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Energiemessung von photonen von biologischen assays

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Publication number
DE60224684T2
DE60224684T2 DE2002624684 DE60224684T DE60224684T2 DE 60224684 T2 DE60224684 T2 DE 60224684T2 DE 2002624684 DE2002624684 DE 2002624684 DE 60224684 T DE60224684 T DE 60224684T DE 60224684 T2 DE60224684 T2 DE 60224684T2
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DE
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Grant
Patent type
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DE2002624684
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George William Fraser
John Seymour Heslop-Harrison
Andrew David Holland
Gertrude Maria Schwarzacher
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University of Leicester
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University of Leicester
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using infra-red, visible or ultra-violet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • GPHYSICS
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    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Description

  • [0001]
    Die Erfindung betrifft den Nachweis der Energie von Photonen aus biologischen Assays, einschließlich derjenigen, die charakteristische Transmissions-, Reflexions- und Absorptionsspektren verursachen. Besonders, aber nicht ausschließlich, betrifft die vorliegende Erfindung den Nachweis von Fluoreszenz, und speziell den Nachweis von fluoreszenzmarkierten biologischen Proben. In einem wichtigen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung den Nachweis von Fluoreszenz in Nucleinsäurehybridisierungs-Chips.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • [0002]
    Die Abbildung der Hybridisierung von Nucleinsäuresonden einschließlich Sonden an Nucleinsäuretargets, zu denen DNA-Targets gehören, ist eine Schlüsseltechnologie der modernen Biologie, welche die Grundlage von molekularen, genomischen und Nucleinsaure/DNA-Diagnoseverfabren bildet.
  • [0003]
    Die radioaktive Markierung ist eine Option, wie z. B. für die Membranhybridisierung, aber die Gewinnung von quantitativen Ergebnissen und die Unterscheidung zwischen mehreren Markierungen ist schwierig. Fluorochromverfahren bieten Vorteile, besonders bei Systemen mit Anwendung optischer Linsen, zu denen Mikroarrays, Mikroskope und Durchflußzytometer gehören. In der Biologie sind verschiedene Technologien für den Fluoreszenz-Wellenlängennachweis angewandt worden, zu denen dichroitische Emissionsbandfilter, Emissionsprismensysteme, Gitterverfahren und Raman-Spektroskopie gehören. Zumindest die ersten drei sind auf Mikroarray-Auslesesysteme angewandt worden.
  • [0004]
    Zur Erläuterung wird auf US 5784162 verwiesen, die spektrale Bio-Imaging-Verfahren (bildgebende Verfahren in der Biologie) für biologische Forschung, medizinische Diagnostik und Therapie beschreibt. Das System besteht aus einer Anregungslichtquelle, einem mit zwei oder mehr Fluorochromen markierten biologischen Target (das ein Mikroarray sein könnte); einer Sammeloptik; einem Interferometer; einer Austrittsoptik und einer zweidimensionalen Anordnung von Detektorsystemen. Für ein Mikroarray-Experiment mit zwei Fluorochromen mit Emissionsmaxima bei den Wellenlängen L1 und L2 und charakteristischen Anregungs- und Emissionsspektren kann das Ergebnis des Experiments zum Beispiel ein Intensitätsunterschied sein; D = I(L1) – I(L2)
  • [0005]
    Die Spektrometerelemente können so angeordnet werden, daß das in jedem Pixel ankommende Signal des Ausgangsdetektors proportional zu der von einem gegebenen Punkt in der Probe emittierten (optischen) Intensitätsdifferenz D ist. Die D-Intensitätsskala wird dann zur Wiedergabe auf eine Falschfarbenskala abgebildet, so daß zum Beispiel ein Punkt, für den I(L1) >> I(L2) ist, rot erscheint, und so weiter. Das System ist auf die Verwendung des Interferometers angewiesen, um Linearkombinationen von Intensitäten zu konstruieren, die bei bestimmten Wellenlängen emittiert werden.
  • [0006]
    US 5994694 offenbart die Verwendung von Tieftemperaturdetektoren bei der Messung der Masse von großen Spezies. US 5784162 offenbart spektrale Bio-Imaging-Verfahren für biologische Forschung, medizinische Diagnostik und Therapie. US 6211519 betrifft einen Supraleitungsübergangssensor mit elektrothermischer Rückkopplungsschaltung. Rande et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A370 (1996), 85–87, offenbaren den Nachweis von Photonen unter Anwendung supraleitender Tunnelübergangsdetektoren. GB 2315131 und US 4922092 lehren die Anwendung ladungsgekoppelter Bauelemente (CCDs) beim Nachweis von Fluoreszenz.
  • [0007]
    Die vorliegende Erfindung bietet eine Neuentwicklung bei Nachweissystemen für biologische Assays.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • [0008]
    Gemäß der vorliegenden Erfindung verwenden wir einen supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor in einem biologischen bzw. Bioassay, wobei Licht von dem Assay mit einem Lichtleiter zu dem Detektor übertragen wird. Ein supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektor arbeitet bei einer Temperatur, wo das Photoneneinfangelement nahe bei oder unterhalb der Temperatur arbeitet, bei der es supraleitende Eigenschaften aufweist. Ein solcher Detektor kann die Energie von Photonen von Bioassays erfassen, besonders von denjenigen, die Fluoreszenzänderungen verursachen.
  • [0009]
    Die Erfindung ist nicht auf Fluoreszenz beschränkt, und supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektoren können allgemeiner in Bioassays genutzt werden, die charakteristische Transmissions-, Reflexions- und Absorptionsspektren hervorrufen.
  • [0010]
    Ein supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektor arbeitet bei einer Temperatur unter 1 K und kann optische Photonen zählen und ihre Energie auflösen. Derartige Tieftemperatur-Photonendetektoren sind für die Anwendung in der Astronomie bekannt. Es wird zum Beispiel auf N. Rando et al., Experimental Astronomy 10 (4) (200) 499–517 verwiesen. Wie nutzen jetzt einen solchen supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor, um jedes Photon von einer Fluorochrom- oder anderen Quelle zu markieren, typischerweise durch Protokollieren der Ankunftszeit, der Energie sowie der x- und y-Koordinaten.
  • [0011]
    Die Erfindung bietet hohe Empfindlichkeit und genaue Quantifizierung für Bio-Imaging, besonders für die parallele Registrierung der Fluoreszenz von mehreren unterschiedlichen Sonden in Hybridisierungsassays, wie sie zum Beispiel bei Genchips oder -arrays auftritt, sowie für Membranhybridisierung, Gewebe und Zellen.
  • [0012]
    Ein erfindungsgemäßes biologisches bzw. Bioassay erfordert typischerweise eine spezifische Bindung eines Analyten an einen Bindungspartner und den Nachweis von Photonen, die das Bindungsereignis anzeigen. Einer der Bindungspartner kann durch Bindung an einen Träger immobilisiert werden. Einer der Bindungspartner kann mit einem Fluorochrom oder einem anderen Photonenemitter markiert werden.
  • DETAILS DER ERFINDUNG
  • [0013]
    Die Zählung optischer Photonen mit supraleitenden Tunnelübergängen (STJ) wurde zuerst von A. Peacock et al., Nature 381 (1996) 135, beschrieben. Der gegenwärtige Stand der Technik (6 × 6-Matrix von Tantal-Bauelementen) wird in der Arbeit von Rando et al., Experimental Astronomy 10(4) (200) 499–517, angegeben.
  • [0014]
    Die letzte Figur dieser Arbeit veranschaulicht die mögliche Leistungsverbesserung beim Übergang zu Systemen auf Hafnium- oder Molybdänbasis.
  • [0015]
    Supraleitende Tunnelübergänge sind nicht die einzige Art supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektoren, die wir für eine gegebene Wellenlängenauflösung im optischen Bereich verwenden können. Ein weiterer Anwärter ist der Übergangskantensensor (TES), dessen Anwendung im optischen Bereich von B. Cabrera et al., Applied Physics Letters 73 (6) (1998) 735, beschrieben wird.
  • [0016]
    Gemäß der vorliegenden Erfindung arbeitet ein supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektor, der auf herkömmlichen Metallsupraleitern basiert, geeigneterweise bei einer Temperatur, die typischerweise unter 1 K liegt, gewöhnlich unter 500 mK, und möglicherweise unter 300 mK oder 100 mK oder sogar 10 mK.
  • [0017]
    Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Fluoreszenzlicht mit einem Lichtleiter zu dem supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor übertragen. Der Lichtleiter ist wärmer als der Kryostat, mit einer Effektivtemperatur am warmen Ende von ungefähr 293 K. Der Lichtleiter ist dadurch ein schwarzer Körper bzw. Hohlraumstrahler mit einer präzisen Spektralform, die ein Eichsignal liefert. Das System ist folglich selbsteichend.
  • [0018]
    Grobe Berechnungen lassen darauf schließen, daß einer supraleitende Tieftemperatur-Tunnelübergangsdetektor (STJ-Detektor) annähernd 150 bis 200 mal empfindlicher ist als ein existierender optischer photonenzählender (aber nicht energieauflösender) Detektor mit Verwendung einer Durchstrahlungsphotokathode, wie z. B. der Multialkali-Antimond S20-Kathode.
  • [0019]
    Derzeitige STJ-Detektoren auf Tantalbasis bieten Auflösungsvermögen λ/δλ von etwa 10 im optischen Bereich. Dies würde die gleichzeitige Abbildung von etwa 3 oder 4 Fluorochromen ermöglichen, vorausgesetzt, daß sie sorgfältig so ausgewählt werden, daß sie eine maximale spektrale Trennung aufweisen. Verbesserte Datenanalyse, Ereignisunterscheidung und besonders Bauelemente der nächsten Generation, die (zum Beispiel) auf dem Supraleiter Hafnium basieren, könnten Auflösungsvermögen λ/δλ in der Größenordnung von 50 und eine daraus folgende Zunahme der Fluorochrome von 3 oder 4 auf etwa 10 bis 15 oder mehr liefern.
  • [0020]
    Daher ermöglichen supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektoren die gleichzeitige Auflösung mehrerer verschiedener Fluorochrome oder anderer Fluoreszenzquellen, so daß in kürzerer Zeit mehr Informationen gewonnen werden können. Die verschiedenen Fluorochrome können durch eines oder mehrere der folgenden Mittel voneinander unterschieden werden: (a) das Anregungsspektrum, (b) das Emissionsspektrum, (c) die Zeit zwischen Anregung und Emission. Die Anwendung der Zeitauflösung (des zeitlichen Abstands zwischen Anregung und Emission) als Methode zur Unterscheidung von Fluorochromen und als Methode zur Unterscheidung der Probenfluoreszenz von der Substrat- oder endogenen (umgangssprachlich als "Hintergrund" bezeichneten) Fluoreszenz/Lumineszenz eignet sich besonders für die Auflösung multipler Fluorochrome.
  • [0021]
    Es gibt viele bekannte Fluorochrome, die gegenwärtig wegen eines zu kleinen Abstands zwischen Anregungswellenlänge und Emissionswellenlänge (Stokes-Verschiebung) oder wegen zu niedriger Fluoreszenzausbeute (d. h. niedrigem Helligkeitsgrad) oder dem Schmalbandcharakter von Fluorochromen nicht routinemäßig verwendet werden, aber dies sind für die neuen Detektorfähigkeiten keine Probleme. Daher verwendet die vorliegende Erfindung nach einem Aspekt mehrere Fluorochrome, die für herkömmliche Detektionssysteme ungeeignet sind, die zum Beispiel Photomultiplier (PMT) und Bildverstärker nutzen, die aber für Tieftemperatur-Detektion geeignet sind.
  • [0022]
    Die Zeitauflösung (zeitgesteuerte Detektion) der Fluoreszenz ist ein sehr wichtiges Merkmal, um den Hintergrund zu minimieren und eine Auswahl bei Substraten, Aufbereitungs- und Hybridisierungsverfahren zu ermöglichen. Ebenso wie Anregungs- und Emissionswellenlängen weist jedes fluoreszierende Molekül eine charakteristische Zeit zwischen Anregung und Emission auf, und diese könnte genutzt werden, um weitere Fluorochrome aufzulösen. Der größte Teil der (Eigen-)Fluoreszenz von Substraten und Proben weist eine Zeitverzögerung auf, die sich von den Proben-Fluorochromen unterscheidet, und diese kann ausgesteuert werden. Die Zeitauflösung vereinfacht auch Filter im Lichtweg, da kein reflektiertes Lichtsignal von der Probe in den Detektorweg gelangt. Die Zeiten variieren in der Größenordnung von ps (Pikosekunden) bis zu einigen hundert ns, typischerweise von 10 bis 100 ns. Relativ große Bandbreiten von Signalen können bewältigt werden; gegenwärtige Kameras sind mit 12 Bit ausgelegt, obwohl es selten notwendig ist, mehr als 8 Bit zu nutzen. Unterschiedliche Fluorochrome auf einem Objektträger können jedoch in der Helligkeit über einen 14-Bit-Bereich variieren, und dann wird ein geeigneter Detektor benötigt.
  • [0023]
    Fluorochrome sind gegenwärtig so konstruiert, daß sie eine hohe Helligkeit (Fluoreszenzausbeute), große Stokes-Verschiebung (Wellenlängenabstand zwischen Anregung und Emission), Anregung bei Quecksilberlampen- und Laser-Hauptwellenlängen und hohe Stabilität unter Beleuchtung aufweisen. Bei unserer Technologie können sich diese Überlegungen ändern. Bei Photonenzählung spielt die Helligkeit unter Umständen keine Rolle, die Zeitauflösung kann bedeuten, daß kleine Verschiebungen nutzbar sind, und es kann hilfreich sein, eine ganze Familie von Fluorochromen mit einer einzigen Anregungsquelle zu konstruieren, gleichgültig ob ein Laser oder eine Lampe mit oder ohne eingebaute Filter verwendet wird.
  • [0024]
    Tieftemperaturdetektoren ermöglichen eine hochempfindliche, quantitative Analyse der Informationen von Genchips bzw. -arrays oder anderen Hybridisierungssystemen, auf eine Weise, die eine ganze Menge mehr Informationen analysiert, als dies gegenwärtig zu irgendeinem gegebenen Zeitpunkt möglich ist. Wir stellen uns die Verwendung von mehr als einem Fluorochrom vor, vielleicht von mindestens 3, 4 oder 5, vorzugsweise mindestens 10, und stärker bevorzugt mindestens 15 verschiedenen Fluorochromen.
  • [0025]
    Beispiele bestimmter Fluorochrome, die verwendet werden könnten, sind unter anderem die Cyaninfarbstoffe (zum Beispiel Cy3, Cy3.5, Cy5 von der Amersham Company, obwohl Cyanin eine generische Gruppe von Fluorophoren etwa aus den 1950er Jahren ist), die Alexa-Reihe von Farbstoffen von der Molecular Probes Company, oder die Spectrum-Farbstoffe von der Vysis Company. Weitere, ältere Fluorochrome sind unter anderem Texas Red und Fluorescein.
  • [0026]
    Die Fluorochrommoleküle sind typischerweise in einer zu einem Nucleotid (DNA-Komponente) konjugierten Form im Handel erhältlich und werden unter Verwendung von Enzymen in die Sonden-DNA eingebaut. Einige nichtenzymatische Verfahren sind gleichfalls für den Einbau verfügbar und besonders für diagnostische Anwendungen kann die markierte Sonde verwendet werden.
  • [0027]
    Abgesehen von der parallelen Registrierung der Fluoreszenz von mehreren Proben in Hybridisierungsassays (Genchips oder -arrays), eignet sich die vorliegende Erfindung für die Abbildung von entwickelten Versionen von Membran-(Southern-)Hybridisierungen und anderen Hybridisierungsverfahren. Überdies können supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektoren zur Quantifizierung von anderen Fluoreszenzmarkern als denjenigen für die Hybridisierung von DNA-Sonden verwendet werden. Weitere Beispiele sind unter anderem:
    • 1) Moleküle, die ihre Konformation und daher Fluoreszenz verändern, wenn sie sich an das Target (z. B. DNA, Proteine, Cellulose) binden. In der DNA-Array-Situation kann die DNA-Menge auf jedem Spot unter Verwendung von Fluorochromen wie z. B. DAPI, Hoechst 33258, Paraosanilin, Chromomycin A3 oder der PoPo, BoBo, ToTo-Serie von Molecular Probes quantifiziert werden;
    • 2) Fluoreszenzindikatoren (verändern die Fluoreszenz in Gegenwart von Ionen, z. B. Wasserstoffionen zur pH-Messung, oder von Calcium);
    • 3) biologische Moleküle oder Strukturen, die selbst fluoreszieren – rote Blutkörperchen oder Chloroplasten sind Beispiele, wobei die Fluoreszenz von beiden durch Krankheit beeinflußt wird;
    • 4) Paralleltechnologien zu den DNA-Arrays unter Verwendung von Protein-Arrays und fluoreszierend markierten Antikörpern;
    • 5) Charakterisieren von Fluoreszenzemissionsspektren von Markierungen und biologischen Molekülen;
    • 6) Messen des Lichtabsorptionsvermögens durch biologische Moleküle und Strukturen (z. B. DNA und RNA).
  • [0028]
    Für membrangestützes (Southern- und verwandte) Hybridisierung könnte eine Mikrotechnologie entwickelt werden, um auf einer Fläche von wenigen Quadratzentimetern zu arbeiten. Da Roboterladesysteme allgemein verfügbar werden, ist das Beladen von Bahnen auf einem kleinflächigen Gel wenig problematisch, und dünne Substrate und kurze Durchlaufe sind sehr vorteilhaft. Mit der Möglichkeit von mehrfachen Fluoreszenzsonden wird das Austreiben von radioaktiven Sonden unnötig, und sogar die Hybridisierung zu DNA, die in getrockneten Gelen immobilisiert ist, ist brauchbar, oder tatsächlich eine Echtzeit-Abbildung beim Durchgang von Fluoreszenzbanden durch den Detektor, wie in ABI DNA-Sequenzierungsanlagen.
  • [0029]
    In ihrer elementarsten Form beinhaltet die vorliegende Erfindung in einem Aspekt die Bereitstellung eines Nucleinsäurebindungspartners auf einer Matrix, dessen Hybridisierung mit einer fluorochrommarkierten Sonde, anschließendes Beleuchten mit Anregungslicht (angepaßt an das Fluorochrom, das so gewählt werden kann, daß es nach Bedarf typischerweise zwischen UV und Gelb angeregt wird), und Messen des Emissionsspektrums. Im wesentlichen würde dafür das System als Spektrophotometer benutzt. In einer anderen Betriebsart kann eine sehr kleine Zahl von Photonen analysiert werden, die nicht ausreichen, um ein Spektrum zu liefern, deren von dem supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor gelieferten Eigenschaften aber die Bestimmung der molekularen Quelle der Photonen ermöglichen.
  • [0030]
    Für hohen Durchsatz wird gegenwärtig ein kontinuierliches System gegenüber einem chargenorientierten System bevorzugt. Für diesen Aspekt der Erfindung könnte das Substrat mit der immobilisierten DNA ein flexibler/rollfähiger Substratstreifen (wie z. B. eine Nylonmembran) von vielen Metern Länge mit auf einer oder wenigen Seiten darauf angeordneten Targets sein (und beispielsweise mit einem Strichcode entlang der Seite, um jede Probe zu kennzeichnen). Ein solcher Ansatz würde die Robotertechnik zum Anordnen der Proben und zum Vorbeibewegen der Oberfläche am Detektor enorm vereinfachen. Es ist sorgfältig auf die Kompatibilität mit den Verfahren zur Herstellung synthetischer Sonden auf der Substratoberfläche zu achten (typischerweise lichtempfindliche/Photolithographieverfahren). Noch besser wäre es, alles in Fluiden auszuführen, da die Abscheidung und Trocknung von DNA auf Substraten ein unangenehmer Prozeß mit Targetverlusten ist und fließende Lösungen über dem immobilisierten Target schwer automatisch zu steuern sind. Systeme von Ventilen und Pumpen wären am leichtesten machbar: vielleicht könnten große Moleküle in einem Gel gehalten werden, während kleine Moleküle (Sonden) eindiffundiert und ausgewaschen werden könnten und die sich bildenden Hybride in einem Format zurücklassen würden, das durch Detektoren und rundumgepumpt werden kann.
  • [0031]
    Als Erläuterung einer möglichen Anwendung der vorliegenden Erfindung können Anordnungen in Form von Chips krebsspezifische Gene in einer Gruppe von Patienten identifizieren. Eine große Auswahl krebsspezifischer Gene werden an dem Chip fixiert, und DNA-Proben von etwa 20 Patienten auf einmal können alle zur Analyse auf einen Chip aufgebracht werden, wobei jede DNA-Probe ihr eigenes Fluorochrom aufweist, das von allen anderen unterscheidbar ist. Alle Patienten können daher unter Verwendung des gleichen Chips gleichzeitig analysiert werden. Diese Fähigkeit für Targets mit mehreren Sonden, mehrere Fluorochrome zu verwenden, ist ein bedeutender Vorteil gegenüber allem, was bereits getan wird.
  • [0032]
    Ferner ist eines der entscheidenden Erfordernisse für mehr Farben die Einbeziehung von Kontrollen, d. h. von Proben mit bekanntem Ergebnis. Zum Beispiel könnte man, statt 20 Patienten zu prüfen, mehrere (4 bis 6) Proben von dem in Frage kommenden Tumor eines Patienten, irgendeine tumorfreie DNA von dem gleichen Patienten und dann verschiedene Typen/Stadien von Tumor-DNA von diagnostizierten Fällen einbeziehen. Mit mehr Farben können dann zusätzliche reale Proben hinzugefühgt werden, wodurch die Kontrollen effizienter genutzt werden.
  • [0033]
    In einer Ausführungsform beinhaltet die vorliegende Erfindung ein System zur Abbildung von Fluoreszenz von der Hybridisierung mehrfacher DNA-Sonden auf einem Mikroskop-Objektträger, in typischerweise 10 nm breiten Kanälen quer über die sichtbaren Wellenlängen, die Wellenlängen im nahen Infrarot und im nahen Ultraviolett, in einem pixelbasierten System mit hoher Geschwindigkeit, Zeitauflösung und Pixelgrößen bis hinab zu etwa 10 μm (Mikrometer) im Quadrat oder weniger. Die für die Abtastung erforderliche Größe könnte eine Fläche von 22 mm × 44 mm auf einem 1 Zoll × 3 Zoll großen Standard-Mikroskopobjektträgerformat sein. Es sind verschiedene Anregungsstrategien möglich. Mehrphotonenanregung, wie z. B. Zweiphotonenanregung von Fluorochromen, wie in konfokalen Mikroskopen, ermöglicht Laserdioden. In einem typischen Chip kann der Detektor statisch sein und mit dem Licht von Probenzellen zeilenweise auf einen linearen Chip von supraleitenden Tunnelübergängen gerastert werden. In einem typischen Chip führt zu jedem Element der Matrix im wesentlichen ihr eigener Lichtleiter, und der Chip kann eindimensional (linear) oder zweidimensional (planar) sein. Lichtleiter von defekten Matrixelementen ('Pixeln') können weggelassen werden. Alternativ kann es möglich sein, das gesamte Bild auf eine Matrix zu fokussieren (wie in einer herkömmlichen Kamera). Die Lichtleitkabel können in großen Abständen vom Lesegerät angeordnet sein und sind nicht darauf beschränkt, von einem einzigen Gerät auszugehen, und könnten gleichzeitig mit unterschiedlichen Gerätetypen verbunden sein und sich sogar in verschiedenen Labors oder Gebäuden befinden.
  • [0034]
    Die Auflösung beträgt vorzugsweise mindestens 5 μm (d. h. 200 × 200 pro mm2), wobei eine Erhöhung auf vielleicht 0,2 μm ideal ist (d. h. auf den theoretischen Grenzwert der Lichtmikroskopie). Um die Probe auf dem Objektträger zu finden, ist eine Abtastung mit 100 μm Auflösung und dann mit 30–40 μm zur vorläufigen Analyse erforderlich. Eine Gestaltungsmöglichkeit bei einem Sensor mit linearer oder flächenhafter Anordnung ist, mit einer Matrix von 256 Elementen zu beginnen und dann eine Vergrößerung um das 8- oder 16-fache zu erwägen.
  • [0035]
    In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird der supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektor auf Fluoreszenz- oder konfokale Mikroskope oder als Detektor für Fluoreszenz, Rückstreuung, Seitenstreuung und Absorptionsvermögen an einem Durchflußzytometer angewandt, das die Eigenschaften von Zellen oder Zellkomponenten in Suspension analysiert.
  • [0036]
    Das Ausgangssignal von der bildgebenden Vorrichtung ist im wesentlichen ein Spektrum, eine Wellenlänge oder ein Photonenenergie-Histogramm für jedes Pixel bei jeder Anregungswellenlänge (das sind folglich mindestens 5 Dimensionen; X und Y des Pixels, Anregungswellenlänge, Emissionswellenlänge und Zeit zwischen Anregung und Emission). Die Software kann dann den Beitrag jedes Fluorochroms berechnen.
  • [0037]
    Hierin wird ein System zur Durchführung von biologischen Tests bzw. Bioassays beschrieben, das eine Datenerfassungseinrichtung und Datenverarbeitungssoftware einschließt. Das System kann ferner eine Einrichtung zur Erzeugung einer Sichtanzeige oder eines Ausdrucks enthalten, welche die Ergebnisse des Assays anzeigen.
  • [0038]
    Bei der vorliegenden Erfindung wird typischerweise ein supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektor zum Nachweis von Fluoreszenz verwendet, wie sie etwa bei der Sondenhybridisierung unter Verwendung von Fluorochrom-Markern auftreten kann, obwohl die Erfindung nicht an Fluoreszenz gebunden ist, die von Markern herrührt, da wir auch die Erfassung des Transmissions-/Reflexions-/Autofluoreszenz-/Absorptionsspektrums in Betracht ziehen ("Farbe"). Die Erfindung erstreckt sich auch auf andere stimulierte Emissionsspektren als Fluoreszenzspektren und schließt die Photonenemission von Elektronenchromophoren ein, wie z. B. denjenigen, die auf Polymeren oder Dendrimeren basieren. Diese Elektronenchromophore emittieren sichtbare Photonen als Reaktion auf die Zufuhr elektrischer Energie, gegenwärtig die Basis einer neuen Flachbildschirmtechnologie. Fertigungsverfahren, die für diese Produkte entwickelt wurden, die auf herkömmlichen Genchips angewend werden, können Bauelemente liefern, bei denen das emittierte Licht mit der angelegten Spannung variiert und damit ein Maß der biologischen Targets liefert, mit denen der Chromophor verbunden ist.
  • ZEICHNUNGEN DER ERFINDUNG
  • [0039]
    In den beigefügten Zeichnungen zeigen:
  • [0040]
    1 ein Nachweissystem gemäß der vorliegenden Erfindung;
  • [0041]
    2 Fluoreszenzemissionsspektren, die durch einen Tieftemperaturdetektor von einer Anzahl markierter Nucleotide und Fluorochrome aufgenommen wurden, die zu anderen Komponenten konjugiert waren;
  • [0042]
    3 weitere derartige Fluoreszenzemissionsspektren;
  • [0043]
    4 Fluoreszenzemissionsspektren, die von einer Papierprobe aufgenommen wurden;
  • [0044]
    5 das STJ-Impulshöhenspektrum (logarithmische Skala) eines Alexa 594 Leica I3-Filtersatzes. Gestrichelte Kurve-Gausssche Anpassung an IR-Maximum. Oberes Nebenbild-Funktionsschema des supraleitenden Tunnelübergangs (STJ). Unteres Nebenbild-Nomaski-Mikroskopbild eines STJ-Chips von 10 × 32 Pixeln;
  • [0045]
    6 liefert übereinander gezeichnete Alexa 594 und 488-Spektren (individuelle Symbole). Leica I3-Filtersatz. Ausgezogene Kurven – Emissionsspektren des Herstellers, korrigiert für Lichtleiter-Übertragung und STJ-Quantenwirkungsgrad. Das endliche Auflösungsvermögen des Detektors wird durch Halbwertsbreiten-Energieauflösungs-"Fehlerbalken" angezeigt;
  • [0046]
    7 gibt die STJ-Impulshöheneichung an und läßt auf eine hervorragende Linearität des Detektors schließen;
  • [0047]
    8 liefert übereinander gezeichnete Alexa 594 und 488-Spektren. Angepaßter Omega-Filtersatz;
  • [0048]
    9 zeigt eine Analyse eines zusammengesetzten Fluoreszenzspektrums von genetischem Material, das an drei Sonden hybridisiert wurde.
  • [0049]
    Für 1 gilt der folgende Schlüssel:
  • 1
    Anregungslichtquelle
    2
    Eingangsfilter (wenn erforderlich)
    3
    einfallender Lichtstrahl
    4
    Mikroarray auf Substrat von Standardformat
    5
    (Nebenbild) hybridisierte DNA in einer Mikroarrayzelle; die Sondenstränge tragen (zur Erläuterung) zwei Fluorochrome
    6
    Fluoreszenzemission von Fluorochromen, Emissionsmaxima-Wellenlängen λ1 und λ2
    7
    Ausgangsoptik
    8
    wellenlängenauflösende Photonenzähldetektoranordnung
    9
    Kryostat
    10
    Verstärkung und Signalverarbeitung
    11
    Spektralverarbeitung, Anpassung und Anzeige
    12
    (Nebenbild) Intensität in Abhängigkeit vom Wellenlängenspektrum, zeigt die Auflösung von Fluorochrom-Emissionen
  • BEISPIELE DER ERFINDUNG
  • [0050]
    Wir übernehmen die folgende Terminologie:
    • Träger: Das Material, an welches das Target gebunden ist
    • Target: nicht markierte Moleküle, die an den Träger gebunden sind
    • Sonde: markierte Moleküle in der Lösung, die mit dem Target hybridisieren oder daran binden.
  • [0051]
    Einige Forscher kehren die Definitionen von Sonde und Target um.
  • [0052]
    Das Target kann irgendein biologisches Molekül, DNA, RNA, ein synthetisches Oligonucleotid, Peptid oder Protein sein. DNA kann cDNA (das heißt, Gene wie RNA, die enzymatisch in die DNA-Form kopiert sind), genomische DNA oder RNA, Klone in irgendeinem Vektor, wie z. B. Plasmide, Lambda, BACs oder YACs), Teilmengen der gesamten genomischen DNA sein, die von einem oder mehreren Chromosomen herrühren. RNA und DNA können von irgendeinem Organismus (Pflanzen, Tiere, Viren, Bakterien, Pilze oder irgendeiner ihrer Teilmengen) und von irgendeinem Gewebe stammen. Synthetische Oligonucleotide sollten mindestens 15 bp (Basenpaare) lang sein und können eine Länge bis zu 100 bp haben, basierend auf einer bekannten DNA- oder RNA-Sequenz, die statistisch verteilt ist oder in irgendeiner Position modifizierte Nucleotide aufweist.
  • [0053]
    Die Sonde kann irgendeine RNA oder DNA oder ein Antikörper sein und ist zur Erkennung besonders markiert. In irgendeinem gegebenen Experiment werden vorzugsweise 3–10 oder mehr verschiedene Sonden verwendet und müssen unterschiedlich markiert werden. In den meisten Fällen umfaßt die Sonde die Gesamtmenge oder eine geeignete Teilmenge der RNA oder DNA von zwei oder mehr verschiedenen Arten, Varietäten oder Populationen oder von Individuen in unterschiedlichen Umweltbedingungen, Entwicklungsstadien usw.
  • [0054]
    Der Träger kann aus irgendeinem Material bestehen, an das sich das Target bindet. Der Träger kann zweckmäßigerweise ein normaler Mikroskop-Objektträger sein, typischerweise mit Abmessungen von 76 × 26 mm. Der Träger kann jedoch auch ein Chip von geeigneter Größe sein. Geeignete Materialien für den Objektträger oder Chip sind Glas oder Metall. Der Träger wird gewöhnlich beschichtet oder aufgeladen, um die Bindung des Targets zu erleichtern. Beispiele geeigneter Beschichtungen sind Poly-L-lysin, Aminosilane, Cellulose und andere biologische Moleküle.
  • BEISPIEL 1
  • [0055]
    Bei vielen Krebsbiopsien müssen mehreren Biopsien eines Gewebes ausgeführt werden, um die Krebszellen zu finden. Gegenwärtig wird von jeder Biopsie ein Präparat auf einem Mikroskop-Objektträger hergestellt und von qualifizierten Beobachtern untersucht, um den Zustand jeder Biopsie zu ermitteln. Mit dem Chip und der Detektortechnologie gemäß der vorliegenden Erfindung werden genetisches DNA-Material oder exprimierte RNA-Gene von jeweils etwa fünf Biopsien zusammen mit fünf Kontrollproben – von bekannten Karzinomen unterschiedlicher Stadien oder Typen, und normale Proben von unbeeinflußten Kontrollen und dem Patienten – isoliert (automatisch), mit verschiedenen Fluorochromen markiert und an den Chip hybridisiert. Wenn irgendwelche Proben Anomalien aufweisen, ist dies sofort durch das unterschiedliche Verhältnis der Hybridisierung der Sonden an das unterschiedliche Target auf den Objektträgern nachweisbar. Gegenwärtige Technologien weisen eine schlechte Quantifizierung auf und können die Anzahl von Sonden nicht unterscheiden, die für eine sorgfältige Kontrolle und unterschiedliche Krebsarten erforderlich sind.
  • BEISPIEL 2
  • [0056]
    Eine anomale Expression von fünf bis zehn Genen tritt bei vielen Erkrankungen auf. DNA oder RNA von individuellen Proben wird als Target auf die Trägeroberfläche aufgebracht und dann mit fünf Gensequenzen hybridisiert, die in unterschiedlichen Farben markiert sind. Die Hybridisierung jedes Punkts auf dem Chip wird dann untersucht, und Unterschiede gegenüber der Kontrolle zeigen an, daß eine Probe anomal ist.
  • BEISPIEL 3
  • [0057]
    Einige (aber nicht alle) wilden Arten, die mit Kulturpflanzen verwandt sind, z. B. Bananen, sind resistent gegen Krankheiten wie z. B. Pilzerkrankungen, aber diese unterscheiden sich sehr voneinander und von empfindlichen kommerziellen Kulturvarietäten. Wir bringen viele Tausende von Pflanzengenen oder anderen DNA-Sequenzen auf den Chip auf und hybridisieren mit DNA oder RNA von resistenten und anfälligen Pflanzen, wobei wir 10 auf einmal verwenden, die jeweils mit einem anderen Fluorochrom markiert sind. Falls ein Target ausschließlich mit Sonden von allen resistenten Akzessionen hybridisiert, ist es ein Resistenzkandidatengen. Diejenigen, die ausschließlich mit Sonden von wenigen resistenten Akzessionen hybridisieren, sind wahrscheinlich Gene, die eine Variabilität zwischen Akzessionen aufweisen; daher ist die Verwendung mehrerer Sonden wesentlich, um derartige falsche Ergebnisse zu entfernen.
  • BEISPIEL 4
  • [0058]
    Viele Erkrankungen rühren von der Unfähigkeit des Körpers her, eine bestimmte Chemikalie zu erzeugen, aber das Fehlen der Chemikalie kann durch den Ausfall eines Schritts in einem mehrstufigen Biosyntheseprozeß entstehen. Obwohl die Krankheitssymptome die gleichen sind, könnte in Abhängigkeit von dem fehlgeschlagenen Schritt eine unterschiedliche pharmazeutische Behandlung angewandt werden. DNA (oder RNA/cDNA) von Patienten, die an dem Syndrom leiden, könnte extrahiert und als Target aufgebracht werden, das dann mit Sonden für jedes der an der Biosynthese beteiligten Gene (und Kontrollgene) hybridisiert wird. Die Sonde, bei der keine Hybridisierung festgestellt wird, stellt das Gen dar, das in dem Patienten fehlt.
  • BEISPIEL 5
  • [0059]
    Gegenwärtige Technologien erfordern eine hohe Reinheit der DNA/RNA-Probe für Hybridisierungsanalysen. Wegen der hohen Empfindlichkeit und der hohen Hintergrundunterscheidung des vorgeschlagenen Systems, der Anzahl von Kontrollen der Hybridisierung, die einbezogen werden können, und der Möglichkeit der Verwendung zusätzlicher Nachweiskanäle, um vorhandene Targetmengen zu quantifizieren, können rohe oder minimal präparierte Zellpräparate (z. B. Anquetschen des Gewebes an das Substrat, mit oder ohne weitere Lösungsbehandlungen) verwendet werden, um hochwertige Daten zu erhalten. So könnten ganze Zellen an den Träger angequetscht werden und mit mehreren DNA-Sonden und Farbstoffen sondiert werden, um die Menge des gebundenen Zellmaterials zu messen und die Expression eines Gens zu diagnostizieren, das mit einer Krankheit verbunden ist.
  • BEISPIEL 6
  • [0060]
    Auf den Chip können Proteine aufgebracht und gegen markierte Antikörper hybridisiert werden. Es könnte auch sein, daß unmarkierte Proteine eine genügend charakteristische Fluoreszenz oder sogar ein charakteristisches Transmissions-/Reflexions-/Autofluoreszenz-/Absorptionsspektrum ("Farbe") aufweisen, so daß sie in Proteinproben identifiziert werden können.
  • BEISPIEL 7
  • [0061]
    Das System kann verwendet werden, um die Verteilung bestimmter repetitiver DNA unter einer Gruppe von Pflanzenspezies auf ihre Diversität und Verteilung zu prüfen: z. B. Retroelement-Klone, die aus einer Auswahl verwandter oder nicht verwandter Spezies als Targets isoliert werden; gesamtgenomische DNA von verschiedenen verwandten oder nicht verwandten Pflanzenspezies, z. B. Koniferen oder Brassica-Spezies, als Sonden. Dies zeigt den evolutionären Abstand zwischen Spezies und die Möglichkeiten ihrer Verwendung in Züchtungsprogrammen.
  • BEISPIEL 8
  • [0062]
    Das System kann verwendet werden, um die Allelvariabilität von DNA-Sequenzen oder Genen zu prüfen z. B. synthetische Oligonucleotide, die alle möglichen Nucleotidänderungen in einer definierten Region einer repetitiven DNA-Sequenz oder einer DNA-Sequenz mit niedriger Kopienzahl als Targets darstellen, z. B. einer repetitiven DNA-Familie, Centromer-DNA, einer multigenen Familie, rDNA, von krankheitsassoziierten oder Resistenzproteinen, Speicherproteinen. Gesamtgenomische DNA von Spezies, Varietäten, Populationen oder Individuen von verwandten oder nicht verwandten Individuen oder Spezies als Sonden.
  • BEISPIEL 9
  • [0063]
    Das System kann verwendet werden, um die Existenz, Variabilität und Expression von krankheitserzeugenden Organismen in einer Auswahl von Wirtsspezies zu prüfen; z. B. Virus-DNA (Klone oder Oligonucleotide) als Targets, gesamtgenomische DNA von verschiedenen Individuen als Sonden.
  • BEISPIEL 10
  • [0064]
    In einer Übersicht möchte man die Häufigkeit ermitteln, mit der unterschiedliche Formen eines bestimmten Gens (Allele) in einer Population auftreten. Die DNA von tausenden Individuen wird extrahiert und auf einen Chip aufgebracht.
  • BEISPIEL 11
  • [0065]
    Eine Zelle enthält ein bestimmtes Enzym, das charakteristisch für ihren Zustand nach einer bestimmten Behandlung ist. Auf die Zelle wird ein Substrat aufgebracht, das die Eigenschaft der Chemilumineszenz aufweist. Diese Lichtemission wird mit einem Tieftemperaturdetektor nachgewiesen.
  • BEISPIELE 12 BIS 14
  • [0066]
    Die Beispiele 12 bis 14 sind Modellversuche, die den Nutzen der vorliegenden Erfindung an Modellsystemen zeigen, die Fluorochrome (Sonden) aufweisen, die an biologische Moleküle (Targets) gebunden sind. In jedem dieser Beispiele war der Tieftemperaturdetektor derjenige am Forschungs- und Technologiezentrum für die Europäische Raumfahrtagentur, ESTEC, Noordwijk, Holland, der ein Tieftemperatur-Supraleitungstunnelübergangs-(STJ-)Detektor ist, der bei einer Temperatur von etwa 300 mK (Millikelvin) mit einem Detektor von 30 μm × 30 μm betrieben wird.
  • BEISPIEL 12
  • [0067]
    Der Tieftemperaturdetektor wurde benutzt, um Fluoreszenzemissionsspektren von einer Anzahl verschiedener, im Handel erhältlicher, markierter Nucleotide und Fluorochrome zu erfassen, die zu anderen Komponenten konjugiert sind, nämlich:
    • LR_C: Fluorored (Fluorrot) (Rhodamin-4-dUTP, RPN2122), Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK
    • FG_C: Fluorogreen (Fluorgrün) (Fluorescein-11-dUTP, RPN2121), Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK
    • A48_C: Chromatid Alexa Fluor (488-5-dUTP), Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA
    • A59_C: Chromatid Alexa Fluor (594-5-dUTP), Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Fluorochrom-konjugierte Komponenten:
    • TR_C Texas Red-Avidin D (A-2006), Vector Laboratories, Burlingame, Californien, USA
    • FI_C: Fluorescein Streptavidin (FITC; SA-5001), Vector Laboratories, Burlingame, Californien, USA
  • [0068]
    Die obigen Proben wurden von Hand auf einen normalen Glas-Mikroskopobjektträger getüpfelt.
  • [0069]
    Das Fluoreszenzemissionsspektrum wurde außerdem von einer Probe von Whatman-Filterpapier Nr. 1 (FIL-C) aufgenommen, die fluoreszierende Aufheller enthält.
  • [0070]
    Ein Leica-Fluoreszenzmikroskop und eine Quecksilberlampe (W100) als Fluoreszenzlichtquelle sowie ein Filtersatz mit 340–380 nm (Nah-UV) Anregungsfilter und 425 nm-Langpaßemissionsfilter (Leica-Satz A) wurden für die Anregung der Fluorochrome verwendet. Die erhaltenen Spektren sind in 2 dargestellt. Wenn auch die Anregung vom Maximum weit entfernt war, erhielt man gute Spektren von Fluorochromen, die im roten Bereich emittieren (Alexa 594, Fluorored und Texas red), während starke Spektren im grünen Bereich von den Fluorochromen mit besser geeigneten Eigenschaften aufgenommen wurden (Fluorogreen, FITC und Alexa 488). Alle Spektren hatten charakteristische Formen, Maxima und Flächen. Gezahlte Photonenwerte, die nicht von den Fluorochromen herrühten und deren Wellenlänge unter 1 μm lag, waren nicht nachweisbar, und bei der Erfassung von Spektren ohne eingeschaltete Fluoreszenzlichtquelle wurden etwa 4 Photonen pro Minute erfaßt (einschließlich des Elektronenrauschens, das eine andere Impulscharakteristik aufweist und daher herausgefiltert werden kann), im Vergleich zu Zäh raten von 5000 bis 50000 pro Minute, die man typischerweise von den Fluorochromen erhielt.
  • [0071]
    Der Versuch zeigt: 1) der Tieftemperaturdetektor kann charakteristische Fluoreszenzemissionsspektren von Fluorochromen nachweisen, die gewöhnlich in der Biologie verwendet werden. 2) Der Detektor weist minimale Hintergrundpegel auf (typischerweise 0,01%) und liefert äußerst saubere Spektren. 3) Die Form der Emissionsspektren, sogar mit einzelnen Anregungswellenlängenbereichen, ermöglicht die Trennung von einzelnen Fluorochromen. 4) Die Helligkeit kann durch Photonenzählungen exakt quantifiziert werden. 5) Es können extrem niedrige Niveaus von Fluorochromen gemessen werden.
  • BEISPIEL 13
  • [0072]
    Es wurden Spektren von vier von den in Beispiel 11 verwendeten Fluorochromen aufgenommen, wobei mit Ausnahme der Verwendung des Filters Leica 13 die gleichen Bedingungen angewandt wurden. Die Spektren sind in 3 dargestellt.
  • BEISPIEL 14
  • [0073]
    Der Tieftemperaturdetektor wurde verwendet, um Fluoreszenzemissionsspektren von einer Papierprobe aufzunehmen, die Fluoreszenzaufheller enthielt, nämlich der weißen Fläche eines selbstklebenden Adreßetiketts, das von Abel-Label, Northampton, UK, gedruckt wurde.
  • [0074]
    Dies zeigt die Charakterisierung der Färbung von Cellulose und anderen Zellenbestandteilen durch Farbstoffe der Fluoreszenzaufhellerklasse. Die Spektren wurden mit UV-Anregung und Langpaß(-filter)-Blauanregung (Linie SL_D, Leica-Filtersatz A), Blauanregung, Langpaß-Grünanregung (SL_C, Leica-Filtersatz I3) und mit Dreifachbandfilter (SL_T, Omega Optical XF56-Filtersatz) aufgenommen. Die Spektren sind in 4 dargestellt. Dieser Versuch demonstriert den Nutzen des Verfahrens für 1) die Charakterisierung der Natur unbekannter Fluorochrome, die als Farbstoffe verwendet werden; 2) den Nachweis der Natur oder Zusammensetzung von gefärbten Objekten biologischen oder anderen Ursprungs unter Verwendung von Farbstoffen von bekannter Spezifität; 3) den Nachweis der Menge gefärbter Objekte biologischen oder anderen Ursprungs.
  • BEISPIEL 15
  • [0075]
    Eine ausführlichere experimentelle Untersuchung wurde ausgeführt, wie nachstehend berichtet:
  • Nachweis mehrerer Fluoreszenzmarkierungen unter Anwendung supraleitender Tunnelübergangsdetektoren
  • [0076]
    Die gleichzeitige Messung der optischen Emission von zusammen angeordneten Fluorochromen ist ein häufiges Problem in der Biologie. Die Abbildung von Zellenkomponenten erfordert die zeitliche Registrierung mehrerer Fluoreszenzmarkierungen, wie z. B. von Varianten von Grün-Fluoreszenzprotein (GFP). Bei der resonanten Fluoreszenzenergieübertragung (FREI) zeigen Änderungen im Emissionsspektren die physikalische Trennung zwischen Donator- und Akzeptorfarbstoffmolekülen an. Die quantitative Bestimmung der Hybridisierung von markierten Nucleinsäuren (Sonden) an immobilisierte Targetmoleküle im Mikroarrayformat oder in Zellen in situ erfordert idealerweise die gleichzeitige effiziente, artefaktfreie Messung von Fluoreszenzspektren, siehe Dokument 1.
  • [0077]
    Auf Tieftemperatur gekühlte supraleitende Tunnelübergangsdetektoren (STJ-Detektoren), siehe Dokumente 2–6, die für die Astronomie entwickelt wurden, messen die Energien von individuellen optischen Photonen bei sehr niedrigen internen Hintergrundniveaus. Hier zeigen wir, daß STJ-Detektoren für die empfindliche Registrierung von mehreren biologischen Fluorochromen eingesetzt werden können. Unter Verwendung eines einzigen Nah-UV-Anregungsfilters und normaler dichroitischer und Langpaßfilter konnten die Emissionsspektren gewöhnlicher Fluorochrome leicht unterschieden werden – voneinander und von einer Breitband-Substratfluoreszenz.
  • [0078]
    Tieftemperaturdetektoren haben das Potential, die quantitative Abbildung von mehreren Fluorochromen in der Biologie zu revolutionieren.
  • [0079]
    Photomultiplier bzw. Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) und Bildverstärker sind die Photonenzähldetektoren, die am häufigsten benutzt werden, um schwach fluoreszierende biologische Proben abzubilden. Diese Detektoren liefern nur dann Informationen über die Photonenfarbe (Energie oder Wellenlänge), wenn sie zusammen mit Schmalband-Ausgangsfiltern oder Dispersionsgittern eingesetzt werden. Ihr Wirkungsgrad ist durch die Quantenausbeute Q (Elektronen/Photon) der SEV-Photokathode begrenzt. Für eine Photokathode wie z. B. S20 (CsKNaSb), siehe Dokument 7, ist Q < 20% im optischen Bereich. Systeme auf Gitterbasis bieten jetzt bis zu 32 parallele Energiekanäle, siehe Dokument 8, die jeweils durch einen unabhängigen SEV ausgelesen werden, aber die Empfindlichkeit des Geräts bleibt durch die mit dem Dunkelstromrauschen verbundene Zählrate der Photokathode beschränkt – B ≥ 10 Zählimpulse·cm–2·s–1 bei Raumtemperatur, siehe Dokument 9. Häufiger werden die Fluorochrome nacheinander angesprochen, wobei die Probe wiederholt abgetastet und die Fluoreszenz über eine Serie von Schmalband-Ausgangsfiltern registriert wird. Die mehrfache Abtastung erhöht die Möglichkeit der Photobleichung.
  • [0080]
    Der niedrige Durchsatz von Dispersionsspektrometern war in den 1990-er Jahren einer der Anreize für die Entwicklung von energieauflösenden Tieftemperaturdetektoren in der Astronomie, wie z. B. des STJ und des Übergangskantensensors (TES), siehe Dokument 10. Ein STJ besteht aus zwei supraleitenden Schichten, die auf einer Temperatur T gehalten werden, die weit unter ihrer Übergangstemperatur Tc vom supraleitenden zum Normalzustand liegt, und die durch eine isolierende Oxidschicht getrennt sind (siehe oberes Nebenbild zu 5). Für T ~ Tc/10 ist der thermisch induzierte Tunnelstrom vernachlässigbar, und die Absorption eines Photons der Wellenlänge λ (nm) führt zu einer Zahl No ~ 7 × 105/λΔ(T) von überschüssigen freien Ladungen (Quasiteilchen), wobei Δ (meV) der Supraleitungs-Energieabstand ist, siehe Dokument 4. Das Eigenauflösungsvermögen (oder "tunnelbegrenzte" Auflösungsvermögen) R = λ/Δλ eines symmetrischen STJ ist dann: R = 357[λΔ]–1/2[1 + F + 1/<n>]–1/2 (1) Gl.wobei F der Fano-Faktor ist (~ 0,22 für Übergangsmetall-Supraleiter, siehe Dokument 6) und <n> angibt, wie oft jedes Quasiteilchen im Mittel die Potentialbarriere durchtunnelt.
  • [0081]
    Der in unserer Anfangsuntersuchung der biologischen Fluoreszenz verwendete Detektor war ein einzelner STJ von 30 × 30 μm2 mit 100 nm dicken Ta-Schichten und 30 nm dicken Al-Schichten auf beiden Seiten der Tunnelbarriere. Die Übergangstemperatur für massives Tantal beträgt 4,5 K, und der Energieabstand Δ(0) beträgt 0,69 meV. Der Detektor wurde unter Anwendung von photolitographischen Verfahren aus einer Ta/Al-Mehrfachschicht hergestellt, die auf einem polierten Saphirsubstrat abgeschieden wurde. Der niedrige Leckstrom (< 0,1 pA/μm2) ergab einen vernachlässigbaren Beitrag zum Grundlinienstörpegel, während die hohe Durchlässigkeit der Barriere zu hohen Signalamplituden führte.
  • [0082]
    Der Detektor hatte eine Empfindlichkeit von <n>No ~ 40000 getunnelten Elektronen pro eV Photonenenergie und eine Impulsabfallzeit von ~ 20 μs. Gl. (1) gibt dann das Auflösungsvermögen von 16,0 und 8,8 bei Wellenlängen von 600 nm und 2000 nm an. Die Eichung mit monochromatischer Strahlung ergab R (600 nm) ~ 13,3. Durch Abkühlung auf 300 mK in einem 3He-Kryostat (d. h. T ~ Tc/15) wurde der thermisch angeregte Quasiteilchenstrom weit unter der Leckstromstärke gehalten. Wir würden dann erwarten, daß die dominierende Störpegelquelle in dem STJ Myonen aus kosmischer Strahlung sind, die auf komplexe Weise mit dem Saphirsubstrat in Wechselwirkung treten, um bei einer oberen Grenzrate B ~ 0,01 cm–1s–1 paarspaltende Phononen zu erzeugen.
  • [0083]
    Bei gegebenem STJ-Quantenwirkungsgrad Q (600 nm) von 75%, siehe Dokument 4, gelangen wir dann zu dem Empfindlichkeitsvorteil des Tieftemperaturdetektors gegenüber einem System auf SEV-Basis: {QSTJ/√JBSTJ}/{QSEV/√BSEV} = 120 mal Gl.(2)
  • [0084]
    Licht von einem Leica Aristoplan-Auflichtfluoreszenzmikroskop mit einer 100 W Osram HBO Quecksilberlampen-Anregungquelle wurde über eine 6 Meter langen Oriel 77530 Quarzglaslichtleiter von UV-Qualität und ein Bandfilter mit λ ~ 200–2000 nm in den rückseitig beleuchteten STJ eingekoppelt. Der STJ-Quantenwirkungsgrad ist höher als 50% für λ-Werte zwischen 150 und 700 nm. Es wurde nicht versucht, das Licht von der Probe auf den Lichtleiter oder von dem Lichtleiter auf den Detektor zu fokussieren. Der Kopplungswirkungsgrad war daher extrem niedrig (< 0,01%). Der Detektor wurde innerhalb einer lichtdichten Abschirmung auf der Systembasistemperatur von 300 mK gehalten. Das warme Ende der Lichtleitfaser bildet jedoch einen schwarzen Strahler bei 300 K, der in Verbindung mit der Faserübertragung in allen STJ-Spektren bei einer Wellenlänge von 2 μm ein effektives Bezugssignal liefert (siehe 5, 7).
  • [0085]
    Die warme Ausleseelektronik bestand aus einem ladungsempfimdlichen Vorverstärker, der in einem Abstand von ~ 1m vom Detektor angeordnet war, einem Verstärker (10 μs Impulsformungszeit) und einem Analog-Digital-Wandler (AD-Wandler), dessen Ausgang optisch an einen PC gekoppelt wurde, in dem die Impulsamplitude und die Abfallzeit für jedes erfaßte Photon aufgezeichnet wurde. Zur Auswahl gültiger Ereignisse wurde ein Impulsanstiegszeitfenster angewandt.
  • [0086]
    Fluoreszenzspektren wurden von elf verschiedenen, im Handel erhältlichen, markierten Uridin-Nucleotiden gemessen. Es wurden auch sechs verschiedene Substrate untersucht. Vier Anregungsfilter wurden verwendet: die hier dargestellten Spektren wurden mit den folgenden zwei Filtersätzen aufgenommen:
    Leica-Filtersatz I3; Anregung 450–490 nm, dichroitische Grenzwellenlänge 510 nm, und 515 nm-Langpaßfilter
    Omega Optics Inc. 11 XF56-Dreifachanregungsfilter, mit auf 457, 528 und 633 nm zentrierten Durchlaßbereichen, seinem zugeordnetem dichroitischen Spiegel und einem Omega 580-Langpaßemissionsfilter.
  • [0087]
    Die Durchgangswerte der aktuell verwendeten Filter wurden im Nachhinein unter Verwendung eines Spektrophotometers bestätigt.
  • [0088]
    Obwohl die Anregung weit entfernt vom maximalen Absorptionsmaß angeregt erfolgte, wurden Spektren von Fluorochromen aufgenommen, die im roten (Alexa 594, Fluorored und Texas Red) und grünen Bereich (Fluorogreen, Avidin FITC und Alexa 488) emittierten. Wir veranschaulichen die Möglichkeiten des STJ für die Fluoreszenzbilderzeugung unter besonderer Bezugnahme auf die Farbstoffe Alexa 488 und Alexa 594 12. 5 zeigt das Impulshöhenspektrum des letzteren Fluorochroms bei dem Leica-I3-Filtersatz. Das Spektrum wird bei 2,4 eV (515 nm) durch das Langpaßfilter abgeschnitten. Selbst bei dem mit nur ~ 3% des maximalen Absorptionsvermögens angeregten Fluorochrom beträgt das Signal-Untergrundverhältnis (maximaler Kanalzählwert, dividiert durch den mittleren Kanalzählwert bei Energien unmittelbar über dem IR-Peak) mindestens 275:1. Die Anpassung einer Normalverteilung (der gestrichelten Kurve) an den IR-Peak läßt erkennen, daß R(2000 nm) = 4,0 ist.
  • [0089]
    Durch Injektion einer bekannten Ladung in den warmen STJ-Vorverstärker von einem elektronischen Impulsgeber wurde eine Peakbreite von 0,084 eV Halbwertsbreite erzeugt. Die Quadratursumme des Tunnelgrenzwerts und elektronischer Störbeiträge läßt dann auf ein 2 μm-Auflösungsvermögen von R = 5,7 schließen, das etwas besser als das beobachtete ist.
  • [0090]
    Für jedes Fluorochrom wurde der Brennpunkt des Mikroskops so eingestellt, daß eine Ausgangszählrate von 800 Hz erzeugt wurde – die maximale Rate, bevor die Impulsanhäufung die spektrale Auflösung gefährdete. Die "Dunkel-"Zählrate, die man durch Schließen des Mikroskopverschlusses zwischen Glühlampe und Filter erhielt war gleich 0,09 s–1. Da einzelne Spektren nicht mit konstanter Intensität aufgenommen wurden, stellt die Überlagerung von zwei STJ-Spektren nicht unbedingt den spektralen Zerlegungsgrad für das entsprechende Gemisch von Fluorochromen dar. Nichtsdestoweniger läßt 6 erkennen, daß der spektrale Überlappungsgrad zwar signifikant ist, die relativen Intensitätsbeiträge von gemischten Alexa 488- und -594-Sonden aber einfach zerlegt werden können.
  • [0091]
    Wir stellen fest, daß maximale Emissionsenergien und Spektralbreiten für beide Sonden siginifkant von den durch den Hersteller veröffentlichten Vorlagen abweichen, siehe Dokument 12. Da die STJ- Eichung jede "Nullverschiebung" in der Detektorcharakteristik ausschließt (siehe 7), folgern wir, daß diese Messungen den Nachweis für den Einfluß der lokalen Umgebung auf die Fluorochrom-Emission liefern. Hier trockneten die Farbstoffe aus der Lösung aus, die auf mit Chromsäure gereinigtes Glas getupft wurde.
  • [0092]
    8 zeigt die Alexa 594- und -488-Spektren, die mit dem Omega-Dreifachfiltersatz aufgenommen wurden; die "haubenförmigen" Durchlaßbereiche des Ausgangsfilters sind durch vertikale gestrichelte Linien angedeutet. Diese Figur zeigt, daß die spektroskopische Fähigkeit des STJ mit geeigneten Auswahlen von Eingangs- und Ausgangsfiltern kombiniert werden kann, um eine stark bevorzugte Registrierung eines Fluorochroms zu liefern.
  • [0093]
    9 veranschaulicht die Anwendung des STJ auf die Untersuchung von genetischem Material, das auf einem ArrayitTM-Substrat, siehe Dokument 13, mit Mehrfachsonden hybridisiert wurde (Alexa 568, Alexa 594 und Bodipy 630/650 – alle hergestellt von Molecular Probes Inc., siehe Dokument 12). Der Datensatz 1 stellt das gemessene Probenspektrum dar, während die Kurven 2, 4, 5, 6 die Komponentenspektren sind, die getrennt für die drei Fluorochrome und für das Substrat gemessen wurden. Kurve 3 läßt erkennen, daß eine lineare Summe der Komponentenintensitäten mit den Gewichten: Alexa 568:Bodipy:Substrat:Alexa 594 = 10:10:4:3 eine ausgezeichnete Anpassung an die Daten im Bereich von 1,9–2,4 eV (515–652 nm) liefert.
  • [0094]
    Wir können die zu hohe Intensität bei niedrigeren Energien nicht auf die Gegenwart von nichthybridisierter DNA in der Probe zurückführen, da die Eigenfluoreszenz der DNA bekanntlich im UV-Bereich ihren Höchstwert erreicht. Eine alternative Erklärung ist eine Excimer-Emission (eines angeregten Dimers), die als Ergebnis der hohen Konzentrationen der Fluorochromsonden in der Probe entsteht.
  • [0095]
    Zusammenfassend haben wir gezeigt, daß ein Tieftemperaturdetektor quantitativ und mit einem sehr hohen Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zum herkömmlichen System charakteristische Emissionsspektren von Fluorochromen erfassen kann, die gewöhnlich in der Biologie eingesetzt werden. Selbst bei einzelnen Anregungswellenlängenbereichen ermöglicht die Aufnahme des vollständigen Spektrums die Trennung von Mehrfachfluorochromen. Bemerkenswerterweise haben wir festgestellt, daß nichtfokussierte, niedrige Intensitäten der peripheren Probenbeleuchtung mit Philips TLD 36W/83-Leuchtstoffröhren (d. h. normale Laborbeleuchtung) Zählraten von mehr als 1000 Hz anregen konnten.
  • [0096]
    Die gegenwärtige Ta-Technologie (R ~ 10–20) ist mit mindestens vier gleichzeitigen Markierungen mit einem einzigen Anregungsfilter kompatibel; die Möglichkeiten von Hf (Δ(0) = 0,02 meV; R ~ 80) und Mo (Δ(0) = 0,14 meV; R ~ 40) für bessere Auflösung (bei niedrigeren Betriebstemperaturen) sind gut dokumentiert, siehe Dokument 4. Im Zusammenhang mit dem Auslesen von Mikroarrays ist jede Erhöhung der Anzahl von Markierungen wichtig, die ohne Störung gemessen werden können, da entweder die Anzahlen von einbeziehbaren internen Kontrollen erhöht werden können oder mehr Proben gleichzeitig getestet werden können. Die bescheidene Zählratenbeschränkung eines einzelnen STJ-Pixels kann durch Verwendung paralleler Arrays überwunden werden; Ta-STJ-Matrizen von 6 × 6 Elementen sind gefertigt worden, und die Entwicklung von 10 × 32 Mo-Arrays ist von der ESTEC-Gruppe untersucht worden (siehe unteres Nebenbild zu 5). Diese Entwicklungen und die Herstellung von geschlossenen Kühlsystemen für den Bereich mit T < 100 mK wird einen wichtigen Einfluß auf den Endnutzen optischer STJs in den Biowissenschaften haben.
  • LITERATUR
    • 1. T. Schwarzacher und J. S. Heslop-Harrison, "Practical in-situ hybridisation" (Praktische In-situ-Hybridisierung), Bios, Oxford (2000) 213 S.
    • 2. M. A. C. Perryman, C. L. Foden & A. Peacock, "Optical photon counting using superconducting tunnel junctions" (Zählung optischer Photonen mit supraleitenden Tunnelübergängen), Nucl. Instrum. Meth. A325, 319–325 (1993).
    • 3. A. Peacock, P. Verhoeve, N. Rando, A. van Dordrecht, B. G. Taylor, C. Erd, M. A. C. Perryman, R. Venn, J. Howlett, D. J. Goldie, J. Lumley & M. Wallis, "Single optical photon detection with a superconducting tunnel junction" (Nachweis einzelner optischer Photonen mit einem supraleitenden Tunnelübergang), Nature 381, 135–137 (1996).
    • 4. P. Verhoeve, N. Rando, A. Peacock, A. van Dordrecht, A. Poelaert & D. Goldie, "Superconducting tunnel junctions as photon counting detectors in the infrared to the ultraviolet" (Supraleitende Tunnelübergänge als Photonenzähldetektoren im infraroten bis ultravioletten Bereich), IEEE Trans. Appl. Supercon., 7, 3359–3362 (1997).
    • 5. N. Rando, J. Verveer, S. Andersson, P. Verhoeve, A. Peacock, A. Reynolds, M. A. Perryman & F. Favata, "S-Cam: a spectrophotometer for optical astronomy: Performance and latest results" (S-Cam: ein Spektrophotometer für die optische Astronomie: Leistung und neuste Ergebnisse), Rev. Sci. Instr. 71, 4582–4591 (2000).
    • 6. N. Rando, A. Peacock, A. van Dordrecht, C. L. Foden, R. Engelhardt, B. G. Taylor, P. Gare, J. Lumley & C. Pereira, Nucl. Instr. Meth. A 313, 173–83 (1992).
    • 7. A. H. Sommer, "Photoemissive materials" (Photoemissionsmaterialien), Wiley (New York) (1968).
    • B. META detector for the Carl Zeiss LSM 510 confocal microscope (META-Detektor für das konfokale Carl Zeiss LSM 510-Mikroskop), Carl Zeiss, Welwyn Garden City, Herts, UK.
    • 9. I. G. Butler et al., "Performance of a large area MCP photon counting intensifier" (Leistung eines großflächigen MCP-Photonenzählverstärkers), Proc. SPIE 2278, 126–30 (1994).
    • 10. R. W. Romani, A. J. Miller, B. Cabrera, S. W. Nam und J. M. Martinis, "Phase resolved Crab studies with a cryogenic TES spectrophotometer" (Phasenaufgelöste Crab-Untersuchungen mit einem TES-Tieftemperatur-Spektrophotometer), Ap. J., in Druck (2002).
    • 11. Omega Optics Inc., 210 Main Street, Brattleboro, VT 05301, USA.
    • 12. N. Panchuk-Voloshina et al., "Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates" (Alexa-Farbstoffe, eine Serie von neuen Fluoreszenzfarbstoffen, die außergewöhnlich helle, photostabile Konjugate liefern), J. Histochemistry & Cytochemistry 47(1999)1179–88.
    • 13. TeleChem International Inc., 524 E. Weddell Drive, Suite No. 3, Sunnyvale, CA94089, USA.

Claims (20)

  1. Anwendung eines supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektors zum Nachweis von Photonen in einem Bioassay, wobei Licht von dem Assay mit einem Lichtleiter zu dem Detektor übertragen wird.
  2. Anwendung nach Anspruch 1, wobei der supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektor ein supraleitender Tunnelübergang (STJ) ist.
  3. Anwendung nach Anspruch 1, wobei der Detektor Fluoreszenz nachweist und das Licht Fluoreszenzlicht ist.
  4. Anwendung nach Anspruch 3, wobei das Bioassay Chemilumineszenz beinhaltet.
  5. Anwendung nach Anspruch 3, wobei die Fluoreszenz Röntgenfluoreszenz ist.
  6. Anwendung nach Anspruch 1, wobei der Detektor stimulierte Emission nachweist.
  7. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Photonen von einem Marker herrühren.
  8. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Photonen über ein Spektrum erfaßt werden.
  9. Anwendung nach Anspruch 8, wobei Fluoreszenz von Ultraviolett bis Infrarot erfaßt wird.
  10. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bioassay Hybridisierung beinhaltet.
  11. Anwendung nach Anspruch 10, wobei die Hybridisierung zwischen einem immobilisierten Nukleinsäure-Bindungspartner und einer markierten Sonde erfolgt.
  12. Anwendung nach Anspruch 1, wobei der Detektor die Lichtextinktion erfaßt.
  13. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Detektor ein einziges Element aufweist.
  14. Anwendung nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Detektor aus zwei oder mehreren Detektorelementen besteht.
  15. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche mit Nachweis von mehreren Fluoreszenzfarben oder mehreren Absorptionsfarben der Probe.
  16. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche mit Nachweis einer Änderung zwischen der ungebundenen Sonde und der gebundenen Sonde, die von einer Änderung der Konformation oder der lokalen Umgebung bei der Bindung der Sonde an das Target herrührt.
  17. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei am warmen Ende des Lichtleiters ein Eichsignal erzeugt wird.
  18. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mit einem vernetzten Lichtleiter von mehr als einem Bioassay oder diagnostischen Assay Licht zu dem Tieftemperaturdetektor übertragen wird.
  19. Bioimaging-Verfahren, das den Nachweis von Photonen mit einem supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor zur Erfassung von Photonendaten umfasst, wobei Licht von einem Bioassay mit einem Lichtleiter zu dem Detektor übertragen wird, und die Auswertung der Daten aufweist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Verfahren zum quantitativen Bioimaging von mehreren Fluoreszenzfarbstoffen bzw. Fluorochromen dient und den Nachweis von Fluoreszenz aufweist.
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