DE69129236T2

DE69129236T2 - Behandlung für gewebeulzerationen

Info

Publication number: DE69129236T2
Application number: DE69129236T
Authority: DE
Inventors: Richard E. Guilford Ct 06437 Galardy; Damian Watsonia North Victoria 3087 Grobelny; Gregory Gainsville Fl 32605 Schultz
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1990-11-21
Filing date: 1991-11-21
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2011-11-22
Also published as: US5114953A; CA2096223A1; ATE164767T1; EP0558681A1; AU9135191A; CA2096223C; JPH06102626B2; EP0558681A4; DE69129236D1; AU652016B2; JPH05508164A; EP0558681B1; ES2115668T3; WO1992009282A1

Description

Fachgebiet

Die Erfindung betrifft Arzneimittel, die bei Erkrankungen, die durch unerwünschte Collagenasewirkung gekennzeichnet sind, geeignet sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Hydroxamate, bei denen es sich um Dipeptidanaloga, die kondensierte oder konjugierte Bicycloarylsubstituenten umfassen, handelt.

Hintergrund

Es gibt ein Reihe von Enzymen, die einen Zusammenbruch von Strukturproteinen bewirken und bei denen es sich um strukturell verwandte Metalloproteine handelt. Zu diesen gehören die Fibroblastcollagenase der menschlichen Haut, die Fibroblastgelatinase der menschlichen Haut, die Collagenase und die Gelatinase des menschlichen Sputums sowie das Stromelysin des Menschen. Dabei handelt es sich um zinkhaltige Metalloproteinaseenzyme, wie die Angiotensin-Converting-Enzymes und die Enkephalinasen.
Collagenase und verwandte Enzyme sind als Vermittler der Symptomatalogie einer Reihe von Erkrankungen wichtig, einschließlich der rheumatischen Arthritis (Mullins, D.E., et al. Biochim. Biophys. Acta (1983) 695:117-214); der Metastase von Tumorzellen (ibid., Broadhurst, M.J., et al., EP-Anmeldung 267436 (1987), Reich, R., et al., Cancer Res. (1988) 48:3307-3312); und verschiedenen ulzerierten Zuständen. Ulzerierte Zustände können in der Kornea als Folge von Verätzungen mit Alkali oder als Folge von Infektionen durch Pseudomonas aeruginosa, Acanthamoeba, Herpes simplex und Vaccinaviren auftreten. Andere Zustände, die durch unerwünschte Metalloproteinasewirkung in der Matrix gekennzeichnet sind, schließen periodontale Erkrankungen und Epidermolysis bullosa ein.
Im Hinblick auf die Verwicklung von Collagenase in eine Reihe von Erkrankungszuständen wurden Versuche unternommen Inhibitoren dieses Enzyms herzustellen. Eine Reihe solcher Inhibitoren werden in den EP-Anmeldungen 126,974 (veröffentlicht 1984) und 159,396 (veröffentlicht 1985), die auf G.D. Searle übertragen wurden, offenbart. Bei diesen Inhibitoren handelt es sich um sekundäre Amine, die in beiden an das Aminostickstoffatom gebundenen Substituenten in der Position 2 Oxosubstituenten enthalten.
Mit den erfindungsgemäßen Verbindungen noch näher verwandt sind diejenigen, die in den US-Patenten 4,599,361 und 4,743,587, die ebenfalls auf G.D. Searle übertragen wurden, offenbart sind. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um Hydroxyamin-Dipeptidderivate, die als einen Bestandteil des Dipeptidrestes einen Tyrosin oder einen derivatisierten Tyrosinrest oder bestimmte Analoga davon enthalten.
US-A-4,473,587 offenbart in Beispiel 10 die Herstellung der Verbindung N-[3-(N'- Hydroxycarboxamid)-2-(2-methylpropyl)-propanoyl]-O-benzyl-L-Tyrosin-N-methylamid.
Von Tryptophan ist ebenfalls bekannt, daß es als Therapeutikum bei verschiedenen Zuständen wirksam ist, von denen bei einigen Collagenase beteiligt sein kann. (siehe zum Beispiel JP 57/058626; US 4,698,342; 4,291,048). In US 4,558,034 wurden ebenfalls Inhibitoren von bakteriellen Collagenasen offenbart.
Es wurde nun gefunden, daß die nachstehend beschriebenen Verbindungen bezüglich der Matrixmetalloproteasen eine überragende Remmwirkung besitzen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen ergänzen das Repertoire der Mittel, die für die Behandlung von Zuständen und Erkrankungen zur Verfügung stehen, die durch die unerwünschte Wirkung der Klasse von Proteinen gekennzeichnet sind, die Strukturproteine zerstören und die hier als "Matrixmetalloprotease" bezeichnet werden.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung stellt neue Verbindungen bereit, die zur Vorbeugung oder Behandlung von Gewebeulzerationen, insbesondere des Korneagewebes, geeignet sind. Die Verbindungen benutzen den Einbaus von Tryptophan oder anderen kondensieten oder konjugierten bicyclischen aromatischen Aminosäureresten in einen Inhibitor der Matrixmetalloproteinase in Form eines als Hydroxylamat derivatisierten Dipeptids aus.
Demgemäß bezieht sich die Erfindung in einer Ausführungsform auf die Behandlung von ulzeriertem Gewebe sowie auf Formulierungen zur Behandlung von ulzeriertem Gewebe mit Verbindungen der Formel:
wobei R¹ H und R² einen C&sub3;&submin;&sub8;-Alkylrest darstellen oder R¹ und R² zusammen einen Rest-(CH&sub2;)n- darstellen, wobei n = 3-5 ist;
R³ R oder einen C14-Alkylrest darstellt;
R&sup4; ein Zweiringsystem mit aromatischem Charakter, das eine Methylengruppe besitzt, darstellt;
X einen Rest OR&sup5; oder NHR&sup5; darstellt, wobei R&sup5; H oder einen substituierten oder unsubstituierten C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkylrest, C&sub6;&submin;&sub1;&sub2;-Arylrest oder C&sub6;&submin;&sub1;&sub6;-Arylalkylrest bedeutet; oder
X einen Aminosäurerest oder ein Amid davon darstellt; oder
X einen Rest eines cyclischen Amins oder heterocyclischen Amins darstellt; einschließlich der optischen Isomere und Racemate davon;
ausgenommen die Verbindung N-[3-(N'-Hydroxycarboxamido)-2-(2-methylpropyl)- propanoyl]-O-benzyl-L-Tyrosin-N-methylamid.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Bei Figur 1 handelt es sich um eine Darstellung, die die Wirkung des erfindungsgemäßen Inhibitors auf korneale Verätzungen unter Verwendung eines klinischen Bestimmungsverfahrens zeigt.
Figur 2 zeigt die entsprechende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung auf korneale Verätzungen unter Verwendung eines Perforationskriteriums.

Arten der Durchführung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Inhibitoren der Matrixmetalloproteasen von Säugern. Wie hier verwendet, bedeutet "Matrixmetalloprotease von Säugern" ein Enzym, das in Säugern gefunden wird und das unter Testbedingungen den Zusammenbruch von Collagen oder Gelatine katalysieren kann. Geeignete Testbedingungen können zum Beispiel im US-Patent 4,743,587 gefunden werden, das Bezug auf das Verfahren von Cawston, et al., Anal. Biochem. (1979) 99:340-345 nimmt, und die Verwendung eines synthetischen Substrats wird von Weingarten, H. et al., Biochem. Biophs. Res. Comm. (1984) 139:1184-1187 beschrieben.
Natürlich kann jedes Standardverfahren verwendet werden, das den Zusammenbruch dieser Strukturproteine analysiert. Bei den Matrixmetalloproteaseenzymen, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, handelt es sich um zinkhaltige Proteasen, die strukturell beispielsweise dem Stromelysin oder der Fibroblastcollagenase des Menschen ähnlich sind.
Die Fähigkeit der zu prüfenden Verbindungen die Matrixmetalloproteasewirkung zu hemmen, kann natürlich in den vorstehend beschriebenen Tests untersucht werden. Zur Bestätigung der Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen können isolierte Matrixmetalloproteaseenzyme verwendet werden oder Rohextrakte, die die Reihe von Enzymen enthalten, die Gewebezusammenbruch hervorrufen können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als modifizierten Dipeptide angesehen werden. Am "N-Terminus" befindet sich das Hydroxamatderivat eines Bernsteinsäure- oder Maleinsäuregrundgerüstes, wobei die alternierende Carboxylgruppe die Peptidbindung mit einer "C-terminalen" Aminosäure bildet. Bei der "C-terminalen" Aminosäure handelt es sich um einen Rest einer Aminosäure, die ein kondensiertes oder konjugiertes, bicyclisches aromatisches System enthält, wie ein Tryptophanrest oder ein Naphthylalanylrest. Der C-terminale Rest kann ebenfalls amidiert sein oder um einen oder zwei zusätzliche Aminosäurereste verlängert sein.
Somit können die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Umsetzung der entsprechenden nicht derivatisierten Verbindungen, bei denen es sich Carbonsäuren oder Ester des Maleinsäure und Bernsteinsäurerestes handelt, mit Hydroxylamin hergestellt werden.
Der "N-terminale" Rest in Formel 1 enthält mindestens eine und in einigen Fällen zwei chirale Zentren. Innerhalb der Erfindung ist jede Konfiguration an jedem chiralen Zentrum eingeschlossen, ebenso wie Gemische von Verbindungen, die die beiden möglichen Konfigurationen an jedem Chiralitätspunkt enthalten. Jedoch wird im allgemeinen gefunden, daß eine bestimmte Konfiguration an jedem dieser chiralen Zentren bevorzugt wird. Ähnlich kann bei Verbindungen der Formel 2 die Doppelbindung entweder in cis- oder trans-Konfiguration vorliegen. In diesem Fall wird ebenfalls eine oder die andere Konfiguration für einen bestimmten Satz von Ausführungsformen bevorzugt. Das Kohlenstoffatom, an das der Rest R&sup4; gebunden ist, ist in beiden Formeln chiral. Obwohl beide Konfigurationen in der Erfindung eingeschlossen sind, wird diejenige bevorzugt, die einer L-Aminosäure entspricht.
Wie hier verwendet, hat "Alkyl" die herkömmliche Bedeutung eines geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten Kohlenwasserstoffrestes, wie eine Methyl-, Ethyl-, Isobutyl-, Cyclohexyl-, t-Butylgruppe oder dergleichen. Die erfindungsgemäßen Alkylsubstituenten können 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, die mit 1 oder 2 Substituenten substituiert sein können. Substituenten sind im allgemeinen diejenigen, die die Wirksamkeit der Verbindung nicht beeinflussen, einschließlich Hydroxyl gruppen, des Restes "CBZ", Aminogruppen und gleichen. "Aryl" bezieht sich auf aromatische Ringsysteme, wie Phenyl-, Naphthyl-, Pyridyl-, Chinolyl-, Indolylreste und dergleichen; "Arylalkyl" bezieht sich auf Arylreste, die über einen Alkylrest mit der angegebenen Position verknüpft sind. "Aycl" bezieht sich auf einen Substituenten der Formel RCO-, wobei der Rest R einen wie vorstehend definierten Alkylrest darstellt. "Cyclische Amine" beziehen sich auf diejenigen Amine, in denen das Stickstoffatom einen Teil eines heterocyclischen Rings darstellt, wie Piperidin, "heterocyclische Amine" beziehen sich auf solche Heterocyclen, die ein zusätzliches Heteroatom enthalten, wie Morpholin.
Bei den Verbindungen der Formel 1 gehören zu den bevorzugten Ausführungsformen für R¹ und R² diejeningen, in denen R¹ H und R² eine Isobutyl-, 2-Methylbutyl- oder Isopropylgruppe darstellen. Besonders bevorzugt ist die Isobutylgruppe.
Für beide Formeln 1 und 2 stellt in den bevorzugten Ausführungsformen R³ H und eine Methylgruppe dar, insbesondere H.
Bei R&sup4; handelt es sich um ein kondensiertes oder konjugiertes, bicyclisches aromatisches System, das über eine Methylengruppe an das Molekül gebunden ist. Dabei handelt es sich um ein Zweiringsystem mit aromatischen Charakter, das ferner ein oder mehrere Heteroatome, wie S, N oder O enthalten kann. Wenn ein Heteroatom wie N eingeschlossen ist, kann das System, das einen Teil der Formeln (1) oder (2) bildet, eine an das Stickstoffatom gebundene Acylschutzgruppe (C&sub1;&submin;&sub5;) enthalten. Beispielhafte kondensierte, bicyclische aromatischen Systeme schließen die Naphthyl-, Indolyl-, Chinolinyl- und Isochinolinylgruppe ein. Beispielhafte konjugierte Systeme schließen die Biphenyl-, Phenylpyrimidyl-, 3-Phenylpyridylgruppe und dergleichen ein. In allen Fällen kann jede verfügbare Position des kondensierten oder konjugierten bicyclischen Systems für die Bindung über die Methylengruppe verwendet werden. Das kondensierte oder konjugierte aromatische System kann ferner durch ein bis zwei (C&sub1;&sub4;)- Alkylreste und/oder eine Hydroxygruppe substituiert sein.
Bevorzugte Ausführungsformeri für R&sup4; schließen die 1-(2-Methylnaphthyl)methylen-, 1-Chinolylmethylen-, 1-Naphthylmethylen-, 2-Naphthylmethylen-, 1-Isochinolylmethylen-, 3- Isochinolylmethylen-, 3-Thionaphthylenmethylen-, 3-Cumaronylmethylen-, 3-(5-Methylindolyl)methylen-, 3-(5-Hydroxyindolyl)methylen-, 3-(2-Hydroxyindolyl)methylen-; Biphenyl- und die 4-Phenylpyrimidylgruppe ein.
Viele dieser Substituenten sind als Teile eines Aminosäurerestes in Greenstein und Winitz, "Chemistry of the Amino Acids" (1%1) 3:2731-2741 (John Wiley & Sons, NY) beschrieben.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für R&sup4; ist die 3-Indolylmethylengruppe oder deren N-acyliertes Derivat, d.h. diejenige Ausführungsform, in der die "C-terminale" Aminosäure einen Tryptophanrest oder eine geschützte Form davon darstellt. Eine bevorzugte Konfiguration an dem Kohlenstoffatom, an den Rest R&sup4; gebunden ist, ist diejenige, die L- Tryptophan entspricht.
Bevorzugte Ausführungsformen für X sind diejenigen der Formel NHR&sup5;, in denen R&sup5; H, einen substituierten oder unsubstituierten C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;&submin;Alkylrest oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Arylalkylrest bedeutet. Besonders bevorzugte Substitutentionen an R&sup5; erfolgen durch eine Hydroxylgruppe oder eine Phenylmethoxycarbamylgruppe (CBZ). Zusätzlich kann das "Dipeptid" durch Ausführungsformen, in denen X einen zusätzlichen Aminosäurerest darstellt, verlängert sein, insbesondere durch einen Glycyl rest, der wie beschrieben auch amidiert sein kann.

Therapeutische Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen

Wie im vorstehenden Kapitel Hintergrund bekanntgegeben, ist eine Reihe von Erkrankungen bekannt, die durch überschüssige oder unerwünschte, die Matrix zerstörende Metalloproteasewirkung vermittelt werden. Zu diesen gehören Tumormetastase, rheumatische Arthritis, Ulzerationen, insbesondere der Kornea, Reaktion auf Infektionen und dergleichen. Die Behandlung von ulzeriertem Gewebe wird durch die direkte Anwendung der Verbindung oder ihrer Zusammensetzungen bewirkt, wenn das Gewebe zugänglich ist, oder es kann eine systemische Verabreichung erforderlich sein, wenn dies nicht der Fall ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher zur Verwendung für die Behandlung oder Vorbeugung dieser Zustände zu Arzneimitteln formuliert werden. Es werden pharmazeutische Standardformulierungverfahren verwendet, wie sie in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, neuste Ausgabe offenbart sind. Wenn die Verbindungen injiziert werden, können sie unter Verwendung von herkömmlichen Excipienten, wie physiologischer Kochsalzlösung, Hank's Lösung, Ringerlösung und dergleichen, für Injektionen formuliert werden. Die Injektion kann intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder subkutan erfolgen Dosierungsspiegel liegen in der Größenordnung von 0,1 ug/kg des Patienten bis zu 1 mg/kg des Patienten, natürlich in Abhängigkeit von der Natur der Ulzeration, der Art des Patienten, der gewählten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen, der Natur der Formulierung und von dem Verabreichungsweg.
Zusätzlich zu der Verabreichung durch Injektion können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zu Zusammensetzungen für transdermale oder transmucosale Verabreichung formuliert werden, indem Mittel eingebaut werden, die das Eindringen in diese Gewebe bewirkt, wie Gallensalze, Fusidinsäurederivate, Cholsäure und dergleichen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Abhängigkeit von der Natur des zu behandelnden Zustands in Verabreichungssystemen auf Liposombasis und in Formulierungen für topische und orale Verabreichung verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren können unter Verwendung von zielspezifischen Liganden auf bestimmte Stellen, an die Matrixmetalloproteasen angehäuft sind, gerichtet werden. Um zum Beispiel die Inhibitoren auf die Matrixmetalloprotease zu richten, die in einem ulzerierten Gewebe enthalten ist, wird der Inhibitor mit einem gewebespezifischen Marker an einen Antikörper oder ein Fragment davon gebunden, das immunoreaktiv ist, wie es im allgemeinen bei der Herstellung von Immunotoxinen bekannt ist. Bei dem zielgerichteten Liganden kann es sich auch um einen Liganden handeln, der für einen Rezeptor geeignet ist, der auf dem Gewebe vorhanden ist. Es kann jeder zielgerichtete Ligand verwendet werden, der spezifisch mit einem Marker für das gewünschte Zielgewebe reagiert. Verfahren zur Bindung der erfindungsgemäßen Verbindungen and den zielgerichteten Liganden sind bekannt und denen ähnlich, die nachstehend für die Bindung an einen Träger beschrieben sind.
Zur topischen Verabreichung bei der direkten Behandlung von ulzeriertem Gewebe können die Verbindungen auf eine Art und Weise formuliert werden, die für das Zielgewebe geeignet ist. Für oberflächliche Ulzerationen erfolgt die Verabreichung im allgemeinen in der Form von Salben, Pasten, Lotionen, Gelen und dergleichen. Typische, in diesen Formulierungen vorhandene Excipienten können verwendet werden, um die Applikation des Wirkstoffs auf das krankhafte Gewebe zu erleichtern.
Wenn sich das ulzerierte Gewebe im Verdauungstrakt befindet, werden die Zusammensetzungen für die orale Verabreichung formuliert, wobei Sirupe, Tabletten, Kapseln und dergleichen verwendet werden. Für weniger zugänglichen Läsionen kann, wie vorstehend beschrieben, eine systemische Verabreichung notwendig sein.

Herstellung und Verwendung von Antikörpern

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch für Immunisierungsprotokolle verwendet werden, wobei für die erfindungsgemäßen Verbindungen immunospezifische Antiseren erhalten werden. Da es sich bei den erfindungsgemäßen Verbindungen um relativ kleine Haptene handelt, werden sie vorteilhafterweise an Träger gebunden, die bezüglich der Antigene neutral sind, wie das herkömmlicherweise verwendete Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) oder Serumalbuminträger. Die Kupplung an den Träger kann nach Verfahren durchgeführt werden, die im allgemeinen im Fachgebiet bekannt sind; mit der -COX-Funktionalität der erfindungsgemäßen Verbindungen bietet sich eine besonders günstige Stelle für die Anwendung dieser Techniken an. Zum Beispiel kann der -COX-Rest zu einem Aldehyd reduziert werden und über eine Umsetzung mit Seitenkettenketteaminogruppen in Trägern auf Proteinbasis gekuppelt werden, gegebenenfalls gefolgt von der Reduktion der gebildeten Iminobindung. Der -COX-Rest kann auch mit Seitenkettenaminogruppen unter Verwendung von Kondensationenmitteln, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder anderen Carbodiimid-Dehydratisierungsmitteln, umgesetzt werden. Ebenso können Linkerverbindungen verwendet werden, um die Kupplung zu bewirken; von der Pierce Chemical Company, Rockford, IL sind sowohl homo-bifunktionelle als auch hetero-bifunktionelle Linker erhältlich. Die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verbindungen 31-34 sind dafür bestimmt, über ihre C-terminalen Carboxylgruppen (oder Aminogruppen bei der Verbindung 32) unter Verwendung von passenden Kupplungsmitteln an Träger gebunden zu werden, die bezüglich der Antigene neutral sind.
Der erhaltene immunogene Komplex kann dann in geeignete Säuger, wie Mäuse, Kaninchen und dergleichen injiziert werden. Geeignete Protokolle umfassen die wiederholte Injektion des Immunogens in Gegenwart von Adjuvantien nach einem Schema, das die Herstellung von Antikörpern im Serum ankurbelt. Die Titer des Immunserums können ohne weiteres unter Verwendung von Immunoassay-Verfahren, die im Fachgebiet nun Standard sind, unter Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen als Antigene gemessen werden.
Die erhaltenen Antiseren können direkt verwendet werden oder es können monoklonale Antikörper erhalten erhalten werden, indem die Lymphocyten aus peripherem Blut oder die Milz von immunisierten Tieren geerntet werden oder die Antikörper produzierenden Zellen immortalisiert werden, gefolgt von der Identifizierung der geeigneten Antikörperproduzenten unter Verwendung von Standardimmunoassaytechniken.
Die polyklonalen oder monoklonalen Präparationen sind dann für die Überwachung von Therapie oder Prophylaxeschemata, die die erfindungsgemäßen Verbindungen einschließen, geeignet. Geeignete Proben, wie diejenigen die aus Blut, Serum, Urin oder Speichelflüssigkeit gewonnen werden, können zu verschiedenen Zeiten während des Behandlungsprotokolls auf die Anwesenheit des verabreichten Inhibitors untersucht werden, indem Standardimmunoassaytechniken verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Antikörperpräparationen einsetzen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können unter Verwendung von Standardkupplungsverfahren auch an Isotopenmarkierungen, wie szintigraphische Markierungen, z.B. Technetium-99 oder I-139, gebunden werden. Die markierten Verbindungen werden Patienten verabreicht, um in vivo die Orte von überschüssigen Mengen eines oder mehrerer Matrixmetalloproteasen zu bestimmen. Die Fähigkeit der Inhibitoren, Matrixmetalloproteasen selektiv zu binden, wird somit ausgenutzt, um die Verteilung dieser Enzyme Ln situ abzubilden. Die Techniken können natürlich auch bei histologischen Verfahren eingesetzt werden und die markierten, erfindungsgemäßen Verbindungen können in kompetitiven Immnoassays verwendet werden.

Verwendung als Affinitätsliganden

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können an feste Träger, wie Trennmembranen, chromatographische Träger, wie Agarose, Sepharose, Polyacrylamid und dergleichen, oder an Mikrotiterplatten gekuppelt werden, wobei Affititätsträger erhalten werden, die für die Reinigung von verschiedenen Matrixmetalloproteasen von Säugern geeignet sind. Die selektive Bindung der Matrixmetalloproteasen an den Inhibitorliganden erlaubt die Adsorption des gewünschten Enzyms und seine nachfolgende Elution, indem zum Beispiel veränderte Ionenstärken und/oder pH-Bedingungen verwendet werden.

Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen

Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen erhalten, indem eine Carbonsäure- oder eine Estervorstufe der Formeln
wobei R H oder einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl rest darstellt, durch die Behandlung dieser Verbindungen oder der aktivierten Formen davon mit Hydroxylamin unter Bedingungen, die eine Überführung bewirken, in die entsprechenden Hydroxamate überführt werden.
Im allgemeinen wird das Hydroxylaminreagenz in situ erzeugt, indem das Hydrochloridsalz mit einem Überschuß an KOH in Methanol gemischt wird und das ausgefallene Kaliumchlorid durch Filtration entfernt wird. Das Filtrat wird dann mehrere Stunden bei Raumtemperatur mit der aktivierten Carbonsäure oder eine Estervorstufe der Formeln 3 oder 4 gerührt, und das Gemisch wird dann unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird angesäuert, dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, extrahiert, der Extrakt wird mit wäßriger Kaliumhydrogensulfatlösung und Kochsalzlösung gewaschen und dann mit einem festen Trocknungsmittel, wie wasserfreiem Magnesiumsulfat, getrocknet. Der Extrakt wird dann erneut bis zur Trockne eingedampft und kristallisiert.
Zur Herstellung der Ausgangsmaterialien der Formeln 3 und 4 wird die einfach veresterte Carbonsäure der Formel
oder der Formel
mit der Aminosäure der Formel
in der X etwas anderes als OH darstellt, unter Bedingungen umgesetzt, unter denen eine Kondensation zur Erzeugung der Peptidbindung stattfindet. Solche Bedingungen umfassen typischerweise das Mischen der beiden Komponenten in einem nicht-wäßrigen, wasserfreien, polaren aprotischen Lösungsmittel in Gegenwart von Base oder einem Kondensationsmittel, wie einem Carbodiimid. Somit kann die Erzeugung der Peptidbindung in Gegenwart von Standarddehydratisierungsmitteln, wie den Carbodiimiden, zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N-Carbonyldiimidazol, katalysiert werden. Das Produkt wird dann als ein Diastereomerengemisch der Formel 3 oder 4 gewonnen. Dieses Gemisch wird vorzugsweise für die Überführung in die Hydroxamate, wie sie vorstehend beschrieben ist, verwendet und eines der erhaltenen Diastereomere wird direkt aus dem Produktgemisch kristallisiert. Alternativ können die Diastereomere vor der Überführung in die Hydroxamate durch Flashchromatographie getrennt und einzeln gewonnen werden. Dieses Verfahren ist im Vergleich zu dem Verfahren, in dem die Trennung der Diastereomeren aufgeschoben wird, bis das Endprodukt erhalten wird, weniger bevorzugt.
Bei den in den Beispielen verwendeten Bezeichnungen ist das Isomere "A" als dasjenige definiert, das im DSC schneller wandert und das Isomere "B" als dasjenige, das langsamer wandert. Wenn die "L"-Form von Tryptophan oder einer ander Aminosäure in einem kondensierten, bicyclischen aromatischen Ringsystem als "C-terminaler" Rest verwendet wird, handelt es sich im allgemeinen bei der "A"-Form um diejenige, die die übereinstimmende Konfiguration an dem Kohlenstoffatom, das den R²-Substituenten trägt (vorausgesetzt, daß es sich dabei um das einzige andere Asymmetriezentrum handelt), in dem Hydroxamatendprodukt enthält. Jedoch enthält im nachstehenden Beispiel 2, bei dem in der Verbindung D-Tryptophan eingebaut ist, das "B"-Isomere diejenige Verbindung, die einer "L"-Konfiguration an dem Kohlenstoffatom, das in Verbindungen der Formel 1 den Rest R² trägt, entsprechen würde.
Die Komponenten, aus denen die Verbindungen der Formeln 3 und 4 erzeugt werden, sind im Falle des Tryptophans und seiner Analoga in Form von Estern oder Amiden ohne weiteres erhältlich.
Wie vorstehend bekanntgegeben, werden viele analoge, kondensierte bicyclische aromatische Ringsysteme von Greenstein und Winitz (siehe oben) beschrieben. Die Aminosäuren, in denen R&sup4; eine 1-(2-Methylnaphthyl)-methylen-; 1-Chinolylmethylen-; 1-Naphthylmethylen-; 1-Isochinolylmethylen und 3-Isochinolylmethylengruppe darstellt, können, wie im Fachgebiet bekannt, aus den bicyclischen aromatischen Methylenhalogeniden unter Verwendung der Acetamidomalonsäureestersynthese von Aminosäuren hergestellt werden. Die Methylenhalogenide selbst können aus ihren entsprechenden Carbonsäuren durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid und Bromierung des erhaltenen Alkohols mit Thionylbromid hergestellt werden.
In einigen Fällen sind die derivatisierten Malein und Bemsteinsäurereste ebenfalls im Handel erhältlich. Falls nicht, können sie ohne weiteres hergestellt werden, in den Ausführungsformen, in denen R¹ H ist, durch Umsetzung eines 2-Oxocarbonsäureesters der Formel R²COCOOR' in einer Wittigreaktion mit einem Alkyltriphenylphosphoranyliden-acetat. Das Methylacetat ist bevorzugt, es kann jedoch jeder geeignete Ester verwendet werden. Die Umsetzung wird in einem nicht-wäßrigen, unpolaren Lösungsmittel normalerweise bei Raumtemperatur durchgeführt. Die erhaltene Verbindung hat die Formel ROOCCR¹CR²COOR', wobei R und R' die Reste der veresterten Alkyl- oder Arylalkylalkohole darstellen.
Wenn die Verbindungen der Formel 4 gewünscht sind, wird dieses Produkt mit dem passenden Tryptophan oder einem analogen Derivat kondensiert; wenn die Verbindungen der Formel 3 gewünscht sind, wird die Zwischenverbindung unter Verwendung von Wasserstoff mit einem geeigneten Katalysator reduziert. Die Reaktionsfolge, um diejenigen Ausführungsformen zu erhalten, in denen R¹ H und R² einen Alkylrest darstellen, sind im Reaktionsschema 1 aufgeführt. Reaktionsschema 1 Formel
* Durch die Hydrierungsreaktion wird R' entfernt, wenn R' = Benzyl ist.
In den Ausführungsführungsformen, in denen R¹ und R² zusammengenommen einen Rest (CH&sub2;)n darstellen, können die erfindungsgemäßen Verbindungen auf analoge Art und Weise, wie sie Reaktionsschema 1 bekanntgegeben ist, hergestellt werden, mit der Ausnahme, daß die Zwischenverbindung der Formel ROOCCHR¹CHR²COOR aus der entsprechenden 1,2- Cycloalkandicarbonsäure, d.h. 1,2-Cyclopentandicarbonsäureanhydrid; 1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid oder 1,2-Cycloheptandicarbonsäureanhydrid, hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, jedoch nicht einschränken.

BEISPIELE

In den nachstehenden Beispielen handelt es sich bei den DSC-Systemen um folgende: (A) Ethylacetatimethanol (95:5); (B) Ethylacetat/Methanol (25:5); (C) Ethylacetat; (D) Ethylacetat/Methanol (30:5); (E) Ethylacetat/Hexan (1:1); (F) Chloroform/Methanol/Essigsäure (30:60:2).

Beispiel 1

Herstellung von N-[D,L-2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- trvptophan-methylamid

Eine Suspension aus 5 g (0,033 mol) des Natriumsalzes von 4-Methyl-2-oxopentansäure und 5,65 g (0,033 mol) Benzylbromid in 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurde 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde der Rückstand mit Hexan auf 100 ml verdünnt, mit Wasser (3 x 20 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittel lieferte 6,4 g (88% Ausbeute) 4-Methyl-2-oxopentansäurebenzylester (1) als ein farbloses Öl.
Ein Gemisch aus 6,4 g (0,029 mol) (1) und 9,7 g (0,029 mol) Methyl(triphenylphosphoranyliden)-acetat in 100 ml trockenem Methylenchlorid wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Hexan (3 x 50 ml) extrahiert. Die Hexanlösung wurde mit 10%iger Natriumhydrogencarbonatlösung (2 x 30 ml), Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels lieferte 8,01 g (100% Ausbeute) Benzyl-2-isobutyl-3-(methoxycarbonyl)-propionat (2) als ein Gemisch von E- und Z- Isomeren.
Ein Gemisch aus 8,01 g (0,029 mol) (2) und 1 g 10%igem Palladium auf Aktivkohle in 50 ml Methanol wurde 8 Stunden unter 4 Atmosphären Wasserstoffgas bei Raumtemperatur hydriert. Nach Entfernung des Katalysators durch Filtration wurde das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 4,7 g (86% Ausbeute) 2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)-propionsäure (3) als ein farbloses Öl erhalten wurden.
Zu einem Gemisch aus 0,85 g (4,5 mmol) (3) und 0,57 g (4,5 mmol) Oxalylchlorid in 10 ml trockenem Methylenchlorid wurden 0,1 ml wasserfreies Dimethylformamid gegeben. Nach 1stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde mit wasserfreiem Dimethylformamid auf 5 ml verdünnnt. Dazu wurden 1,06 g (4,1 mmol) des Hydrochloridsalzes von L-Tryptophanmethylamid (Kortylewicz und Galardy, J. Med. Chem. (1990) 33:263-273) gegeben, gefolgt von der Zugabe von 1,3 ml (9,3 mmol) Triethylamin bei -10ºC. Dieses wurde 7 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat auf 150 ml verdünnt und mit Wasser (2 x 15 ml), 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung (5 x 20 ml), 10%iger Natriumhydrogencarbonatlösung (2 x 20 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann eingedampft, wobei 1,6 g (83% Ausbeute) N-[D,L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)propanoyl]-tryptophan-methylamid 4 als ein Gemisch der Diastereomere 4A und 4B erhalten wurde.
Die Isomere 4A und 4B wurden durch Flashchromatographie (Silicagel, Ethylacetat) getrennt.
Isomer 4A: Schmp. = 134-137ºC, Rf(C)=0,37.
Isomer 4B: Schmp. = 157-158ºC, Rf(C)=0,2.
Alternativ wurde das Gemisch aus 4A und 4B wie nachstehend beschrieben direkt in seine Hydroxamate überführt. In diesem Fall wurde 5A aus dem Gemisch aus 5A und 5B kristallisiert.
Ein warmes Gemisch aus 0,22 g (3,% mmol) Kaliumhydroxid in 1 ml Methanol wurde zu einem warmen Gemisch aus 0,184 g (2,65 mmol) des Hydrochloridsalzes von Hydroxylamin gegeben. Nach dem Abkühlen in Eis unter einer Argonatmosphäre wurde das Kaliumchlorid abfiltriert und zu dem Filtrat wurden 0,5 g (1,32 mmol) (4A) gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 7 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Ethylacetat suspendiert und mit 10 ml 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus Ethylacetat kristallisiert, wobei 0,28 g (56% Ausbeute) reines 5A erhalten wurden.
Das Isomer 4B wurde, wie für 4A beschrieben, in seine entsprechende Hydroxamsäure SB (72% Ausbeute) überführt.
Isomer 5A: Schmp.= 176-182ºC, Rf(C)=0,45.
Isomer 5B: Schmp.= 157-162ºC, Rf(C)=0,39.
Für den Fall, in dem das Gemisch aus 4A und 4B verwendet wird, kann 5A direkt wie vorstehend beschrieben aus dem Rückstand gewonnen werden.
Auf eine ähnliche Art und Weise, wie sie vorstehend bekanntgegeben wurde, jedoch indem 4-Methyl-2-oxopentansäure durch 2-Oxopentansäure, 3-Methyl-2-oxobuttersäure, 2- Oxohexansäure, 5-Methyl-2-oxo-hexansäure oder 2-Decansäure ersetzt wird, werden die entsprechenden Verbindungen der Formel 1 hergestellt, in denen R¹ H ist und R² eine n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, 2-Methylbutyl- beziehungsweise n-Octylgruppe darstellt. Zusätzlich werden indem man den Verfahren, die vorstehend in Beispiel 1 bekanntgegeben wurden, folgt jedoch die Stufe ausläßt, in der die durch die Wittigreaktion erhaltene Zwischenverbindung hydriert wird, die entsprechenden Verbindungen der Formel 2 erhalten, in denen R¹ H und R² wie vorstehend bekanntgegeben ist.
Zur Synthese der Verbindungen, die acylierte Formel des Indoylrestes enthalten, werden von den als Zwischenprodukte auftretenden Estern der Formel 3 oder 4 die Estergruppen entfernt und vor der Überführung in das Hydroxamat wird acyliert. Beispielsweise wird von 4A mit Natriumhydroxid in Ethanol die Estergruppe entfernt und dann wird angesäuert, wobei N-(L- 2-Isobutyl-3-carboxypropanoyl)-L-tryptophanmethylamid erhalten wird, das mit einem Anhydrid einer C&sub1;&submin;&sub4;-Alkancarbonsäure behandelt wird, wobei N-(L-2-Isobutyl-3-carboxypropanoyl)-L- ((N-acyl)indolyl)-tryptophanmethylamid erhalten wird. Dieses Zwischenprodukt wird dann mit Oxalylchlorid behandelt, gefolgt von der Behandlung mit Hydroxylamin bei niedriger Temperatur, wobei das entsprechende Hydroxamat erhalten wird.

Beispiel 2

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- D-tryptophan-methylamid (7B)

Das Gemisch der beiden Diastereoisomere von N-[2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)- propanoyl]-D-tryptophan-methylamid 6A,B wurde, wie für 4A,B in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Das Gemisch wurde aus Ethylacetat kristallisiert, wobei nach zweimaligem Umkristal-lisieren 0,26 g (49%) des reinen Diastereomers 68 erhalten wurden: Schmp. 155-157ºC, Rf(C)=0,32. 6B wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren in seine Hydroxamsäure 7B in 50%iger Ausbeute (119 mg) überführt: Schmp. 157-159ºC, Rf(D)= 0,39.

Beispiel 3

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- N-methyl-L-tryptophan-methylamid (9A)

Die Umsetzung von N-Methyl-L-tryptophanmethylamid, das wie in Beispiel 1 für L- Tryptophanmethylamid beschrieben hergestellt wurde, mit 3 auf die wie für 4 beschriebene Art und Weise lieferte rohes N-[D,L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)-propanoyl]-N-methyl-L- tryptophan-methylamid 8A,B, das aus Ethylacetat kristallisiert wurde, wobei 76 mg (19% Ausbeute) 8A erhalten wurden: Schmp. 171-174ºC, Rf(C)=0,40.
8A wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren in 45%iger Ausbeute (34 mg) in 9A überführt: Schmp. 180-183ºC, Rf(D)=0,54.

Beispiel 4

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- L-3-(2-naphthyl-)-alanin-methylamid (11A)

N-[D,L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)-propanoyl]-L-3-(2-naphthyl)-alanin 10A wurde wie in Beispiel 1 beschrieben aus L-3-(2-Naphthyl)-alanin-methylamid und 3 hergestellt. Das Rohprodukt wurde über 60 g Silicagel in Ethylacetat:Hexan 1:1 chromatographiert, wobei 12 mg (5% Ausbeute) 10A erhalten wurden: Schmp.= 151-158ºC, Rf(C)=0,69.
10A wurde wie in Beispiel 1 in 30%iger Ausbeute (3 mg) in das Hydroxamat 11A überführt: Schmp.= 179-181ºC, Rf(D)=0,17. MS-FAB (m/z) 400 (M&spplus; +H).

Beispiel 5

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- L-tryptophan-2-hydroxyethylamid (13A)

Das Hydrochloridsalz von L-Tryptophan-2-hydroxyethylamid wurde hergestellt und mit 3 gekuppelt, wie es für das Hydrochloridsalz von L-Tryptophan-methylamid beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß 3 bei Raumtemperatur 20 Minuten mit 1,1'-Carbonyldiimidazol in Methylenchlorid aktiviert wurde. Bei dem Rohprodukt handelte es sich um ein Gemisch aus 0,7 g (67% Ausbeute) der Diastereomeren 12A,B: Rf(C) 12A 0,38, Rf(C) 12B 0,19.
12A wurde in 35%iger Ausbeute (0,18 g) aus Ethylacetat kristallisiert: Schmp. 161- 163ºC, Rf(C)= 0,38.
12A wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, in 35%iger Ausbeute (62 mg) in N-[2- Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]-L-tryptophan-2-hydroxyethylamid 13A überführt: Rf(D)=0,17, Schmp. 162-163ºC. MS-FAB (m/z) 419 (M&spplus; +H).

Beispiel 6

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- L-tryptophan-amylamid (15A)

Das Hydrochloridsalz von L-Tryptophan-amylamid wurde, wie in Beispiel 1 für L- Tryptophanmethylamid beschrieben, vorbereitet und mit 3, das bei Raumtemperatur 20 Minuten mit 1,1'-Carbonyldiimidazol in Dichlormethan aktiviert wurde, umgesetzt. Das Gemisch der zwei Diastereomeren von N-[D,L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)-propanoyl]-L-tryptophanamylamid 14A,B (90% Ausbeute) wurde, wie für 4A beschrieben, in seine entsprechenden Hydroxamsäuren überführt. Langsames Eindampfen der Ethylacetatlösung lieferte 0,343 g (71%) 15A,B: Schmp. 160-163ºC. MS-FAB (m/z) 445 (M&spplus; +H).

Beispiel 7

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- L-tryptophan-piperidinamid (17A,B)

L-Tryptophan-piperidinamid wurde mit 3 umgesetzt, wie es in Beispiel 1 für L- Tryptophanmethylamid durchgeführt wurde, wobei 1,14 g (89% Ausbeute) N-[D,L-2-Isobutyl- 3-(methoxycarbonyl)-propanoyl]-L-tryptophan-piperidinamid 16A,B als ein Schaum erhalten wurde; Rf(C) 16A 0,74, Rf(C) 16B 0,67.
16A,B wurde auf identische Art und Weise wie 4A in Beispiel 1 in 88%iger Ausbeute (570 mg) in rohes 17A,B überführt: Rf(D) 17A 0,41, Rf(D) 17B 0,30. Rohes 17A,B wurde über 180 g Silicagel in 12% Isopropanol in Ethylacetat chromatographiert, wobei nach Kristallisation aus Ethylacetat 140 mg (25% Ausbeute) 17A erhalten wurden: Schmp.= 169-170ºC. MS- FAB (m/z) 443 (M&spplus; +H).

Beispiel 8

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- L-tryptophan-dodecylamid (19A)

Die Reaktionslösung von L-Tryptophan-dodecylamid wurde auf eine Art und Weise hergestellt, die analog zu der in Beispiel 1 für L-Tryptophan-methylamid beschriebenen ist. Dieser Ester wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit 3 umgesetzt, wobei rohes N-[D,L-Isobutyl- 3-(methoxycarbonyl)-propanoyl]-L-tryptophan-dodecylamid 18A,B in 93%iger Ausbeute als ein Gemisch der Isomere 18A und 18B erhalten wurde. Dieses Gemisch wurde über 150 g Silicagel in Ethylacetat:Hexan 1:2 chromatographiert, wobei 0,62 g des Gemisches der beiden Isomere erhalten wurden: Rf(E) 18A 0,37, Rf(E) 18B 0,29.
Die Kristallisation durch langsames Verdampfen von Ethylacetat lieferte 0,38 g 18A, das laut DSC und NMR-Analyse mit etwa 10% 18B verunreinigt war: Schmp. 133-135ºC. 18A wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, in seine entsprechende Hydroxamsäure überführt, mit der Ausnahme, daß das Kaliumsalz von 19A in 81%iger Ausbeute (222 mg) aus dem alkalischen Reaktionsgemisch kristallisierte. Das Kaliumsalz von 19A (54 mg) wurde in 2 ml siedendem Methanol gelöst, dazu wurden einige Tropfen Wasser gegeben, die Lösung wurde mit 0,1 N Chlorwasserstoffsäure auf pH 6 angesäuert und mit Wasser verdünnt, wobei 50 mg (100% Ausbeute) 19A erhalten wurden: Schmp.= 155-159ºC, Rf(D)=0,49. MS-FAB (m/z) 543 (M&spplus; +H).

Beispiel 9

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- L-tryptophan-(S)-methylbenzylamid (21A)

Die Umsetzung von L-Tryptophan-(S)-benzylamid mit 3 wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, wobei nach Kristallisation aus Ethylacetat 18330 mg (51% Ausbeute) N-[2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)-propanoyl]-L-tryptophan-(S)-methylbenzylamid 20A erhalten wurden: Schmp.= 160-162ºC, Rf(C)=0,77.
20A wurde auf identische Art und Weise wie in Beispiel 1 in 38%iger Ausbeute (76 mg) in das Hydroxamat 21A überführt: Schmp.= 165-166ºC, Rf(D)=0,73. MS-FAB (m/z) 479 (M&spplus; +H).

Beispiel 10

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- L-tryptophan-(6-phenylmethoxycarbonyl-aminohexyl-1)-amid (27A)

Zur Herstellung von 1-Amino-6-phenylmethoxycarbonyl-aminohexan (23) wurde ein äquimolares Gemisch (0,01 mol) aus 1,6-Diaminohexan und Benzaldehyd in 25 ml Methylenchlorid 5 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1,5 g wasserfreiem Magnesiumsulfat gerührt. Nach der Entfernung des Trocknungsmittels durch Filtration, wurde das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 2 g (100% Ausbeute) rohes 1-Amino-6- phenylaminohexan 22 als ein farbloses Öl erhalten wurden; NMR (CDCl&sub3;) 1,1-1,9 (m, 10H, Hexan CH&sub2;-2, -3, -4, -5, NH&sub2;); 2,6 (m, 2H, CH&sub2;-1); 3,51 (m, 2H, Hexan CH&sub2;-6); 7,1-7,8 (m, 5H, aromatisch); 8,16 (s, 1H, Imin-CH). Zu einem Gemisch aus 2 g (0,01 mol) 22 und 1,4 ml (0,01 mol) Triethylamin in 20 ml Methylenchlorid, wurden dann bei -5ºC tropfenweise 1,78 g (0,01 mol) Benzylchlorformiat gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 0,5 Stunden bei 0ºC und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Methylenchlorid auf 50 ml verdünnt und mit Wasser (20 ml), 2%iger Natriumhydrogencarbonatlösung (20 ml), Wasser (20 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde der Rückstand in 5 ml Ethanol gelöst und dazu wurden 10 ml 2 N Chlorwasserstoffsäure gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Wasser auf 50 ml verdünnt und mit Ethylether (2 x 15 ml) gewaschen. Die wäßrige Phase wurde unter vermindertem Druck eingedampft und das Produkt 23 wurde durch Kristallisieren aus einer kleinen Menge Wasser gereinigt, wobei eine 42%ige Ausbeute erhalten wurde; Schmp. 175-178ºC.
Herstellung des Dipeptidanalogen (N-(L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)-propanoyl]- L-tryptophan (25a)) zur Derivatisierung mit 23: Zu einem Gemisch aus 1,754 g (9,32 mmol) 2- Isobutyl-3-methoxycarbonylpropionsäure 3 in 4 ml 50%igem wasserfreien DMF in Methylenchlorid wurden bei Raumtemperatur 1,66 g (10,2 mmol) N,N'-Carbonyldiimidazol (CDI) gegeben. Nach 15minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurden 3,08 g (9,31 mmol) des Hydrochloridsalzes von L-Tryptophanbenzylester gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Ethylacetat auf 60 ml verdünnt, mit 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung (2 x 15 ml), Wasser (2 x 15 ml) und und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck lieferte 4,32 g (100% Ausbeute) 24, dem Benzylester von 25 als einen farblosen Schaum, der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe verwendet wurde.
Durch ein Gemisch aus 4,32 g (9,31 mmol) 24 und 0,5 g 10%igem Palladium auf Aktivkohle in 15 ml Methanol wurde 2 Stunden Wasserstoffgas geleitet, dabei wurde Methanol zugegeben, um das Volumen des Reaktionsgemisches konstant zu halten. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit frischem Methanol (15 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und Trocknen des Rückstand unter Vakuum lieferte 3,08 g (88% Ausbeute) der Säure 25A,B als ein Gemisch von zwei Diastereoisomeren in Form eines farblosen glasigen Feststoffs. Dieser wurde durch Flashchromatographie (Silicagel; Ethylacetat; Rf (25A) = 0,24, Rf (258) = 0,1) getrennt, wobei die Isomere 25A und 25B erhalten wurden.
Die Verbindung 25A wurde wie folgt in (N-(L-2-Isobutyl-3-(methoxycarbonyl)- propanoyl]-L-tryptophan-(6-phenylmethoxycarbonyl-aminohexyl-1)amid (26A) überführt. Ein Gemisch aus 0,55 g (1,47 mmol) 25A und 0,24 g (1,48 mmol) CDI in 1 ml 2%igem Dimethylformamid in Methylenchlorid wurde 0,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dazu wurden 0,42 g (1,47 mmol) 23 gegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit Chloroform auf 50 ml verdünnt und mit 2%iger Kaliumhydrogensulfatlösung (2 x 10 ml), Wasser (10 ml), 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung (2 x 10 ml), Wasser (2 x 10 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck lieferte 0,8 g rohes 26A, das durch Flashchromatographie (Silicagel; Ethylacetat/Hexan 25:5) gereinigt wurde: Ausbeute 56%, Rf(E)=0,57.
Wenn das Produkt 26A anstelle von 4A in Beispiel 1 eingesetzt wurde, lieferte das identische Verfahren die Titelverbindung 27A, Schmelzpunkt bei 102-108ºC, in 46%iger Ausbeute, Rf(D)=O,63.

Beispiel 11

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)-propanoyl]- L-tryptophan-cyclohexylamid (28A)

Wenn Cyclohexylamin anstelle von 23 in Beispiel 10 eingesetzt wurde, lieferte das identische Verfahren die Titelverbindung 28A, die bei 199-200ºC schmolz, in 49%iger Ausbeute, Rf(D)=0,51.

Beispiel 12

Herstellung von N-[cis-2-(N'-hydroxycarbonylamido)-cyclohexylcarbonyl]- L-tryptophan-methylamid (29A,B)

Ein Gemisch aus 2 g (0,013 mol) cis-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid in 15 ml Methanol wurde 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 2,41 g (100% Ausbeute) cis-2-Methoxycarbonyl-cyclohexancarbonsäure erhalten wurden. Wenn diese anstelle von 3 in Beispiel 1 eingesetzt wurde, lieferte das identische Verfahren die Titel verbindung, die bei 140-144ºC schmolz, in 36%iger Ausbeute; Rf(D)=0,53, 0,47.

Beispiel 13

Herstellung von N-[trans-2-(N'-hydroxycarbonylamido)-cyclohexylcarbonyl]- trvptophan-methylamid (30A,B)

Wenn (+)-trans-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid anstelle von cis-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid in Beispiel 12 eingesetzt wurde, lieferte das identische Verfahren die Titelverbindung 30A,B, die bei 167-174ºC schmolz, in 37%iger Ausbeute, Rf(D)=0,57.

Beispiel 14

Herstellung von N-[2-Isobutyl-3-(N'-hydroxycarbonylamido)- propanoyl-L-tryptophan (31A)

31A wurde aus in Beispiel 10 erhaltenem 25A auf ähnliche Art und Weise hergestellt, wie die Herstellung von 5A in Beispiel 1, dabei wurde es als ein Schaum aus Ethylacetat in 75%iger Ausbeute (128 mg) isoliert: Rf(F)=0,55. MS-FAB (m/z) (M&spplus; +H). Eine kleine Probe von 31A wurde aus Ethylacetatumkristallisiert und hatte eine Schmelzpunkt von 116-120ºC.

Beispiel 15

Herstellung von N-(D,L-2-Isobutyl-3-carboxypropanoyl)- L-tryptophan-(6-aminohexyl-1)amid (32A)

Ein Gemisch aus 0,5 g (8,24 mmol) 26A in 0,4 ml 2 N Kaliumhydroxidlösung in Methanol wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Wasser auf 15 ml verdünnt und mit 1 N Chlorwasserstoffsäure auf pH = 2 angesäuert. Die rohe freie Säure von 26A wurde mit Ethylacetat (3 x 15 ml) aufgenommen, die organische Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, wobei 0,45 g (92% Ausbeute) 26A als ein farbloser Schaum erhalten wurden.
Durch ein Gemisch aus 0,395 g (6,6 mmol) der freien Säure 26A in 15 ml Methanol wurde bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,12 g 10%igem Palladium auf Aktivkohle 2 Stunden Wasserstoffgas geleitet. Der Katalysator wurde abfiltriert, mit Ethanol (2 x 20 ml) gewaschen und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 0,3 g (92% Ausbeute) der Titelverbindung 32A als ein farbloser Schaum erhalten wurden; Rf(G) = 0,08.

Beispiel 16

Herstellung von N-[2-(Isobutyl-3-carboxypropanoyl)- L-tryptophanyl]-glycin (34A,B)

Die Umsetzung von L-Tryptophanyl-glycinmethylester mit der Säure 3, die wie für 25A beschrieben durchgeführt wurde, lieferte rohen N-[N-(D,L-2-Isobutyl-3-methoxycarbonylpropanoyl)-L-tryptophanyl]-glycinmethylester 33 in 87%iger Ausbeute als ein Gemisch der Diastereomere 33A und 33B. Die Isomere 33A und 33B wurden durch Flashchromatographie (Silicagel;Ethylacetat) getrennt. Isomer 33A: Schmp. 154-155ºC; Rf(C) = 0,46.
Die Ester 33A,B wurden durch Verseifung mit zwei Äquivalenten methanolischem Kaliumhydroxid, wie für 25A beschrieben, in die freien Säuren 34A,B überführt. Isomer 34A: Ausbeute 92%; Schmp. 96-102ºC; Rf(G) = 0,31. Isomer 348: Ausbeute 93%; Schmp. 99- 105ºC; Rf(G) = 0,25.

Beispiel 17

Herstellung von N-(cis-2-Carboxy-cyclohexylcarbonyl]- L-tryptophan-methylamid (35)

Zu einem Gemisch aus 0,281 g (1,82 mmol) cis-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid und 0,47 g des Hydrochloridsalzes von L-Trp-NHMe in 0,5 ml Dimethylformamid wurden bei Raumtemperatur 0,51 ml Triethylamin gegeben. Nach 2stündi gem Rühren wurde das erhaltene Gemisch mit Wasser auf 10 ml verdünnt und dazu wurden 25 ml Ethylacetat gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde mit 10%iger Kaliumhydrogensulfatlösung auf pH = 2 angesäuert, und die organische Phase wurde mit Wasser (2 x 15 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Die Titelverbindung 35 wurde durch Kristallisieren aus einem Ethylacetat-Hexan-Gemisch gereinigt. Ausbeute 48%; Schmp. 105-112ºC, Rf(G) = 0,65, 0,61.

Beispiel 18

Herstellung von N-(trans-2-Carboxy-cyclohexylcarbonyl]- L-tryptophan-methylamid (36)

Wenn (+)-trans-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid anstelle von cis-1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid in Beispiel 17 eingesetzt wurde, lieferte das identische Verfahren die Titelverbindung 36 in 56%iger Ausbeute: Schmp. = 167-174ºC; Rf(G)=0,67, 0,61.

Beispiel 19

Test der Hemmwirkung

Die Inhibitoren wurden unter Verwendung des synthetischen Thiolestersubstrats bei pH 6,5, genau wie es von Kortylewicz und Galardy, J. Med. Chem. (1990) 33:263-273 beschrieben wurde, gegen rohe oder gereinigte Fibroblastcollagenase der menschlichen Haut getestet. Die Collagenasekonzentration betrug 1-2 nM. Die Verbindungen der Beispiele 1-18 wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die rohe Collagenase und Gelatinase aus menschlichen Hautfibroblasten, die rohe Collagenase und Gelatinase des eitrigen menschlichen Sputums und das Stromelysin des Menschen in diesem Test zu hemmen. Die Ergebnisse hinsichtlich der rohen Enzympräparation sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Der Ki-Wert von 5A für die gereinigte Collagenase der menschlichen Haut, die wie in Kortylewicz und Galardy (ibid.) beschrieben gereinigt wurde, beträgt 0,4 nM. Tabelle 1

Beispiel 20

Vorbeugung der kornealen Ulzeration bei durch Alkali verätzten Kaninchenkornea

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, der Ulzeration vorzubeugen, wurde durch ein Kornealtest, der von Gregory Schultz an der University of Florida, Gainsville, FL durchgeführt wurde, bestätigt.
Zwanzig Kaninchenaugen wurden bis zu einem Durchmesser von 10 mm 60 Sekunden mit 1 N NaOH verätzt. Zehn Kontrollaugen wurden in der Zeit von 8.00 Uhr bis 18.00 Uhr alle zwei Stunden mit 2 Tropfen hypotonischem Puffer und dann am Abend mit einer subkonjunctivalen Injektion von 0,5 ml Puffer behandelt. Die Versuchsaugen wurden mit der Ausnahme, daß im Puffer 400 ug Inhibitor pro ml enthalten waren, identisch behandelt. Die Augen wurden klinisch bewertet, wobei 0 keinerlei Ulzeration bedeutet und 5 mit der Perforation der Kornea gleichgesetzt wird. Figur 1 zeigt die durchschnittliche klinische Bewertung über 26 Tage. Die Verbindung 5A weist den bezeichneten Schutz der Kornea vor Perforation auf. Figur 2 zeigt den prozentualen Anteil der Korneae, die innerhalb von 26 Tagen nicht perforiert waren; die Verbindung 5A weist einen 100%igen Schutz auf.
Eine histologische Untersuchung der behandelten und unbehandelten Korneae ergab folgendes:
28 Tage nach den schweren Verätzungen durch Alkali, die dadurch hervorgerufen wurden, daß die Korneae von anästhesierten Kaninchen in einer Vertiefung mit 12,5 mm Durchmesser 60 Sekunden einer 2 N Natriumhydroxidlösung ausgesetzt waren, wurden die senkrechten Schnitte durch die Korneae der Kaninchen untersucht. Nach der Verätzung wurden die Kaninchen in der Zeit von 8.00 Uhr bis 18.00 Uhr jede Stunde mit 2 Tropfen, gefolgt von einer subkonjunctivalen Injektion von 0,5 ml Collagenaseinhibitor der Formel 5A oder einer Trägersubstanz (50 mM Hepes, Antibiotics) behandelt.
Die Kornea eines mit Collagenaseinhibitor behandelten Kaninchens weist Lamellen auf, die begonnen haben, sich wieder mit Keratocyten zu bevölkern, die höchst wahrscheinlich von der unverletzen Kornea und Sklera dorthin gewandert sind. Das Stroma enthält auch einige entzündliche Zellen, vermutlich Makrophagen, die in die verletzte Kornea gewandert sind. Es gibt wenige Anzeichen für einen Riß der extrazellulären Matrix der Stromalamellen und es deutet nichts auf eine deutliche extrazelluläre Zerstörung der Matrix hin. Das Epithelium in diesem Schnitt ist wieder an der Oberfläche der Kornea aufgetaucht, obwohl das Epithelium schwach gebunden ist, wie durch die Abtrennung der Schnitte des Epitheliums von dem darunterliegenden Stroma deutlich wird. Es deutet nichts auf Gefäßneubildung dieses Teils der Kornea hin. Die Endotheloberfläche hat sich nicht regeneriert und die Descemet-Membran hat sich in einer trüben Kornea, bei der eine anhaltende und vollständige Epithelregeneration und auch eine deutliche Ulzeration des Stromas fehlen, vom Stroma getrennt.
Die nur mit der Trägersubstanz behandelte Kornea wies ein dominantes Erscheinen ausgedehnten Verfalls der Stromamatrix und das Vorhandensein von massiven entzündlichen Zellinfiltraten auf. Bei diesen entzündlichen Zellen handelt es sich höchst wahrscheinlich um Makrophagen und Neutrophile. Die Stromalamellen haben in diesem Schnitt etwa zweidrittel der gesamten Stromatiefe verdaut, und in benachbarten Schnitten hat eine Erosion der Descemet- Membran stattgefunden. Das Stroma wirkt, als hätte es an den Kanten, an denen die entzündliche Zellinfiltration am ausgedehntesten ist, ein abgeschürftes Aussehen. Frakturlinien, die durch das Stroma verlaufen, deuten auf eine allgemeine Schwächung der extrazellulären Matrix hin. In diesem Schnitt deutet nichts auf Gefäßneubildung, Epithelzellen oder Endothelzellen hin. Fragmente von Endothelzellen sind zusammen mit entzündlichen Zellen in dem Fluid der vorderen Augenkammer auf der Descemet-Membran vorhanden. Im Stroma können einige wenige, falls überhaupt, Keratocyten identifiziert werden. Dieser mikroskopische Schnitt stimmt im allgemeinen mit den Ergebnissen der Schlitzlampenmikroskopie überein, die anzeigt, daß die Kornea ausgedehnte Ulzeration und periphäre Gefäßneubildung aufweist.
Alles in allem, deutet die Histopathologie dieser beiden Schnitte darauf hin, daß die Hauptwirkung des Collagenaseinhibitors bei der Verbeugung von Ulzerationen auf eine Verminderung bei der entzündlichen Zellinfiltration in die durch Alkali verätzte Kornea zurückzuführen ist. Ferner deutet dieser Schnitt darauf hin, daß eine Wiederbevölkerung des Stromas in den durch Collagenaseinhibitoren behandelten Korneae und eine unvollständige epithele Regeneration vorübergehender Natur auf der Epitheloberfiäche, ohne Regeneration des Endotheliums, begonnen hat.

Claims

1. Verbindung, die mindestens eine Matrixmetalloprotease eines Säugers hemmt und eine der folgenden Formeln hat:

wobei R¹ ein H-Atom und R² einen C&sub3;&submin;&sub8;-Alkylrest darstellen, oder, wenn R¹ und R² zusammengenommen werden, sie einen Rest -(CH&sub2;)n- darstellen, wobei n eine ganze Zahl von 3-5 ist;

R³ H-Atom oder einen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest darstellt;

R&sup4; ein substituiertes oder unsubstituiertes Zweiringsystem mit aromatischem Charakter darstellt, das eine Methylengruppe besitzt;

X einen Rest OR&sup5; oder NHR&sup5; darstellt, wobei R&sup5; ein H-Atom oder einen substituierten oder unsubstituierten C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkylrest, C&sub6;&submin;&sub1;&sub2;-Arylrest oder C&sub6;&submin;&sub1;&sub6;-Arylalkylrest bedeutet; oder

X einen Aminosäurerest oder ein Amid davon darstellt, oder der Rest eines cyclischen Amins oder heterocyclischen Amins ist;

einschließlich optischer Isomere und Racemate davon;

ausgenommen die Verbindung N-[3-(N'-Hydroxycarboxamido)-2-(2-methylpropyl)- propanoyl]-O-benzyl-L-Tyrosin-N-methylamid.

2. Verbindung nach Anspruch 1, die die Formel (1) hat und wobei R¹ ein Wasserstoffatom darstellt und R² eine Isobutyl-, 2-Methylbutyl- oder Isopropyl gruppe darstellt.

3. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei R³ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl gruppe darstellt.

4. Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei R&sup4; eine 3-Indolylmethylengruppe darstellt.

5. Arzneimittel, umfassend eine Verbindung, wie sie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung des Körpers eines Menschen oder Tieres.

7. Verbindung nach Anspruch 6 zur Behandlung von Korneageschwüren.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, die mindestens eine Matrixmetalloprotease eines Säugers hemmt und eine der folgenden Formeln hat:

R³ H-Atom oder einen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest darstellt;

X einen Rest OR&sup5; oder NHR&sup5; darstellt, wobei R&sup5; ein H-Atom oder einen substituierten oder unsubstituierten C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkylrest, C&sub6;&submin;&sub1;&sub2;-Arylrest oder C&sub6;&submin;&sub1;&sub6;-Arylalkylrest bedeutet: oder

einschließlich optischer Isomere und Racemate davon;

ausgenommen die Verbindung N-[3-(N'-Hydroxycarboxamido)-2-(2-methylpropyl)- propanoyl]-O-benzyl-L-Tyrosin-N-methylamid,

wobei das Verfahren die Umsetzung von Hydroxylamin mit einer Verbindung einer der Formeln

umfaßt, wobei eine Verbindung der Formel (1) aus der Umsetzung mit einer Verbindung der Formel (3) und eine Verbindung der Formel (2) aus der Umsetzung mit einer Verbindung der Formel (4) erhalten wird.

9. Verwendung einer Verbindung, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung, die durch überschüssige oder unerwünschte, Matrix-zerstörende Metalloproteasewirkung hervorgerufen wird.

10. Verwendung nach Anspruch 9 zur Behandlung von Tumormetastase, rheumatischer Arthritis, Geschwüren und Reaktionen auf Infektionen.

11. Verwendung einer Verbindung, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hornhautgeschwüren.