DE60123833T2 - DESIGN AND USE OF IMPROVED ZINC CHELAT-MAKING PEPTIDES FOR REGULATING MATRIX METAL PROTEINASES - Google Patents

DESIGN AND USE OF IMPROVED ZINC CHELAT-MAKING PEPTIDES FOR REGULATING MATRIX METAL PROTEINASES Download PDF

Info

Publication number
DE60123833T2
DE60123833T2 DE60123833T DE60123833T DE60123833T2 DE 60123833 T2 DE60123833 T2 DE 60123833T2 DE 60123833 T DE60123833 T DE 60123833T DE 60123833 T DE60123833 T DE 60123833T DE 60123833 T2 DE60123833 T2 DE 60123833T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
mmp
peptide
zinc
seq
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60123833T
Other languages
German (de)
Other versions
DE60123833D1 (en
Inventor
Stephen Alpharetta QUIRK
David John Appleton TYRRELL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kimberly Clark Worldwide Inc
Kimberly Clark Corp
Original Assignee
Kimberly Clark Worldwide Inc
Kimberly Clark Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kimberly Clark Worldwide Inc, Kimberly Clark Corp filed Critical Kimberly Clark Worldwide Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE60123833D1 publication Critical patent/DE60123833D1/en
Publication of DE60123833T2 publication Critical patent/DE60123833T2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Abstract

The present invention relates to MMP regulators that comprise new synthetic peptides, that comprise amino acid sequences structurally similar to those of MMP binding region of TIMPs, coupled to zinc chelators. The invention also relates to methods for making these MMP regulators and their use for the treatment of chronic and acute wounds and for the treatment of angiogenesis-associated diseases.

Description

BEREICH DER ERFINDUNGAREA OF INVENTION

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen MMP-Regulator, Zusammensetzungen, die diesen enthalten, und seine Verwendung zum Herstellen von Zusammensetzungen für eine erhöhte Wundheilung, speziell von chronischen Wunden (z.B. diabetischen Wunden, Wunden durch Druckstellen). Mehr speziell bezieht sich die Erfindung auf eine verbesserte Wundheilung durch Regulierung der Matrixmetalloproteinase-Aktivität.The The present invention relates to an MMP regulator, compositions, containing them, and its use for preparing compositions for one increased Wound healing, especially of chronic wounds (e.g., diabetic Wounds, sores caused by bruises). More specifically, that refers Invention for improved wound healing by regulation of Matrix metalloproteinase activity.

HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND THE INVENTION

In normalen Geweben wird die zelluläre Bindegewebssynthese durch extrazellulären Matrixabbau ausgelöst, diese zwei gegensätzlichen Effekte existieren in dynamischem Gleichgewicht. Der Abbau der Matrix wird durch den Einfluss von Matrixmetalloproteinasen (MMPs), die von dort ansässigen Bindegewebszellen und eindringenden inflammatorischen Zellen freigelassen werden, ausgelöst. Normalerweise werden diese Stoffwechselenzyme gezielt auf der Ebene ihrer Synthese und Sekretion reguliert und ebenso auf der Ebene ihrer extrazellulären Aktivität. Extrazelluläre Kontrolle tritt hauptsächlich durch Regulierung mit spezifischen Enzymen, wie beispielsweise TIMPs (Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen) ein, die Komplexe mit MMPs bilden. Diese Komplexe verhindern die Wirkung der MMPs. Kontrolle der MMP-Aktivität auf zellulärer Ebene tritt hauptsächlich durch das Regulieren der MMP-Genexpression und durch das Herabregulieren der Expression der Membran-gebundenen MMPs (MT-MMP) auf, das die ausgeschiedene Pro-Enzym-Form von MMP aktiviert.In normal tissues becomes the cellular Connective tissue synthesis triggered by extracellular matrix degradation, this two opposing ones Effects exist in dynamic equilibrium. The degradation of the matrix will by the influence of matrix metalloproteinases (MMPs) produced by resident there Connective tissue cells and invading inflammatory cells released be triggered. Usually, these metabolic enzymes are targeted at the level regulated their synthesis and secretion and also at the level of their extracellular Activity. Extracellular Control occurs mainly by regulation with specific enzymes, such as TIMPs (Tissue inhibitors of metalloproteinases) containing complexes with Form MMPs. These complexes prevent the action of MMPs. control the MMP activity on cellular Level occurs mainly by regulating MMP gene expression and downregulating the expression of the membrane-bound MMPs (MT-MMP), which the excreted pro-enzyme form of MMP activated.

MMPs sind eine Familie von neutralen Metalloenzymen, die fähig sind extrazelluläre Matrix(EZM)-Makromoleküle abzubauen. Mitglieder dieser Familie, die isoliert und charakterisiert wurden, umfassen interstitielle Fibroblasten-Collagenase, Stromelysin und Typ IV-Collagenase. Andere potentielle Mitglieder umfassen eine wenig charakterisierte 94.000 Dalton Gelatinase und mehrere Gelatinasen mit niedrigem Molekulargewicht und Telopeptidasen ein. Strukturell enthalten MMPs eine Zink(II)-Ionenbindungsstelle an der Aktivierungsstelle des Proteins. Die Bindung von Zink an die Ionenbindungsstelle ist eine Voraussetzung für hydrolytische Aktivität.MMPs are a family of neutral metalloenzymes that are capable extracellular Matrix (ECM) -Makromoleküle dismantle. Members of this family who are isolated and characterized include interstitial fibroblast collagenase, stromelysin and type IV collagenase. Other potential members include one little characterized 94,000 dalton gelatinase and several gelatinases low molecular weight and telopeptidases. Structurally MMPs contain a zinc (II) ion-binding site at the activation site of the protein. The binding of zinc to the ionic binding site is a requirement for hydrolytic activity.

TIMPs sind Glykoproteine, die spezifisch interstitielle Collagenase auf einer stöchiometrischen Basis von 1:1 regulieren. Das heißt, TIMPs bilden sehr spezifische regulatorische Komplexe mit MMPs, dabei regulieren sie nur eine spezifische Unterart der MMPs. Kein natürlich vorkommendes TIMP-Molekül reguliert allein alle Arten von MMPs.TIMPs are glycoproteins that specifically target interstitial collagenase a stoichiometric Base from 1: 1. That is, TIMPs are very specific Regulatory complexes with MMPs, they regulate only one specific subtype of MMPs. No naturally occurring TIMP molecule regulated all kinds of MMPs alone.

In chronischen Wunden ist das Verhältnis von MMPs zu TIMPs derart hoch, dass die meisten MMPs unreguliert bleiben. Diese unregulierte MMP-Aktivität ergibt eine beschleunigte Beschädigung der EZM, was zu einer Zerstörung des neu gebildeten Wundbettes führt. Zusätzlich bewirkt die gleichzeitige Erhöhung von Proteinasespiegeln Hydrolisation von TIMP-Molekülen, wodurch das Verhältnis von MMP zu TIMP weiter erhöht wird.In chronic wounds is the relationship from MMPs to TIMPs are so high that most MMPs are unregulated stay. This unregulated MMP activity results in an accelerated damage the ECM, causing destruction leads the newly formed wound bed. additionally causes the simultaneous increase of proteinase levels resulting in hydrolysis of TIMP molecules The relationship from MMP to TIMP further increased becomes.

Viele Individuen leiden an chronischen Wunden. Offene Hautwunden repräsentieren eine Hauptkategorie von derartigen Wunden und umfassen Brandwunden, neuropatische Geschwüre, Wunden durch Druckstellen, Venostasegeschwüre und diabetische Geschwüre. Weltweit haben 8 Mio. Menschen chronische Beingeschwüre und 7 Mio. Menschen haben Wunden durch Druckstellen (Clinica 559, 14–17, 1993. Alleine in den USA beträgt das Vorkommen von Hautgeschwüren 4,5 Mio., einschließlich 2 Mio. Druckschmerzpatienten, 900.000 Venengeschwür-Patienten und 1,6 Mio. Patienten mit diabetischem Geschwür (Med Pro Month, Juni 1992, 91–94). Die in der Behandlung dieser Wunden involvierten Kosten sind erschreckend und erreichen bei durchschnittlich $ 3.000,00 pro Patient über $ 13 Milliarden pro Jahr alleine in den USA.Lots Individuals suffer from chronic wounds. Represent open skin wounds a major category of such wounds and include burns, neuropathic ulcers, Wounds caused by bruises, venostasis ulcers and diabetic ulcers. Worldwide 8 million people have chronic leg ulcers and 7 million people Sores caused by bruises (Clinica 559, 14-17, 1993. Alone in the USA is the occurrence of skin ulcers 4.5 million, including 2 million pressure-pain patients, 900,000 venous ulcer patients and 1.6 million patients with diabetic ulcer (Med Pro Month, June 1992, 91-94). The costs involved in treating these wounds are appalling and averaging $ 3,000 per patient over $ 13 Billions a year in the US alone.

Brandwunden haben eine berichtete Häufigkeit von 7,8 Mio. Fällen pro Jahr weltweit, 0,8 Mio. davon benötigen einen Krankenhausaufenthalt (Clinica 559). In den USA gibt es 2,5 Mio. Brandpatienten pro Jahr, 100.000 davon benötigen einen Krankenhausaufenthalt und 20.000 davon haben Brandwunden, die mehr als 20% der gesamten Körperoberfläche betreffen (MedPro Month, Juni 1992).burns have a reported frequency of 7.8 million cases per year worldwide, 0.8 million of them require hospitalization (Clinica 559). There are 2.5 million burns per year in the US, 100,000 need of it a hospital stay and 20,000 of them have burns, which affect more than 20% of the total body surface area (MedPro Month, June 1992).

Aus der unkontrollierten Beschädigung von Bindegeweben durch MMPs ergeben sich auch viele andere Probleme. Diese Probleme umfassen, z.B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Osteopenien, wie beispielsweise Osteoporose, Periodontitis, Gingivitis, Hornhautepiderm- und Magengeschwürbildung, Tumormetastase, -invasion und -wachstum, neuroinflammatorische Störungen, einschließlich die in, die in Myelinabbau involviert sind, z.B. Multiple Sklerose, und Angiogenese-abhängige Erkrankungen, welche Angiofibrome, Hemangiom, solide Tumore, von Blut übertragene Tumore, Leukämie, Metastase, Telangiektasie, Psoriasis, Sklerodermie, pyogenes Granulom, Herzmuskelangiogenese, Plaque-Neovaskularisation, koronare Collateralis, ischämische Syndrom-Angiogenese, Hornhauterkrankungen, Rubeose, neovaskuläres Glaukom, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, Arthritis, diabetische Neovaskularisation, Makuladegeneration, Wundheilung, Magen- und Zwölffingerdarmgeschwür, Knochenbrüche, Keloide, Vaskulogenese, Blutbildung, Ovulation, Menstruation und Plazentation umfassen.The uncontrolled damage of connective tissues by MMPs also raises many other problems. These problems include, for example, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteopenias such as osteoporosis, periodontitis, gingivitis, corneal epidermal and gastric ulcer, tumors neuronal inflammatory disorders, including those involved in myelin breakdown, eg, multiple sclerosis, and angiogenesis-dependent diseases such as angiofibromas, hemangioma, solid tumors, blood-borne tumors, leukemia, metastasis, telangiectasis, Psoriasis, scleroderma, pyogenic granuloma, cardiac muscle angiogenesis, plaque neovascularization, coronary collateral, ischemic syndrome angiogenesis, corneal disorders, rubeosis, neovascular glaucoma, diabetic retinopathy, retrolental fibroplasia, arthritis, diabetic neovascularization, macular degeneration, wound healing, gastric and duodenal ulcer, fractures, Include keloids, vasculogenesis, hematopoiesis, ovulation, menstruation and placentation.

In Bezug auf die große Anzahl von Erkrankungen, die mit MMP-Aktivität einhergehen, besteht ein Bedarf, die MMP-Aktivität zu kontrollieren. Mehrere Vorgehensweisen sind vorgeschlagen worden, solch eine Regulierung zu bewerkstelligen. Ein Ansatz hat sich auf die katalytische Rolle von Zink in MMPs konzentriert und Zink-chelatbildende Regulatoren entwickelt. Wirksame Regulatoren wurden durch das Einführen von Zink-chelatbildenden Gruppen, wie beispielsweise Peptidhydroxamate und Thiol-enthaltende Peptide, in Substrate hergestellt. Peptidhydroxamate und TIMPs wurden erfolgreich in Tiermodellen eingesetzt, um Krebs und Entzündungen zu behandeln. Während diese Hydroxamate durch das Binden an Zink wirksam an Regulatoren der MMPs sind, sind sie toxisch für Menschen, da sie an alle Zink-enthaltenden Enzyme binden. Da viele biochemische Reaktionen, die im Körper auftreten, Zink erfordern, wirkt sich die Verwendung von den Hydroxamaten schädlich auf diese anderen Funktionen aus und kann zum Tod führen.In Respect to the big one There is a number of diseases associated with MMP activity Demand, the MMP activity to control. Several approaches have been proposed, to bring about such regulation. One approach has been up the catalytic role of zinc concentrated in MMPs and zinc chelating Regulators developed. Effective regulators were introduced by introducing Zinc-chelating Groups such as peptide hydroxamates and thiol-containing ones Peptides, produced in substrates. Peptide hydroxamates and TIMPs were Used successfully in animal models to fight cancer and inflammation to treat. While these hydroxamates bind to regulators by binding to zinc of the MMPs, they are toxic to humans as they are involved in all Bind zinc-containing enzymes. Because many biochemical reactions, in the body When zinc occurs, the use of hydroxamates will be detrimental these other functions and can lead to death.

Andere bekannte Zink-chelatbildende MMP-Regulatoren sind Peptidderivate, die auf natürlich auftretende Aminosäuren basieren und Analoge der Spaltstelle in dem Collagenmolekül sind (Odake et al. (1994) Biophys. Res. Comm. 119, 14426). Manche MMP-Regulatoren haben eine weniger peptidische Struktur und können besser als Pseudopeptide oder Peptidmimetika betrachtet werden. Derartige Verbindungen haben für gewöhnlich eine funktionelle Gruppe, die fähig ist, an das Zink-(II) zu binden, das in der MMP gebunden ist. Bekannte Verbindungen umfassen jene, in welcher die Zink-Bindungsgruppe eine Hydroxamsäure, Carbonsäure, Sulphydryl ist oder mit Sauerstoff angereicherte Phosphorgruppen sind (z.B., Phosphinsäure und Phosphonamidat, einschließlich Aminophosphonsäure).Other known zinc chelating MMP regulators are peptide derivatives, the on natural occurring amino acids and analogs of the cleavage site in the collagen molecule are (Odake et al. (1994) Biophys. Res. Comm. 119, 14426). Some MMP regulators have a less peptidic structure and can do better than pseudopeptides or peptide mimetics. Have such compounds usually one functional group that capable is to bind to the zinc (II) bound in the MMP. Known Compounds include those in which the zinc linking group is a hydroxamic acid, carboxylic acid, sulphydryl or oxygen-enriched phosphorus groups (e.g. Phosphinsäure and phosphonamidate, including Aminophosphonic).

Andere Ansätze umfassen das Regulieren kleiner Moleküle (Levy et al. (1998) J. Med. Chem. 41, 199–223; Wojtowicz-Praga et al. (1997) Invest. New Drugs 15, 61–75; Duivenvoorden, et al. (1997) Invasion und Metas. 17, 312–22) und Regulierung über anti-MMP-Antikörper (Su et al. (1995) Hybridoma. 14, 383–90).Other approaches include the regulation of small molecules (Levy et al. (1998) J. Med. Chem. 41, 199-223; Wojtowicz-Praga et al. (1997) Invest. New Drugs 15, 61-75; Duivenvoorden, et al. (1997) Invasion and Metas. 17, 312-22) and regulation via anti-MMP antibody (Su et al. (1995) Hybridoma. 14, 383-90).

Mehr spezifisch offenbart U.S. Patent Nr. 5,734,014 von Ishima et al. einen Elastaseinhibitor. Elastase, das von Neutrophilen sekretiert wird, bewirkt Gewebeschäden und erzeugt in diesem Prozess einen aktiven Überfluss an Sauerstoff. Elafin, das aus Psoriasepatienten isoliert wurde, besitzt Elastase-inhibierende Aktivität. Jedoch ist dieses natürlich vorkommende Elafin Oxidations-instabil. Ishima entwickelte Elafin-Derivate, die Oxidations-stabil sind, so dass Elastase-Regulierung effizienter sein kann. Das Oxidations-stabile Derivat wird durch eine teilweise Modifizierung der Aminosäuresequenz von natürlichem Elafin erzeugt. Die Modifikation kann entweder durch chemische Synthese oder ortsspezifische Mutagenese („site-directed mutagenesis") durchgeführt werden.More specifically, U.S. Pat. U.S. Patent No. 5,734,014 to Ishima et al. an elastase inhibitor. Elastase secreted by neutrophils will cause tissue damage and creates an active abundance of oxygen in this process. Elafin, which has been isolated from psoriatic patients, has elastase-inhibiting Activity. However, this is natural occurring Elafin oxidation-unstable. Ishima developed elafin derivatives, which are oxidation-stable, making elastase regulation more efficient can be. The oxidation-stable derivative is characterized by a partial Modification of the amino acid sequence of natural Elafin produced. The modification can be done either by chemical synthesis or site-directed mutagenesis.

U.S. Patent Nr. 5,464,822 von Christophers et al. offenbart ein Polypeptid, das inhibitorische Aktivität gegen humane Leukozyten-Elastase besitzt. Die Polypeptide besitzen inhibitorische Aktivität, die für Serinproteasen spezifisch ist. Zum Beispiel besitzen sie inhibitorische Aktivität gegen Proteasen, wie beispielsweise humane Leukozyten-Elastase und Schweine ähnliche Bauchspeicheldrüsenelastase, besitzen aber keine signifikante inhibitorische Aktivität gegen Trypsin. Diese Polypeptide können durch Gentechnik hergestellt werden oder aus psoriatischen Schuppen der menschlichen Haut isoliert werden.U.S. U.S. Patent No. 5,464,822 to Christophers et al. discloses a polypeptide the inhibitory activity against has human leukocyte elastase. The polypeptides have inhibitory Activity, the for Serine proteases is specific. For example, they have inhibitory activity against proteases, such as human leukocyte elastase and Pigs similar Bauchspeicheldrüsenelastase, but have no significant inhibitory activity against Trypsin. These polypeptides can produced by genetic engineering or from psoriatic scales to be isolated from human skin.

U.S. Patent No. 5,698,671 von Stetler-Stevenson et al. offenbart ein Protein, das durch die Gegenwart von spezifischen Cystein-enthaltenden Aminosäuresequenzen definiert ist und aus einem Kontrollmedium („conditioned media") von kultivierten humanen Tumorzellen isoliert wurde, das mit einer hohen Affinität an MMPs und Analoge davon bindet. Der bestimmte Inhibitor wird durch Herstellen von Peptiden und Proteinen, die einen Cysteinrest in demselben Bereich wie die verschiedenen Gewebeinhibitoren der Metalloproteinasen (TIMPs) aufweisen, hergestellt. Die Peptide müssen mindestens zwei Cysteine in angemessenem Abstand aufweisen, um inhibitorische Aktivität aufgrund der Bildung einer Disulfidbrücke sicherzustellen. Zusätzlich veröffentlicht die Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung natürlicher MMP-Inhibitoren durch MMP-Affinitätschromatographie.U.S. Patent No. 5,698,671 to Stetler-Stevenson et al. discloses one Protein that is characterized by the presence of specific cysteine-containing amino acid sequences is defined and cultivated from a "conditioned media" human tumor cells were isolated with a high affinity to MMPs and analogues bind to it. The particular inhibitor is made by manufacturing of peptides and proteins that have a cysteine residue in the same area like the various tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) have been produced. The peptides must have at least two cysteines at a reasonable distance due to inhibitory activity the formation of a disulfide bridge sure. additionally released the invention a method for the purification of natural MMP inhibitors by MMP-affinity chromatography.

WO 99/47550 von Koivunen et al. offenbart Inhibitoren und Herab-Regulatoren von MMP, welche auf einer Ringstruktur basieren, die das Peptidmotif "CXXHWGFXXC" aufweist, worin X eine beliebige Aminosäure ist. Die Ringstruktur wird durch Disulfidbindungen zwischen den Cysteinen erreicht. Die Inhibitoren sind spezifisch für MMP-9 und MMP-2. Ferner offenbart WO 99/47550 die Verwendung der MMP-Inhibitoren und Herab-Regulatoren für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen und Zusammensetzungen für die Forschung sowie für die biochemische Isolierung und Reinigung von MMPs.WO 99/47550 to Koivunen et al. discloses inhibitors and down-regulators of MMPs which occur on based on a ring structure having the peptide motif "CXXHWGFXXC", wherein X is any amino acid. The ring structure is achieved by disulfide bonds between the cysteines. The inhibitors are specific for MMP-9 and MMP-2. Further, WO 99/47550 discloses the use of the MMP inhibitors and down regulators for the preparation of pharmaceutical compositions and compositions for research as well as for the biochemical isolation and purification of MMPs.

Trotz dieser unterschiedlichen Ansätze wird im jetzigen Stand der Technik die MMP-Aktivität nicht selektiv reguliert. Herkömmlicherweise wurden Hochaffinitäts-Regulatoren eingesetzt, die zu vollständiger MMP-Hemmung führten. Jedoch ist das Ausschalten jedweder MMP-Aktivität sogar zerstörerisch für den Heilungsprozess, da eine gewisse MMP-Aktivität für die Wiederherstellung von Gewebe erforderlich ist. Zum Beispiel ist eine wirksame Hemmung, die auf die Zink(II)-Stelle zielt, toxisch für Menschen, da sie das Binden an alle Zink-enthaltenden Enzyme ausschaltet. Daher ist es notwendig, eine selektive Regulierung bereitzustellen.In spite of of these different approaches In the current state of the art, MMP activity is not selectively regulated. traditionally, became high affinity regulators used, leading to complete MMP inhibition led. However, turning off any MMP activity is even destructive for the Healing process, as a certain MMP activity for the recovery of Tissue is required. For example, an effective inhibition which targets the zinc (II) site, toxic to humans as it binds switches off all zinc-containing enzymes. Therefore, it is necessary to provide selective regulation.

Folglich besteht ein Bedarf in der Technik für eine verbesserte Regulierung der MMPs, um die Heilung von chronischen und akuten Wunden zu fördern.consequently There is a need in the art for improved regulation MMPs to promote the healing of chronic and acute wounds.

Ebenso besteht ein Bedarf in der Technik für einen Inhibitor, der eine relativ gute, selektive Affinität aufweist.As well There is a need in the art for an inhibitor that has a relatively good, selective affinity having.

Weiterhin besteht ein Bedarf in der Technik für MMP-Inhibitoren, die nicht toxisch für das Individuum sind, an das sie verabreicht werden.Farther There is a need in the art for MMP inhibitors that are not toxic to the individual to whom they are administered.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY THE INVENTION

In einer Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung durch das Verwenden eines neuartigen Ansatzes zur Handhabung der Proteinase an Wundstellen eine neue Klasse von MMP-Regulatoren bereit. Diese Regulatoren umfassen einen Zink-Chelator, der kovalent an ein Peptid gebunden ist, das mit einer Region eines TIMP-Proteins korrespondiert, die direkt mit einem MMP-Molekül in der Nähe des katalytischen Zinkmoleküls interagiert, um die Wundstellenproteinasen zu binden. Die Bindungsspezifität des Peptids bringt den Zink-Chelator in einer derartigen Art und Weise in eine molekulare Nähe des MMP-gebundenen Zinks, um das Binden zuzulassen. Zusätzlich zu dieser Affinität wird die genaue Sequenz des Peptids das Zielen auf spezifische MMPs zulassen. Diese chemische Eigenschaft reguliert den Grad der MMP-Aktivität auf eine Art und Weise, die Heilung begünstigt. Dadurch wird ein MMP-Regulator bereitgestellt, der, anders als bekannte MMP-Regulatoren, mit hoher Affinität selektiv die MMP-Aktivität regulieren kann.In In one aspect, the present invention provides by using a novel approach to handling the proteinase at wound sites a new class of MMP regulators ready. These regulators include a zinc chelator that is covalent is attached to a peptide linked to a region of a TIMP protein which interacts directly with an MMP molecule in the vicinity of the catalytic zinc molecule, to bind the wound site proteinases. The binding specificity of the peptide brings the zinc chelator in such a way in one molecular proximity of the MMP-bound Zinc to allow for binding. In addition to this affinity, the accurate sequence of the peptide allow targeting to specific MMPs. This chemical property regulates the level of MMP activity to one Way that favors healing. This provides an MMP regulator which, unlike known ones MMP regulators, with high affinity, selectively regulate MMP activity can.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen der neuen Klasse der MMP-Regulatoren bereit. Das Verfahren umfasst das Binden eines Zink-Chelators an synthetische Peptide. Die ausgewählten Peptidsequenzen waren der Teil des TIMPs, die die genaueste Annäherung an das MMP in der Nähe des katalytischen Zink erzielten. Die Sequenz ist ein herkömmliches strukturelles Merkmal der Bindungsstelle.In In another aspect, the present invention provides a method ready to manufacture the new class of MMP regulators. The Method involves binding a zinc chelator to synthetic peptides. The selected ones Peptide sequences were the part of the TIMPs that provided the most accurate approach the MMP nearby of the catalytic zinc. The sequence is a conventional one structural feature of the binding site.

In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des neuartigen MMP-Regulators der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung chronischer und/oder akuter Hautwunden und anderer Erkrankungen, in welchen MMPs eine Rolle spielen, bereit. Die neuen MMP-Regulatoren der vorliegenden Erfindung sind dadurch vorteilhaft gegenüber konventionellen Inhibitoren, da sie sowohl eine verbesserte Selektivität als auch eine verbesserte Affinität bereitstellen. Zusätzlich binden die MMP-Regulatoren der vorliegenden Erfindung selektiv an MMPs, ohne dem zu behandelnden Individuum einen potentiellen Schaden zuzufügen. Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die die neuartigen MMP-Regulatoren der Erfindung umfassen, welche einen Zink-Chelator enthalten, der an ein TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist. Diese Zusammensetzungen binden MMP besonders wirksam, ohne andere Zink-abhängige biochemische Aktivitäten zu beeinträchtigen. Letztendlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der neuartigen MMP-Regulatoren der Erfindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Kontrollieren von Erkrankungen, die durch unkontrollierte MMP-Aktivität verursacht werden, bereit, worin die neuartigen MMP-Regulatoren ohne die Verwendung von toxischen Inhibitoren an einer zu behandelnden Stelle verabreicht werden.In In yet another aspect, the present invention provides Use of the novel MMP regulator of the invention for production a pharmaceutical composition for the treatment of chronic and / or acute skin wounds and other diseases in which MMPs play a role, ready. The new MMP regulators of the present Invention are therefore advantageous over conventional inhibitors, as it has both improved selectivity and improved affinity provide. additionally selectively bind the MMP regulators of the present invention MMPs, without the individual to be treated a potential damage inflict. The present invention also provides pharmaceutical compositions ready comprising the novel MMP regulators of the invention, which contain a zinc chelator attached to a TIMP-derived Peptide is bound. These compositions bind MMP especially effective, without other zinc-dependent biochemical activities to impair. At long last The present invention provides the use of the novel MMP regulators the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for controlling of disorders caused by uncontrolled MMP activity be prepared in which the novel MMP regulators without the use of toxic inhibitors administered at a site to be treated become.

Daher ist es eine Aufgabe der Erfindung neue MMP-Regulatoren bereitzustellen.Therefore It is an object of the invention to provide new MMP regulators.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, MMP-Regulatoren bereitzustellen, die einen Zink-Chelator umfassen, der kovalent an synthetische Peptide gebunden ist, die neuartige Aminosäuresequenzen enthalten, die an die TIMP-Bindungsstelle der MMP binden.Another object of the invention is to provide MMP regulators containing a zinc chelator which is covalently linked to synthetic peptides containing novel amino acid sequences that bind to the TIMP binding site of MMPs.

Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, neuartige synthetische Peptide zur Verwendung in der Herstellung der MMP-Regulatoren der Erfindung bereitzustellen.Yet Another object of the invention is novel synthetic Peptides for use in the production of MMP regulators To provide invention.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuartigen Zink-Chelator für die Verwendung in der Herstellung der MMP-Regulatoren der Erfindung bereitzustellen.It It is another object of the present invention to provide a novel Zinc chelator for the use in the preparation of the MMP regulators of the invention provide.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, synthetische Peptide, die die SEQ ID Nrn. 1, 2 und 3 aufweisen, bereitzustellen.It It is an object of the invention to provide synthetic peptides comprising SEQ ID Nos. 1, 2 and 3 provide.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, MMP-Regulatoren bereitzustellen, die Peptide umfassen, die die SEQ ID Nrn. 1, 2 oder 3 und einen Zink-Chelator aufweisen.A Another object of the present invention is MMP regulators comprising peptides having SEQ ID Nos. 1, 2 or 3 and a zinc chelator.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung MMP-Regulatoren bereitzustellen, die Peptide enthalten, die mindestens einen Cysteinrest enthalten.It Another object of the present invention is MMP regulators provide peptides containing at least one cysteine residue contain.

Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Verwendung der MMP-Regulatoren der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von chronischen und akuten Wunden bereitzustellen.Yet Another object of the invention is the use of the MMP regulators the invention for the preparation of a pharmaceutical composition to provide for the treatment of chronic and acute wounds.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und einen MMP-Regulator umfasst, worin der MMP-Regulator einen Zink-Chelator enthält, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist.It Another object of the present invention is a pharmaceutical To provide a composition which is a pharmaceutically acceptable carrier and an MMP regulator, wherein the MMP regulator comprises a zinc chelator contains which is covalently bound to a TIMP-derived peptide.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENSHORT DESCRIPTION THE DRAWINGS

1 stellt einen zeitlichen Reaktionsablauf der MMP-9 Hydrolyse von mit Fluoreszein versehenem Collagen in der Gegenwart von ansteigenden Mengen der Zink-chelatbildenden Peptiden dar. Die Kurven (von oben nach unten) zeigen MMP-9:ChePep-1 in molaren Stöchiometrien von 1:0, 1:0,25, 1:0,5 und 1:1. ChePep-1 ist zusammengesetzt aus PSDE, gebunden mit dem Peptid, das die SEQ ID Nr. 4 aufweist. Der Graph zeigt die Fluoreszenz als eine Funktion der Zeit in dem fortlaufenden Assay. 1 Figure 10 depicts a temporal course of MMP-9 hydrolysis of fluoresceinated collagen in the presence of increasing amounts of the zinc chelating peptides. The curves (top to bottom) show MMP-9: ChePep-1 in 1: 0 molar stoichiometries , 1: 0.25, 1: 0.5 and 1: 1. ChePep-1 is composed of PSDE bound with the peptide having SEQ ID NO: 4. The graph shows the fluorescence as a function of time in the ongoing assay.

2 stellt ChePep-2 Regulierung von MMP-9 mittels FRET Assay dar. ChePep-2 ist zusammengesetzt aus IDA, gekoppelt mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr. 5 aufweist. Dieses Gemisch wurde zu dem FRET Substratpeptid in Reaktionspuffer hinzugefügt. Fluoreszenzmessungen wurden zu den angegebenen Zeiten durchgeführt. Die Kurven zeigen ChePep-2:MMP-9 in molaren Stöchiometrien von 0:1 (geschlossener Kreis), 0,1:1 (offener Kreis), 0,2:1 (geschlossenes Quadrat), 0,3:1 (offenes Quadrat). 2 ChePep-2 represents regulation of MMP-9 by FRET assay. ChePep-2 is composed of IDA coupled to a peptide having SEQ ID NO: 5. This mixture was added to the FRET substrate peptide in reaction buffer. Fluorescence measurements were taken at the times indicated. The curves show ChePep-2: MMP-9 in molar stoichiometries of 0: 1 (closed circle), 0.1: 1 (open circle), 0.2: 1 (closed square), 0.3: 1 (open square ).

3 zeigt ChePep-3 (geschlossenes Quadrat) und ChePep-4 (offener Kreis) Regulierung von MMP-9 mittels FRET Assay. ChePep-3 wird hergestellt durch Koppeln von PSDE mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr. 6 aufweist, und ChePep-4 wird hergestellt durch Koppeln von IDA mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr. 6 aufweist. Die ChePeps wurden mit MMP-9 für 10 Minuten inkubiert, um das Binden zu bewirken. Dieses Gemisch wurde zu dem FRET Substratpeptid in Reaktionspuffer hinzugefügt. Fluoreszenzmessungen wurden zu den angegebenen Zeiten durchgeführt. MMP-9, nur als Kontrolle, ist gezeigt als Referenz (geschlossener Kreis). Die molare Stöchiometrie von ChePep:MMP-9 ist 0,25:1. 3 shows ChePep-3 (closed square) and ChePep-4 (open circle) regulation of MMP-9 by FRET assay. ChePep-3 is made by coupling PSDE with a peptide having SEQ ID NO: 6, and ChePep-4 is prepared by coupling IDA with a peptide having SEQ ID NO: 6. The ChePeps were incubated with MMP-9 for 10 minutes to effect binding. This mixture was added to the FRET substrate peptide in reaction buffer. Fluorescence measurements were taken at the times indicated. MMP-9, for control only, is shown as a reference (closed circle). The molar stoichiometry of ChePep: MMP-9 is 0.25: 1.

4 erläutert ChePep-5 Regulierung von MMP-9 mittels FRET Assay. ChePep-5 ist zusammengesetzt aus einem AFTA, gekoppelt mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr: 7 aufweist. ChePep-5 wurde mit MMP-9 für 10 Minuten inkubiert, um das Binden zu bewirken. Dieses Gemisch wurde zu dem FRET Substratpeptid in Reaktionspuffer hinzugefügt. Fluoreszenzmessungen wurden zu den angegebenen Zeiten durchgeführt. Die Kurven repräsentieren ChePep-5:MMP-9 in molaren Stöchiometrien von 0:1 (geschlossene Kreise), 0,1:1 (offene Kreise), 0,2:1 (geschlossene Quadrate), 0,3:1 (offene Quadrate). Anregung war bei 365 nm und Emission war unveränderlich bei 450 nm. 4 discusses ChePep-5 regulation of MMP-9 by FRET assay. ChePep-5 is composed of an AFTA coupled to a peptide having SEQ ID NO: 7. ChePep-5 was incubated with MMP-9 for 10 minutes to effect the binding. This mixture was added to the FRET substrate peptide in reaction buffer. Fluorescence measurements were taken at the times indicated. The curves represent ChePep-5: MMP-9 in 0: 1 molar stoichiometries (closed circles), 0.1: 1 (open circles), 0.2: 1 (closed squares), 0.3: 1 (open squares ). Excitation was at 365 nm and emission was invariable at 450 nm.

5 zeigt ChePep-6 Regulierung von MMP-9 mittels FRET Assay. ChePep-6 ist hergestellt durch Koppeln von AFTA mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr. 8 aufweist. ChePep-6 wurde mit MMP-9 für 10 Minuten inkubiert, um das Binden zu bewirken. Dieses Gemisch wurde zu dem FRET Substratpeptid in Reaktionspuffer hinzugefügt. Fluoreszenzmessungen (Anregungsmessungen 365 nm, Emission 450 nm) wurden zu den angegebenen Zeiten ausgeführt. Die Kurven zeigen ChePep-6:MMP-9 in molaren Stöchiometrien von 0:1 (geschlossene Kreise), 0,1:1 (offene Krise). 5 shows ChePep-6 regulation of MMP-9 by FRET assay. ChePep-6 is made by coupling AFTA to a peptide having SEQ ID NO: 8. ChePep-6 was incubated with MMP-9 for 10 minutes to effect binding. This mixture was added to the FRET substrate peptide in reaction buffer. Fluorescence measurements (excitation measurements 365 nm, emission 450 nm) were added to the specified times. The curves show ChePep-6: MMP-9 in 0: 1 molar stoichiometries (closed circles), 0.1: 1 (open crisis).

6 stellt eine SPR Analyse von ChePep-6 Bindung an immobilisiertes MMP-9, das auf der Oberfläche eines BiaCore CM-5 Chips gelagert ist, dar. Das Sensorgramm zeigt das relative SPR Signal als eine Funktion der Zeit für eine 400 Sekunden dauernde Assoziationsphase und eine 800 Sekunden dauernde Dissoziationsphase. Die Durchflussrate wurde bei einer Rate von 20 μl pro Minute gehalten. 6 Figure 12 depicts an SPR analysis of ChePep-6 binding to immobilized MMP-9 stored on the surface of a BiaCore CM-5 chip. The sensorgram shows the relative SPR signal as a function of time for a 400 second association phase and a 800 seconds dissociation phase. The flow rate was maintained at a rate of 20 μl per minute.

7 zeigt einen Assay der Lebensfähigkeit der Verbindungen. Die grafische Darstellung zeigt die prozentuale Lebensfähigkeit der in dieser Studie eingesetzten Peptide relativ zu einer PBS Kontrolle. Balken in Messabweichungen sind +/–SD. Proben (von links nach rechts) sind wie folgt: PBS Positivkontrolle, 1% Triton X-100 Negativkontrolle. ChePep-1, ChePep-2, ChePep-3, ChePep-4, ChePep-5 und ChePep-6. 7 shows an assay of the viability of the compounds. The graph shows the percentage viability of the peptides used in this study relative to a PBS control. Bars in deviations are +/- SD. Samples (from left to right) are as follows: PBS positive control, 1% Triton X-100 negative control. ChePep-1, ChePep-2, ChePep-3, ChePep-4, ChePep-5 and ChePep-6.

8 ist ein Reaktionsschema der Modifikation von EDTA zu PSDE, um das Koppeln des EDTA-Chelatbildners an die Peptide der Erfindung zu gewähren. 8th Figure 10 is a reaction scheme of the modification of EDTA to PSDE to allow coupling of the EDTA chelating agent to the peptides of the invention.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMENDETAILED DESCRIPTION THE PREFERRED EMBODIMENTS

MMPs enthalten ein im aktiven Zentrum lokalisiertes Zinkmolekül. Dieses Zinkmolekül nimmt eng an der Chemie des degradierenden Collagens teil. Als ein Ergebnis, falls das Zink blockiert oder entfernt wird, kann die enzymatische Aktivität der MMP gehemmt werden. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen (hierin beschrieben als ChePeps) für die Regulierung von MMP-Aktivität dar. Diese Zusammensetzungen umfassen einen Zink-Chelatbildner, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist. Der Zink-Chelatbildner kann eine beliebige Verbindung sein die Zink bindet, egal ob das Molekül ein echter Chelatbildner ist oder nicht. Das von TIMP-abgeleitete Peptid entspricht einer Region des TIMP-Proteins, die direkt mit dem MMP-Molekül in der Nähe des katalytischen Zinkmoleküls interagiert. Die Bindungsspezifität dieses Pep tids hilft den Zink-Chelatbildner in einer Art und Weise in eine molekulare Nähe mit dem MMP-gebundenen Zink zu bringen, um das Binden des Zinks der MMP zu gewähren. Zusätzlich zu dieser Affinität wird die genaue Peptidsequenz das Zielen („targeting") auf spezifische MMPs gewähren. Diese Chemie reguliert den Grad der MMP-Aktivität bis zu einem Punkt, der das Heilen fördert.MMPs contain a zinc molecule located in the active center. This zinc molecule participates closely in the chemistry of degrading collage. As a Result, if the zinc is blocked or removed, the enzymatic activity the MMP be inhibited. The present invention provides compositions (described herein as ChePeps) for the regulation of MMP activity Compositions include a zinc chelator that is covalent is linked to a TIMP-derived peptide. The zinc chelating agent can be any compound that binds zinc, whether that molecule a true chelator or not. That from TIMP-derived Peptide corresponds to a region of the TIMP protein that interacts directly with the MMP molecule near of the catalytic zinc molecule interacts. The binding specificity of this peptide helps the Zinc chelating agent in a molecular proximity with the species MMP-bound zinc bring about the binding of zinc to the MMP to grant. additionally to this affinity For example, the exact peptide sequence will allow targeting to specific MMPs Chemistry regulates the level of MMP activity to a point that the Promotes healing.

Vorzugsweise wird moderne molekulare Modellmethodik eingesetzt, um die neuartigen Peptide der vorliegenden Erfindung zu entwickeln, die an die Zink(II)-Stelle der MMPs binden können und daher ein umfassendes Spektrum der MMPs regulieren. Eine Analyse der dreidimensionalen Struktur der verschiedenen MMPs und TIMPs und die chemische Beschaffenheit und eine Identifizierung der konservierten und abweichenden Aminosäuren in der MMP-TIMP Kontaktstelle wird bevorzugt mittels molekularer Modelle unter Einsatz von zwei Visualisierungsprogrammen, Swiss PDB Viewer (Guex und Peitsch, 1997) und Rasmol (Sayle und Milner-White, 1995), vollzogen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben durch Visualisierung der TIMP~MMP Komplexe herausgefunden, dass die TIMP-Moleküle einen erheblichen Kontakt mit dem Bereich herstellen, die die MMP-aktive Stelle umgibt.Preferably modern molecular model methodology is used to develop the novel To develop peptides of the present invention which bind to the zinc (II) site can bind the MMPs and therefore regulate a wide range of MMPs. An analysis the three-dimensional structure of the different MMPs and TIMPs and the chemical nature and identification of the conserved and different amino acids in the MMP-TIMP contact site is preferred by means of molecular Models using two visualization programs, Swiss PDB Viewer (Guex and Peitsch, 1997) and Rasmol (Sayle and Milner-White, 1995). The inventors of the present invention have by visualizing the TIMP ~ MMP complexes found out that the TIMP molecules make a significant contact with the area that the MMP active Place surrounds.

Andere Forscher haben die Interaktion zwischen MMPs und TIMPs untersucht (Butler et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 20391–96; Overall et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 4421–29; Meng et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 10184–89). In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung die Ableitung der Peptide von TIMP-Proteinen, die Strukturen in Übereinstimmung mit den drei Regionen der TIMP-Proteine umfassen, die in nächster Nähe zu dem MMP-katalytischem Zink liegen.Other Researchers have studied the interaction between MMPs and TIMPs (Butler et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 20391-96; Overall et al. (1999). J. Biol. Chem. 274, 4421-29; Meng et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 10184-89). In one embodiment For example, the present invention encompasses the derivation of the peptides from TIMP proteins. the structures in agreement with the three regions of TIMP proteins in close proximity to the MMP catalytic zinc.

In einer weiteren Ausführungsform umfassen die neuartigen synthetischen Peptide der vorliegenden Erfindung relative kurze Strecken der Aminosäuren, die der TIMP/MMP Bindungsdomäne entsprechen. Diese Peptide können an einen Zink-Chelatbildner gekoppelt werden und sind fähig, viele MMP-Enzyme in dem Bereich des katalytischen Zinks zu bilden.In a further embodiment include the novel synthetic peptides of the present invention relative short stretches of the amino acids corresponding to the TIMP / MMP binding domain. These peptides can be coupled to a zinc chelating agent and are capable of many To form MMP enzymes in the region of the catalytic zinc.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung drei Peptide, die von TIMP-Regionen abgeleitet werden, die eine große Anzahl an spezifischen Seitenketten-Interaktionen mit MMPs aufweisen. Die genaue Sequenz der eingesetzten Peptide gewährt ein Zielen auf spezifische MMPs. Diese Sequenzen werden von drei separaten Regionen der TIMPs I-IV, die MMPs binden, abgeleitet.In a preferred embodiment For example, the present invention encompasses three peptides derived from TIMP regions be derived, which is a big one Number of specific side-chain interactions with MMPs. The exact sequence of the peptides used allows for targeting to specific ones MMPs. These sequences are from three separate regions of the TIMPs I-IV, which bind MMPs, derived.

Diese bevorzugten Peptide umfassen die Aminosäuresequenzen bezeichnet als SEQ ID Nrn. 1 bis 3. Diese Sequenzen werden in nachstehender Tabelle 1 gezeigt. Das Peptid mit der SEQ ID Nr. 1 erstreckt sich auf die MMP-Aminosäuren 2–9. Diese Peptide weisen eine Länge von sieben Aminosäuren auf. Das Peptid mit der SEQ ID Nr. 2 erstreckt sich auf die MMP-Aminosäuren 62–73 und weist eine Länge von 12 Aminosäuren auf. Das Peptid mit der SEQ ID Nr. 3 weist eine Länge von 9 Aminosäuren auf und umfasst MMP-Rest 97–105.These preferred peptides include the amino acid sequences designated as SEQ ID NOs: 1 to 3. These sequences are shown in Table 1 below. The peptide having SEQ ID NO: 1 extends to MMP amino acids 2-9. These peptides are seven amino acids in length. The peptide SEQ ID NO: 2 extends to MMP amino acids 62-73 and has a length of 12 amino acids. The peptide having SEQ ID NO: 3 has a length of 9 amino acids and comprises MMP residue 97-105.

Innerhalb dieser bevorzugten Peptide besteht ein hohes Maß an Sequenzvariationen, gezeigt durch die Positionen in Klammem. Diese Variabilität kann als ein Werkzeug benutzt werden, um die Bindungsaffinität und die Spezifität der TIMP-Bindungsinteraktionen anzupassen. Die genaue Sequenz des Peptids kann durch Anpassen der Bindungsaffinität und/oder -spezifität geändert werden, solange lediglich ein Cysteinrest in dem Peptid vorkommt. Diese drei bevorzugten Peptide können durch C-ter Amidierung und N-ter Acetylierung weiter modifiziert werden. Es wird häufig beobachtet, dass diese Ladungsneutralisation die Bindungsaffinität erhöht, da es vortäuscht, dass das Peptid im Zusammenhang des ganzen Proteins vorliegt. Zusammenfassend, diese spezifischen Peptide gewähren den Grad der spezifischen MMPs in einer koordinierten Art und Weise abzuändern. Tabelle 1. Peptidfamilie-Sequenzen

Figure 00110001
Within these preferred peptides, there is a high degree of sequence variation, shown by the positions in clamps. This variability can be used as a tool to tailor the binding affinity and specificity of TIMP binding interactions. The exact sequence of the peptide can be altered by adjusting the binding affinity and / or specificity as long as only one cysteine residue is present in the peptide. These three preferred peptides can be further modified by C-terminal amidation and N-th acetylation. It is often observed that this charge neutralization increases the binding affinity, as it pretends that the peptide is present in the context of the whole protein. In summary, these specific peptides allow to alter the level of specific MMPs in a coordinated manner. Table 1. Peptide family sequences
Figure 00110001

In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die synthetischen Peptide der vorliegenden Erfindung mindestens einen Cysteinrest.In a preferred embodiment For example, the synthetic peptides of the present invention contain at least a cysteine residue.

Obwohl es nicht erwünscht ist, an die folgende Theorie gebunden zu sein, scheint es, dass die bevorzugten ChePep-Komplexe die Iminocarboxylatgruppen mittels Zink- Chelatbildung blockieren, bevor sie die verbleibende Carboxylgruppe aktiviert an die Peptide zu binden. Einmal an das Zink-Ion gebunden sind diese Carboxylgruppen nicht mehr fähig an der Aktivierungsreaktion teilzunehmen. Die Zink-Bindungsaffinität ist hoch genug, um eine langsame Reaktionsgeschwindigkeit zu garantieren, so dass die bindenden Carboxylgruppen während der NHS/EDC-Reaktion an das Zink gebunden werden (siehe Beispiele). Das Zink-Ion wird dann durch umfangreiche Dialyse entfernt. Zum Beispiel kann das Material durch eine 500 MWCO Celluloseacetat-Dialysesonde gegen 50% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)/Wasser, für 48 Stunden vorzugsweise bei Raumtemperatur, dialysiert werden.Even though not wanted is to be bound to the following theory, it seems that the preferred ChePep complexes use iminocarboxylate groups Zinc chelation block before activating the remaining carboxyl group to bind to the peptides. Once bound to the zinc ion these are carboxyl groups no longer capable participate in the activation reaction. The zinc binding affinity is high enough to guarantee a slow reaction rate allowing the binding carboxyl groups during the NHS / EDC reaction be attached to the zinc (see examples). The zinc ion will then removed by extensive dialysis. For example, the material through a 500 MWCO cellulose acetate dialysis probe against 50% phosphate-buffered Saline (PBS) / water, for 48 hours, preferably at room temperature, dialyzed.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zink-Chelatbildner ein Molekül, das einen Di-Essigsäure-Anteil enthält und daher ein guter Chelatbildner für bestimmte zweiwertige Kationen, einschließlich Zink, ist. Obwohl diese Verbindungen bevorzugt werden, kann jedes kleine organische Molekül, das die Fähigkeit aufweist, an ein Zinkmolekül zu binden oder zu chelatieren, räumlich in das MMP-aktive Zentrum eintreten (ohne jegliche zerstörerische elektrostatische Interaktionen auszuführen) und ist der Aufnahme in ein Chelat-bildendes Peptid (ChePep) fähig. Der Vorgang der Chelatbildung selbst ist dadurch, dass jegliches Zink ein potentielles Ziel zur Chelatbildung darstellt, nicht spezifisch. Mögliche Chelatbildner umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, Zitronensäure, Salicylsäure, und Hydroxybernsteinsäure. Andere Chelatbildner umfassen Peptide, die an Zink binden können. Zum Beispiel, Peptide mit der SEQ ID Nr. 9 (CDIC) oder SEQ ID Nr. 10 (HTITI-) chelatieren die Zinkanteile durch Interaktionen mit den zwei Cysteinen (SEQ ID Nr. 9) oder den zwei Histidinen (SEQ ID Nr. 10). Diese Sequenzen werden von der Konsensus-Struktur des Zinkfingermotifs, beschrieben von Berg (Berg et al., Ann Rev Biophys Biomol Struct, 1997, 26: 357–71), abgeleitet. Diese Peptide können an das Zielpeptid mittels Standardpeptidsynthese gekoppelt werden.In a preferred embodiment For example, the zinc chelating agent is a molecule containing a diacetic acid portion contains and therefore a good chelating agent for certain divalent cations, including Zinc is. Although these compounds are preferred, each may small organic molecule, that the ability has, to a zinc molecule to bind or chelate, spatially into the MMP-active center (without any destructive perform electrostatic interactions) and is the recording into a chelating peptide (ChePep). The process of chelation itself is that any zinc is a potential target for Chelation represents, not specific. Include possible chelating agents, but are not limited on, EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, citric acid, salicylic acid, and Malic acid. Other chelating agents include peptides that can bind to zinc. To the Example, peptides having SEQ ID NO: 9 (CDIC) or SEQ ID NO: 10 (HTITI) chelate the zinc moieties through interactions with the two cysteines (SEQ ID NO: 9) or the two histidines (SEQ ID NO: 9). 10). These sequences are derived from the consensus structure of the zinc finger motif, Berg (et al., Ann Rev Biophys Biomol Struct. 1997, 26: 357-71), derived. These peptides can be coupled to the target peptide by standard peptide synthesis.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist eines der drei Zink-chelatbildenden Moleküle kovalent an eines von den verschiedenen TIMP-abgeleiteten Peptiden, die die vorliegende Erfindung umfassen, verknüpft. Die chemische Struktur dieser drei Zink-chelatbildenden Moleküle: Pyridindisulfidethylendiamintetraessigsäure (PSDE), Aminoiminodiessigsäure (IDA) und 2-Amino-4-Fluorophenol-N,N,O-tri-Essigsäure (AFTA), sind nachfolgend in Struktur 1 dargestellt. Struktur 1

Figure 00130001
In a preferred embodiment, one of the three zinc chelating molecules is covalently linked to one of the various TIMP-derived peptides comprising the present invention. The chemical structure of these three zinc chelating molecules: pyridine disulfide ethylenediaminetetraacetic acid (PSDE), aminoiminodiacetic acid (IDA) and 2-amino-4-fluorophenol-N, N, O-tri-acetic acid (AFTA) are shown below in Structure 1. Structure 1
Figure 00130001

Die Pyridindisulfidethylendiamintetraessigsäure (PSDE) der vorliegenden Erfindung wird in einer aus der Literatur bekannten Synthese hergestellt (Hayward et al. (1995), J. Org. Chem. 60, 3924–27). Kovalentes Koppeln von PDSE an das Peptid wird durch einen einfachen stöchiometrischen Disulfidaustausch mit einem Cystein an dem Aminoende ausgeführt. Für gewöhnlich führt der Prozess zu einem wesentlich reinen Produkt mit einer Gesamtausbeute von etwa 10 bis 25%.The Pyridine disulfide ethylenediaminetetraacetic acid (PSDE) of the present invention Invention is prepared in a synthesis known from the literature (Hayward et al., (1995) J. Org. Chem. 60, 3924-27). Covalent coupling of PDSE to the peptide is replaced by a simple stoichiometric disulfide exchange with a cysteine at the amino terminus. Usually the process leads to a substantial one pure product with an overall yield of about 10 to 25%.

Die in nachfolgender Struktur 2 gezeigte Peptidsequenz ist eine Modifikation von SEQ ID Nr. 1, worin das Cystein in Position 3 durch ein Alanin ausgetauscht wurde. Dieses Molekül kann direkt an ein beliebiges freies Thiol mittels einer einfachen Disulfidaustauschreaktion gekoppelt werden. Struktur 2

Figure 00130002
The peptide sequence shown in Structure 2 below is a modification of SEQ ID NO: 1 wherein the cysteine at position 3 has been replaced by an alanine. This molecule can be coupled directly to any free thiol via a simple disulfide exchange reaction. Structure 2
Figure 00130002

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung PSDE gekoppelt mit SEQ ID Nr. 4 (CSAVPVH) mit einer Gesamtausbeute von 80% bereit. Das Reaktionsprodukt wird dann mittels RP-HPLC aufgereinigt, wie in den Beispielen beschrieben. Das Einführen dieses Moleküls, ChePep-1, in MMP-9 unterbindet das Enzym mit Fluoreszein versehenes Collagen in einer Dosis-abhängigen Art und Weise, wie in 1 gezeigt, abzubauen.In another embodiment, the present invention provides PSDE coupled with SEQ ID NO: 4 (CSAVPVH) with an overall yield of 80%. The reaction product is then purified by RP-HPLC as described in the Examples. The introduction of this molecule, ChePep-1, into MMP-9 inhibits the enzyme with fluorescein-provided collagen in a dose-dependent manner, as in 1 shown to mine.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Bildung eines zusammengeschlossenen Regulators (Bindungsspezifität durch das Peptid und Zink-Chelatbildung durch das kleine Molekül) durch kovalentes Verbinden von EDTA oder IDA an eine von TIMP-abgeleitete Peptidsequenz, bereit. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Iminoessigsäure (IDA) sind wirksame Chelatbildner von Zink. Jedoch benötigt ein EDTA-Chelatbildner etwas vorhergehende, aus der Literatur bekannte, Synthese um eine Kopplungsreaktion, die von der vorliegenden Erfindung bevorzugt wird, auszuführen. Diese Synthese ist von Hayward et al. (J. Org. Chem., Vol. 60 (12), 1995, 3924–3927) beschrieben und in 8 dargestellt. Eine derartige Synthese ist für IDA nicht notwendig, da es relativ leicht ist, IDA an die Carboxylatgruppe eines Aspartats zu koppeln, das durch Reaktion mit N-Hydroxybernsteinsäureimid (NHS/N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbo-diimid (EDC) (EDC/NHS) in ein Bernsteinsäureimidester umgewandelt wurde.In yet another embodiment, the present invention provides for the formation of an aggregated regulator (binding specificity by the peptide and zinc chelation by the small molecule) by covalently linking EDTA or IDA to a TIMP-derived peptide sequence. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and iminoacetic acid (IDA) are effective chelating agents of zinc. However, an EDTA chelating agent requires some prior synthesis known from the literature Coupling reaction, which is preferred by the present invention to carry out. This synthesis is by Hayward et al. (J. Org. Chem., Vol. 60 (12), 1995, 3924-3927) and in 8th shown. Such a synthesis is not necessary for IDA since it is relatively easy to couple IDA to the carboxylate group of an aspartate obtained by reaction with N-hydroxysuccinimide (NHS / N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) carbo-diimide (EDC). (EDC / NHS) was converted to a succinimide ester.

Durch das Koppeln von IDA an ein ähnliches Peptid, SEC ID Nr. 5 (DSAVPVH), kann der Einfluss der Größe des EDTA-Anteiles an ChePep-1 (PSDE und SEQ ID Nr. 4) bestimmt werden. In diesem Augenblick wird die Carboxylatgruppe der N-ter Peptidasparaginsäure in ein Succiminidester mittels Inkubation mit EDC/NHS aktiviert. Diese einfache Reaktion wird normalerweise verwendet, um freie Aminogruppen mit aktivierten Carboxylaten zu verbinden. Die Allgemeinstruktur eines Peptids, das durch ein aktiviertes Asparaginsäurecarboxylat kovalent an IDA gebunden ist, ist in nachfolgender Struktur 3 gezeigt. Struktur 3

Figure 00150001
By coupling IDA to a similar peptide, SEC ID No. 5 (DSAVPVH), the influence of the size of the EDTA portion on ChePep-1 (PSDE and SEQ ID NO. 4) can be determined. At this moment, the carboxylate group of the N-th peptidasparaginic acid is activated in a succinimide ester by incubation with EDC / NHS. This simple reaction is normally used to link free amino groups with activated carboxylates. The general structure of a peptide covalently linked to IDA by an activated aspartic acid carboxylate is shown in structure 3 below. Structure 3
Figure 00150001

Vorzugsweise läuft das gesamte Syntheseschema, das IDA an das Peptid koppelt und das Endprodukt reinigt, mit einer Gesamtausbeute von 49% ab. Um mögliche Verunreinigungen in der Reaktion zu vermeiden, wird ein Peptid mit einer C-ter Amidgruppe verwendet. Daher sollte die einzige freie Carboxylgruppe in dem Peptid eine Asparaginsäure-Seitenkette sein.Preferably is that going? full synthetic scheme coupling IDA to the peptide and the final product cleans, with an overall yield of 49%. To possible impurities In the reaction, a peptide with a C-tert amide group is avoided used. Therefore, the only free carboxyl group in the Peptide an aspartic acid side chain be.

Das Molekül ChePep-2 (IDA und SEQ ID Nr. 5) reguliert MMP-9 in dem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Assay in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Das Konstrukt ist wesentlich wirksamer in der Regulation von MMP-9 als es ChePep-1 war, wie in 2 gezeigt. Dies kann an der Fähigkeit eines IDA-Anteiles liegen, das aktive Zentrum von Zink aufgrund der räumlichen Berücksichtigung wirksamer als PSDE zu binden, als auch aus dem Bedarf die Ladungsinteraktionen mit der zweiten Chelat-bildenden Gruppe auf PSDE zufriedenzustellen. Zusätzlich kann die Neutralisation der C-ter negativen Ladung des Peptids mittels der Amidierung ebenso die Bindungsaffinität verändern.The molecule ChePep-2 (IDA and SEQ ID NO: 5) regulates MMP-9 in the fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay in a dose-dependent manner. The construct is significantly more effective in the regulation of MMP-9 than it was in ChePep-1, as in 2 shown. This may be due to the ability of an IDA moiety to bind the active site of zinc more effectively than PSDE due to spatial considerations, as well as the need to satisfy the charge interactions with the second chelating moiety on PSDE. In addition, neutralization of the C-th negative charge of the peptide by amidation can also alter the binding affinity.

In einer weiteren Ausführungsform ist PSDE an ein Peptid der SEQ ID Nr. 2 gekoppelt. Spezifischer ist PSDE an ein Peptid gekoppelt, das die SEC ID Nr. 10 aufweist, das an dem Amino-Ende (IYTACMSAV-NH2) mittels der gleichen, vorgehend beschriebenen, Disulfidaustauschreaktion mit einem Amin versehen wurde. Die Ausbeute des Endprodukts betrug 37%. Die allgemeine Struktur eines Chelat-bildenden Peptids (ChePep) zusammengesetzt aus PSDE und SEQ ID Nr. 2 ist nachfolgend gezeigt. Struktur 4

Figure 00160001
In another embodiment, PSDE is coupled to a peptide of SEQ ID NO: 2. More specifically, PSDE is coupled to a peptide having SEC ID No. 10 which has been amino-terminated at the amino-terminus (IYTACMSAV-NH 2 ) by the same, previously described, disulfide exchange reaction. The yield of the final product was 37%. The general structure of a chelating peptide (ChePep) composed of PSDE and SEQ ID NO: 2 is shown below. Structure 4
Figure 00160001

Sollte der Cysteinrest in der fünften Position des oben aufgeführten Moleküls zu Asparaginsäure umgebaut sein, dann kann IDA an der gleichen Position in die Struktur eingebracht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist IDA, mittels der EDC/NHS Reaktion wie in den Beispielen beschrieben, an SEQ ID Nr. 2, spezifischer an das Peptid von SEQ ID Nr. 11, gekoppelt. Die Ausbeute des Endprodukts betrug 75%. Die RP-HPLC Chromatogramme beider ChePep-Moleküle zeigten einen einzigen Absorptionspeak bei 214 nm.Should the cysteine residue in the fifth Position of the above molecule to aspartic acid be rebuilt, then IDA can at the same position in the structure be introduced. In a preferred embodiment, IDA is by means of the EDC / NHS reaction as described in the examples, to SEQ ID No. 2, more specifically coupled to the peptide of SEQ ID NO: 11. The yield of the final product was 75%. The RP-HPLC chromatograms of both ChePep molecules showed a single absorption peak at 214 nm.

Sowohl ChePep-3 (PSDE und SEQ ID Nr. 6) und ChePep-4 (IDA und SED ID Nr. 6) zeigen nahezu eine identische Fähigkeit MMP-9 in dem Standard FRET Assay zu regulieren. Der zeitabhängige Regulierungsablauf wird in 3 gezeigt. Trotz der Tatsache, dass es Unterschiede zwischen IDA und PSD gibt, zeigt das molekulare Modellverfahren, das die Chelat-bildenden Gruppen beider ChePep-Konstrukte eine ähnliche Zugänglichkeit an das aktive Zink-Zentrum in MMP besitzen. Tatsächlich macht die zweite Chelat-bildende Gruppe von PSDE keine energetisch ungünstigen Interaktionen, die die Bindungsaffinität herabsetzen würden. Es wird angenommen, dass ChePep-3 einige Bindungsenergie durch die Interaktion des Carboxylatsauerstoffs mit dem freien Ligandenanteil eines MMP-9 Hauptamids („backbone amide") gewinnt.Both ChePep-3 (PSDE and SEQ ID NO: 6) and ChePep-4 (IDA and SED ID No. 6) show nearly identical ability to regulate MMP-9 in the standard FRET assay. The time-dependent regulatory flow is in 3 shown. Despite the fact that there are differences between IDA and PSD, the molecular model method shows that the chelating groups of both ChePep constructs have similar accessibility to the active zinc center in MMP. In fact, the second chelating group of PSDE does not make energetically unfavorable interactions that would decrease binding affinity. It is believed that ChePep-3 gains some binding energy through the interaction of the carboxylate oxygen with the free ligand moiety of an MMP-9 major amide ("backbone amide").

Moleküle, wie 2-Amino-4-fluorophenol-N,N,O-tri-Essigsäure (AFTA) sind gemäß der wissenschaftlichen Literatur nicht allgemeinen bekannt oder werden als Metall-Chelatbildner verwendet, können aber in dieser Anwendung tatsächlich leicht Zink-Chelate bilden. Es wurde herausgefunden, dass AFTA gut an das aktive Zentrum von MMP-ähnlichen Enzymen bindet. Die Diacetatgruppe an der zweiten Ringposition bildet das Zink-Chelat. Die dritte Acetatgruppe kann verwendet werden, um ein Peptid an das Molekül zu koppeln. Das elektronegative Fluor kann durch spezifische Interaktionen in dem aktiven Zentrum des Enzyms auch an der Regulierung von MMP mitwirken. Die Allgemeinstruktur von SEQ ID Nr. 3, kovalent an AFTA gebunden, ist nachfolgend gezeigt. Struktur 5

Figure 00170001
Molecules such as 2-amino-4-fluorophenol-N, N, O-tri-acetic acid (AFTA) are not generally known or used as metal chelants in the scientific literature, but in fact can easily form zinc chelates in this application , It has been found that AFTA binds well to the active site of MMP-like enzymes. The diacetate group at the second ring position forms the zinc chelate. The third acetate group can be used to couple a peptide to the molecule. The electronegative fluorine may also participate in the regulation of MMP by specific interactions in the active site of the enzyme. The general structure of SEQ ID NO: 3, covalently linked to AFTA, is shown below. Structure 5
Figure 00170001

Die oben aufgeführte Struktur wird durch Koppeln eines Peptides mit der SEQ ID Nr. 7 (VHTHLCD) an einen AFTA Zink-Chelatbildner, unter Verwendung der gleichen, vorstehend beschriebenen EDC/NHS Reaktion, zusammengesetzt, mit dem Unterschied, dass die aktivierte Carboxylgruppe durch den AFTA-Anteil bereitgestellt wurde. Da sich an AFTA drei freie Carboxylgruppen befinden, wovon nur zwei an der Zinkbindung (siehe Struktur 1) teilnehmen können, ist es notwendig, diese Chelat-bildenden Gruppen der EDC/NHS Behandlung gegenüber unreaktiv zu machen. Dies kann durch Mischen von AFTA mit Zinksulfat vor der EDC/NHS Aktivierung erreicht werden. Das Zink-Ion wird durch den Iminodiessigsäureanteil Chelat-gebunden, dabei bleibt ein einziges freies Carboxylat übrig. Der Bernsteinsäureimidester wird dann an dieser Gruppe, wie in den Beispielen beschrieben, gebildet. Der aktivierte AFTA-Zink-Komplex wird an die N-ter Aminogruppe des Peptids gekoppelt und das daraus resultierende Molekül (ChePep-5) wird mittels RP-Phase HPLC bis zur Homogenität gereinigt. Vorzugsweise betrug die Gesamtausbeute 61% und der am Ende erhaltene Stoff wird als 97% rein betrachtet. Die allgemeine Struktur dieses in Struktur 5 gezeigten Typs des Regulators ist fähig, die Hydrolyse des FRET-Peptids in einer Dosis-abhängigen Art und Weise zu verhindern.The listed above Structure is made by coupling a peptide with SEQ ID NO: 7 (VHTHLCD) to an AFTA zinc chelator using the same, EDC / NHS reaction described above, composed, with the difference that the activated carboxyl group is replaced by the AFTA share was provided. Since there are three free carboxyl groups on AFTA of which only two participate in zinc bonding (see structure 1) can, It is necessary to use these chelating groups of EDC / NHS treatment across from to make unreactive. This can be done by mixing AFTA with zinc sulfate be achieved before the EDC / NHS activation. The zinc ion gets through the iminodiacetic acid fraction Chelated, leaving a single free carboxylate left. Of the Bernsteinsäureimidester is then formed on this group as described in the examples. The activated AFTA-zinc complex is attached to the N-th amino group of the Coupled peptide and the resulting molecule (ChePep-5) is purified to homogeneity by RP-phase HPLC. Preferably was the overall yield is 61% and the final material is reported as 97% pure. The general structure of this in structure The type of regulator shown in Figure 5 is capable of hydrolysis of the FRET peptide in a dose-dependent manner Way to prevent.

Tatsächlich stellte sich ChePep-5 gemäß der in 4 gezeigten molaren Stöchiometrie-Tests als ein besserer Regulator als IDA oder die PSDE-basierenden Chelat-bildenden Peptide heraus. Sein Erfolg kann von vier Faktoren kommen, ist aber nicht auf diese limitiert: die Fluorgruppe, die aufgrund seiner Elektronennegativität hartnäckig an die Proteine bindet; der Ring selbst, der hydrophob ist und daher gut an das hydrophobe, aktive Zentrum der MMP bindet; die Gegenwart von drei zu bindenden Carboxylgruppen, um die Zink-Chelatbildung zu gewähren; und die Aminogruppen, um Spezifizität zu erzeugen.In fact, ChePep-5, according to the in 4 As a better regulator than IDA or the PSDE-based chelate-forming peptides shown molar stoichiometry tests. Its success can come from, but is not limited to, four factors: the fluorine group, which stubbornly binds to proteins because of its electronegativity; the ring itself, which is hydrophobic and therefore binds well to the hydrophobic active site of the MMP; the presence of three carboxyl groups to be attached to afford zinc chelation; and the amino groups to produce specificity.

In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird ein zweites AFTA-Peptidkonstrukt synthetisiert. Dieses Peptid (ChePep-6) umfasst die SEQ ID Nr. 8 (CTCVP) und ein AFTA, in dem das AFTA-Molekül an das Aminoende des Peptids gekoppelt ist. Die Kopplung wird vorzugsweise durch vorhergehendes Mischen von gleichen Mengen Zinksulfat und AFTA hergestellt. Der sich daraus ergebende Komplex wird dann mit NHS/EDC aktiviert. Eine Amidkopplung wird dann durch die Verwendung der N-ter Region des Peptids hergestellt. Hilfsweise kann AFTA an das Cysteinthiol mittels einer Disulfidaustauschreaktion gebunden werden. Die Struktur des bevorzugten Chelat-bildenden Peptids ist nachfolgend in Struktur 6 gezeigt. Struktur 6

Figure 00190001
In another embodiment of this invention, a second AFTA peptide construct is synthesized. This peptide (ChePep-6) comprises SEQ ID NO: 8 (CTCVP) and an AFTA in which the AFTA molecule is coupled to the amino end of the peptide. The coupling is preferably made by previously mixing equal amounts of zinc sulfate and AFTA. The resulting complex is then activated with NHS / EDC. Amide coupling is then made by using the Nth region of the peptide. Alternatively, AFTA can be linked to the cysteine thiol by a disulfide exchange reaction. The structure of the preferred chelating peptide is shown below in Structure 6. Structure 6
Figure 00190001

Dieses Chelat-bildende Peptid besitzt die Fähigkeit, die Hydrolyse des FRET Substratpeptids in dem Standardassay zu verhindern. Wie aus 5 ersichtlich ist, ist ChePep-6 ein effektiver MMP-9 Regulator bei niedrigmolaren Stöchiometrien. Zusätzlich bindet ChePep-6 schnell und mit hoher Affinität; und, wie aus 6 ersichtlich, erst einmal gebunden, dissoziiert ChePep-6 nicht. Tatsächlich ergab die Kombination von Peptiden der Gruppe I mit einem AFTA-Anteil den wirksamsten Regulator von all den ChePeps.This chelating peptide has the ability to prevent hydrolysis of the FRET substrate peptide in the standard assay. How out 5 ChePep-6 is an effective MMP-9 regulator at low molar stoichiometries. In addition, ChePep-6 binds rapidly and with high affinity; and, how out 6 Once bound, ChePep-6 does not dissociate. In fact, the combination of Group I peptides with an AFTA moiety resulted in the most potent regulator of all the ChePeps.

In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung des MMP Regulators der Erfindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von chronischen und akuten Wunden. Durch Verabreichen der Zusammensetzung auf die chronische Wunde kann die MMP-Aktivität reguliert werden. Spezifischer umfasst die Zusammensetzung ein Peptid mit Bindungsspezifität, um den Zink-Chelatbildner in einer derartigen Art und Weise in molekulare Umgebung des MMP-gebundenen Zinks zu bringen, um das Binden zu erlauben. Zusätzlich zu dieser Affinität wird die genaue Sequenz des Peptids das Zielen der spezifischen MMPs gewähren. Die Reaktion reguliert den Grad der MMP-Aktivität bis zu einem Punkt, der Heilung fördert.In In another aspect, the present invention encompasses the use the MMP regulator of the invention for the preparation of a pharmaceutical Composition for the treatment of chronic and acute wounds. By administering composition of the chronic wound can regulate MMP activity become. More specifically, the composition comprises a peptide having Binding specificity, um the zinc chelator in such a manner in molecular Environment of MMP-bound zinc bring to allow the binding. In addition to this affinity, the provide accurate sequence of the peptide targeting the specific MMPs. The Reaction regulates the level of MMP activity to a point of healing promotes.

Ein herausragender Punkt dieser auf Peptid basierenden Therapie ist die Plastizität, in welcher dieses Material auf chronische Wunden aufgetragen werden kann. Wenn die Infektion auf der Haut sitzt, ist eine bevorzugte Formulierung eine Salbe, Lotion oder eine andere topische Formulierung. Die Zusammensetzung für topische Verabreichung, die sich nützlich für die vorliegende Erfindung erweist, kann in einer Vielfalt von Produktarten hergestellt werden. Diese umfassen, sind aber nicht limitiert auf, Cremes, Gels, Sticks, Sprays, Pasten, Schäume oder jedes beliebige wässrige Medium. Diese Produktarten können verschiedene Arten von Trägersystemen umfassen, einschließlich, aber nicht limitiert auf, Lösungen, Dispersionen, Emulsionen, Gele, Feststoffe und Liposome. Zusätzlich können die Peptide mittels Abgabe durch das Wundbandmaterial selbst in einer kontinuierlichen Art und Weise in das Wundbett eingebracht werden. Bevorzugte Dosierungen zum Behandeln von chronischen Wunden betragen zwischen ungefähr 0,01 und 1,0 mg/ml.An outstanding feature of this peptide-based therapy is the plasticity in which this material can be applied to chronic wounds. When the infection is on the skin, a preferred formulation is an ointment, lotion or other topical formulation. The composition for topical administration which is useful for the present invention can be prepared in a variety of product types. These include, but are not limited to, creams, gels, sticks, sprays, pastes, foams, or any aqueous medium. These product types may include various types of carrier systems, including, but not limited to, solutions, dispersions, emulsions, gels, solids, and liposomes. In addition, the peptides may be delivered by delivery through the wound band material itself be introduced into the wound bed in a continuous manner. Preferred dosages for treating chronic wounds are between about 0.01 and 1.0 mg / ml.

Schließlich ist es eine weitere Ausführungsform der Erfindung, spezifisch die MMP-Aktivität zu kontrollieren. Bestimmte Erkrankungen werden durch unkontrollierbare MMP-Aktivität verursacht. Tatsächlich werden manche Erkrankungen nur durch ein bestimmtes der neun MMP-Moleküle verursacht. Durch das Herstellen von Peptiden, die einem aktiven Zentrum von spezifischen MMPs entsprechen und nachfolgendem Koppeln eines Zink-Chelatbildners an das Peptid, wird nur zielgerichtete MMP-Aktivität mit einem hohen Grad an Affinität und Spezifität reguliert.Finally is it is another embodiment of the invention to specifically control MMP activity. Certain Diseases are caused by uncontrollable MMP activity. In fact, some will Diseases caused only by a specific one of the nine MMP molecules. By making peptides that form an active center of correspond to specific MMPs and subsequent coupling of a zinc chelating agent To the peptide, only targeted MMP activity is used with one high degree of affinity and specificity regulated.

Die MMP-Regulatoren der vorliegenden Erfindung sind nicht toxisch in einem Hautähnlichen Modell. Die allgemeinen toxischen Auswirkungen eines nicht-spezifischen Zink-Chelatbildners sind durch die Tatsache, dass der Peptidteil des ChePep- Konstruktes direkt auf das Konstrukt des MMP-aktiven Zentrums in einer derartigen Art und Weise zielt, um die Chelatbildung an sekundären (nicht MMP-) Zielen herabzusetzen, abgeschwächt.The MMP regulators of the present invention are non-toxic in a skin-like Model. The general toxic effects of a non-specific Zinc chelating agents are due to the fact that the peptide part of the ChePep construct directly to the construct of the MMP-active center in such a Way aims to chelate at secondary (not MMP) targets, toned down.

HERSTELLVERFAHRENMethods of Preparation

Alle Peptide wurden unter Verwendung konventioneller Verfahren durch Sigma-Genosys, Inc. synthetisiert. Die freigesetzten Peptide wurden bis zu einer mehr als 95%igen Homogenität mittels RP-HPLC durch die Firma gereinigt. Das am Peak gesammelte eluierte Material wurde entsalzt und lyophilisiert. Massenspektronomieanalysen bestätigten das molekulare Gewicht und die Reinheit der Peptide. Wenn nicht anders vermerkt, wurden alle chemischen Mittel von Sigma-Chemical Corp. oder von Fluka Chemikal Co. bezogen. Aktive MMP-9 Enzyme wurden von Calbiochem bezogen.All Peptides were run using conventional techniques Sigma-Genosys, Inc. synthesized. The released peptides were up to one more as 95% homogeneity purified by RP-HPLC by the company. The collected at the peak eluted material was desalted and lyophilized. Massenspektronomieanalysen confirmed the molecular weight and purity of the peptides. Unless otherwise noted, all chemical agents were from Sigma-Chemical Corp. or purchased from Fluka Chemical Co. Active MMP-9 enzymes were added purchased from Calbiochem.

Die molekularen Modellverfahren verwendeten zwei Visualisierungsprogramme. Swiss PDB Viewer (Guex und Peitsch, 1997) und Rasmol (Sayle und Milner-White, 1995). Die Modellerstellung wurde an einem Compaq PC mit Windows 95 sowie an einer Silicongraphics, Inc. Octane UNIX Workstation ausgeführt. Zusätzlich wurde das Cerius2 Molekularpaket von Molecular Simulations, Inc. an der Octane Workstation eingesetzt. Dreidimensionale Strukturdaten wurden von der Protein Datenbank wie folgt heruntergeladen (Dateiname, Referenz): MMP-1 (1FBL, Li et al., 1995), MMP-2 (1GEN, Libson et al., 1995), MMP-8 (1JAO, 1JAN, Grams, et al., 1995; Reinemer et al., 1994), MMP-9 (1MMQ, Browner et al., 1995), TIMP-2/MT-1 MMP-Komplex (1BUV, Fernandez-Catalan et al., 1998), TIMP-2 (1BR9, Tuuttila et al., 1998), und TIMP-1/MMP-Komplex (1UEA, Gomis-Ruth et al., 1997; Huang et al., 1996; Becker et al., 1995). Diese Dateien wurden verwendet, um die dreidimensionale Struktur der Proteine und die chemische Natur und Identifizierung von konservierten und abweichenden Aminosäuren an der MMP-TIMP-Kontaktstelle zu analysieren. Diese Information wurde verwendet, um ein minimalistisches Peptid herzustellen, das an einen Zink-Chelatbildner gekoppelt werden konnte, und das viele MMP-Enzyme in dem Bereich des katalytischen Zinks binden würde.The molecular modeling techniques used two visualization programs. Swiss PDB Viewer (Guex and Whip, 1997) and Rasmol (Sayle and Milner-White, 1995). The modeling was done on a Compaq PC with Windows 95 as well as at a Silicongraphics, Inc. Octane UNIX Workstation executed. additionally was the Cerius2 molecular package from Molecular Simulations, Inc. used on the Octane workstation. Three-dimensional structural data were downloaded from the protein database as follows (filename, Reference): MMP-1 (1FBL, Li et al., 1995), MMP-2 (1GEN, Libson et al., 1995), MMP-8 (1JAO, 1JAN, Grams, et al., 1995; Reinemer et al., 1994), MMP-9 (1MMQ, Browner et al., 1995), TIMP-2 / MT-1 MMP complex (1BUV, Fernandez-Catalan et al., 1998), TIMP-2 (1BR9, Tuuttila et al., 1998), and TIMP-1 / MMP complex (1UEA, Gomis-Ruth et al., 1997; Huang et al., 1996; Becker et al., 1995). These files were used to the three-dimensional structure of the proteins and the chemical nature and identification of conserved and aberrant amino acids the MMP TIMP contact point analyze. This information was used to be a minimalist Produce peptide that could be coupled to a zinc chelating agent, and that many MMP enzymes in the area of catalytic zinc would tie.

BEISPIEL 1: IDA Chelat-bildende PeptideEXAMPLE 1: IDA chelate-forming peptides

Das Peptid wurde in Wasser bis zu einer Endkonzentration von 100 mM resuspendiert. Die Aminoform von IDA wurde in einer kleinen Menge DMSO gelöst, gefolgt von der langsamen Zugabe von Wasser bis die Verbindung eine Konzentration von 150 mM erreichte. Zu der IDA-Lösung wurden N-Hydroxybernsteinsäureimid (NHS) bis zu einer Endkonzentration von 175 mM und N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) bis zu einer Endkonzentration von 400 mM hinzugefügt. Die Lösung wurde bei 37°C unter schonendem Rühren für 30 Minuten inkubiert. Die vorher hergestellte Peptidlösung wurde dieser Reaktion langsam über einen Zeitraum von 5 Minuten hinzugefügt. Rühren wurde für weitere 30 Minuten fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Ethanolamin-HCl bis zu einer Endkonzentration von 1,0 M abgeschreckt. Das Endgemisch wurde über eine Zeitdauer von 10 Stunden in einem Rotovac getrocknet. Das feste Material wurde dann in 500 μl Wasser resuspendiert und das Chelat-bildende Peptid wurde von nicht-reagierenden Arten mittels RP-HPLC aufgereinigt. Eine Chromatographie mit einer 250 mm × 100 mm, 5 ml Hypersil ODS-2 RP Säule wurde mit einer mobilen Phase von: A: 0,1% TFA/Wasser, B: 0,1% TFA/Acetonitril durchgeführt. Nach Probeninjektion wurde ein Gradient von 100% A (0 bis 2 min.) and 0–60% B (2 bis 25 min.) eingesetzt. Das Chelat-bildende Peptid wurde durch Integration am Peak bei 214 nm nachgewiesen und wies eine Reinheit von 96% auf. Die eluierten Peaks wurden zusammengefasst, mit 3 Volumen Wasser gemischt und gefriergetrocknet. Das entstehende Pulver wurde in Wasser resuspendiert und durch eine 500 MWCO Zelluloseazetatdialyse-Sonde gegen 50% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)/Wasser dialysiert. Das Chelat-bildende Peptid wurde aliquotiert und gefroren bei –20°C aufbewahrt.The Peptide was dissolved in water to a final concentration of 100 mM resuspended. The amino form of IDA was in a small amount DMSO solved, followed by the slow addition of water until the compound is one Reached a concentration of 150 mM. To the IDA solution was added N-hydroxysuccinimide (NHS) to a final concentration of 175 mM and N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC) added to a final concentration of 400 mM. The solution was at 37 ° C with gentle stirring for 30 Incubated for a few minutes. The previously prepared peptide solution was slowly over this reaction added a period of 5 minutes. Stirring was for more Continued for 30 minutes. The reaction was confirmed by the addition of Ethanolamine HCl quenched to a final concentration of 1.0M. The final mixture was over dried for 10 hours in a Rotovac. The solid Material was then added in 500 μl Water was resuspended and the chelating peptide was unreacted Species purified by RP-HPLC. Chromatography with a 250 mm × 100 mm, 5 ml Hypersil ODS-2 RP column with a mobile phase of: A: 0.1% TFA / water, B: 0.1% TFA / acetonitrile carried out. After sample injection, a gradient of 100% A (0 to 2 min.) and 0-60% B (2 to 25 minutes) used. The chelate-forming peptide was replaced by Integration at the peak detected at 214 nm and showed a purity from 96% up. The eluted peaks were pooled, with 3 volumes Water mixed and freeze-dried. The resulting powder was resuspended in water and through a 500 MWCO cellulose acetate dialysis probe dialyzed against 50% phosphate-buffered saline (PBS) / water. The chelate-forming peptide was aliquoted and stored frozen at -20 ° C.

BEISPIEL 2: AFTA Chelat-bildende PeptideEXAMPLE 2: AFTA chelating agent peptides

AFTA (50 mg) wurde in einer kleinen Menge DMSO gelöst, gefolgt von der langsamen Zugabe von Wasser bis die Verbindung eine Konzentration von 200 mM erreichte. Zu dieser Lösung wurde Zinksulfat bis zu einer Endkonzentration von 300 mM hinzugefügt. Diese Lösung wurde langsam bei Raumtemperatur gerührt. Die Probe wurde dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit EDC/NHS behandelt. Der entstehende AFTA-Bernsteinsäureimidester wurde mit einem Peptid mit der SEQ ID No. 7 oder 8, gekoppelt und das entstehende Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgereinigt. Nach dem Gefriertrocknen wurde das AFTA-Peptid in Wasser resuspendiert und es wurde umfangreich gegen Wasser in einer 500 MWCO Zelluloseacetatdialyse-Sonde dialysiert. Die Abwesenheit eines Zink-Ions wurde durch atomare Absorptionsspektroskopie bestätigt.AFTA (50 mg) was dissolved in a small amount of DMSO followed by the slow one Add water until the compound reaches a concentration of 200 reached. To this solution Zinc sulfate was added to a final concentration of 300 mM. These solution was stirred slowly at room temperature. The sample was then as described in Example 1, treated with EDC / NHS. The resulting AFTA succinimide ester was with a peptide having the SEQ ID no. 7 or 8, coupled and the resulting peptide was purified as described in Example 1. After lyophilization, the AFTA peptide was resuspended in water and it became bulky against water in a 500 MWCO cellulose acetate dialysis probe dialyzed. The absence of a zinc ion was by atomic Absorption spectroscopy confirmed.

BEISPIEL 3: PSDE Chelat-bildende PeptideEXAMPLE 3: PSDE chelate-forming peptides

PSDE wurde gemäß dem Verfahren von Hayward et al. (1995) hergestellt. Dieses Material wurde direkt mit einer stöchiometrischen Menge eines Cystein-enthaltenden Peptids mit der SEQ ID Nr. 4 oder 6, mittels der folgenden Disulfidaustauschreaktion gekoppelt. PSDE in einer Menge von 100 mM in Wasser und Peptid in einer Menge von 100 mM in 25 mM Tris-HCl (pH 7,2) wurden gemischt und für 45 Minuten bei 30°C gewährt zu reagieren. Das Produkt wurde mittels Dialyse gegen 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) in einer 500 MWCO Zelluloseacetatdialyse-Sonde von den Reaktionspartnern gereinigt. Das Produkt wurde weiter mittels RP-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt.PSDE was according to the procedure by Hayward et al. (1995). This material became direct with a stoichiometric Amount of a cysteine-containing peptide having SEQ ID NO: 4 or 6, coupled by the following disulfide exchange reaction. PSDE in an amount of 100 mM in water and peptide in an amount of 100mM in 25mM Tris-HCl (pH 7.2) was mixed and left for 45 minutes at 30 ° C granted to react. The product was dialyzed against 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) in a 500 MWCO cellulose acetate dialysis probe from the Reactants cleaned. The product was further purified by RP-HPLC, as described in Example 1, purified.

BEISPIEL 4: Regulierung der MMPsEXAMPLE 4: Regulation the MMPs

Zwei enzymatische Assays wurden ausgeführt. Mit dem ersten Assay wurde die enzymatische Hydrolyse von mit Fluoreszein versehenem Collagen durch MMP-9 als eine Funktion der Zeit gemessen. Mit Fluoreszein versehenes Collagen (Molecular Probes, Inc.) mit einer Konzentration von 5 μM wurde zu Reaktionspuffer hinzugefügt (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0,1 mM NaN3) und in eine Spectrosil Quarz Fluormeter-Kuvette überführt. MMP in einer Konzertration von 0,1 μM wurde mit variierenden Mengen von Chelat-bildenden Peptiden mit den SEQ ID Nrn. 4 oder 6 gemischt und für 10 min. bei 25°C inkubiert um eine Bindung hervorzurufen. Das Proteingemisch wurde zu dem Collagen-Substrat hinzugefügt und rasch vermischt. Fluoreszenzemissionsintensität wurde bei 520 nm in einem Shimadzu RF5301 Fluormeter als eine Funktion der Zeit (Anregungswellenlänge 495 nm) gemessen. Der Fluoreszeinfreisetzungs-Assay wurde zur Bestimmung der inhibitorischen Konstante (Ki) des chelat-bildenden Peptidinhibitors ([I]) nach Segel (1993) gemäß der Verwendung von Dixonplots (1/v vs. [I]) derart verwendet, dass: Steigung = Km/(VmaxKi[S]) (1) worin Km die Michaelis Konstante, Vmax die maximale Reaktionsgeschwindigkeit und [S] die Substratkonzentration ist.Two enzymatic assays were performed. The first assay measured the enzymatic hydrolysis of fluorescein-containing collagen by MMP-9 as a function of time. Fluorescein-added collagen (Molecular Probes, Inc.) at 5 μM concentration was added to reaction buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 , 0.1 mM NaN 3 ). and transferred to a Spectrosil quartz fluorometer cuvette. MMP at a concentration of 0.1 μM was mixed with varying amounts of chelating peptides with SEQ ID Nos. 4 or 6 and incubated for 10 min. incubated at 25 ° C to cause binding. The protein mixture was added to the collagen substrate and rapidly mixed. Fluorescence emission intensity was measured at 520 nm in a Shimadzu RF5301 fluorometer as a function of time (excitation wavelength 495 nm). The fluorescein release assay was used to determine the inhibitory constant (K i ) of the chelating peptide inhibitor ([I]) of Segel (1993) according to the use of Dixon plots (1 / v vs. [I]) such that: Slope = K m / (V Max K i [S]) (1) where K m is the Michaelis constant, V max is the maximum reaction rate, and [S] is the substrate concentration.

Der zweite Assay setzte das Verfahren des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) ein. Die Substratpeptide (Calbiochem #444221) umfassten sieben Aminosäuren, die an einen Carboxy-terminalen Dinitrophenylakzeptor und einen Amino-terminalen 2-Aminobenzoanthraniloyl(Abz)-Donorrest gekoppelt waren. Spaltung dieses Substrats durch MMP-9 ergab die Freisetzung eines Fluoreszenzproduktes (365 nm Anregung, 450 nm Emission). Peptide in einer Konzentration von 5 μM wurden zu Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0,1 mM NaN3) hinzugegeben und in eine schwarze Microtiterplatte mit 96 Vertiefungen („96-well") überführt, die vorhergehend mit 1% BSA blockiert wurde. MMP in einer Konzentration von 0,1 μM wurde mit variierenden Mengen eines Chelat-bildenden Peptids gemischt (0, 0,01, 0,02, 0,04, and 0,1 μM) und für 10 min. bei 25°C inkubiert um eine Bindung hervorzurufen. Das Proteingemisch wurde zu dem Peptidsubstrat hinzugefügt und rasch vermischt. Fluoreszenzintensität wurde mit einem Dynex MFX Fluoreszenz-Microtiterplatten-Lesegerät als eine Funktion der Zeit gemessen. Fluoreszenzintensität wurde auf die Molanzahl der gespaltenen Peptide mittels Herstellen einer Standardkurve mit einem Abz-enthaltenen Nicht-FRET-Peptid rückbezogen. Inhibitorische Konstanten wurden von den Kurven abgeleitet und sind nachfolgend in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2: Inhibitorkonstanten

Figure 00240001
The second assay employed the Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) technique. The substrate peptides (Calbiochem # 444221) comprised seven amino acids coupled to a carboxy-terminal dinitrophenyl acceptor and an amino-terminal 2-aminobenzoanthraniloyl (Abz) donor moiety. Cleavage of this substrate by MMP-9 resulted in the release of a fluorescent product (365 nm excitation, 450 nm emission). Peptides at a concentration of 5 μM were added to reaction buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 , 0.1 mM NaN 3 ) and placed in a black 96-well microtiter plate (" 96-well ") previously blocked with 1% BSA. MMP at 0.1 μM was mixed with varying amounts of a chelating peptide (0, 0.01, 0.02, 0.04, and 0.1 μM) and incubated for 10 min at 25 ° C to induce binding The protein mixture was added to the peptide substrate and rapidly mixed Fluorescence intensity was measured with a Dynex MFX fluorescence microtitre plate reader as a function of time. Fluorescence intensity was referred back to the number of moles of cleaved peptides by making a standard curve with an Abz-containing non-FRET peptide Inhibitory constants were derived from the curves and are listed in Table 2 below. Table 2: Inhibitor constants
Figure 00240001

Beispiel 5: Oberflächen-Plasmon-ResonanzExample 5: Surface plasmon resonance

Das BiaCore-X Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) Gerät wurde verwendet, um die Interaktion zwischen dem Chelat-bildenden Peptid (CP) und MMP-9 zu messen. Für diese Experimente wurde ein Carboxymethyldextran Sensorchip (BiaCore, AB; CM-5, Lofas et al., 1993) mit 50 mM N-Hydroxybernsteinsäureimid, 0,2 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 μl pro Minute für zehn Minuten aktiviert. MMP-9 mit einer Konzentration von 75 ng/μl wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 μl pro Minute für zehn Minuten mit der aktivierten Oberfläche gekoppelt. Die abschließende Oberfläche wurde dadurch inaktiviert, dass 1 M Ethanolamin-HCl mit einer Geschwindigkeit von 10 μl pro Minute für fünf Minuten über die Sensoroberfläche geleitet wurde. CP wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 μl pro Minute und mit Konzentrationen von 10, 25 und 50 nM über die Sensoroberfläche geleitet. Die Bindungsisotherme wurden durch gleichzeitiges Anpassen der vorwärts (ka) und rückwärts (kd) Geschwindigkeitskonstanten an die folgende Formel bewertet: d[CP~MMP-9]/dt = (ka[CP][MMP-9]) – (kd[CP~MMP-9]) (2) The BiaCore-X surface plasmon resonance (SPR) device was used to measure the interaction between the chelating peptide (CP) and MMP-9. For these experiments, a carboxymethyldextran sensor chip (BiaCore, AB; CM-5, Lofas et al., 1993) was reacted with 50 mM N-hydroxysuccinimide, 0.2 M N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) -carbodiimide at a flow rate of 10 μl per minute for ten minutes. MMP-9 at a concentration of 75 ng / μl was coupled to the activated surface at a flow rate of 10 μl per minute for ten minutes. The final surface was inactivated by passing 1 M ethanolamine-HCl over the sensor surface at a rate of 10 μl per minute for five minutes. CP was passed over the sensor surface at a flow rate of 20 μl per minute and at concentrations of 10, 25, and 50 nM. The binding isotherms were evaluated by simultaneously fitting the forward (k a ) and backward (k d ) rate constants to the following formula: d [CP ~ MMP-9] / dt = (k a [CP] [MMP-9]) - (k d [CP ~ MMP-9]) (2)

(Karlsson und Falt, 1997), worin [CP], [MMP-9] und [CP~MMP-9] die Konzentrationen der freien Chelat-bildenden Peptide, freien MMP-9 bzw. des Komplexes darstellen. Die Gleichgewichtsaffinitätskonstante (KA) ist definiert als: KA = ka/kd (3) (Karlsson and Falt, 1997), wherein [CP], [MMP-9] and [CP-MMP-9] represent the concentrations of free chelating peptides, free MMP-9 and the complex, respectively. The equilibrium affinity constant (K A ) is defined as: K A = k a / k d (3)

Gleichung 3 wird in Form des SPR Signals (Mortonet et al., 1995) ausgedrückt als: dR/dt = kaCRmax – (kaC + kd)R (4)worin R das SPR Signal (in Ausgabeeinheiten, "response units", RU) zu einer Zeit t ist, Rmax ist das Maximum der MMP-9 Bindungskapazität in RU, und C ist die Chelat-bildende Peptidkonzentration. Kinetische Analysen (O'Shannessy et al., 1993) wurden unter Verwendung von Origin von Microcal, Inc. durchgeführt.Equation 3 is expressed in terms of the SPR signal (Mortonet et al., 1995) as: dR / dt = k a CR Max - (k a C + k d ) R (4) where R is the SPR signal (in response units, RU) at a time t, R max is the maximum of the MMP-9 binding capacity in RU, and C is the chelating peptide concentration. Kinetic analyzes (O'Shannessy et al., 1993) were performed using Origin from Microcal, Inc.

BEISPIEL 6: Lebensfähigkeits-AssaysEXAMPLE 6: Viability assays

Die relative Toxizität der Chelat-bildenden Peptide und der Substratpeptide wurde mittels Verwendung des Hautmodells Epiderm, welches kommerziell von MatTek Corp. verfügbar ist, getestet. Die einzelnen Hautprobenbehälter wurden vor der Zugabe der Peptidkonstrukte für zwei Stunden in Kulturmedium bei 37°C unter 5% CO2 inkubiert. Die Probenbehälter wurden auf Platten mit 6 Vertiefungen mit frischem Medium übertragen. Alle Peptide wurden in PBS mit einer Endkonzentration von 10 mM gelöst, und jeweils 100 μl Peptidlösung wurden auf die Oberfläche der Epiderm-Probenbehälter pipettiert. Inkubation wurde für 12 Stunden bei 37°C unter 5% CO2 fortgesetzt. Nach der Inkubationszeit wurden die Probenbehälter dreimal mit PBS gewaschen und die Probenbehälter wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die 300 μl des MTT Assay Mediums pro Vertiefung (MTT Konzentration war 1 mg/ml) enthielt, übertragen. Der kolorimetrische Assay wurde während drei Stunden (Inkubation bei 37°C unter 5% CO2) entwickelt. Die Probenbehälter wurden dann auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die 2 ml Isopropanol pro Vertiefung enthielt, übertragen. Extraktion des farbigen Niederschlags trat über eine Zeitdauer von vier Stunden bei Raumtemperatur auf. Absorptionsmessungen wurden für jede Probe bei 570 nm und 650 nm abgelesen. Die prozentuale Lebensfähigkeit einer jeden Probe relativ zur PBS-Kontrolle wurde berechnet als: 100 × (OD570 sam – OD650 sam)/(OD570 con – OD650 con) (5) The relative toxicity of the chelating peptides and substrate peptides was assessed by using the skin model Epiderm, which was commercially available from MatTek Corp. is available, tested. The individual skin sample containers were incubated for 2 hours in culture medium at 37 ° C under 5% CO 2 prior to the addition of the peptide constructs. The sample containers were transferred to 6-well plates with fresh medium. All peptides were dissolved in PBS to a final concentration of 10 mM, and 100 μl each of peptide solution was pipetted onto the surface of the Epiderm sample containers. Incubation was continued for 12 hours at 37 ° C under 5% CO 2 . After the incubation period, the sample containers were washed three times with PBS and the sample containers were transferred to a 24-well plate containing 300 μl of the MTT assay medium per well (MTT concentration was 1 mg / ml). The colorimetric assay was developed for 3 hours (incubation at 37 ° C under 5% CO 2 ). The sample containers were then transferred to a 24-well plate containing 2 ml of isopropanol per well. Extraction of the colored precipitate occurred over a period of four hours at room temperature. Absorbance measurements were read for each sample at 570 nm and 650 nm. The percentage viability of each sample relative to the PBS control was calculated as: 100 × (OD 570 sam - OD 650 sam ) / (OD 570 con - OD 650 con ) (5)

Jede Peptidprobe wurde routinemäßig zweifach oder dreifach getestet.each Peptide sample became routinely duplicate or tested in triplicate.

BEISPIEL 7:EXAMPLE 7

Ein Haut-ähnliches Toxizitätsmodell (Epiderm) wurde eingesetzt, um die gesamte zelluläre Lebensfähigkeit in der Gegenwart der sechs Peptidkonstrukte zu messen. Eine einzelne Dosis von 10 mM Peptide (in PBS) wurde auf die Epiderm Proben über einen Zeitraum von 12 Stunden aufgetragen. Die resultierende Lebensfähigkeit ist in 7 gezeigt. Eine PBS-Kontrolle ist an einen Wert von 100 Prozent Lebensfähigkeit angepasst. Der oberflächenaktive Stoff Triton X-100 diente als Negativkontrolle, d.h. die Anwendung von einer 1%-igen Tritonlösung sollte zu einem Zelltod von über 90% der Zellen führen. Wie in 7 gesehen werden kann, zeigten alle sechs Peptide ungefähr 94,2 +/– 3,8 Prozent. AFTA, eines der drei Zink-Chelatbildner, scheint ein wenig mehr toxisch zu sein (90,5% Lebensfähigkeit) als IDA (94,8% Lebensfähigkeit) oder PSDE (96,5% Lebensfähigkeit), obwohl die Unterschiede in der Lebensfähigkeit nicht signifikant sind. SEQUENZPROTOKOLL

Figure 00270001
Figure 00280001
Figure 00290001
Figure 00300001
Figure 00310001
Figure 00320001
Figure 00330001
A skin-like toxicity model (epiderm) was used to measure total cellular viability in the presence of the six peptide constructs. A single dose of 10mM peptide (in PBS) was applied to the Epiderm samples over a period of 12 hours. The resulting viability is in 7 shown. A PBS control is adjusted to a value of 100 percent viability. The surfactant Triton X-100 served as a negative control, ie the use of a 1% Triton solution should lead to a cell death of more than 90% of the cells. As in 7 all six peptides showed approximately 94.2 +/- 3.8 percent. AFTA, one of the three zinc chelating agents, appears to be slightly more toxic (90.5% viability) than IDA (94.8% viability) or PSDE (96.5% viability), although differences in viability are not significant are. SEQUENCE LISTING
Figure 00270001
Figure 00280001
Figure 00290001
Figure 00300001
Figure 00310001
Figure 00320001
Figure 00330001

Claims (23)

Ein MMP Regulator umfassend einen Zink-Chelatbildner, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist.An MMP regulator comprising a zinc chelating agent, which is covalently bound to a TIMP-derived peptide. Der Regulator gemäß Anspruch 1, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, IDA, PSDE, AFTA, Zitronensäure, Salicylsäure und Hydroxybernsteinsäure.The regulator according to claim 1, wherein the zinc chelating agent is selected from the group consisting from EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, IDA, PSDE, AFTA, citric acid, salicylic acid and Malic acid. Der Regulator gemäß Anspruch 2, worin der Zink-Chelatbildner IDA, PSDE oder AFTA ist.The regulator according to claim 2, wherein the zinc chelating agent is IDA, PSDE or AFTA. Der Regulator gemäß Anspruch 1, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 9 und 10.The regulator according to claim 1, wherein the zinc chelating agent is selected from the group consisting from SEQ ID Nos. 9 and 10. Der Regulator gemäß Anspruch 1, worin das Peptid die SEQ ID Nr. 1–3 umfasst.The regulator according to claim 1, wherein the peptide comprises SEQ ID Nos. 1-3. Der Regulator gemäß Anspruch 4, worin das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 5, 6, 7, 8 und 11.The regulator according to claim 4, wherein the peptide is selected is selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 4, 5, 6, 7, 8 and 11. Der Regulator gemäß Anspruch 1, worin das Peptid mindestens einen Cysteinrest enthält.The regulator according to claim 1, wherein the peptide contains at least one cysteine residue. Die Verwendung eines MMP Regulators, umfassend einen Zink-Chelatbildner, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von chronischen oder akuten Wunden.The use of an MMP regulator comprising a Zinc chelator covalently attached to a TIMP-derived peptide is bound for the preparation of a pharmaceutical composition for treatment of chronic or acute wounds. Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, IDA, PSDE, AFTA, Zitronensäure, Salicylsäure und Hydroxybernsteinsäure.The use according to claim 8, wherein the zinc chelating agent selected is selected from the group consisting of EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, IDA, PSDE, AFTA, citric acid, salicylic acid and malic acid. Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Zink-Chelatbildner IDA, PSDE oder AFTA ist.The use according to claim 9, wherein the zinc chelating agent IDA, PSDE or AFTA. Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 9 und 10.The use according to claim 8, wherein the zinc chelating agent selected is selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 9 and 10. Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin das Peptid die SEQ ID Nr. 1–3 umfasst.The use according to claim 8, wherein the peptide SEQ ID Nos. 1-3 includes. Die Verwendung gemäß Anspruch 12, worin das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 5, 6, 7, 8 und 11.The use according to claim 12, wherein the peptide selected is selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 4, 5, 6, 7, 8 and 11. Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin das Peptid mindestens einen Cysteinrest enthält.The use according to claim 8, wherein the peptide contains at least one cysteine residue. Eine Zusammensetzung umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und einen MMP Regulator, worin der MMP Regulaator einen Zink-Chelatbildner umfasst, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist.A composition comprising a pharmaceutical acceptable carrier and an MMP regulator wherein the MMP regulator is a zinc chelator which is covalently linked to a TIMP-derived peptide is. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin die Zusammensetzung in topischer Form vorliegt.The composition of claim 15, wherein the composition present in topical form. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin die Zusammensetzung in Form einer Lotion, Salbe, Creme, Gel, Stift, Spray, Paste, Schaum, Lösung, Dispersion, Emulsion, fester Form und als Liposom vorliegt.The composition of claim 15, wherein the composition in the form of a lotion, ointment, cream, gel, pen, spray, paste, foam, Solution, Dispersion, emulsion, solid form and is present as a liposome. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, IDA, PSDE, AFTA, Zitronensäure, Salicylsäure und Hydroxybernsteinsäure.The composition of claim 15, wherein the zinc chelating agent selected is selected from the group consisting of EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, IDA, PSDE, AFTA, citric acid, Salicylic acid and Malic acid. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, worin der Zink-Chelatbildner IDA, PSDE oder AFTA ist.The composition of claim 18, wherein the zinc chelating agent IDA, PSDE or AFTA. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 9 und 10.The composition of claim 15, wherein the zinc chelating agent selected is selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 9 and 10. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin das Peptid die SEQ ID Nr. 1–3 umfasst.The composition of claim 15, wherein the peptide SEQ ID Nos. 1-3 includes. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 21, worin das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 5, 6, 7, 8 und 11.The composition of claim 21, wherein the peptide selected is selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 4, 5, 6, 7, 8 and 11. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin das Peptid mindestens einen Cysteinrest enthält.The composition of claim 15, wherein the peptide contains at least one cysteine residue.
DE60123833T 2000-12-29 2001-12-21 DESIGN AND USE OF IMPROVED ZINC CHELAT-MAKING PEPTIDES FOR REGULATING MATRIX METAL PROTEINASES Expired - Lifetime DE60123833T2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US753139 2000-12-29
US09/753,139 US7041787B2 (en) 2000-12-29 2000-12-29 Design and use of advanced zinc chelating peptides to regulate matrix metalloproteinases
PCT/US2001/049276 WO2002053173A2 (en) 2000-12-29 2001-12-21 Design and use of advanced zinc chelating peptides to regulate matrix metalloproteinases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60123833D1 DE60123833D1 (en) 2006-11-23
DE60123833T2 true DE60123833T2 (en) 2007-11-29

Family

ID=25029322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60123833T Expired - Lifetime DE60123833T2 (en) 2000-12-29 2001-12-21 DESIGN AND USE OF IMPROVED ZINC CHELAT-MAKING PEPTIDES FOR REGULATING MATRIX METAL PROTEINASES

Country Status (9)

Country Link
US (1) US7041787B2 (en)
EP (1) EP1348024B1 (en)
KR (1) KR100818874B1 (en)
AT (1) ATE342352T1 (en)
AU (1) AU2002231087A1 (en)
CA (1) CA2431853A1 (en)
DE (1) DE60123833T2 (en)
MX (1) MXPA03005903A (en)
WO (1) WO2002053173A2 (en)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6989139B2 (en) * 2000-02-15 2006-01-24 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Matrix metalloproteinase inhibitors
CA2492143A1 (en) * 2002-07-12 2004-01-22 Medarex, Inc. Methods and compositions for preventing oxidative degradation of proteins
US20100131051A1 (en) * 2008-11-24 2010-05-27 Medtronic Vascular, Inc. Systems and Methods for Treatment of Aneurysms Using Zinc Chelator(s)
US20100131001A1 (en) * 2008-11-24 2010-05-27 Medtronic Vascular, Inc. Targeted Drug Delivery for Aneurysm Treatment
WO2010070076A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Crystax Pharmaceuticals, S.L. Alkanoic acid derivatives and their therapeutic use as hdac inhibitors
KR101363455B1 (en) * 2011-09-09 2014-02-21 (주)케어젠 Peptides Inhibiting the Activity of Matrix Metalloproteases and Use Thereof
US9782457B2 (en) * 2011-10-07 2017-10-10 Tissue Repair Company Flowable formulations for tissue repair and regeneration
WO2015073538A2 (en) * 2013-11-12 2015-05-21 Echogen, Inc. Interaction with metalloenzymes
CN104710525B (en) * 2015-03-18 2020-08-04 浙江海洋学院 Tuna bone collagen source zinc chelated collagen peptide and preparation method and application thereof

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5622871A (en) 1987-04-27 1997-04-22 Unilever Patent Holdings B.V. Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents
CS249311B1 (en) 1983-09-29 1987-03-12 Jaroslava Turkova Proteolytic wound dressing
US4882760A (en) * 1983-12-02 1989-11-21 Yee Raymond M Sound reproduction system
GB2150833B (en) * 1983-12-08 1987-04-15 Ceskoslovenska Akademie Ved Proteolytic wounds dressing
US4999285A (en) 1984-11-15 1991-03-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Chromatographic cassette
US4868108A (en) 1985-12-12 1989-09-19 Hygeia Sciences, Incorporated Multiple-antibody detection of antigen
DE3606265A1 (en) * 1986-02-27 1987-09-03 Roehm Pharma Gmbh POLYSACCHARID-BASED Wound Dressing As a Carrier Therapeutically Effective, Non-Immobilized Enzymes and with High Absorbency
US5196196A (en) * 1986-06-03 1993-03-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Use of protease nexin-I in wound dressings
US5112608A (en) * 1987-03-13 1992-05-12 Incyte Pharmaceuticals Use of protease nexin-I to mediate wound healing
JP2609858B2 (en) 1987-02-27 1997-05-14 富士薬品工業 株式会社 Enzyme immunoassay for collagenase inhibitors
ES2050704T5 (en) 1987-04-27 2004-04-16 Inverness Medical Switzerland Gmbh IMMUNOENSAYS AND DEVICES FOR THEIR REALIZATION.
US4943522A (en) 1987-06-01 1990-07-24 Quidel Lateral flow, non-bibulous membrane assay protocols
CA1313616C (en) 1987-06-01 1993-02-16 Robert B. Sargeant Lateral flow, non-bibulous membrane protocols
US4956302A (en) 1987-09-11 1990-09-11 Abbott Laboratories Lateral flow chromatographic binding assay device
EP0306772B1 (en) 1987-09-11 1993-03-10 Abbott Laboratories Lateral flow chromatographic binding assay device
DK158336C (en) * 1987-09-22 1990-10-01 Coloplast As CONNECTOR MATERIALS FOR THE TREATMENT OF WOUNDS AND TEMPLES FOR USE IN MANUFACTURING THEREOF
US4876332A (en) * 1987-10-08 1989-10-24 Regents Of The Univeristy Of Minnesota Polypeptides with type IV collagen activity
US5275785A (en) 1987-10-30 1994-01-04 Unilever Patent Holdings B.V. Test device for detecting an analyte in a liquid sample
US5670381A (en) 1988-01-29 1997-09-23 Abbott Laboratories Devices for performing ion-capture binding assays
US5270447A (en) * 1988-05-20 1993-12-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Metalloproteinase peptides: role in diagnosis and therapy
US5280106A (en) * 1988-05-20 1994-01-18 Liotta Lance A Matrix metalloproteinase peptides: role in diagnosis and therapy
US4883760A (en) 1988-06-20 1989-11-28 Adi Diagnostics Inc. Device for performing enzyme immunoassays
US5037735A (en) 1988-06-24 1991-08-06 Microgenics Corporation Visual discrimination qualitative enzyme complementation assay
AU2684488A (en) 1988-06-27 1990-01-04 Carter-Wallace, Inc. Test device and method for colored particle immunoassay
US5188938A (en) 1988-12-29 1993-02-23 Microgenics Corporation Enzyme quantitation wicking assay
EP0460016B1 (en) 1989-02-27 1993-12-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Metastasis-associated collagenolytic metalloproteinases
AU634533B2 (en) * 1989-03-21 1993-02-25 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Matrix metalloproteinase inhibitor peptides
US5698671A (en) 1989-03-21 1997-12-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Metalloproteinase peptides
JPH02304365A (en) 1989-05-18 1990-12-18 Shionogi & Co Ltd Method for measuring elastase i
NO177716C (en) 1989-06-09 1995-11-08 Zeneca Ltd Method for Preparation of Therapeutically Active Polypeptides, DNA Sequence, Expression Vector and Antibody
US5252496A (en) 1989-12-18 1993-10-12 Princeton Biomeditech Corporation Carbon black immunochemical label
CZ277766B6 (en) 1990-01-04 1993-04-14 Vnii Textilno Biologically active material and process for preparing thereof
EP0513209A4 (en) 1990-01-26 1993-08-25 Us Commerce A method for quantitatively measuring collagenase
US5141850A (en) 1990-02-07 1992-08-25 Hygeia Sciences, Inc. Porous strip form assay device method
US5270168A (en) 1990-02-21 1993-12-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for diagnosing non-healing ulcers
US5169754A (en) * 1990-10-31 1992-12-08 Coulter Corporation Biodegradable particle coatings having a protein covalently immobilized by means of a crosslinking agent and processes for making same
JP3081638B2 (en) 1990-11-16 2000-08-28 富士薬品工業株式会社 Monoclonal antibody against human 72 kDa gelatinase and use thereof
GB2250993B (en) * 1990-11-21 1995-02-15 Inst Nat Sante Rech Med Stromelysin-3 and its application in the diagnosis and treatment of malignant breast cancer
US5484726A (en) * 1990-11-21 1996-01-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies specific for human stromelysin-3 and a method for detection of stromelysin-3
DE69229334T2 (en) 1991-01-11 1999-12-16 Quidel Corp ONE-STAGE CROSS-FLOW ANALYZING METHOD AND A NON-SUCTIONABLE CARRIER USED IN IT
JPH085920B2 (en) * 1991-01-21 1996-01-24 富士薬品工業株式会社 Anti-human stromlysin monoclonal antibody and enzyme immunoassay
JP3118015B2 (en) 1991-05-17 2000-12-18 アークレイ株式会社 Biosensor and separation and quantification method using the same
FR2678513B1 (en) * 1991-07-03 1995-06-30 Laboratoires Hygiene Dietetique HEALING DRESSING.
JP3076640B2 (en) 1991-07-26 2000-08-14 富士薬品工業株式会社 Immunoassay for human 92kDa gelatinase
US5804213A (en) * 1991-10-09 1998-09-08 Lectec Corporation Biologically active aqueous gel wound dressing
JP3135959B2 (en) 1991-12-12 2001-02-19 アークレイ株式会社 Biosensor and separation and quantification method using the same
JP3017591B2 (en) 1992-01-17 2000-03-13 富士薬品工業株式会社 Production method of anti-human TIMP-2 monoclonal antibody and use thereof
US5541069A (en) 1992-02-28 1996-07-30 Quidel Corporation Assay having improved dose response curve
DE69329377T2 (en) 1992-03-10 2001-04-05 Quidel Corp RELEASE AGENT FOR RED BLOOD CELLS IN EXAMINATIONS WITH SPECIFIC BINDING
US5324634A (en) 1992-03-31 1994-06-28 The Research Foundation Of State University Of New York Diagnostic tests measuring gelatinase/inhibitor complexes for detection of aggressive and metastatic cancer
US5516891A (en) * 1992-06-16 1996-05-14 Kinerton, Ltd. Liquid phase synthesis of peptides and peptide derivatives
DK88293A (en) 1992-08-03 1994-02-04 Becton Dickinson Co Solid Phase Analysis
US5734014A (en) 1992-08-11 1998-03-31 Tsumura & Co. Elafin derivative
US5354692A (en) 1992-09-08 1994-10-11 Pacific Biotech, Inc. Analyte detection device including a hydrophobic barrier for improved fluid flow
JP3098640B2 (en) 1992-12-24 2000-10-16 富士薬品工業株式会社 Immunoassay for human 72-kDa gelatinase / type IV collagenase
JP2673929B2 (en) 1993-04-12 1997-11-05 富士薬品工業株式会社 Immunological assay of human interstitial collagenase-inhibitor complex and its application to clinical diagnosis
IT1270951B (en) 1993-06-07 1997-05-26 Boehringer Mannheim Italia METHOD AND DEVICE FOR SIMULTAN DETECTION OF NEISSERIA GONORRHOEAE, CHLAMYDIA TRACHOMATIS AND MYCOPLASMA
US5415994A (en) 1993-08-02 1995-05-16 Quidel Corporation Lateral flow medical diagnostic assay device with sample extraction means
JPH07159402A (en) 1993-12-09 1995-06-23 Kyodo Nyugyo Kk Iv type collagenase measuring method
GB9405076D0 (en) * 1994-03-16 1994-04-27 Inst Of Ophtalmology A medical use of matrix metalloproteinase inhibitors
US5641636A (en) 1994-05-20 1997-06-24 University Of Pennsylvania Method of predicting fetal membrane rupture based on matrix metalloproteinase-9 activity
GB9414303D0 (en) * 1994-07-15 1994-09-07 C V Lab Ltd Alginate fibres, method of preparation and use
JPH10508343A (en) 1994-07-28 1998-08-18 ポール・コーポレーション Fibrous web and method for producing the same
FI98961C (en) 1994-08-26 1997-09-10 Medix Biochemica Ab Oy Procedure and test means for diagnosing periodontal disease activity and / or peri-implantitis and / or increased risk thereof
US5605809A (en) * 1994-10-28 1997-02-25 Oncoimmunin, Inc. Compositions for the detection of proteases in biological samples and methods of use thereof
JPH08136548A (en) 1994-11-11 1996-05-31 Morinaga & Co Ltd Diagnostic method for urinary organ cancer
US5916521A (en) 1995-01-04 1999-06-29 Spectral Diagnostics, Inc. Lateral flow filter devices for separation of body fluids from particulate materials
JP2742886B2 (en) 1995-01-20 1998-04-22 富士薬品工業株式会社 Immunoassay for neutrophil collagenase
US5569608A (en) 1995-01-30 1996-10-29 Bayer Corporation Quantitative detection of analytes on immunochromatographic strips
JP2949467B2 (en) 1995-02-16 1999-09-13 富士薬品工業株式会社 Determination of human promatrix metalloprotease 7 by immunoassay
JP2864219B2 (en) 1995-02-20 1999-03-03 富士薬品工業株式会社 Fractional determination of free active matrix metalloproteases
US5712172A (en) 1995-05-18 1998-01-27 Wyntek Diagnostics, Inc. One step immunochromatographic device and method of use
US5830468A (en) * 1995-05-17 1998-11-03 The New York Blood Center, Inc. Fibrin(ogen) degradation by fibrinolytic matrix metalloproteinase
US6020181A (en) * 1995-05-17 2000-02-01 New York Blood, Inc. Inhibition of thrombus formation by medical related apparatus comprising treating with fibrinolytic matrix metalloproteinase
US5770691A (en) 1995-06-05 1998-06-23 Regents Of The University Of Minnesota Discriminatory substrates for MMP hydrolysis
US5935796A (en) * 1995-06-30 1999-08-10 The University Of Melbourne Diagnostic methods and compositions relating to the proteoglycan proteins of cartilage breakdown
WO1997004080A1 (en) * 1995-07-14 1997-02-06 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Novel protein and monoclonal antibody specific thereto
JPH0987299A (en) 1995-07-14 1997-03-31 Fuji Yakuhin Kogyo Kk Monoclonal antibody specific to mmp-2 activation factor
IT1277904B1 (en) 1995-08-07 1997-11-12 Polifarma Spa METHOD FOR DETERMINING THE THERAPEUTIC ACTIVITY OF METALLOPROTEINASE INHIBITOR COMPOUNDS, NEW INHIBITOR COMPOUNDS, AND THEIR USE
US5952236A (en) 1995-10-26 1999-09-14 Thompson; Richard B. Enzyme-based fluorescence biosensor for chemical analysis
US5741659A (en) 1996-01-04 1998-04-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Rapid microbial protease assay
DE69725901T2 (en) 1996-01-04 2004-09-09 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno METHOD FOR DETERMINING PROTEOLYTIC ENZYMES USING FLUORESCENCE-EXTINGUISHED SUBSTRATES
JPH09206099A (en) 1996-01-31 1997-08-12 Sekisui Chem Co Ltd Cell function assay
ATE239092T1 (en) 1996-02-29 2003-05-15 Fuji Photo Film Co Ltd METHOD FOR ANALYZING PROTEASES AND THIN MEMBRANE FOR USE IN THIS METHOD
US5876944A (en) 1996-06-10 1999-03-02 Bayer Corporation Method for amplification of the response signal in a sandwich immunoassay
US6022948A (en) 1996-09-17 2000-02-08 Washington University Method of cell surface activation and inhibition
US5798273A (en) 1996-09-25 1998-08-25 Becton Dickinson And Company Direct read lateral flow assay for small analytes
EP0937257B1 (en) 1996-10-25 2004-12-29 Idexx Laboratories, Inc. Immunoassay device employing housing which can be separated in two parts
US5710005A (en) 1996-10-29 1998-01-20 Biocode, Inc. Analyte detection with a gradient lateral flow device
US6194221B1 (en) 1996-11-19 2001-02-27 Wyntek Diagnostics, Inc. Hybrid one-step immunochromatographic device and method of use
US6025150A (en) * 1996-11-21 2000-02-15 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for wound healing
US5922550A (en) 1996-12-18 1999-07-13 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Biosensing devices which produce diffraction images
DE19701141C1 (en) * 1997-01-16 1998-04-09 Hoechst Ag Gene construct for treatment of disease involving protease, particularly tumours and inflammation
US5879951A (en) 1997-01-29 1999-03-09 Smithkline Diagnostics, Inc. Opposable-element assay device employing unidirectional flow
GB2322192B (en) 1997-02-14 2001-01-31 Unilever Plc Assay devices
US6037137A (en) * 1997-02-20 2000-03-14 Oncoimmunin, Inc. Fluorogenic peptides for the detection of protease activity
US6294344B1 (en) 1997-03-19 2001-09-25 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods for the early diagnosis of ovarian cancer
US6180288B1 (en) 1997-03-21 2001-01-30 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Gel sensors and method of use thereof
JPH10287700A (en) 1997-04-10 1998-10-27 Fuji Yakuhin Kogyo Kk Antibody against active type matrilysin (mmp-7) and immunoassay using the same
JPH10313896A (en) 1997-05-15 1998-12-02 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd New synthetic substrate for measurement of activity having chromophore of fluorophore to matrix metalloprotease
US6258548B1 (en) 1997-06-05 2001-07-10 A-Fem Medical Corporation Single or multiple analyte semi-quantitative/quantitative rapid diagnostic lateral flow test system for large molecules
US5895765A (en) 1997-06-30 1999-04-20 Bayer Corporation Method for the detection of an analyte by immunochromatography
US5985675A (en) 1997-12-31 1999-11-16 Charm Sciences, Inc. Test device for detection of an analyte
US5876332A (en) * 1997-07-24 1999-03-02 Genzyme Corporation Surgical support member
US6043087A (en) * 1997-07-25 2000-03-28 The New York Blood Center Monospecific antibody reactive with matrix metalloproteinase cleavage products of fibrin(ogen)
JPH1183858A (en) 1997-09-12 1999-03-26 Oriental Yeast Co Ltd Mmp-9 related new tumor specific antigen
US6060256A (en) 1997-12-16 2000-05-09 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Optical diffraction biosensor
JPH11318449A (en) 1998-03-10 1999-11-24 Fuji Chem Ind Ltd Antibody against stromelysin-2 (mmp-10)
FI980604A0 (en) * 1998-03-18 1998-03-18 Univ Helsinki Licensing New matrix metalloprotein inhibitors and regulators
US6183972B1 (en) 1998-07-27 2001-02-06 Bayer Corporation Method for the determination of analyte concentration in a lateral flow sandwich immunoassay exhibiting high-dose hook effect
US6143506A (en) 1998-08-13 2000-11-07 The Research Foundation Of State Of Ny Diagnostic method for detection of periodontitis or peri-implantitis
US6136610A (en) 1998-11-23 2000-10-24 Praxsys Biosystems, Inc. Method and apparatus for performing a lateral flow assay
US6203757B1 (en) 1998-12-02 2001-03-20 Bionike, Inc. Fluid sample distriution system for test device
US6221579B1 (en) 1998-12-11 2001-04-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Patterned binding of functionalized microspheres for optical diffraction-based biosensors
US6297020B1 (en) 1999-03-01 2001-10-02 Bayer Corporation Device for carrying out lateral-flow assays involving more than one analyte

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002053173A3 (en) 2003-04-10
EP1348024B1 (en) 2006-10-11
EP1348024A2 (en) 2003-10-01
US20030073808A1 (en) 2003-04-17
US7041787B2 (en) 2006-05-09
MXPA03005903A (en) 2003-09-10
AU2002231087A1 (en) 2002-07-16
KR100818874B1 (en) 2008-04-01
ATE342352T1 (en) 2006-11-15
WO2002053173A2 (en) 2002-07-11
KR20030064885A (en) 2003-08-02
DE60123833D1 (en) 2006-11-23
CA2431853A1 (en) 2002-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69233474T2 (en) Pharmaceutical composition containing S-nitrosoimmunoglobulins and use thereof
DE60312309T3 (en) USE OF BOTULINUM TOXIN TO TREAT HEART AND CIRCULAR DISEASES
DE69434448T2 (en) POLYMER PEPTIDE CONJUGATE
EP1003786B1 (en) Peptide with radio protective effect
US20040101580A1 (en) Peptide extract of lupine and pharmaceutical or cosmetic or nutritional composition comprising the same
DD232498A5 (en) PROCESS FOR THE PRODUCTION OF DESULFATOHIRUDINES
DE60131464T2 (en) USE OF RHEIN OR ITS DERIVATIVES AS MATRIX METALLOPROTEINASE INHIBITORS
WO1986003493A1 (en) Hirudin-pa and derivatives thereof, process for the production a nd utilization thereof
DE69909076T2 (en) NEW INHIBITORS AND REGULATORY SUBSTANCES FOR MATRIX METALLOPROTEINASES
DE60123833T2 (en) DESIGN AND USE OF IMPROVED ZINC CHELAT-MAKING PEPTIDES FOR REGULATING MATRIX METAL PROTEINASES
EP1272223A1 (en) Therapeutic and diagnostic ligand systems comprising transport molecule binding properties and medicaments containing the same
WO2001058446A1 (en) Use of compatible solutes as inhibitors of the enzymatic decomposition of macromolecular biopolymers
DE3230275A1 (en) ELASTAS INHIBITORS, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND THE MEDICINAL PRODUCTS CONTAINING THEM
DE69627191T2 (en) BRADIKININE ANALOGS AS SELECTIVE THROMBINE INHIBITORS
EP1601686A1 (en) Protein-binding doxorubicin peptide derivatives
EP2046813B1 (en) Protein-binding methotrexate derivatives, and medicaments containing the same
EP0501215B1 (en) Fusion proteins with monoclonal antibody, Linker and beta Glucuronidase for prodrug activation; preparation and use thereof
DE69835832T2 (en) COMPOSITIONS AND METHODS OF REGULATING PHAGOCYTOSIS AND ICAM-1 EXPRESSION
DE69835426T2 (en) ACTIVATION OF PEPTIDES
EP1040190B1 (en) Serine proteinase inhibitors
DE69737202T2 (en) THROMBOLYTIC SUBSTANCES WITH ANTITROMOMOTIC ACTIVITY
EP1466614A1 (en) Polypeptide, the conjugate thereof containing doxorubicine and a pharmaceutical composition based thereon
DE2900926C2 (en)
CN102846657A (en) Divalent cation/talc containing compositions and methods for treating and/or preventing enzymatic irritation
EP0373335B1 (en) Serine protease inhibitor proteins, medicaments containing them, DNA sequences coding for these proteins and methods for producing these proteins, medicaments and DNA sequences

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: ZIMMERMANN & PARTNER, 80331 MUENCHEN