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Technisches Gebiet
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zum Aufhalten von Zellwachstum,
die in der Krebsbehandlung und -therapie einsetzbar sind.
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Hintergrund des Stands der Technik
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Krebs
ist eine wesentliche tödliche
Erkrankung für
den Menschen und wird durch physiologisch unkontrollierte Zellproliferation
verursacht, die die normalen physiologischen Zustände des
menschlichen Körpers
beeinträchtigt,
was zu schweren pathologischen Reaktionen führt, die häufig zum Tod führen. Obwohl
enorme Bemühungen
zu Krebsstudien und -behandlungen unternommen wurden, ist Krebs derzeit
noch die Haupttodesursache des Menschen. Es gibt mehrere Ansätze zur
Behandlung von Krebspatienten, einschließlich Operation, Strahlentherapie
und Chemotherapie. Da durch die ersten zwei Verfahren Krebszellen
im Patienten nicht vollständig eliminiert
werden können,
wird das letztere Verfahren gewöhnlich
angewendet, um das Krebszellwachstum mit oder ohne andere Behandlungen
zu kontrollieren. In Patienten verwendete Antikrebsverbindungen
zielen häufig
auf die Prävention
von Krebszellproliferation ab oder töten sich teilende Zellen ab.
Wenn die Verbindungen für
Krebszellen toxisch sind, können sie
auch normale, sich teilende Zellen, die für das menschliche Leben unerlässlich sind,
schwer beeinträchtigen.
Daher besteht eine der Hauptrichtungen in Krebsstudien darin, Verfahren
zu finden, die Krebszellen spezifisch hemmen oder abtöten, ohne
die normale Zellproliferation zu beeinträchtigen. Es besteht nun ein
Bedarf für
eine derartige Behandlung für
Krebspatienten.
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ErbBs
sind Klasse eins Rezeptor-Protein-Tyrosinkinasen. ErbB-vermittelte
Zellsignalwirkung spielt eine entscheidende Rolle bei der Embryoentwicklung
und der Organfunktion des Erwachsenen. Auf zellulärer Ebene
wurde gezeigt, dass ErbB-Rezeptoren
Signale für
die Zellproliferation, -differenzierung, -migration und Reorganisation
der Zellstruktur vermitteln. Es gibt vier strukturell ähnliche
ErbB-Mitglieder,
ErbB-1, ErbB-2, ErbB-3 und ErbB-4. Der epidermale Wachstumsfaktor
(EGF) ist einer von mehreren Liganden, die ErbB-1 binden. ErbB-3
oder ErbB-4 binden auch mehrere Liganden, einschließlich Neuregulin-1
(NRG-1). Bisher wurde kein Ligand für ErbB-2 identifiziert. Jedoch
dient ErbB-2 als Heterodimerpartner für ErbB-3, ErbB-4 oder ErbB-1
und ist entscheidend an der NRG-1-aktivierten Zellsignalwirkung
beteiligt.
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In-vivo-Studien
unter Verwendung von Gene-Targeting (gezielte Genmodifizierung)-Experimenten
zeigen, dass Entwicklungsschäden,
die aus der Inaktivierung von ErbB-2 resultieren, ähnlich denen
sind, die in NRG-1-inaktivierten Tieren beobachtet werden. Beide
Tiere zeigen Schäden
bei der Entwicklung der neuralen kranialen Ganglien und Herztrabekel.
Weiterhin zeigen ErbB-3- oder ErbB-4-Gen-inaktivierte Mäuse ähnliche oder überlappende
Phänotypen
zu NRG-1- oder ErbB-2-Knockout-Mäusen.
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Neben
seiner Rolle bei der Entwicklung wird das menschliche ErbB-2-Gen
häufig
amplifiziert und sein kodiertes Protein wird in einer Vielfalt von menschlichen
Karzinomen überexprimiert.
In der frühen
Forschung zu ErbB-2 wurde entdeckt, dass eine onkogene Punktmutation
zur Bildung von ErbB-2-Homodimeren führte, die wiederum eine erhebliche Phosphorylierung
der Tyrosinreste an der intrazellulären Domäne verursachte. Während in
ErbB-2 überexprimierenden
menschlichen Karzinomen keine entsprechende Punktmutation gefunden
wurde, führt die
Upregulation von ErbB-2 zur Bildung von Homodimeren, die wiederum
die Tyrosin-Phosphorylierung seiner
intrazellulären
Domäne
erhöht.
Von diesem Prozess wird angenommen, dass er der Beginn einer Signalkaskade
ist, die die Zelltransformation und/oder das Zellwachstum initiiert,
und somit Tumorgenese auslöst.
Es gibt jedoch Hinweise, die der Hypothese, dass ErbB-2-Homodimere
für die
Initiation der Tumorgenese verantwortlich sind, widersprechen: i)
einige ErbB-2-Mutanten, die für
eine verstärkte
Dimerisierung und Selbstphosphorylierung modifiziert werden, haben
keinen Effekt auf die Zelltransformation; ii) Antikörper, die
zur extrazellulären Domäne von ErbB-2
binden und vermutlich die Homodimerisierung fördern, führen zur Wachstumspromotion
von ErbB-2 exprimierenden Krebszellen, während andere das Krebszellwachstum
inhibieren. Diese Angaben zeigen, dass die Homodimerisierung von
ErbB-2 für
die Zellwachstumspromotion oder Zelltransformation unzureichend
ist und andere Voraussetzungen, die möglicherweise spezifische Dimerorientierung
oder -konformation einschließen,
erforderlich sind.
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ErbB-2
fungiert als Heterodimerpartner für die ligandbindenden ErbB-3-
oder ErbB-4-Rezeptoren. Es wurde ermittelt, dass der Ligand, NRG-1, zwei
unabhängige
Rezeptorbindungsstellen hat: eine, die eine hohe Affinität für ErbB-3
oder ErbB-4 hat und die andere, die eine niedrige, doch unspezifische Affinität für alle ErbB-Mitglieder hat. Somit
würde die Exposition
von NRG-1 gegenüber
Zellen, die ErbB-3/4
und ErbB-2 exprimieren, zu Heterodimeren von ErbB-2 und ErbB-3/4
führen.
Bei Abwesenheit des Liganden ist jedoch unklar, ob ErbB-2 eine Affinität zu anderen
ErbB-Rezeptoren hat, und es ist möglich, dass eine derartige
Wechselwirkung an der Initiation von Krebs beteiligt sein könnte. Unter
allen ErbB-Rezeptoren ist ErbB-3 einzigartig, da: i) ErbB-2 bevorzugt
Heterodimere mit ErbB-3 bildet; ii) Cotransfektion von NIH3T3-Zellen
mit ErbB-2 und ErbB-3 zu viel höheren
Graden der Zelltransformation führt
als die der Transfektion mit ErbB-2 allein; iii) in mit ErbB-2-Überexpression
assoziierten Brustkrebszellen ErbB-3 auch hoch exprimiert wird;
iv) ErbB-3 auch in ErbB-2 überexprimierenden
Tumorzellen von ErbB-2-transgenen
Mäusen überexprimiert
wird.
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Klapper
et al. ('A subclass
of tumor-Inhibitory monoclonal antibodies to ErbB2/HER2 blocks crosstalk
with growth factor receptors' ONCOGENE
vol. (Bd.) 14, no. (Nr.) 17, 1997, Seiten 2099–2109) offenbaren die Erzeugung
einer großen
Reihe von monoklonalen Antikörpern
(mAbs) für
ErbB-2. Es wurde gefunden, dass die meisten Antikörper die
Tyrosin-Phosphorylierung von ErbB-2 stimulieren.
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Pinkas-Kramarski
et al. ('The oncogenic ErbB2/ErbB3
heterodimer is a surrogate receptor of the epidermal growth factor
and betacellulin' ONCOGENE
vol. (Bd.) 16, 1998, Seiten 1249–1258) offenbaren, dass der
epidermale Wachstumsfaktor bei hohen Konzentrationen Zellwachstum
und -differenzierung bei Abwesenheit von ErbB-1 induzieren kann. Die
Veröffentlichung
schlägt
auch Kooperativität
zwischen ErbB-3 und ErbB-2 vor.
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Gegenstand
von
WO 97/35885 sind
Antikörper,
die zum ErbB-3-Protein binden, um:
die Heregulin-induzierte
Bildung eines ErbB2-ErbB3-Proteinkomplexes in einer Zelle, die ErbB2
und ErbB3 exprimiert, zu verringern;
die Bindungsaffinität von Heregulin
für das ErbB3-Protein
und
das Merkmal der Reduzierung der Heregulin-induzierten ErbB2-Aktivierung
in einer Zelle, die ErbB2 und ErbB3 exprimiert, zu verstärken.
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Drebin
J. A. et al. ('Monoclonal
antibodies reactive with distinct domains of the neu oncogene-encoded
p185 molecule excert synergistic anti-tumor effects in vivo' ONCOGENE vol. (Bd.)
2, 1988, Seiten 273–277,
XP008064827) untersuchen den Effekt der Verabreichung von p185-spezifischem
monoklonalem Antikörper
während
des tumorerzeugenden Wachstums von neu-transformierten NIH3T3-Zellen, die
in nackte Mäuse
implantiert wurden.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten die Rolle von ErbBs
und ihre Wechselwirkung beim Zellwachstum und bei der Zellinhibierung. Es
ist wichtig, dass gefunden wurde, dass die Bildung von Homo- und
Heterodimer von ErbBs eine Rolle bei der Zellproliferation, insbesondere
bei Krebszellen, spielen kann.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise gefunden,
dass die ErbB-2-Expression zur Inhibierung von onkogener Ras-vermittelter
Zelltransformation führt.
Weiterhin haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden,
dass die Bildung eines ErbB-2/ErbB-3-Heterodimers zur Stimulierung
des Zellwachstums, insbesondere bei Krebszellen, führt.
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In
einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung
zum Aufhalten oder Inhibieren von Zellwachstum bereit, die ein Mittel
umfasst, das die Bildung des ErbB-2/ErbB-3-Heterodimers in einer
Zelle verhindert oder verringert, worin das Mittel eine Kombination
eines Anti-ErbB-2-(extrazelluläre-Domäne)-Antikörpers und eines
Anti-ErbB-3-Antikörpers
ist.
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Bevorzugt
ist die Zelle eine Krebszelle, bevorzugter eine menschliche Brustkrebszelle.
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Ein
Weg der Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Behandlung der Zelle mit einem geeigneten Mittel. Bevorzugt
ist das Mittel aus Molekülen
ausgewählt,
die ErbB-2 oder ErbB-3 binden und die Bildung des ErbB-2/ErbB-3-Heterodimers
oder Konformationen hemmen, unterbrechen oder stören, was zur Inhibierung des
Zellwachstums führt.
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In
einer bevorzugten Form ist das Mittel eine Kombination aus einem
Anti-ErbB-2-(extrazelluläre-Domäne)-Antikörper und
einem Anti-ErbB-3-Antikörper.
Es wurde gefunden, dass eine derartige Kombination einen additiven
oder synergistischen Effekt des Aufhaltens, Inhibierens oder Unterdrückens des Zellwachstums
erzeugt.
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Es
wurde gefunden, dass eine Kombination aus dem Anti-ErbB-2-Antikörper N12
und dem Anti-ErbB-3-Antikörper
H3.105.5 für
die vorliegende Erfindung besonders geeignet ist.
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Die
ErbB-2-Dimerisierung kann durch mehrere Vermittler verursacht werden,
beispielsweise ein hoher Grad an ErbB-2-Expression, Antikörper, die zur
ErbB-2-extrazellulären Domäne binden. ErbB-2-aktivierter
Arrest des Zellwachstums kann die onkogene Ras-aktivierte Zelltransformation
ausschalten, was eine therapeutische Verwendung der ErbB-2-Dimerisierung
nahelegt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden,
dass ErbB-2 tatsächlich
mit anderen ErbB-Mitgliedern, wie zum Beispiel ErbB-3, wechselwirkt.
Weiterhin wurde gefunden, dass die Bildung des ErbB-2/ErbB-3-Komplexes
unabhängig
von der Liganden (Neuregulin 1)-Stimulierung
ist. Durch die Gegenwart von ErbB-3 in ErbB-2 exprimierenden Zellen
gelang die ausreichende Hemmung des ErbB-2-Homodimer-aktivierten
Arrests des Zellwachstums. In der Tat wird ErbB-3 gewöhnlich in
ErbB-2 exprimierenden Krebszellen exprimiert, was das Krebszellwachstum
ermöglicht.
Diese Entdeckung zeigt, dass Moleküle, die die Wechselwirkung
zwischen ErbB-2 und anderen Membranproteinen hemmen können, die
ErbB-2-Homodimerisierung unterstützen
oder erhöhen
werden. Da natives ErbB-2 die in Krebszellen überexprimierte Hauptform ist,
ermöglicht
diese Entdeckung die Entwicklung neuer Verfahren zur Behandlung
von Krebspatienten, die ErbB-2 exprimierende Krebszellen tragen.
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In
einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren
zum Aufhalten oder Inhibieren von Zellwachstum bereit, das das Inkontaktbringen
einer Zelle mit einer Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben,
umfasst.
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Bevorzugt
ist die Zelle eine Krebszelle, bevorzugter eine menschliche Brustkrebszelle.
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Bevorzugt
schließt
die Krebstherapie die Verabreichung eines oder mehrerer Mittel ein,
die zur Verhinderung oder Verringerung der Bildung des ErbB-2/ErbB-3-Heterodimers in der
Krebszelle geeignet sind, ohne wesentliche negative Auswirkungen
auf normale Zellen im Patienten zu verursachen. Das eine oder mehrere
Mittel können
durch Verhindern oder Verringern der Wechselwirkung von ErbB-2 mit
ErbB-3 in Krebszellen wirken.
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Bevorzugt
ist das Mittel aus Molekülen
ausgewählt,
die ErbB-2 oder ErbB-3 binden und die Bildung des ErbB-2/ErbB-3-Heterodimers
oder Konformationen hemmen, untErbBechen oder stören, was zur Inhibierung des
Zellwachstums führt.
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In
einer bevorzugten Form ist das Mittel eine Kombination aus einem
Anti-ErbB-2-(extrazelluläre-Domäne)-Antikörper und
einem Anti-ErbB-3-Antikörper.
Es wurde gefunden, dass eine derartige Kombination einen additiven
oder synergistischen Effekt beim Aufhalten, Inhibieren oder Unterdrücken des Zellwachstums
erzeugt.
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Es
wurde gefunden, dass eine Kombination aus dem Anti-ErbB-2-Antikörper N12
und dem Anti-ErbB-3-Antikörper
H3.105.5 für
die vorliegende Erfindung besonders geeignet ist.
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Es
wird jedoch eingesehen werden, dass andere Antikörper, die die Bildung des ErbB-2/ErbB-3-Heterodimers
in einer Zelle verhindern oder verringern, geeignete Kandidaten
für die vorliegende
Erfindung sein würden.
Für die
klinische Verwendung am Menschen würden humanisierte Antikörper geeigneter
sein, sodass Komplikationen durch die Therapie minimiert werden.
Techniken zur Entwicklung derartiger Antikörper sind gut bekannt und könnten zur
Entwicklung von geeigneten Mitteln angewendet werden, die die Bildung
des ErbB-2/ErbB-3-Heterodimers oder Konformationen in Zellen hemmen,
untErbBechen oder stören,
um das Zellwachstum aufzuhalten oder zu inhibieren.
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Bevorzugt
ist das Mittel eine oder mehrere der Verbindungen, die einen hohen
Grad der ErbB-2-Expression in einer Krebszelle verursachen, Verbindungen,
die zur ErbB-2-extrazellulären
Domäne
binden, wie zum Beispiel Antikörper
und andere Liganden, und Verbindungen, die die ErbB-3-Expression
in einer Zelle verhindern oder verringern oder die die Wechselwirkung
von ErbB-3 mit ErbB-2 in einer Zelle verhindern. Andere Mittel schließen DNA-Expressionskonstrukte
ein, die cDNAs enthalten, die Proteine/Peptide kodieren, die die
ErbB-2-Homodimerisierung vermitteln oder erhöhen oder die Wechselwirkung
zwischen ErbB-2 und anderen ErbB-Mitgliedern, wie zum Beispiel ErbB-3,
verhindern oder verringern können.
Diese Verbindungen können
Anti-ErbB-2- oder Anti-ErbB-3-Antikörper sein. Die DNA-Konstrukte
können
durch Gentherapieverfahren zugeführt
werden, die DNA-Transfektion,
Infektion mit Viren, die die cDNAs tragen, oder andere DNA-Zuführungsverfahren
oder -systeme einschließen.
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In
einem dritten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung in der Verwendung
eines Mittels zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von ErbB-2 überexprimierendem
Krebs, worin das Mittel eine Kombination aus Anti-ErbB-2-(extrazelluläre-Domäne)-Antikörper und
einem Anti-ErbB-3-Antikörper
ist.
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In
dieser gesamten Patentschrift, soweit es der Kontext nicht anderweitig
verlangt, wird das Wort „umfassen" oder Variationen,
wie zum Beispiel „umfasst" oder „umfassend", so verstanden werden,
dass es den Einschluss eines angegebenen Elements, einer angegebenen
ganzen Zahl oder eines angegebenen Schritts, oder von Gruppenelementen,
ganzen Zahlen oder Schritten, doch nicht den Ausschluss irgendeines
anderen Elements, irgendeiner anderen ganzen Zahl oder irgendeines
anderen Schritts, oder irgendeiner anderen Gruppe von Elementen,
jedweder anderer ganzer Zahlen oder Schritte beinhaltet.
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Damit
die vorliegende Erfindung deutlicher verstanden werden kann, werden
bevorzugte Formen unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen
beschrieben werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1. ErbB-2 wechselwirkt mit ErbB-3 in ErbB-2/ErbB-3-cotransfizierten
NIH3T3-Zellen bei Abwesenheit von NRG-1. NIH3T3-Zellen wurden mit ErbB-2,
ErbB-3 oder ErbB-2 mit ErbB-3 transient transfiziert. Nach 48 Stunden
wurde eine cotransfizierte Probe mit Neuregulin 1 (NRG-1) (50 nM)
für 10 min
behandelt. Die Zellen wurden lysiert und die Rezeptoren mit Anti-ErbB-2- oder Anti-ErbB-3-Antikörpern immunpräzipitiert.
Die Präzipitate
wurden durch 8% PAGE aufgetrennt und durch Western-Blot analysiert.
- a) (oberes Feld). Western-Blot-Analyse mit
Anti-Phosphotyrosin-Antikörper.
Es ist zu beachten, dass ErbB-2-Rezeptoren in ErbB-2-transfizierten Zellen
phosphoryliert wurden und NRG-1 den Phosphorylierungsgrad der Rezeptoren
in ErbB-2/3-cotransfizierten Zellen erhöhte.
- a) (mittleres Feld) Western-Blot-Analyse mit Anti-ErbB-2-Antikörper. ErbB-2-Rezeptoren wurden in
Zellen nachgewiesen, die einzig mit ErbB-2 transfiziert und mit
ErbB-2 mit ErbB-3 cotransfiziert waren. NRG-1 erhöhte auch
die Wechselwirkung von ErbB-2 und ErbB-3.
- a) (unteres Feld) Western-Blot-Analyse mit Anti-ErbB-3-Antikörper. Außer bei
den ErbB-2-transfizierten Zellen zeigten alle anderen Proben eine ErbB-3-Hauptbande
(165 kDa).
- b) ErbB-2/3-cotransfizierte Zellen wurden mit Anti-ErbB-2-Antikörper und
Phosphotyrosin immunpräzipitiert.
ErbB-3 und ErbB-2 wurden durch Western-Blot (vom oberen zum unteren
Feld) nachgewiesen. Es ist zu beachten, dass NRG-1 den Tyrosin-Phosphorylierungsgrad
und die Wechselwirkung von ErbB-2 und ErbB-3 erhöhte. Somit werden ErbB-2/ErbB-3-Wechselwirkungen durch
dieses Coimmunpräzipitationsexperiment gezeigt.
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2. ErbB-2 und ErbB-3 bilden Heterodimere
ErbB-2- und ErbB-3-cotransfizierten NIH3T3-Zellen
und die durch Cross-Linking-Experimente identifizierten Heterodimere.
- a) ErbB-2-, ErbB-3- oder ErbB-2/3-cotransfizierte Zellen
wurden für
12 h unter Serummangel gehalten. Die Kontrollzellen wurden für 10 min
mit HRG b1 stimuliert. Das Cross-Linking (Quervernetzung) wurde
mit BS3-Reagenz für
30 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Zellen wurden lysiert
und mit Anti-ErbB-2- oder Anti-ErbB-3-Antikörpern immunpräzipitiert
und die Präzipitate
4% PAGE und einer Western-Blot-Analyse mit Anti-ErbB-2-Antikörper (oberes
Feld), Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (mittleres
Feld) und Anti-ErbB-3-Antikörper
(unteres Feld) unterzogen. Die Position der Dimere und Monomere
sind gezeigt. Es ist zu beachten, dass NGR-1 eine Bandenverschiebung
für das
Heterodimer verursacht, doch das Bandenmuster des Homodimers nicht beeinflusste.
- b) Ein ähnlicher
Cross-Linking-Assay von ErbB-2- und ErbB-3-cotransfizierten Zellen,
die nicht unter Serummangel gehalten wurden. Wie vorstehend sind
die Dimere und Monomere angezeigt: es ist zu beachten, dass bei
dem Dimer eine ähnliche Bandenverschiebung
als Antwort auf die NRG-1-Stimulierung auftritt.
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3.
Die ErbB-2- und ErbB-3-Heterodimere werden in menschlichen Brustkrebszellen
bei Abwesenheit des Liganden, Neuregulin-1, identifiziert. MDA-MB-453-, BT-474-
und SK-BR-3-Zellen wurden unter Serummangel in serumfreiem Medium für 24 h gehalten
und dann mit NRG-1 stimuliert. Die Zellen wurden lysiert und mit
Anti-ErbB-3-Antikörper immunpräzipitiert.
Die Präzipitate
wurden dann durch 8% SDS-PAGE aufgetrennt und einer Western-Blot-Analyse
mit Anti-ErbB-2-Antikörper (oberes Feld),
Anti-Phosphotyrosin-Antikörper
(mittleres Feld) und Anti-ErbB-3-Antikörper (unteres
Feld) unterzogen. In allen Zelllinien coimmunpräzipitierten die ErbB-2-Rezeptoren
mit dem Anti-ErbB-3-Antikörper. NRG-1
erhöhte
die Wechselwirkung von ErbB-2- und ErbB-3-Rezeptoren in diesen Brustkrebszelllinien
beträchtlich
(oberes Feld). Es wurde auch gezeigt, dass NRG-1 den Grad der Tyrosin-Phosphorylierung
erhöht
(mittleres Feld).
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4. ErbB-3 bindet zum Signalprotein, Shc,
in ErbB-2- und ErbB-3-cotransfizierten
NIH3T3- und menschlichen Brustkrebszellen bei Abwesenheit des Liganden.
- a) ErbB-2-, ErbB-3- oder ErbB-2/3-cotransfizierte NIH3T3-Zellen
wurden für
12 h unter Serummangel gehalten und mit NRG-1 behandelt. Die Zelllysate
wurden mit Anti-ErbB-3-Antikörpern
immunpräzipitiert
und durch SDS-PAGE, gefolgt vom Western-Blot analysiert. Coimmunpräzipitation von
Shc mit Anti-ErbB-2- und -ErbB-3-Antikörpern wurde
durch einen spezifischen Anti-Shc-Antikörper nachgewiesen. 4a zeigt,
dass die Shc-Isoformen von 46 kDa und 52 kDa durch den Anti-Erb-2-Antikörper in
Zellen copräzipitiert
wurden, die einzig mit ErbB-2 und mit ErbB-2/ErbB-3 cotransfiziert
waren, und NRG-1 die Shc-Bindung zu den Rezeptoren zu erhöhen scheint
(unteres Feld). Das obere Feld zeigt ErbB-2-Rezeptoren, die durch
Anti-ErbB-2-Antikörper
in diesen transfizierten Zellen nachgewiesen wurden.
- b) Die zwei Shc-Isoformen wurden durch den Anti-ErbB-3-Antikörper in
Brustkrebszellen coimmunpräzipitiert.
Es ist zu beachten, dass Shc ErbB-3-Rezeptoren in einer Zelle, die einzig
mit ErbB-3 transfiziert war, nicht binden konnte. Die vier menschlichen
Brustkrebszelllinien wurden unter Serummangel in serumfreiem Medium
für 12
Stunden gehalten und dann mit dem Liganden, HRG b1, für 10 mm,
wie gekennzeichnet, stimuliert. Die Zellen wurden dann geerntet
und der Immunpräzipitation
mit Anti-ErbB-3-Antikörper
unterzogen.
- c) Präzipitiertes
ErbB-3 wurde durch den Anti-ErbB-3-Antikörper zur Normalisierung der
Menge an ErbB-3-Protein nachgewiesen.
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5. Durch Anti-ErbB-2- und Anti-ErbB-3-Antikörper vermittelte
Wachstumsinhibierung von menschlichen Brustkrebszellen bei Abwesenheit
des Liganden, Neuregulin-1. Menschliche (A) BT-474-, (B) SK-BR-3-
und (C) MDA-MB-453-Brustkrebszelllinien
wurden in 96-Well-Platten bei einer Konzentration von 2000 Zellen
pro Well ausgelegt. Nach dem Adhärieren
an die Platten (16 Std.) wurden die Kulturen mit Antikörpern, wie
angegeben, behandelt. Die Konzentration von jedem Antikörper war
wie folgt: IgG 5 mg/ml: Ab5 (Anti-ErbB-3-Antikörper): 2,5 mg/ml: N12 (Anti-ErbB-2-Antikörper 2,5
mg/ml. Die Kulturen wurden für
14 Tage wachsen gelassen, Medium und Antikörper wurden am Tag 7 wieder
aufgefüllt.
Nach 14 Tagen wurden die Zellzahlen unter Verwendung des CellTiter
96® AQueous
nichtradioaktiven Zellproliferationskits (Promega) ermittelt.
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6. Focusbildung von mit ErbB-Konstrukten
transfizierten NIH3T3-Zellen.
Zellen, die mit dem Wildtyp ErbB-2 oder ErbB-3 (WT) (obere Reihe) transfiziert
waren oder mit ErbB-2/H-ras, ErbB-3/H-ras cotransfiziert waren,
wie in Feld A angezeigt, wurden zur Focusbildung kultiviert. Wildtyp ErbB-2
(WT), ErbB-2 V/E659659-Mutante (V659E) oder einzig H-ras wurde in
Zellen zur Focusbildung transfiziert, wie in Feld B gezeigt. Foci
wurden durch Xylol-Färbung
sichtbar gemacht.
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Erfindungsgemäße Ausführungsformen
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EXPERIMENTELLE METHODEN
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Material
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NIH3T3-Zelllinie
und die Brustkrebszelllinien SK-BR-3, MDA-MB-453 und BT-474 wurden
von der American Type Culture Collection erworben. Das Transfektionsreagenz
LipofectAMINETM wurde von Life Technologies, Inc. erhalten. NRG-1
und die Antikörper
N 12 und H3.105.5 wurden von Neo Markers erworben. Das Cross-Linking-Reagenz
BS3 wurde von PIERCE Chemical Company erhalten. Das ErbB-2-Expressionsplasmid
pRC/CMV-ErbB-2, das eine menschliche ErbB-2-cDNA vollständiger Länge kodiert,
und des ErbB-3-Expressionsplasmid pCMVneo-HER3, das eine menschliche
ErbB-3-cDNA vollständiger
Länge kodiert,
wurden freundlicherweise von den Doktoren Rodney Fiddes und Roger
Daly (The Garvan Institute of Medical Research, Darlinghurst, NSW
2010, Australien) bereitgestellt. Antikörper, die ErbB-2 erkennen (NCL-CB
11 und NCL-PC 11) wurden von Novocastra Laboratories Ltd. erworben.
Anti-ErbB-3 wurde von Santa Cruz Biotechnology erworben. Anti-Shc,Anti-Phosphotyrosin
(rekombinant RC20:HRPO) wurde von Transduction Laboratories erworben.
Meerrettichperoxidase-konjugierte sekundäre Antikörper und Reagenzien zur verstärkten Chemilumineszenz
(ECL) wurden von NEN Life Science Products erworben.
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Zellkultur und transiente Transfektionen
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NIH3T3-
oder menschliche Brustkrebszellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle
Medium (DMEM), das mit 10% fötalem
Rinderserum (FBS) und dem selektiven Antibiotikum ergänzt war,
bei 37°C
in einer 5% CO2-Atmosphäre gehalten. NIH3T3 wurden
mit ErbB-2- und ErbB-3-DNA-Plasmid einzeln oder zusammen unter Verwendung
des LipofectAMINETM-Reagenz entsprechend den Vorschriften des Herstellers
transfiziert. Experimente wurden 48 h nach der Transfektion begonnen.
Vor der Stimulierung mit Wachstumsfaktor wurden die Zellen für 18 Stunden
in DMEM unter Mangelbedingungen gehalten.
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Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse
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Zur
Analyse von ErbB-Rezeptoren und assoziierten Proteinen wurden transfizierte
Zellen (1–2 · 106) mit kaltem PBS gewaschen und in 1 ml Lysepuffer
(50 mM Tris [pH 7,4], 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2
mM Natriumorthovanadat, 50 mM Natriumfluorid, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, Proteaseinhibitor-Cocktail
(Boeringher)) auf Eis solubilisiert. Die Lysate wurden mit Protein
A-(Sigma) oder Protein G-(Amersham Pharmacia Biotech)Sepharose bei
4°C für 60 min
auf einem Drehrotor inkubiert, bevor sie durch Zentrifugieren bei
13000 g für 15
min geklärt
wurden. Für
Immunpräzipitationen wurden
die Zelllysate mit spezifischen Antikörpern für 60 min bei 4°C inkubiert.
Immunkomplexe wurden mit Protein-A- oder Protein-G-Sepharose gesammelt und
viermal mit Lysepuffer gewaschen. Die Zelllysate oder immunpräzipitierten
Proteine wurden durch Sieden im Probenpuffer solubilisiert und wurden SDS-PAGE
unterzogen. Die Proteine wurden auf PVDF-Membranen elektrotransferiert.
Nach der Blockierung mit 5% Magermilch in PBS mit 0,02% Tween 20
bei 4°C über Nacht
wurden die Membranen mit primären
Antikörpern,
gefolgt von sekundären
Antikörpern
jeweils für
60 min bei Raumtemperatur behandelt. Proteine wurden mit Peroxidase-gekoppeltem
sekundärem
Antikörper
unter Verwendung eines Reagenz zur verstärkten Chemilumineszenz (NEN
Life Science Products) sichtbar gemacht. Für eine erneute Behandlung wurden
die geblotteten Membranen mit 1% SDS, 0,2 M Tris pH 8,0 durch Schütteln bei
RT für
2 Stunden gestrippt, dann wurden sie mit den jeweiligen Antikörpern behandelt.
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Chemischer Assay zum Cross-Linking
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Vor
den Cross-Linking- und Immunpräzipitationsassays
wurden die transfizierten Zellen über Nacht in serumfreiem Medium
(DMEM) unter Serummangel gehalten. Am nächsten Tag wurden die Zellen
mit 50 nM NRG-1 (Neo Markers) in serumfreiem Medium für 10 min
behandelt. Die Kulturen wurden dreimal in PBS gewaschen, bevor sie
mit dem zellimpermeablen Cross-Linking-Reagenz BS3 (PIERCE) (2
mM in PBS) bei Raumtemperatur für
30 min behandelt wurden. Dann wurde die Cross-Linking-Reaktion mit
10 mM Tris pH 7,5, 0,9% NaCl und 0,1 M Glycin für 15 min bei Raumtemperatur
abgebrochen. Die Lysate der ganzen Zellen wurden mit Lysepuffer erhalten
und sofort einem Immunpräzipitationsassay, wie
vorstehend beschrieben, unterzogen.
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Antikörper-vermittelte
Inhibierung des Zellwachstums
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SK-BR-3-,
MDA-MB-453-, BT474-, MCF-7- und T47D-Zellen wurden mit Antikörpern behandelt, die
für ErbB-2
und/oder ErbB-3 spezifisch sind. Der verwendete Anti-ErbB-2-Antikörper war
N12, von dem bekannt ist, dass er das Wachstum von verschiedenen
Krebszelllinien, die ErbB-2 überexprimieren,
inhibiert. Der verwendete Anti-ErbB-3-Antikörper war H3.105.5, von dem
berichtet wird, dass er das Wachstum von Krebszelllinien, die ErbB-3 überexprimieren,
nicht beeinflusst (Neomarkers Katalog). Beide Antikörper sind
vom gleichen Isotyp (IgGl) und erkennen die extrazelluläre Region
des Rezeptors. Zellen wurden in 96-Well-Platten bei einer Dichte
von 5000 Zellen/Well ausgelegt und 16 Stunden zum Adhärieren belassen.
Dann wurden Antikörper
zu den Wells gegeben (N12 – 1
mg/ml; H3.105.5 2,5 mg/ml, ungereinigtes Maus-IgG – 5 mg/ml)
und die Kulturen wurden für
weitere 5 Tage inkubiert. Die Anzahl der Zellen in jedem Well wurde
unter Verwendung des Cell Titre AQeous Proliferationsassays (Promega), dem
Protokoll des Herstellers folgend, bestimmt.
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EINLEITUNG
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ErbBs
sind Klasse eins Rezeptor-Protein-Tyrosinkinasen. ErbB-vermittelte
Zellsignalwirkung spielt eine entscheidende Rolle bei der Embryoentwicklung
und der Organfunktion des Erwachsenen. Auf zellulärer Ebene
wurde gezeigt, dass die ErbB-Rezeptoren Signale für die Zellproliferation, -differenzierung,
-migration und Reorganisation der Zellstruktur vermitteln. Es gibt
vier strukturell ähnliche ErbB-Mitglieder, ErbB-1,
-2, -3 und -4. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) ist einer von
mehreren Liganden, die ErbB-1 binden. ErbB-3 oder ErbB-4 binden
auch mehrere Liganden, einschließlich Neuregulin-1 (NRG-1).
Bisher wurde kein Ligand für
ErbB-2 identifiziert. Jedoch dient ErbB-2 als Heterodimerpartner
für ErbB-3,
ErbB-4 oder ErbB-1 und ist entscheidend an der NRG-1-aktivierten
Zellsignalwirkung beteiligt.
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In-vivo-Studien
unter Verwendung von Gene-Targeting (gezielte Genmodifizierung)-Experimenten
zeigen, dass Entwicklungsschäden,
die aus der Inaktivierung von ErbB-2 resultieren, ähnlich denen
sind, die in NRG-1-inaktivierten Tieren beobachtet werden. Beide
Tiere zeigten Schäden
bei der Entwicklung der neuralen kranialen Ganglien und Herztrabekel.
Weiterhin zeigen ErbB-3- oder ErbB-4-Gen-inaktivierte Mäuse ähnliche oder überlappende
Phänotypen
zu NRG-1- oder ErbB-2-Knockout-Mäusen.
Dies weist deutlich darauf hin, dass ErbB-2 an NRG-1-aktivierten ErbB-3-
oder ErbB-4-Signalwegen in vivo beteiligt ist.
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Neben
seiner Rolle bei der Entwicklung wird das menschliche ErbB-2-Gen
häufig
amplifiziert und sein kodiertes Protein wird in einer Vielfalt von menschlichen
Karzinomen überexprimiert.
In der frühen
Forschung zu ErbB-2 wurde entdeckt, dass eine onkogene Punktmutation
zur Bildung von ErbB-2-Homodimeren führte, die wiederum eine erhebliche Phosphorylierung
der Tyrosinreste an der intrazellulären Domäne verursachte. Während in
ErbB-2 überexprimierenden
menschlichen Karzinomen keine entsprechende Punktmutation gefunden
wurde, führt die
Upregulation von ErbB-2 zur Bildung von Homodimeren, die wiederum
die Tyrosin-Phosphorylierung seiner
intrazellulären
Domäne
erhöht.
Von diesem Prozess wird angenommen, dass er der Beginn einer Signalkaskade
ist, die die Zelltransformation und/oder das Zellwachstum initiiert,
und somit Tumorgenese auslöst.
Es gibt jedoch Hinweise, die der Hypothese, dass ErbB-2-Homodimere
für die
Initiation der Tumorgenese verantwortlich sind, widersprechen: i)
einige ErbB-2-Mutanten, die für
eine verstärkte
Dimerisierung und Selbstphosphorylierung modifiziert werden, haben
keinen Effekt auf die Zelltransformation; ii) Antikörper, die
zur extrazellulären Domäne von ErbB-2
binden und vermutlich die Homodimerisierung fördern, führen zur Wachstumspromotion
von ErbB-2 exprimierenden Krebszellen, während andere das Krebszellwachstum
inhibieren. Diese Angaben zeigen, dass die Homodimerisierung von
ErbB-2 für
die Zellwachstumspromotion oder Zelltransformation unzureichend
ist und andere Voraussetzungen, die möglicherweise spezifische Dimerorientierung
oder -konformation einschließen,
erforderlich sind.
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ErbB-2
fungiert als Heterodimerpartner für die ligandbindenden ErbB-3-
oder ErbB-4-Rezeptoren. Es wurde ermittelt, dass der Ligand, NRG-1, zwei
unabhängige
Rezeptorbindungsstellen hat: eine, die eine hohe Affinität für ErbB-3
oder ErbB-4 hat und die andere, die eine niedrige, doch unspezifische Affinität für alle ErbB-Mitglieder hat. Somit
würde die Exposition
von NRG-1 gegenüber
Zellen, die ErbB-3/4
und ErbB-2 exprimieren, zu Heterodimeren von ErbB-2 und ErbB-3/4
führen.
Bei Abwesenheit des Liganden ist jedoch unklar, ob ErbB-2 eine Affinität zu anderen
ErbB-Rezeptoren hat, und es ist möglich, dass eine derartige
Wechselwirkung an der Initiation von Krebs beteiligt sein könnte. Unter
allen ErbB-Rezeptoren ist ErbB-3 einzigartig, da: i) ErbB-2 bevorzugt
Heterodimere mit ErbB-3 bildet; ii) Cotransfektion von NIH3T3-Zellen
mit ErbB-2 und ErbB-3 zu viel höheren
Graden der Zelltransformation führt
als die der Transfektion mit ErbB-2 allein; iii) in mit ErbB-2-Überexpression
assoziierten Brustkrebszellen ErbB-3 auch hoch exprimiert wird;
iv) ErbB-3 auch in ErbB-2 überexprimierenden
Tumorzellen von ErbB-2-transgenen
Mäusen überexprimiert
wird.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten, ob ErbB-2 und
ErbB-3 auf eine von einem Liganden unabhängige Weise in NIH3T3-Zellen,
die mit den zwei Rezeptoren cotransfiziert wurden, Wechselwirken.
Durch Coimmunpräzipitation
wurde ErbB-2 in ErbB-3-Präzipitaten
aus Zellen, die unter Abwesenheit von NRG-1 kultiviert werden, nachgewiesen
und umgekehrt wurde ErbB-3 in ErbB-2-Präzipitaten nachgewiesen. ErbB-2/3-Komplexe
wurden auch in Cross-Linking-Experimenten identifiziert. Die vom
Liganden abhängigen
und vom Liganden unabhängigen
ErbB-2/ErbB-3-Heterodimere
wurden durch die verschiedenen Mobilitäten der zwei quervernetzten
Dimere durch SDS-PAGE unterschieden. Jedoch sind sowohl ErbB-2 als
auch ErbB-3 in dem vom Liganden unabhängigen Heterodimer phosphoryliert
und binden zu Shc, einem intrazellulären Zellsignalprotein. Diese
vom Liganden unabhängigen ErbB-2/ErbB-3-Heterodimere
wurden auch in Zellen von ErbB-2 überexprimierenden menschlichen
Brustkrebslinien, SK-BR-3, TB-474 und MDA-MB-453, nachgewiesen. Um zu testen,
ob das vom Liganden unabhängige
Heterodimer das Zellwachstum in Brustkrebsen aktivieren kann, wurden
die vorstehenden drei menschlichen Brustkrebszelllinien mit Anti-ErbB-2-(extrazelluläre-Domäne)- und
Anti-ErbB-3-(extrazelluläre-Domäne)-Antikörpern in
einem Zellwachstumsassay behandelt. Der Anti-ErbB-2-Antikörper, N12,
unterdrückte
das Wachstum in allen drei Krebszelllinien, während der Anti-ErbB-3-Antikörper das
Wachstum in BT-474- und MDA-MB-453-Krebszelllinien verringerte.
Bei Kombination des ErbB-2-Antikörpers
mit dem ErbB-3-Antikörper
in Kulturen von SK-BR-3-Krebszellen hatten die zwei Antikörper interessanterweise
einen synergistischen Inhibierungseffekt auf das Krebszellwachstum.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ErbB-3 am Wachstum von menschlichen
Brustkrebszellen durch vom Liganden unabhängige Heterodimerisierung mit
ErbB-2 beteiligt ist.
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ERGEBNISSE
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Zur
Untersuchung von ErbB-2- und ErbB-3-Wechselwirkungen bei Abwesenheit
von NRG-1 verwendeten die Erfinder der vorliegenden Erfindung NIH3T3-Zellen,
die geringe Mengen von ErbB-2 und keine nachweisbaren Mengen der
anderen ErbB-Rezeptoren exprimieren, und entweder ErbB-2, ErbB-3
oder sowohl ErbB-2 als auch ErbB-3 transient exprimierten. Um mögliches
NRG-1 im Serum des Zellkulturmediums zu vermeiden, wurden die Zellen
in serumfreiem Medium für
24 h vor dem Ernten kultiviert. ErbB-2 oder ErbB-3 wurden dann unter
Verwendung von Antikörpern,
die für
einen der Rezeptoren spezifisch sind, präzipitiert und die Präzipitate
wurden durch Western-Blot analysiert. Immunoblots unter Verwendung
von Anti-ErbB-2-Antikörpern
wiesen ErbB-2 in ErbB-3-Präzipitaten
nach (1a, mittleres Feld, Spur 3).
Dies war keine Kreuzreaktion der Antikörper, da der Anti-ErbB-3-Antikörper nicht
ErbB-2 präzipitieren
konnte (1a, mittleres Feld, Spur 5)
oder zu ErbB-2 im Western-Blot binden konnte (1a,
unteres Feld, Spur 1). Ähnlich
konnte der Anti-ErbB-2-Antikörper
nicht ErbB-3 präzipitieren
(1a, unteres Feld, Spur 1) oder zu ErbB-3 auf dem
Western-Blot binden (1a, mittleres Feld, Spur 2).
Die Komplexbildung erfordert Membranassoziation von ErbB-2 und ErbB-3,
da lösliche
Rezeptoren nicht in der Lage sind, den Komplex in gemischten Zellextrakten
von Zellen, die mit ErbB-2 und ErbB-3 separat transfiziert wurden,
zu bilden (1a, mittleres Feld, Spur 5). ErbB-3-Rezeptoren
wurden auch durch Western-Immunoblotting von Anti-ErbB-2-Präzipitaten
von ErbB-2/3-cotransfizierten NIH3T3-Zellen nachgewiesen (1b).
Die Gegenwart von NRG-1 verstärkte die
Heterodimerisierung von ErbB-2 und ErbB-3 wie erwartet (1a,
Spur 4; 1b, Spur 2).
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Immunoblotting
wies die Gegenwart von phosphorylierten Tyrosinen von einem 180-kDa-Protein
aus ErbB-2/3-Zellen, die mit oder ohne NRG-1 behandelt wurden, nach
(1a, oberes Feld, Spur 3 bzw. 4). Es wird erwartet,
dass diese Phosphorylierung auf intrazellulärem ErbB-2 und/oder ErbB-3
vorlag, die ein vom Liganden unabhängiges Heterodimer gebildet
hatten. Anders als ErbB-2 hat ErbB-3 eine beeinträchtigte
Kinasedomäne
und würde
nicht in der Lage sein, andere Proteine zu phosphorylieren. Daher
zeigt dies, dass das phosphorylierte Protein sehr wahrscheinlich
ErbB-3 ist.
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Um
zu testen, ob der durch Coimmunpräzipitation nachgewiesene ErbB-2-
und ErbB-3-Komplex ein Heterodimer ist, wurden Cross-Linking-Experimente
mit Zellen durchgeführt,
die einzig mit ErbB-2 oder ErbB-3 transfiziert oder die mit ErbB-2
und ErbB-3 cotransfiziert waren. Die Zelllysate wurden mit Anti-ErbB-2-
oder Anti-ErbB-3-Antikörpern immunpräzipitiert.
ErbB-2-Überexpression
führt zur Homodimerisierung,
da Proteindoppelbanden bei ungefähr
360 kDa nachgewiesen wurden, während
der monomere Rezeptor bei ungefähr
180 kDa nachgewiesen wurde (2a, oberes
Feld, Spur 1). Die Bildung des ErbB-2-Homodimers erfolgte unabhängig von
der Ligandenstimulierung (2a, oberes
Feld, Spur 1 im Vergleich zu Spur 2).
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Ein
360-kDa-Dimer wurde auch in ErbB-2/ErbB-3-cotransfizierten Zellen
nachgewiesen (2a, Spur 5). Dies war ein Heterodimer,
da das Protein mit Anti-ErbB-3-Antikörper präzipitiert wurde und auf dem
Western-Blot mit Anti-ErbB-2-Antikörper nachgewiesen
wurde. Jedoch, anders als das ErbB-2-Homodimer, bestand das ErbB-2/ErbB-3-Heterodimer
nur aus einer einzigen Bande. Als Antwort auf die NRG-1-Stimulierung
von ErbB-2/ErbB-3-cotransfizierten Zellen lag nur ein Heterodimerkomplex mit
geringerer Mobilität
vor, ähnlich
dem, der in ErbB-2-transfizierten
Zellen beobachtet wurde (2a, oberes
Feld, Spur 1 im Vergleich zu 6). Die Abnahme der Mobilität des ligandenaktivierten
Heterodimers trat nicht aufgrund der erhöhten Tyrosin-Phosphorylierung
auf, da i) die Doppel-Dimere beide an den Tyrosinresten phosphoryliert
werden; und ii) beide vom Liganden abhängigen und vom Liganden unabhängigen Heterodimere
einen ähnlichen
Grad der Tyrosin-Phosphorylierung zeigten (2a, mittleres
Feld, Spuren 5 und 6). Erneut war die Gegenwart von ErbB-2/3-Heterodimeren
nicht das Ergebnis von Kreuzreaktivität der Antikörper, da die ErbB-2-Homodimere
durch den Anti-ErbB-3-Antikörper nicht
nachgewiesen wurden (2a, unteres Feld, Spuren 1 und
2). ErbB-3 war nur in der Lage, eine begrenzte Menge an Homodimeren
zu bilden, selbst in Gegenwart von NRG-1 (2a, unteres Feld,
Spuren 3 und 4).
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Um
zu testen, ob die Heterodimerisierung von ErbB-2 und ErbB-3 durch
einen unbekannten Liganden im Serum stimuliert werden könnte, wurden ErbB-2/ErbB-3-cotransfizierte Zellen
in entweder serumfreiem Medium oder in Medium, das Serum enthielt,
kultiviert. Wie in 2b, linke und rechte Seite, gezeigt
ist, werden ähnliche
Bandenmuster von Zellen nachgewiesen, die mit oder ohne Serum kultiviert wurden.
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Um
zu testen, ob die durch ErbB-2- und ErbB-3-Überexpression vermittelte Bildung
des Heterodimers in NIH3T3-Zellen irgendeine Bedeutung für Krebszellen,
die ErbB-2 überexprimieren,
hat, wurden die menschlichen Brustkrebszelllinien SK-BR-3, MDA-MB-453
und BT-474, die ErbB-2 und ErbB-3 überexprimieren, untersucht.
Wie bei den cotransfizierten NIH3T3-Zellen copräzipitierte ErbB-2 mit ErbB-3
unter Verwendung des Anti-ErbB-3-Antikörpers (3a).
Außerdem,
in Übereinstimmung mit
den Ergebnissen von den cotransfizierten NIH3T3-Zellen, erhöhte NRG-1
die Bildung von ErbB-2/3-Heterodimeren in diesen Zellen erheblich (3a).
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Da
bekannt ist, dass durch Liganden stimulierte ErbB-2/ErbB-3-Heterodimere
zum Zellsignalmolekül
Shc binden, untersuchten die Erfinder der vorliegenden Erfindung,
ob die vom Liganden unabhängigen
ErbB-2/ErbB-3-Heterodimere auch zu Shc binden. Ähnliche Mengen an Shc coimmunpräzipitierten
mit ErbB-2 von ErbB-2-transfizierten
Zellen und ErbB-2/3-cotransfizierten Zellen bei Abwesenheit von
NRG-1 (4a,
Spuren 1 und 2). Da die Überexpression
von ErbB-2 in NIH3T3-Zellen
zu ErbB-2-Homodimeren führte
(2a), zeigt dieses Ergebnis, dass Shc zu ErbB-2-Homodimeren
binden kann. Jedoch coimmunpräzipitierte
Shc auch mit ErbB-3 von ErbB-2/3-transfizierten Zellen bei Abwesenheit
und Gegenwart von NRG-1 (4b, Spuren
2 und 3). Da Shc nicht mit ErbB-3 aus Zellen, die nur ErbB-3 exprimieren,
coimmunpräzipitierte,
zeigt dieses Ergebnis, dass Shc mit ErbB-2/3-Heterodimeren in Gegenwart und Abwesenheit
von NRG-1 assoziiert ist.
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Als
Nächstes
wurde untersucht, ob Shc auch mit ErbB-2/3-Heterodimeren in menschlichen
Brustkrebszellen assoziiert war. Erneut wurde gefunden, dass Shc
mit ErbB-3 aus jeder Krebszelllinie coimmunpräzipitiert (4c).
In jeder getesteten Zelllinie erhöhte NRG-1 die Coimmunpräzipitation
von Shc mit ErbB-3, was zeigt, dass Shc mit ErbB-2/3-Heterodimeren
wechselwirkt.
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Um
zu testen, ob die vom Liganden unabhängigen ErbB-2/ErbB-3-Heterodimere bei
der Zellsignalwirkung und der Stimulierung von Zellwachstum aktiv
sind, wurden handelsübliche
Anti-ErbB-2(N12)- und Anti-ErbB-3(Ab5)-(extrazelluläre-Domäne)-Antikörper verwendet, um Kulturen
von menschlichen Brustkrebszellen, die ErbB-2 und ErbB-3 überexprimieren,
zu behandeln. Es wurde vorausgesagt, dass die Kombination dieser
Antikörper vorgeformte
ErbB-2/3-Heterodimere
spalten und somit ihre Signaleigenschaften und möglicherweise die Stimulierung
von Zellwachstum stören
würden.
Es wurde zuvor berichtet, dass N12 das Wachstum von verschiedenen
Krebszelllinien inhibiert und hier wird es bestätigt, dass der Antikörper das
von Verankerung abhängige
Wachstum von Krebszelllinien, einschließlich MDA-MB-453-, BT-474-
und SK-BR-3-Zellen, inhibiert (5).
BT-474-Zellen waren gegenüber
N12 empfindlicher, im Vergleich zu den anderen Zelllinien. Jedoch
wurde gefunden, dass Ab5 auch das Wachstum in sowohl BT-474- als auch MDA-MB-453-Zellen
inhibierte (5a bzw. b). Wie bei N12 waren
BT-474-Zellen gegenüber
Ab5 empfindlicher, im Vergleich zu den anderen getesteten Zelllinien.
Bei Kombination von N12 und Ab5 zur Behandlung dieser Brustkrebszellen
hatten sie einen additiven Effekt auf MDA-MB-453- und BT-474-Zellen und einen
synergistischen Effekt auf SK-BR-3-Zellen. T47D- und MCF-7-Zellen wurden auch
mit diesem Zellwachstumsassay getestet. In T47D-Zellen werden ErbB-2
und ErbB-3 überexprimiert
und in MCF-7-Zellen werden ErbB-1, -3 und -4 hoch exprimiert. Jedoch
reagierte keine der Zellen auf N12 oder Ab5, was zeigt, dass die
Wachstumsaktivität
von ErbB-3 von der Gegenwart von aktivem ErbB-2 (das auf den Anti-ErbB-2-Antikörper reagieren
kann) abhängt
(Daten nicht gezeigt). Somit wurde geschlussfolgert, dass ErbB-2/3-Heterodimere
in vielen menschlichen Brustkrebszellen, selbst bei Abwesenheit
eines Liganden, aktiv sind und dieses Heterodimer für die Stimulierung
des Zellwachstums verantwortlich ist.
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DISKUSSION
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Insgesamt
haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung einen Effekt zur Stimulierung
von Zellwachstum aufgezeigt, der durch ErbB-2/ErbB-3 bei Abwesenheit
des Liganden, NRG-1, ausgelöst
wird. Dieser wird mit der Überexpression
von ErbB-2 und ErbB-3 in menschlichen Brustkrebszellen in Verbindung
gebracht. Dieses Ergebnis wird durch folgende Beobachtungen gestützt: i) überexprimiertes
ErbB-2 und ErbB-3 bilden Heterodimere in ErbB-2/ErbB-3-cotransfizierten
NIH3T3-Zellen und in ErbB-2 überexprimierenden
menschlichen Brustkrebszellen, die auf den Inhibierungseffekt des
Anti-ErbB-2-Antikörpers
reagieren; ii) in den vom Liganden unabhängigen ErbB-2/ErbB-3-Heterodimeren
ist ErbB-3 an Tyrosinresten phosphoryliert; iii) das vom Liganden
unabhängige
Heterodimer bindet zum Zellsignalmolekül Shc; iv) ein handelsüblicher
Anti-ErbB-3-Antikörper, von
dem zuvor berichtet wurde, dass er keinen Inhibierungseffekt auf
Krebszellen ausübt,
inhibiert das Wachstum von menschlichen Brustkrebszellen und bei
Kombination mit einem Anti-ErbB-2-Antikörper zeigen sie entweder einen
additiven oder einen synergistischen Effekt auf die Inhibierung
des Zellwachstums. Somit wird gefolgert, dass ErbB-3 am Wachstum
von menschlichen Brustkrebszellen über eine vom Liganden unabhängige Wechselwirkung
mit überexprimiertem
ErbB-2 beteiligt ist.
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Frühe Studien
postulierten, dass ErbB-2-Überexpression
allein ausreichte, um Tumorgenese zu induzieren. Derartige Schlussfolgerungen wurden
aus den folgenden Beobachtungen gezogen: i) ErbB-2 wird in einer
Vielfalt von menschlichen Krebszellen überexprimiert, da das ErbB-2-Gen
amplifiziert wird; ii) ErbB-2-Überexpression
führt zur Phosphorylierung
seiner intrazellulären
Domäne
und Bindung zu Zellsignalproteinen, Shc und Grb2; iii) Transfektion
von kultivierten Fibroblastenzellen mit dem Wildtyp-ErbB-2-Gen führt zur
Zelltransformation; und iv) ErbB-2-Mutante, bei der die Homodimerisierung
verstärkt
ist, zeigt einen höheren
Grad der Transformationsaktivität.
Obwohl jedoch eine ErbB-2-Mutante Zellen transformieren kann, ist
nicht klar, ob Wildtyp-ErbB-2 auch Zellen transformieren kann, da
andere Studien eine derartige Aktivität für ErbB-2 allein nicht aufzeigen
können.
Es ist nicht klar, ob in diesen wenigen ErbB-2-transformierten Zellen auch
ErbB-3 exprimiert wird, da eine derartige ErbB-3-Expression in Tumorzellen
von der ErbB-2-transgenen Linie auftrat. Auch wenn ErbB-2 am Krebszellwachstum
oder an der Zelltransformation beteiligt ist, ist somit nicht klar,
ob ErbB-2 allein zur Vermittlung von Zellsignalen für das Zellwachstum oder
die Zelltransformation. ausreicht. Es ist möglich, dass nur das ErbB-2/ErbB-3-Heterodimer,
doch nicht das ErbB-2-Homodimer, direkt an der Tumorgenese beteiligt
ist.
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Diese
Studie zeigt, dass ErbB-2- und ErbB-3-heterodimere Komplexe ohne
Ligandenbindung auf der Zelloberfläche in ErbB-2 überexprimierenden
und ErbB-3 hoch exprimierenden Zellen vorliegen. Dies wird durch
die Coimmunpräzipitation
von ErbB-2 und ErbB-3 aus cotransfizierten NIH3T3-Zellen bestätigt. Die
Coimmunpräzipitation
gelingt auch mit Zellen der menschlichen Brustkrebszelllinien SK-BR3,
MDA-MB-453 und BT-474, die ErbB-2 überexprimieren und große Mengen
von ErbB-3 exprimieren, doch nicht NRG-1. Es wird angenommen, dass das
vom Liganden unabhängige
Heterodimer eine höhere
Affinität
zu NRG-1 als zum ErbB-3-Homodimer haben könnte. Künstliche Heterodimere von ErbB-2
und ErbB-3 haben eine viel höhere
Ligandenbindungsaffinität
als künstliche
ErbB-3-Homodimere oder Monomere. Jedoch deuteten frühere Studien an,
dass der Ligand die ErbB-2- und ErbB-3-Dimerisierung initiierte.
Dieser offensichtliche Widerspruch wurde nicht angemessen erklärt. Daher
ist aus diesen Studien unklar, ob das Dimer vor oder nach der Ligandenbindung
zu ErbB-3 gebildet wird. Außerdem deutet
das vorliegende Ergebnis an, dass die vom Liganden unabhängige Bildung
des ErbB-2-ErbB-3-heterodimeren
Komplexes gegenüber
der Bildung der ErbB-2-Homodimere überwiegen könnten, da die Gegenwart von
ErbB-3 die Bildung von ErbB-2-Homodimer-Doppelbanden
bei der SDS-PAGE verhindern kann.
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Es
ist unerwartet, dass die vom Liganden abhängigen ErbB-2/ErbB-3-Heterodimere eine
geringere Mobilität
bei SDS-PAGE zeigen als die vom Liganden unabhängigen Heterodimere. Dieser
Unterschied kann auf der Molekularmasse des Liganden, NRG-1, beruhen,
der zu den Rezeptoren quervernetzt sein könnte. Jedoch enthält der in
diesem Experiment verwendete Ligand nur eine EGF-Domäne von etwa
7 kDa, somit ist es unwahrscheinlich, dass die Molekularmasse des
Liganden die Mobilität
des Heterodimers bedeutend verändern
kann. Alternativ könnte
dieser Unterschied der Mobilität
aufgrund von unterschiedlichen Konformationen zwischen den zwei
Heterodimeren zustande kommen, die durch die Cross-Linking-Reagenzien
fixiert sind, oder aufgrund von unterschiedlichen Phosphorylisierungsgraden zustande
kommen, obwohl beide Heterodimere zu vergleichbaren Graden phosphorylisiert
werden, was durch den Anti-Phosphotyrosin-Antikörper nachgewiesen wurde.
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Ein
weiterer entscheidender Aspekt dieser Studie ist die Inhibierung
des durch den Anti-ErbB-3-Antikörper
vermittelten Krebszellwachstums. Der in dieser Studie verwendete
Anti-ErbB-3-Antikörper
(H3.105.5) wurde zuvor untersucht und es wurde gefunden, dass er
keinen Effekt auf das Wachstum von Krebszellen hat, die ErbB-3. exprimieren
(NeoMarks Katalog 1999). Die abweichenden Beobachtungen könnten auf
den verschiedenen verwendeten Zelllinien beruhen. Anders als die
frühere
Studie haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung fünf menschliche
Brustkrebszelllinien getestet: MCF-7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-453
und BT-474. Zellen von den letzteren zwei Linien reagieren auf den
ErbB-3-Antikörper
allein. Interessanterweise reagieren SK-BR-3-Zellen nicht maßgeblich auf
den ErbB-3-Antikörper
allein, doch zeigen eine 2,5-fach größere Reaktion auf eine Kombination
aus ErbB-2- und ErbB-3-Antikörpern als
auf den ErbB-2-Antikörper
allein. Es ist entscheidend, dass alle drei Zelllinien, die auf
den ErbB-3-Antikörper
reagieren, auch auf den ErbB-2-Antikörper reagieren. MCF-7- und
T47D-Zellen reagieren weder auf den ErbB-2-Antikörper noch auf den ErbB-3-Antikörper, obgleich
MCF-7-Zellen ErbB-1, -3 und -4 exprimieren und T47D ErbB-2 und ErbB-3 überexprimieren.
In Anbetracht, dass der Anti-ErbB-2-Antikörper, Herceptin, der bei Brustkrebspatienten
zur Unterdrückung
des Krebszellwachstums angewendet wurde, nur bei 50% der Patienten
wirksam ist, deutet die Zufälligkeit,
dass die drei Zellen auf beide Antikörper reagieren, an, dass das
ErbB-2/ErbB-3-Heterodimer die einzige aktive Form bei der Stimulierung
des Krebszellwachstums sein kann.
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein neuer Ansatz für die Krebstherapie
durch Hemmen oder Stören
der Bildung des ErbB-2/ErbB-3-Heterodimers.