahm das abgekühlte Gemisch in Ether (40 mL) auf, wusch mit 10%igem NaHCO&sub3; (20 mL) und Wasser (20 mL) und trocknete die organische Phase (MgSO&sub4;). Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhielt man 2,68 g (74%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 0,98 (m, 3H, CH&sub3;CH&sub2;), 1,28 (m, 28H, CH&sub2;), 2,25 (m, 6H, CH&sub2;), 3,70 (s, 3H, CH&sub3;O).

b) N-(2',3'-Dihydroxypropyl)-10,12-tricosadiinamid

Methyl-10,12-tricosadiinoat (1,69 g, 4,67 mmol) wurde in Methanol gelöst. Man fügte 3-Amino-1,2-propandiol (0,509 g, 5,6 mmol) und eine 2,5%ige Lösung von Natriummethoxid in Methanol (0,146 g, 3 mol%) hinzu Man erhitzte das Gemisch 3 Stunden unter Rückfluss und dampfte das Lösungsmittel ab. Die Kristallisation des Rohproduktes aus Chloroform ergab 1,00 g (51%).
¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): δ 0,7-1,0 (m, 3H, CH&sub3; CH&sub2;), 1,3 (s, br, 28H, CH&sub2;), 2,0-2,4 (m, 6H, CH&sub2;), 3,3-3,8 (m, 5H, 2xCH&sub2; und CH (Propandiol)), 6,0-6,3 (m, 1H, NH).

Beispiel 14

N,N'-Bis(2,3-dihydroxypropyl)2,4,6-triiod-5-(tricosa-10,12- diinoylamino)isophthalamid

5-Amino-N,N'-bis(2,3-diacetoxypropyl)-2,4,6-triiodisophthalamid (2,19 g, 2,5 mmol) und 10,12-Tricosadiinoylchlorid (1,82 g, 5 mmol) wurden in 20 mL Dichlormethan gelöst. Man rührte unter Stickstoff die Lösung 3 Tage bei Raumtemperatur. Die TLC-Kontrolle (Ethylacetat) belegte die Vollständigkeit der Umsetzung. Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft und in einem Gemisch von Methanol (30 mL) und 1M Natriumhydroxidlösung (15 mL) gelöst. Nach 1 Stunde war laut TLC (Methanol/Chloroform) die Umsetzung vollständig. Man neutralisierte die Lösung mit konzentrierter Salzsäure. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst und filtriert. Das Lösungsmittel wurde entfernt und die Reinigung des Rückstandes an Kieselgel mit Methanol/Chloroform (1 : 3) ergab die Titelverbindung.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO): δ 0,8 (CH&sub3;, t), 1,2-1,7 (17x CH&sub2;, m), 2,2-2,3 (2xCH&sub2;, t), 3,1-3,2 (2xCH&sub2;NH, m), 3,3-3,5 (2xCH&sub2;OH, m), 3,6-3,8 (2xCHOH), 4,4-4,7 (4xOH, m), 8,4-8,5 (2xCONH, m), 9,8 (2xArNHCO, s).

Beispiel 15

N-(3',4',5'-Trihydroxy-6'-hydroxymethyltetrahydropyran-2'-yl)-10,12- tricosadiinamid

1-Amino-1-deoxy-β-D-galaktose (180 mg, 1 mmol), 10,12-Tricosadiinsäure (350 mg, 1 mmol) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid wurden in 25 mL trockenem Dimethylformamid gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Man entfernte das Lösungsmittel im Vakuum, löste den Rückstand in Chlorform/Methanol (1 : 1), filtrierte und reinigte durch Straight Phase Chromatographie an einem CHROMATO- TRON. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum eingeengt und das Produkt durch NMR charakterisiert.

Beispiel 16

6-(2',6'-Diaminohexanoylamino)-3,4,5-trihydroxytetrahydropyran-2- ylmethyl-10,12-tricosadiinoat

1-Amino-1-deoxy-β-D-galaktose (180 mg, 1 mmol) und Fmoc-Lys(Boc)-OPfp (650 mg, 1 mmol) wurden in 4 mL trockenem Dimethylformamid gelöst und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand wurde in Acetonitril/Wasser (1 : 1) gelöst, filtriert und durch Umkehrphasenchromatographie (Lobar RPBB, Acetonitril/Wasser 50 : 50 und 65 : 35) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum eingeengt und das Produkt durch NMR charakterisiert. Das gereinigte Produkt (1 g, 1 mmol), 10,12-Tricosadiinsäure (350 mg, 1 mmol) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid wurde in 10 mL trockenem Dimethylformamid gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Man entfernte das Lösungsmittel im Vakuum, löste den Rückstand in Chlorform/Methanol (95 : 5), filtrierte und reinigte durch Straight Phase Chromatographie an einem CHROMATOTRON. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum eingeengt und das Produkt durch NMR charakterisiert. Die Schutzgruppen der α-s-Aminogruppen wurden mit Standardreaktionen entfernt. Boc ließ sich durch 30-minütiges Behandeln mit Trifluoressigsäure/Methylenchlorid entfernen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Fmoc ließ sich durch 30-minütiges Umsetzen des Rückstandes mit 20%igem Piperidin in Dimethylformamid entfernen. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasenchromatographie (Lobar RPBB) gereinigt.

Beispiel 17

(3,4,5,6-Tetrahydroxytetrahydropyran-2-ylmethyl)-10,12- tricosodiinoat

1,2;3,4-Di-O-Isopropyliden-D-galaktopyranose (2,6 g, 10 mmol) und 10,12-Tricosadiinsäure (3,5 g, 10 mmol) wurden in 25 mL Methylenchlorid gelöst. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (2 g, > 10 mmol) wurde hinzugefügt. Man rührte das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde auf 100 mL verdünnt, mit Wasser (2 · 25 mL) extrahiert, über MgSO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man behandelte das Rohprodukt 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäure (10 mL), dampfte im Vakuum ein und reinigte durch Straight Phase Chromatographie an einem CHROMATOTRON, Eluent: Methanol/Chlorform (5 : 95). Das Produkt wurde durch NMR charakterisiert.

Herstellung von Ultraschallkontrastmitteln

Beispiele 18-41

i) Allgemeines Herstellungsverfahren

Das polymerisierbare Amphiphil wurde in einer minimalen Menge Methanol gelöst und zu einem Gemisch aus Wasser und Kohlenwasserstoff gegeben. Gegebenenfalls fügte man ein Comonomer und/oder 2,2'- Azobisisobutyronitril (AIBN), gelöst in einer minimalen Menge Methylenchlorid hinzu und leitete 1 Minute Stickstoff durch das Gemisch, beschallte anschließend unter Stickstoff das Gemisch mit einem LAB- SONIC 2000 Gerät, platzierte die Beschallungsprobe (Länge 127 mm, Durchmesser 9,5 mm) 2 bis 3 cm unterhalb der Oberfläche des Gemischs bei "maximaler Stellung" oder "halber Stellung" der Energie auf der Messskala bei niedriger Einstellung. Gegebenenfalls wurden die erhaltenen Emulsionen unter Stickstoff mit UV-Licht bestrahlt oder mit einem Redoxstarter versetzt, der Kalimmetabisulfit (0,05 g, 0,22 mmol) in Wasser (1 mL) und Kaliumperoxosulfat (0,0023 g, 3,3 · 10&supmin;³ mmol) in Wasser (1 mL) enthielt. Das Verfahren wurde in Beispiel 31 dahingehend abgewandelt, dass man AIBN hinzufügte und das Gemisch anschließend mit der Hand schüttelte, anschließend einen ersten Teil des Comonomers hinzufügte und beschallte, während man Stickstoffgas durch die Lösung leitete. Anschließend fügte man eine weitere Menge an Comonomer hinzu und unterwarf die erhaltene Emulsion der UV- Bestrahlung.
Die in jedem Beispiel angewandten speziellen Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 1 aufgelistet. Man kann ähnliche Reaktionsbedingungen beim Behandeln der in den Beispielen 14 bis 17 hergestellten Amphiphile anwenden, z. B. Beschallung bei maximaler Stellung auf der Messskala für 5 Minuten und einstündige Bestrahlung oder Zugabe des zuvor beschriebenen Redoxstartersystems und sorgfältiges Rühren über 30 Minuten. Tabelle 1: Reaktionsbedingungen
Legende:
PB Petrolether (Sdp, 40-60ºC); IP Isopentan;
TG Toluol; MM Methylmethacrylat;
ST Styrol;
fs maximale Stellung;
hs halbe Stellung
* Menge des Kaliumperoxosulfats wurde auf 0,002 g (0,003 mmol) reduziert.

ii) Akustische Charakterisierung

Man untersuchte die akustischen Wirkung der Produkte aus den Beispielen 18 bis 41 durch Messung ihrer Ultraschalldurchlässigkeit als Funktion der Zeit über eine Zeitdauer von 90 Sekunden. Man führte die Untersuchungen an Proben des emulgierten Materials durch, wie man es unmittelbar nach der Beschallung erhielt oder an Material nach UV-Bestrahlung oder Redoxinitiierung. Hinsichtlich des Beispiels 25 wurde die Probe nach der Bestrahlung entnommen und nach Verdünnung mit Wasser (1 : 1) erneut untersucht. Im Falle des Beispiels 31 untersuchte man auch eine Probe, die man nach dem manuellen Schütteln entnommen hatte. Man verwendete einen 3,5 MHz Breitband-Transducer nach einem Impuls-Reflexion-Verfahren. Alle Anzeigen waren während der 90 sekündigen Messdauer stabil, so dass ein einziger Wert (in dB/cm) für die Beschreibung jeder 90-sekündigen Messung ausreichend ist. In bestimmten Fällen wurden zur weiteren Untersuchung der Stabilität der Ultraschallkontrastmittel die Messungen in Zeitabständen wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt, die Zeitintervalle (gemessen in Minuten nach der Beschallung) zur akustischen Charakterisierung sind für jede Messung in Klammern angegeben. Tabelle 2 Akustische Eigenschaften

iii) Mikroskopische Analyse

Ausgewählte Produkte der Beispiele 18-41 wurden mit einem Lichtmikroskop (Nikin UFX-II) mit einer Mikrometerskala untersucht. In der Regel führte man die Untersuchungen dergestalt durch, dass man Proben von emulgiertem Material, wie es unmittelbar nach der Beschallung gebildet wurde, entnahm, abgesehen von Beispiel 31 (Probeentnahme nach manuellem Schütteln), Beispiel 39 (Probeentnahme nach UV-Bestrahlung) und Beispiel 40 (Probeentnahme sowohl sofort nach der Beschallung und nach Redoxinitiierung) und jede Probe zwischen zwei Glasplatten platzierte. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 3 dargestellt; die Zeitabstände (angegeben in Minuten nach der Beschallung) bis zur mikroskopischen Analyse sind für jede Probe angegeben. Tabelle 3 Mikroskopische Analyse

iv) Größenausschlusschromatographie

Man führte die Größenausschluss-Chromatographie (SEC) an dem gefriergetrocknetem Produkt aus Beispiel 25 unter Verwendung von Tetrahydrofuran (Rathburn HPLC Qualität) als Eluent und des Brechungsindex als Detektor (Knauer, Deutschland) durch. Das verwendete Säulenset bestand aus 3 · 30 cm Säulen, die 5 jzm Styrogel mit Porengrößen von 10&sup5;, 10&sup4; und 500 Å (Polymer Laboratories Ltd., England) enthielten. Die Kalibrierung erfolgte gegen Polystyrolstandard (Polymer Laboratories Ltd., England). Das amphiphile monomere Ausgangsmaterial hatte ein maximales Molekulargewicht von 1600 Dalton und das polymere Produkt ein maximales Molekulargewicht von 22000 Daltons, jeweils in Polystyroläquivalente angegeben. Bei Verwendung des Umwandlungsfaktors von 0,59 zur Umwandlung von Polystyroläquivalente in "reale" Molekulargewichte (der Wert für PEG ist Dawkins et al., J, Liq, Chromatog, 7, 1739 (1984) entnommen), entspricht dies Molekulargewichten von 944 Daltons für das Monomer beziehungsweise 13000 Daltons für das Polymer.

Claims

1. Gasgefüllte Mikrobläschen enthaltende Kontrastmittel zur Verwendung in diagnostischen Ultraschalluntersuchungen, umfassend in Monoschichten oder eine oder mehrere Doppelschichten nicht-proteinhaltiger vernetzter oder polymerisierter amphiphiler Molekülteile eingekapselte Gasmikrobläschen, mit der Maßgabe, dass (i) die vernetzten oder polymerisierten amphiphilen Molekülteile kein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polymer bilden und (ii) das Kontrastmittel keine Polyaldehyd-Mikropartikel enthält.

2. Kontrastmittel nach Anspruch 1, worin die vernetzten oder polymerisierten amphiphilen Molekülteile biologisch abbaubare Bindungen enthalten.

3. Kontrastmittel nach Anspruch 2, worin die biologisch abbaubaren Bindungen in den amphiphilen Molekülteilen vorliegen.

4. Kontrastmittel nach Anspruch 3, worin die biologisch abbaubaren Bindungen in den hydrophilen Teilen der amphiphilen Molekülteile vorliegen.

5. Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 4, enthaltend unter Amid-, Imid-, Imin-, Ester-, Anhydrid-, Acetal-, Carbamat-, Carbonat-, Kohlensäureester- und Disulfidgruppen ausgewählte biologisch abbaubare Bindungen.

6. Kontrastmittel nach Anspruch 5, enthaltend biologisch abbaubare vernetzende Gruppen.

7. Kontrastmittel nach Anspruch 6, worin die biologisch abbaubaren vernetzenden Gruppen Einheiten der Formel

-(Y)n-CO-O-C(R¹R²)-O-CO-(Z)n-

enthalten (worin Y und Z, die gleich oder verschieden sein können, für -O-, -S- oder -NR³ stehen; R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, für Wasserstoffatome oder kohlenstoffgebundene, monovalente organische Gruppen stehen oder zusammen eine kohlenstoffgebundene, divalente organische Gruppe bilden; R³ für ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe steht; und die Symbole n, die gleich oder verschieden sein können, null oder eins sind).

8. Kontrastmittel nach Anspruch 1, erhalten aus polymerisierbaren amphiphilen Molekülteilen, die ungesättigte lipophile Ketten enthalten:

9. Kontrastmittel nach Anspruch 8, worin die ungesättigten lipophilen Ketten Oleyl- oder Linoleylgruppen sind oder Diacetylengruppierungen oder Acryloyl- oder Methacryloylgruppierungen enthalten.

10. Kontrastmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die hydrophilen Anteile der amphiphilen Molekülteile eine oder mehrere unter quaternärem Ammonium, Hydroxyl, Carboxyl, Carboxylat, Amid, Phosphat, Sulfat und Sulfonat ausgewählte Gruppen enthalten.

11. Kontrastmittel nach Anspruch 10, worin die hydrophilen Anteile der amphiphilen Molekülteile den Triglycerylteil eines Phospholipids, ein iodiertes Röntgenkontrastmittel, ein Kohlenhydrat oder einen Cholin-, Ethanolamin-, Serin- oder Glycerinrest umfassen.

12. Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die hydrophilen Anteile der amphiphilen Molekülteile einen Polyoxyethylenglycolrest oder einen veretherten Polyoxyethylenglycolrest umfassen.

13. Kontrastmittel nach Anspruch 12, worin die amphiphilen Molekülteile Tetraethylenglycolmono-12-(methacryloyloxy)dodecanoat enthalten.

14. Kontrastmittel nach Anspruch 12, worin die amphiphilen Molekülteile Polyethylenglycol(550)methylether-12-(methacryloyloxy)dodecanoat enthalten.

15. Kontrastmittel nach Anspruch 12, worin die amphiphilen Molekülteile Polyethylenglycol(2000)methylether-12-(methacryloyloxy)dodecanoat enthalten.

16. Kontrastmittel nach Anspruch 12, worin die amphiphilen Molekülteile Tetraethylenglycolmono-16-(methacryloyloxy)hexadecanoat enthalten.

17. Kontrastmittel nach Anspruch 12, worin die amphiphilen Molekülteile Polyethylenglycol(350)methylether-16-(methacryloyloxy)hexadecanoat enthalten.

18. Kontrastmittel nach Anspruch 12, worin die amphiphilen Molekülteile Tetraethylenglycolmono-12-(acryloyloxy)dodecanoat enthalten.

19. Kontrastmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Mikrobläschen ein unter Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Wasserstoff, Lachgas, Kohlendioxid, Helium, Argon, Schwefelhexafluorid und bei 37ºC gasförmigen, gegebenenfalls fluorierten, niedermolekularen Kohlenwasserstoffen ausgewähltes Gas enthalten.

20. Kontrastmittel nach Anspruch 19, worin das Gas Schwefelhexafluorid oder einen fluorierten, bei 37ºC gasförmigen, niedermolekularen Kohlenwasserstoff umfasst.

21. Kontrastmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die außerdem einen anorganischen, teilchenförmigen Stabilisator enthalten.

22. Kontrastmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Mikrobläschen eine durchschnittliche Größe von 0,1 bis 10 um aufweisen.

23. Kontrastmittel nach Anspruch 22, worin die Mikrobläschen eine durchschnittliche Größe von 1 bis 7 um aufweisen.

24. Kontrastmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer in vivo-Halbwertzeit von weniger als 48 Stunden.

25. Kontrastmittel nach Anspruch 24 mit einer in vivo-Halbwertzeit von 1 bis 12 Stunden.

26. Verfahren zur Herstellung eines Kontrastmittels nach Anspruch 1, bei dem man eine fluide Dispersion von Vesikeln bildet, die ein in Monoschichten oder eine oder mehrere Doppelschichten des nichtproteinhaltigen amphiphilen Materials eingekapseltes Gas oder einen Vorläufer dafür enthalten, und das amphiphile Material anschließend vernetzt oder polymerisiert.

27. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem man die fluide Dispersion durch Beschallung unter Bildung einer Öl-in-Wasser-Emulsion herstellt, in der ein flüchtiger Kohlenwasserstoff in Monoschichten oder eine oder mehrere Doppelschichten des amphiphilen Materials eingekapselt ist und der flüchtige Kohlenwasserstoff nach Vernetzung oder Polymerisation des amphiphilen Materials teilweise oder vollständig aus den Vesikeln entfernt wird.

28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem man das Kontrastmittel durch Gefriertrocknung isoliert.

29. Fluide Dispersion von Vesikeln, die zur Herstellung eines Ultraschallkontrastmittels geeignet ist, worin die Vesikel Schwefelhexafluorid oder einen fluorierten, bei 37ºC gasförmigen niedermolekularen Kohlenwasserstoff enthalten, die in Monoschichten oder eine oder mehrere Doppelschichten eines nicht-proteinhaltigen amphiphilen Materials eingekapselt sind, wobei das amphiphile Material keinen polymerisierbaren Aldehyd umfasst.

30. Fluide Dispersion nach Anspruch 29, worin die hydrophilen Anteile des amphiphilen Materials eine oder mehrere unter quaternärem Ammonium, Hydroxyl, Carboxyl, Carboxylat, Amid, Phosphat, Sulfat und Sulfonat ausgewählte Gruppen enthalten.

31. Fluide Dispersion nach Anspruch 30, worin die hydrophilen Anteile des amphiphilen Materials den Triglycerylteil eines Phospholipids, ein iodiertes Röntgenkontrastmittel, ein Kohlenhydrat oder einen Cholin-, Ethanolamin-, Serin- oder Glycerinrest umfassen.

32. Fluide Dispersion nach einem der Ansprüche 29 bis 31, worin die hydrophilen Anteile des amphiphilen Materials einen Polyoxyethylenglycolrest oder einen veretherten Polyoxyethylenglycolrest enthalten.

33. Fluide Dispersion nach Anspruch 29, worin das amphiphile Material ein Phospholipid enthält.

34. Fluide Dispersion nach einem der Ansprüche 29 bis 33, worin die Vesikel eine durchschnittliche Größe von 0,1 bis 10 um aufweisen.

35. Fluide Dispersion nach Anspruch 34, worin die Vesikel eine durchschnittliche Größe von 1 bis 7 um aufweisen.

36. Verfahren zur Herstellung eines Ultraschallkontrastmittels, bei dem man eine fluide Dispersion von Vesikeln, die Schwefelhexafluorid oder einen fluorierten, bei 37ºC gasförmigen niedermolekularen Kohlenwasserstoff enthalten, die in Monoschichten oder eine oder mehrere Doppelschichten eines nicht-proteinhaltigen amphiphilen Materials eingekapselt sind, welches keinen polymerisierbaren Aldehyd umfasst, erzeugt, indem man das nicht-proteinhaltige amphiphile Material in Wasser in Gegenwart des Schwefelhexafluorids oder fluorierten Kohlenwasserstoffs schüttelt oder beschallt.

37. Öl-in-Wasser-Emulsion, die zur Herstellung eines Ultraschallkontrastmittels geeignet ist, worin die Ölphase der Emulsion aus einem flüchtigen, in Monoschichten oder eine oder mehrere Doppelschichten eines nicht-proteinhaltigen amphiphilen Materials eingekapselten Kohlenwasserstoff besteht, wobei das nicht-proteinhaltige amphiphile Material keinen polymerisierbaren Aldehyd umfasst.

38. Emulsion nach Anspruch 37, worin das amphiphile Material ein Phospholipid umfasst.