DE4433384C2 - Ecotoxicological metabolism test with stable isotopes - Google Patents
Ecotoxicological metabolism test with stable isotopesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Testung ökotoxikoligischer Wirkungen bestimmter Substanzen bzw. Substanzgemische auf biologische Systeme.The invention relates to the testing of ecotoxicological effects certain substances or substance mixtures to biological Systems.
Die Ökotoxikologie beschäftigt sich mit der Umweltgefährlichkeit von Stoffen. Sie verarbeitet Erkenntnisse aus der Biologie (Ökologie), Medizin (Toxikologie) und der Rechtswissenschaft (Umweltrecht) und untersucht die Wirkungen von Stoffen auf Organismen.Ecotoxicology deals with environmental hazards of fabrics. It processes findings from biology (Ecology), medicine (toxicology) and law (Environmental law) and examines the effects of substances Organisms.
Bekannte ökotoxikologische Untersuchungen bedienen sich des Einzelspezies-Tests im Labor, beispielsweise mit Algen (vgl. F. Korte, Lehrbuch der ökologischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart-New York 1987, S. 215). Die Beeinflussung der Algen durch die Teststoffe wird durch Meßparameter, wie die Wachstums reduktion oder physiologische Veränderungen ermittelt. Nachteile bekannter ökotoxikologischer Untersuchungen bestehen insbesondere im Zeitaufwand, der erforderlich ist, um eine Aus sage zu treffen, sowie darin, daß Wachstumsreduktion oder Verän derungen erst dann sichtbar werden, wenn das Lebendmaterial nachhaltig geschädigt ist. Ebenso werden Rädertierchen (vgl. F. Korte, Lehrbuch der ökolo gischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart-New York 1987, S. 216) und Fische in Tests verwendet. Es ist weiterhin bekannt, Pestizide in Nahrungsmitteln mit Hilfe von Insektengeweben, die spezifische Enzyme zur Bindung von Pestiziden enthalten, wobei letztendlich das gebundene radio aktive (¹⁴C) Pestizid gemessen wird (USP 5.200.311). Diese Methode ist auf ein anderes Anwendungsgebiet gerichtet und hat außerdem den Nachteil, daß mit einem radioaktiv-markierten Isotop gearbeitet werden muß.Known ecotoxicological studies use the Single species tests in the laboratory, for example with algae (cf. F. Korte, textbook of ecological chemistry, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart-New York 1987, p. 215). Influencing algae by the test substances by measuring parameters, such as the growth reduction or physiological changes determined. Disadvantages of known ecotoxicological studies exist especially in the amount of time it takes to get out say to meet, as well as that growth reduction or change changes only become visible when the living material is sustainably damaged. Also rotifers (see F. Korte, textbook of ecology Chemical chemistry, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart-New York 1987, P. 216) and fish used in tests. It is also known to use pesticides in food of insect tissues that have specific enzymes for binding Contain pesticides, ultimately the bound radio active (14 C) pesticide is measured (USP 5,200,311). This method is aimed at another area of application and also has the disadvantage that with a radio-labeled Isotope must be worked.
Es ist weiterhin bekannt, den Einbau radioaktiv-markiertens ³H-Thymidins in die DNS von Bakterien unter dem Einfluß chemischer Substanzen zu bestimmen (USP 4.419.955). Diese Methode ist auch auf ein anderes Anwendungsgebiet gerich tet und hat ebenso den Nachteil, daß mit einem radioaktiv- markierten Isotop gearbeitet werden muß. It is also known to incorporate radio-labeled 3 H-thymidine in the DNA of bacteria under the influence of chemical Determine substances (USP 4,419,955). This method is also applicable to another area of application tet and also has the disadvantage that with a radioactive labeled isotope must be worked.
Ebenso ist es bekannt, eine ¹⁵N-Markierung zu benutzen, um den Nachweis zu führen, daß Bodenpilze in der Lage sind, Triazinringe zu spalten und den dabei freiwerdenden Stickstoff in die Biomasse einzubauen (Myskow, W. et al.: Acta Microbiol. Pol 32 (2) 177-183 (1982).It is also known to use a ¹⁵N label to denote the Proving evidence that soil fungi are able to Cleave triazine rings and the nitrogen released in the process built into the biomass (Myskow, W. et al .: Acta Microbiol. Pol 32 (2) 177-183 (1982).
Bei Anwendung dieser Methode wird aber keinerlei Aussage über den Einfluß von Schadstoffen bzw. von Schadstoffen enthaltenden Umweltproben gewonnen. Die Anwendung stabiler Isotope in der Pflanzenphysiologie und Biochemie sowie in der ¹⁵N-Tracertechnik und ¹⁵N- Isotopenanalytik ist an sich bekannt.When using this method, however, nothing is said about the influence of pollutants or those containing pollutants Environmental samples obtained. The application of stable isotopes in plant physiology and Biochemistry as well as in ¹⁵N tracer technology and ¹⁵N- Isotope analysis is known per se.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ökotoxikologische Wirkun gen von Substanzen oder Substanzgemischen auf pflanzliche Systeme in kurzer Zeit zu bestimmen und daraus Aussagen zur Bewertung des Gefährdungspotentials von Umweltproben zu treffen.The aim of the invention is ecotoxicological effects genes of substances or mixtures of substances on plant systems to be determined in a short time and from it statements for evaluation of the hazard potential of environmental samples.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Stickstoff-Stoffwechselkapazität/Proteinsyntheseleistung lebenden Materials durch Einsatz des stabilen, nicht radioaktiven Stick stoffisotops ¹⁵N bestimmt wird und durch einen Vergleichstest mit schadstofffreiem Medium Störungen, die Umweltschadstoffe im Stickstoff- bzw. Proteinstoffwechsel des Lebendmaterials bewir ken, diagnostiziert werden, wobei gleichzeitig ¹⁵N-markierte anorganische oder organische Stickstoff-Quellen (z. B. Nitrat, Ammonium bzw. Aminosäuren) als Tracer und wasserlösliche Umwelt schadstoffe oder Umweltproben an meristematische Pflanzengewebe appliziert werden und nach einer definierten Inkubationszeit unter standardisierten Bedingungen über die ¹⁵N-Isotopenanalyse des pflanzlichen Gewebes bzw. relevanter N- bzw. Proteinfrak tionen (löslicher N, lösliches Protein, Gesamtprotein) die metabolische Aktivität/Proteinsyntheseleistung des so behandel ten Pflanzengewebes im Vergleich zu den unbehandelten Kontroll geweben gemessen wird, wobei die Stickstoff-Inkorperation/Proteinsynthese leistung pflanzlicher Gewebe unter Schadstoffeinfluß durch Einsatz des stabilen, nicht radioaktiven Stickstoffisotops ¹⁵N bestimmt wird und durch einen Vergleichstest mit schadstoff freiem pflanzlichem Gewebe die Störungen, die Schadstoffe (Xenobiotika) im pflanzlichen Stickstoff- bzw. Proteinstoff wechsel bewirken, festgestellt werden. According to the invention the object is achieved in that the Nitrogen metabolic capacity / protein synthesis performance living Material by using the stable, non-radioactive stick substance isotopes ¹⁵N is determined and by a comparison test with pollutant-free medium disturbances, the environmental pollutants in the Cause nitrogen or protein metabolism of the living material ken, can be diagnosed, while ¹⁵N-labeled inorganic or organic nitrogen sources (e.g. nitrate, Ammonium or amino acids) as a tracer and water-soluble environment pollutants or environmental samples on meristematic plant tissue be applied and after a defined incubation period under standardized conditions using the ¹⁵N isotope analysis of the plant tissue or relevant N or protein fractions ions (soluble N, soluble protein, total protein) die metabolic activity / protein synthesis performance of the so treated plant tissue compared to the untreated control tissue is measured, with nitrogen incorporation / protein synthesis performance of plant tissues under the influence of pollutants Use of the stable, non-radioactive nitrogen isotope ¹⁵N is determined and by a comparative test with pollutants free plant tissue the disorders, the pollutants (Xenobiotics) in vegetable nitrogen or protein cause change, be determined.
Durch gleichzeitige Applikation ¹⁵N-markierter anorganischer (Nitrat, Ammonium) oder organischer (Aminosäuren) Stickstoff- Quellen als Tracer und wasserlöslicher Xenobiotika an meristematische Pflanzengewebe gelingt es, nach einer definier ten Inkubationszeit unter standardisierten Bedingungen über die ¹⁵N-Isotopenanalyse des pflanzlichen Gewebes bzw. relevanter N- bzw. Proteinfraktionen (löslicher N, lösliches Protein, Gesamt protein) im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgeweben die metabolische Aktivität/Proteinsyntheseleistung des Pflanzenge webes oder anderen Lebendmaterials unter Schadstoffeinwirkung zu bestimmen.By simultaneous application of ¹⁵N-labeled inorganic (Nitrate, ammonium) or organic (amino acids) nitrogen Sources as tracers and water-soluble xenobiotics Meristematic plant tissue succeeds according to a defined incubation time under standardized conditions over the ¹⁵N isotope analysis of plant tissue or relevant N- or protein fractions (soluble N, soluble protein, total protein) compared to the untreated control tissues metabolic activity / protein synthesis performance of the plant gene weave or other living material under the influence of pollutants determine.
Hierzu wird der Quotient Qw gebildetFor this purpose, the quotient Q w is formed
Hohe Quotienten (Qw ∼ 1.0) bedeuten, daß keine oder nur eine geringe Beeinflussung der pflanzlichen Stickstoff-Stoffwechsel kapazität/Proteinsyntheseleistung durch das Xenobiotikum verur sacht wird, respektive das ökotoxikologische Potential der betreffenden Substanz bzw. des Substanzgemisches (Abwasser, De poniesickerwässer) gering ist. Umgekehrt gestatten niedrige Quotienten differenzierte Bewertungen des ökotoxikologischen Potentials.High quotients (Q w ∼ 1.0) mean that no or only a slight influence on the plant nitrogen metabolism capacity / protein synthesis performance is caused by the xenobiotic, and the ecotoxicological potential of the substance or mixture of substances (waste water, deoxygenated leachate) is low is. Conversely, low quotients allow differentiated assessments of the ecotoxicological potential.
Entsprechend den Richtlinien der Internationalen Atomenergie- Organisation ist die Anreicherung (enrichment) stabiler Isotope die Modifikation der natürlichen Isotopenverhältnisse in Rich tung eines (gewöhnlich des selteneren) stabilen Isotops. Die Anreicherung wird angegeben als Häufigkeit (abundance) in Atom-% (At.-%) bzw. Exzeßhäufigkeit (At.-% exc.). Dies ist die Häufigkeit eines stabilen Isotops minus der natürlichen Häufig keit von ∼0,37 At.-%. Beispiel: Stickstoff mit 10.0 At.-% ¹⁵N ist mit ¹⁵N relativ angereichert und enthält 9.63 At.-% ¹⁵N excess. Der Test ist geeignet, da nicht Photosynthese-aktive pflanzliche Gewebe eingesetzt werden, potentiell Tierversuche zu ersetzen.According to the guidelines of the International Atomic Energy Organization is the enrichment of stable isotopes the modification of the natural isotope ratios in Rich development of a (usually the rarer) stable isotope. Enrichment is given as frequency (abundance) in Atom% (At .-%) or excess frequency (At .-% exc.). this is the Frequency of a stable isotope minus the natural frequency von0.37 at%. Example: nitrogen with 10.0 at .-% ¹⁵N is relatively enriched with ¹⁵N and contains 9.63 at% ¹⁵N excess. The test is suitable because plant-based photosynthesis is not active Tissues are used to potentially replace animal testing.
Vorteilhaft ist es, als meristematische Pflanzengewebe Epikotylselektionen von Erbsen (Pisum arvense) zu verwenden.It is advantageous as a meristematic plant tissue Use epicotyl selections of peas (Pisum arvense).
Besonders vorteilhaft ist es, die Epikotyle von Erbsen (Pisum arvense) etioliert anzuziehen werden.The epicotyle of peas (pisum arvense) etiolated.
Unter etioliert wird dabei verstanden, daß das Pflanzenmaterial im Dunkeln zum Keimen gebracht werden kann.Etiolated is understood to mean that the plant material can germinate in the dark.
Die Erfindung wird zusammenfassend durch das folgende Schema
erläutert. Der Test wird mit dem Namen
Ecotoxicological Stable Isotope Metabolic Assay (ESIMA)
bezeichnet.The invention is summarized by the following scheme. The test is named
Ecotoxicological Stable Isotope Metabolic Assay (ESIMA)
designated.
Applikation des Xenobiotikums und des ¹⁵N-Tracers in einem Inkubationsmedium an das pflanzliche Gewebe bzw. biologische System;Application of the xenobiotic and the ¹⁵N tracer in one Incubation medium to the plant tissue or biological System;
Die Erfindung ist geeignet für die Bestimmung des ökotoxikologischen Potentials vonThe invention is suitable for determining the ecotoxicological potential of
- - organischen Substanzen, - organic substances,
- - anorganischen Substanzen,- inorganic substances,
-
- Substanzgemischen unterschiedlicher Herkunft
(Kombinationswirkungen),
- * Extrakte biologischer Probematerialien,
- * Bodenextrakte,
- * Deponiesickerwässer, Abwässer,
- * schadstoffbelastete wäßrige Medien,
- * Extracts of biological sample materials,
- * Soil extracts,
- * Landfill leachate, waste water,
- * polluted aqueous media,
in kürzester Zeit und mit hoher Genauigkeit. Durch Kombination des Tests mit organischen und anorganischen Analyseverfahren sind über das Testmaterial Aussagen zur Bioak kumulation und Bioverfügbarkeit von Xenobiotika sowie deren biologische Wirkung möglich. Die Erfindung soll anschließend an drei Beispielen erläutert werden.in the shortest possible time and with high accuracy. By combining the test with organic and inorganic Analysis methods are statements about the Bioak via the test material accumulation and bioavailability of xenobiotics and their biological effect possible. The invention will be explained using three examples will.
Epikotylsektionen von Erbsen (Pisum arvense).Epicotyl sections of peas (Pisum arvense).
Erbsen für vier Tage einquellen und im Dunkeln bei 25°C zum Keimen bringen. Ein Zentimeter lange Gewebeabschnitte inkubie ren.Soak peas for four days and in the dark at 25 ° C to Bring germination. One centimeter long sections of tissue incubate ren.
1% Saccharose
0,05 Vol.-% Tween 20 (Emulgator)
10-4 mol Penicillin (Langzeit-Test)
0,1% (¹⁵N) Ammoniumchlorid (Tracer)1% sucrose
0.05% by volume of Tween 20 (emulsifier)
10 -4 mol penicillin (long-term test)
0.1% (¹⁵N) ammonium chloride (tracer)
Schüttelansatz mit 20 Gewebesektionen bei 25°C im Dunkeln.Shake with 20 tissue sections at 25 ° C in the dark.
Analyse der gewaschenen Gewebeabschnitte direkt oder nach Ex traktion der relevanten Stickstoff-Fraktion (Protein nach Homogenisation der inkubierten Gewebe in 80% Äthanol und Präzipitation bei 4°C). Überführen des biologischen Materials in ein Ammoniumsalz durch Aufschluß mit konz. Schwefelsäure und Wasserdampfdestillation (Kjeldahl).Analysis of the washed tissue sections directly or after Ex traction of the relevant nitrogen fraction (protein after Homogenization of the incubated tissues in 80% ethanol and Precipitation at 4 ° C). Transfer of biological material in an ammonium salt by digestion with conc. Sulfuric acid and Steam distillation (Kjeldahl).
Bestimmung der ¹⁵N Exzeßhäufigkeit durch Massenspektrometrie oder Emissionsspektrometrie (¹⁵N Isotopenanalyse ausgehend vom Ammoniumsalz).Determination of the ¹⁵N excess frequency by mass spectrometry or emission spectrometry (¹⁵N isotope analysis based on Ammonium salt).
Bestimmung der Wirkstoffinkorperation in Pisum-
Epikotylgewebe unter Einwirkung des Herbicides MCPA unterschied
licher Konzentration und des Peptidyl-transferase-Inhibitors
Cycloheximids nach 5stündiger Inkubation.
Testfrage: Proteinsyntheseleistung.
Testmaterial: Pisum arvense (Epikotyle).
Tracer: [¹⁵N]-Ammoniumchlorid: 96,2 At.-% ¹⁵N.
Testsubstanz: MCPA, Cycloheximid.
Inkubation: Temp.: 25°C, Dauer: 5 Std.Determination of the active substance incorporation in pisum epicotyl tissue under the influence of the Herbicides MCPA of different concentrations and the peptidyl transferase inhibitor cycloheximide after 5 hours of incubation.
Test question: protein synthesis performance.
Test material: Pisum arvense (epicotyle).
Tracer: [¹⁵N] ammonium chloride: 96.2 at% ¹⁵N.
Test substance: MCPA, cycloheximide.
Incubation: Temp .: 25 ° C, duration: 5 hours
Bestimmung der Wirkstoffinkorperation in Pisum-
Epikotylgewebe unter Einwirkung des Herbicides MCPA unterschied
licher Konzentration und des Peptidyl-transferase-Inhibitors
Cycloheximids nach 22stündiger Inkubation.
Testfrage: Proteinsyntheseleistung.
Testmaterial: Pisum arvense (Epikotyle).
Tracer: [¹⁵N]-Ammoniumchlorid: 96,23 At.-% ¹⁵N.
Testsubstanz: MCPA, Cycloheximid.
Inkubation: Temp.: 25°C, Dauer: 22 Std.Determination of the active substance incorporation in pisum epicotyl tissue under the influence of the Herbicides MCPA of different concentration and the peptidyl transferase inhibitor cycloheximide after 22 hours of incubation.
Test question: protein synthesis performance.
Test material: Pisum arvense (epicotyle).
Tracer: [¹⁵N] ammonium chloride: 96.23 at% ¹⁵N.
Test substance: MCPA, cycloheximide.
Incubation: Temp .: 25 ° C, duration: 22 hours
a) Deponiesickerwässer (Deponie Möckern)
siehe Tabelle 3
b) Bohrlochwasser (Großkayna)
siehe Tabelle 4
c) Labortests mit Standardwirkstoffen
siehe Tabelle 5a) Landfill leachate (Möckern landfill) see Table 3
b) Borehole water (Großkayna) see Table 4
c) Laboratory tests with standard active substances see table 5
Die Testergebnisse zeigen, daß ausgehend von einfachen, kostengünstigen, anorganischen Tracersubstanzen (¹⁵NH₄Cl) allein über die Bestimmung der ¹⁵N-Isotopen-Häufigkeiten des pflanz lichen Materials (Pisum-Epikotylsektionen) sehr rasch und sensitiv eine Beeinflussung des N- und Proteinstoffwechsel durch Schadstoffe nachgewiesen werden kann. Dies ermöglicht eine differenzierte Bewertung des ökotoxikologischen Potentials von Schadstoffen und Schadstoffgemischen sowie die Ableitung von prophylaktischen und sanierenden Maßnahmen. The test results show that starting from simple, inexpensive, inorganic tracer substances (¹⁵NH₄Cl) alone on the determination of the ¹⁵N isotope frequencies of the plant material (pisum epicotyl sections) very quickly and sensitive to an influence on the N and protein metabolism Pollutants can be detected. This enables one differentiated assessment of the ecotoxicological potential of Pollutants and pollutant mixtures as well as the derivation of prophylactic and remedial measures.
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