DE60132798T2

DE60132798T2 - Zusammensetzung einer natriumkanal-blockierenden verbindung

Info

Publication number: DE60132798T2
Application number: DE60132798T
Authority: DE
Inventors: Yuhong Nanning City KANG; Frank Haykong North Point Shum
Original assignee: Nanning Maple Leaf Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wex Medical Ltd
Priority date: 2000-11-22
Filing date: 2001-11-19
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2021-11-20
Also published as: DE60132798D1; WO2002041915A1; CN1353990A; US6559154B2; EP1335747B1; EP1335747A4; AU2002221491A1; US20020119987A1; JP2004513186A; EP1930027A3; CN1236773C; ATE385799T1; EP1930027A2; EP1335747A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Arzneimittel, die mindestens eine Natriumkanal-blockierende Verbindung in einem geeigneten pharmazeutischen Vehikel umfasst.
CN-A-1 192 903 offenbart Lösungen, die Tetrodotoxin und Benzoe- oder Essigsäure umfassen. Der pH-Wert der Lösung ist 4,0 oder 5,0. EP-A-0 750 909 offenbart Lösungen, die Tetrodotoxin oder Analoga davon und Benzoe- oder Essigsäure umfassen. Der pH-Wert der Lösung ist 4,0 oder 5,0. US-A-6,030,974 offenbart wässrige Lösungen von Tetrodotoxin oder Saxitoxin, die einen pH-Wert zwischen 4 und 8 haben.
US-A-3,898,339 offenbart Lösungen von Tetrodotoxin, die einen pH-Wert von 3,5 bis 5,0 haben. Die Lösungen enthalten Salzsäure.
WO 98/51290 offenbart Lösungen von Tetrodotoxin in Citratpuffer bei einem pH-Wert von 4,45.
WO 02/22128 und WO 02/22129 offenbaren eine Lösung von Tetrodotoxin in Acetatpuffer, die einen pH-Wert von 4,0 bzw. 3,5 hat.
Indrasena und Gill (2000), Food Chemistry 71, Seiten 71–77 beschreiben die Lagerfähigkeit von Paralytic Shellfish Poison in Toxinen (paralytische Muschelvergiftung) und berichten, dass unter anderem Saxitoxin oder Neosaxitoxin bei niedrigem pH-Wert (pH (pH 3–4) und –35°C stabil sind.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellen eine Lösung bereit, die die Anforderungen für die klinische Verwendung erfüllt. Spezifisch bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Zusammensetzung, umfassend (a) mindestens eine Natriumkanal-blockierenden Verbindung, die spezifisch an eine Stelle auf einer SS1-Region oder einer SS2-Region einer alpha-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der eine wässrige Lösung einer schwachen organischen Säure und ein C₂ bis C₆-Alkanglycol umfasst und der einen pH-Wert hat, der von 3,0 bis 5,0 reicht, wobei die Natriumkanal-blockierende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tetrodotoxin, einem Hydrotetradotoxin, Tetrodaminotoxin, Methoxytetrodotoxin, Ethoxytetrodotoxin, Desoxytetrodotoxin, Tetrodonsäure und Saxitoxin. Die Formulierung kann systemisch für Indikationen, die Schmerz, der Analgesie erfordert, und die Behandlung von Drogenabhängigkeit beinhalten, aber nicht darauf begrenzt sind, verabreicht werden (S. US Patent 5,846,975 ). Die Formulierung kann verabreicht werden, wie in A Method of Analgesia, Dong Q. et al, US Patent 6,407,088 , am 18. Juni 2002 veröffentlicht, beschrieben.
Tetrodotoxin ist ein Nichtprotein-Neurotoxin mit starker Aktivität Es wird in verschiedenen Tierarten gefunden, die Kugelfisch, Grundel, Molch, Frösche und den blaugeringten Oktopus beinhalten.
Als Natriumkanal-blockierende Verbindungen mit hoher Selektivität binden Tetrodotoxin und Saxitoxin spezifisch an eine Stelle an der extrazellulären Region, entweder an eine SS1-Region oder an eine SS2-Region einer alpha-Untereinheit eines Natriumkanals. Überraschenderweise können Verbindungen, die an die SS1- oder SS2-Region eines Natriumkanals binden, lang wirkende und starke Analgesie oder Anästhesie mit nicht schweren Nebenwirkungen erzeugen (Dong Q. et al, oben, und Ku B. et al, US Patent US 6,599,906 , am 29. Juli 2003 veröffentlicht).
Tetrodotoxin (TTX) hat eine chemische Formel von C₁₁H₁₇N₃O₈, und hat ein Molekulargewicht von 319,28. Der Merck Index, 10. Aufl. (1983), gibt an, dass Tetrodotoxin der generische Name für die Verbindung Octahydro-12-(hydroxymethyl)-2-imino-5,9:7,10a-dimethano-10aH-(1,3)dioxocino(6,5-d)-pyrimidin-4,7,10,11,12-pentol ist, welches die folgende Struktur hat:
Das TTX-Molekül besteht aus einer Perhydrochinozolingruppe mit einem Guanidin und sechs Hydroxylgruppen. Reines TTX ist ein weißes kristallines Pulver, geruchlos und geschmacklos. Es wird um 220°C ohne Zersetzung schwarz. TTX ist in saurer wässriger Lösung löslich, aber es ist nicht in organischen Lösungsmitteln löslich. Der pKa-Wert (wässrig) von TTX ist 8,76. Damit ist TTX ein basisches Alkaloid. Die wässrige Lösung von starken Säuren kann TTX zersetzen, so wird TTX gewöhnlich in einer wässrigen Lösung einer schwachen organischen Säure gelöst. TTX ist in neutralen bis schwach sauren Lösungen thermisch relativ stabil, aber wird schnell in einer stark saueren oder basischen wässrigen Lösung zerstört werden.
Die vorliegende Erfindung verwendet Tetrodotoxin, das eine Reinheit von mindestens 96% hat, als hauptsächliche Arzneistoffsubstanz. Tetrodotoxin kann durch die Methode erhalten werden, die in A. Method of Extracting Tetrodotoxin, Zhou M. et al, US Patent Nr. US 6,552,191 , am 22. April 2003 veröffentlicht, beschrieben ist. Die weitere Reinigung von TTX wird in der chinesischen Patentanmeldung Nr. 00132673.2 , eingereicht am 22. November 2000, und im U.S. Patent 6,562,968 , veröffentlicht am 13. Mai 2003, beschrieben.
Die Analoga von Tetrodotoxin, welche durch die Formulierung der Erfindung umfasst werden, sind Anhydrotetrodotoxin, Tetrodaminotoxin, Methoxytetrodotoxin, Ethoxytetrodotoxin, Desoxytetrodotoxin und Tetrodonsäure.
Da sich TTX schnell in Magensäure zersetzt, gilt die orale Aufnahme nicht als bevorzugter Verabreichungsweg. Daher sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung hauptsächlich für die Injektion, vorzugsweise für die intramuskuläre Injektion. Die meisten injizierbaren Formulierungen sind Lösungen, und solche Eigenschaften wie Löslichkeit, Stabilität und Sicherheit des Arzneistoffs müssen während des Konzipierens einer Injektion bedacht werden (Bi D., Pharmaceutics, 4. Auflage).
Die Berechung der TTX-Dosis für die Injektion beruht auf den Ergebnissen der präklinischen Pharmakologie und Pharmakodynamik-Studien. Die Berechnung der klinischen pharmazeutischen Dosierung beruht auf der in Tieren effektiven Dosierung: Im Allgemeinen wird sie als 1/5 der effektiven Tierdosierung berechnet. Jeweils 50, 60 und 70 kg werden als menschliche Körpergewichte verwendet.
Die analgetische ID₅₀ (halbmaximale Hemmungsdosis) von TTX in dem Essigsäure-induzierten Twisting-Test bei Mäusen ist 2,80 μg/kg (intramuskulär, IM). Demgemäß ist die empfohlene klinische Dosierung für Menschen: 2,80 μg/kg × (1/5) × 50 (60, 70) kg = 28,0 (33,6, 39,2) μg
Die effektive Dosierung von TTX in dem Formalin-induzierten Entzündungstest bei Ratten ist 2,5 μg/mg (IM) (P < 0,01). Demgemäß ist die empfohlene klinische Dosierung für Menschen: 2,50 μg/kg × (1/5) × 50 (60, 70) kg = 25,0 (30,0, 35,0) μg
Es ist auch möglich, die klinische Anfangsdosierung bezogen auf den LD₅₀-Wert zu berechnen. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse von Pharmakodynamik-Studien kann die klinische Dosierung als 1/50 von LD₅₀ berechnet werden. Jeweils 50, 60 und 70 kg werden als menschliche Körpergewichte verwendet. Unsere neueste Studie zeigt, dass LD₅₀ bei Mäusen 11,1 μg/kg (im) ist, daher ist die vorgeschlagene klinische Dosis: 11,1 μg/kg × l/50 × 50 (60, 70) kg = 11,1 (13,32, 15,54) μg
Auf Grundlage der Ergebnisse der Pharmakologie-Studien und der Erkenntnis auf dem Fachgebiet wird konzipiert, dass die Konzentration von TTX für die Injektion 15 μg/ml ist und die Füllung einer TTX-Injektion normalerweise 1 oder 2 ml ist.
TTX ist eine Perhydrochinozolinverbindung, die in Wasser nur schwer löslich, aber in einer wässrigen Lösung, die einen sauren oder basischen pH-Wert hat, löslich ist. Daher können solche allgemein verwendeten Hilfslösungsmittel wie verdünnte Essigsäure, Salzsäure und Citronensäure verwendet werden, um TTX für die Formulierung zu lösen. Das Aufrechterhalten eines sauren pH-Werts hilft, die Stabilität einer TTX-Formulierung zu gewährleisten, da TTX in schwach sauren Lösungen ziemlich stabil ist.
Die durch die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltende Säure ist eine schwache organische Säure, und Ameisensäure, Essigsäure oder Propionsäure wird bevorzugt.
Es ist bevorzugt, einen geeigneten Puffer, wie einen Acetatpuffer, einen Citratpuffer, einen Phosphatpuffer oder einen Boratpuffer für den Zweck einzubeziehen, den pH-Wert der Formulierung in einem zulässigen Bereich aufrechtzuerhalten. Wir fanden (S. Beispiel 1), dass der pH-Wert einer TTX-Formulierung zwischen 3,0 bis 5,0 gehalten werden sollte. Der Puffer kann in einer Menge von bis zu 0,5% nach Gewicht der Formulierung hinzugegeben werden. (Eine Dichte von 1 g/ml wird für das formulierte Produkt angenommen.) Als Beispiel kann eine Mischung von 55,5 ml einer 0,2 M Essigsäurelösung und 4,5 ml einer 0,2 M Natriumacetatlösung hergestellt werden, dann zu einer Formulierung in einer Menge bis zu 5% nach Volumen der Formulierung gegeben werden. In diesem Beispiel wird der Puffer etwa 0,06% nach Gewicht der Formulierung ausmachen. So kann der Puffer normalerweise etwa 0,1% nach Gewicht der Formulierung ausmachen.
Wie vorstehend angegeben und in den Patentansprüchen charakterisiert, ist zusätzlich ein gemischtes Lösungsmittel, das aus C₂-C₆-Alkanglykol, am meisten bevorzugt aus Propylenglycol, und Wasser besteht, auch in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt, um die Stabilität von TTX in einer Formulierung zu verbessern. Das Alkanglycol Propylenglycol ist vorzugsweise bei einer Konzentration zwischen etwa 50% und etwa 80% vorhanden. Die Zugabe des C₂-C₆-Alkanglycols zu der Formulierung führt zur akzeptablen Stabilität mit der Verwendung eines höheren pH-Werts, was eine Formulierung bereitstellt, die von dem Patienten nach der Injektion besser vertragen wird.
Umweltfaktoren wie Temperatur, Licht, Feuchtigkeit und Sauerstoff wurden untersucht um ihren Einfluss auf die Stabilität der TTX-Formulierung zu bestimmen, so dass ein Formulierungs- und Herstellungsverfahren, das die Qualitätsanforderungen erfüllt, entwickelt werden kann. Die Testergebnisse (S. Beispiel 4) zeigen, dass die Feuchtigkeit und das Licht keinen signifikanten Effekt auf eine TTX-Formulierung haben, aber dass zunehmende Temperatur verursachen wird, dass der Gehalt von TTX abnimmt. Daher sollte eine TTX-Formulierung bei niedriger Temperatur gelagert werden, um ihre Stabilität zu gewährleisten.
Mehr Komponenten können zu einer TTX-Formulierung unter Berücksichtigung gegeben werden, das Ergebnis und die Bequemlichkeit der Lagerung zu verbessern, wie zum Beispiel Viskosität erhöhende Mittel wie Polyvinylalkohol, Cellulosen wie Hydroxypropyl-methyl-cellulose und Carbomer, Konservierungsmittel wie Benzalkoniumchlorid, Chlorbutanol, Phenylquecksilberacetat und Phenylquecksilbernitrat; Tonizitätsregulierer wie Natriumchlorid, Mannit und Glycerin und Penetrationsverstärker wie Glycole, Ölsäure, Alkylamine und dergleichen. Ein Vasokostriktor kann auch zu der Formulierung gegeben werden. Kombinationsformulierungen, welche die lang wirkende Natriumkanal-blockierende Verbindung und ein Antibiotikum, einen steroidalen oder einen nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneistoff und/oder einen Vasokostriktor beinhalten, werden in Erwägung gezogen.
Unter Berücksichtigung der Arzneistoffsicherheit zeigen die in A Method of Analgesia, Dong Q. et al., oben, beschriebenen Beispiele, dass die TTX-Formulierung die Anforderungen für geringe Toxizität, geringe Hämolysation und geringe örtliche Reizung erfüllen. Dong Q. et al wies auch darauf hin, dass die Verabreichung einer TTX-Formulierung keine schweren oder nicht umkehrbaren Nebenwirkungen hat.
Eine bevorzugte Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst die Substanz Tetrodotoxin, die eine Reinheit von 96% oder höher hat, als einen Wirkstoff, ein Hilfslösungsmittel, das aus verdünnter Essigsäure, verdünnter Salzsäure und Citronensäure ausgewählt wird, und einen 5%igen Essigsäure-Natriumacetatpuffer, um den pH-Wert zwischen 3,0–5,0 beizubehalten. Hohe Temperatur sollte während der Herstellung der Formulierung vermieden werden, und steriles Verarbeiten wird bevorzugt. Während des Transports sollte es vermieden werden das Produkt übermäßig dem zu direkten Sonnenlicht auszusetzen, und es wird empfohlen, dass das fertige Produkt an einem kühlen Ort, vorzugsweise bei 4–20°C gelagert wird.
Saxitoxin hat dem Tetrodotoxin ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften. Saxitoxin wird in Dinoflagellaten gefunden, welche Alexandrium tamarense, Gymnodium catenatum und Pyrodinium bahamense umfassen. Saxitoxin hat die folgende Struktur:
Saxitoxin ist auch in sauren Lösungen stabil. Saxitoxin ist ein hoch selektiver Natriumkanalblocker und erzeugt Analgesie oder Anästhesie durch diesen Mechanismus. Daher kann Saxitoxin auf die gleiche Weise wie TTX in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Formulierung der vorliegenden Erfindung kann gegebenenfalls ein saures Hilfslösungsmittel, ausgewählt aus verdünnter Essigsäure, verdünnter Salzsäure oder Citronensäure, und einen Puffer, ausgewählt aus Acetatpuffer, Citratpuffer, Phosphatpuffer und Boratpuffer, enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1. UV-Spektrum der Bestimmung der Tetrodotoxin-Injektion (990120-1A).
2. UV-Spektrum der Bestimmung der Tetrodotoxin-Kontrollprobe (S-1).
3. Chromatogramm der Retentionszeit von drei Chargen von Tetrodotoxin und einer Kontrollprobe.
4. HPLC-Chromatogramm einer Gehaltsbestimmung einer Probe von einer Tetrodotoxin-Injektions-Formulierung (990120-1A).
5. HPLC-Chromatogramm eines Wiederfindungstests einer Probe von einer Tetrodotox-Ininjektions-Formulierung.
6. Tag 0-Chromatogramm von TTX-Injektionsproben (Charge 990120-1A).
7. Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), 5 Tage Fluoreszenzlicht ausgesetzt.
8. Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), 10 Tage Fluoreszenzlicht ausgesetzt.
9. Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), 5 Tage bei 40°C gelagert.
10. Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), 10 Tage bei 40°C gelagert.
11. Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), 5 Tage bei 60°C gelagert.
12. Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), 10 Tage bei 60°C gelagert.
13. Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), 5 Tage bei 80°C gelagert.
14. Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), 10 Tage bei 80°C gelagert.
15. Monat 1-Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A) im Stresstest bei 40°C.
16. Monat 2-Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A) im Stresstest bei 40°C.
17. Monat 1-Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Formulierung (Charge 990120-1A), bei 4–5°C gelagert.
18. Monat 3-Chromatogramm einer Probe von einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), bei 4–5°C gelagert.
19. Monat 6-Chromatogramm einer Probe einer TTX-Injektions-Formulierung (Charge 990120-1A), bei 4–5°C gelagert.
20. Tag 10-Chromatogramm von TTX-Injektionsproben (Charge 990120-1A), bei der Feuchtigkeit von 92,5% gelagert.
21. Monat 1-Chromatogramm von TTX-Injektionsproben (Charge 990120-1A) im Stresstest bei 40°C.
22. Monat 2-Chromatogramm von TTX-Injektionsproben (Charge 990120-1A) im Stresstest bei 40°C.
23. Monat 1-Chromatogramm von TTX-Injektionsproben (Charge 990120-1A), bei 4–5°C gelagert.
24. Monat 3-Chromatogramm von TTX-Injektionsproben (Charge 990120-1A), bei 4–5°C gelagert.
25. Monat 6-Chromatogramm von TTX-Injektionsproben (Charge 990120-1A), bei 4–5°C gelagert.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, aber begrenzen die Erfindung nicht, welche durch die nachstehenden Patentansprüche definiert wird.
Beispiel 1 – Rezepturscreening
Dieses Experiment erforschte hauptsächlich die Auswirkungen von verschiedenen Hilfslösungsmitteln, verschiedenen pH-Werten, Temperatur, Licht, Sauerstoff und Puffermengen auf die Stabilität der pharmazeutischen Lösungen von Tetrodotoxin (TTX). Folglich wird eine optimale Zusammensetzung einer TTX-Formulierung bestimmt. Die Experiment-Ergebnisse legen eine Zusammensetzung nahe, die verdünnte Essigsäure als Hilfslösungsmittel und eine 5%ige Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung als Stabilisator für den pH-Wert der pharmazeutischen Lösung von TTX umfassen. Der optimale pH-Wert ist in dem Bereich von 3.5–4.5. Hohe Temperatur sollte vermieden werden. Die Sterilisation sollte als in-process Schritt beim Verfahren der Formulierungsherstellung durchgeführt werden. Während des Transports sollte das Produkt nicht übermäßig dem Sonnenlicht ausgesetzt werden; und es wird empfohlen, dass das fertige Produkt an einem kühlen Ort gelagert wird.
Alle Testchargen, die nach der vorstehend beschriebenen Formulierungsmethode hergestellt wurden, erfüllten die Qualitätsstandards für die Injektionen in jedem Testparameter. Ihre Stabilität und Reproduzierbarkeit waren gut, was anzeigt, dass dieser Formulierungsentwurf geeignet und durchführbar ist.
1. Die Auswahl des Hilfslösungsmittels:
Die in der Formulierung allgemein verwendeten Hilfslösungsmittel verdünnte Salzsäure-, verdünnte Essigsäure- bzw. Citronensäurelösung wurden für die Formulierung von TTX für die Injektion getestet. Die Stabilität von TTX in diesen drei sauren wässrigen Lösungen wird dann durch Stresstest im 100°C-Wasserbad verglichen.
Probenvorbereitung:

Charge Nr. 1: TTX, gelöst in 0,01 N verdünnter Salzsäure, geben Sie Wasser zu und stellen Sie die TTX-Lösung mit einer Konzentration von 12 μg/ml her, stellen sie ihren pH-Wert auf etwa 4,4 ein, füllen und versiegeln Sie sie in 2 ml-Ampullen.
Charge Nr. 2: TTX, gelöst in 0,5% verdünnter Essigsäure, geben Sie Essigsäure-Natriumacetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 4,40 zu, geben Sie Wasser zu, um die TTX-Lösung mit einer Konzentration von 12 μg/ml herzustellen, füllen und versiegeln Sie sie in 2 ml-Ampullen.
Charge Nr. 3: TTX, gelöst in 0,5%iger Citronensäurelösung, geben Sie Citronensäure – Natriumcitratpufferlösung mit einem pH-Wert von 4,40 zu, geben Sie Wasser zu, um die TTX-Lösung mit einer Konzentration von 12 μg/ml herzustellen, füllen und versiegeln Sie sie in 2 ml-Ampullen.

Testverfahren
Inkubieren Sie die vorstehenden Proben in einem 100°C-Wasserbad für die Stressexperimente. Nehmen Sie eine Probe und bestimmen Sie die pH-Werte und den TTX-Gehalt bei 0 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min und 60 min. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Die Begründung für die Wahl des Stressexperiments im 100°C-Wasserbad und die Probenahme innerhalb von 60 Minuten, um die pH-Werte und den TTX-Gehalt zu bestimmen, ist, dass das allgemeine Verfahren für sterile Injektion normalerweise ist, die Formulierung 15–30 Minuten mit einer 100°C-Dampfzirkulation zu sterilisieren. Wenn das Experiment unter diesen Bedingungen ausgeführt wird, können nicht nur die Testergebnisse der Formulierungsstabilität in kürzerer Zeit erhalten werden, sondern die Sterilisationsbedingungen können auch geeignet ausgewählt werden.
Tabelle 1. Änderungen der pH-Werte und Gehalte von verschiedenen sauren wässrigen Lösungen (Hilfslösungsmittel) von TTX im 100°C-Wasserbad
Diskussion:
Wie in Tabelle 1 gezeigt, führten die drei unterschiedlichen Formulierungsverfahren zur Schwankung ihrer pH-Werte. Nach Erhitzen bei 100°C nahm der TTX-Gehalt von allen Chargen ab. Der pH-Wert der TTX-Salzsäurelösung änderte sich wesentlich, wenn keine Pufferlösung hinzugefügt wurde. Bei den anderen zwei Verfahren, wo verdünnte organische Säuren als Hilfslösungsmittel verwendet wurden und ein Puffer zugegeben wurde änderte sich der pH-Wert kaum. Daher muss eine bestimmte Menge Pufferlösung in die Formulierung gegeben werden, um den pH-Wert konstant zu halten. Tabelle 1 zeigt auch, dass das Erhitzen eine wesentliche Abnahme im TTX-Gehalt verursachen konnte. Die Zersetzung des Probe (2)-Gehalts ist kleiner als die der anderen zwei Proben, was anzeigt, dass TTX in Essigsäurelösung stabiler ist.
2. Die Auswirkungen von Sauerstoff in der Luft und Erhitzen bei hoher Temperatur auf die TTX-Lösung
Gemäß der in Tabelle 1 gezeigten Testergebnisse nahmen die TTX-Gehalte von jeder Charge 20–35% ab, wenn 10 min bei 100°C erhitzt wurde, was anzeigt, dass das Erhitzen bei hoher Temperatur große Auswirkungen auf den TTX-Gehalt hat. Andererseits war es auch notwendig, zu bestimmen, ob oder nicht der Sauerstoff in der Luft einer der Gründe war, der verursachte, dass der TTX-Gehalt wesentlich abnahm. Daher wurden Stresstests von TTX-Lösungen bei hoher Temperatur mit und ohne Desoxygenierung der Präparation ausgeführt. Auch wurde mit der Füllung der Ampullen mit N₂ bzw. CO₂ verglichen.
Probenvorbereitung.

Charge Nr. 1: TTX, gelöst in 0,5%iger verdünnter Essigsäure, geben Sie Essigsäure – Natriumacetatpufferlösung (pH 4,40) zu, geben Sie Wasser zu, um eine TTX-Lösung mit einer Konzentration von 12 μg/ml herzustellen, füllen und versiegeln Sie sie in 2 ml-Ampullen (Präparation ohne Desoxygenierung).
Charge Nr. 2: TTX, formuliert wie vorstehend für Charge 1, aber während der Präparation wird die Wasserlösung zuerst mit N₂ desoxygeniert, dann in 2 ml-Ampullen unter N₂ gefüllt und versiegelt (desoxygenierte Präparation).
Charge Nr. 3: TTX, formuliert wie vorstehend für Charge Nr. 1, aber in dem Formulierungsverfahren wird die Wasserlösung zuerst mit Kohlendioxid (CO₂) deoxygeniert, dann in 2 ml-Ampullen unter CO₂ gefüllt und versiegelt (deoxygenierte Präparation).

Testverfahren:
Die Chargen wurden in einem 100°C-Wasserbad für die Stressexperimente inkubiert. Proben wurden genommen und die pH-Werte und der TTX-Gehalt wurden bei 0 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 20 Minuten, 25 Minuten, 30 Minuten und 60 Minuten bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2. Testergebnisse der Auswirkung des Sauerstoffs in der Luft und Erhitzen bei hoher Temperatur (100°C) auf die TTX-Lösung
Diskussion:
Auf Grundlage der in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse gab es keine ersichtlichen Unterschiede im TTX-Gehalt zwischen den Beschleunigungstests mit Deoxygenierung und ohne Deoxygenierung, was nahelegt, dass der Sauerstoff in der Luft keine Auswirkung auf die TTX-Gehalte der Lösungen hat. In diesen Tests nahmen die TTX-Gehalte aller Gruppen durchschnittlich bis 25% ab, wenn sie 10 Minuten bei 100°C erhitzt wurden, was nahelegt, dass das Erhitzen bei hoher Temperatur der Hauptgrund für die Abnahme im TTX-Gehalt der Lösungen ist. Daher sollte Erhitzen bei hoher Temperatur bei dem Formulierungsverfahren vermieden werden. Es wird empfohlen, Filtrationssterilisation anstatt von Hitze-Sterilisation zu verwenden.
3. Die Auswirkungen von Licht auf die Stabilität der TTX-Lösung
Es wird in der Literatur berichtet, dass TTX gegenüber Licht relativ stabil ist. Die Auswirkungen des Lichts auf seine Formulierungen werden getrennt mit Diffusionslicht (normales Innenlicht) und direktes ausgestrahltes Sonnenlicht beobachtet.
Probenvorbereitung:
Die Proben wurden hergestellt, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
Testverfahren:
Setzen Sie die Proben unterschiedlichen Zeitdauern Diffusionslicht bzw. Sonnenlicht aus; dann untersuchen Sie die Gehaltänderungen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 und Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 3. Auswirkungen von Diffusionslicht (normales Innenlicht) auf die TTX-Lösung
Tabelle 4. Auswirkungen von direktem ausgestrahltem Sonnenlicht auf die TTX-Lösung
Diskussion:
Tabelle 3 und Tabelle 4 zeigen, dass die Testergebnisse in Übereinstimmung mit jenen sind, über die in der Literatur berichtet wurde. Die TTX-Lösung ist relativ stabil gegenüber Licht, so gibt es keine Notwendigkeit, das Produkt vor Licht zu schützen. Wenn direktem Sonnenlicht ausgesetzt, änderte sich jedoch leicht der Gehalt, was nahelegt, dass es vermieden werden sollte die Formulierung übermäßig dem Sonnenlicht auszusetzen und die Formulierung an kühlen und beschatteten Orten gelagert werden sollte.
4. Die Beobachtung der Stabilität von TTX-Lösungen bei verschiedenen pH-Werten
Es wurde in der Literatur berichtet, dass TTX in saurer und neutraler wässriger Lösung relativ stabil ist. Die TTX-Stabilität wird bei unterschiedlichen pH-Werten untersucht.
Probenvorbereitung:
TTX-Lösungen, die verschiedene Puffermengen enthielten, um pH-Werte von jeweils 3,00, 3,50, 4,00, 4,50, 5,00, 5,50 zu erreichen, wurden hergestellt. TTX wurde in 0,5%iger verdünnter Essigsäurelösung gelöst, geben Sie die erforderliche Menge Essigsäure-Natriumacetatpufferlösungen zu, um die vorstehenden pH-Werte zu erhalten, geben Sie Wasser zu und stellen sie die TTX-Lösung mit einer Konzentration von 12 μg/ml her, füllen und versiegeln Sie sie in 2 ml-Ampullen.
Testverfahren:
Die Proben wurden bei 70°C inkubiert. Die Proben wurden gezogen und der TTX-Gehalt wurde jeweils bei 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 Stunden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgelistet.
Tabelle 5. Beschleunigungstestergebnisse von TTX-Lösungen bei verschiedenen pH-Werten bei konstanter Temperatur (70°C)
Diskussion:
Die Testergebnisse zeigten die pH-abhängige Zersetzung der TTX-Lösung an. Die Zersetzung ist größer bei höherem pH-Wert. TTX ist relativ stabiler mit einem pH-Wert im Bereich von 3,00–4,08.
5. Die Auswahl der zugegebenen Acetatpuffermenge
Wie in den vorstehenden Tests gezeigt, ist die Zersetzungsgeschwindigkeit einer erwärmten TTX-Lösung mit zunehmendem pH-Wert größer. Daher sollte für den Rezepturentwurf der pH-Wert der TTX-Injektion nur zum partiell sauren Bereich zugewiesen werden, und eine angemessene Menge Pufferlösung sollte zugegeben werden. Auf diese Art und Weise kann eine relativ konstante pH-Umgebung für die Formulierung beibehalten werden, um die Stabilität der Formulierung während einer vorgesehenen Lagerungsdauer zu gewährleisten. Somit wandten wird das orthogonale Verfahren an, um die zugebende Menge Acetatpufferlösungen verschiedener pH-Werte für die Tests zu konzipieren.
Experimentaufbau:
De pH-Werte der Acetatpufferlösungen und ihre jeweiligen zugebenden Mengen werden durch die Methode des orthogonalen Testentwurfs optimiert. Die ausgewählten und verwendeten Faktoren und ihre Niveaus für die Tests sind in der folgenden Tabelle 6 aufgelistet. Tabelle 6. Faktoren und Niveaus

Niveau Faktor

A pH B Zugebende Menge Pufferlösungen (auf Grundlage des Gesamtvolumens der hergestellten Lösungen)

1 3,0 0,1%

2 3,5 1%

3 4,5 5%

4 5,0
Testverfahren:

Gemäß dem orthogonalen Testentwurf wählen Sie Acetatpufferlösungen mit verschiedenen pH-Werten und die zugehörige hinzufügende Menge aus, um die Proben herzustellen. In Anlehnung an die ausgewählten Testbedingungen, wie in Abschnitt 4 beschrieben, erhitzen Sie die Proben 2 h in einem 70°C-Wasserbad; dann untersuchen Sie die TTX-Gehalte in den Proben und berechnen Sie die Restanteile. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgelistet. Tabelle 7. Die Anordnung der orthogonalen Experimente und die Analyse der Ergebnisse

Tabelle 8. Varianzanalyse

Varianzursprung	Summe der Quadrate	Freiheitsgrad	Varianz	F-Wert	Signifikanz
A B	SS_A = 319.98 SS_B = 133.38	3 2	SS_A/3 = 106,66 SS_B/2 = 66,69	F_A = 28,52 F_B = 17,83	※ ※ ※ ※
Fehler	SS_e = 22.44	6	SS_e/6 = 3,74
Summe	SS = 475.80	11

F_0,05 (3,6) = 4,76, F_0,01 (3,6) = 9,78,
F_0,05 (2,6) = 5,14, F_0,01 (2,6) = 10,92

Diskussion:
Auf Grundlage der Testergebnisse und der Tabelle der Varianzanalyse wurde gefunden, dass Faktor A und Faktor B signifikant unterschiedlich sind (P < 0,01), was anzeigt, dass der pH-Wert des Acetatpuffers und die zugegebene Puffermenge beträchtliche Auswirkungen auf die Stabilität der Formulierung haben. Auf Grundlage der Testergebnisse ist die beste Kombination A₂B₃, d. h. die höchste Stabilität der TTX-Lösung wird erreicht, wenn der pH-Wert 3,5 ist und die zugegebene Puffermenge 5% ist.
Aus den vorstehenden Experimenten wird nahegelegt, dass eine TTX-Formulierung verdünnte Essigsäure als Hilfslösungsmittel und 5% Essigsäure-Natriumacetatpuffer vom pH-Wert in dem Bereich von 3,5 bis 4,0 umfasst. Das Erhitzen bei hoher Temperatur sollte bei dem Herstellungsprozess der Formulierung vermieden werden, so wird es empfohlen, die sterile Herstellung oder Filtration der fertigen Formulierung für die Sterilisation zu verwenden. Es sollte während des Transports vermieden werden das Produkt direktem Sonnenlicht auszusetzen. Es wird empfohlen, dass das fertige Produkt an einem kühlen Ort gelagert wird.

Alle mit der vorstehenden Formulierungstechnik hergestellten Testprodukte erfüllten die Qualitätsanforderungen für pharmazeutische Injektionen, nachdem sie in allen Kriterien untersucht wurden, und zeigten ausgezeichnete Reproduzierbarkeit und Stabilität an. Tabelle 9. Quellen und Qualitätsstandards der Roh- und Hilfsmaterialien

Name China, Bd. 1995: 1064	Spezifizierung	Qualitätsstandard	Hersteller
TTX		Standard des Herstellers	Nanning Maple Leaf Pharmaceutical Co., Ltd
Essigsäure	Pharmaceutica 1	Pharmakopöe der V.R. China, Bd. 1995: 1064	Nanning No 2 Chemical Factory
Natriumacetat	AR	Nationaler Standard GB 694 = 81	Guangzhou No 2 Chemical Reagent Factory

Literaturnachweis

[1] Dianzhou Bi, Pharmaceutics, 4. Aufl., S. 271–272, People's Health Publisiting Services.
[2] Maoqin Zhou et al, A method of extracting tetrodotoxin with high yield, chinesische Patentanmeldung Nr. 00124517.1 , 18. Sep. 2000
[3] Qingbin Dong, A method of analgesia by systemic administration, chinesische Patentanmeldung Nr. 00124516.3 , 18. Sep. 2000.

Beispiel 2 – Die Qualitätsstudie der Tetrodotoxin-Formulierung
1. Eigenschaften
Dieses Produkt ist eine farblose, klare Flüssigkeit.

Chargennummer Eigenschaften

990120-1A Farblose, klare Flüssigkeit

990121-2A Farblose, klare Flüssigkeit

990122-3A Farblose, klare Flüssigkeit

Schlussfolgerung: Alle Proben der drei Chargen sind farblose, klare Flüssigkeiten.

2. Identifizierung

2.1 UV-Absorption: Tetrodotoxin selbst hat keine charakteristische UV-Absorption. Es kann jedoch mit basischem Wasser hydrolysiert werden und 2-Amino-6-methylol-8-hydroxychinazolin (C₉-Base) und eine bestimmte Menge Natriumoxalat produzieren, welches eine signifikante charakteristische Absorption in der UV-Region zeigt und so für Identifizierungszwecke verwendet werden kann. Verfahren: Nehmen Sie 10 ml des Produkts und geben Sie es in ein Teströhrchen mit Stopfen, geben Sie 1,0 ml 6,0 M NaOH-Lösung zu, schütteln und mischen Sie gut, und erhitzen Sie 45 Minuten in einem 80°C-Wasserbad, dann kühlen Sie sofort auf Raumtemperatur ab und messen Sie sein Absorptionsspektrum in dem Bereich von 340–220 nm gemäß dem Spektralphotometrie-Verfahren, das im Anhang IV A, Pharmakopöe der V.R. China, Bd. 2, 1995 aufgelistet ist. (Die Ergebnisse werden in den 1 und 2 und in der Tabelle nachstehend gezeigt).

Chargennummer	λmax (nm)		λmin (nm)
Kontrollprobe	277,5	230,8	255,7
990120-1A	277,1	232,3	255,1
990121-2A	277,6	232,8	255,6
990122-3A	277,0	232,0	254,2

2.2 HPLC: HPLC wurde durchgeführt, wie für die „Gehaltsbestimmung" nachstehend beschrieben. Das Chromatogramm wird in 3 gezeigt. Die Produktprobe und die Kontrollprobe zeigen die gleiche Retentionszeit.

Chargennummer	t_R(min)
Kontrollprobe	16,8
990120-1A	16,7
990121-2A	16,6
990122-3A	16,6

3. Kontrolle

3.1 Acidität: Der pH-Wert der Probelösungen.

Chargennummer	PH
990120-1A	3,9
990121-2A	3,9
990122-3A	3,9

Schlussfolgerung: Die pH-Werte der drei Chargen der Proben sind alle 3,9.

3.2 Klarheit der Lösung: Nehmen Sie 200 Ampullen von jeder der drei Chargen, untersuchen Sie auf Klarheit bzgl. der „Clarity Inspection Procedures und Standards". Die Ergebnisse sind nachstehend aufgelistet:

Chargennummer	Klarheit
990120-1A	Klar
990121-2A	Klar
990122-3A	Klar

Schlussfolgerung: Die Proben der drei Chargen sind alle klar.

3.3 Optische Durchlässigkeit der Lösung: Die optische Durchlässigkeit der Proben von den drei Chargen wird bei 430 nm gemäß dem Spektralphotometrie-Verfahren gemessen (Pharmakopöe der V.R. China, Anhang IV A, Bd. 2, 1995). Die Ergebnisse sind, wie folgt, aufgelistet:

Chargennummer	Optische Durchlässigkeit
990120-1A	98,9
990121-2A	100,1
990122-3A	99,8

Schlussfolgerung: Die Lichtdurchlässigkeiten der drei Chargen der Proben sind alle größer als 98%.

3.4 Beladungsmenge: Nehmen Sie 5 Ampullen von jeder der drei Chargen, prüfen Sie ihre Beladungsmengen gemäß dem Kontrollverfahren für die Beladungsmenge der Injektion, das im Anhang I B, Pharmakopöe der V.R. China, Bd. 2, 1995 aufgelistet ist. Die Ergebnisse sind, wie folgt:

Chargennummer	Verpackungsmenge (ml)
990120-1A	2,10, 2,16, 2,20, 2,22, 2,22
990121-2A	2,38, 2,32, 2,38, 2,36, 2,34
9901223A	2,32, 2,36, 2,34, 2,40, 2,36

Schlussfolgerung: Die Beladungsmengen dieser Proben sind alle mehr als die gekennzeichnete Menge von 2.0 ml.

3.5 Sterilisation: Nehmen Sie das Produkt und kontrollieren Sie es gemäß dem Verfahren, das im Anhang XI H, Pharmakopöe der V.R. China, Bd. 2, 1995 aufgelistet ist. Das Produkt erfüllt die Kriterien.
3.6 Bakterienendotoxin: Nehmen Sie das Produkt und prüfen Sie es gemäß dem Verfahren, das im Anhang XI E, Pharmakopöe der V.R. China, Bd. 2, 1995 aufgelistet ist. Der Gehalt des Bakterienendotoxin ist weniger als 7,5 EU/ml.
3.7 Abnorme Toxizität: Nehmen Sie das Produkt und verdünnen Sie es als 1:75-Verhältnis, kontrollieren Sie es gemäß dem Verfahren, das im Anhang XI C, Pharmakopöe der V.R. China, Bd. 2, 1995 aufgelistet ist. Die Ergebnisse erfüllen die Kriterien.
3.8 Hypersensibilitätstest: Verfahren: Einer Gruppe von 6 Meerschweinchen, zur Hälfte männlich und zur Hälfte weiblich, wurden jeweils intraperitoneal 0,5 ml TTX-Injektion alle zwei Tage gegeben, eine Gesamtmenge von drei Dosierungen pro Tier. Vierzehn Tage nach der letzten Dosis wurden drei Tieren der Gruppe jeweils 1,5 ml intravenös der Testarzneistoff gegeben, um auf Hypersensibilitätsreaktionen zu testen. Die Tiere wurden in den folgenden 15 Minuten bis 24 Stunden auf Hypersensibilitätsreaktionen genau beobachtet. Positive Hypersensibilitätsreaktionen wurden gefolgert, wenn zwei oder mehrere der folgenden klinischen Anzeichen beobachtet wurden: Piloarrektion, dyspnoische Atmung, Niesen, Würgen und Husten. Hypersensibilität wurde auch gefolgert, wenn ein beliebiges von Rasselgeräusch, Zuckung, oder Tod aus Kollaps beobachtet wurden. Anderenfalls wurden negative Reaktionen gefolgert. Einundzwanzig Tage nach der letzten Dosis wurden die übrigen drei Tiere durch das gleiche Verfahren getestet, und ihre Reaktionen wurden durch die gleichen Kriterien bestimmt.
3.9 Verunreinigungen: Gemäß dem Verfahren in „Gehaltsbestimmung", nachstehend, wiegen Sie genau eine geeignete Menge des Produkts ein, geben Sie Wasser zu, um eine Kontrolllösung mit einer Konzentration von 0,75 μg/ml herzustellen. Nehmen Sie 100 μl dieser Kontrolllösung und injizieren Sie sie in den Chromatographen für vorbereitende Tests. Stellen Sie die Nachweisempfindlichkeit so ein, dass die Peakhöhe der Hauptkomponenten 10–25% der ganzen Skala ist. Nehmen Sie genau 100 μl des Produkts und injizieren Sie sie in den Chromatographen, nehmen sie das Chromatogramm über die doppelte Retentionszeit der Hauptkomponenten auf. Messen Sie die Summe der Verunreinigungspeaks, welche nicht größer als die Peakfläche der Hauptkomponente sein sollten.

Chargennummer	Verwandte Substanz (%)
990120-1 A	Nicht größer als die Peakfläche der Hauptkomponente
990121-2A	Nicht größer als die Peakfläche der Hauptkomponente
990122-3A	Nicht größer als die Peakfläche der Hauptkomponente

4. Gehaltsbestimmung
Die HPLC-Untersuchung wird als das Analysenverfahren für die Gehaltsbestimmung verwendet.

4.1 Instrument und Reagenzien Instrument: Beckman HPLC (U.S.A., einschließlich Model 125-Pumpe. Variabler Wellenlänge-Detektor Model 166 und Gold Noveau-Chromatographie-Arbeitsstation). Arzneimittel: Tetrodotoxin, von Nanning Maple Leaf Pharmaceutical Co., Ltd. (MLP) aufgereinigt; und die Kontrollprobe von TTX, bereitgestellt von MLP. Reagenzien: Natrium-1-heptansulfonat (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd. Japan), Methanol (Merck), entionisiertes Wasser.
4.2 Chromatographie-Bedingungen und System: Säule: ODS (5 μm), 4.6 mm × 250 mm Säulentemperatur: 30°C Mobile Phase: 0.01 M Natrium-1-heptansulfonat (pH 5,30) – Methanol (100:1) Durchflussgeschwindigkeit: 1,5 ml/min Nachweiswellenlänge: 205 nm Das Chromatogramm wird in 4 gezeigt. Säuleneffizienz(n) Berechnet als Tetrodotoxin-Peak, n = 43227 theoretische Bodenzahl/Meter Trennung des Tetrodotoxin-Peaks und seiner benachbarten Peaks (R) = 1,8 Asymmetrischer Faktor für den Tetrodotoxin-Peak (T) = 1,14
4.3 Präzision Injizieren Sie 10 μl Probenlösung in den Chromatographen, nehmen Sie das Chromatogramm auf und messen Sie die Peakfläche, wiederholen Sie die Untersuchung sechsmal. Die RSD der Tetrodotoxin-Peakfläche ist 0,2% (n = 6).
4.4 Linearer Bereich und minimale Nachweisgrenze Wiegen Sie genau 13,90 mg der TTX-Kontrollprobe ein und geben Sie sie in einen 100 ml-Messkolben, geben Sie 0,02%ige Essigsäurelösung zu und verdünnen Sie zur Marke, schütteln und mischen Sie gut. Injizieren Sie genau 80, 40, 20, 8 und 4 μl der Lösung in den Chromatographen und nehmen Sie jeweils ihr Chromatogramm auf. Verwenden Sie die Peakfläche als vertikale Achse und die Menge der Probenahme als horizontale Achse, um die Standardeichkurve aufzuzeichnen. Die Gleichung der linearen Regression ist y = 3403,91 + 243226x mit einem linearen Bereich von 12,6250,505 μg und einem Korrelationskoeffizient von 0,9999.
Die minimale Nachweisgrenze ist 0.01 ng auf Grundlage des Signal-Rausch-Verhältnisses (S/N ≥ 3)
4.5 Wiederfindungstest:

Tetrodotoxin	15 mg
0,2%ige Essigsäurelösung	1 ml
pH 3,5 Essigsäure-Natriumacetatlösung	5% (50 ml)
Wasser zur Injektion	geben sie zu 1000 ml zu

Verfahren: Stellen Sie eine Lösung ohne Tretrodotoxin gemäß dem vorstehenden Rezept her, Lösung A genannt.
Wiegen Sie 14,08 mg Tetrodotoxin ein und geben Sie 0,2%ige Essigsäure zu, um 50 ml Lösung herzustellen. Diese Lösung wird Lösung B genannt.
Nehmen Sie 0.5 ml Lösung B und geben Sie 0,2%ige Essigsäurelösung zu, um 10 ml herzustellen. Diese Lösung wird Lösung C genannt.
Nehmen Sie 0.5 ml Lösung B und geben Sie Lösung A zu, um 10 ml herzustellen. Diese Lösung wird Lösung D genannt.
Nehmen Sie 100 μl der Lösungen A, C und D und injizieren Sie sie jeweils in das HPLC-System, und nehmen Sie ihre Chromatogramme auf (5).

Berechnen Sie die Wiederfindung. Die untersuchte Wiederfindung von Tetrodotoxin war 101,8%.

Lösung	Tetrodotoxin Peakfläche	Durchschnitt der Peakfläche	Durchschnittsgehalt von Tetrodotoxin (μg/100 ml)
C (0.2%ige Essigsäurelösung des Hauptarzneimittels	436671	436901,5	1,39659
C (0.2%ige Essigsäurelösung des Hauptarzneimittels)	437132	436901,5	1,39659
D (Hauptarzneimittel + Lösung A)	444093	444516	1,42256
D (Hauptarzneimittel + Lösung A)	444939
A (reines Lösungsmittel)	0

Wiederfindung R(%) = 1,42256/1,39659 × 100 = 101,85% ≈ 101,8%

4.6 Bestimmung des Probengehalts Nehmen Sie genau 100 μl der Probe und injizieren Sie sie in eine HPLC-Säule, nehmen Sie das Chromatogramm auf (4) und messen Sie die Peakfläche. Der Gehalt wird auf der Grundlage der Standardeichkurve berechnet. Die Ergebnisse der Proben der drei Chargen sind, wie folgt:

Chargennummer	Gehalt (%)
990120-1A	101.0
990121-2A	108.5
990122-3A	107.8

5. Literaturnachweis

[1] Pharmakopöe der V.R. China,. Anhang, Bd. 2, 1995
[2] Compilation Of Guidelines For Pre-Clinical Studies Of New Drug (Western Medicine), 1993
[3] Huozhong Zhang und Yuling Wen, Chemistry of Animal Active Component. Tianjin Science and Technology Press, 1995

Beispiel 3 – Das Durchmustern der besten Wasser- und Propylenglycolanteile für die TTX-Formulierung
Die Stabilität von TTX in Mischungen von verschiedenen Wasser- und Propylenglycolanteilen wurde bestimmt. Die Mischungen von verschiedenen Wasser- und Propylenglycolanteilen wurden verwendet, um TTX-Formulierungen herzustellen, welche dann jeweils 10 Minuten in einem 100°C-Wasserbad erhitzt wurden.
Instrument und Reagenzien:

• Waters 510 HPLC
• Elektrowärme-Wasserbad, Beijing Medical Equipment Factory
• TTX (Reinheit 96,85%), Nanning Maple Leaf Pharmaceutical
• 1.2-Propylenglycol, AR, Xinning Chemical Plant, Guangdong

Experimentaufbau:

				Gruppe
[Rezeptur I]	R₀	TTX	1,5 mg
Kontrollgruppe		0,5%ige Essigsäure	0,1 ml
		(pH = 3,5) HAC-NaAC-Puffer	5%	Gruppe a
	R₁	TTX	1,5 mg
		0,5%ige Essigsäure	0,1 ml	Gruppe A
		Propylenglycol	20 ml
		Wasser zur Injektion, fügen Sie hinzu auf (pH, mit 10%iger Essigsäure auf 3,5 eingestellt)	100 ml
	R₂	TTX	1,5 mg
		0,5%ige Essigsäure	0,1 ml	Gruppe B
		Propylenglycol	40 ml
		Wasser zur Injektion, fügen Sie hinzu auf (pH, mit 10%iger Essigsäure auf 3,5 eingestellt)	100 ml
	R₃	TTX	1,5 mg
		0,5%ige Essigsäure	0,1 ml	Gruppe C
		Propylenglycol	50 ml
		Wasser zur Injektion, fügen Sie hinzu auf 3,5 (pH, mit 10%iger Essigsäure auf eingestellt)	100 ml
	R₄	TTX	1,5 mg
		0,5%ige Essigsäure	0,1 ml	Gruppe D
		Propylenglycol	60 ml
		Wasser zur Injektion, fügen Sie hinzu auf (pH, mit 10%iger Essigsäure au 3,5 eingestellt)	100 ml
	R₅	TTX	1,5 mg
		0,5%ige Essigsäure	0,1 ml	Gruppe E
		Propylenglycol	70 ml
		Wasser zur Injektion, fügen Sie hinzu auf (pH, mit 10%iger Essigsäure auf 3,5 eingestellt)	100 ml
	R₆	TTX	1,5 mg
		0,5%ige Essigsäure	0,1 ml	Gruppe F
		Propylenglycol	80 ml
		Wasser zur Injektion, fügen Sie hinzu auf (pH, mit 10%iger Essigsäure auf 3,5 eingestellt)	100 ml
	R₇	TTX	1,5 mg
		0,5%ige Essigsäure	0,1 ml	Gruppe B
		Propylenglycol (pH, mit 10%iger Essigsäure auf 3,5 eingestellt)	100 ml

Wie vorstehend beschrieben, wurden die TTX-Formulierungen hergestellt und in 2 ml-Ampullen gefüllt. Die Ampullen (jede Gruppe 6) wurden dann 10 Minuten im 100°C-Wasserbad erhitzt. Als nächstes wurde der TTX-Gehalt in den Proben von jeder Gruppe untersucht und mit dem bei der Zeit 0 verglichen, und der TTX-Restgehalt in Prozent wurde für jede Gruppe berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10. Rest-TTX (%) in den gemischten Lösungsmitteln Propylenglycol und Wasser (Erhitzungszeit: 10 Min. bei 100°C)

Gruppe (Propylenglycol %) a (Kontrollgruppe) A 20% B 40% C 50% D 60% E 70% F 80% G > 95%

Rest-TTA (%) 83,50% 84,70% 86,60% 88,75% 89,50% 88,30% 88,70% 88,20%
Analyse und Schlussfolgerung:
Die Stabilität von TTX, d. h. der Restgehalt von TTX, nimmt allgemein mit dem Anteil von Propylenglycol zu. Der Restgehalt von TTX wurde um 88,5% gehalten, wenn der Propylenglycolanteil über 60% nach Volumen ist. Die Zugabe einer geeigneten Menge Propylenglycol verbessert die Stabilität einer TTX-Formulierung.
Das vorstehende Durchmusterungsexperiment zeigte, dass die Stabilität der TTX-Formulierung in einem gemischten Lösungsmittel von Wasser und Propylenglycol (pH auf 3,5 eingestellt) verbessert wird, verglichen zu einem Träger, der Essigsäure und einen Puffer umfasst. Daher kann TTX mit dem gemischten Lösungsmittel von Wasser und Propylenglycol formuliert werden, um seine Stabilität zu verbessern. Die Studie zeigte auch, dass der am meisten vorzuziehende Propylenglycolanteil in der Mischung mit Wasser 60% für die Stabilität der TTX-Formulierung ist.
Beispiel 4 Die Stabilitätsstudie der Tetrodotoxin (TTX)-Injektion
Die Stabilität von Tetrodotoxin (TTX), für die Injektion formuliert, gegenüber Licht, Hitze und Lagerungszeit unter unterschiedlichen Lagerungsbedingungen wurde untersucht. Die Ergebnisse zeigten an, dass Licht keine auffälligen Auswirkungen auf das TTX, wie für die Injektion formuliert, hat, und keine offensichtlichen Änderungen in dem physikalischen Aussehen und dem Gehalt wurden beobachtet. Jedoch war das Produkt empfindlich gegenüber der Temperatur; sein Gehalt nahm mit zunehmender Temperatur ab. Es wird empfohlen, dass die TTX-Injektion bei niedriger Temperatur gelagert wird.
1. Zweck
Um die Stabilität der TTX-Injektion gegenüber Licht, Hitze und Lagerungszeit unter verschiedenen Lagerungsbedingungen durch Entfernen der Verpackung einer Charge von Tetrodotoxin-Injektions-Formulierung (Chargennnummer 990120-1A) zu beobachten.
2. Testbedingungen

2.1 Licht: Setzen Sie sie 1, 3, 5 und 10 Tage Fluoreszenzlicht (2000–4000 Lx) aus
2.2 Hohe Temperatur: Setzen Sie sie 1, 3, 5 und 10 Tage 40°C, 60°C und 80°C aus.
2.3 Stresstest: Setzen Sie sie zwei Monate 40°C und 75% RH aus.

3. Versuchspositionen und Verfahren

3.1 Aussehen: visuelle Beobachtung
3.2 Gehaltsbestimmung: HPLC-Verfahren (S. Beispiel 2 für Details)

4. Testergebnisse
S. Tabelle 11, 8 bis 19.
5. Schlussfolgerung
Die Ergebnisse zeigten, dass nach Aussetzen der einen Gruppe der Testproben zu Fluoreszenz (3000 Lx) ihr Aussehen und ihre Gehalte unverändert blieben. Wenn sie 40°C, 60°C und 80°C ausgesetzt wurden, hatte ihr Aussehen keine signifikanten Änderungen, aber ihr Gehalt nahm beträchtlich ab. Für die gleiche Lagerungszeit, je höher die Temperatur, desto geringer der Gehalt.

Die Ergebnisse legen nahe, dass die Tetrodotoxin-Injektion bei niedriger Temperatur (2°C–8°C) gelagert werden sollte. Tabelle 11. Stabilitätsstudie der Tetrodotoxin-Injektion (990120-1A)

Testbedingung	Lagerungszeit	Aussehen	Gehalt (%)
Innentemperatur und Aussetzen einem Licht von 3000 LX	0 Tage 1 Tag 3 Tage 5 Tage 10 Tage	Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit	98,8 93,7 95,4 93,7 93,8
bei 40°C	0 Tage 1 Tag 3 Tage 5 Tage 10 Tage	Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit	98,8 90,8 88,3 86,4 87,0
bei 60°C	0 Tage 1 Tag 3 Tage 5 Tage 10 Tage	Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit	98,8 79,9 72,0 66,6 64,9
bei 80°C	0 Tage 1 Tag 3 Tage 5 Tage 10 Tage	Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit	98,8 55,2 53,7 45,2 39,6
Stresstest bei 40°C und RH 75%	0 Tage 1 Monat 2 Monate 3 Monate 6 Monate	Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit	98,8 75,65 71,49 n. d. n. d.
Lagerung bei 4–5°C	0 Tage 1 Monat 3 Monat 6 Monate	Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit Farblose und klare Flüssigkeit	98,8 96,16 95,43 95,69

Literaturnachweis

[1] Pharmakopöe der V.R. China, Bd. 2, 1995
[2] Compilation of Guidelines for Preclinical Research an New Drugs (Western Drugs), 1991
[3] Standardverfahren der Arzneistoffkontrolle der V.R. China

Claims

Zusammensetzung umfassend: (a) mindestens eine Natriumkanal-blockierende Verbindung, die spezifisch an eine Stelle auf einer SS1-Region oder einer SS2-Region einer alpha-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der eine wässrige Lösung einer schwachen organischen Säure und ein C2 bis C6-Alkanglycol umfasst und der einen pH-Wert hat, der von 3.0 bis 5.0 reicht, wobei die Natriumkanal-blockierende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tetrodotoxin, Anhydrotetrodotoxin, Tetrodaminotoxin, Methoxytetrodotoxin, Ethoxytetrodotoxin, Desoxytetrodotoxin, Tetrodonsäure und Saxitoxin.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Alkanglycol Propylenglycol ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Alkanglycol in einer Konzentration von zwischen etwa 50% und etwa 80% vorhanden ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die schwache organische Säure Essigsäure ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die ferner mindestens ein saures Hilfslösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus verdünnter Essigsäure, verdünnter Salzsäure und verdünnter Citronensäure umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die ferner mindestens einen pH- Puffer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Acetatpuffer, einem Citratpuffer, einem Phosphatpuffer und einem Boratpuffer, umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die ferner einen Vasokonstriktor, ein Antibiotikum, oder einen steroiden oder einen nicht-steroiden entzündungshemmenden Arzneistoff umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, ferner umfassend ein Konservierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzalkoniumchlorid, Chlorbutanol, Phenylquecksilberacetat und Phenylquecksilbernitrat.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ferner umfassend einen Tonizitäts-Vermittler ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumchlorid, Mannit und Glycerin.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, ferner umfassend einen Penetrationsverstärker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycol, Ölsäure und einem Alkylamin.