-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Gebiet der Erfindung
-
Die
Erfindung bezieht sich auf ein Biochip-Lesegerät zum Lesen der Fluoreszenz-Wellenlängen, die
sich aus der Anregung von Proben auf einem Biochip mit Anregungslicht
ergeben. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf Verbesserungen,
die durchgeführt
wurden, um die Geschwindigkeit der Messung zu erhöhen, das
Biochip-Lesegerät zu
vereinfachen, Schaden an den Proben zu verringern, und die Intensitätsverteilung
innerhalb eines Lichtspots gleichmäßig zu machen, der gebildet
wird, wenn Anregungslaserlicht mit einer Mikrolinse verdichtet wird.
-
Beschreibung des Standes der Technik
-
Es
gab eine Vorrichtung zum Erfassen und Analysieren von DNA- oder
Proteinsegmenten durch Markieren der Segmente mit einer fluoreszierenden Substanz,
Emittieren von Laserlicht auf sie und Lesen des so erzeugten Fluoreszenzlichtes.
Bei dieser Art von Vorrichtung wird ein Biochip verwendet, auf dem
Proben, wie etwa mit einer fluoreszierenden Substanz markierte DNA-
oder Proteinssegmente, in Arrays getüpfelt sind.
-
1 ist eine schematische Konzeptansicht, die
ein Beispiel eines herkömmlichen
epi-illuminierten Biochip-Lesegeräts zeigt.
Bei diesem Biochip-Lesegerät
wird 1) eine Mehrzahl von DNA-Molekülen (Gene) A, B, C, ... mit
bekannten Sequenzen kombiniert und auf einem Substrat PL angeordnet,
um einen Biochip 6 zu bilden, wie in 1a gezeigt
ist, 2) der Biochip 6 mit einem unbekannten Gen α hybridisiert,
wie in 1b gezeigt ist, und 3) das
Ergebnis der Hybridisierung mit einem derartigen Mechanismus gelesen,
wie in 1c gezeigt ist.
-
In 1c wird von einer Lichtquelle 1 emittiertes
Licht (Laserlicht) durch eine Linse 2 kollimiert, durch
einen dichroitischen Spiegel 4 gelenkt, und dann auf dem
Biochip 6 durch eine Linse 3 verdichtet. Von dem
Biochip 6 zurückkehrendes
Licht wird in paralleles Licht durch eine Linse 3 zurückgeändert, durch
den dichroitischen Spiegel 4 reflektiert, und bildet ein
Bild auf einem Detektor 9 mittels einer Linse 8.
-
In
diesem Fall wird ein Tisch (in der Figur nicht gezeigt), auf dem
der Biochip 6 angebracht ist, in der X/Y-Achsenrichtung durch
ein Antriebsmittel (in der Figur nicht gezeigt) bewegt, sodass die
Oberfläche
des Biochips 6 optisch abgetastet und ein Oberflächenbild
erhalten wird.
-
Ein
derartiges Biochip-Lesegerät,
wie oben beschrieben, wies jedoch Probleme auf. Ein Problem besteht
darin, dass der Tisch mit einem einzelnen, auf den Biochip 6 gestrahlten
Lichtspot abgetastet wird, um das Oberflächenbild des Biochips zu erhalten.
Dieses Verfahren ist ungünstig,
da ein Tischantriebsmechanismus komplex ist und eine lange Zeit benötigt wird,
um das Bild zu erhalten.
-
Ein
weiteres Problem besteht darin, dass die Intensität eines
Lichtstrahls im Biochip-Lesegerät des
Stands der Technik hoch sein muss. Dies ist ebenfalls ungünstig, da
ein hoher Pegel der Lichtintensität bewirkt, das Fluoreszenzfarbstoff
einfacher ausbleicht.
-
Noch
ein weiteres Problem besteht darin, dass ein Lichtspot hoher Intensität dazu neigt,
den Detektor 9 oder einen nachfolgenden A/D-Wandler sättigen kann.
Aus diesem Grund muss der Verstärkungsfaktor
des Detektors oder Wandlers niedriger gemacht werden. Dies ist ebenfalls
ungünstig,
da ein Absenken des Verstärkungsfaktors
die Messung von schwachem Licht verhindert and daher zu einem schmaleren
dynamischen Messbereich führt.
-
Ein
Biochip-Lesegerät
gemäß dem Oberbegriff
von Anspruch 1 ist von der
WO
98 28775 bekannt.
-
Weitere ähnliche
Biochip-Lesegeräte
werden in der
US 4 892 409 und
in Proceedings of the 1999 Three-Dimensional and Multidimensional
Microscopy: IMAGE AQUISITION AND PROZESSING VI; San Jose, CA, USA,
Januar 24 – Januar
25, 1999, Bd. 3605, Seiten 298–307,
Proc SPIE Int Soc Opt Eng; Proceedings of SPIE; Bogdanov Valery
u. a.; „Parallel,
confocal, and complete spectrum imager for fluorescent detection
of high-density microarray" offenbart.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Eine
Aufgabe der Erfindung besteht darin, die oben erwähnten Probleme
durch Bereitstellen eines Biochip-Lesegeräts zu lösen, das die Notwendigkeit
zum Bewegen eines Tisches beseitigt, auf dem Proben angeordnet sind,
wie beim Stand der Technik praktiziert wird, und das praktisch kein
Risiko des Ausbleichens von Fluoreszenzfarbstoff beinhaltet. Somit
ist die Erfindung bestimmt, ein einfach strukturiertes Biochip-Lesegerät bereitzustellen,
das imstande ist, sogar schwaches Licht zu messen.
-
Erfindungsgemäß wird die
obige Aufgabe durch ein Biochip-Lesegerät gemäß Anspruch 1 erreicht. Die
abhängigen
Ansprüche
sind auf weitere vorteilhafte Aspekte der Erfindung gerichtet.
-
Diese
Biochip-Lesegerät-Konfiguration
beseitigt die Notwendigkeit, einen Tisch zu bewegen, und ermöglicht nicht- abgetastetes Lesen
von Bildinformation von einer Mehrzahl von Proben. So lange wie
ein Vergleich mit Bezug die gleiche Lesedauer durchgeführt wird,
nimmt der erforderliche Pegel der Lichtintensität ab, wenn die Anzahl von Strahlen
zunimmt. Somit ist es nicht nötig,
Laserlichtstrahlen hoher Intensität zu emittieren, wie beim Stand
der Technik zu sehen ist, und daher gibt es nahezu kein Risiko des
Ausbleichens von Fluoreszenzfarbstoff. Folglich es ist möglich, ein
Biochip-Lesegerät zu verwirklichen,
das imstande ist, sogar schwaches Licht zu messen.
-
Mit
der Erfindung ist es bei der oben erwähnten Biochip-Lesegerät-Konfiguration
für einen
auf eine beliebigen der Mehrzahl von Proben emittierten Lichtstrahl
ebenfalls möglich,
ein Bild an einer Position auf der optischen Achse zu bilden, die
von einer Position auf der Oberfläche der Probe unterschiedlich
ist. Als Ergebnis wird ein Lichtspot auf dem Biochip eine fast gleichmäßige Intensitätsverteilung über seine
Gesamtheit aufweisen, und die Verteilung von Anregungslicht-Intensität wird die
Probe nicht länger beeinflussen.
-
Es
sei bemerkt, dass, wenn ein Biochip an einer Position auf der optischen
Achse über
den Brennpunkt einer Objektivlinse hinaus angebracht ist, der Arbeitsabstand
zunimmt und sich daher der Wirkungsgrad von derartigen Arbeiten,
wie Montage oder Entfernen des Biochips, verbessert.
-
Mit
der Erfindung ist es außerdem
möglich, ein
Fluoreszenzbild der oben erwähnten
Probe an einer Position auf der optischen Achse zu bilden, die von
einer Position auf der Oberfläche
eines Detektors unterschiedlich ist. Als Ergebnis ist es möglich, den Bias
in der Intensität
in dem Detektor oder einem A/D-Wandler zu verringern und somit den
dynamischen Bereich der Messung zu erweitern.
-
Mit
der Erfindung kann der oben erwähnte emittierte
Lichtstrahl dazu gebracht werden, schräg auf die Probe einzufallen,
sodass das Fluoreszenzbild von der Probe und das Bild des Anregungslichts voneinander
getrennt werden. Als Ergebnis kann Hintergrundrauschen infolge des
Anregungslichts entfernt werden.
-
Mit
der Erfindung können
das Fluoreszenzbild und das Bild des Anregungslichts von der Probe an
Positionen auf dem Detektor gebildet werden, die voneinander entfernt
sind. Als Ergebnis es ist möglich,
das Reflexionsbild des Anregungslichts während des Bildverarbeitungsstadiums
ohne Weiteres zu entfernen.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 ist eine schematische Ansicht, die ein Beispiel
eines Biochip-Lesegeräts
des Stands der Technik zeigt.
-
2 ist
eine schematische Ansicht, die ein Biochip-Lesegerät gemäß der vorliegenden Offenbarung
zeigt.
-
3 ist
eine schematische Ansicht, die einen Vergleich in der Größe zwischen
den Spots des Bildes und Proben zeigt.
-
4 ist
eine schematische Ansicht, die das Biochip-Lesegerät gemäß der vorliegenden Offenbarung
zeigt.
-
5 ist
eine schematische Ansicht, die einen Vergleich in der Größe zwischen
den Brennspots und Proben zeigt.
-
6 ist
eine graphische Darstellung, die einen Vergleich in der Intensitätsverteilung
zwischen den Spots von fokussierten und defokussierten Strahlen
zeigt.
-
7 ist
eine schematische Ansicht, die zeigt, wie ein Biochip in einem Biochip-Lesegerät positioniert
werden kann.
-
8 ist eine schematische Ansicht, die den Fall
darstellt, wenn ein auf einen Biochip einfallender Lichtstrahl geneigt
ist.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Bevorzugte
Ausführungsformen
werden nun ausführlich
mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben. 2 ist
eine schematische Ansicht, die das Biochip-Lesegerät gemäß der vorliegenden
Offenbarung zeigt. In 2 werden Lichtstrahlen von einer
Lichtquelle 1 durch eine Linse 2 gebündelt bzw.
kollimiert und durch die Mikrolinsen ML eines Mikrolinsenarrays
MA verdichtet, das mit dem gleichen Beabstandungsintervall wie der
Abstand P von Proben auf einem Biochip 6 angeordnet ist.
Dann werden die Strahlen durch eine Linse 3 kollimiert,
durch einen dichroitischen Spiegel 4 reflektiert und bilden
Bilder auf dem Biochip 6 mittels einer Objektivlinse 5.
-
Jeweilige
Spots auf dem Biochip 6 werden durch die darauf verdichteten
Strahlen angeregt, wodurch die Spots veranlasst werden, Fluoreszenzlicht zu
emittieren. Das Fluoreszenzlicht läuft durch die Objektivlinse 5,
den dichroitischen Spiegel 4 und ein Filter 7 in
dieser Folge und bildet ein Bild auf dem Detektor 9 mittels
einer Linse 8. Folglich es ist möglich, das Oberflächenbild
von Proben zu erhalten, ohne ein optisches Abtasten durchführen zu
müssen.
-
Es
sei bemerkt, dass die Größe A von
Bildspots, die durch das Mikrolinsenarray MA gebildet werden, ausgestaltet
ist, um grundsätzlich
die gleiche wie die Größen S1,
S2, ... von Proben zu sein, wie in 3 gezeigt
ist.
-
4 ist
eine schematische Ansicht, die das Biochip-Lesegerät gemäß der vorliegenden Offenbarung
zeigt. Es sei bemerkt, dass im Fall des Biochip-Lesegeräts von 2 Spots auf
dem Biochip unter der Intensitätsverteilung
von Lichtspots angeregt werden, die durch Linse 5 verdichtet
werden. Daher wird Fluoreszenzlicht auf eine ungleichmäßige Art
und Weise in jedem Spot des Biochips erzeugt. Als Ergebnis ist das
Anregungsausmaß bzw.
-Magnitude in dem mittleren Bereich des Spots hoch, wohingegen die
Magnitude in dem peripheren Bereich niedrig ist. Somit beeinflusst
die Intensitätsverteilung die
Intensität
der Fluoreszenz selbst. Mit anderen Worten tritt Fluoreszenz hoher
Intensität
in dem mittleren Bereich auf, wohingegen Fluoreszenz niedriger Intensität nur in
dem peripheren Bereich auftritt. Außerdem bleicht Fluoreszenzfarbstoff
einfacher in dem mittleren Bereich als in dem peripheren Bereich
aus.
-
Das
erfindungsgemäße Biochip-Lesegerät von 4 ist
das Ergebnis des Lösens
derartiger Probleme, wie oben angemerkt ist. Obwohl die jeweiligen
Elemente von 4 mit denen von 2 identisch
sind, unterscheidet sich das Biochip-Lesegerät von 4 von dem
von 2 darin, dass emittiertes Licht an einer Position
auf der optischen Achse fokussiert wird, die von einer Position
auf der Oberfläche
des Biochips 6 unterschiedlich ist.
-
In 4 werden
Lichtstrahlen von der Lichtquelle 1 durch eine Linse 2 kollimiert
und durch ein Mikrolinsenarray MA verdichtet, das mit dem gleichen
Beabstandungsintervall wie der Abstand P von Proben auf einem Biochip 6 angeordnet
ist. Der Betriebsprozess bis zu diesem Punkt ist der gleiche wie der,
der in der Ausführungsform
von 2 ersichtlich ist.
-
Die
Strahlen werden dann durch einen dichroitischen Spiegel 4 reflektiert
und an einer Position auf der optischen Achse (durch gestrichelte
Linien in 4 angegeben), die von irgendeiner
Position auf der Oberfläche
des Biochips 6 unterschiedlich ist, durch die Objektivlinse 5 fokussiert.
-
Mit
anderen Worten werden die Strahlen in einem unfokussierten Zustand
(defokussiert) auf dem Biochip 6 platziert.
-
Folglich
sind die Brennpunkte A von Strahlen, die auf die Proben emittiert
werden, größer als die
Größen S1,
S2, S3 und S4 der Proben, wie in 5 gezeigt
ist.
-
6 ist
eine graphische Darstellung, die einen Vergleich in der Intensitätsverteilung
zwischen den Spots von fokussierten und defokussierten Strahlen
zeigt, die auf eine Probe emittiert wurden. Wie ebenfalls von dieser
Figur offensichtlich ist, weisen Punkte außerhalb des Fokus A eine fast
gleichmäßige Intensitätsverteilung
innerhalb der Größe -S1,
-S2,
-S3 und -S4 Spots auf dem Biochip auf.
-
Jeder
Spot auf dem Biochip wird durch diesen defokussierten Laserlichtstrahl
angeregt und emittiert Fluoreszenzlicht. Dieses Fluoreszenzlicht läuft durch
die Objektivlinse 5, den dichroitischen Spiegel 4 und
ein Filter 7 und bildet ein Bild auf dem Detektor 9 mittels
einer Linse 8. In diesem Fall ist die Position der abbildenden Linse 8 voreingestellt,
sodass sowohl die abbildende Oberfläche des Detektors 9 als
auch die Oberfläche
des Biochips 6 die gleiche Brennweite aufweisen.
-
Wie
oben in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Offenbarung beschrieben ist, werden Punkte auf
dem Biochip in ihrer Gesamtheit unter einer fast gleichmäßigen Verteilung
der Lichtintensität
angeregt. Folglich es ist möglich,
ohne weiteres ein Fluoreszenzbild zu erhalten, das nahezu frei von
Einflüssen
der Intensitätsverteilung
des Anregungslichts ist.
-
In 4 ist
der Biochip an einer Position auf dieser Seite des Brennpunkts der
Objektivlinse 5 angebracht. Alternativ kann der Biochip
an einer Position auf der fernen Seite des Brennpunkts angebracht werden,
wie in 7 gezeigt ist. Dieses Montageverfahren ist vorteilhaft,
da ein Arbeitsabstand d zunimmt, wodurch Arbeit, wie die Montage
oder das Entfernen des Biochips, erleichtert wird.
-
Bei
dem oben erwähnten
Montageverfahren ist es vorzuziehen, dass ein Bild von Punkten auf dem
Biochip auf dem Detektor 9 auf eine Ausser-Fokus-Art gebildet
wird. Diese Strategie macht es möglich,
den Bias in der Intensität
in dem Detektor (z. B. CCD) oder einem nachfolgenden A/D-Wandler
zu verringern und somit den dynamischen Bereich der Messung zu erweitern.
-
Es
kann ebenfalls möglich
sein, Strahlen des auf den Biochip 6 einfallenden Anregungslichts
zu neigen, wie in 8a gezeigt ist.
Als Ergebnis kann das Anregungslicht seinen ursprünglichen
optischen Pfad nicht zurückgehen,
und somit kann Hintergrundrauschen infolge von Anregungslicht entfernt werden.
Es ist insbesondere vorteilhaft, ein Fluoreszenzbild und das Reflexionsbild
des Anregungslichts auf eine solche Art und Weise zu bilden, dass
die Bilder auf dem Detektor 9 nicht miteinander überlappen, wie
in 8b gezeigt ist, weil Hintergrundrauschen ohne
weiteres während
der späteren
Bildverarbeitung entfernt werden kann.
-
Sogar
wenn das einfallende Licht geneigt ist, wie in 8 gezeigt
ist, wird Fluoreszenzlicht über
einen Bereich von 360° emittiert.
Demgemäß wird Anregungslicht
ohne irgendeinen Verlust durch die Objektivlinse verdichtet, um
ein Bild auf dem Detektor 9 zu bilden.
-
Es
ist ebenfalls möglich,
den Biochip 6 selbst mit einem Winkel zu der Einfallsachse
zu neigen, statt das einfallende Licht zu neigen, während die
optische Achse des einfallenden Lichts vertikal gehalten wird.
-
Bei
den oben beschriebenen Ausführungsformen
wird lediglich der Fall von kreisförmigen Proben angeführt, obwohl die
Proben ebenfalls rechteckig oder linienförmig sein können.
-
Wie
hier zuvor beschrieben wurde, weist das System der vorliegenden
Offenbarung die folgenden vorteilhaften Wirkungen auf:
- 1) Es ist möglich,
Bildinformation von einer Mehrzahl von Proben zu lesen, ohne den
Tisch bewegen zu müssen,
wie es beim Stand der Technik praktiziert wird, um die Proben abzutasten.
Folglich kann die Geschwindigkeit der Messung ohne Weiteres erhöht werden.
-
Außerdem nimmt,
solange wie ein Vergleich mit Bezug auf die gleiche Lesedauer durchgeführt wird,
der erforderliche Pegel der Lichtintensität ab, wenn die Anzahl von Strahlen
zunimmt. Somit gibt es keine Notwendigkeit, Laserlichtstrahlen hoher
Intensität
zu emittieren, wie beim Stand der Technik zu sehen ist. Dies bedeutet,
dass es nahezu kein Risiko des Ausbleichens von Fluoreszenzfarbstoff
gibt. Folglich ist es möglich,
ein einfach strukturiertes Biochip-Lesegerät bereitzustellen, das imstande
ist, sogar schwaches Licht zu messen.
- 2) Es
ist für
einen auf eine Mehrzahl von Proben gestrahlten Lichtstrahl möglich, ein
Bild an einer Position auf der optischen Achse zu bilden, die von
einer Position auf der Oberfläche
der Probe unterschiedlich ist. Als Ergebnis wird ein Lichtspot auf
dem Biochip eine fast gleichmäßige Intensitätsverteilung über seine
Gesamtheit aufweisen, und die Verteilung von Anregungslicht-Intensität wird nicht
länger
die Probe beeinflussen.
- 3) Es ist für
ein Fluoreszenzbild von einer Probe möglich, sich an einer Position
auf der optischen Achse zu bilden, die von einer Position auf der Oberfläche eines
Detektors unterschiedlich ist. Als Ergebnis ist es möglich, den
Bias in der Intensität
in dem Detektor oder einem nachfolgenden A/D-Wandler zu verringern
und somit den dynamischen Bereich der Messung ohne Umstände zu erweitern.
- 4) Das Biochip-Lesegerät
kann auf eine solche Art und Weise konfiguriert sein, dass ein emittierter Lichtstrahl
dazu gebracht wird, schräg
auf eine Probe einzufallen. Als Ergebnis werden ein Fluoreszenzbild
und das Bild des Anregungslichts von der Probe voneinander getrennt,
und somit kann Hintergrundrauschen infolge des Anregungslichts entfernt
werden.
- 5) Das Biochip-Lesegerät
kann konfiguriert sein, sodass sich ein Fluoreszenzbild und das
Reflexionsbild des Anregungslichts von Proben an Positionen auf
dem Detektor entfernt voneinander bilden. Als Ergebnis ist es möglich, das
Reflexionsbild während
des Bildverarbeitungsstadiums ohne Weiteres zu entfernen.