-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Konzentration
eines gelösten Stoffes,
der in einer zu detektierenden Lösung
gelöst vorliegt,
und insbesondere ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines
Proteins und bevorzugt die Konzentration einer optisch aktiven Substanz,
die kein Protein ist.
-
Als
ein herkömmliches
Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gibt es ein Verfahren,
in welchem Trichloressigsäure
in einer zu detektierenden Lösung
zur Koagulierung des Proteins vermischt wird, um dadurch die Lösung einzutrüben, und die
Proteinkonzentration wird aus der resultierenden Trübung bestimmt.
Jedoch ist es mit einem solchen Verfahren schwierig, die zu detektierenden
Lösung bei
einer Temperatur von 25°C
oder höher
stabil einzutrüben.
Deshalb ist es manchmal unmöglich,
die Messung bei einer Temperatur von 25 bis 40°C, was zu Hause eine normale
Umgebungstemperatur ist, durchzuführen.
-
Als
ein herkömmliches
Gerät für die Urinanalyse
gibt es ein Gerät,
in welchem ein Testpapier oder dergleichen, das mit einem Reagens
imprägniert
ist, in den Urin eingetaucht wird, und eine Farbreaktion davon wird
mittels eines Spektroskops oder dergleichen untersucht, um die Komponenten
des Urins zu bestimmen. Die hierin eingesetzten Testpapiere erfordern
eine individuelle Herstellung gemäß den entsprechenden Prüfpunkten
wie etwa Glukose und Protein.
-
Die
EP-A-0 845 673 beschreibt ein Messverfahren, das zur Messung der
Konzentrationen von spezifischen Bestandteilen, insbesondere dem
Urinproteinspiegel und dem -zuckerspiegel, am meisten zweckmäßig ist.
Nachdem eine proteinhaltige flüssige
Probe mittels Erwärmung
eingetrübt
worden ist oder während
der Erwärmung
der Probe, wird Licht in die flüssige
Probe projeziert. Die Proteinkonzentration wird aus der Intensität des durch
die Probe transmittierten Lichts oder des von der Probe gestreuten Lichts
bestimmt.
-
Die
JP-A-58209946 beschreibt eine Beschichtungszusammensetzung zum Backen.
-
Die
JP-A-07138119 beschreibt ein Zahnhaftmittel mit einem Derivat der
Gallussäure
oder einem Derivat der Tanninsäure.
-
Es
ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das vorstehende
Problem zu lösen.
Es ist nämlich
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Messung
einer Proteinkonzentration bereitzustellen, welches hochstabil und
leicht bei einer Temperatur von 0 bis 40°C oder Umgebungstemperatur zu
Hause einzuhalten und zu handhaben ist.
-
Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Möglichmachung
einer einfachen und hochgenauen Urinanalyse vorzusehen.
-
Um
das vorstehend beschriebene Problem zu lösen ist es das Verfahren zur
Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung durch
die Verwendung eines Reagens als einem Reagens zur Änderung
der optischen Charakteristik von nur dem Protein gekennzeichnet,
welches aus der aus Tannin, Tanninsäure und m-Galloyl-Gallussäure bestehenden
Gruppe ausgewählt
ist.
-
Ferner
ist das Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden
Erfindung in einer bevorzug ten Ausführungsform durch die Zugabe
eines pH-Einstellmittels
in einer zu detektierenden Lösung
zur Regulierung des pH-Werts der zu detektierenden Lösung auf
1,5 bis 5,8 gekennzeichnet.
-
Das
Verfahren zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden
Erfindung ist in Anspruch 1 definiert.
-
Hierin
ist es bevorzugt, dass eine Proteinkonzentration in einer zu detektierenden
Lösung
in einem niedrigen Konzentrationsbereich aus der Intensität des gestreuten
Lichts bestimmt wird, und dass die Proteinkonzentration einer zu
detektierenden Lösung
in einem hohen Konzentrationsbereich aus der Intensität des transmittierten
Lichts bestimmt wird.
-
Die
Gegenwart oder die Anwesenheit einer Fehlerbehafteten Messung aufgrund
eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase in der zu detektierenden
Lösung
kann mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 7 detektiert werden.
-
Außerdem sieht
die vorliegende Erfindung bevorzugt ein Verfahren zur Messung einer
Proteinkonzentration in einer Lösung
vor, welches die folgenden Schritte umfasst:
(a) Messen der
Intensitäten
wenigstens eines transmittierten Lichts oder eines gestreuten Lichts
einer zu detektierenden Lösung
vor und nach dem Vermischen eines Reagens darin, (b) Bestimmen einer Proteinkonzentration
der zu detektierenden Lösung, basierend
auf den Intensitäten
wenigstens, (c) Messen eines Winkels der Polarisationsrotation der
zu detektierenden Lösung
vor dem Vermischen eines Reagens darin, des transmittierten Lichts
oder des gestreuten Lichts und (d) Bestimmen einer Konzentration
einer optisch aktiven Substanz in der zu detektierenden Lösung, die
kein Protein ist, aus der Proteinkonzentration, neben dem Winkel der
Polarisationsrotation, der in Schritt (c) gemessen wurde, und (e)
Korrigieren des gemessenen Winkels der Polarisationsrotation, basierend
auf der so gemessenen Proteinkonzentration.
-
Dieses
Verfahren wendet das gleiche Prinzip wie das vorstehend erwähnte zur
Messung einer Proteinkonzentration an. Somit wird als Reagens ein
Reagens eingesetzt, das aus der aus Tannin, Tanninsäure und
m-Galloyl-Gallussäure
bestehenden Gruppe ausgewählt
ist. Zusätzlich
wird der pH-Wert der zu detektierenden Lösung in der gleichen Art und
Weise reguliert.
-
Während die
neuen Merkmale der Erfindung im Einzelnen in den angehängten Ansprüchen aufgeführt sind,
wird die Erfindung hinsichtlich ihrem Aufbau und ihrem Gehalt zusammen
mit anderen Aufgaben und Merkmalen aus der folgenden detaillierten Beschreibung
in Zusammenhang mit den angehängten
Zeichnungen besser verständlich
und sie wird detaillierter erläutert.
-
Kurzbeschreibung
der Ansichten der Zeichnung
-
1 ist
eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung eingesetzten Messgeräts zeigt.
-
2 ist
eine Draufsicht des gleichen Geräts.
-
3 ist
ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in
einer zu detektierenden Lösung
und der Intensität
des gestreuten Lichts zeigt.
-
4 ist
ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in
einer zu detektierenden Lösung
und der Intensität
des transmittierten Lichts zeigt.
-
5 ist
eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einer weiteren
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung eingesetzten Messgeräts zeigt.
-
6 ist
eine Draufsicht des gleichen Geräts.
-
7 ist
ein Graph, der die Änderung
der Intensität
des gestreuten Lichts einer zu detektierenden Lösung zeigt.
-
8 ist
ein Graph, der die Änderung
der Intensität
des transmittierten Lichts einer zu detektierenden Lösung zeigt.
-
9 ist
ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration einer
zu detektierenden Lösung
und der Menge der Änderung
der Intensität
des transmittierten Lichts zeigt.
-
10 ist
ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in
einer zu detektierenden Lösung
und dem Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts zeigt.
-
11 ist
eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einer noch
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung eingesetzten Messgeräts zeigt.
-
12 ist
ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in
einer zu detektierenden Lösung
und dem Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts zeigt.
-
13 ist
ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in
der zu detektierenden Lösung
und der Intensität
des gestreuten Lichts zeigt.
-
14 ist
ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in
einer zu detektierenden Lösung
und der Intensität
des transmittierten Lichts zeigt.
-
15 ist
ein Graph, der die Änderung
der Intensität
des gestreuten Lichts einer zu detektierenden Lösung zeigt.
-
16 ist
ein Graph, der die Änderung
der Intensität
des transmittierten Lichts einer zu detektierenden Lösung zeigt.
-
17 ist
Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in einer
zu detektierenden Lösung
und der Menge der Änderung
der Intensität
des transmittierten Lichts zeigt.
-
18 ist
ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in
einer zu detektierenden Lösung
und des Verhältnisses
der Intensität des
transmittierten Lichts zeigt.
-
19 ist
ein Graph, der die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration in
einer zu detektierenden Lösung
und das Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts zeigt.
-
Das
in der Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung
eingesetzte Tanninreagens ist ein allgemeiner Ausdruck für komplizierte
aromatische Verbindungen, die im Pflanzenreich weit verbreitet sind,
und viele phenolische Hydroxylgruppen aufweisen (Dictionary of Chemistry, Tokyo
Kagaku Dojin), wobei deren Molekularge wichte zwischen 600 und 2000
liegen (Encyclopaedia Chimica, Kyoritsu Shuppan).
-
Tanninsäure ist
eine Substanz, die durch die Formel C76H52O46 dargestellt
wird und die CAS-Registry Number 1401-55-4 besitzt. m-Galloyl-Gallussäure ist
eine Substanz, die durch die Formel C14H10O9 dargestellt
wird und die CAS Registry Number 536-08-3 besitzt.
-
Diese
Reagentien reagieren mit Protein in einer zu detektierenden Lösung, um
eine der Proteinkonzentration entsprechende Eintrübung zu
verursachen. Die Proteinkonzentration einer zu detektierenden Lösung kann
durch Vermischen dieser Reagentien darin gemessen werden. Zum Beispiel
werden, falls Urin als eine zu detektierende Lösung eingesetzt wird, diese
Reagentien im Urin vermischt, um die Proteinkomponente zu koagulieren
und um dadurch die optische Charakteristik zu verändern. Dann
kann in einer bevorzugten Ausführungsform
die Proteinkonzentration in der zu detektierende Lösung aus
der Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor
und nach dem Vermischen des Reagens ((Intensität des gestreuten Lichts nach
Vermischen des Reagens)/(Intensität des gestreuten Lichts vor dem
Vermischen des Reagens)) und/oder aus dem Verhältnis der Intensität des transmittierten
Lichts nach dem Vermischen des Reagens zu der vor dem Vermischen
des Reagens ((Intensität
des transmittierten Lichts nach dem Vermischen des Reagens)/(Intensität des transmittierten
Lichts vor dem Vermischen des Reagens)) bestimmt werden.
-
Falls
die Proteinkonzentration hoch ist (annähernd 250 bis 500 mg/dl oder
höher),
gibt es hierin Fälle,
in denen das Protein nicht vollständig koaguliert oder nicht
entsprechend der Konzentration koaguliert. In diesen Fällen ist
es unmöglich,
die Proteinkonzentration zu messen, weil das Protein nicht vollständig eintrübt oder
nicht eine der Konzentration entsprechende Trübung verursacht. Selbst in
solchen Fällen,
in denen eine Messung nicht durchgeführt werden kann, ist es möglich, das
Protein durch Vermischen eines pH-Einstellmittels in die Lösung zur
Regulierung von dessen pH-Wert nach dem Vermischen des ph-Einstellmittels
auf 1,5 bis 5,8 einzutrüben.
-
Es
ist anzumerken, dass die vorstehenden, erfindungsgemäß eingesetzten
Reagentien manchmal als ein pH-Einstellmittel fungieren. In solch
einem Fall ist die Zugabe eines pH-Einstellmittels nicht notwendig.
-
Auf
diese Art und Weise kann, selbst falls die Proteinkonzentration
hoch ist, eine der Proteinkonzentration entsprechende Trübung herbeigeführt werden,
und deshalb kann die Proteinkonzentration gemessen werden. Falls
Urin als eine zu detektierende Lösung
eingesetzt wird, ist es besonders zweckmäßig, eine Säure aus der Gruppe auszuwählen, welche
aus Kaliumhydrogenphthalat, Essigsäure, Zitronensäure und
Ascorbinsäure
besteht, und zwar als eine in das Reagens und/oder die zu detektierende
Lösung
zu vermischende Säure,
weil diese Säuren
leicht eine geeignete Pufferkapazität ergeben, billig sind, leicht
zu handhaben sind, und außerdem
die Möglichkeit
einer Induzierung der Präzipitation
eines Phosphats, eines Carbonats oder dergleichen ermöglichen,
und somit sehr gut einsetzbar sind.
-
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur
Messung einer Proteinkonzentration ist es möglich, eine Proteinkonzentration
zu bestimmen, die im Urin oder anderen Körperflüssigkeiten wie etwa cerebrospinale
Flüssigkeit,
Blutserum, Plasma und Speichel, Nahrungsmitteln wie etwa Molkereiprodukte, Spirituosen
und Essig, industriellen Flüssigkeiten
wie etwa Nährlösung, eine
in der künstlichen
Dialyse einge setzte Flüssigkeit
und deren Abfallflüssigkeit
und dergleichen enthalten ist.
-
Es
ist ebenso möglich,
eine Proteinkonzentration und die einer optisch aktiven Substanz,
außer Protein,
wie etwa Glukose zum gleichen Zeitpunkt durch Messung des Rotationswinkels
einer zu detektierenden Lösung,
gefolgt von der Mischung des Reagens in die zu detektierende Lösung zur
Messung dessen Proteinkonzentration zu bestimmen.
-
Das
heißt,
dass die vorliegende Erfindung ebenso bevorzugt ein Verfahren zur
Messung einer Konzentration einer Lösung umfasst, welches die Schritte
der Messung der Intensitäten
von wenigstens einem transmittierten Licht oder einem gestreuten
Licht einer zu detektierenden Lösung
vor und nach dem Vermischen eines Reagens darin, welches aus der
aus Tannin, Tanninsäure
und m-Galloyl-Gallussäure
bestehenden Gruppe ausgewählt
ist, und das Messen eines Rotationswinkels der zu detektierenden
Lösung
vor dem Vermischen des Reagens darin umfasst, wobei die Proteinkonzentration
in der zu detektierenden Lösung
basierend auf den Intensitäten
von wenigsten den transmittierten Licht oder dem gestreuten Licht
bestimmt wird und die Konzentration irgendeiner optisch aktiven
Substanz, außer Protein,
in der zu detektierenden Lösung
aus der Proteinkonzentration und dem Rotationswinkel bestimmt wird.
-
Als
solches ist die vorliegende Erfindung insbesondere zur Messung und
zum Testen einer Proteinkonzentration im Urin und einem Zuckerwert
im Urin unter Verwendung von Urin als eine zu detektierende Lösung effektiv,
weil es die Zuverlässigkeit
und Genauigkeit des Tests verbessert und im Wesentlichen dessen
Schritte vereinfacht.
-
Wie
vorstehend beschrieben ist es bevorzugt, dass das Reagens den pH-Wert
der zu detektierenden Lösung
auf 1,5 bis 5,8 reguliert und wenigstens eine Säure als ein pH-Einstellmittel enthält, das
aus der aus Kaliumhydrogenphthalat, Essigsäure, Zitronensäure und
Ascorbinsäure
bestehenden Gruppe ausgewählt
ist.
-
Deshalb
wird das Reagens bevorzugt in dem Zustand einer in Wasser gelösten wässrigen
Lösung eingesetzt.
Eine Konzentration des Reagens in der wässrigen Lösung liegt bevorzugt bei 250
g/dl oder geringer.
-
Ferner
ist es bevorzugt, dass die Konzentration des pH-Einstellmittels auf den höchstmöglichen Wert
eingestellt wird, so lange das pH-Einstellmittel sich in einem für das Reagens
anwendbaren Temperaturbereich nicht abscheidet.
-
In
den folgenden Abschnitten werden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen
bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung beschrieben. Jedoch ist die vorliegende
Erfindung nicht darauf beschränkt.
-
Ausführungsform 1
-
Eine
detaillierte Beschreibung wird an einem Beispiel mit Bezugnahme
auf 1 gegeben, in welchem eine wässrige Tanninlösung mit
einer Konzentration von 1 g/dl und eine zu detektierende Lösung in
einem Volumenverhältnis
von 1:1 vermischt wurden, um das Protein zu koagulieren und dadurch
die Lösung
einzutrüben,
und die Intensität
des gestreuten Lichts der zu detektierenden Lösung wurde gemessen und die
Proteinkonzentration wurde aus der Intensität bestimmt.
-
1 ist
eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einem Verfahren
zur Messung einer Proteinkonzent ration gemäß der vorliegenden Erfindung
eingesetzten Geräts
zeigt. 2 ist eine Draufsicht, die das optische System
des gleichen Geräts
zeigt. In diesen Figuren steht das Bezugszeichen 1 für ein Halbleiterlasermodul
als eine Lichtquelle, welche ein im Wesentlich paralleles Licht 2 mit
einer Wellenlänge
von 780 nm, einer Intensität von
3,0 mW und einem Strahlendurchmesser von 2,0 mm projiziert. Eine
Probenzelle 3 ist ein rechtwinkliger aus Glas hergestellter
Behälter
mit einer Grundfläche
von 10 × 10
mm und einer Höhe
von 50 mm mit einer oben liegenden Öffnung, wobei dessen Seite
transparente optische Fenster sind. Die Probenzelle 3 ist
zur Einstrahlung des im Wesentlichen parallelen Lichts 2 in
die darin enthaltene zu detektierende Lösung fähig, während das gestreute Licht 7 herauskommt.
Das transmittierte Licht und das gestreute Licht werden jeweils
mittels eines Photosensors 4 zur Detektion eines Lichts,
welches durch die Lösung hindurch
gegangen ist, und eines Photosensors 5 für das gestreute
Licht 7, welches während
des Durchlaufs des Lichts durch die Lösung auftritt, detektiert. Ein
Computer 6 steuert die Lichtquelle 1 und analysiert
die Ausgangssignale aus den Photosensoren 4 und 5.
-
Die
Schritte der Messung einer Proteinkonzentration unter Verwendung
einer wässrigen
Proteinlösung
als eine zu detektierende Lösung
wurden mit dem in 1 beschriebenen Messgerät durchgeführt. Es
ist anzumerken, dass die folgenden Operationen in einem Raum mit
einer Temperatur von ungefähr
40°C durchgeführt wurden,
wobei die Temperatur einer zu detektierenden Lösung, eines Reagens und eines
Messgeräts
jeweils bei ungefähr
40°C lagen.
-
Als
erstes wurden jeweils 1 ml einer zu detektierenden Lösung und
einer wässrigen
Tanninlösung
mit einer Konzentration von 1 g/dl in ein Becherglas gegeben, gefolgt
von einem Rühren.
Als nächstes
wurde die so erhaltene vermischte Lösung in die Probenzelle 3 eingeführt, woraufhin
der Computer die Lichtquelle 1 in Betrieb setzte und gleichzeitig
die Ausgabesignale aus den Photosensoren 4 und 5 maß.
-
Wenn
das wässrige
Tanninlösungsreagens in
die zu detektierenden Lösung
gemischt worden war, koagulierten die Proteinkomponenten, wobei
sie die zu detektierende Lösung
eintrübt,
um dadurch die Intensität
des transmittierten Lichts zu senken und die des gestreuten Lichts
zu steigern. Durch Analysieren eines jeden der Ausgabesignale der
Photosensoren 4 und 5 zu diesem Zeitpunkt wurde
die Proteinkonzentration bestimmt.
-
Wässrige Proteinlösungen (Serumalbumin) mit
entsprechenden Konzentrationen von 0, 2, 5, 15, 30, 60 und 100 mg/dl
wurden hergestellt. Die Intensitäten
des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts, d.h. die Ausgabesignale
aus den Photosensoren 4 und 5, wurden unter Verwendung
dieser Lösungen
mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren gemessen. Jedes der Ergebnisse
wurde in der 3 bzw. 4 geplottet.
In 3 gibt die Abszisse die Proteinkonzentration an
und die Ordinate gibt die Intensität des gestreuten Lichts (das
Ausgabesignal aus Photosensor 5) an. In 4 gibt
die Abszisse die Proteinkonzentration an und die Ordinate gibt die
Intensität
des transmittierten Lichts (das Ausgabesignal des Photosensors 4)
an. Es ist anzumerken, dass alle hier eingesetzten Lösungen transparent
wie Wasser waren und die Intensitäten des transmittierten Lichts
und des gestreuten Lichts vor dem Vermischen mit dem wässrigen
Tanninlösungsreagens
die gleichen wie Wasser waren. Zusätzlich wurde im Falle einer
zu detektierenden Lösung
mit einer Konzentration von 0, d.h. von Wasser, keine Änderung
der Intensität
des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts nach Vermischen
des wässrigen
Tanninlö sungsreagens
beobachtet und sie war im Wesentlichen transparent.
-
In 3 wurde
jeder der gemessenen Werte mit einer durchgezogenen Linie verbunden,
und die gemessenen Werte in dem Konzentrationsbereich von 0 bis
15 mg/dl, in der sich die Intensität des gestreuten Lichts linear
mit der Proteinkonzentration änderte,
wurden mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde
verlängert.
Wie aus diesen Linien ersichtlich ist, fallen die durchgezogene
und die gestrichelte Linie zusammen, und zwar bis die Proteinkonzentration
annähernd
15 mg/dl erreichte, und deshalb war die Intensität des gestreuten Lichts proportional
zur der Proteinkonzentration. Wenn jedoch die Proteinkonzentration
höher wurde,
wurde der gemessene Wert graduell niedriger als der entsprechende
Wert, der zu der Proteinkonzentration proportional war. Als Grund
wurde der Folgende angenommen. Falls die Proteinkonzentration höher wurde,
so stieg die Wahrscheinlichkeit, dass das Licht gestreut wurde.
Dies lies die Wahrscheinlichkeit ansteigen, dass das Licht erneut
gestreut wurde, während
das gestreute Licht sich von dem Punkt, an dem es entstand, zu dem Äußeren der
Probezelle sich fortsetzte, wodurch die Wahrscheinlichkeit, dass das
gestreute Licht den Photosensor 5 erreichen würde, sank.
Deshalb konnte bei der Berechnung der Proteinkonzentration aus der Änderung
der Intensität des
gestreuten Lichts der Konzentration in einem niedrigen Konzentrationsbereich
(ungefähr
15 mg/dl oder niedriger), in dem die Linearität sicher gestellt war, genauer
bestimmt werden.
-
In 4 steht
die Abszisse für
die Proteinkonzentration und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung)
gibt die Intensität
des transmittierten Lichts an. Jeder der gemessenen Werte wurde
durch eine durchgezogene Linie verbunden und die gemessenen Werte
im Proteinkonzentrationsbereich von 15 bis 100 mg/dl, in dem sich
der Logarithmus der Intensität
des transmittierten Lichts mit der Proteinkonzentration linear änderte,
wurde mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde
verlängert. Wie
in 4 gezeigt ist, lag der Messwert nicht auf der
gestrichelten Linie, falls die Proteinkonzentration niedrig war,
wie etwa 2 und 5 mg/dl. Es wurde angenommen, dass der Grund dafür darin
lag, dass das Ausgabesignal für
Einflüsse
von verschiedenen Störungen
anfälliger
war, weil die Änderung
des transmittierten Lichts verglichen mit der im gesamten Ausgabesignal
(= 1,0 V) im Falle, dass eine zu detektierende Lösung ohne Trübung eingesetzt
wurde, zu klein war. Daraus wurde bestätigt, dass bei der Berechnung
einer Proteinkonzentration aus der Änderung der Intensität des transmittierten
Lichts die zu detektierende Lösung
bevorzugt in einem hohen Konzentrationsbereich (ungefähr 15 mg/dl
oder höher)
lag, um die Einflüsse
der verschiedenen Störungen
zu vermeiden.
-
Deshalb
war es bevorzugt, dass die wie vorstehend erhaltenen 3 und 4 als
Standard-Kalibrierkurven (analytische Kurven) für einen niedrigen Konzentrationsbereich
bzw. einen hohen Konzentrationsbereich verwendet wurden. Obwohl die 3 und 4 Beispiele
zeigten, in welchen die Temperatur der zu detektierenden Lösung und
das Reagens, und die Umgebungstemperatur bei 40°C lagen, war es möglich, die
Messungen mit einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C durchzuführen. Deshalb
ermöglicht,
anders als das Verfahren unter Verwendung von Trichloressigsäure als
Reagens, das erfindungsgemäße Verfahren
eine mit einer Temperatur von 25°C
oder höher
durchgeführte
Messung, wobei es bei einer möglichen
Umgebungstemperatur zu Hause verwendet werden könnte.
-
Wie
vorstehend beschrieben konnte eine Proteinkonzentration in einer
zu detektierenden Lösung
durch Vermischen eines wässrigen
Tanninlösungsreagens
in die zu detektierende Lösung
zur Messung der Intensitäten
des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts davon bestimmt
werden.
-
Ferner
konnte durch Messung beider Intensitäten zur Bestimmung einer Konzentration
einer zu detektierenden Lösung
in einem niedrigen Konzentrationsbereich aus der Intensität des gestreuten Lichts
und der in einem hohen Konzentrationsbereich aus der Intensität des transmittierten
Lichts ein genau messbarer Konzentrationsbereich der zu detektierenden
Lösung,
d.h. ein dynamischer Bereich, im wesentlichen auf geweitet werden.
Dies eliminierte Herkömmlicherweise
benötigte
Schritte wie etwa die Verdünnung
einer zu detektierenden Lösung
in einem hohen Konzentrationsbereich, um dadurch die praktischen
Effekte für
eine höhere
Genauigkeit, Effizienz und Laborsicherheit der Messung und des Tests
stark zu verbessern.
-
In
dieser Ausführungsform
lag die Konzentration des wässrigen
Tanninlösungsreagens
bei 1 g/dl. In diesem Fall lag die Konzentration des Reagens nach
dem Vermischen in die zu detektierende Lösung bei 0,5 g/dl, weil das
Mischungsverhältnis des
Reagens zu der detektierenden Lösung
bei 1:1 lag. Jedoch könnte
eine Proteinkonzentration mit jeder anderen Konzentration des Reagens
nach dem Vermischen in einem Bereich von 5 × 10–3 bis
5 g/dl durch Ausbilden einer Kalibrierkurve, die der Tanninkonzentration
nach dem Vermischen des Reagens entspricht, gemessen werden. Falls
die Tanninkonzentration geringer als der vorstehende Bereich ist, gab
es Fälle,
in denen das Protein nicht koagulierte, so dass die Durchführung einer
stabilen Messung schwierig war. Falls die Tanninkonzentration höher als
der vorstehende Bereich war, gab es Fälle, in denen das koagulierte
Protein schnell präzipitierte,
um eine nicht gleichförmige
Trübung
zu verursachen, wobei die zu detektierende Lösung an einer der Konzentration
entsprechenden Eintrübung
rund um diesen Bereich, in dem im wesentlichen paralleles Licht 2 hindurchging,
gehindert wurde, so dass die Durchführung einer stabilen Messung
schwierig war. Deshalb war es praktisch bevorzugt, die Messung innerhalb
des vorstehenden Konzentrationsbereichs durchzuführen.
-
Ausführungsform 2
-
5 ist
eine Seitenansicht, die schematisch den Aufbau eines in einem Verfahren
zur Messung einer Proteinkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung
eingesetzten Geräts
zeigt. 6 ist eine Draufsicht des optischen Systems des
gleichen Geräts.
In diesen Figuren stehen die Bezugszeichen 1 bis 7 für die gleichen
Komponenten, die durch die entsprechenden Bezugszeichen in den 1 und 2 angegeben
wurden, und deren Konfigurationen sind ebenso die gleichen wie die
in den 1 und 2. Am Boden der Probenzelle 3 wurde ein
Einlass 8 für
ein Reagens vorgesehen, durch welchen das Reagens in einer vorbestimmten
Menge in die zu detektierende Lösung
in der Probenzelle 3 mit einer Pipette 9 zugemischt
wurde. Der Computer 6 steuerte die Lichtquelle 1 und
die Pipette 9, während der
Analyse der Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5.
-
In
dieser Ausführungsform
wurde eine wässrige
Tanninsäurelösung in
die zu detektierende Lösung
zur Koagulierung des Proteins gemischt, um dadurch die zu detektierende
Lösung
einzutrüben, und
die Proteinkonzentration wurde basierend auf der Änderung
der Trübung
nach dem Vermischen der wässrigen
Tanninsäurelösung bestimmt.
Genauer gesagt wurde ein wässriges
Tanninsäurelösungsreagens
mit einer Konzentration von 3 × 10–4 M
(entspricht 0,05 g/dl) und die zu detektie rende Lösung in einem
Volumenverhältnis
von 1 zu 9 zur Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts
und/oder des gestreuten Lichts vor und nach dem Vermischen des Reagens
vermischt, und die Proteinkonzentration in der zu detektierenden
Lösung
wurde aus den Intensitäten
bestimmt. Hierin lag die Konzentration an Tanninsäure in der
zu detektierenden Lösung
nach dem Vermischen des Reagens bei 3 × 10–5 M
(entspricht 5 × 10–3 g/dl).
Wie in Ausführungsform
1 wurden die folgenden Operationen in einem Raum mit einer Temperatur
von ungefähr
40°C durchgeführt, und
die Temperatur der zu detektierenden Lösung, des Reagens und des Messgeräts lagen
jeweils bei ungefähr 40°C.
-
Eine
Proteinkonzentration wurde durch Verwendung eines Urins als eine
zu detektierende Lösung
mit dem vorstehenden Messgerät
folgendermaßen
getestet.
-
Als
erstes wurden 1,8 ml einer zu detektierenden Lösung in die Probezelle 3 eingeführt, woraufhin
der Computer 6 die Lichtquelle 1 in Betrieb setzte
und gleichzeitig startete die Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 aufzuzeichnen.
Als nächstes
steuerte der Computer 6 die Pipette 9 in einer
solchen Art und Weise, dass 0,2 ml eines wässrigen Tanninsäurelösungsreagens
in die Probezelle 3 durch den Einlass 8 gemischt
wurde. Beim Vermischen des Tanninsäurereagens in der zu detektierenden
Lösung
koagulierten die Proteinkomponenten der zu detektierenden Lösung, um
die Lösung
einzutrüben,
um dadurch die Intensität
des transmittierten Lichts zu senken und die des gestreuten Lichts
zu steigern. Die Proteinkonzentration wurde durch Analysieren eines
jeden Ausgabesignals aus den Photosensoren 4 und 5 nach
dem Vermischen des Reagens bestimmt.
-
Die
Intensitäten
des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts, d.h., die
Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5, welche
durch Verwendung einer zu detektierenden Lösung mit einer Proteinkonzentration
von 5 mg/dl mit dem vorstehenden Verfahren gemessen wurden, wurden
in den 7 bzw. 8 geplottet. In den 7 und 8 steht die
Abszisse für
die verstrichene Zeit (Sekunde) nach Vermischen des Reagens, und
die Ordinate gibt die Intensitäten
des durch die Photosensoren detektierten Lichts an, wobei sie die Änderung
der Intensitäten des
gestreuten Lichts oder des transmittierten Lichts anzeigen, welche
von 60 Sekunden vor bis 300 Sekunden nach dem Vermischen des Reagens
auftraten.
-
Die
Korrelation zwischen der Änderung
der Intensität
des gestreuten Lichts und der Proteinkonzentration und die Korrelation
zwischen dem Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts und der Proteinkonzentration wurden in
den 9 bzw. 10 geplottet.
In der 9 gibt die Ordinate die Differenz zwischen den
Intensitäten
des gestreuten Lichts vor und 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens
((Intensität
des gestreuten Lichts nach Vermischen des Reagens) – (Intensität des gestreuten Lichts
vor Vermischen des Reagens)) an. In 10 gibt
die Ordinate das Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens
zu der vor Vermischen des Reagens an ((Intensität des transmittierten Lichts
nach Vermischen des Reagens)/(Intensität des transmittierten Lichts
vor Vermischen des Reagens)). Die Ergebnisse der Messung von Urin
mit entsprechenden Konzentrationen von 0, 15, 30, 60 und 100 mg/dl
als zu detektierende Lösung
wurde in den 9 und 10 geplottet,
zusätzlich
zu der zu detektierenden Lösung
mit einer Proteinkonzentration von 5 mg/dl. In diesen Fällen waren
alle zu detektierenden Messlösungen
optisch so transparent wie Wasser und die Intensitäten des
transmittierten Lichts und des gesteuerten Lichts vor Vermischen
des Reagens waren die gleichen wie Wasser.
-
In 9 wurde
jeder Messwert durch eine durchgezogene Linie verbunden und die
gemessenen Werte in dem Proteinkonzentrationsbereich von 0 bis 30
mg/dl, in dem die Menge der Änderung
der Intensität
des gestreuten Lichts (die Differenz zwischen den Intensitäten des
gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens) sich linear
mit der Proteinkonzentration änderten,
wurden mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Durch
Verwendung dieser durchgezogenen Linie als Kalibrierkurve konnte
die Proteinkonzentration erhalten werden. Wie aus diesen Linien ferner
ersichtlich ist, lagen die durchgezogene und die gestrichelte Linie übereinander,
bis die Proteinkonzentration annährend
30 mg/dl erreichte, und deshalb war die Menge der Änderung
der Intensität des
gestreuten Lichts proportional zu der Proteinkonzentration. Als
die Proteinkonzentration jedoch höher wurde, wurde der gemessene
Wert graduell niedriger als der entsprechende Wert, welcher proportional
zu der Proteinkonzentration war. Als Grund wurde das Folgende angenommen.
Wenn die Proteinkonzentration hoch wurde, so wurde die Wahrscheinlichkeit hoch,
dass das Licht gestreut wurde. Dies lies die Wahrscheinlichkeit
ansteigen, dass das Licht wiederum gestreut werden würde, während das
gestreute Licht von dem Punkt, an dem es auftrat, zu dem äußeren der
Probezelle sich fortsetzte, um dadurch die Wahrscheinlichkeit, dass
das gestreute Licht den Photosensor 5 erreichen würde, zu
senken. Deshalb könnte
bei der Berechnung einer Proteinkonzentration aus der Änderung
der Intensität
des gestreuten Lichts die Konzentration in einer höheren Genauigkeit
in einem niedrigen Konzentrationsbereich (ungefähr 30 mg/dl oder niedriger),
in dem die Linearität
sichergestellt war, bestimmt werden.
-
In 10 gibt
die Abszisse die Proteinkonzentration an, und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung)
gibt das Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor
Vermischen des Reagens an. Jeder der Messwerte wurde mit einer durchgezogenen
Linie verbunden und die gemessenen Werte in einem Proteinkonzentrationsbereich
von 60 bis 100 mg/dl, in dem sich der Logarithmus der Intensität des transmittierten
Lichts linear mit der Proteinkonzentration änderte, wurden mit einer gestrichelten
Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Wie in 10 gezeigt
ist, gab es bei einer Proteinkonzentration von nicht höher als
30 mg/dl Fälle,
in denen der gemessene Wert nicht auf der gestrichelten Linie lag.
Als Grund wurde angenommen, dass das Ausgabesignal für Einflüsse von
verschiedenen Störungen
anfälliger war,
weil die Änderung
des transmittierten Lichts verglichen mit den gesamten Ausgabesignal
zu klein war. Daraus wurde gefunden, dass bei Berechnung einer Proteinkonzentration
von der Intensität
des transmittierten Lichts die zu detektierten Lösung bevorzugt in einem hohen
Konzentrationsbereich (ungefähr
30 mg/dl oder höher)
lag, um die Einflüsse
von verschiedenen Störungen
zu vermeiden.
-
Wie
vorstehend beschrieben konnte eine Proteinkonzentration in einer
zu detektierenden Lösung
durch Messung der Intensitäten
des transmittierten Lichts oder des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen
des Reagens detektiert werden. Ferner konnte durch Messen beider
Intensitäten
zur Bestimmung einer Konzentration einer zu detektierenden Lösung in
einem niedrigen Konzentrationsbereich von der Intensität gestreuten
Lichts und der in einem hohen Konzentrationsbereich von der Intensität des transmittierten
Lichts ein mit hoher Genauigkeit messbarer Konzentrationsbereich
der zu detektierenden Lösung,
d.h. ein dynamischer Bereich, aufgeweitet werden.
-
Gemäß dieser
Ausführungsform
konnte eine Proteinkonzentration unter Verwendung eines Urins, welcher
durch Präzipitation
von verschiedenen Salzarten trübe
gemacht worden war, bestimmt werden. Dies wird im Folgenden beschrieben.
-
Als
erstes wurde ein trüber
Urin mit einer Proteinkonzentration von 30 mg/dl in die Probenzelle 3 als
eine zu detektierende Lösung
eingeführt.
Hierin lag das Ausgabesignal des Photosensors 5 (Intensität des gestreuten
Lichts) bei ungefähr
0,05 V. Da das Ausgabesignal des Photosensors 5 vor Vermischen des
Reagens 0,0 V im Falle einer zu detektierenden Lösung ohne Trübung aus 7 war,
konnte angegeben werden, dass die Differenz zwischen diesen Ausgabesignalen
das Niveau an Trübung
angegeben werden, das in der zu detektierenden Lösung dieser Ausführungsform
inhärent
war. Die diesen Wert entsprechende Proteinkonzentration war 10 bis
12 mg/dl bei Verwendung der in 9 gezeigten
durchgezogene Linie als einer Kalibrierkurve. Zu diesem Zeitpunkt
wurde das Reagens in die zu detektierende Lösung dazugemischt und die Änderung
der Ausgabesignale aus den Photosensoren 4 und/oder 5 wurde beobachtet.
Das Ausgabesignal des Photosensors 5 nach 300 Sekunden
nach Zumischung des Reagens betrug 0,19 V. Deshalb lag die Differenz
zwischen diesem Signal und dem Ausgabesignal nach 0 Sekunden nach
Vermischen des Reagens bei 0,14 V. Die dieser Differenz zwischen
dem Ausgabesignal (0,14 V) entsprechende Proteinkonzentration lag
bei 30 mg/dl, wenn die in 9 gezeigte
durchgezogene Linie als eine Kalibrierkurve genommen wird. Diese Konzentration
stimmte mit einer bekannten Konzentration überein, welche im Voraus gemessen
worden war. Daraus konnte bestätigt
werden, dass die Proteinkonzentration in der zu detektierenden trüben Lösung aus
der Differenz zwischen den Ausgabesignalen des Photosensors 5 vor
und nach Vermischen des Reagens durch Verwendung der Kalib rierkurve aus 9,
welche aus der zu detektierenden Lösung ohne Trübung erhalten
worden war, genau bestimmt werden konnte.
-
Wie
vorstehend beschrieben konnte die Konzentration einer Lösung ohne
irgendeinen Einfluss aufgrund der Trübung oder dergleichen durch
Berechnung der Konzentration der Lösung aus der Differenz zwischen
den Intensitäten
des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens genau bestimmt
werden.
-
Unterdessen
lag das Ausgabesignal des Photosensors 4 (Intensität des transmittierten
Lichts) vor Vermischen des Reagens bei 0,55 V. Da das Ausgabesignal
des Photosensors 4 vor Vermischen des Reagens bei 0,6 V
in einer zu detektierenden transparenten Lösung ohne Trübung lag,
wie in 8 gezeigt ist, konnte die Differenz der Trübung der
Lösung zugerechnet
werden. Das Ausgabesignal betrug 300 Sekunden nach Vermischen des
Reagens 0,45 V und deshalb betrug das Verhältnis dieser Signale 0,82. Die
dem Verhältnis
der Ausgabesignale (0,82) entsprechende Proteinkonzentration lag
bei 30 mg/dl, wenn die in 10 gezeigte
durchgezogene Linie als Kalibrierkurve hergenommen wird. Diese Konzentration
stimmte mit einer bekannten Konzentration überein, welche im Voraus gemessen
worden war. Daraus konnte bestätigt
werden, dass die Proteinkonzentration in einer zu detektierenden
Lösung
durch das Verhältnis
der Ausgabesignale des Photosensors 4 nach Vermischen des
Reagens zu dem vor Vermischen des Reagens und durch Umwandlung von
diesem zu einer Proteinkonzentration unter Verwendung von 10 als
Kalibrierkurve, die aus der zu detektierenden Lösung ohne Trübung erhalten worden
war, genau bestimmt werden konnte.
-
In
dieser Ausführungsform
wurde die Konzentration der Lösung
aus den Intensitäten
des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts unmittelbar
vor und 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens bestimmt. Jedoch
kann der Zeitraum geeigneter Weise gemäß dem Messgerät, der Charakteristik der
zu detektierenden Lösung
und des Tanninsäurereagens
wie etwa der Konzentration eingestellt werden.
-
Obwohl
die Beispiele in den 7 bis 10 gezeigt
wurden, in welchen die Temperatur der zu detektierenden Lösung und
des Reagens und die Umgebungstemperatur jeweils bei 40°C lag, war es
ebenso möglich,
die Messung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C durchzuführen. Deshalb
ermöglicht
das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung, anders als das Verfahren unter Verwendung von Trichloressigsäure als
Reagens, die Durchführung
der Messung bei einer Temperatur von 25°C oder höher, und könnte bei einer möglichen Umgebungstemperatur
zu Hause eingesetzt werden.
-
In
dieser Ausführungsform
wurden ein wässriges
Tanninsäurelösungsreagens
mit einer Konzentration von 3 × 10–4 (entspricht
0,05 g/dl) und eine zu detektierende Lösung mit einen Volumenverhältnis von
0,1 bis 0,9 vermischt, um die Tanninsäurekonzentration in der zu
detektierenden Lösung
auf 3 × 10–5 (entspricht
5 × 10–3 g/dl)
nach Vermischen des Reagens zu regulieren. Die Proteinkonzentration könnte jedoch
mit irgendeiner anderen Konzentration des Reagens nach dem Vermischen
im Bereich von 3 × 10–5 bis
3 × 10–2 M
(entspricht 5 × 10–3 bis
5 g/dl) durch Ausbildung einer Kalibrierkurve, die der Tanninsäurekonzentration
nach Vermischen des Reagens entspricht, gemessen werden. Falls die
Tanninsäurekonzentration
geringer als der vorstehende Bereich ist, gab es Fälle, in
denen das Protein nicht koagulierte, so dass die Durchführung einer
stabilen Messung schwierig war. Falls die Tanninsäurekonzentration
höher als
der vorstehende Bereich war, präzipitierte
das koagulierte Protein schnell, um eine ungleichförmige Trübung zu
verursachen, was verhinderte, dass die zu detektierende Lösung rund
um den Bereich, durch den das im Wesentlich parallele Licht 2 hindurchging,
sich entsprechend der Konzentration eintrübte, so dass die Durchführung einer
stabilen Messung erschwert war. Deshalb war es praktisch bevorzugt,
dass die Messung innerhalb des vorstehend Konzentrationsbereichs
durchgeführt
wurde.
-
In
dieser Ausführung
lag das Mischungsverhältnis
der zu detektierenden Lösung
zu dem Reagens bei 9:1. Selbst falls eine Tanninsäurekonzentration
nach dem Vermischen des Reagens bei 3 × 10–5 M
(entspricht 5 × 10–3 g/dl)
lag, welche die gleiche wie in dem vorstehend Beispiel war, änderte sich
jedoch die Kalibrierkurve, wenn das Mischungsverhältnis unterschiedlich
war. Deshalb war es notwendig, eine dem Mischungsverhältnis entsprechende
Kalibrierkurve zu erzeugen. Wenn hierin das Mischungsverhältnis der
zu detektierenden Lösung
zu dem Reagens anstieg, z.B. auf 1:1, wurde die Trübung der
zu detektierenden Lösung
verglichen mit der zu detektierenden Lösung mit der gleichen Proteinkonzentration
niedriger. Deshalb war es Vorteilhaft, wenn die Tanninsäurekonzentration
nach dem Vermischen des Reagens konstant gehalten wurde, ein wässriges Tanninsäurelösungsreagens
mit einer hohen Tanninsäurekonzentration
einzusetzen, weil die Absenkung des Mischungsverhältnisses
zur Vereinfachung der Verbesserung der Empfindlichkeit der zu detektierenden
Lösung
hinsichtlich der Proteinkonzentration effektiv war. Hier konnte
bestätigt
werden, dass eine Tanninsäurekonzentration,
in der weder eine Präzipitation
noch eine Denaturierung auftrat, nicht höher als 1,5 M (entspricht 250
g/dl) war. Deshalb war es effektiv, die Konzentration des wässrigen
Tanninsäurelösungsreagens
auf nicht höher
als diese Konzentration einzustellen.
-
Ausführungsform 3
-
In
dieser Ausführungsform
wurde die Anwesenheit oder die Abwesenheit eines Hindernisses aufgrund
eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase in einer zu detektierenden
Lösung
durch Messen der Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 und
Vergleich der gemessenen Werte unter Verwendung des in den 5 und 6 gezeigten Geräts mit dem
gleichen Verfahren wie in Ausführungsform 2 detektiert.
-
Falls
irgendein suspendiertes Teilchen wie etwa eine Blase in einer zu
detektierenden Lösung vorhanden
war und in den optischen Weg des im Wesentlichen parallelen Lichts 2 eindrang,
wurde das im Wesentlichen parallele Licht 2 gestreut, und
dadurch wurde die genaue Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts
und/oder des gestreuten Lichts mit einem Fehler behaftet. In diesem
Falle sank die Intensität
des transmittierten Lichts substantiell. Andererseits sank entweder
die Intensität
des gestreuten Lichts substantiell oder sie stieg an, und zwar in Abhängigkeit
des Sichtwinkels des Photosensors 5, des Orts des suspendierten
Teilchens wie etwa einer Blase, die in dem optischen Weg vorhanden
war, und dergleichen.
-
Falls
kein Hindernis aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer
Blase vorhanden war, bestand eine bestimmte Beziehung zwischen der
Intensität
des gestreuten Lichts und der Intensität des transmittierten Lichts,
wie in den 9 und 10 gezeigt
ist. Zum Beispiel lag die Differenz zwischen den Intensitäten des
gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens bei 0,14 V
und das Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor
Vermischen des Reagens lag bei 0,82 in dem Falle, in dem die Proteinkonzentration
der zu detektierenden Lösung 30 mg/dl
betrug. Falls wie vorstehend jedoch ein Hindernis auftrat, wurde
ein zu der vorstehenden Beziehung inkonsistenter Wert gemessen.
Deshalb konnte die Anwesenheit oder Abwesenheit des vorstehend erwähnten Hindernisses
detektiert werden, und zwar durch eine Überprüfung, ob die durch den gemessenen
Wert des Photosensors 4 erhaltene Proteinkonzentration,
basierend auf der Kalibrierkurve der 10, mit
der aus den gemessenen Werten des Photosensors 5 vor und
nach Vermischen des Reagens, basierend auf der Kalibrierkurve der 9, erhaltene
Konzentrationen identisch waren.
-
Wie
vorstehend beschrieben wurde, konnte gemäß dieser Ausführungsform
ein Hindernis aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase
zur Verhinderung einer fehlerbehafteten Messung detektiert werden,
und zwar durch Messen beider Intensitäten des transmittierten Lichts
und des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des wässrigen
Tanninsäurelösungsreagens
und durch Vergleichen der Intensitäten. Dies verbesserte die Zuverlässigkeit
der Messung und trägt
für einen
praktischen Effekt bei, nämlich
zur Ermöglichung
einer verbesserten Zuverlässigkeit
und Laborsicherheit für die
Messungen und Tests.
-
Ausführungsform 4
-
In
dieser Ausführungsform
wurde der Rotationswinkel einer zu detektierenden Lösung gemessen,
bevor darin das Reagens zugemischt wurde. Eine wässrige m-Galloyl-Gallussäurelösung wurde
in die zu detektierende Lösung
gemischt, um das Protein zu koagulieren, so dass die zu detektierende
Lösung
eingetrübt
wurde, die Proteinkonzentration wurde aus der Änderung der Trübung nach
Vermischen des Reagens gemessen und die Konzentration irgendeiner
optisch aktiven Substanz, außer
Protein, wurde aus den gemessenen Werten bestimmt.
-
11 ist
ein Diagramm, das den Aufbau eines in dieser Ausführungsform
eingesetzten Messgeräts
veranschaulicht. Ein Halbleiterlasermodul als eine Lichtquelle 11 projiziert
ein im wesentliches paralleles Licht 12 mit einer Wellenlänge von
670 nm, einer Intensität
von 3,0 mW und einem Strahldurchmesser von 2,0 mm. Ein Polarisator 17 lässt nur
eine polarisierte Lichtkomponente durch, welche parallel zu der
Ebene dieses Blattes ist. Eine Probenzelle 13 für das Halten
einer zu detektierenden Lösung
ist durch eine Solenoidspule 14 rundherum umwickelt, so
dass ein magnetisches Feld an die zu detektierende Lösung in
Richtung der Ausbreitung des im wesentlichen parallelen Lichts 12 angelegt
werden kann und besitzt eine substantielle optische Weglänge von 50
mm und eine begrenzte Füllmenge
von 5 ml. Dies moduliert und steuert die Richtung der Polarisation durch
Modulieren und Steuern des durch die Solenoidwicklung 14 hindurch
tretenden Stroms unter Verwendung des optischen Faradayeffekts der
zu detektierenden Lösung.
Das Grundprinzip des Verfahrens zur Messung eines Rotationswinkels
unter Einsatz des Faradayeffekts, der in der zu detektierenden Lösung inhärent ist,
ist in der offen gelegten Japanischen Patentschrift Nr. Hei 9-145605
beschrieben.
-
Die
Probenzelle 13 ist mit einem Einlass 15 für das Reagens
und einem Belüftungsloch 16 für den Eintritt
und Austritt von Luft versehen. Ein Analysator 18 ist derart
angeordnet, dass er nur eine polarisierte Lichtkomponente durchlässt, welche
senkrecht zu der Ebene dieses Blattes ist. Das im Wesentlichen parallele
Licht 12, welches durch den Analysator 18 hindurch
passiert, wird an einem Photosensor 19 detektiert. Ein
Signalgenerator 21 erzeugt ein moduliertes Signal, welches
den durch die Solenoidspule 14 hindurch passierenden Strom
moduliert, zu einem Spulenantriebsgerät 20. Das Spulenantriebsgerät 20 steuert
den durch die Solenoidspule 14 hindurch passierenden Strom.
Ein Einschluss verstärker 22 ermöglicht die
phasensensitive Detektion am Ausgangsignal des Photosensors 19 unter
Verwendung des modulierten Signals der Solenoidspule 14 als
einem Referenzsignal. Bei der Messung eines Rotationswinkels der
zu detektierenden Lösung
liefert der Computer 23 ein Steuerungsstromsignal zu dem Spulenantriebsgerät 20 in
der Art und Weise, dass das Ausgangssignal des Einschlussverstärkers 22 Null
wird.
-
Genauer
gesagt werden nach der Messung eines Rotationswinkels der zu detektierenden
Lösung
ein wässriges
m-Galloyl-Gallussäurelösungreagens
mit einer Konzentration von 7,8 × 10 M (entspricht 250 g/dl)
und die zu detektierende Lösung
in einem Volumenverhältnis
von 1:49 vermischt, um die Intensitäten des transmittierten Lichts
vor und nach Vermischen des Reagens zu messen. Dann wurde die Proteinkonzentration
in der zu detektierenden Lösung
aus dieser Intensität
erhalten und die Konzentration irgendeiner optischen aktiven Substanz,
außer Protein,
wurde aus der Proteinkonzentration und dem Rotationswinkel bestimmt.
Hier lag die Konzentration der wässrigen
m-Galloyl-Gallussäurelösung nach
Vermischen des Reagens bei 1,6 × 10–1 M
(entspricht 5 g/dl). Im Folgenden wird dies detaillierter erläutert.
-
In
dieser Ausführungsform
wurde ein Modulationsstrom mit einer Amplitude von 0,001 A und einer
Frequenz von 1,3 kHz durch die Solenoidspule 14 hindurch
passieren lassen. Dadurch wurde das Steuerstromsignal zur Berechnung
des Rotationswinkels detektiert, und zwar wenn das Ausgangssignal
des Einlassverstärkers 22 gleich
Null wurde. Hier wurde ein Verfahren genommen, in welchem der Rotationswinkel
aus dem Steuerstromsignal bestimmt wurde, welches ein magnetisches
Feld gab, in dem der Rotationswinkel aufgrund von Protein oder Glukose
als einer optisch aktiven Substanz in einer zu detektierenden Lösung identisch
mit dem Rotationswinkel des Lösungsmittels
Wasser der zu detektierenden Lösung
in der Richtung der Polarisation aufgrund eines Faradayeffekts,
verursacht durch das Anlegen eines magnetischen Felds, war.
-
Mit
einer Pipette 24 wurden 0,1 ml einer wässrigen m-Galloyl-Gallussäurelösung in die zu detektierende
Lösung
in der Probenzelle 13 aus dem Einlassventil 15 über eine
Röhre 25 gemischt.
Der Computer 23 steuerte die Lichtquelle 11 und
die Pipette 24, während
das Ausgangssignal mittels des Photosensors 19 analysiert
wurde.
-
Eine
Glukosekonzentration (Zuckerwert im Urin) und eine Proteinkonzentration
im Urin wurden mittels eines Urins als eine zu detektierende Lösung mit
dem vorstehenden Gerät
folgendermaßen
getestet.
-
Als
erstes wurde die zu detektierende Lösung in die Probezelle 13 eingeführt, woraufhin
der Computer 23 die Lichtquelle 11 und das Spulenantriebsgerät 20 zur
Messung eines Rotationswinkels der zu detektierenden Lösung in
Betrieb setzte.
-
Als
nächstes
stoppte der Computer 23 die Operation des Spulenantriebsgeräts 20 und
gleichzeitig startete die Aufnahme eines Ausgabesignals des Photosensors 19.
Dann steuerte der Computer 23 die Pipette 24 in
einer solchen Art, dass das wässrige
m-Galloyl-Gallussäurelösungsreagens
in die zu detektierende Lösung
in der Probezelle 13 aus dem Einlassventil 15 gemischt
wurde. Unter der Annahme, dass die Änderung des Ausgangssignals
des Photosensors 19 nach Vermischen des Reagens die Änderung
der Intensität
des transmittierten Lichts war, wurde eine Kalibrationslinie entsprechend 10 basierend
auf dem analytisierten Verhältnis der
Intensität
des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der Intensität vor Vermischen des
Reagens unter Verwen dung von Urin mit entsprechenden Proteinkonzentrationen
von 0, 2, 5, 15 und 60 mg/dl als zu detektierende Lösungen mit
dem gleichen Verfahren wie in Ausführungsform 2 erzeugt. Diese
Kalibrierkurve ist in 12 gezeigt.
-
In
dem Fall, in dem Urin mit einem Zuckerwert im Urin von 100 mg/dl
und einer Proteinkonzentration im Urin von 15 mg/dl als die zu detektierende Lösung als
ein Beispiel der vorstehenden Messung eingesetzt wurde, lag der
Rotationswinkel bei 0,017°. Der
spezifische Rotationswinkel von Glukose bei dieser Wellenlänge (670
nm) lag bei 40° deg/cm·dl/kg. Unter
der Annahme, dass der gesamte gemessene Rotationswinkel auf der
Glukose basierte, lag die Glukosekonzentration, d.h., der Zuckerwert
im Urin bei 85 mg/dl. Unterdessen lag die Proteinkonzentration,
bestimmt aus 12, bei 15 mg/dl, weil das Verhältnis der
Intensität
des transmittierten Lichts 0,41 war. Da der spezifische Rotationswinkel
des Proteins bei –40° deg/cm·dl/kg
lag, war der Rotationswinkel für
das Protein –0,003°. Deshalb
wurde der wahre Rotationswinkel für Glukose mit 0,02° durch Subtraktion
von –0,003° von den
vorstehend erwähnten 0,017° berechnet
und die Glukosekonzentration wurde als 100 mg/dl berechnet.
-
Daraus
wurde bestätigt,
dass ein Zuckerwert im Urin und eine Proteinkonzentration im Urin
gleichzeitig durch Messung des Rotationswinkels der zu detektierenden
Lösung
vor Vermischen des wässrigen
m-Galloyl-Gallussäurelösungreagens
und durch Messen des Verhältnisses
der Intensität
des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu dem vor
Vermischen des Reagens genau bestimmt werden konnte.
-
Wie
vorstehend beschrieben konnte gemäß dieser Ausführungsform
die Konzentration an Protein und die von Glukose, welche eine weitere
optisch aktive Substanz neben dem Protein ist, gleichzeitig bestimmt
werden und deshalb war das Verfahren dieser Ausführungsform praktisch insbesondere
dann praktikabel, wenn eine zu detektierende Lösung Urin war. Dies wird im
Folgenden erläutert.
-
Falls
eine Proteinkonzentration im Urin normal ist, ist Glukose die vorherrschende
optisch aktive Substanz im Urin. Deshalb kann der Zuckerwert im Urin
grob durch Messen des Rotationswinkels von Urin untersucht werden.
Jedoch kann eine Urinanalyse genauer durch Bestimmen einer Proteinkonzentration
im Urin mit einem anderen Messverfahren als den, das auf einem Rotationswinkel
basiert, gemessen werden. Der Grund liegt darin, dass beim Messen
einer Proteinkonzentration im Urin basierend auf dem Rotationswinkel
die Kombination des Rotationswinkels für Glukose und der für Protein
als der Rotationswinkel von Urin beobachtet werden, da das Protein
ebenso eine optisch aktive Substanz wie Glukose ist. Deshalb können in
dieser Ausführungsform
ein Zuckerwert im Urin und eine Proteinkonzentration im Urin genau
bestimmt werden, und zwar durch das Erhalten der Proteinkonzentration
aus der Änderung der
optischen Charakteristik nach Vermischen des Reagens, neben dem
Messen des Rotationswinkels, und durch Korrigieren des gemessenen
Rotationswinkels, basierend auf der so gemessenen Proteinkonzentration.
-
Wenn übrigens
das Reagens in die zu detektierende Lösung vor Messung des Rotationswinkels gemischt
wurde, koagulierte die Proteinkomponente, um dadurch zu verhindern,
dass das durch die Lösung
transmittierte Licht detektiert wird, oder um dadurch eine Proteindenaturierung
zu verursachen, so dass der Rotationswinkel verändert wird. Somit war es nicht
möglich,
den Zuckerwert im Urin und die Proteinkonzentration im Urin genau
zu bestimmen.
-
In
dieser Ausführungsform
wurde der Rotationswinkel und die Intensität des transmittierten Lichts
unter Verwendung eines Lichts mit einer Wellenlänge von 670 nm gemessen. Im
Allgemeinen steigt der spezifische Rotationswinkel einer Substanz mit
der Abnahme der Wellenlänge
an, bis die Wellenlänge
die Wellenlänge
erreicht, an der die der Substanz inhärente Absorption (rund 180
nm im Falle von Glukose) beginnt. Außerdem steigt die Trübung aufgrund
der Koagulation von Protein mit sinkender Wellenlänge. Deshalb
ist es hinsichtlich der Empfindlichkeit vorteilhafter, dass der
Rotationswinkel, die Intensitäten
des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts unter Verwendung
eines Lichts mit einer kürzeren
Wellenlänge
gemessen werden. Falls jedoch die zu detektierende Lösung Urin
ist, wird Licht mit einer Wellenlänge von 500 nm oder kürzer durch
einen im Urin enthaltenen Farbstoff wie etwa Urochrom absorbiert.
Aus diesem Grund ist die Genauigkeit der Messung manchmal verschlechtert,
wenn die Messung mit einem Licht mit einer Wellenlänge von
500 nm oder kürzer
durchgeführt
wird. Deshalb war es praktikabel, dass die Messung unter Verwendung
eines Lichts mit einer Wellenlänge
von 500 nm oder länger durchgeführt wurde.
-
In
dieser Ausführungsform
lag das Mischungsverhältnis
der zu detektierenden Lösung
zu dem Reagens bei 49:1. Selbst wenn die Konzentration von m-Galloyl-Gallussäure nach
Vermischen des Reagens bei 1,6 × 10–1 M
(entspricht 5 g/dl) lag, welches die gleiche wie in dem vorstehenden
Beispiel war, änderte
sich jedoch die Kalibrierkurve, wenn das Mischungsverhältnis unterschiedlich
war. Deshalb war es notwendig, eine Kalibrierkurve entsprechend dem
Mischungsverhältnis
zu erzeugen. Weil das Mischungsverhältnis der zu detektierenden
Lösung
zu dem Reagens anstieg, z.B. auf 1:1, sank hierin die Trübung der
zu detektierenden Lösung
mit gleicher Konzentration. Deshalb war es Vorteilhaft, wenn die Tanninsäurekonzentration
nach dem Vermischen des Reagens konstant gehalten wurde, ein wässriges m-Galloyl-Gallussäurelösungsreagens
mit einer hohen m-Galloyl-Gallussäurekonzentration
einzusetzen, weil die Absenkung des Mischungsverhältnisses zur
Vereinfachung der Verbesserung der Empfindlichkeit der zu detektierenden
Lösung
hinsichtlich der Proteinkonzentration effektiv war. Hier wurde bestätigt, dass
die Konzentration von m-Galloyl-Gallussäure, in
der weder eine Präzipitation
noch eine Denaturierung auftrat, bei 7,8 M (entspricht 250 g/dl)
oder niedriger lag. Deshalb war es effektiv, die Konzentration des
wässrigen
m-Galloyl-Gallussäurslösungsreagens
auf nicht höher
als diese Konzentration einzustellen.
-
Ausführungsform 5
-
In
dieser Ausführungsform
wurde ein wässrige
Tannin/Zitronensäure-Lösung mit
einer Tanninkonzentration von 1 g/dl und einer Zitronensäurekonzentration
von 20 g/dl als Reagens eingesetzt. Der pH-Wert des Reagens lag
annähernd
bei 1,4 bis 1,5.
-
Das
vorstehende Reagens und die zu detektierende Lösung wurden mit einem Volumenverhältnis von
1.1 zur Koagulation des Proteins vermischt, um dadurch die Lösung einzutrüben, die
Intensität des
gestreuten Lichts der Lösung
wurde gemessen und die Proteinkonzentration wurde aus der Intensität bestimmt.
-
Der
Schritt der Messung der Proteinkonzentration unter Verwendung einer
wässrigen
Proteinlösung
als eine zu detektierende Lösung
wurde mit dem in 1 beschriebenen Messgerät durchgeführt. Es
ist anzumerken, dass die folgenden Operationen in einem Raum mit
einer Temperatur von ungefähr
40°C durchgeführt wurden
und die Temperatur einer zu detek tierenden Lösung, eines Reagens und eines
Messgeräts
jeweils bei ungefähr
40°C lagen.
-
Als
erstes wurden 1 ml einer zu detektierenden Lösung und einer wässrigen
Tannin/Zitronensäure-Lösung mit
einer Tanninkonzentration von 1 g/dl und einer Zitronensäurekonzentration
von 20 g/dl in ein Becherglas geschüttet, gefolgt von Rühren. Als nächstes wurde
die so erhaltene gemischte Lösung in
die Probenzelle 3 eingeführt, woraufhin der Computer 6 die
Lichtquelle 1 in Betrieb setzte und gleichzeitig die Ausgabesignale
der Photosensoren 4 und 5 analysierte.
-
Beim
Vermischen des Reagens der wässrigen
Tannin/Zitronensäure-Lösung und
der zu detektierenden Lösung
koagulierten die Proteinkomponenten, um die Lösung einzutrüben, dadurch
wurde die Intensität
des transmittierten Lichts gesenkt und die des gestreuten Lichts
gesteigert. Die Proteinkonzentration wurde durch Analysieren der
Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 zu diesem
Zeitpunkt bestimmt.
-
Wässrige Proteinlösungen (Serumalbumin) mit
entsprechender Konzentration von 0, 2, 5, 15, 30, 60, 100, 250 und
500 mg/dl wurden hergestellt. Die Intensitäten des gestreuten Lichts und
des transmittierten Lichts, d.h. die Ausgabesignale aus den Photosensoren 4 und 5,
wurden unter Verwendung dieser Lösungen
mit den vorstehend beschriebenen Verfahren gemessen. Jedes der Ergebnisse
wurde in der 13 bzw. 14 geplottet.
In 13 gibt die Abszisse die Proteinkonzentration
an und die Ordinate gibt die Intensität des gestreuten Lichts (das
Ausgabesignal aus Photosensor 5) an. In 14 gibt
die Abszisse die Proteinkonzentration an und die Ordinate gibt die
Intensität
des transmittierten Lichts (das Ausgabesignal des Photosensors 4)
an. Es ist anzumerken, dass alle hier eingesetzten Lösungen transparent
wie Wasser waren und die Intensitäten des transmittierten Lichts
und des gestreuten Lichts vor dem Vermischen mit dem vorstehenden
Reagens die gleichen wie Wasser waren. Zusätzlich wurde im Falle einer
zu detektierenden Lösung
mit einer Konzentration von 0, d.h. von Wasser, keine Änderung
der Intensität
des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts nach Vermischen
des Reagens beobachtet und die zu detektierende Lösung war
im Wesentlichen transparent.
-
In 13 wurde
jeder der gemessenen Werte mit einer durchgezogenen Linie verbunden,
und die gemessenen Werte in dem Konzentrationsbereich von 0 bis
15 mg/dl, in der sich die Intensität des gestreuten Lichts linear
mit der Proteinkonzentration änderte,
wurden mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde
verlängert.
Wie aus diesen Linien ersichtlich ist, fallen die durchgezogene
und die gestrichelte Linie zusammen, und zwar bis die Proteinkonzentration
annähernd
15 mg/dl erreichte, und deshalb war die Intensität des gestreuten Lichts proportional
zur der Proteinkonzentration. Wenn jedoch die Proteinkonzentration
höher wurde,
wurde der gemessene Wert graduell niedriger als der entsprechende
Wert, der zu der Proteinkonzentration proportional war. Als Grund
wurde der Folgende angenommen. Falls die Proteinkonzentration höher wurde,
so stieg die Wahrscheinlichkeit, dass das Licht gestreut wurde.
Dies lies die Wahrscheinlichkeit ansteigen, dass das Licht erneut
gestreut wurde, während
das gestreute Licht sich von dem Punkt, an dem es entstand, zu dem Äußeren der
Probezelle sich fortsetzte, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass das
gestreute Licht den Photosensor 5 erreichen würde, sank.
Deshalb konnte bei Berechnung der Proteinkonzentration aus der Änderung
der Intensität des
gestreuten Lichts die Konzentration in einem niedrigen Konzentrationsbereich (ungefähr 15 mg/dl oder
niedriger), in dem die Linearität
sicher gestellt war, genauer bestimmt werden. Eine Proteinkonzentration
in einem mittleren und einem hohen Konzentrationsbereich (über 15 mg/dl
oder höher),
welche nicht mit der Linearität übereinstimmten,
konnten durch Verwendung einer durch die durchgezogene Linie gezeigten
Kalibrierkurve bestimmt werden.
-
Es
wurde ebenso bestätigt,
dass eine Konzentration im Bereich von bis zu 500 mg/dl direkt gemessen
werden kann, da die zu detektierende Lösung keine vollständige Sättigung
erreichte.
-
Falls
hierin Zitronensäure
nicht in die wässrige
Tanninlösung
gemischt wurde, gab es einen Fall, in dem die Intensität des gestreuten
Lichts (Ausgabesignal des Photosensors 5) bei einer Konzentration von
500 mg/dl gleich 1,0 V oder niedriger wurde, was zu einer fehlerhaften
Operation führte,
in welche die Konzentration als ungefähr 120 mg/dl oder niedriger angenommen
wurde.
-
Wie
jedoch in dieser Ausführungsform
gezeigt ist, war es durch Verwendung eines durch Vermischen von
Zitronensäure
in einer wässrigen
Tanninlösung
hergestellten Reagens möglich,
eine der Konzentration entsprechende Trübung zur verursachen, und zwar
selbst für
den Fall einer zu detektierenden Lösung mit einer hohen Konzentration
wie etwa 500 mg/dl.
-
In 14 steht
die Abszisse für
die Proteinkonzentration und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung)
gibt die Intensität
des transmittierten Lichts an. Jeder der gemessenen Werte wurde
durch eine durchgezogene Linie verbunden und die gemessenen Werte
im Proteinkonzentrationsbereich von 15 bis 100 mg/dl, in dem sich
der Logarithmus der In tensität
des transmittierten Lichts mit der Proteinkonzentration linear änderte,
wurde mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde
verlängert. Wie
in 4 gezeigt ist, lag der Messwert nicht auf der
gestrichelten Linie, falls die Proteinkonzentration niedrig war,
wie etwa 2 und 5 mg/dl. Es wurde angenommen, dass der Grund dafür darin
lag, dass das Ausgabesignal für
Einflüsse
von verschiedenen Störungen
anfälliger
war, weil die Änderung
des transmittierten Lichts verglichen mit der im gesamten Ausgabesignal
(= 1,0 V) im Falle, dass eine zu detektierende Lösung ohne Trübung eingesetzt
wurde, zu klein war. Daraus wurde bestätigt, dass bei der Berechnung
einer Proteinkonzentration aus der Änderung der Intensität des transmittierten
Lichts, die zu detektierende Lösung
bevorzugt in einem hohen Konzentrationsbereich (ungefähr 15 bis
100 mg/dl oder höher)
lag, um die Einflüsse
der verschiedenen Störungen
zu vermeiden.
-
Falls
jedoch die Konzentration im hohen Konzentrationsbereich (ungefähr 100 mg/dl
oder höher)
lag, unterschied sich die durchgezogene Linie graduell von der linearen
gestrichelten Linie. Der Grund wurde folgendermaßen angenommen. Wenn die Trübung extrem
hoch wurde, trat das folgende Phänomen
als ein Ergebnis der Streuungen wie etwa Mehrfachstreuung auf: Ein
Licht, welches mehrere Wege durchwandert, erreicht den Photosensor 4;
das Ausgabesignal des Photosensors 4 sinkt (ungefähr 10–4 V),
um hinsichtlich des Einflusses verschiedener Störungsarten anfälliger zu
werden. Deshalb konnte bei Bestimmung einer Proteinkonzentration
aus der Intensität
des transmittierten Lichts die Konzentration im hohen Konzentrationsbereich
(von ungefähr
15 bis 100 mg/dl), in dem die Linearität sicher gestellt war, genauer
bestimmt werden. Eine Proteinkonzentration in einem mittleren und
hohen Konzentrationsbereich (über
100 mg/dl), welche die Linearität
nicht sicherstellte, konnte durch Verwendung einer durch die durchgezogene
Linie gezeigten Kalibrierkurve bestimmt werden. Es wurde ebenso
bestätigt,
dass eine Proteinkonzentration im Bereich von bis zu 500 mg/dl direkt
gemessen werden konnte, weil die zu detektierende Lösung nicht
vollständig
gesättigt
war.
-
Falls
hierin Zitronensäure
nicht in die wässrige
Tanninlösung
gemischt wurde, gab es Fälle,
in denen die Intensität
des transmittierten Lichts (Ausgabesignal des Photosensors 4)
bei einer Proteinkonzentration von 500 mg/dl gleich 0,05 V oder
höher wurde,
was zu fehlerhaften Operationen führte, in welchen die Konzentration
als ungefähr
120 mg/dl oder niedriger angenommen wurde. Durch Verwendung eines
durch Vermischen von Zitronensäure
in einer wässrigen
Tanninlösung
hergestellten Reagens war es jedoch möglich, die der Konzentration
entsprechende Trübung
zu verursachen, selbst falls die zu detektierende Lösung eine
hohe Konzentration wie etwa 500 mg/dl besaß, wie in dieser Ausführungsform
gezeigt wurde. Deshalb konnte eine hohe Genauigkeit durch Verwendung
der so erhaltenen gestrichelten Linie der 3 und 4 zur
Berechnung der Konzentrationen in einem hohen Konzentrationsbereich
bzw. einem niedrigen Konzentrationsbereich sichergestellt werden.
-
Obwohl
in den 13 und 14 Beispiele gezeigt
sind, in welchen die Temperatur der zu detektierenden Lösung und
des Reagens, und die Umgebungstemperatur bei 40°C lagen, war es möglich die Messungen
mit einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C durchzuführen. In diesem Fall war es
jedoch bevorzugt, die gestrichelte Linie und die feste Linie, die
denen in 13 und 14 für die entsprechenden
Temperaturen entsprechen, zu verwenden. Deshalb ermöglicht,
anders als das Verfahren unter Verwendung von Trichloressigsäure als
Reagens, das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung das Durchführen
von Messungen bei einer Temperatur von 25°C o der höher, und könnte bei möglichen Umgebungstemperaturen
zu Hause eingesetzt werden.
-
Wie
vorstehend beschrieben konnte eine Proteinkonzentration in einer
zu detektierenden Lösung
durch Vermischen eines wässrigen
Reagens der Tannin/Zitronensäure-Lösung in
die zu detektierende Lösung
zur Messung der Intensitäten
des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts davon bestimmt
werden.
-
Ferner
konnte durch Messung beider Intensitäten zur Bestimmung einer Konzentration
einer zu detektierenden Lösung
in einem niedrigen Konzentrationsbereich aus der Intensität des gestreuten Lichts
und der in einem mittleren Konzentrationsbereich aus der Intensität des transmittierten
Lichts ein genau messbarer Konzentrationsbereich der zu detektierenden
Lösung,
d.h. ein dynamischer Bereich, im wesentlichen aufgeweitet werden.
Dies eliminierte Herkömmlicherweise
benötigte
Schritte wie etwa die Verdünnung
einer zu detektierenden Lösung
in einem hohen Konzentrationsbereich, um dadurch die praktischen
Effekte für
eine höhere
Genauigkeit, Effizienz und Laborsicherheit der Messung und des Tests
stark zu verbessern.
-
Die
pH-Werte der gemischten Lösungen, hergestellt
durch Vermischen von zu detektierenden wässrigen Proteinlösungen (Serumalbumin)
mit entsprechenden Konzentrationen von 0, 2, 5, 15, 30, 60, 100,
250 und 500 mg/dl und des vorstehenden Reagens der wässrigen
Tannin/Zitronensäure-Lösung waren
im Bereich von 1,5 bis 1,9. In dieser Ausführungsform wurde das eingesetzte
Reagens durch Zugabe von Zitronensäure in die wässrige Tanninlösung hergestellt.
Jedoch könnte
ein ähnlicher
Effekt durch Verwendung einer jeglichen Säure, die zur Regulierung des
pH-Werts der Lösung
nach Vermischen der zu detektierenden Lösung und des Reagens auf 1,5 bis 5,8
fähig ist,
eingesetzt werden. Der ähnliche
Effekt könnte
ebenso durch Zugabe einer Säure
in die zu detektierende Lösung
zur Regulierung des pH-Werts der Lösung nach Vermischen des Reagens auf
1,5 bis 5,8 erhalten werden. Falls die Sorte oder die Menge der
in die zu detektierende Lösung
zu mischende Säure
und/oder in das Reagens unterschiedlich war, wurden unterschiedliche
Kalibrierkurven erhalten (entsprechend den gestrichelten Linien und
den durchgezogenen Linien der 13 und 14).
Deshalb war es notwendig, unterschiedliche Kalibrierkurven zu erzeugen
(entsprechend den gestrichelten und durchgezogenen Linien der 13 und 14).
Falls der pH-Wert der zu detektierenden Lösung nicht in dem vorstehend
erwähnten
Bereich lag, gab es Fälle,
in dem das Protein nicht vollständig
koagulierte, so dass es unmöglich
war, eine stabile Messung durchzuführen. Somit war es praktisch
bevorzugt, die Messung innerhalb des vorstehenden pH-Bereichs durchzuführen.
-
In
dieser Ausführungsform
lag die Tanninkonzentration in dem Reagens der wässrigen Tannin/Zitronensäure-Lösung bei
1 g/dl. In diesem Fall lag die Konzentration des Reagens nach dem
Mischen in der zu detektierenden Lösung bei 0,5 g/dl, weil das
Mischungsverhältnis
des Reagens zu der Lösung
bei 1:1 lag. Jedoch könnte
im Falle, dass die Konzentration des Reagens unterschiedlich von
dem vorstehenden Wert war, eine Proteinkonzentration durch Erzeugen
einer Kalibrierkurve (entsprechend den gestrichelten Linien und
den durchgezogenen Linien der 13 und 14)
gemäß der Tanninkonzentration
nach Vermischen des Reagens in die zu detektierende Lösung gemessen
werden, so lange sie im Bereich von 5 × 10–3 bis
5 g/dl lag. Falls die Tanninkonzentration niedriger als der vorstehende Bereich
war, gab es Fälle,
in denen das Protein nicht koagulierte, so dass es schwierig war
eine stabile Messung durchzuführen.
Falls die Tanninkonzentration höher
als der vorstehende Bereich war, präzipitierte das koagulierte
Protein schnell, um eine ungleichförmige Trübung zu verursachen, was verhindert, dass
die zu detektierende Lösung
in Übereinstimmung
mit der Konzentration rund um die Region, in dem im Wesentlichen
paralleles Licht 2 hindurch passierte, eingetrübt wurde,
so dass eine stabile Messung schwer durchgeführt werden konnte. Deshalb war
es praktisch bevorzugt, dass die Messung innerhalb des vorstehenden
Konzentrationsbereichs durchgeführt
wurde.
-
In
dieser Ausführungsform
wurde bestimmt, dass hinsichtlich der Konzentration in einem niedrigen
Konzentrationsbereich (ungefähr
15 mg/dl oder niedriger), eines mittleren Konzentrationsbereichs (von
ungefähr
15 bis 100 mg/dl) und eines hohen Konzentrationsbereichs (ungefähr 100 mg/dl
oder höher),
Ergebnisse mit einer höheren
Genauigkeit erhalten werden konnte, und zwar durch Messung einer
Konzentration in dem niedrigen Konzentrationsbereich basierend auf
der Intensität
des gestreuten Lichts und durch Messung der Konzentration in dem mittleren
Konzentrationsbereich basierend auf der Intensität des transmittierten Lichts.
Jedoch sollte angemerkt werden, dass die entsprechenden Werte des
niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationsbereichs in Abhängigkeit
der optischen Weglänge
der Probenzelle 3 des durchlaufenden Abstands des gestreuten
Lichts 7 in der zu detektierenden Lösung, des Orts des optischen
Systems, de Art des Reagens oder dergleichen variieren könnten, und
nicht auf die vorstehenden Werte beschränkt war. Momentan kann eine
Proteinkonzentration von 15 mg/dl oder niedriger durch Messen der
Intensität
des transmittierten Lichts berechnet werden, wenn die optische Weglänge des
transmittierten Lichts auf nicht länger als der Weglänge in dieser
Ausführungsform
(länger als
10 mm) eingestellt war. Jedoch reduziert eine solche Ausdehnung
der optischen Weglänge
das Ausgabesignal des Photosensors 4 (annähernd 10–4 V), im Falle
eines Hochkonzentrationsbereichs, so dass die Bestimmung der Konzentration
erschwert ist. Außerdem
dehnt die Ausdehnung der optischen Weglänge inhärent die Gerätegröße aus und
ist deshalb nicht praktisch bevorzugt. Der größte Vorteil, der durch die
vorliegende Erfindung erhalten wurde, war, dass ein messbarer Konzentrationsbereich
oder ein dynamischer Bereich durch Verwendung von sowohl der Intensität des gestreuten
Lichts als auch der Intensität
des transmittierten Lichts ausgeweitet werden konnte, falls der
Aufbau oder die Größe des Geräts bestimmten
Schranken unterlagen.
-
Ausführungsform 6
-
In
dieser Ausführungsform
wurde eine wässrige
Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung in
die zu detektierende Lösung
zur Koagulierung des Proteins gemischt, um dadurch die zu detektierende
Lösung einzutrüben, und
die Proteinkonzentration wurde basierend auf der Änderung
der Trübung
nach dem Vermischen der wässrigen
Tannin/Zitronensäure-Lösung bestimmt.
Genauer gesagt wurde eine wässrige Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung mit
einer Konzentration von 3 × 10–4 M
(entspricht 0,05 g/dl) und einer Zitronensäure-Konzentration von 5 g/dl wurde als Reagens
eingesetzt. Der pH-Wert dieses Reagens lag bei ungefähr 1,8 bis
2,0.
-
Genauer
gesagt wurden die wässrige
Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung und
die zu detektierende Lösung
in einem Volumenverhältnis
von 1 zu 9 zur Messung der Intensitäten des transmittierten Lichts
und/oder des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens
vermischt. Dann wurde die Proteinkonzentration in der zu detektierenden
Lösung
aus den Intensitäten
bestimmt. Hierin lag die Konzentration an Tanninsäure nach
dem Vermischen des Reagens bei 3 × 10–5 M
(entspricht 5 × 10–3 g/dl). Wie
in Ausführungsform 5
wurden die folgenden Operationen in einem Raum mit einer Temperatur von
ungefähr
40°C durchgeführt, und
die Temperatur der zu detektierenden Lösung, des Reagens und des Messgeräts lagen
jeweils bei ungefähr
40°C.
-
Eine
Proteinkonzentration wurde durch Verwendung eines Urins als eine
zu detektierende Lösung
mit dem vorstehenden in 5 dargestellten Messgerät folgendermaßen getestet.
-
Als
erstes wurden 1,8 ml einer zu detektierenden Lösung in die Probezelle 3 eingeführt, woraufhin
der Computer 6 die Lichtquelle 1 in Betrieb setzte
und gleichzeitig startete, die Ausgabesignale der Photosensoren 4 und 5 aufzuzeichnen.
Als nächstes
steuerte der Computer 6 die Pipette 9 in einer
solchen Art und Weise, dass 0,2 ml eines Reagens der wässrigen
Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung in
die Probezelle 3 durch den Einlass 8 gemischt
wurde. Beim Vermischen des Reagens der wässrigen Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung in
der zu detektierenden Lösung
koagulierten die Proteinkomponenten der zu detektierenden Lösung, um
die Lösung
einzutrüben,
um dadurch die Intensität
des transmittierten Lichts zu senken und die des gestreuten Lichts
zu steigern. Die Proteinkonzentration wurde durch Analysieren eines
jeden Ausgabesignals aus den Photosensoren 4 und 5 nach
dem Vermischen des Reagens bestimmt.
-
Die
Intensitäten
des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts, das heißt die Ausgabesignale
der Photosensoren 4 und 5, welche durch Verwendung
einer zu detektierenden Lösung
mit einer Proteinkonzentration von 5 mg/dl mit dem vorstehenden
Verfahren gemessen wurden, wurden in den 15 bzw. 16 geplottet.
In den 15 und 16 steht
die Abszisse für
die verstrichene Zeit (Sekunde) nach Vermischen des Reagens, und
die Ordinate gibt die Intensitäten
des durch die entsprechenden Photosensoren detektier ten Lichts an,
wobei sie die Änderung
der Intensitäten
des gestreuten Lichts oder des transmittierten Lichts anzeigen,
welche von 60 Sekunden vor bis 300 Sekunden nach dem Vermischen
des Reagens auftraten.
-
Die
Korrelation zwischen der Änderung
der Intensität
des gestreuten Lichts und der Proteinkonzentration und die Korrelation
zwischen dem Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts und der Proteinkonzentration wurden in
den 17 bzw. 18 geplottet.
In der 17 gibt die Ordinate die Differenz
zwischen den Intensitäten
des gestreuten Lichts vor und 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens
((Intensität
des gestreuten Lichts nach Vermischen des Reagens) – (Intensität des gestreuten Lichts
vor Vermischen des Reagens)) an. In 18 gibt
die Ordinate das Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens
zu der vor Vermischen des Reagens an ((Intensität des transmittierten Lichts
nach Vermischen des Reagens)/(Intensität des transmittierten Lichts
vor Vermischen des Reagens)). Die Ergebnisse der Messungen von Urin
mit entsprechenden Konzentrationen von 0, 15, 30, 60, 100, 250 und 500
mg/dl als zu detektierende Lösung
wurde in den 17 und 18 geplottet,
zusätzlich
zu der zu detektierenden Lösung
mit einer Proteinkonzentration von 5 mg/dl. In diesen Fällen waren
alle zu detektierenden Messlösungen
optisch so transparent wie Wasser und die Intensitäten des
transmittierten Lichts und des gesteuerten Lichts waren die gleichen wie
Wasser.
-
In 17 wurde
jeder Messwert durch eine durchgezogene Linie verbunden und der
gemessene Wert in dem Proteinkonzentrationsbereich von 0 bis 30
mg/dl, in dem sich die Menge der Änderung der Intensität des gestreuten
Lichts (die Differenz zwischen den Intensitäten des gestreuten Lichts vor
und nach Vermischen des Reagens) linear mit der Prote inkonzentration änderte,
wurde mit einer gestrichelten Linie verbunden und diese Linie wurde
verlängert. Durch
Verwendung dieser festen Linie als Kalibrierkurve konnte die Proteinkonzentration
erhalten werden.
-
Wie
aus diesen Linien ferner ersichtlich ist, lagen die durchgezogene
und die gestrichelte Linie übereinander,
bis die Proteinkonzentration annährend
30 mg/dl erreichte, und deshalb war die Menge der Änderung
der Intensität
des gestreuten Lichts proportional zu der Proteinkonzentration.
Als die Proteinkonzentration jedoch höher wurde, wurde der gemessene
Wert graduell niedriger als der entsprechende Wert, welcher proportional
zu der Proteinkonzentration war. Als Grund wurde das Folgende angenommen.
Wenn die Proteinkonzentration hoch wurde, so wurde die Wahrscheinlichkeit
hoch, dass das Licht gestreut wurde. Dies lies die Wahrscheinlichkeit ansteigen,
dass das Licht wiederum gestreut werden würde, während das gestreute Licht von
dem Punkt, an dem es auftrat, zu dem äußeren der Probezelle sich fortsetzte,
um dadurch die Wahrscheinlichkeit, dass das gestreute Licht den
Photosensor 5 erreichen würde, zu senken. Deshalb könnte bei
der Berechnung einer Proteinkonzentration aus der Änderung
der Intensität
des gestreuten Lichts die Konzentration in einer höheren Genauigkeit
in einem niedrigen Konzentrationsbereich (ungefähr 30 mg/dl oder niedriger),
in dem die Linearität
sichergestellt war, bestimmt werden.
-
Eine
Proteinkonzentration in einem hohen Konzentrationsbereich (über 30 mg/dl
oder höher), welche
nicht mit der Linearität übereinstimmten, konnten
durch Verwendung einer durch die durchgezogene Linie gezeigten Kalibrierkurve
bestimmt werden. Es wurde ebenso bestätigt, dass eine Konzentration
im Bereich von bis zu 500 mg/dl direkt gemessen werden konnte, da
die zu detektierende Lösung nicht
vollständig
gesättigt
war.
-
Falls
hierin Zitronensäure
nicht in die wässrige
Tanninsäurelösung gemischt
wurde, gab es einen Fall, in dem die Intensität des gestreuten Lichts (Ausgabesignal
des Photosensors 5) der zu detektierenden Lösung mit
einer Konzentration von 500 mg/dl etwa 0 V wurde, was zu einer fehlerhaften
Operation führte,
in welcher die Konzentration als ungefähr 0 mg/dl oder niedriger angenommen
wurde.
-
Wie
jedoch in dieser Ausführungsform
gezeigt ist, war es durch Verwendung eines durch Vermischen von
Tanninsäurelösung in
einer wässrigen Tanninlösung hergestellten
Reagens möglich,
eine der Konzentration entsprechende Trübung zu verursachen, und zwar
selbst im Falle einer zu detektierenden Lösung mit einer hohen Konzentration
wie etwa 500 mg/dl.
-
In 18 gibt
die Abszisse die Proteinkonzentration an, und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung)
gibt das Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor
Vermischen des Reagens an. Jeder der Messwerte wurde mit einer durchgezogenen
Linie verbunden und der gemessene Wert in einem Proteinkonzentrationsbereich
von 30 bis 100 mg/dl, in dem sich der Logarithmus der Intensität des transmittierten
Lichts linear mit der Proteinkonzentration änderte, wurden mit einer gestrichelten
Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Wie in 18 gezeigt
ist, gab es bei einer Proteinkonzentration von nicht höher als
30 mg/dl einen Fall, in dem der gemessene Wert nicht auf der gestrichelten
Linie lag. Als Grund wurde angenommen, dass das Ausgabesignal für Einflüsse von
verschiedenen Störungen anfälliger war,
weil die Änderung
des transmittierten Lichts verglichen mit dem gesamten Ausgabesignal zu
klein war. Daraus wurde gefunden, dass bei Berechnung einer Proteinkonzentration
von der Intensität
des transmittierten Lichts die zu detektierten Lösung bevorzugt in einem hohen
Konzentrationsbereich (ungefähr
30 mg/dl oder höher)
lag, um die Einflüsse
von verschiedenen Störungen
zu vermeiden. Es wurde ebenso bestätigt, dass eine Proteinkonzentration
im Konzentrationsbereich bis zu 500 mg/dl direkt gemessen werden
konnte, weil keine Sättigung beobachtet
wurde.
-
Wenn
Zitronensäure
hierin nicht in die wässrige
Tanninsäurelösung gemischt
wurde, kam es zu Fällen,
in denen die Intensität
des transmittierten Lichts (Ausgabesignal des Photosensors 4)
der zu detektierenden Lösung
mit einer Konzentration von 500 mg/dl kleiner als 0,6 V wurde, was
zu einer fehlerhaften Operation führte, in welcher die Konzentration
als annähernd
nicht mehr als 0 mg/dl angenommen wurde. Bei Verwendung des Reagens,
hergestellt durch Zitronensäure
in einer wässrigen
Tanninsäurelösung, war
es jedoch möglich,
eine der Konzentration entsprechende Trübung zu verursachen, selbst
falls die zu detektierende Lösung
eine hohe Konzentration aufwies, wie etwa 500 mg/dl, wie in dieser
Ausführungsform
gezeigt ist.
-
Deshalb
konnte eine hohe Genauigkeit durch Verwendung der so erhaltenen
gestrichelten Linie der 17 und 18 sichergestellt
werden, um die Konzentration in einem hohen Konzentrationsbereich
bzw. die in einem niedrigen Konzentrationsbereich zu bestimmen.
Wie vorstehend beschrieben konnte eine Proteinkonzentration einer
zu detektierenden Lösung
durch Messen der Intensität
des transmittierten Lichts oder der Intensität des gestreuten Lichts vor
und nach Vermischen des Reagens erhalten werden.
-
Ferner
konnte durch Messen von beiden Intensitäten zur Bestimmung einer Konzentration
einer zu detektierenden Lösung
geringen Konzentrationsbereich aus der Intensität des gestreuten Lichts und der
in einem hohen Konzentrationsbereich aus der Intensität des transmittierten
Lichts konnte der mit hoher Genauigkeit messbare Konzentrationsbereich der
zu detektierende Lösung,
das heißt
der dynamisch Bereich, substantiell ausgeweitet werden.
-
Gemäß dieser
Ausführungsform
konnte eine Proteinkonzentration unter Verwendung eines Urins, welcher
durch Präzipitation
von verschiedenen Salzarten trübe
gemacht worden war, bestimmt werden. Dies wird im Folgenden beschrieben.
-
Als
erstes wurde ein trüber
Urin mit einer Proteinkonzentration von 30 mg/dl in die Probenzelle 3 als
eine zu detektierende Lösung
eingeführt.
Hierin lag das Ausgabesignal des Photosensors 5 (Intensität des gestreuten
Lichts) bei ungefähr
0,05 V. Da das Ausgabesignal des Photosensors 5 vor Vermischen des
Reagens 0,0 V im Falle einer zu detektierenden Lösung ohne Trübung aus 15 war,
konnte angegeben werden, dass die Differenz zwischen diesen Ausgabesignal
das Niveau an Trübung
angegeben werden, das in der zu detektierenden Lösung dieser Ausführungsform
inhärent
war. Die diesen Wert entsprechende Proteinkonzentration war 10 bis
12 mg/dl bei Verwendung der in 17 gezeigten
durchgezogene Linie als einer Kalibrierkurve. Zu diesem Zeitpunkt
wurde das Reagens in die zu detektierende Lösung dazugemischt, um die Änderung
der Ausgabesignale aus den Photosensoren 4 und/oder 5 zu
beobachten. Das Ausgabesignal des Photosensors 5 nach 300
Sekunden nach Zumischung des Reagens betrug 0,19 V. Deshalb lag
die Differenz zwischen diesem Signal und dem Ausgabesignal nach
0 Sekunden nach Vermischen des Reagens bei 0,14 V. Die dieser Differenz
zwischen dem Ausgabesignal (0,14 V) entsprechende Protein konzentration
lag bei 30 mg/dl, wenn die in 17 gezeigte
durchgezogene Linie als eine Kalibrierkurve genommen wird. Diese
Konzentration stimmte mit einer bekannten Konzentration überein,
welche im Voraus gemessen worden war. Daraus konnte bestätigt werden,
dass die Proteinkonzentration in der zu detektierenden trüben Lösung aus
der Differenz zwischen den Ausgabesignalen des Photosensors 5 vor
und nach Vermischen des Reagens durch Verwendung der Kalibrierkurve aus 17,
welche aus der zu detektierenden Lösung ohne Trübung erhalten
worden war genau bestimmt werden konnte.
-
Wie
vorstehend beschrieben konnte die Konzentration einer Lösung ohne
irgendeinen Einfluss aufgrund von Trübung oder dergleichen durch
Berechnung der Konzentration der Lösung aus der Differenz zwischen
den Intensitäten
des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens genau bestimmt
werden.
-
Unterdessen
lag das Ausgabesignal des Photosensors 4 (Intensität des transmittierten
Lichts) vor Vermischen des Reagens bei 0,55 V. Da das Ausgabesignal
des Photosensors 4 vor Vermischen des Reagens bei 0,6 V
in einer zu detektierenden transparenten Lösung ohne Trübung lag,
wie in 16 gezeigt ist, konnte die Differenz
der Trübung
der Lösung
zugerechnet werden. Da das Ausgabesignal 300 Sekunden nach Vermischen
des Reagens 0,45 V betrug, betrug das Verhältnis dieser Signale 0,82.
Die dem Verhältnis
der Ausgabesignale (0,82) entsprechende Proteinkonzentration lag
bei 30 mg/dl, wenn die in 18 gezeigte
durchgezogene Linie als Kalibrierkurve hergenommen wird. Diese Konzentration stimmte
mit einer bekannten Konzentration überein, welche im Voraus gemessen
worden war. Daraus konnte bestätigt
werden, dass die Proteinkonzentration in einer zu detektierenden
Lösung
durch das Verhältnis
der Ausgabesignale des Photosensors 4 nach Vermischen des
Reagens zu dem vor Vermischen des Reagens und durch Umwandlung von
diesem zu einer Proteinkonzentration unter Verwendung von 18 als
Kalibrierkurve, die aus der zu detektierenden Lösung ohne Trübung erhalten
worden war, genau bestimmt werden konnte.
-
In
dieser Ausführungsform
wurde die Konzentration der Lösung
aus den Intensitäten
des transmittierten Lichts und des gestreuten Lichts unmittelbar
vor und 300 Sekunden nach Vermischen des Reagens bestimmt. Jedoch
kann der Zeitraum geeigneter Weise gemäß dem Messgerät, der Charakteristik der
zu detektierenden Lösung
und des Tanninsäurereagens
wie etwa der Konzentration eingestellt werden.
-
In
den 15 bis 18 wurden
Beispiele gezeigt, in denen die Temperatur der zu detektierenden
Lösung
und des Reagens, und die Umgebungstemperatur jeweils bei 40°C lag. Jedoch
war es ebenso möglich,
die Messung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C durchzuführen. Deshalb
ermöglicht
das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung, anders als das Verfahren unter Verwendung von Trichloressigsäure als
Reagens, die Durchführung
der Messung bei einer Temperatur von 25°C oder höher, und könnte bei einer möglichen
Umgebungstemperatur zu Hause eingesetzt werden.
-
Die
pH-Werte der gemischten Lösungen, hergestellt
durch Vermischen der in dieser Ausführungsform als zu detektierende
Lösung
eingesetzten Urine und der vorstehenden Reagentien der wässerigen
Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung, lagen
bei 2,4 bis 3,0. In dieser Ausführungsform
wurde das eingesetzte Reagens durch Zugabe von Zitronensäure in die
wässrige
Tanninlösung
hergestellt. Jedoch könnte
ein ähnlicher
Effekt durch Verwendung einer jeglichen Säure, die zur Regulierung des
pH-Werts der Lösung
nach Vermischen der zu detektierenden Lösung und des Reagens auf 1,5
bis 5,8 fähig ist,
eingesetzt werden. Der ähnliche
Effekt könnte
ebenso durch Zugabe einer Säure
in die zu detektierende Lösung
zur Regulierung des pH-Werts der Lösung nach Vermischen des Reagens
auf 1,5 bis 5,8 erhalten werden. Falls die Art oder die Menge der
in die zu detektierende Lösung
zu mischende Säure
und/oder in das Reagens unterschiedlich war, änderten sich die Kalibrierkurven
(entsprechend den gestrichelten Linien und den durchgezogenen Linien
der 17 und 18). Deshalb
war es notwendig, unterschiedliche Kalibrierkurven zu erzeugen (entsprechend
den gestrichelten und durchgezogenen Linien der 17 und 18)
in diesem Fall. Falls der pH-Wert nicht in dem vorstehend erwähnten Bereich
lag, konnte das Protein nicht vollständig koagulieren, so dass es
unmöglich
war, eine stabile Messung durchzuführen. Somit war es praktisch
bevorzugt, die Messung innerhalb des vorstehenden pH-Bereichs durchzuführen.
-
Falls
hierin die zu detektierende Lösung
Urin war, war es besonders praktikabel, eine Säure als eine in das Reagens
und/oder in die zu detektierende Lösung zu mischende Säure aus
der Gruppe auszuwählen,
die aus Kaliumhydrogenphtalat, Essigsäure, Zitronensäure und
Ascorbinsäure
besteht, weil diese Säuren
leicht eine geeignete Pufferkapazität ergeben, billig sind, leicht
zu handhaben sind und außerdem
die Möglichkeit
der Induzierung der Präzipitation von
Phosphat, Carbonat, oder dergleichen reduzieren und somit sehr praktikabel
sind.
-
In
dieser Ausführungsform
wurden eine wässrige
Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung mit
einer Konzentration von Tanninsäure
von 3 × 10–4 (entspricht
0,05 g/dl) und einer Konzentration von Zitronensäure von 5 g/dl, die als Reagens
eingesetzt wurde, und eine zu detektierende Lösung in einem Volumenverhältnis von
0,1 bis 0,9 vermischt, um die Konzentration von Tanninsäure auf
3 × 10–5 (entspricht
5 × 10–3 g/dl)
und die Konzentration von Zitronensäure auf 0,5 g/dl nach dem Vermischen
des Reagens zu regulieren. Selbst wenn jedoch jede dieser Konzentrationen
nach dem Vermischen des Reagens nicht in den vorstehenden Bereichen
lag, konnte die Proteinkonzentration durch Erzeugen von Kalibrierkurven, die
den Konzentration von Tanninsäure
und Zitronensäure
nach dem Vermischen des Reagens in der zu detektierende Lösung entsprachen,
gemessen werden, so lange die Tanninsäurekonzentration von 3 × 10–5 bis
3 × 10–2 M
(entspricht 5 × 10–3 bis
5g/dl) lag und der pH-Wert von 1, 5 bis 5, 8 nach dem Vermischen
des Reagens lag. Falls die Tanninsäurekonzentration geringer als
der vorstehende Bereich ist, gab es Fälle, in denen das Protein nicht
koagulierte, so dass die Durchführung
einer stabilen Messung schwierig war. Falls die Tanninsäurekonzentration höher als
der vorstehende Bereich war, präzipitierte das
koagulierte Protein schnell, um eine ungleichförmige Trübung zu verursachen, was verhinderte,
dass die zu detektierende Lösung
rund um den Bereich, durch den das im Wesentlich parallele Licht 2 hindurchging,
sich entsprechend der Konzentration eintrübte, so dass die Durchführung einer
stabilen Messung erschwert war. Deshalb war es praktisch bevorzugt,
dass die Messung innerhalb des vorstehend Konzentrationsbereichs
durchgeführt
wurde.
-
In
dieser Ausführung
lag das Mischungsverhältnis
der zu detektierenden Lösung
zu dem Reagens bei 9.1. Selbst falls die Tanninsäure- und Zitronensäurekonzentration
nach dem Vermischen des Reagens in dem gleichen Bereich wie im vorstehenden
Beispiel lagen, änderte
sich jedoch die Kalibrierkurve, wenn das Mischungsverhältnis unterschiedlich
war. Deshalb war es notwendig, eine dem Mischungsverhältnis entsprechende
Kalibrierkurve zu erzeugen. Wenn hierin das Mischungsverhältnis der zu
detektierenden Lösung
zu dem Reagens anstieg, z.B. auf 1:1, wurde die Trübung der
zu de tektierenden Lösung
verglichen mit der zu detektierenden Lösung mit der gleichen Proteinkonzentration
niedriger. Deshalb war es Vorteilhaft, wenn die Tanninsäurekonzentration
nach dem Vermischen des Reagens konstant gehalten wurde, ein Reagens
der wässrigen Tanninsäure/Zitronensäurelösung mit
einer hohen Tanninsäurekonzentration
einzusetzen, weil die Absenkung des Mischungsverhältnisses
zur Vereinfachung der Verbesserung der Empfindlichkeit der zu detektierenden
Lösung
hinsichtlich der Proteinkonzentration effektiv war. Hier konnte
bestätigt
werden, dass eine Tanninsäurekonzentration,
in der weder eine Präzipitation
noch eine Denaturierung bei einer Temperatur von 0 bis 40°C auftrat,
welche eine mögliche
Umgebungstemperatur zu Hause ist, bei der das Reagens eingesetzt
wird, nicht höher
als 1,5 M (entspricht 250 g/dl) war. Deshalb war es praktisch vorteilhaft,
die Konzentration des wässrigen
Tanninsäurelösungsreagens
auf nicht höher
als diese Konzentration einzustellen.
-
Ähnlich war
es ebenso Vorteilhaft, Zitronensäure
in einer hohen Konzentration einzusetzen. Jedoch war es notwendig,
dass die Zitronensäurekonzentration
nicht höher
als die Konzentration ist, in der weder eine Präzipitation noch eine Denaturierung
bei einer Temperatur von 0 bis 40°C,
welche die vorstehende Umgebungstemperatur ist, auftrat. Hierin
war es ebenso notwendig, dass die Konzentration in dem Bereich lag,
in dem keine Präzipitation
oder Denaturierung aufgrund einer Wechselwirkung zwischen Tanninsäure und
Zitronensäure
auftrat.
-
Ausführungsform 7
-
Die
Anwesenheit oder die Abwesenheit eines Hindernisses aufgrund eines
suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase in einer zu detektierenden
Lösung
durch Messen der Ausgabe signale der Photosensoren 4 und 5 und
Vergleich der gemessenen Werte unter Verwendung des in den 5 und 6 gezeigten
Geräts
mit dem gleichen Verfahren wie in Ausführungsform 2 detektiert. Falls
irgendein suspendiertes Teilchen wie etwa eine Blase in einer zu
detektierenden Lösung
vorhanden war und in den optischen Weg des im Wesentlichen parallelen
Lichts 2 eindrang, wurde das im Wesentlichen parallele Licht 2 gestreut,
und dadurch wurde die genaue Messung der Intensitäten des
transmittierten Lichts und/oder des gestreuten Lichts mit einem
Fehler behaftet. In diesem Falle sank die Intensität des transmittierten
Lichts substantiell. Andererseits sank entweder die Intensität des gestreuten
Lichts substantiell oder sie stieg an, und zwar in Abhängigkeit
des Sichtwinkels des Photosensors 5, des Orts des suspendierten
Teilchens wie etwa einer Blase, die in dem optischen Weg vorhanden
war, und dergleichen.
-
Falls
kein Hindernis aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer
Blase vorhanden war, bestand eine bestimmte Beziehung zwischen der
Intensitäten
des gestreuten Lichts und des transmittierten Lichts, wie in den 17 und 18 gezeigt
ist. Zum Beispiel lag die Differenz zwischen den Intensitäten des
gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens der wässrigen
Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung bei
0,14 V und das Verhältnis der
Intensität
des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor
Vermischen des Reagens lag bei 0,82 in dem Falle, in dem die Proteinkonzentration
der zu detektierenden Lösung
30 mg/dl betrug. Falls wie vorstehend jedoch ein Hindernis auftrat,
wurde ein zu der vorstehenden Beziehung inkonsistenter Wert gemessen.
Deshalb konnte die Anwesenheit oder Abwesenheit des vorstehend erwähnten Hindernisses
detektiert werden, und zwar durch eine Überprüfung, ob die durch den gemessenen
Wert des Photosensors 4 erhaltene Proteinkonzentration, basierend
auf der Kalibrierkurve der 18, mit
der aus den gemessenen Werten des Photosensors 5 vor und
nach Vermischen des Tanninsäure/Zitronensäurereagens,
basierend auf der Kalibrierkurve der 17, erhaltenen
Konzentrationen identisch waren oder nicht.
-
Wie
vorstehend beschrieben wurde, konnte gemäß dieser Ausführungsform
ein Hindernis aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer Blase
zur Verhinderung einer fehlerbehafteten Messung detektiert werden,
und zwar durch Messen beider Intensitäten des transmittierten Lichts
und des gestreuten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens der
wässrigen
Tanninsäure/Zitronensäure-Lösung und
durch Vergleichen der Intensitäten.
Dies verbesserte die Zuverlässigkeit
der Messung und trägt
für einen
praktischen Effekt bei, nämlich
zur Ermöglichung
einer verbesserten Zuverlässigkeit
und Laborsicherheit für
die Messungen und Tests.
-
Ausführungsform 8
-
In
dieser Ausführungsform
wurde der Rotationswinkel einer zu detektierenden Lösung gemessen,
bevor darin das Reagens zugemischt wurde. Eine wässrige m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung wurde
in die zu detektierende Lösung
gemischt, um das Protein zu koagulieren, so dass die zu detektierende
Lösung
eingetrübt
wurde. Die Proteinkonzentration wurde aus der Änderung der Trübung nach
Vermischen des Reagens gemessen und die Konzentration irgendeiner
optisch aktiven Substanz, außer
Protein, wurde aus den gemessenen Werten bestimmt.
-
Genauer
gesagt werden nach der Messung eines Rotationswinkels der zu detektierenden
Lösung
ein Reagens der wässrigen
m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung mit
einer m-Galloyl-Gallussäurekonzentration
von 0,047 M (entspricht 1,5 g/dl) und mit einer Zitronensäurekonzentration
von 0,3 g/dl und die zu detektierende Lösung in einem Volumenverhältnis von
1:49 vermischt, um die Intensitäten
des transmittierten Lichts vor und nach Vermischen des Reagens zu
messen. Hierin lag der pH-Wert des Reagens bei ungefähr 2,6 bis
2,8.
-
Dann
wurde die Proteinkonzentration aus dieser Intensität erhalten
und die Konzentration irgendeiner optischen aktiven Substanz, außer Protein,
wurde aus der Proteinkonzentration und dem Rotationswinkel bestimmt.
Hier lag die Konzentration der m-Galloyl-Gallussäure nach Vermischen des Reagens
bei 9,4 × 10–4 M
(entspricht 0,03 g/dl) und die Konzentration der Zitronensäure lag
bei 0,006 g/dl. Im Folgenden wird dies detaillierter erläutert.
-
Eine
Glukosekonzentration (Zuckerwert im Urin) und eine Proteinkonzentration
im Urin wurden mittels eines Urins als eine zu detektierende Lösung mit
den in 11 gezeigten Geräten, die
in Ausführungsform
4 eingesetzt wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Ausführungsform
4 getestet.
-
Als
erstes wurde die zu detektierende Lösung in die Probezelle 13 eingeführt, woraufhin
der Computer 23 die Lichtquelle 11 und das Spulenantriebsgerät 20 zur
Messung eines Rotationswinkels der Lösung in Betrieb setzte.
-
Als
nächstes
stoppte der Computer 23 die Operation des Spulenantriebsgeräts 20 und
gleichzeitig startete die Aufnahme eines Ausgabesignals des Photosensors 19.
Dann steuerte der Computer 23 die Pipette 24 in
einer solchen Art, dass das Reagens der wässrigen m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung in die zu detektierende
Lösung
in der Probezelle 13 aus dem Einlassventil 15 gemischt wurde.
Unter der Annahme, dass die Änderung
des Ausgangssignals des Photosensors 19 nach Vermischen
des Reagens die Änderung
der Intensität
des transmittierten Lichts war, wurde eine Kalibrationslinie entsprechend 18 unter
Verwendung von Urin mit entsprechenden Proteinkonzentrationen von
0, 2, 5, 15, 60, 100 und 250 mg/dl als zu detektierende Lösungen,
basierend auf dem analytisierten Verhältnis der Intensität des transmittierten
Lichts nach Vermischen des Reagens zu der Intensität vor Vermischen des
Reagens, mit dem gleichen Verfahren wie in Ausführungsform 6 erzeugt. Diese
Kalibrierkurve ist in 19 gezeigt.
-
In 19 gibt
die Abszisse die Proteinkonzentration an, und die Ordinate (in logarithmischer Darstellung)
gibt das Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu der vor
Vermischen des Reagens an. Jeder der Messwerte wurde mit einer durchgezogenen
Linie verbunden und die gemessenenen Werte in einem Proteinkonzentrationsbereich
von 0 bis 30 mg/dl, in dem sich der Logarithmus der Intensität des transmittierten
Lichts linear mit der Proteinkonzentration änderte, wurden mit einer gestrichelten
Linie verbunden und diese Linie wurde verlängert. Die Proteinkonzentration
konnte durch Verwendung der durchgezogenen Linie als Kalibrierkurve
bestimmt werden. Falls jedoch die Konzentration im hohen Konzentrationsbereich
(ungefähr
100 mg/dl oder höher)
lag, unterschied sich die durchgezogene Linie graduell von der linearen
gestrichelten Linie, wie in 19 gezeigt
ist. Der Grund wurde folgendermaßen angenommen. Wenn die Trübung extrem
hoch wurde, trat das folgende Phänomen
als ein Ergebnis der Streuungen wie etwa Mehrfachstreuung auf: Die
Polarisierung des im Wesentlichen parallelen Lichts 12 sinkt,
um dadurch die Menge des durch den Analysator 18 transmittierten
Lichts zu steigern; ein Licht, welches mehrere Wege durchwandert,
erreicht den Photosensor 19; das Ausgabesignal des Photosensors 19 sinkt
(ungefähr
10–4 V),
um hinsichtlich des Einflusses verschiedener Störungsarten anfälliger zu
werden. Deshalb konnte bei Bestimmung einer Proteinkonzentration
aus der Intensität
des transmittierten Lichts die Konzentration im Konzentrationsbereich von
ungefähr
0 bis 60 mg/dl), in dem die Linearität sicher gestellt war, genauer
bestimmt werden. Eine Proteinkonzentration im Konzentrationsbereich
von größer als
100 mg/dl, in welchem die Linearität nicht sichergestellt war,
konnte durch Verwendung einer durch die durchgezogene Linie erhaltenen
Kalibrierkurve bestimmt werden. Es wurde ebenso bestätigt, dass
eine Proteinkonzentration im Bereich von bis zu 250 mg/dl direkt
gemessen werden konnte, weil die zu detektierende Lösung nicht
vollständig
gesättigt war.
-
Falls
hierin Zitronensäure
nicht in die wässrige
m-Galloyl-Gallussäurelösung gemischt
wurde, gab es Fälle,
in denen das Verhältnis
der Intensität des
transmittierten Lichts (Ordinate der 19) ungefähr 0,1 wurde,
was zu einer fehlerhaften Operation führte, in welcher die Konzentration
als ungefähr 40
mg/dl angenommen wurde. Durch Verwendung eines durch Vermischen
von Zitronensäure
in einer wässrigen
Galloyl-Gallussäurelösung hergestellten Reagens
war es jedoch möglich,
die der Konzentration entsprechende Trübung zu verursachen, selbst falls
die zu detektierende Lösung
eine hohe Konzentration wie etwa 250 mg/dl besaß, wie in dieser Ausführungsform
gezeigt wurde.
-
In
dem Fall, in dem Urin mit einem Zuckerwert im Urin von 100 mg/dl
und einer Proteinkonzentration im Urin von 15 mg/dl in einem Beispiel
der vorstehenden Messung eingesetzt wurde, lag der Rotationswinkel
bei 0,017°.
Der spezifische Rotationswinkel von Glukose bei dieser Wellenlänge (670
nm) lag bei 40° deg/cm·dl/kg.
Unter der Annahme, dass der gesamte gemessene Rotationswinkel auf
der Glukose basierte, lag die Glukosekonzentration, d.h., der Zuckerwert
im Urin bei 85 mg/dl. Unterdessen lag die Proteinkonzentration,
bestimmt aus 19, bei 15 mg/dl, weil das Verhältnis der
Intensität
des transmittierten Lichts 0,41 war. Da der spezifische Rotationswinkel
des Proteins bei –40° deg/cm·dl/kg
lag, war der Rotationswinkel für
das Protein –0,003°. Deshalb wurde
der wahre Rotationswinkel für
Glukose mit 0,02° durch
Subtraktion von 0,003° von
den vorstehend erwähnten
0,017° berechnet
und die Glukosekonzentration wurde als 100 mg/dl berechnet.
-
In
dem Fall, in dem Urin mit einem Zuckerwert im Urin von 50 mg/dl
und einer Proteinkonzentration im Urin von 80 mg/dl in einem weiteren
Beispiel der vorstehenden Messung eingesetzt wurde, lag der Rotationswinkel
bei –0,006°. Der spezifische
Rotationswinkel von Glukose bei dieser Wellenlänge (670 nm) lag bei 40° deg/cm·dl/kg.
Unter der Annahme, dass der gesamte gemessene Rotationswinkel auf der
Glukose basierte, wurde die Glukosekonzentration mit 0 oder niedriger
berechnet, was nicht mit dem Messwert übereinstimmte. Unterdessen
lag die Proteinkonzentration, bestimmt aus 19, bei
80 mg/dl, weil das Verhältnis
der Intensität
des transmittierten Lichts 8 × 10–3 war.
Da der spezifische Rotationswinkel des Proteins bei –40° deg/cm·dl/kg
lag, war der Rotationswinkel für
das Protein –0,016°. Deshalb
wurde der wahre Rotationswinkel für Glukose mit 0,01° durch Subtraktion
von –0,016° von den
vorstehend erwähnten –0,006° berechnet
und die Glukosekonzentration wurde als 50 mg/dl berechnet.
-
Daraus
wurde gemäß dieser
Ausführungsform
bestätigt,
dass ein Zuckerwert im Urin und eine Proteinkonzentration im Urin
gleichzeitig durch Messung des Rotationswinkels der zu detektierenden
Lösung
vor Vermischen des Reagens der wässrigen m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung und durch
Messen des Verhältnisses
der Intensität
des transmittierten Lichts nach Vermischen des Reagens zu dem vor
Vermischen des Reagens genau bestimmt werden konnte.
-
Wie
vorstehend beschrieben konnten gemäß dieser Ausführungsform
die Protein- und Glukosekonzentrationen, welche eine weitere optisch
aktive Substanz neben dem Protein ist, gleichzeitig bestimmt werden
und deshalb war das Verfahren dieser Ausführungsform praktisch insbesondere
dann praktikabel, wenn eine zu detektierende Lösung Urin war. Dies wird im
Folgenden erläutert.
-
Falls
eine Proteinkonzentration im Urin normal war, war Glukose die vorherrschende
optisch aktive Substanz im Urin. Deshalb konnte der Zuckerwert im
Urin grob durch Messen des Rotationswinkels von Urin untersucht
werden. Jedoch konnte eine Urinanalyse genauer durch Bestimmen einer
Proteinkonzentration im Urin mit einem anderen Messverfahren als
den, das auf einem Rotationswinkel basiert, gemessen werden. Der
Grund lag vermutlich darin, dass der durch das Verfahren erhaltene
Rotationswinkel des Urins den von Glukose stammenden Rotationswinkel
und den von Protein stammenden Rotationswinkel umfasste, weil sowohl
Protein als auch Glukose optisch aktive Substanzen waren.
-
Deshalb
konnten, wie in dieser Ausführungsform
gezeigt ist, ein Zuckerwert im Urin und eine Proteinkonzentration
im Urin genau bestimmt werden, und zwar durch das Erhalten der Proteinkonzentration
aus der Änderung
der optischen Charakteristik nach Vermischen des Reagens und durch
Korrigieren des gemessenen Rotationswinkels, basierend auf der so
gemessenen Proteinkonzentration.
-
Wenn übrigens
das Reagens in die zu detektierende Lösung vor Messung von dessen
Rotationswinkel gemischt wurde, koagulierte die Proteinkomponente,
um zu verhindern, dass das durch die Lösung transmittierte Licht detektiert
wird, oder das Protein denaturierte, um den Rotationswinkel zu verändern, und
deshalb war es nicht möglich,
den Zuckerwert im Urin und die Proteinkonzentration im Urin genau
zu bestimmen.
-
In
dieser Ausführungsform
wurde ein Beispiel gezeigt, in dem der Rotationswinkel und die Intensität des transmittierten
Lichts unter Verwendung eines Lichts mit einer Wellenlänge von
670 nm gemessen wurde. Im Allgemeinen steigt der spezifische Rotationswinkel
einer Substanz mit der Abnahme der Wellenlänge an, bis die Wellenlänge die
Wellenlänge erreicht,
an der die der Substanz inhärente
Absorption (rund 180 nm im Falle von Glukose) beginnt. Außerdem steigt
die Trübung
aufgrund der Koagulation von Protein mit sinkender Wellenlänge. Aus
diesem Grund war die Genauigkeit der Messung manchmal verschlechtert,
falls die Messung mit einem Licht der Wellenlänge von 500 nm oder kürzer durchgeführt wurde.
Deshalb war es hinsichtlich der Empfindlichkeit vorteilhaft, dass
der Rotationswinkel, die Intensitäten des gestreuten Lichts und
des transmittierten Lichts unter Verwendung eines Lichts mit einer
kürzeren
Wellenlänge
gemessen wurden.
-
Falls
jedoch die zu detektierende Lösung Urin
ist, wird Licht mit einer Wellenlänge von nicht länger als
500 nm durch einen im Urin enthaltenen Farbstoff wie etwa Urochrom
absorbiert. Die Messung ist wenig genau. Deshalb war es praktikabel, dass
bei der Messung Licht mit einer Wellenlänge von nicht kürzer als
500 nm eingesetzt wurde.
-
In
dieser Ausführungsform
lag das Mischungsverhältnis
der zu detektierenden Lösung
zu dem Reagens bei 49:1. Selbst wenn die Konzentration von m-Galloyl-Gallussäure und
Zitronensäure nach
Vermischen des Reagens die gleiche wie die im vorstehenden Beispiel
war, änderte
sich jedoch die Kalibrierkurve, wenn das Mischungsverhältnis unterschiedlich
war. Deshalb war es notwendig, eine Kalibrierkurve entsprechend
dem Mischungsverhältnis zu
erzeugen. Weil das Mischungsverhältnis
der zu detektierenden Lösung
zu dem Reagens anstieg, z.B. auf 1:1, sank hierin die Trübung der
zu detektierenden Lösung
im Vergleich zu der Lösung
mit der gleichen Konzentration. Deshalb war es Vorteilhaft, wenn
die m-Galloyl-Gallussäurekonzentration
nach dem Vermischen des Reagens konstant gehalten wurde, ein Reagens
mit einer hohen m-Galloyl-Gallussäurekonzentration einzusetzen,
weil die Absenkung des Mischungsverhältnisses zur Vereinfachung der
Verbesserung der Empfindlichkeit der zu detektierenden Lösung hinsichtlich
der Proteinkonzentration effektiv war. Hier wurde bestätigt, dass
die Konzentration von m-Galloyl-Gallussäure, bei
der weder eine Abscheidung noch eine Denaturierung auftrat, bei
einer Temperatur von 0 bis 40°C,
welche eine mögliche
Umgebungstemperatur zu Hause ist, nicht höher als 7,8 M (entspricht 250
g/dl) war. Demgemäß wurde
die Konzentration des wässrigen
m-Galloyl-Gallussäurslösungsreagens
auf nicht höher
als diese Konzentration eingestellt.
-
Die
pH-Werte der gemischten Lösungen, hergestellt
durch Vermischen von wässrigen
Proteinlösungen
(Serumalbumin) mit entsprechenden Konzentrationen von 0, 2, 5, 15,
60, 100 und 250 mg/dl und des vorstehenden Reagens der wässrigen m-Galloyl-Gallussäure/Zitronensäure-Lösung waren im
Bereich von 4,5 bis 5,8. In dieser Ausführungsform wurde das eingesetzte
Reagens durch Zugabe von Zitronensäure in die wässrige m-Galloyl-Gallussäurelösung hergestellt.
Jedoch könnte
ein ähnlicher
Effekt durch Verwendung einer jeglichen Säure, die zur Regulierung des
pH-Werts der Lösung
nach Vermischen der zu detektierenden Lösung und des Reagens auf 1,5
bis 5,8 fähig
ist, eingesetzt werden. Der ähnliche
Effekt könnte
ebenso durch Zugabe einer Säure
in die zu detektierende Lösung
zur Regulierung des pH-Werts der Lösung nach Vermischen des Reagens
auf 1,5 bis 5,8 erhalten werden. Falls die Sorte oder die Menge
der in die zu detektierende Lösung
zu mischende Säure
und/oder in das Reagens unterschiedlich war, wurde eine unterschiedliche
Kalibrierkurve erhalten (entsprechend der gestrichelten Linie und
dern durchgezogenen Linie der 19). Deshalb
war es notwendig, eine unterschiedliche Kalibrierkurve zu erzeugen
(entsprechend der gestrichelten und durchgezogenen Linie der 19).
Falls der pH-Wert der zu detektierenden Lösung nach dem Vermischen des
Reagens nicht in dem vorstehend erwähnten Bereich lag, gab es Fälle, in
dem das Protein nicht vollständig
koagulierte, so dass es unmöglich
war, eine stabile Messung durchzuführen. Somit war es praktisch
bevorzugt, die Messung innerhalb des vorstehenden pH-Bereichs durchzuführen.
-
Falls
hierin die zu detektierende Lösung
Urin war, war es besonders zweckmäßig eine Säure als eine in das Reagens
und/oder in die zu detektierende Lösung zu mischende Säure aus
der Gruppe auszuwählen,
die aus Kaliumhydrogenphtalat, Essigsäure, Zitronensäure und
Ascorbinsäure
besteht, weil diese Säuren
leicht eine geeignete Pufferkapazität ergeben, billig sind, leicht
zu handhaben sind und außerdem
die Möglichkeit
der Induzierung der Präzipitation von
Phosphat, Carbonat, oder dergleichen reduzieren und somit sehr praktikabel
sind.
-
In
dieser Ausführungsform
lag die Konzentration der m-Galloyl-Gallussäure in dem
Reagens bei 0,047 M (entspricht 1,5 g/dl). Da das Mischungsverhältnis des
Reagens zur zu detektierenden Lösung 49:1
war, lag die Konzentration der m-Galloyl-Gallussäure nach dem Vermischen des
Reagens bei 9,4 × 10–4 M
(entspricht 0,03 g/dl). Jedoch könnte
die Pro teinkonzentration mit jeder Konzentrationen im Bereich von
5 × 10–3 bis
5 g/dl durch Erzeugen einer Kalibrierkurve (entsprechend der gestrichelten
und durchgezogenen Linien in 19), die
der Konzentration der m-Galloyl-Gallussäure nach
dem Vermischen des Reagens entsprach, gemessen werden. Falls die
der m-Galloyl-Gallussäurekonzentration
geringer als der vorstehende Bereich ist, gab es Fälle, in
denen das Protein nicht koagulierte, so dass die Durchführung einer
stabilen Messung schwierig war. Falls die m-Galloyl-Gallussäurekonzentration
höher als
der vorstehende Bereich war, präzipitierte
das koagulierte Protein schnell, um eine ungleichförmige Trübung zu
verursachen, was verhinderte, dass die zu detektierende Lösung rund
um den Bereich, durch den das im Wesentlich parallele Licht 2 hindurchging, sich
entsprechend der Konzentration eintrübte, so dass die Durchführung einer
stabilen Messung erschwert war. Deshalb war es praktisch bevorzugt, dass
die Messung innerhalb des vorstehend Konzentrationsbereichs durchgeführt wurde.
-
Wie
vorstehend gezeigt, kann erfindungsgemäß eine Proteinkonzentration
bei einer Temperatur von 0 bis 40°C,
welche eine mögliche
Raumtemperatur zu Hause ist, gemessen werden. Außerdem kann durch ein Mischen
einer Säure
in ein Reagens eine Proteinkonzentration in einem hohen Konzentrationsbereich
(annähernd
250 bis 500 mg/dl oder höher)
ebenso gemessen werden. Ferner kann ein messbarer Konzentrationsbereich
einer zu detektierenden Lösung
ausgeweitet werden und gleichzeitig kann die Anwesenheit oder Abwesenheit
irgendeines Hemmnisses der Messung aufgrund eines suspendierten
Teilchens wie etwa einer Blase detektiert werden. Als ein Ergebnis
kann eine Proteinkonzentration in einer zu detektierenden Lösung mit
hoher Genauigkeit bestimmt werden. Ferner ist es möglich, eine sehr
genaue, praktikable und sichere Messung einer Konzentration einer
Lösung,
insbeson dere einer Proteinkonzentration im Urin, wie im Labor, durchgeführt werden.
-
Ferner
ist es erfindungsgemäß möglich, sowohl
die Konzentration an Protein als auch jeder optisch aktiven Substanz,
außer
Protein, in einer zu detektierenden Lösung durch detektieren. Falls
die zu detektierende Lösung
Urin ist, können
die erforderlichen Schritte für
die Urinanalyse wesentlich vereinfacht werden, da die Proteinkonzentration
in Urin und der Zuckerwert im Urin gleichzeitig genau bestimmt werden
können,
wodurch sie stark zu einem praktischen Effekt beitragen.
-
Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Proteinkonzentration
stabil bei einer Temperatur von nicht höher als 25°C, welches eine mögliche Raumtemperatur
zu Hause ist, zu messen, und ferner den messbaren Konzentrationsbereich
auszudehnen, während
eine Hemmung aufgrund eines suspendierten Teilchens wie etwa einer
Blase und dergleichen verhindert werden soll, und zwar unter Verwendung
eines Reagens, das durch Vermischen einer Säure in eine Lösung mit
Tannin, Tanninsäure und
m-Galloyl-Gallussäure
hergestellt worden ist. Durch Vermischen des Reagens in eine zu
detektierende Lösung
zur Eintrübung
der Lösung
werden die Intensitäten
wenigstens eines transmittierten Lichts oder eines gestreuten Lichts
der zu detektierenden Lösung
gemessen und eine Proteinkonzentration davon wird basierend auf
der Intensität
bestimmt. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren
zur Messung einer Konzentration einer Lösung und ein Verfahren der
Urinanalyse bereit, wobei eine Proteinkonzentration nach Messung
des Rotationswinkels gemessen wird.