DE69227347T2 - Auf rezeptorgrundlage arbeitende screening-verfahren für amylin-agonisten und- antagonisten - Google Patents
Auf rezeptorgrundlage arbeitende screening-verfahren für amylin-agonisten und- antagonistenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung physiologisch aktiver Stoffe, zum Beispiel chemischer Verbindungen, indem ihre Fähigkeit zur Wechselwirkung mit natürlich vorkommenden oder isolierten oder geklonten Rezeptorstellen bewertet wird. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten für Amylin und verwandte Peptidhormone, die zur Regulierung der Auswirkungen von Insulin nützlich sind, umfassend eine Bewertung der Bindungsfähigkeit von Kandidat-Verbindungen an bestimmte biologische Präparate, die Rezeptoren für Amylin enthalten.
- Bei mehreren ernsthaften Erkrankungen kann eine Insulinresistenz vorliegen, wie zum Beispiel bei Diabetes mellitus Typ II, Fettsucht und bei Bluthochdruck. Diese Insulinresistenz äußert sich in verminderter Wirksamkeit einer gegebenen Insulindosis im Vergleich zu der beim nicht-resistenten Zustand. So ist bei einem Insulin-resistenten Patienten mit Diabetes mellitus Typ II das Kontrollvermögen sowohl von endogenem Insulin als auch von exogen verabreichtem Insulin einer chronischen Hyperglykämie, wie sie bei solchen Patienten eintritt, ernstlich beeinträchtigt. Folglich treten die aus unkontrolliertem Diabetes mellitus erwachsenden Komplikationen, wie z. B. frühzeitige Arteriosklerose, interkapilläre Glomerulosklerose, Retinopathie, Neuropathie und Nierenversagen, bei Insulinresistenten Diabetikern mit höherer Wahrscheinlichkeit auf als bei Insulinempfindlichen Diabetikern. Im klinischen Sinne liegt eine Insulinresistenz dann vor, wenn normale oder erhöhte Glucosekonzentrationen trotz normaler oder erhöhter Insulinkonzentrationen im Gesamtkreislauf weiterbestehen. Eine Insulinresistenz bedeutet im wesentlichen eine Hemmung der Glykogen-Synthese aus Stoffwechsel- Vorläufern aufgrund einer Abnahme entweder der basalen oder der Insulinstimulierten Glykogenese oder von beiden auf subnormale Niveaus.
- Für die Hyperglykämie bei Diabetes mellitus Typ II gibt es mindestens zwei Ursachen: (1) eine ausfallende Aktivierung der Glucosespeicherung (Lillioja, S., , 62: 922-927 (1986)); und (2) eine fehlerhafte Insulinfreisetzung aus der Bauchspeicheldrüse (Waingot, A., , , 79: 4432-4436 (1982)). Die Behandlung dieser Krankheit hat sich bisher auf Versuche konzentriert, einen oder beide dieser Defekte umzukehren.
- Vor kurzem wurde gezeigt, daß ein neuartiges, aus der Bauchspeicheldrüse isoliertes Proteinhormon bestimmte Wirkungsweisen des Insulins moduliert. Das Hormon, Aymlin genannt (ursprünglich als Diabetes-assoziiertes Peptid oder DAP bezeichnet), wurde vor kurzem bis zur Homogenität aus Amyloid der Bauchspeicheldrüse von an humanem Diabetes mellitus Typ II erkrankten Patienten ausgereinigt. Cooper, G. J. S., , , 84: 8628-8632 (1987). Amylin ist der Gegenstand von EP-A-0189287 (UK-Patentanmeldung der laufenden Nr. 8709871, eingereicht am 27. April 1987, und entsprechende US-Anmeldungen, eingereicht am 27. April 1988, 23. November 1988 und 2. Mai 1989). Die Verwendung von Amylin zur Behandlung von Diabetes mellitus ist Gegenstand der EP-A-0309/00 (UK-Patentanmeldung d. laufenden Nr. 8720115, eingereicht am 26. August 1987, von G. J. S. Cooper , und eingereicht in den Vereinigten Staaten am 26. August 1988).
- Bei nativem Amylin handelt es sich um ein Protein aus 37 Aminosäuren, das durch eine Disulfid-Brücke zwischen den Cys-Resten an Positionen 2 und 7 und einer Amid-Gruppe am C-terminalen Tyrosin gekennzeichnet ist. Das Amylin-Subpeptid 18-27 ist amyloidogen, das heißt, es zeigt die Neigung zur Ausbildung eines Amyloids. Die Struktur des Amylin weist eine 43%ige Homologie zum Calcitonin- Gen-zugehörigen Peptid-1 (CGRP-1), eine 46%ige Homologie zu CGRP-2 und einige Ähnlichkeit zu Insulin. Amylin kann ein Mitglied einer Familie verwandter Peptide sein, zu denen CGRP, Insulin, insulinähnliche Wachstumsfaktoren und die Relaxine zählen und die ein gemeinsames genetisches Erbe teilen. Cooper, G. J. S., , 1: 99-105 (1989). Amara, S. G., , , 229: 1094-1097 (1985); Rosenfeld, M. G., , , 304: 129-135 (1983). Die beiden Peptide Calcitonin und CGRP-1 teilen eine gemeinsame Abstammung im Calcitonin-Gen, wobei eine alternative Weiterbearbeitung des primären mRNA-Transkripts zur Erzeugung zweier verschiedener Peptide führt, die eine nur begrenzte Sequenz-Homologie teilen (etwa 30%). Amara, S. G. , , 229: 1094-1097 (1985).
- In EP-A-0348490 wurde beschrieben, daß Amylin eine Verminderung sowohl der basalen als auch der Insulin-stimulierten Aufnahme von markierter Glucose in das Glykogen im Skelettmuskel bewirkt. Letztere Wirkung wurde auch für CGRP beschrieben. Leighton, B. und Cooper, G. J. S., , 335: 632-635 (1988). Amylin und CGRP waren etwa gleichwertig, indem sie eine ausgeprägte Aktivität bei 1 bis 10 nM zeigten. Amylin vermindert berichtetermaßen auch die Insulin-stimulierte Aufnahme von Glucose in den Skelettmuskel und senkt den Glykogen-Gehalt. Young , . 259: 457-461 (1990). Von Amylin wird auch angegeben, daß es unter bestimmten Umständen die Lactat-Freisetzung aus Skelettmuskel erhöht. Leighton, B. und Foote, E., 269: 19-23 (1990).
- Es wird angenommen, daß die Amylin-Familie der Peptidhormone durch in den Plasmamembranen vorhandene Rezeptoren wirkt. Wir haben gezeigt, daß Amylin im Skelettmuskel über einen Rezeptor-vermittelten Mechanismus arbeitet, der die Glykogenolyse fördert, indem das Raten-limitierende Enzym für den Glykogen- Abbau, die Phosphorylase a, aktiviert wird (Young, A. , 1991 FEBS-Letter in Druck).
- Die wichtigsten Stoffwechselwirkungen von Amylin, die berichtet wurden, sind: (1) Eine Verminderung der unter "neuglykämischen Klammer"-Bedingungen beobachteten Insulinwirkung, wobei die Infusion von Amylin die Insulin-vermittelte Glucose-Clearance vermindert (Molina , Diabetes 39: 260-265 (1990) und Young . Am. J. Physiol. 259: 457-461 (1990)) und teilweise die Insulin-vermittelte Unterdrückung der hepatischen Glucose-Abgabe umkehrt (Molina . ; Koopmans, J. J. . Diabetes 39: 101A (1990)); (2) Bei leicht anästhesierten, 18 Std. lang fastengelassenen Ratten bewirkten Bolusinjektionen von Amylin zunächst einen Anstieg des Plasmalactats und dann einen anhaltenden Anstieg der Plasmaglucose. Der Anstieg des Plasmalactats wird als Spiegelbild der Lactatproduktion im Skelettmuskel, resultierend aus der Amylinstimulierung der Glykogenolyse, erachtet. Diese Wirkungsweise des Amylins wird sowohl bei den gefütterten als auch den 18 Std. lang fastengelassenen Ratten beobachtet, ebenso wie während der Somatostatin-Infusion, die zur Beschränkung der Sekretion der Bauchspeicheldrüsenhormone, einschließlich Insulin und Glucagon, verabreicht wird. Dies Daten erhärten die Feststellung, daß Amylin unabhängig von anderen hormonalen Regulatoren fördernd auf die Lactat-Freisetzung aus Skelettmuskel bei unversehrten Tieren wirkt.
- Der Anstieg der Plasmaglucose hängt mit einer Verdünnung von infundierter Spurenglucose zusammen, was auf eine erhöhte hepatische Glucoseabgabe hinweist. Es ist derzeit nicht bekannt, ob die Wirkungsweisen der Amylin-Infusion bei "euglykämisch geklammerten" Ratten und der Amylin-Injektionen zur Erhöhung der hepatischen Glucoseabgabe eine Folge direkter Wirkungen von Amylin auf die Leber oder einer indirekten Auswirkung der Amylin-Wirkungsweisen, wie etwa die Freisetzung von Lactat aus Muskel, ist. So wurde zum Beispiel berichtet, daß Amylin die Glukoneogenese und die Glykogenolyse bei kultivierten Hep G2-Zellen (eine aus einem menschlichen Lebertumor stammende Zellinie) erhöht. Ciaraldi , Diabetes 39: Supp. 1, 145A (1990). Andererseits wurde berichtet, daß Amylin keine beobachtbaren Auswirkungen auf den Glucose-Stoffwechsel bei isolierten Rattenleberzellen oder bei perfundierter Rattenleber zeigte (Stephens , Diabetes, in Druck 1991).
- Es wird außerdem berichtet, daß Amylin bestimmte andere Prozesse bewirken kann, einschließlich einer Gefäßerweiterung. Brain S. D. , Am. J. Pathol., 136: 487-490 (1990). Amylin erwies sich als 100- bis 1000mal weniger wirksam als ein Vasodilatator als das verwandte Peptid CGRP. Dies könnte eine schwache Wirkung des Amylins auf CGRP-Rezeptoren widerspiegeln, obschon kein Beweis zur Stützung dessen erbracht wurde. Von Amylin wird auch berichtet, daß es das Plasmacalcium bei Kaninchen und Ratten senkt (Datta H. K. ., Biochem. Biophys. Res. Commun. 162: 876-881 (1989)). Diese Wirkung ähnelt der von Calcitonin. Menschliches Calcitonin war wirksamer als Amylin beim Erbringen einer Hypokalzämie, und es ist möglich, wennauch unbewiesen, daß Amylin weniger stark als Calcitonin an Calcitonin-Rezeptoren der Knochenzellen wirkt.
- Es wird davon ausgegangen, daß CGRP und Calcitonin über Membranrezeptoren wirken, von denen zumindest einige zur Aktivierung der Adenylatcyclase und Erzeugung von zyklischem AMP als einem intrazellulären zweiten Messenger dienen. In dieser Hinsicht wird von hochaffinen Bindungsstellen (Rezeptoren) für CGRP an der Lebermembran berichtet; an diesen Stellen soll CGRP die Adenylatcyclase stark aktivieren. . Morishita, . Diabetes 39: 875-877 (1990). Von Amylin wurde berichtet, daß es markiertes CGRP von diesen Bindungsstellen verdrängt, jedoch bei viel geringerer Affinität von etwa 300 nM als CGRP mit etwa 9 pM. Gewissermaßen ähnliche Befunde werden berichtet von Chantry ., Biochem J. in Druck 1991); diese Autoren berichten offenbare Affinitäten für CGRP und Amylin an Lebermembranen von etwa 100 bis 300 pM bzw. 10 nM. Chantry . weisen darauf hin, daß Leber sehr wenig CGRP enthält und daß Amylin aus der Pfortader, die die Leber direkt versorgt, abgesondert wird. Sie schlagen vor, daß die Glucose-regulierende Rolle dieser Peptide beim Leberstoffwechsel primär durch Amylin vermittelt wird. Allerdings waren Chantry . nicht in der Lage, die Amylin- Bindung an Lebermembranen zu messen. Stephens , , konnten die CGRP- und Amylin-Bindung an ein Präparat der Leberzellmembranen messen; aus Untersuchungen getrennter parenchymatöser und interstitieller Leberzellen folgerten sie jedoch, daß die Bindung hauptsächlich an interstitielle Zellen erfolgte und daß das Fehlen von Bindung an parenchymatöse Zellen mit dem Fehlen einer Amylinwirkung auf den Leberzell-Stoffwechsel übereinstimmte. Daher ist die Frage nach der Beschaffenheit und sogar der Existenz funktionell relevanter Amylin-Rezeptoren an der Leber unklar und ungelöst. Tatsächlich wurde die Existenz eines Amylin- Rezeptors oder -Rezeptoren von einigen in Frage gestellt, wohingegen wieder andere erkennen, daß ein derartiger Rezeptor eines Tages identifiziert werden wird (Banks, P. Journal of NIH Research 2: 34-35 (1990); Diabetes Forecast, März 1991, 27-31).
- Bis heute liegt lediglich ein Bericht zu einer Untersuchung von Amylin-Rezeptoren im Skelettmuskel vor. Chantry . berichten, daß CGRP und Amylin um die ¹²&sup5;I-CGRP-Bindung an Rohmembran-Präparate konkurrieren, CGRP mit einem IC&sub5;&sub0; von 300 pM und Amylin mit einem IC&sub5;&sub0; von 10 nM. Sie schlagen vor, daß diese Daten ein gemeinsames System zur Vermittlung der Wirkungsweise beider Peptide auf den Skelettmuskel aufzeigen. Dies erscheint jedoch unvereinbar mit der Tatsache, daß bei funktionellen Untersuchungen des Skelettmuskels Amylin etwas wirksamer als CGRP befunden wurde und nicht 30mal weniger wirksam, wie in den zitierten Bindungsstudien festgestellt.
- Daraus wird ersichtlich, daß zwar mehrere Forscher Rezeptoren postuliert und/oder gesucht haben, die die Stoffwechselwirkungen von Amylin vermitteln könnten, doch keine identifiziert worden waren. Aus den verfügbaren Bindungsdaten und den kardiovaskulären Reaktionen, wie von Brain . berichtet, könnte lediglich spekuliert werden, daß es der bei Lebermembranen berichtete hochaffine Rezeptor ist, der die starken vasodilatatorischen Wirkungen von CGRP vermittelt und daß Amylin seine viel schwächeren vasodilatatorischen Reaktionen über diesen Rezeptor ausüben kann. Dieser Rezeptor wird geeigneterweise als CGRP-Rezeptor bezeichnet, wobei es sich um die Art von Rezeptor in Skelettmuskelmembranen handeln kann, die von Chantry . untersucht wurde.
- Bindungsstellen für Calcitonin und CGRP sind im Zentralnervensystem weit verteilt. Die beiden Peptide wirken jedoch an ihren eigenen unterschiedlichen hochaffinen Rezeptoren mit verschiedenen biochemischen Spezifitäten und geringer Wechselwirkung an der alternierenden Rezeptorstelle.
- Sexton, P. M. . (1988), . So wurde beispielsweise berichtet, daß sowohl bei der humanen (Tschopp, F. A. , 82: 248-252 (1985)) als auch der Ratten- (Sexton, P. M. , 19: 1235-1245 (1986)) Großhirnrinde Calcitonin als 500- bis 1000mal weniger wirksam befunden wurde als Ratten- oder humanes CGRP in Konkurrenz um CGRP-Bindungsstellen. In ähnlicher Weise war CGRP 500 bis 1000mal weniger wirksam in Konkurrenz um Calcitonin- Stellen in Hirn- und Nierenmembranen (Goltzman und Mitchell, 227: 1343- 1345 (1985)), als auch in Gesamtnierenabschnitten (Sexton, P. M. , . 32: 862-868 (1987)). Einige Daten bezüglich atypischer CGRP-Bindungsstellen in Regionen des Rattenhirns wurden berichtet. Dennis, T., , 16: 514, Übersicht 220.7 (1990); Sexton, P. M. , 12: 323-335 (1988). Es wurde berichtet, daß hohe Dichten von Bindungsstellen mit hoher Affinität für die beiden ansonsten biochemisch verschiedenen Peptide Lachs-Calcitonin und CGRP α durch die Verwendung autoradiographischer Methoden in Teilen des ventralen Striatums, einschließlich des posterioren Nucleus accumbens (mit Ausnahme eines kleinen Innenbandes, das mit der Schale des accumbens assoziiert ist) und seiner kaudalen Fortsetzung mit dem posteriokaudalen Putamen caudatus und posterioren Fundus striati, als auch dem Außenrand des Seitenbettkerns der Stria terminalis und dem medialen Nucleus des Amygdala, identifiziert wurden. Sexton, P. M. (1988), . Außerhalb der Basalganglien-zugehörigen Kerne waren das Organum vasculosum der Lamina terminalis, Flügel der dorsalen Raphe und die Area postrema die einzigen berichteten Regionen, in denen eine Calcitoninempfindliche CGRP-Bindung durch Sexton . identifiziert wurde.
- In WO89/06135 sind Verbindungen und Verfahren zur Blockierung der Auswirkungen von Amylin beschrieben. Morishita et al ( ; 875, 1990) berichten von der Aktivierung der Adenylatcyclase durch "Insel-Amyloid-Polypeptid mit einem Carboxy-terminalen Amid" über CGRP-Rezeptoren an Rattenleber- Plasmamembranen. Stephens et al ( ; 395, 1991) berichten vom Vorhandensein von Leber-CGRP/Amylin-Rezeptoren lediglich in nicht-parenchymatösen Zellen und vom Fehlen einer direkten Regulierung des Rattenleber- Glucose-Stoffwechsels durch CGRP/Amylin.
- Derzeit wird die Amylin-Agonist-Aktivität durch Messen der Inhibition der Insulinstimulierten Glykogen-Synthese beim intakten Ratten-Soleusmuskel bewertet. Leighton et al (1988) . Diese Methode ist zwar als quantitativer biologischer Assay wirksam, doch relativ langsam, arbeitsintensiv und empfindlich gegenüber den Auswirkungen zellulärer proteolytischer Enzyme auf die zu testenden Peptide. Der Soleus-Assay ist zur Quantifizierung der relativen Stärken der Agonisten effektiv, doch kann die Affinität eines Liganden für seinen Rezeptor aus Agonist-Dosis/ Reaktions-Beziehungen in Gesamtgeweben oder -organen nicht akkurat bestimmt werden. So können zum Beispiel Unterschiede bei den Molekulargrößen oder der Löslichkeit oder der Neigung zur Bindung an Gewebekomponenten die definierten Stärken beeinflussen. Der Soleus-Assay weist außerdem einen geringen oder gar keinen Wert als effektiver Primär-Screening-Assay mit hohem Durchsatz für an Amylin-Rezeptoren aktive Verbindungen auf. Weitere Verfahren für das Screening potentieller Amylin- und verwandter Peptidhormon-Agonisten und -Antagonisten für die klinische Anwendung, die preiswert, schnell und auf physiologischen Grundsätzen basierend sind, wären in hohem Maße erwünscht. Solche Verfahren wurden entdeckt und werden im folgenden beschrieben.
- Die Erfindung umfaßt schnelle, preiswerte und physiologische Verfahren zur Identifizierung, zum Screening und zur Charakterisierung potentieller Amylin-Agonisten und -Antagonisten zum therapeutischen Nutzen, umfassend die Bewertung der Fähigkeit solcher Kandidat-Moleküle zum Konkurrieren gegen Tracer-Konzentrationen bestimmter markierter Peptide, einschließlich bestimmter markierter Peptidhormone und Fragmente und deren Analoga, um die Bindung an spezifische Rezeptor-Bindungsstellen in Zellen oder Membranen, die aus diesen Zellen oder aus Geweben, die Zellen mit Membranrezeptoren für Amylin enthalten, präpariert oder isoliert wurden. Die Amylin-Rezeptoren können durch eine Bindungsaffinität für Bolton-Hunter ¹²&sup5;I-markiertes Ratten-Amylin von zwischen etwa 20 bis etwa 50 pM unter magnesiumfreien und salzarmen Bedingungen oder durch Verdrängung dieser Amylin-Markierung durch andere Liganden identifiziert werden.
- Bei einer Ausführungsform wird mit der Erfindung ein Assay-Verfahren zur Verwendung beim Identifizieren oder Screenen von Agonisten oder Antagonisten von Amylin bereitgestellt, welches das Zusammenbringen einer Testprobe und eines Amylin-Rezeptor-Präparats umfaßt, wobei die Testprobe eine oder mehrere Testverbindungen enthält und das Amylin-Rezeptor-Präparat ein isoliertes Zell- oder Membran-Präparat umfaßt, enthaltend Amylin-Rezeptoren, die zum nachweisbaren Binden von Amylin fähig sind und ein derartiges relatives Liganden-Bindungsprofil aufweisen, daß die Bindungsstärke von Ratten-Amylin und Lachs-Calcitonin an das Rezeptor-Präparat größer ist als die Bindungsstärke von CGRP, daß die Bindungsstärke von CGRP an dieses Rezeptor-Präparat größer ist als die Bindungsstärke von menschlichem CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;, wobei die Bindungsstärke der Liganden durch Bestimmen der Fähigkeit der Liganden zum Konkurrieren mit einem Amylin-Liganden um die Bindung an das Amylin-Rezeptor-Präparat gemessen wird; das Inkubieren der Testprobe und des Rezeptor-Präparats unter Bedingungen, die die Bindung von Amylin an das Rezeptor-Protein zulassen; und das Identifizieren jener Testproben, enthaltend eine oder mehrere Testverbindungen, die nachweisbar an das Rezeptor- Protein binden. Bei einer anderen Ausführungsform umfaßt dieses Verfahren außerdem die Schritte des Screenings der Testproben, die nachweisbar an das Rezeptor-Protein binden, auf eine in vitro Stimulation oder Inhibition der Amylin- Rezeptor-vermittelten Aktivität und das Identifizieren jener Testproben, die sich als Agonisten oder Antagonisten von Amylin verhalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Testproben, die nachweisbar an das Amylin-Rezeptor- Protein binden, durch Messen der Verdrängung eines markierten ersten Liganden aus dem Rezeptor-Protein-Präparat durch die Testprobe und Vergleichen der gemessenen Verdrängung des ersten markierten Liganden aus dem Rezeptor- Präparat durch die Testprobe mit der gemessenen Verdrängung des markierten ersten Liganden aus dem Rezeptor-Präparat durch einen oder mehrere bekannte zweite Liganden identifiziert. Markierte erste Liganden und zweite Liganden umfassen Amylin, einen Amylin-Agonisten oder einen Amylin-Antagonisten. Zu nützlichen Rezeptor-Präparaten zählen isolierte Zellen, die den Amylin-Rezeptor tragen, isolierte Membran-Präparate, die den Amylin-Rezeptor tragen, und isoliertes Amylin-Rezeptor-Protein. Werden isolierte Membranen als das Rezeptor-Präparat verwendet, so sind Membranen aus der Vorderhirnbasis-Region besonders bevorzugt. Die bei einem beliebigen der obigen Verfahren verwendeten Testproben, die mehr als eine Testverbindung enthalten und welche positive Ergebnisse erbringen, können dann aufgeteilt und sooft wie erforderlich und wie geeignet, um die Verbindung oder Verbindungen in der Testprobe zu identifizieren, die zur Erbringung des positiven Ergebnisses verantwortlich sind, nochmals getestet werden.
- Bei einer anderen Ausführungsform wird durch die Erfindung ein Assay-Verfahren zur Auswertung einer oder mehrerer Rezeptor-Bindungseigenschaften bereitgestellt, die für eine bekannte oder eine Kandidat-Amylin-Agonist- oder -Antagonist- Verbindung bestimmt werden sollen, welches folgende Schritte umfaßt: Bewerten oder Messen der Fähigkeit der Verbindung zum Konkurrieren gegen einen markierten Liganden um die Bindung an ein Amylin-Rezeptor-Präparat, wie oben definiert; Bewerten oder Messen der Fähigkeit der Verbindung zum Konkurrieren gegen den markierten Liganden um die Bindung an ein CGRP-Rezeptor-Präparat, oder Bewerten oder Messen der Fähigkeit der Verbindung zum Konkurrieren gegen den markierten Liganden um die Bindung an einen Calcitonin-Rezeptor, oder Bewerten oder Messen der Fähigkeit der Verbindung zum Konkurrieren gegen den markierten Liganden um die Bindung an ein CGRP-Rezeptor-Präparat und an ein Calcitonin-Rezeptor-Präparat; und Bestimmen der Rezeptor-Bindungseigenschaft, die für diese Verbindung bestimmt werden soll. Zu den Rezeptor-Bindungseigenschaften, die bestimmt werden sollen, zählt die Bindungsaffinität und die Bindungsspezifität. Zu den CGRP-Rezeptor-Präparaten zählen Leberzell-Präparate, einschließlich Primärzellkulturen oder etablierter Zellinien. Zu den Calcitonin- Rezeptor-Präparaten zählen Zell- oder Membran-Präparate, die den C1-Rezeptor tragen.
- Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird mit der Erfindung ein Assay- Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge einer Amylin- Rezeptor-bindenden Verbindung in einer zu untersuchenden Testprobe bereitgestellt, welches folgende Schritte umfaßt: Zusammenbringen der Testprobe und eines Amylin-Rezeptor-Präparats, wie oben definiert; Messen der Fähigkeit der Testprobe zum Konkurrieren gegen einen markierten Liganden um die Bindung an das Amylin- Rezeptor-Präparat; und wahlweise Inbeziehungsetzen der Menge an Amylin- Rezeptor-bindender Verbindung in der Testprobe mit der für eine negative Kontrollprobe gemessenen Menge an Amylin-Rezeptor-bindender Verbindung, wobei die negative Kontrollprobe als von jeglicher Amylin-Rezeptor-bindenden Verbindung frei bekannt ist, und/oder Inbeziehungsetzen der Menge an Amylin-Rezeptor-bindender Verbindung in der Testprobe mit den Mengen an Amylin-Rezeptor-bindender Verbindung, wie für positive Kontrollproben gemessen, die bekannte Mengen an Amylin-Rezeptor-bindenden Verbindungen enthalten, um das Vorhandensein oder die Menge an in der Testprobe vorhandener Amylin-Rezeptor-bindender Verbindung zu bestimmen. Dieses Assay-Verfahren kann bei wiederum weiteren Ausführungsformen zur Auswertung der Stabilität eines Amylin-Präparats, zur Auswertung der Potenz eines Amylin-Präparats und zur Auswertung der Löslichkeitseigenschaften eines Amylin-Präparats verwendet werden.
- Bei einer anderen Ausführungsform können die Rezeptor-Präparate der Erfindung zur Herstellung von Anti-Amylin-Rezeptor-Antikörpern, einschließlich polyklonaler Antiseren und monoklonaler Antikörper, unter Anwendung im Fachbereich bekannter Methoden verwendet werden.
- Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Erfindung eingesetzt zum Screening von Zellinien, von aus Geweben abgetrennten Zeilen und von Zellen aus menschlichem oder tierischem Blut zur Identifizierung jener, die Amylin-Rezeptoren tragen. Die Amylin-Rezeptor-Präparate der Erfindung können auch an eine feste Phase gebunden und bei verschiedenen affinitätschromatographischen Verfahren verwendet und zum Beispiel zur Reinigung von Amylin oder zur Auswertung von Proben, die bekannter- oder vermutetermaßen Amylin, Amylin-Agonisten oder Amylin-Antagonisten enthalten, verwendet werden.
- Daher besteht eine Aufgabe dieser Erfindung in der Identifizierung von Rezeptor- Präparaten, die für die Screening-Verfahren dieser Erfindung geeignet sind.
- Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung besteht in der Bereitstellung von Einzelheiten der Screening-Verfahren der Erfindung, wie auf potentielle Agonisten und Antagonisten angewendet.
- Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung besteht in der Unterrichtung des Verfahrens zur Bewertung der relativen Potenzen und Spezifitäten der Kandidat- Agonisten und -Antagonisten.
- Eine noch darüber hinausgehende Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens unter Anwendung von Amylin-Rezeptor-Präparaten zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge an Amylin und anderen Molekülen, die an den Amylin-Rezeptor binden.
- Diese und weitere Aufgaben werden unter Bezugnahme auf die Beschreibung und die Ansprüche im Anhang leicht erkennbar werden.
- In Abb. 1 ist ein Scatchard-Diagramm der Sättigungsbindung von ¹²&sup5;I-h-CGRP an Rattenlebermembran gezeigt. Die ¹²&sup5;I-h α-CGRP-Konzentration wurde von 1,3 bis 150 pM variiert. Die nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 107M h α-CGRP gemessen. Kd = 19,1 pM, Bmax = 49,4 fmol/mg Protein.
- In Abb. 2 sind Kompetitions-Bindungskurven um die Bindung an humanes CGRP (Quadrate), an humanes CGRP (Fragment 8-37) (Dreiecke) und Ratten- Amylin (Kreise) an Rattenlebermembranen unter Verwendung von ¹²&sup5;I-h CGRP als Tracer gezeigt.
- In Abb. 3 sind die Zunahmen bei der Plasmaglucose gezeigt, wie durch Verabreichung von Amylin (durchgehende Linie) oder h CGRP (unterbrochene Linie) (0-1000 ug i.v.) an fastengelassene anästhesierte Ratten erzielt.
- In Abb. 4 sind Kompetitionskurven für die Konkurrenz von h α-CGRP (Kreise) und r Amylin (Quadrate) um ¹²&sup5;I-CGRP-Bindungsstellen in Membranen gezeigt, die von Ratten-Cerebrum (A) und Ratten-Vorderhirnbasis (B) stammten.
- In Abb. 5 ist ein Scatchard-Diagramm der Sättigungsbindung von ¹²&sup5;I-r Amylin an Ratten-Vorderhirnbasis-Membranen gezeigt. Die Bindung steigender Konzentrationen von Ratten-Amylin an Membranen, präpariert aus 2,5 mg Gewebe, wurde gemessen. Die nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 100 nM Lachs- Calcitonin gemessen. Kd = 27,1 ± 2,1 pM, Bmax = 0,98 ± 0,096 fmol/mg (n = 3).
- In Abb. 6 ist die Bindung von ¹²&sup5;I-r Amylin an Rattenhirnregionen gezeigt. Die spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-r Amylin wurde bei einer Konzentration von 17 pM gemessen. Die nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 25 nM r Amylin gemessen.
- Die vorliegende Erfindung stellt neuartige, preiswerte, schnelle und physiologische Verfahren zum Screenen, Identifizieren und Charakterisieren potentieller Agonisten und Antagonisten der physiologischen Wirkungsweisen des Peptidhormons Amylin bereit, welche das Bewerten der relativen Fähigkeiten von Kandidat-Agonisten und -Antagonisten zum Konkurrieren gegen relevante Peptide um die Bindung an spezifische Amylin-Rezeptorstellen umfassen. Die für diese und andere Zwecke verwendeten Rezeptorstellen können als isolierte Rezeptor-tragende Gewebe, als aus diesen Rezeptor-tragenden Geweben präparierte Zellen, als von diesen Zellen herstammende Membran-Präparate und als isolierte Rezeptor-Protein-Präparate, einschließlich geklonter Rezeptor-Präparate unter Verwendung rekombinanter DNA- Methoden, vorliegen.
- Es besteht allgemeine Übereinstimmung darüber, daß sich der Begriff "Rezeptor" oder "spezifischer Rezeptor" auf ein Makromolekül bezieht, das zum Erkennen und selektiven Binden eines Liganden fähig ist und das nach der Ligandenbindung zum Erzeugen bestimmter physikalischer oder chemischer Signale fähig ist, die die Kette von Ereignissen auslösen, die zur physiologischen Reaktion führen. Blecher, M., , "Receptors and Human Disease", Williams & Wilkins, Baltimore, 1981, Kapitel 1. Daher besteht ein wichtiger Teil dieser Erfindung darin, daß Gewebe, Zellen, Membran oder Rezeptor-Präparate, die bei den auf Kompetition basierenden Screening-Verfahren der Erfindung verwendet werden, die Bindungseigenschaften eines natürlichen Rezeptors aufweisen.
- Die aus den Zielgeweben der physiologischen Wirkungsweisen von Amylin stammenden Gewebepräparate oder Zellpräparate wurden zur Verwendung bei den Verfahren zum Screening von Amylin-Agonisten und -Antagonisten identifiziert, doch sind für die Verfahren dieser Erfindung minderwertig. Unerwarteterweise haben wir festgestellt, daß Zellen oder Membranen, die den Amylin-Rezeptor tragen, oder Amylin-Rezeptorprotein-Präparate, vorzugsweise aus Hirnregionen isoliert werden. Blecher, M., Hsg. "Methods in Receptor Research," Bände 1 und 2, Marcel Dekker, New York, 1976; Boulton, A. A. , Hsg., "Neuromethods For Receptor Bindung," Humana Press, Clifton, NJ, 1986.
- Membranen der Vorderhirnbasis, umfassend Membranen aus dem Nucleus accumbens und den umgebenden Regionen, sind aus mehreren Gründen bevorzugt.
- Zunächst liegt, wie später ausführlich erläutert, eine hochaffine Bindungsstelle für Amylin bei hoher Dichte in der Vorderhirnbasis als auch in anderen Hirnregionen vor; die spezifische Bindung von markiertem Amylin an solche Membranen belief sich auf mindestens 70% der Gesamtbindung, was auf die Spezifität und die Fülle der Stellen hinweist. Zweitens sind, wie ebenfalls unten gezeigt, die relativen Stärken von drei auf die Bindung an diese Membranen getesteten Peptiden (Rattenamylin > CGRP > CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;) ihren relativen Stärken beim Verändern des Soleusmuskel-Glykogen- Stoffwechsel ähnlich und recht verschieden von ihrer relativen Stärke beim Hemmen der markierten CGRP-Bindung an Rezeptoren in Leber- und L6-Muskelzell- Membranen. Wir haben festgestellt, daß der in der Ratten-Vorderhirnbasis gemessene hochaffine Rezeptor auch im Soleusmuskel in mittels der derzeitigen Verfahren nicht leicht nachweisbaren Mengen vorhanden ist und das bevorzugte Ziel des Interesses für die Entwicklung von Amylin-Agonist und -Antagonist-Wirkstoffen ist.
- Zu den Auswirkungen, die durch Infusion von entweder CGRP oder Calcitonin in das Hirn erzielt werden, zählt die Verminderung der Amphetamin-induzierten Bewegungsaktivität (de Beaurepaire, R. , 27: 177 (1987); eine verminderte Nahrungsaufnahme (Cooper, C. W., , 20: 451 (1984); eine Reduzierung des freigesetzten Wachstumshormons (Tannenbaum, G. S., , . 116: 2685 (1985); eine Hemmung der Magensäuresekretion (Lenz, H. J., , 88: 539 (1985); und eine Hemmung der Wachstumshormon-Sekretion (Fahim, A., , 51: 688 (1990).
- Die Membranpräparate, die für Assay- und Screening-Zwecke geeignete Amylin- Rezeptoren enthalten, können wie folgt identifiziert werden: (1) Die ¹²&sup5;I Bolton Hunter-Ratten-Amylinbindung weist unter den hierin spezifizierten Bedingungen, besonders dem Fehlen von Magnesium und einer Salzkonzentration von bis zu 50 mM, einen K von etwa 15 pM bis etwa 60 pM auf; (2) die Verdrängung von etwa 10 bis 15 pM markiertem Amylin durch andere Liganden weist IC&sub5;&sub0;-Volumina auf von: Ratten-Amylin, etwa 20 bis 40 pM; Aal-Calcitonin, etwa 20 bis 50 pM; Lachs- Calcitonin, etwa 25 bis 60 pM; Ratten-β-CGRP, etwa 50 bis 100 pM; humanes β-CGRP, etwa 100 bis 200 pM; humanes α-CGRP, etwa 130 bis 230 pM; Ratten- α-CGRP, etwa 250 bis 550 pM; humanes CGRP&sup8;&supmin;³&sup7;, etwa 1 nM bis 5 nM; humanes Calcitonin, etwa 2 bis 10 uM. In den üblichsten Fällen ist es bevorzugt, lediglich bestimmte Liganden zur Bestimmung des Vorhandenseins von Amylin-Rezeptoren auszuwählen, zum Beispiel einen von Ratten-Amylin oder Lachs-Calcitonin und einen von humanem α-CGRP oder humanem β-CGRP und humanem α-CGRPB-&sup8;&supmin;³&sup7;.
- Im allgemeinen werden Gewebemembranen durch kurze (4-10 Sekunden) Homogenisierung von Geweben bei Eisbad-Temperaturen bei einem gepufferten pH-Wert von etwa Neutralität präpariert. Bei einer Ausführungsform wird ein Instrument, zum Beispiel ein Polytron (Brinkman Instruments, N. Y.) verwendet, obschon auch andere ähnliche Homogenisatoren eingesetzt werden können. Auf die Gewebespaltung hin werden die Membranen in der Kälte bei g-Kräften von mindestens etwa 20.000 · g über einen geeigneten Zeitraum, bevorzugt über 40.000 · g über mindestens 10 Minuten hinweg isoliert. Die Membranen werden normalerweise mindestens zweimal durch nochmalige Homogenisierung in frischem Puffer gewaschen und nochmals wie oben isoliert, um endogene störende Substanzen zu entfernen. Die gewaschenen Membranen werden in Puffer, enthaltend einen proteolytischen Enzyminhibitor, wie z. B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) oder Bacitracin, resuspendiert. Es können ausreichende Volumina an Puffer zugegeben werden, um die Gewebe-Endkonzentration auf ein Niveau einzustellen, das für das spezielle Screening-Verfahren der angewandten Ausführungsform geeignet ist.
- Die Inkubationsgemische für das Screening-Verfahren werden wie folgt hergestellt. In Glas- oder Polymerröhrchen wird ein geringes Volumen an Puffergemisch ("HBBM"), zusammengesetzt aus einer Pufferlösung, wie etwa HEPES, enthaltend einen Protease-Hemmer, wie etwa Bacitracin oder PMSF, Protease-freies Serumalbumin (vorzugsweise Fraktion V BSA, Protease-frei) und wahlweise ein Mg²&spplus;-Salz, eingegeben. Diesem Puffergemisch wird ein kleines Puffervolumen, enthaltend die auf die Agonist- oder Antagonist-Aktivität zu testenden unmarkierten Moleküle, bei Konzentrationen von etwa 10&supmin;¹¹ bis 10&supmin;&sup6; M eingegeben. Die Kontrollröhrchen enthalten lediglich Puffer. Diesem Gemisch werden solche Mengen an markiertem Amylin oder CGRP oder Calcitonin in Puffer zugegeben, daß Endkonzentrationen von etwa 10 bis etwa 16 pM erhalten werden. Aufgrund der erzielbaren hochspezifischen Aktivitäten und der einfachen chemischen Markierbarkeit ist eine Markierung der Peptidhormone mit ¹²&sup5;I bevorzugt. Die Peptidhormone können aus menschlichen Geweben isoliert werden (und bezeichnet werden mit "h CGRP" oder "h Amylin", wobei "h" für human steht), aus tierischen Geweben ( . Lachs-(engl.: salmon)- Calcitonin, s Calcitonin, oder Ratten-Amylin, r Amylin) oder mittels chemischer synthetischer oder rekombinanter Methoden hergestellt werden.
- ¹²&sup5;I-h CGRP (markiert bei ¹&sup0;His) und ¹²&sup5;I-r Amylin (Bolton-Hunter-markiert am N-terminalen Lysin) können von Amersham Corporation, Arlington Heights, Illinois, bezogen, in Teilmengen aufgeteilt und bis zur Verwendung gefriergelagert werden.
- Unmarkierte Peptide können von BACHEM Incorporated (Torrance, California) und Peninsula Laboratories (Belmont, California) erhalten werden. Sie werden in sterilem Wasser, enthaltend Protease-freie Fraktion V BSA, gelöst, in Teilmengen aufgeteilt und bis zur Verwendung gefriergelagert werden.
- Die Reaktionen werden durch Zugabe der Membranen in jedes Inkubationsröhrchen eingeleitet. Die pro Röhrchen erforderliche Menge an Gewebe (oder, bequemer, an Membranprotein) ist entsprechend der Rezeptordichten jeder Gewebeart vorgegeben. Üblicherweise werden Membranen von etwa 2,5 mg Gewebe (etwa 100 ug Membranprotein) zugegeben.
- Die Reaktionsgemische werden über einen geeigneten Zeitraum und bei ausreichender Temperatur inkubiert, um innerhalb des Zeitraums stabile Bedingungen zu erreichen. Der Begriff "stabiler Zustand", wie hierin verwendet, soll die Gesamtsumme aller Reaktionen und Prozesse umfassen, die die Nettomenge an gebundenem Hormon beeinflussen. Er kann gleichbedeutend mit "Gleichgewicht" sein, muß aber nicht. Üblicherweise werden die Röhrchen etwa 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
- Die Membranen werden dann isoliert, um die Menge an markiertem Ligand zu bestimmen, der nach Konkurrenz zwischen markierten und unmarkierten Liganden gebunden hat. Bequemerweise werden die Membranen durch Filtration mit einem vakuumverstärkten Brandel Cell Harvester (Brandel Instruments, Gaithersburg, Maryland, Modell M-24) durch Glasfaser-Filter ( . GF/B, Whatman) aufgesammelt, die zuvor mit einem Reagenz durchtränkt wurden, um die nichtspezifische Bindung (NSB) zu vermindern. Bevorzugt werden die Filter etwa 5 Stunden lang mit etwa 0,3% Polyethylenimin durchtränkt. Den Fachleuten werden andere Vorrichtungen zum Aufsammeln der Plasmamembranen bekannt sein, wie etwa die Millipore Filtration Assembly (Modell 1225) oder die Sandbeck-Filterbox (Bennett, J. P., in , H. I. Yamamura , Raven, New York 1978, Seiten 57-90), Sammelfilter und NSB-reduzierende Reagentien, die bei der Ausführung dieser Erfindung verwendet werden können. Sowohl direkt vor als auch direkt nach der Filtration werden die Filter mit großen (Milliliter) Volumina von eiskaltem Puffer gewaschen, um kontaminierende Stoffe, ungebundenes markiertes Peptidhormon, zu entfernen. Die Filter werden entfernt und die Menge an markiertem Peptidhormon, die an die Plasmamembranen gebunden hat, quantifiziert. Besteht die Markierung in ¹²&sup5;I, so kann die Radioaktivität in einem Gammastrahlen-Zähler bewertet werden. Wurde ein chemilumineszierendes Reporter-Molekül ( . AMPPD, Tropix, Inc., Bedford, MA) verwendet, so kann das erzeugte Licht in einem Luminometer quantifiziert werden. Auch enzymatische Markierungen können verwendet werden.
- Statt durch Filtration können die Plasmamembranen nach der Inkubation durch Zentrifugation ( Beckman J-2-21-M Kühlzentrifuge bei 21.000 UpM oder Beckman 12- oder Eppendorf-Mikrofuge) isoliert, mit eiskaltem Puffer gewaschen, dann als solche oder nach Aufschluß der Membranen durch Detergens oder Alkali gezählt werden.
- Scatchard-Diagramm-Sättigungsanalysen der Bindungsdaten, wobei gebundenes/ freies (B/F) markiertes Peptidhormon als eine Funktion der gebundenen Menge aufgetragen wird, werden mittels standardmäßiger Methoden vorgenommen. Siehe Blecher 1976, Blecher 1981, Kapitel 1, und Boulton . 1986, Kapitel 1.
- Kompetitionskurven, bei denen die gebundene Menge (B) als eine Funktion des 10g der Ligandenkonzentration aufgetragen wird ( Abb. 2-5), können mittels Computer analysiert werden, anhand von Analysen mittels nichtlinearer Regression zu einer logistischen Gleichung mit 4 Parametern (Inplot-Programm; GraphPAD Software, San Diego, California) oder das ALLFIT-Programm von DeLean . (ALLFIT, Version 2.7 (NIH, Bethesda, MD 20892)). Munsun, P. U. und Rodbard, D., 107: 220-239 (1980).
- Zur Bestimmung der Bindungskonstanten können Scatchard-Sättigungskurven generiert und gemäß einer Modifikation des Verfahrens von Scatchard analysiert werden, wie beschrieben von Bylund, D. B., , "Methods for Receptor Binding," in H. I. Yamamura , Hsg., , Raven Press, New York, 1990, S. 1-35.
- Um spezifische Bindungswerte experimentell zu erhalten, wird ein breiter Bereich von Tracer-Konzentrationen beim markierten Peptidhormon (gewöhnlich 1-150 pM) zum Erhalt der Gesamtbindung angewendet und außerdem Duplikat-Röhrchen, die in Gegenwart einer sehr hohen Konzentration von 100 nM des unmarkierten Liganden zum Erhalt der nichtspezifischen Bindung (NSB) nochmals ausgewertet werden. Letzterer Wert wird von jedem Wert für die Gesamtbindung subtrahiert, um die spezifische Bindung bei jeder Konzentration des markierten Liganden zu erhalten.
- Die Ergebnisse der nachstehenden Beispiele zeigen, daß das hierin beschriebene Verfahren zur Messung der Fähigkeit von Peptiden zum Konkurrieren gegen ¹²&sup5;I- markiertes Amylin, CGRP und Calcitonin um die Bindung an spezifische Rezeptoren in Membranen aus der Vorderhirnbasis, einschließlich des Nucleus accumbens und der umgebenden Regionen, ein besonders nützliches Verfahren zur Identifizierung von Peptiden und anderen chemischen Verbindungen darstellt, die mit diesen Rezeptoren wechselwirken. Die hohe Dichte und Spezifität der Rezeptoren in und um die Region des Nucleus accumbens führt zu Signal-Rausch-Verhältnissen (d. h. das Verhältnis der spezifischen Bindung zur nichtspezifischen Bindung), die in einen nützlichen Bereich für Wirkstoff-Screening-Studien fallen.
- Die relativen Stärken der drei auf die Bindung an die ¹²&sup5;I-r Amylin-Rezeptorstelle (r Amylin > CGRP > CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;) zu testenden Peptide sind als ihren relativen Stärken beim Verändern des Soleusmuskel-Glykogen-Stoffwechsels ähnlich, dagegen als recht verschieden von ihrer Fähigkeit zum Konkurrieren gegen ¹²&sup5;I-CGRP um die Bindung an seine Rezeptoren in Leber- und Soleusmuskel-Membranen beschrieben. Dieses Ergebnis stimmt mit unserer Feststellung überein, daß der in Membranen der Nucleus accumbens-Region gefundene hochaffine Amylin-Rezeptor auch im Soleusmuskel vorhanden ist, obschon in Mengen, die mittels derzeit verfügbarer Bindungsmethoden nicht leicht nachweisbar sind. Bei letzterem Gewebe handelt es sich natürlich um ein Ziel von Interesse für die Entwicklung von Amylin-Antagonist- und -Agonist-Wirkstoffen.
- Die Korrelation von Bindungsaktivität mit Stärke im Assay des Soleusmuskel-Insulin- Antagonismus zeigt, daß der oben beschriebene ¹²&sup5;I-r Amylin-Bindungsassay eine ausgezeichnete Voraussagefähigkeit in der Identifizierung von Agonisten und Antagonisten der Insulin-Gegenwirkungen von Amylin und CGRP besitzt. Die Fähigkeit eines Bindungsassays unter Verwendung von Hirngewebe zur Identifizierung des Amylin-Rezeptors und zur Identifizierung der Amylin-Rezeptorbindenden Verbindungen ist in hohem Maße unerwartet.
- Bei einer anderen Ausführungsform kann der Amylin-Rezeptor-Assay zur Bestimmung der Konzentration von Amylin- oder Amylin-Rezeptor-aktiven Verbindungen in unbekannten Lösungen oder Gemischen eingesetzt werden. Die Amylin-Rezeptoren werden analysiert, wie in untenstehendem Beispiel III beschrieben. Ein Membran- oder Zell-Präparat, das eine hohe Dichte an Amylin- Rezeptoren enthält, z. B. aus der Vorderhirnbasis-Region des Rattenhirns, oder ein Rezeptor-Protein-Präparat, wird mit radiomarkiertem Amylin und unmarkiertem Amylin bei Konzentrationen von 10&supmin;&sup6; M, wie in Beispiel III beschrieben, inkubiert. In dieser Weise wird eine Kompetitionskurve generiert, die die Menge an Amylin im Assay-Röhrchen zur Hemmung der erhaltenen Bindung von radiomarkiertem Amylin in Beziehung setzt. In zusätzlichen Röhrchen wird unmarkiertes Peptid durch eine Lösung ersetzt, die eine zu quantifizierende unbekannte Menge an Amylin enthält. Bei dieser Lösung kann es sich um Plasma, Serum oder eine andere Flüssigkeit, oder ein in Assay-Puffern ( . HBBP aus Beispiel III) gelöstes Feststoffgemisch handeln. Die unbekannte Lösung wird vorzugsweise in einem Volumen von weniger als oder gleich etwa 10% des Assay-Endvolumens zugegeben, um den Ionengehalt der Lösung nicht wesentlich zu verändern. Werden größere Volumina der unbekannten Lösung verwendet, so wird außerdem Lösung mitaufgenommen, die einen äquivalenten Salzgehalt umfaßt, um die Auswirkungen des veränderten Ionengehalts auf die Bindung zu kontrollieren. Die nichtspezifische Bindung, die Bindung von radiomarkiertem Amylin in Gegenwart einer hohen Konzentration (10&supmin;&sup6; M) von unmarkiertem Amylin oder Lachs-Calcitonin, wird von der Gesamtbindung für jede Probe zum Erhalt der spezifischen Bindung subtrahiert. Der Umfang der Hemmung der spezifischen Bindung von radiomarkiertem Amylin, wie durch die unbekannte Lösung erhalten, wird mit der durch Amylin generierten Inhibitionskurve verglichen, um den Gehalt an Amylin oder Amylin-Rezeptor-aktiven Substanzen in der unbekannten Probe zu bestimmen. Verfahren zur Durchführung dieser Berechnungen sind in verschiedenen Quellen beschrieben, wie etwa in Hsg. H. Yamamura, S. J. Enna, und M. J. Kuhar (Raven Press, New York, 1991).
- Dieses Verfahren wird zur Quantifizierung der Menge an Amylin-Rezeptor-aktiver Verbindungen in einer bekannten oder einer unbekannten Probe angewendet und kann zur Quantifizierung Amylin-Rezeptor-aktiver Verbindungen in Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten und -geweben, zur Verwendung beim Identifizieren aktiver Metaboliten, der Pharmakokinetik, der Stabilität, der Löslichkeit oder der Verteilung von Amylin-Agonisten und Amylin-Antagonisten dienen. Um, wo erforderlich, die Spezifität des Assays für Amylin zu erhöhen, kann die Menge an CGRP in der unbekannten Probe durch einen Radio-Rezeptor-Assay für CGRP bestimmt werden. Solch ein Radio-Rezeptor-Assay kann unter Verwendung von ¹²&sup5;I h CGRP und Rattenleber-Membranen, wie in Beispiel II beschrieben, mit dem dort beschriebenen Puffersystem gemäß den für den Amylin-Radio-Rezeptor-Assay beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Mit diesem Assay läßt sich der CGRP-Gehalt der unbekannten Probe bestimmen. Da der Amylin-Radio-Rezeptor- Assay alle Amylin-Rezeptor-aktive Verbindungen, einschließlich CGRP, identifiziert, ist es sinnvoll, den CGRP-Gehalt, wie mittels Radio-Rezeptor- oder einem anderen Assay, ( . Radioimmunoassay) bestimmt, vom Gesamtgehalt an Amylin-Rezeptoraktiven Verbindungen zu subtrahieren, um die Menge an Amylin in Proben ( Serum), die sowohl Amylin als auch CGRP enthalten können, zu erhalten.
- Bei wiederum einer anderen Ausführungsform wird der Amylin-Rezeptor bei einem Screening-Assay mit hohem Durchsatz unter wahlweiser Verwendung automatisierter Systeme, die den Fachleuten des Bereichs bekannt sind, zur Identifizierung von Verbindungen, die Amylin von seinem Rezeptor verdrängen, und so Kandidat- Agonisten oder -Antagonisten zu identifizieren. Der Assay kann zum Beispiel zum Screening von Banken synthetischer Verbindungen, Pflanzenextrakten, Extrakten von Meeresorganismen oder bakteriellen oder fungalen Fermentationsbrühen verwendet werden. Bei einer Ausführungsform werden beim Einleitungsschritt auf etwa 50 ul des oben beschriebenen Amylin-Rezeptor-Präparats, das mit etwa 10 bis etwa 15 pM ¹²&sup5;I-Bolton-Hunter-Ratten-Amylin, wie oben beschrieben, präinkubiert worden war, und etwa 50 ul der Lösung der Testverbindung in Assay-Puffer, enthaltend zum Beispiel bis zu 10% Ethanol oder 1% DMSO oder 5% Acetonitril zusammengebracht, um die Auflösung der Verbindung, falls erforderlich, zu erleichtern, wenn erforderlich. Bei organischen Extrakten sollte die Endkonzentration des Lösungsmittels im allgemeinen nicht die überschreiten, die die standardmäßige Verdrängungskurve von markiertem Amylin durch kaltes Amylin um 25% verdrängt, d. h. den gemessenen IC&sub5;&sub0; um weniger als 25% verschiebt. Dies läßt sich für jegliches gewählte Lösungsmittel auswerten. Bei identifizierten Verbindungen aus synthetischen Banken beträgt die Testkonzentration etwa 100 nM, 1 uM oder 10 uM, was von der Häufigkeit abhängt, mit der positive Tests auftreten. Ein positiver Test ist üblicherweise dargestellt durch eine mindestens etwa 20%ige Verminderung der spezifischen Bindung von markiertem Amylin. Bei Brühen und Extrakten ist ein positiver Test durch eine mindestens etwa 20%ige, 50%ige oder 80%ige Reduzierung bei der spezifischen Amylin-Bindung entsprechend der Häufigkeit positiver Tests gekennzeichnet.
- Beim Screening mit hohem Durchsatz ist es nützlich, die Verbindungen oder Gemische, die bei einem Ausgangs-Screening positive Tests ergaben, auf eine nichtspezifische Interferenz mit der Ligandenbindung zu überprüfen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden alle positiven Testverbindungen oder Extrakte einem Bindungsassay für einen anderen Liganden im gleichen Membran-Präparat unterzogen. Ein geeigneter Assay zur Auswertung nichtspezifischer Wirkungen ist der mit radiomarkiertem Spiperon oder einem Standardreagenz zur Bestimmung der Dopamin-(D&sub2;)-Rezeptorbindung. Hess , 238: 846-854 (1986). D&sub2;-Rezeptoren liegen in relativer Fülle vor und lassen sich in der Vorderhirnbasis leicht nachweisen. Alternativ dazu kann radioaktiv markiertes Haloperidol ebenso als der Ligand für Dopamin-Rezeptoren eingesetzt werden. Alle Verbindungen, Brühen oder Extrakte, die beim Amylin-Rezeptor-Screening einen positiven Test ergaben und auch beim Dopamin-Rezeptor-Screening anhand derselben quantitativen Kriterien einen positiven Test ergaben, werden als nichtselektiv mit der Ligandenbindung an Membranrezeptoren interferierend ausgeschlossen.
- Zu weiteren Ausführungsformen dieser Erfindung zählt die Bestimmung der Wechselwirkung mit CGRP-Rezeptoren von Verbindungen, Brühen oder Extrakten, die selektiv die Amylin-Bindung reduzieren. Daher werden ähnliche Schritte wie oben beschrieben mit einem Bindungsassay unternommen, bestehend aus mit etwa 10 bis 15 pM ¹²&sup5;I-his&sub1;&sub0;-h α-CGRP zuvor inkubierten Leberzellen oder Membranen. Unter Anwendung der oben spezifizierten quantitativen Kriterien für den Amylin-Assay werden die Verbindungen, Brühen oder Extrakte, die sowohl mit Amylin- als auch CGRP-Rezeptoren wechselwirken, als jene identifiziert, die selektiv am Amylin- Rezeptor, doch nicht am CGRP-Rezeptor, wirken.
- Für Verbindungen, die die beschriebenen Kriterien erfüllen, wird die Stärke der Wechselwirkung mit dem Amylin-Rezeptor und, falls relevant, den CGRP- oder Calcitonin-Rezeptoren, durch Messen der Verdrängung des Liganden aus dem Membranpräparat mittels eines Bereichs von Konzentrationen der Testverbindung bestimmt. Bei Gemischen aus unbekannten Verbindungen, wie bei Brühen und Extrakten, wird die gewünschte Aktivität mittels im Fachbereich bekannter Verfahren, einschließlich der HPLC, isoliert und ausgereinigt, gefolgt durch Testen der abgetrennten Stoffe zur Bestimmung derer, die die gewünschte Aktivität beibehalten. Wird reines oder relativ reines aktives Material erhalten, so kann seine Stärke am Amylin- und CGRP-Rezeptor bestimmt werden. Im Fachbereich bekannte Verfahren, einschließlich NMR, Massenspektroskopie und Elementaranalyse, können zur chemischen Identifizierung jeglichen isolierten Materials mit den erwünschten Rezeptor-bindenden Aktivitäten angewandt werden.
- Zu jedem gewünschten Stadium im Anschluß an die Identifizierung der selektiven Verdrängung des Amylin von seinen Rezeptoren kann ein positives Testmaterial bei einem funktionellen Assay beurteilt werden, um die Amylin-Agonist-Aktivität zum Beispiel durch die Hemmung der Insulin-stimulierten Aufnahme von markierter Glucose in das Glykogen im Ratten-Soleusmuskel auszuwerten. Der Stoff kann bei diesem Assay auch auf die Antagonist-Aktivität getestet werden, indem seine Fähigkeit zur Wiederherstellung der Insulin-stimulierten Aufnahme markierter Glucose in das Glykogen im Ratten-Soleusmuskel, inkubiert mit 10, 20, 50 oder 100 nM Ratten-Amylin, bewertet wird. Durch Anwendung unterschiedlicher Konzentrationen des Testmaterials bei diesen Assays kann die Stärke der Amylin- Agonist- oder -Antagonist-Wirkung bestimmt werden.
- Ein anderer Test der Amylin-Agonist-Wirkung verwendet eine Messung der Erhöhung des Plasmalactats und/oder -glucose zum Beispiel bei Halothananästhesierten, 18 Stunden lang fastengelassenen Ratten, gefolgt von intravenösen Bolus-Injektionen des Testmaterials. Durch Verwenden einer Reihe von Konzentrationen kann die Stärke des Materials als ein Amylin-Agonist bestimmt werden. Bei einem verwandten Assay der Antagonist-Aktivität wird das Testmaterial in 18 Stunden fastengelassene, anästhesierte Ratten intravenös infundiert. Die Verminderung (verglichen zu Kontrollbedingungen) der hyperlaktämischen und/oder hyperglykämischen Reaktion auf intravenöse Injektionen einer bekannten Menge an Amylin-Agonist wird dann gemessen oder anderweitig ausgewertet. Die Antagonist- Stärke dieses Materials kann durch Wiederholen des Tests bei verschiedenen Infusionsraten des Testmaterials bestimmt werden.
- Bei anderen Ausführungsformen werden die Testmaterialien hinsichtlich der Bestimmung, ob positiv getestete Materialien im Amylin-Rezeptor-Bindungsassay Agonisten oder Antagonisten sind, mit Amylin-reaktiven Membran- oder Zellsystemen zusammengebracht, bei denen Amylin die Syntheserate von zyklischem AMP verändert. Solche Präparate umfassen Membranen, die aus kultivierten Zellinien mit reichlich Amylin-Rezeptoren oder aus Zellen selbst hergestellt wurden. Veränderungen bei den cAMP-Gehalten werden mittels Radioimmunoassay nach Exposition der gemäß im Fachbereich bekannter Methoden inkubierten Membran- oder Zellpräparate gemessen. Von den Stoffen, die bei der Verdrängung von Amylin von seinen Rezeptoren positive Tests ergaben und die keine Auswirkung auf die cAMP- Produktion zeigen, kann erwartet werden, daß sie Amylin-Rezeptor-Antagonisten sind. Die Antagonist-Wirkung kann weiter durch Inkubieren verschiedener Konzentrationen des mit Amylin oder einem Amylin-Agonisten analogen Materials und durch Messen des Inhibitionsgrades von Veränderungen bei cAMP, wie durch Amylin oder einen Amylin-Agonisten hervorgerufen, ausgewertet werden.
- Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Erfindung zum Screening von Zellinien, aus Gewebeaufschluß erhaltenen Zellen und von Zellen aus humanem oder tierischem Blut auf Amylin-Rezeptoren verwendet. Diese Zellen werden als leicht zugängliche Quelle für zusätzliche Amylin-Rezeptor-Präparate zur Entwicklung der Agonisten und Antagonisten von Amylin-Rezeptoren eingesetzt. Die Zellmembranen werden durch Homogenisierung von Zellen mit einem Instrument, zum Beispiel einem Polytron (Brinkman Instruments), gefolgt durch Zentrifugation, erhalten. Die derart erhaltenen Membranen werden mit ¹²&sup5;I-Ratten-Amylin in einem Puffersystem, wie etwa dem in Beispiel III beschriebenen, kombiniert und dann inkubiert und aufgesammelt, wie in jenem Beispiel beschrieben. Die spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-Ratten-Amylin an die Zellmembran wird durch Messen der in Gegenwart von zum Beispiel 10&supmin;&sup7; M Ratten-Amylin oder 10&supmin;&sup7; M Lachs-Calcitonin erzielten Abnahme der Bindung identifiziert. Zellen, bei denen eine signifikante Differenz zwischen der Gesamtbindung (Triplikat-Röhrchen) und der nichtspezifischen Bindung (Triplikat- Röhrchen) beim P< 0,05-Niveau vorliegt, werden für eine weitere Untersuchung der Amylin-Rezeptor-Funktion verwendet.
- Der zuvor beschriebene Amylin-Rezeptor-Bindungsassay kann auch zur weiteren Ausreinigung der Amylin-Rezeptoren aus diese Rezeptoren enthaltenden Membranen verwendet werden. Die Membranen werden, wie in Beispiel III beschrieben, aus einer Region erhalten, zum Beispiel dem Nucleus accumbens des Hirns, in der eine hohe Dichte an Amylin-Rezeptoren nachgewiesen wurde. Subzelluläre Membran-Fraktionen, wie durch Differential- oder Dichtegradientzentrifugation erhalten, werden auf die spezifische Bindung von radiomarkiertem Amylin ausgewertet, um die Membran-Fraktion zu identifizieren, die die höchste Dichte an Amylin-Rezeptoren pro Milligramm Protein aufweist (wie durch Bradford- oder Lowry-Proteinassays analysiert). Bevorzugt wird die Membran-Fraktion mit der höchsten Rezeptordichte zur weiteren Ausreinigung verwendet.
- Diese Membran-Fraktion wird aufgesammelt und in einer gepufferten Lösung mit verschiedenen Membran-Aufschlußmitteln behandelt, umfassend Triton, Digitonin, Octylglucosid, Desoxycholat und Cholat, bei Konzentrationen von 0,001% bis 1% Detergens bei reduzierter Temperatur (4ºC) über etwa 1 Stunde hinweg behandelt. Die Protease-Inhibitoren (einschließlich Phenylmethylsulfonylfluorid, EDTA, Aprotinin) werden mit in das Puffersystem aufgenommen, um einen Rezeptorabbau während oder nach Aufschluß zu verhindern. Nach Behandlung der Membranen mit Detergentien werden nicht-aufgeschlossene Membranen mittels Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit (100.000 · g für 1 Stunde) sedimentiert und die resultierenden Überstände, enthaltend die aufgeschlossenen Rezeptoren, auf die Bindung an radiomarkiertes Metolazon, wie oben beschrieben, untersucht. Die aufgeschlossenen Rezeptoren können mittels Filtration auf Polyethyleniminbeschichteten Filtern aufgesammelt werden (Bruns, R. F., . Anal. Biochem. 132: 74-81 (1983). Alternativ dazu werden die aufgeschlossenen Rezeptoren mittels Verfahren), wie etwa einer Ausfällung mit Polyethylenglycol, der Gelfiltration oder Gleichgewichtsdialyse, aufgesammelt. Die Bindungseigenschaften (wie etwa die Affinität für Amylin, CGRP und Calcitonine) der aufgeschlossenen Rezeptoren werden ausgewertet und sollten mit den Eigenschaften der an der Membran lokalisierten Rezeptoren übereinstimmen.
- Nach Bestimmung der geeigneten Bedingungen zum Aufschluß der Amylin- Rezeptoren und zur Untersuchung der aufgeschlossenen Rezeptoren werden diese aufgeschlossenen Rezeptoren aus anderen aufgeschlossenen Membranproteinen mittels chromatographischer Verfahrensweisen ausgereinigt, wie etwa der Affinitätschromatographie auf Trägern, an die Amylin gekoppelt wurde, der Ionenaustausch- Chromatographie, der Lektin-Agarose-Chromatographie, der Gelfiltration und der hydrophoben Chromatographie. Die Chromatographie-Säuleneluate werden auf die spezifische Amylin-Rezeptor-Bindung an den Proteingehalt getestet, um Rezeptoren enthaltende Peaks und das Ausmaß der Reinigung zu identifizieren. Vor Aufnahme in das endgültige Reinigungsprotokoll wird jeder chromatographische Schritt zur Bestimmung des Ausmaßes getestet, in dem er zur Rezeptor-Reinigung beiträgt, wie durch einen Anstieg bei der spezifischen radiomarkierten Amylin-Bindung pro Milligramm Protein gemessen. Die gewünschten chromatographischen Schritte werden unter Verwendung großer Mengen an Ausgangsmaterial sequentiell kombiniert, um nach Wunsch teilweise oder vollständig gereinigte Amylin-Rezeptoren zu erhalten.
- Die Rezeptoren, die teilweise oder vollständig mittels dieses Verfahrens gereinigt wurden, werden zur Erzeugung Amylin-Rezeptor-spezifischer Antikörper zur Verwendung in der Diagnose (Erkrankungszustände mit veränderter Amylin- Rezeptor-Dichte, -Verteilung und -Antigenizität) und zur Verwendung beim Screening rekombinanter Banken für die Amylin-Rezeptor-Expression eingesetzt. Die gereinigten Rezeptor-Präparate können auch zur Gewinnung von Teilsequenz- Information verwendet werden, was zur Präparierung von Oligonukleotid-Sonden zum Screening rekombinanter Banken auf die Amylin-Rezeptor-kodierenden Gensequenzen nützlich ist.
- Spezifische Ausführungsformen des Screening-Verfahrens für den Rezeptor- Bindungsassays dieser Erfindung werden in den folgenden Beispielen erläutert. Diese Beispiele sind in keinster Weise als Einschränkung des Rahmens der Erfindung zu verstehen, wie er in den Ansprüchen dargelegt ist.
- Die Membranen wurden von männlichen Wistar- oder Sprague-Dawley-Ratten (200-250 Gramm) erhalten. Auf die Dekapitation hin wurden Leber, Soleusmuskel und Hirnregionen entnommen und in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 bei 4ºC, eingebracht. Die Gewebe wurden gewogen, dann in 5 ml/g Gewebe eiskalten 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, eingebracht und mit einem Polytron bei Einstellung 4 über 10 Sekunden hinweg homogenisiert. Weitere 30 ml kaltes HEPES wurden zugegeben und die Homogenate bei 48.000 · g über 15 Minuten hinweg zentrifugiert. Nach Abschöpfung der Überstandsflüssigkeiten wurden die Membran- Pellets in 40 ml frischem HEPES-Puffer homogenisiert und wie zuvor zentrifugiert. Die Membranen wurden nochmals mittels Homogenisation in Puffer und Zentrifugation gewaschen.
- Das endgültige Membran-Pellet wurde in einem Volumen von 20 mM HEPES-Puffer, enthaltend 0,2 mM PMSF, das direkt vor Verwendung aus einer 0,2 M Vorratslösung in Ethanol zugegeben wurde, resuspendiert. Dabei wurde ein ausreichendes Puffer- Volumen verwendet, um eine Konzentration von etwa 0 bis etwa 20 mg Ausgangsgewebe/ml zu erhalten.
- In 12 · 75 mm Glas- oder Polypropylen-Röhrchen wurden 150 ul HBBM-Puffer (20 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, enthaltend 1 mg/ml Bacitracin, 1 mg/ml Proteasefreie BSA-Fraktion V, 4 mM MgCl&sub2;), dem 0,2 mM PMSF direkt vor Verwendung zugegeben wurden, eingebracht.
- Dieser Lösung wurden 50 ul unmarkiertes Peptid, verdünnt in HBBM-Puffer bei Konzentrationen von 10&supmin;¹¹ bis 10&supmin;&sup6; M, zugegeben. Die Kontrollröhrchen enthielten lediglich HBBM. Dieser Lösung wurden 50 ul HBBM, enthaltend 5-7 fmol ¹²&sup5;I-h- CGRP oder ¹²&sup5;I-r Amylin, zugegeben. Die Inkubationen wurden durch Zugabe von 250 ul Puffer, enthaltend Membranen von 4 mg Originalgewicht des Gewebes, aufgenommen und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur (24ºC) fortgesetzt.
- Die Suspensionen wurden dann durch GF/B-Glasfaserfilter (zuvor 5 Stunden lang mit 0,3% PEI durchtränkt) in einem Brandel M-24-Harvester filtriert. Die Filter wurden direkt vor Verwendung mit 5 ml kaltem PBS und sofort nach Filtrierung mit 15 ml kaltem PBS gewaschen. Die Filter wurden dann in einem Gamma-Zähler gezählt.
- Die Bindung von ¹²&sup5;I-h CGRP wurde bei 1-150 pM zum Erhalt der Gesamtbindung und nochmals in Gegenwart von 100 nM unmarkiertem h CGRP zum Erhalt der nichtspezifischen Bindung gemessen. Die Konzentration des freien Liganden wurde durch Subtrahieren der Gesamtbindung vom insgesamt zugegebenen Liganden hergeleitet.
- Die Scatchard-Kompetitionskurven-Analyse wurde wie oben beschrieben vorgenommen.
- Die Bindung von 1,3-150 pM ¹²&sup5;I-h CGRP an Rattenleber-Membranen wurde in Abwesenheit und in Gegenwart von 10&supmin;&sup7; M h CGRP gemessen, um eine Sättigungskurve zu generieren. Die Scatchard-Analysen dieser Daten ergaben eine einzige ersichtliche Bindungsstelle mit den folgenden kinetischen Konstanten: Kd = 19,1 pM und Bmax = 49,4 fmol/mg Protein (Abb. 1).
- Die Kompetitionskurven (Abb. 2) ergaben, daß das Profil der Bindungsstelle h CGRP > h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; > r Amylin bei dem in Tabelle 1 gezeigten IC&sub5;&sub0; und den Hill- Gefälle-Werten waren: Tabelle 1
- Die Bindung von ¹²&sup5;I-CGRP αn Lebermembranen war in Gegenwart von 2 mM MgCl&sub2; etwa 2,8-fach erhöht.
- Unter diesen Bedingungen, bei entweder 1 uM h CGRP oder 1 uM r Amylin als dem verdrängenden Peptid, war keine spezifische Bindung von 15 pM ¹²&sup5;I-r Amylin an Rattenleber-Membranen nachweisbar.
- Diese Membranen zeigten eine ¹²&sup5;I-h CGRP-Bindungsstelle mit einem pharmakologischen Profil, identisch dem bei Leberzell-Membranen gemessenen Profil, . CGRP > CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; > Amylin, was die Feststellung widerspiegelt, daß der Peptid- Rezeptor in diesem Gewebe, wie in Lebermembranen, die Rezeptor-vermittelten Amylin-Wirkungen auf den Glykogen-Stoffwechsel im Soleusmuskel nicht simuliert [Amylin ≥ CGRP > CORP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;. Dieser Rezeptor ist jedoch bei Screening-Verfahren für CGRP-Agonisten und -Antagonisten oder zur Identifizierung von Amylin- Agonisten und -Antagonisten, die ganz oder teilweise für den Amylin-Rezeptor selektiv sind, nützlich.
- Auch diese Membranen zeigen eine spezifische ¹²&sup5;I-h CGRP-Rezeptorstelle. Die Stärke des r Amylins beim Konkurrieren um diese Bindungsstelle (IC&sub5;&sub0; = 6,2 nM) war seiner Stärke (10,5 nM, Tabelle 1) beim Konkurrieren um ¹²&sup5;I-h CGRP-Stellen in Lebermembranen ähnlich.
- Beim Test des markierten r Amylin direkt mit diesen Membranen wurde eine sehr geringe Dichte der spezifischen Bindungsstellen erhalten (0,009 fmol/mg Gewebe bei 10 pM ¹²&sup5;I-h Amylin), und lediglich ein geringer Teil der Gesamtbindung (15%) war durch 1 uM unmarkiertes r Amylin verdrängbar.
- Die Experimente mit Rattenleber- und Ratten-Soleusmuskel-Membranen ergaben, daß die größte unter Verwendung von ¹²&sup5;I-h CGRP unter den spezifizierten Konditionen nachweisbare Rezeptor-Population eine Bindungsaffinität (Ki) für r Amylin von 6-10 nM aufweist. CGRP ist 4mal so stark wie h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; und etwa 200mal stärker als r Amylin bei diesem Rezeptor, wie in Lebermembranen gemessen. Diese Affinität stimmt nicht mit den Rezeptor-vermittelten Amylin- Wirkungen auf den Glykogen-Stoffwechsel im Soleusmuskel überein, bei dem Amylin stärker ist als CGRP (Leighton 1988; Young , Amylin Corporation (unveröffentlicht).
- Sie stimmt auch nicht mit dem Stärkeverhältnis für Amylin und CGRP überein, die fastengelassenen, anästhesierten Ratten zur Bewirkung einer Hyperglykämie injiziert wurde. Bei Dosen von 1 und 10 ug ist Amylin das wirksamere hyperglykämische Mittel (Abb. 3), Amylin scheint an der relevanten Rezeptorstelle stärker zu sein. Die bei diesen Experimenten gemessene CGRP-Bindungsstelle steht daher mit größerer Wahrscheinlichkeit für die Rezeptor-vermittelten vasodilatatorischen Wirkungsweisen als für die durch CGRP und Amylin bewirkten Insulinantagonistischen Wirkungsweisen.
- Von der ventralen Oberfläche des Rattenhirns aus wurden Schnitte rostral zum Hypothalamus vorgenommen, der lateral durch die Riechbahnen begrenzt ist und im 45º-Winkel medial zu diesen Bahnen verläuft. Dieses Gewebe, das den Nucleus accumbens und die umgebenden Regionen umfaßt, wurde eingesammelt und gewogen und daraus Membranen präpariert, wie in Beispiel I beschrieben. Die Region, aus der Gewebe wie oben beschrieben entnommen wurde, wird hierin als Vorderhirnbasis bezeichnet und umfaßt den Nucleus accumbens und die umgebenden Regionen.
- Die Bindungsassays wurden wie in Beispiel II beschrieben vorgenommen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit den Rattenleber-Membranen war die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-h CGRP an Nucleus accumbens und umgebende Regionen eindeutig biphasisch (Abb. 4B) bei IC&sub5;&sub0;-Werten für die beiden Stellen von 26 pM bzw. 5,9 nM (Tabelle 2). Tabelle 2
- Auch Cerebrum-Membranen wurden getestet, da diese Fläche hohe Dichten an CGRP-Rezeptoren enthält, doch geringe bis gar keine der im Nucleus accumbens vorhandenen abweichenden CGRP-Rezeptor-Subtypen (Sexton , 1988). Die Hemmung der ¹²&sup5;I-h CGRP-Bindung an Cerebrum ergab lediglich die Stelle mit geringer Affinität (5 nM) für Amylin (Abb. 4A und Tabelle 2).
- Nachdem die hohe Affinität von Amylin für eine Subpopulation der durch ¹²&sup5;I-h CGRP markierten Rezeptoren in der Nucleus accumbens-Region gezeigt worden war, testeten wir die Fähigkeit von ¹²&sup5;I-r Amylin zur Bindung an Membranrezeptoren aus dieser Region des Rattenhirns. Für diese Experimente wurde ein kleineres Assay-Volumen verwendet, wobei MgCl&sub2; aus dem Inkubationsgemisch weggelassen wurde, da Vorab-Experimente ergaben, daß Mg²&spplus; die Bindung von ¹²&sup5;I-r Amylin vermindert. Ein mit HBBM identischer Puffer (wie in Beispiel I), doch ohne MgCl&sub2;, wird als HBBP bezeichnet (HEPES, Bacitracin, BSA, PMSF).
- Die Vorderhirnbasis-Membranen wurden aus Wistar- oder Sprague-Dawley-Rattenhirnen, wie oben beschrieben, präpariert. Auf die Zentrifugation der Gewebehomogenate hin wurde das endgültige Membranpellet in einem ausreichenden Volumen von 20 mM HEPES-Puffer (ohne PMSF) resuspendiert, um eine Konzentration von 50 mg Originalgewebe/ml zu erhalten.
- Die Kompetitionskurven wurden mittels des folgenden Verfahrens generiert. In 12 · 75 mm Polypropylen-Röhrchen wurden 0,1 ml HBBM-Puffergemisch und 20 ul unmarkiertes Peptid bei Konzentrationen von 10&supmin;¹¹ bis 10&supmin;&sup6; M in HBBP eingebracht. Die Kontrollröhrchen enthielten lediglich HBBP-Puffer. Anschließend wurden 30 ul HBBP, enthaltend 3 fmol¹²&sup5;I-r Amylin, zugegeben und die Reaktion durch Zugabe von 50 ul Puffer, enthaltend Membran von 2,5 mg Originalgewicht des Gewebes, eingeleitet. Die Inkubationen wurden vorgenommen und die Reaktionsgemische wie in Beispiel II beschrieben aufbereitet.
- Für die Experimente bezüglich der Sättigungsbindung wurde die Bindung von ¹²&sup5;I-r Amylin an Nucleus accumbens-Membranen bei 1, 2, 4, 9, 18, 35, 70 und 140 pM zum Erhalt der Gesamtbindung und nochmals in Gegenwart von 100 nM unmarkiertem Lachs-Calcitonin zum Erhalt der nichtspezifischen Bindung gemessen. Die Scatchard-Diagramme der Sättigungs-Isothermdaten waren monophasisch (Abb. 5). Die Bindungskonstanten für diese Stelle waren: Kd = 27,1 ± 2,1 pM; Bmax = 0,976 ± 0,096 fmol/mg Gewebe (Mittelwert ± SEM). Diese Befunde stützen unsere Entdeckung, daß Vorderhirnbasisgewebe, einschließlich des Nucleus accumbens und der umgebenden Regionen, Rezeptoren enthalten, die Amylin bei hoher Affinität und bei hoher Dichte der Bindungsstellen binden.
- Das pharmakologische Profil dieser Rezeptoren wurde durch Messen der Fähigkeit verschiedener unmarkierter Peptide zum Konkurrieren um die ¹²&sup5;I-Amylin-Bindung an Ratten-Vorderhirnbasis-Membranen bewertet. ¹²&sup5;I-Amylin war bei den Inkubationen bei einer Konzentration von 14 pM vorhanden, und die Peptide wurden bei 10 Konzentrationen im Bereich von 10&supmin;¹¹ M bis 10&supmin;&sup6; M getestet. Die Inhibitionskonstanten (Ki) sind in Tabelle 3 dargestellt und wurden aus den IC&sub5;&sub0; gemäß der Chang- Prusoff-Gleichung errechnet ( 22: 3099-3108 (1973)) unter Verwendung eines Wertes von 27,1 pM für den Kd von ¹²&sup5;I-Amylin. Tabelle 3 Inhibition der ¹²&sup5;I-r Amylin-Bindung an Ratten-Vorderhirnbasis-Membranen.
- Bei den Ergebnissen handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichungen aus 3-5 getrennten Experimenten unter Verwendung von zehn Konzentrationen jedes Peptids im Bereich von 10&supmin;¹¹ bis 10&supmin;&sup6; M.
- Die Ergebnisse zeigen, daß Ratten-Amylin die stärkste getestete Verbindung bei einem Ki war, der sehr dicht mit dem Kd (27,1 nM) überstimmte, wie aus der Scatchard-Analyse der Sättigungskurven erhalten. Aal- und Lachs-Calcitonin waren etwas weniger stark als Amylin. Ratten- und humanes β-CGRP waren 3mal bzw. 5mal weniger stark als Amylin, wohingegen a-CGRPs etwas weniger stark als die β-CGRPs waren. Ratten-Calcitonin erwies sich als sehr schwacher Inhibitor, was darauf hinweist, daß dieser Rezeptor nicht auf das in Ratten zirkulierende Calcitonin reagiert.
- Die höhere Affinität von Amylin als CGRP für diesen Rezeptor korreliert mit den relativen Stärken dieser Peptide beim Hemmen der Glykogenese im isolierten Soleusmuskel. Die hohe Affinität von Aal- und Lachs-Calcitonin ließ auf die überraschende Möglichkeit schließen, daß Teleost-Calcitonine starke Inhibitoren der Insulin-stimulierten Glykogenese sein könnten (siehe Beispiel V).
- Um die Fähigkeit des oben beschriebenen Amylin-Rezeptor-Assays zur Identifizierung von Antagonisten der glucoregulatorischen Wirkungen von Amylin weiter auszuwerten, wurde h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; als ein kompetitiver Inhibitor getestet. Von diesem verkürzten Analog von h CGRP wurde gezeigt, daß es die Insulininhibitorischen Wirkungen von Amylin im Soleusmuskel, wie oben beschrieben, antagonisiert. Der Ki von h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; für die ¹²&sup5;I-r Amylin-Bindung an Nucleus accumbens betrug 3 nM. Dieser Amylin-Rezeptor-Assay zeigt daher, daß h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; eine mäßige Affinität für neurale Amylin-Rezeptoren besitzt und sagt voraus, daß dieses Peptid wirksam sein wird, wenn es in Konzentrationen vom etwa 100fachen gegenüber Amylin vorhanden ist. Wie nachfolgend beschrieben, stimmt das mittels des Assays der Erfindung gemessene pharmakologische Profil des Amylin- Rezeptors mit dem Profil des Rezeptors überein, der die Inhibition der Insulinstimulierten Glykogenolyse im Skelett-(z. B. Soleus-)-muskel vermittelt.
- Die Bindung von ¹²&sup5;I-r Amylin (17 pM) an Membranen, die mittels des Verfahrens aus Beispiel III aus Hirnregionen, gepoolt aus 3 Sprague-Dawley-Ratten, isoliert worden waren, wurde mittels des auf Rezeptor-Basis arbeitenden Assays aus Beispiel II bestimmt. Die nichtspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 2,5 · 10&supmin;&sup8; M unmarkiertem r Amylin gemessen. Die in Abb. 6 gezeigten Werte repräsentieren den Mittelwert ± SEM von Triplikat-Röhrchen unter Verwendung einer einzigen Gewebsprobe.
- Der Nucleus accumbens und umgebende Region enthielten die höchste Dichte an Rezeptoren für r Amylin (Abb. 6).
- Ein Nutzen des Amylin-Rezeptor-Bindungsassays liegt in der Identifikation von Verbindungen, die die Amylin/Insulin-Wirkungen über eine Tätigkeit an Amylin- Rezeptoren bewirken können. Teleost-Calcitonine wurden auf ihre Fähigkeit zum Binden an den Amylin-Rezeptor im Assay einer Membran der Nucleus accumbens- Region ausgewertet, wobei eine hohe Affinität für den Amylin-Rezeptor entdeckt wurde (Beispiel III). Diese unerwarteten Ergebnisse führten zu unserer Feststellung, daß diese Peptidhormone starke Agonisten oder Antagonisten an Amylin- Rezeptoren im Skelettmuskel sein könnten. Dementsprechend wurden Aal- und Lachs-Calcitonine im Assay des Insulin-Antagonismus im Ratten-Soleusmuskel getestet.
- Die Fähigkeit von Insulin zur Stimulierung der Glykogen-Synthese im Ratten-Soleusmuskel wurde gemessen, wie von Leighton B. und Cooper, G. J. S., 335: 632-635 (1988) beschrieben, allerdings mit den folgenden Modifikationen. Die Ratten wurden vor der Opferung 4 Stunden lang nicht gefüttert; die Muskeln wurden nicht auf Klemmen gestreckt; Rinderserumalbumin (BSA) und HEPES wurden aus dem Assay-Medium weggelassen; und die verwendete Insulin-Konzentration betrug 1000 uU/ml.
- Ratten-Amylin hemmte die Stimulation der Glykogen-Synthese durch Insulin bei einem IC&sub5;&sub0; von 8,3 ± 1,9 nM (Mittelwert ± SEM für 6 Experimente). Der IC&sub5;&sub0; von h α-CGRP, der diese Wirkung erzeugte, betrug 24 nM (Mittelwert aus 2 Experimenten), war 3mal weniger stark. Der IC&sub5;&sub0; von Aal-Calcitonin betrug 0,4 nM und der IC&sub5;&sub0; von Lachs-Calcitonin 0,38 nM.
- Die Ergebnisse zeigten, daß sowohl Aal- als auch Lachs-Calcitonine starke Agonisten an Amylin-Rezeptoren im Ratten-Skelettmuskel waren, da sie beide die Insulin-stimulierte Glykogenese in diesem Gewebe bei subnanomolaren Konzentrationen wirksam reduzierten. Dieser Befund liefert einen weiteren starken Beweis für die Nützlichkeit der Erfindungen von auf Rezeptor-Basis arbeitenden Screening- Assays zur Identifizierung von Verbindungen, die an einem die glucoregulatorischen Wirkungen in peripheren Geweben vermittelndem Amylin-Rezeptor aktiv sind.
- Die Wirkungen von h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; im Glykogenese-System des Ratten-Soleusmuskels wurden gemäß des folgenden Verfahrens gemessen. Die Insulin-stimulierte Glykogen-Synthese wurde wie oben beschrieben in Gegenwart von 100 nM Ratten- Amylin zur maximalen Unterdrückung der Glykogen-Synthese gemessen. Es wurden steigende Konzentrationen von h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; zugegeben, um seine Fähigkeit zur Antagonisierung von Amylin zu testen, zur Steigerung der Glykogen-Synthese unter diesen Bedingungen. Die Ergebnisse zeigten, daß dieses verkürzte Analog von h CGRP die Wirkungen von 100 nM Amylin auf die Insulin-Stimulation der Glykogenese im Skelettmuskel bei einem IC&sub5;&sub0; von 6,6 ± 0,9 uM (Mittelwert ± SEM aus 4 Experimenten) antagonisierte. Dieser Wert ist etwa 800mal höher als der IC&sub5;&sub0; von r Amylin selbst. r Amylin war bei einer Konzentration vorhanden, die 12mal über seinem IC&sub5;&sub0; im Soleus-Assay lag, was darauf hinwies, daß h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; eine etwa 70mal geringere Affinität als r Amylin am relevanten Rezeptor im Skelettmuskel aufweist. Dieses Ergebnis stimmt mit der relativen Affinität von h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; und Ratten-Amylin, wie im Amylin-Rezeptor-Assay demonstriert, bei dem h CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; 100mal weniger stark als r Amylin ist (Beispiel III), überein.
- Es wurde beobachtet, daß alle getesteten Peptide eine im Soleusmuskel-Assay gemessene geringere Stärke als im isolierten Membranrezeptor-Bindungsassay ergaben, was zumindest teilweise auf einen begrenzten Zugang exogen präsentierter Peptide zu all den Zellen des intakten Soleusmuskels, auf einen erhöhten Stoffwechsel von Peptiden durch Muskel-Proteasen intakter Gewebe bei 37ºC und auf eine weniger wirksame Affinität der Liganden für Rezeptoren an intakten Zellen als in Membran-Fragmenten zurückführbar sein kann.
Claims (43)
1. Assay-Verfahren zur Verwendung bei der Identifizierung oder dem Screening von
Agonisten oder Antagonisten von Amylin, welches folgende Schritte umfaßt:
(a) Zusammenbringen einer Testprobe und eines Amylin-Rezeptor-Präparats, wobei
die Testprobe eine oder mehrere Testverbindungen enthält und das Amylin-
Rezeptor-Präparat ein isoliertes Zell- oder Membran-Präparat umfaßt, enthaltend
Amylin-Rezeptoren, die zum nachweisbaren Binden von Amylin fähig sind und
ein derartiges relatives Liganden-Bindungsprofil aufweisen, daß die
Bindungsstärke von Ratten-Amylin und Lachs-Calcitonin an das Rezeptor-
Präparat größer ist als die Bindungsstärke von Calcitonin-Gen-zugehörigem
Peptid (CGRP), daß die Bindungsstärke von CGRP an dieses Rezeptor-Präparat
größer ist als die Bindungsstärke von menschlichem CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;, wobei die
Bindungsstärke der Liganden durch Bestimmen der Fähigkeit der Liganden zum
Konkurrieren mit einem Amylin-Liganden um die Bindung an das Amylin-
Rezeptor-Präparat gemessen wird;
(b) Inkubieren der Testprobe und des Amylin-Rezeptor-Präparats unter
Bedingungen, die die Bindung von Amylin an das Amylin-Rezeptor-Protein
zulassen; und
(c) Identifizieren jener Testproben, enthaltend eine oder mehrere Testverbindungen,
die nachweisbar an das Rezeptor-Protein binden.
2. Assay-Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Testproben, die nachweisbar an
das Amylin-Rezeptor-Protein binden, durch Messen der Verdrängung eines
markierten ersten Liganden aus dem Amylin-Rezeptor-Präparat durch die
Testprobe und Vergleichen der gemessenen Verdrängung des ersten markierten
Liganden aus dem Amylin-Rezeptor-Präparat durch die Testprobe mit der
gemessenen Verdrängung dieses ersten markierten Liganden aus dem Amylin-
Rezeptor-Präparat durch einen oder mehrere bekannte zweite Liganden
identifiziert werden.
3. Assay-Verfahren nach Anspruch 2, wobei der markierte erste Ligand Amylin ist.
4. Assay-Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Amylin Ratten-Amylin ist.
5. Assay-Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Ratten-Amylin ¹²&sup5;I-Ratten-Amylin
ist.
6. Assay-Verfahren nach Anspruch 2, wobei der markierte erste Ligand ein Amylin-
Agonist ist.
7. Assay-Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Amylin-Agonist CGRP, Lachs-
Calcitonin oder Aal-Calcitonin ist.
8. Assay-Verfahren nach Anspruch 2, wobei der markierte erste Ligand ein Amylin-
Antagonist ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Amylin-Antagonist CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7; ist.
10. Assay-Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei der erste Ligand mit
einem radioaktiven Isotop, einem nicht-radioaktiven Isotop, einem
fluoreszierenden Molekül, einem chemilumineszierenden Molekül oder einem
biotinylierten Molekül markiert ist.
11. Assay-Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei der bekannte zweite
Ligand Amylin, Calcitonin, α-CGRP oder β-CGRP ist.
12. Assay-Verfahren nach Anspruch 11, wobei der bekannte zweite Ligand
menschliches Amylin, Hunde-Amylin, Ratten-Amylin, menschliches Calcitonin,
Ratten-Calcitonin, Aal-Calcitonin, Lachs-Calcitonin, menschliches α-CGRP,
menschliches β-CGRP, Ratten-α-CGRP oder Ratten-β-CGRP ist.
13. Assay-Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Amylin-
Rezeptor-Präparat isolierte Zellen umfaßt, die den Amylin-Rezeptor tragen.
14. Assay-Verfahren nach Anspruch 13, wobei die isolierten Zellen Nervenzellen
sind.
15. Assay-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Amylin-
Rezeptor-Präparat isolierte Membranen umfaßt, die den Amylin-Rezeptor tragen.
16. Assay-Verfahren nach Anspruch 15, wobei die isolierten Membranen aus
Nervenzellen isoliert sind.
17. Assay-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Amylin-
Rezeptor-Präparat isoliertes Amylin-Rezeptor-Protein umfaßt.
18. Assay-Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Amylin-Rezeptor-Protein aus
Nervenzellen isoliert ist.
19. Assay-Verfahren nach einem der Ansprüche 14, 16 oder 18, wobei die
Nervenzellen basale Ratten-Vorderhirnzellen sind.
20. Assay-Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches außerdem
umfaßt:
(c') Screening der Testproben, die nachweisbar an das Rezeptor-Protein binden, auf
die in vitro Stimulation oder Inhibition der Amylin-Rezeptor-vermittelten Aktivität;
und
(c") Identifizieren jener Testproben, die sich als Agonisten oder Antagonisten von
Amylin verhalten.
21. Assay-Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
Testprobe mehr als eine Testverbindung enthält, welches außerdem folgende
Schritte umfaßt:
(d) Gewinnen von zwei oder mehr zusätzlichen Testproben aus der Testprobe,
wobei die zusätzlichen Testproben dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine
geringere Anzahl von Testverbindungen enthalten als die Testprobe, aus der sie
gewonnen wurden; und
(e) Wiederholen der Schritte (a)-(d) so oft wie zum Identifizieren der Testverbindung
der -verbindungen, die an das Amylin-Rezeptor-Protein binden, erforderlich.
22. Assay-Verfahren zur Untersuchung einer oder mehrerer Rezeptor-
Bindungseigenschaften, die für eine bekannte oder Kandidat-Amylin-Agonist-
oder -Antagonist-Verbindung bestimmt werden soll, welches folgende Schritte
umfaßt:
(a) Bewerten oder Messen der Fähigkeit der Verbindung zum Konkurrieren gegen
einen markierten Liganden um die Bindung an ein Amylin-Rezeptor-Präparat,
wobei das Amylin-Rezeptor-Präparat ein isoliertes Zell- oder Membran-Präparat
umfaßt, enthaltend Amylin-Rezeptoren, die zum nachweisbaren Binden von
Amylin fähig sind und ein derartiges relatives Liganden-Bindungsprofil aufweisen,
daß die Bindungsstärke von Ratten-Amylin und Lachs-Calcitonin an das
Rezeptor-Präparat größer ist als die Bindungsstärke von CGRP, daß die
Bindungsstärke von CGRP an das Rezeptor-Präparat größer ist als die
Bindungsstärke von menschlichem CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;, wobei die Bindungsstärken dieser
Liganden durch Bestimmen der Fähigkeit dieser Liganden zum Konkurrieren mit
einem Amylin-Liganden um die Bindung an das Amylin-Rezeptor-Präparat
gemessen wird;
(b) Bewerten oder Messen der Fähigkeit der Verbindung zum Konkurrieren gegen
den markierten Liganden um die Bindung an ein CGRP-Rezeptor-Präparat,
wobei das CGRP-Rezeptor-Präparat ein CGRP-Rezeptor-Protein enthält, das
zum Binden an CGRP fähig ist; oder
(c) Bewerten oder Messen der Fähigkeit der Verbindung zum Konkurrieren gegen
den markierten Liganden um die Bindung an einen Calcitonin-Rezeptor, wobei
das Calcitonin-Rezeptor-Präparat ein CGRP-Rezeptor-Protein enthält, das zum
Binden an Calcitonin fähig ist; oder
(d) Durchführen beider Schritte (b) und (c); und
(e) Bestimmen der Rezeptor-Bindungseigenschaft, die für diese Verbindung
bestimmt werden soll.
23. Assay-Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Bindungseigenschaft, die für
diese Verbindung bestimmt werden soll, die Amylin-Rezeptor-Bindungsaffinität
oder Amylin-Rezeptor-Bindungsspezifität ist.
24. Assay-Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei das CGRP-Rezeptor-
Präparat Leberzell- oder Muskelzellmembranen umfaßt.
25. Assay-Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei das CGRP-Rezeptor-
Präparat Leberzellen oder Muskelzellen umfaßt.
26. Assay-Verfahren nach Anspruch 25, wobei sich die Zellen aus einer
Primärzellkultur oder einer etablierten Zellinie zusammensetzen.
27. Assay-Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Zellinie die Hep G2-Zellinie oder
die L6-Zellinie ist.
28. Assay-Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge einer
Amylin-Rezeptor-bindenden Verbindung in einer auf die Verbindung zu
untersuchenden Testprobe, welches folgende Schritte umfaßt:
(a) Zusammenbringen der zu untersuchenden Testprobe und eines Amylin-
Rezeptor-Präparats, wobei das Amylin-Rezeptor-Präparat ein isoliertes Zell- oder
Membran-Präparat umfaßt, enthaltend Amylin-Rezeptoren, die zum
nachweisbaren Binden von Amylin fähig sind und ein derartiges relatives
Liganden-Bindungsprofil aufweisen, daß die Bindungsstärke von Ratten-Amylin
und Lachs-Calcitonin an das Rezeptor-Präparat größer ist als die Bindungsstärke
von CGRP, daß die Bindungsstärke von CGRP an das Rezeptor-Präparat größer
ist als die Bindungsstärke von menschlichem CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;, wobei die
Bindungsstärke dieser Liganden durch Bestimmen der Fähigkeit dieser Liganden
zum Konkurrieren mit einem Amylin-Liganden um die Bindung an das Amylin-
Rezeptor-Präparat gemessen wird;
(b) Messen der Fähigkeit der Testprobe zum Konkurrieren gegen einen markierten
Liganden um die Bindung an das Amylin-Rezeptor-Präparat; und wahlweise
(c) Inbeziehungsetzen der Menge an Amylin-Rezeptor-bindender Verbindung in der
Testprobe mit der Menge an Amylin-Rezeptor-bindender Verbindung, wie für
eine Kontrollprobe gemäß der Schritte (a) und (b) gemessen, wobei die
Kontrollprobe als von jeglicher Amylin-Rezeptor-bindenden Verbindung frei
bekannt ist, und/oder Inbeziehungsetzen der Menge an
Amylin-Rezeptorbindender Verbindung in der Testprobe mit den Mengen an
Amylin-Rezeptorbindender Verbindung, wie gemessen gemäß der Schritte (a) und (b) für
Kontrollproben, die bekannte Mengen an Amylin-Rezeptor-bindender Verbindung
enthalten, zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge an Amylin-
Rezeptor-bindender Verbindung in der Testprobe.
29. Assay-Verfahren nach Anspruch 28, bei dem die Rezeptor-bindende Verbindung
und der markierte Ligand dieselben sind.
30. Assay-Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, wobei die
Amylin-Rezeptorbindende Verbindung Amylin, Amylin-Agonist oder Amylin-Antagonist ist.
31. Assay-Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, wobei der markierte Ligand Amylin,
Amylin-Agonist oder Amylin-Antagonist ist.
32. Assay-Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 31, wobei die Testprobe eine
biologische Flüssigkeit ist.
33. Assay-Verfahren nach Anspruch 32, wobei die biologische Flüssigkeit Blut,
Plasma, Harn, Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit oder Lymphflüssigkeit ist.
34. Assay-Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 31, wobei die Testprobe ein
Amylin-Präparat ist.
35. Verfahren, welches die Verwendung des Assay-Verfahrens nach einem der
Ansprüche 28 bis 34 zur Untersuchung der Stabilität eines Amylin-Präparats
umfaßt.
36. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die an den Amylin-Rezeptor
binden, welches folgende Schritte umfaßt:
(a) Immunisieren eines Tieres mit einem Amylin-Rezeptor-Präparat, umfassend ein
isoliertes Zell- oder Membran-Präparat, enthaltend Amylin-Rezeptoren, die zum
nachweisbaren Binden von Amylin fähig sind und ein derartiges relatives
Liganden-Bindungsprofil aufweisen, daß die Bindungsstärke von Ratten-Amylin
und Lachs-Calcitonin an das Rezeptor-Präparat größer ist als die Bindungpotenz
von CGRP, daß die Bindungsstärke von CGRP an das Rezeptor-Präparat größer
ist als die Bindungsstärke von menschlichem CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;, wobei die
Bindungsstärke der Liganden durch Bestimmen der Fähigkeit der Liganden zum
Konkurrieren mit einem Amylin-Liganden um die Bindung an das Amylin-
Rezeptor-Präparat gemessen wird;
(b) Rückgewinnen der B-Lymphozyten von den immunisierten Tieren;
(c) Verschmelzen der rückgewonnenen B-Lymphozyten mit malignen Zellen zur
Erzeugung von Hybridomen;
(d) Rückgewinnen von Hybridomen, die Antikörper erzeugen, die den Amylin-
Rezeptor binden; und
(e) Rückgewinnen von Antikörpern aus einem oder mehreren der in Schritt (d)
ausgewählten Hybridome.
37. Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern gegen den Amylin-Rezeptor, welches
folgende Schritte umfaßt:
(a) Immunisieren eines Tieres mit einem Amylin-Rezeptor-Präparat;
(b) Auswählen jener Tiere, deren Seren Anti-Amylin-Rezeptor-Antikörper enthalten;
und
(c) Rückgewinnen der Seren, die Anti-Amylin-Rezeptor-Antikörper enthalten, von
den ausgewählten Tieren.
38. Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, wobei das Amylin-Rezeptor-Präparat ein
basales Vorderhirnmembran-Präparat oder ein isoliertes Amylin-Rezeptor-
Protein-Präparat ist.
39. Verfahren zur Abspaltung von Amylin-Rezeptor-bindenden Verbindungen aus
einer Probe, welches folgende Schritte umfaßt:
(a) Zusammenbringen der Probe und eines Amylin-Rezeptor-Präparats, welches
Amylin-Rezeptor-Präparat an einen festen Träger gebundene Amylin-Rezeptor-
Proteinmoleküle umfaßt, wobei das Rezeptor-Präparat ein isoliertes Zell- oder
Membran-Präparat umfaßt, enthaltend Amylin-Rezeptoren, die zum
nachweisbaren Binden von Amylin fähig sind und ein derartiges relatives
Liganden-Bindungsprofil aufweisen, daß die Bindungsstärke von Ratten-Amylin
und Lachs-Calcitonin an das Rezeptor-Präparat größer ist als die Bindungpotenz
von CGRP, daß die Bindungsstärke von CGRP an das Rezeptor-Präparat größer
ist als die Bindungsstärke von menschlichem CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;, wobei die
Bindungsstärke der Liganden durch Bestimmen der Fähigkeit der Liganden zum
Konkurrieren mit einem Amylin-Liganden um die Bindung an das Amylin-
Rezeptor-Präparat gemessen wird;
(b) Abspalten jeglicher Amylin-Rezeptor-bindender Verbindung, die an das Amylin-
Rezeptor-Präparat gebunden ist, vom Rest der Testprobe, der ungebunden ist.
40. Verfahren für das Screening einer biologischen Substanz auf das Vorhandensein
von Amylin-Rezeptoren, die zum nachweisbaren Binden von Amylin fähig sind
und ein derartiges relatives Liganden-Bindungsprofil aufweisen, daß die
Bindungsstärke von Ratten-Amylin und Lachs-Calcitonin an das Rezeptor-
Präparat größer ist als die Bindungpotenz von CGRP, daß die Bindungsstärke
von CGRP an das Rezeptor-Präparat größer ist als die Bindungsstärke von
menschlichem CGRP&sub8;&submin;&sub3;&sub7;, wobei die Bindungsstärke der Liganden durch
Bestimmen der Fähigkeit der Liganden zum Konkurrieren mit einem Amylin-
Liganden um die Bindung an das Amylin-Rezeptor-Präparat gemessen wird,
welches folgende Schritte umfaßt:
(a) Zusammenbringen der biologischen Substanz mit einer ersten
Amylin-Rezeptorbindenden Verbindung;
(b) Zusammenbringen der biologischen Substanz mit einer zweiten Amylin-
Rezeptor-bindenden Verbindung;
(c) wahlweise Zusammenbringen der biologischen Substanz mit einer oder
mehreren zusätzlichen Amylin-Rezeptor-bindenden Verbindungen; und
(d) Bestimmen der relativen Bindungsaffinitäten der Amylin-Rezeptor-bindenden
Verbindungen für Rezeptoren in der biologischen Substanz.
41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die biologische Substanz Zellinien oder
isolierte Zellen umfaßt.
42. Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, wobei die Amylin-Rezeptor-bindende
Verbindung Amylin, ein Calcitonin, ein α-CGRP oder ein β-CGRP ist.
43. Assay-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, 28 bis 34 oder 39, wobei
die Testprobe eine oder mehrere bekannte Verbindungen enthält.
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