DE4415001A1 - Treatment of eukaryotic cells with cpds. that bind lipo-polysaccharide - Google Patents

Treatment of eukaryotic cells with cpds. that bind lipo-polysaccharide

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    • C12N15/87Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Abstract

Treatment of eukaryotic cells, partic. for absorption of foreign material (A), comprises:(a) contacting the cells with a substance (I) that binds lipopolysaccharide (LPS) and neutralises its toxicity for cells, and/or;(b) using (A) that has been freed of LPS before introducing into the cell. Also new are:(1) compsns. for this process that contain (I), and(2) cell culture media contg. such compsns.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Behandeln von eukaryotischen Zellen. The present invention relates to method of treating eukaryotic cells.

Ein beim Arbeiten mit eukaryotischen Zellen in Kultur oder in vivo häufig auftretendes Problem ist die Anwesenheit von Endotoxin. A frequently encountered when working with eukaryotic cells in culture or in vivo problem is the presence of endotoxin.

Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS), eine Hauptkomponente der Zellwand gramnegativer Bakterien, ist z. Endotoxin (lipopolysaccharide, LPS), a major component of the cell wall of gram-negative bacteria, is z. B. häufig als Verunreinigung in Plasmid-DNA-Präparationen zu finden, weil bei den üblicherweise bei der Präparation von Plasmid-DNA angewandten Methoden bis zu 40% des Oberflächen-LPS von E. coli frei werden. often found as an impurity in plasmid DNA preparations, because up to 40% of the surface of E. coli LPS are free at the commonly employed in the preparation of plasmid DNA methods. Aufgrund der negativen Ladungen verhält sich LPS auf Anionenaustausch-Chromatographieharzen ähnlich wie die DNA, andererseits benimmt sich LPS aufgrund der Größe, die es in seiner micellaren Form hat, auf Größenausschlußharzen wie ein großes DNA-Molekül. Due to the negative charges to LPS behaves similarly to the DNA to anion-exchange chromatography resins, on the other hand, LPS acts due to the size which it has in its micellar form, on size exclusion resins as a large DNA molecule. Die Dichte von LPS in CsC1 ist ähnlich der von Plasmid/EtBr- Komplexen, so daß es leicht vorkommen kann, daß die DNA in CsC1-Banden verunreinigt ist. The density of LPS in CsC1 is similar to that of plasmid / EtBr complexes, so that it can easily happen that the DNA is contaminated in CsC1 bands. Bei der Transfektion mit DNA kommen somit die Zellen in Kontakt mit LPS. In the transfection with DNA thus the cells come into contact with LPS.

Da das LPS-Molekül toxisch sowie ein starker Stimulator des Säugetierimmunsystems ist, ist seine Anwesenheit bei der Behandlung von Zellen unerwünscht. Since the LPS molecule and a toxic stimulant of the mammalian immune system, its presence in the treatment of cells is undesirable. Daher gab es bereits zahlreiche Ansätze für den Nachweis von LPS sowie für Methoden, dieses Molekül oder gramnegative Bakterien zu beseitigen bzw. die dadurch bedingten störenden Effekte zu neutralisieren (Cordle et al, 1993; Elsbach und Weiss, 1993; Golenbock et al, 1993; Haziot et al, 1993a; Lynn et al, 1991; Perera et al, 1993; Rustici et al, 1993; Tobias et al, 1988; Tobias et al, 1989; Ziegler-Heitbrock und Ulevitch, 1993). Therefore, there have been numerous approaches for the detection of LPS, as well as methods to eliminate this molecule or gram-negative bacteria and the consequent negative effects upgrades to neutralize (Cordle et al, 1993; Elsbach and Weiss, 1993; Golenbock et al, 1993; Haziot et al, 1993a; Lynn et al, 1991; Perera et al, 1993; Rustici et al, 1993; Tobias et al, 1988; Tobias et al, 1989; Ziegler Heitbrock and Ulevitch, 1993).

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Toxizitätsprobleme im Zusammenhang mit der Gegenwart von LPS bei der Behandlung von eukaryotischen Zellen, wie sie insbesondere im Zusammenhang mit dem Import von Fremdmaterial in die Zelle auftreten, zu beseitigen. The present invention was based on the object to overcome the toxicity problems associated with the presence of LPS in the treatment of eukaryotic cells, such as occur in the cell, in particular in connection with the import of foreign material.

Im Zuge der Experimente, die zur Lösung dieser Aufgabe durchgeführt wurden, wurde zunächst festgestellt, daß beim Transfer von Plasmid-DNA mittels Adenovirus unterstützter Rezeptor-vermittelter Endozytose, die ua in der WO 93/07 283 sowie von Wagner et al, 1992; In the course of experiments that were performed to achieve this object, it was first determined that the transfer of plasmid DNA using adenovirus assisted receptor-mediated endocytosis, among others, in WO 93/07 283 as well as by Wagner et al, 1992; Cotten et al, 1992; Cotten et al, 1992; Curiel et al, 1991; Curiel et al, 1991; Cotten et al, 1993; Cotten et al, 1993; Cristiano et al, 1993a, und Cristiano et al, 1993b, beschrieben ist, in primäre humane Hautfibroblasten oder in primäre humane Melanomzellen Toxizitätsprobleme auftreten. Cristiano et al, 1993a, and Cristiano et al, 1993b is described, occur in primary human skin fibroblasts or in primary human melanoma cells toxicity problems. Anhand von Versuchen mit LPS enthaltender DNA oder reinem LPS konnten diese Probleme auf die Gegenwart von LPS zurückgeführt werden. On the basis of experiments with LPS-containing DNA or pure LPS these problems could be attributed to the presence of LPS. Die Toxizität trat bei Mengen von 100 ng/ml freiem LPS oder, bei Inkorporierung von LPS in die Polylysin/Adenovirus-Komplexe, bei 100 pg/ml auf. Toxicity occurred at levels of 100 ng / ml LPS-free or at incorporation of LPS in the polylysine / adenovirus complexes at 100 pg / ml. Ausgehend von diesen Befunden wurden Methoden entwickelt, die die LPS-Verunreinigungen aus der DNA entfernen und somit die Toxizität beseitigen. Based on these findings, methods have been developed to remove LPS contamination of the DNA and thus eliminate the toxicity. Eine einfache und wirkungsvolle Methode zur Entfernung von LPS wendet das Detergens Triton X-114 an. A simple and effective method of removing LPS applies the detergent Triton X-114th Bei Temperaturen unterhalb von 20°C ist Triton X-114 mit wäßrigen Lösungen mischbar, bei Temperaturen über 20°C trennt es sich in eine gesonderte Phase ab (Bordier, 1981). At temperatures below 20 ° C Triton X-114 is miscible with aqueous solutions, at temperatures above 20 ° C, it separates into a separate phase from (Bordier, 1981). Dieses Phänomen kann ausgenutzt werden, um das lipophile LPS-Molekül aus wäßrigen Proteinlösungen (Aida und Pabst, 1990) oder aus DNA-Präparationen (Manthorpe et al, 1993) zu extrahieren. This phenomenon can be exploited to extract the lipophilic LPS molecule from aqueous protein solutions (Aida and Pabst, 1990) or from DNA preparations (Manthorpe et al, 1993).

Eine alternative Methode zur LPS-Abtrennung verwendet Polymyxin B, ein zyklisches Schimmelpilzpeptidantibiotikum (Storm et al, 1977), das mit hoher Affinität an die Lipid A/Ketodeoxyoctolonsäure-Komponente von LPS bindet (K a = 1.15 × 10⁷ M -1 ; Rustici et al, 1993; Lynn und Golenbock, 1992; Schindler und Osborn, 1979). An alternative method for LPS removal using Polymyxin B, a cyclic mold peptide antibiotic (Storm et al, 1977) that binds with high affinity to the lipid A / Ketodeoxyoctolonsäure component of LPS (K a = 1.15 × 10⁷ M -1; Rustici et al, 1993; Lynn and Golenbock, 1992; Schindler and Osborn, 1979). Polymyxin wurde bisher zur Entfernung von LPS aus Proteinen eingesetzt; Polymyxin has been used to remove LPS from proteins; dazu wird Polymyxin in an ein Harz gebundener Form in Chromatographiesäulen eingesetzt. to polymyxin is used in bound to a resin in the form of chromatography columns.

Die Versuche mit gereinigter DNA haben gezeigt, daß die Entfernung von LPS aus den DNA-Präparationen eine Steigerung der Genexpression bewirkt. The experiments with purified DNA have shown that the removal of LPS from the DNA preparations caused an increase of gene expression.

LPS ist jedoch nicht nur ein unerwünschter Begleiter von DNA-Präparationen, sondern eine ubiquitäre Verunreinigung, die ua in den üblicherweise verwendeten Zellkulturmedien auftritt. However, LPS is not only an unwanted companion of DNA preparations, but a ubiquitous contaminant which occurs among others in commonly used cell culture media. Der LPS-Gehalt von Serumpräparaten kann in weiten Bereichen schwanken; The LPS content of serum preparations can vary widely; wenn nicht besondere Maßnahmen getroffen werden, um verunreinigte Präparate auszuschließen, kann der Gehalt bis zu 10 bis 50 ng/ml betragen. unless special measures are taken to exclude contaminated preparations, the content may be up to 10 to 50 ng / ml. Ein Problem tritt ferner im Zusammenhang mit den üblicherweise verwendeten Glasgeräten auf, die in Kontakt mit Bakterien gekommen sind. A problem also occurs in connection with the commonly used glass devices that have come into contact with bacteria. Da es sehr arbeitsaufwendig ist, den LPS-Gehalt aller Reagentien und Glasgefäße zu überwachen, wurde zur Lösung der gestellten Aufgabe nach einer Methode gesucht, die den mit der Gegenwart von LPS verbundenen Problemen bei der Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere beim Transport von Fremdmaterial in die Zellen, von vornherein entgegenwirkt. Since it is very labor intensive to monitor the LPS content of all reagents and glass vessels, the task set was looking for a way to solve the the requirements linked to the presence of LPS problems in the treatment of eukaryotic cells, particularly in the transport of foreign material in the cells counteracts a priori.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere für die Aufnahme von Fremdmaterial. The present invention relates to a method of treating eukaryotic cells, especially for the intake of foreign material. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die durch Lipopolysaccharid induzierte Toxizität, wie sie insbesondere bei der Aufnahme von Fremdmaterial auftritt, neutralisiert, indem man die Zellen mit einer Substanz behandelt, die Lipopolysaccharid bindet und dessen Toxizität für die Zelle blockiert. The method is characterized in that neutralization induced by lipopolysaccharide toxicity, as occurs in particular in the absorption of foreign material, by treating the cells with a substance which binds lipopolysaccharide and blocks its toxicity to the cell.

Substanzen mit dieser Eigenschaft werden im folgenden der Einfachheit halber "LPS bindende Substanzen" genannt; Substances with these characteristics are referred to below for simplicity "LPS binding substances"; die Substanz kann als Einzelsubstanz oder als Mischung vorliegen. the substance may be present as an individual substance or as a mixture.

Die Anwendung der Erfindung kann sich auf sämtliche Verfahren zum Einbringen von Fremdmaterial in die Zelle erstrecken, sofern die Gegenwart von LPS eine Toxizität hervorruft, die sich negativ auf die Effizienz des Verfahrens auswirkt. The application of the invention may extend to any method for introducing foreign material into the cell, provided that the presence of LPS causes a toxicity which adversely affects the efficiency of the process. Dazu zählen ua Methoden zum Importieren von Arzneimitteln bzw. Arzneimittelkonjugaten oder von Toxinen. These include methods for importing drugs or drug conjugates or toxins. Bevorzugt wird das Verfahren auf Transfektions- und Infektionsmethoden zum Einbringen von Fremd-DNA oder -RNA in die Zelle angewendet, z. The process is preferably applied to transfection and infection methods for introducing foreign DNA or RNA in the cell, eg. B. die Calciumphosphat-, die Mikroinjektions- und die DEAE-Methode, Methoden, die mit Liposomen oder kationischen Lipiden arbeiten, sowie Methoden, die sich rekombinanter Viren bedienen; For example, the calcium phosphate, the microinjection and the DEAE method, methods that work with liposomes or cationic lipids, as well as methods that use recombinant viruses; besonders bevorzugt wird das Verfahren im Zusammenhang mit Gentransfermethoden auf Basis der Rezeptor vermittelten Endozytose angewendet. the method in the context of gene transfer methods based on receptor-mediated endocytosis is particularly preferably employed. Eine Übersicht solcher Methoden wird z. An overview of such methods is z. B. von Cotten und Wagner, 1993, gegeben. B. by Cotten and Wagner, 1993 given. Das Erfordernis für die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf diese Methoden kann auf einfache Weise festgestellt werden, indem die Methode unter ansonsten identischen Bedingungen in Abwesenheit von LPS oder in Gegenwart von LPS durchgeführt und die erhaltenen Ergebnisse verglichen werden. The requirement for the application of the present invention to these methods can be determined in a simple manner by the method under otherwise identical conditions in the absence of LPS or LPS in the presence of carried out and the results obtained are compared.

An die LPS bindenden Substanzen wird die Anforderung gestellt, daß sie sowohl LPS mit ausreichender Avidität binden als auch dessen Wechselwirkung mit Zellkomponenten, welche für die Toxizität verantwortlich ist, blockieren. the request is made to the LPS-binding substances to bind both LPS with sufficient avidity as well as its interaction with cellular components which is responsible for toxicity, to block. (Im Unterschied zu Substanzen, die diese Anforderungen erfüllen, gibt es Proteine, z. B. das Lipopolysaccharid bindende Protein, ein Akutphasenprotein, die mit zwar mit hoher Affinität an LPS binden, jedoch die Antwort der Zelle auf die LPS- Toxizität aktivieren; ein solcher Effekt wäre im Rahmen der vorliegenden Erfindung unerwünscht). (In contrast to substances that meet these requirements, there are proteins, such as the lipopolysaccharide-binding protein, an acute phase protein that bind with, although with high affinity to LPS, but activate the response of the cell to the LPS toxicity;. A such an effect would be undesirable in the present invention).

Die LPS bindenden Substanzen werden in Mengen eingesetzt, die das vorhandene LPS zumindest in einem Ausmaß absättigen, daß dessen Toxizität im Hinblick auf die vorgesehene Anwendung neutralisiert wird und in denen sie selbst nicht toxisch sind. The LPS-binding substances are used in amounts which saturate the existing LPS at least to an extent that its toxicity is neutralized in view of the intended application and in which they themselves are not toxic.

Um die Eignung einer Substanz und deren optimale Konzentration zu ermitteln, werden zweckmäßig Transfektionsversuche durchgeführt, z. To determine the suitability of a substance and its optimal concentration, transfection experiments are conveniently done for. B. im Hinblick auf eine konkret durchzuführende Transfektion mit dem jeweiligen Zelltyp. B. in terms of a concrete to be performed transfection with the respective cell type. Mittels Titrationen wird die geeignete Konzentration festgestellt, in der die Substanz eine Steigerung der Genexpression bewirkt, ohne selbst eine schädigende Wirkung auf die Zellen auszuüben. By means of titrations is determined the appropriate concentration, in which the substance causes an increase in gene expression, without exerting any harmful effect on the cells. In Ergänzung zum Transfektionssystem kann die Wirkung der LPS bindenden Substanz auf die Morphologie der Zellen mikroskopisch untersucht werden. In addition to the transfection system the effect of LPS binding substance on the morphology of the cells can be examined microscopically. Ferner können Assays eingesetzt werden, mit denen die Freisetzung zellulärer Komponenten als Maß für die als Reaktion auf die LPS-Toxizität eintretende Nekrose oder Apoptose gemessen wird. Further assays can be used with which the release of cellular components is measured as a measure of occurring in response to LPS toxicity necrosis or apoptosis. Beispiele dafür sind der kommerziell erhältliche, klinisch in großem Maßstab eingesetzte Lactatdehydrogenase-Assay oder die kürzlich beschriebene Epifluoreszenz-Methode nach Färbung mit Calcein-AM und Propidiumiodid (Lorenzo et al., 1994). Examples are the commercially available and clinically used in large scale lactate dehydrogenase assay or epifluorescence, the recently described method after staining with Calcein-AM and propidium iodide (Lorenzo et al., 1994). Mit Hilfe solcher Methoden wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung im Fall von Polymyxin B festgestellt, daß das Medium vorzugsweise nicht mehr als 100 µg/ml enthalten sollte und die untere Grenze bei 3 µg/ml und darunter liegen kann. With the help of such methods it has been found in the present invention in the case of polymyxin B, that the medium should contain no more than 100 ug / ml and the lower limit is preferably at 3 .mu.g / ml and below it can. Die durch Polymyxin bewirkte Neutralisierung begann sich bei 1 µg/ml und darunter zu verschlechtern. That caused by polymyxin neutralization began at 1 ug / ml and worsen under. Das entspricht einem Erfordernis von 250 ng Polymyxin zur Neutralisierung von 10 bis 100 ng LPS. This corresponds to a requirement of 250 ng polymyxin to neutralize from 10 to 100 ng LPS. Dabei ist zu beachten, daß das LPS in die Transfektionskomplexe eingebaut sein kann und daher nicht unbedingt für die Bindung an die LPS bindende Substanzen verfügbar sein muß. It should be noted that the LPS can be incorporated into the transfection and therefore not necessarily binding substances must be available for binding to the LPS. Es ist auch möglich, daß die Neutralisierung durch die LPS bindende Substanz intrazellulär abläuft, wenn die LPS enthaltenden Transfektionskomplexe ins Zytoplasma freigesetzt werden. It is also possible that the neutralization by the LPS-binding substance occurs intracellularly, when the LPS-containing transfection complexes are released into the cytoplasm. Daher könnte der Überschuß an Antibiotikum im Medium erforderlich sein, um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen an LPS bindenden Substanzen für die Neutralisierung zu gewährleisten. Therefore, the excess of antibiotic in the medium may be required to ensure sufficient intracellular concentrations of LPS-binding substances for the neutralization. Mittels Titrationen kann die für die Blockierung der Toxizität minimal erforderliche Konzentration ermittelt werden. By means of titrations, the minimum required for blocking the toxicity concentration can be determined.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist die LPS bindende Substanz Polymyxin B. In one embodiment of the invention, the LPS binding substance is polymyxin B.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Substanz Polymyxin E (Storm et al, 1977), ein Derivat von Polymyxin B, das sich von diesem nur durch eine Aminosäure unterscheidet. In a further embodiment, the substance is polymyxin E (Storm et al, 1977), a derivative of polymyxin B, which differs from the latter only by one amino acid. Wie Polymyxin B kann es LPS binden, im Gegensatz zu Polymyxin B ist es aber nicht in der Lage, die Aktivierung von Proteinkinase C zu blockieren. How it can bind LPS polymyxin B, as opposed to polymyxin B but it is not able to block the activation of protein kinase C.

Weitere Beispiele für Substanzen von denen bekannt ist, daß sie LPS binden und neutralisieren, sind: HDLs und LDLs (Levine et al, 1993; Flegel et al, 1993; Roth et al, 1993), Apolipoprotein A1 (Flegel et al, 1993), das Protein BPI ("Bactericidal/Permeability Increasing Protein") oder Fragmente davon (Dentener et al, 1993; Elsbach und Weiss, 1993), die die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erforderlichen Eigenschaften aufweisen, Limulus-Proteine (Roth und Tobias, 1993), Derivate von Polymyxin, die eine verminderte Zelltoxizität aufweisen, synthetische Peptide mit Affinität für LPS (Rustici et al, 1993), Antikörper gegen LPS oder Lipid A (Burd et al, 1992). Other examples of substances which are known that they are bind LPS and neutralize: HDLs and LDLs (Levine et al, 1993; Flegel et al, 1993; Roth et al, 1993), apolipoprotein A1 (Flegel et al, 1993) , the protein BPI ( "Bactericidal / Permeability Increasing protein") or fragments thereof (Dentener et al, 1993; Elsbach and Weiss, 1993), having the requisite within the framework of the present invention properties, Limulus proteins (Roth and Tobias 1993 ), derivatives of polymyxin, which have reduced cellular toxicity, synthetic peptides having affinity for LPS (Rustici et al, 1993), antibodies against LPS or lipid a (Burd et al, 1992). Es können darüberhinaus geeignete Substanzen entworfen werden, indem z. It can be designed also make appropriate substances by z. B. von größeren Molekülen, deren LPS bindende Eigenschaft bekannt ist, die LPS bindende Domäne identifiziert und das Peptid, gegebenenfalls in modifizierter Form, eingesetzt wird. B. of larger molecules, the LPS binding property is known that LPS identified binding domain and the peptide is optionally used in modified form. Alternativ kann, ähnlich wie von Rustici et al, 1993, für Polymyxin B vorgeschlagen, von der Struktur niedermolekularer Moleküle mit bekannter LPS-Bindungseigenschaft ausgegangen werden, um neue Moleküle bereitzustellen, die im Hinblick auf Bindung und Entgiftung von LPS optimiert sind. Alternatively, similar of Rustici et al, 1993, proposed for polymyxin B, be assumed that the structure of low molecular weight molecules of known LPS binding property to provide new molecules that are optimized for binding and detoxifying LPS.

Die LPS bindenden Substanzen werden auf einfache Weise eingesetzt, indem sie vorzugsweise als Bestandteil des Transfektionsmediums vorliegen. The LPS-binding substances are used in a simple manner by preferably as part of the transfection. Im allgemeinen ist die Anwesenheit der LPS bindenden Substanzen lediglich während der Transfektion erforderlich, weil der toxische Effekt von LPS sich vor allem bei der Transfektion manifestiert; In general, the presence of the LPS binding substances only during transfection is required because of the toxic effect of LPS primarily manifests itself in transfection; es kann somit beim nach der Transfektion vorgenommenen Medienwechsel der Zusatz an dieser Substanz entfallen. It is therefore not necessary on this matter when made after transfection media change the accessory. Die Anwesenheit der Substanz kann jedoch auch über die Transfektion hinaus von Nutzen für das Wachstum der Zelle sein, wenn z. However, the presence of the substance may be useful for the growth of the cell via transfection addition, if z. B. der verwendete Zelltyp empfindlich auf LPS ist; For example, the cell type used is sensitive to LPS; in diesem Fall enthält auch das nach der Transfektion bzw. Infektion auf die Zellen aufgebrachte frische Medium die LPS bindende Substanz. in this case, the applied after transfection or infection on the cells fresh medium containing the LPS-binding substance.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen vor dem Aufbringen des Transfektionsmediums mit den LPS bindenden Substanzen vorbehandelt, um vorhandenes LPS zu binden und gegebenenfalls zu entfernen. In a further embodiment of the inventive method, the cells are pretreated prior to the application of the transfection with the LPS-binding substances to bind existing LPS and remove, if necessary.

Die Behandlung von Zellen mit LPS bindenden Substanzen kann auch unabhängig von deren Behandlung mit in die Zelle zu importierendem Fremdmaterial von Vorteil sein, z. Treatment of cells with LPS binding substances can also be independent of its treatment with the cell to import from foreign material advantageous z. B. während der Kultur von Zellen, die in ihrem Wachstum sehr empfindlich auf LPS reagieren. B. whereas the culture of cells that react in their growth very sensitive to LPS.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Zusammensetzungen für die Behandlung von höheren eukaryotischen Zellen. The present invention relates in a further aspect of compositions for the treatment of higher eukaryotic cells.

Im Falle von Zellkulturanwendungen ist diese Zusammensetzung ein Medium, das neben den üblichen Komponenten eine oder mehrere LPS bindende Substanzen enthält. In the case of cell culture applications, this composition is a medium which contains the usual components, one or more LPS binding substances. Zu den üblichen Komponenten zählen Nährstoffe für die Zellen, Puffersubstanzen, etc. Für den Fall, daß die LPS bindende Substanz Bestandteil eines Transfektionsmediums ist, enthält dieses außerdem die Transfektionskomponenten, also das in die Zelle zu importierende Fremdmaterial und die Komponenten, die dessen Transport in die Zelle vermitteln (z. B. rekombinante Viren, kationische Lipide, Liposomen, sowie Komplexe für den Rezeptor-vermittelten Gentransfer, gegebenenfalls in Kombination mit endosomolytischen Mitteln, die die Gentransfereffizienz steigern; derartige Komplexe sind ua in der WO 93/07 283 beschrieben). To the usual components include nutrients for the cells, buffers, etc. In the event that the LPS binding substance part of transfection, this also includes the transfection components, so that the cell to import foreign material and the components that its transport in mediate the cell (e.g., recombinant viruses, cationic lipids, liposomes, and complexes for the receptor-mediated gene transfer, optionally in combination with endosomolytic agents that enhance gene transfer efficiency;. such complexes include, in WO 93/07 283 describes) , Bei der Herstellung eines solchen Transfektionsmediums wird die LPS bindende Substanz zweckmäßig vor den Transfektionskomponenten zugegeben. In the manufacture of such a transfection, the LPS-binding substance is added before the appropriate transfection components.

Die vorliegende Erfindung kann sowohl bei der Behandlung von Zellen in Zellkultursystemen als auch in vivo angewendet werden; The present invention can be applied both in the treatment of cells in cell culture systems and in vivo; in letzterem Fall hat das die LPS bindende Substanz enthaltende Medium die Funktion eines Arzneimittels. in the latter case, the LPS-binding substance containing medium has the function of a medicament.

Die Erfindung ist bei therapeutischen Anwendungen von Vorteil, bei denen durch die Anwesenheit von LPS Probleme auftreten. The invention is useful in therapeutic applications advantage where problems occur due to the presence of LPS. Ein Beispiel dafür ist die therapeutische Anwendung von rekombinanten Adenovirusvektoren zwecks Verabreichung von intakten CFTR ("Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator")-Genen an Patienten mit zystischer Fibrose (CF), bei denen diese Gene mutiert sind. One example is the therapeutic use of recombinant adenovirus vectors for the purpose of administration of the intact CFTR ( "Cystic fibrosis transmembrane regulator") - antigens in patients with cystic fibrosis (CF) in which these genes are mutated. Da die Lunge von CF-Patienten große Mengen von Pseudomonas-LPS enthalten kann (Pseudomonas- Infektionen sind eine Begleiterscheinung der Erkrankung), könnte eine Beschränkung in der Anwendung dieser Methode, die entweder über das Nasenepithel oder durch Instillationen direkt in die Lunge erfolgt, in einer Toxizität für das Lungenepithel gelegen sein, welche durch den gemeinsamen Eintritt von rekombinantem Adenovirus und LPS verursacht wird. Since the lungs of CF patients can contain large amounts of Pseudomonas LPS (Pseudomonas infections are a side effect of the disease), could be a restriction in the use of this method, which is carried out either via the nasal epithelium or through instillations directly into the lungs, be located a toxicity to the lung epithelium, which is caused by the common inlet of recombinant adenovirus and LPS. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Versuche mit Atemwegsepithelzellen durchgeführt, in denen gezeigt wird, daß Polymyxin B den durch LPS verursachten starken Abfall in der Genexpression zu blockieren vermag. In the present invention experiments were conducted with airway epithelial cells is shown in which that polymyxin B is able to block LPS-caused sharp decrease in gene expression. Ein Zusatz einer LPS bindenden Substanz zum Adenovirus enthaltenden Medium kann somit entscheidende Verbesserungen bei der therapeutischen Behandlung von Lungenepithelzellen bringen. An addition of an LPS-binding substance containing the adenovirus medium can thus bring significant improvements in the therapeutic treatment of lung epithelial cells.

Ein weiteres Beispiel ist die Anwendung auf Endothelzellen, von denen bekannt ist, daß sie schwer zu transfizieren sind; Another example is the application on endothelial cells, which are known that they are difficult to transfect; eine mögliche Erklärung für diese Schwierigkeit dürfte in der Eigenschaft dieser Zellen gelegen sein, bereits auf sehr geringe Mengen von LPS anzusprechen (Arditi et al, 1993; Haziot et al, 1993b; Pugin et al, 1993), wobei die Sekretion verschiedener zellulärer Faktoren als Reaktion einer Zelle auf LPS auch andere Zellen, die selbst nicht direkt mit LPS in Berührung gekommen sind, beeinflußt. a possible explanation for this difficulty is likely to be located in the property of these cells already responding to very small amounts of LPS (Arditi et al, 1993; Haziot et al, 1993b; Pugin et al, 1993), the secretion of various cellular factors as response of a cell to LPS and other cells that are not themselves come directly to LPS in contact affected. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte anhand von Transfektionen von Nabelvenenendothelzellen gezeigt werden, daß sogar sehr geringe Mengen an LPS-Verunreinigungen eine Toxizität erzeugen; In the present invention it could be shown that even very small amounts of LPS contamination generate a toxicity using transfections of umbilical vein endothelial cells; da LPS-gereinigte DNA verwendet wurde, rührten diese ausschließlich von Gewebekulturreagentien her. since LPS purified DNA was used, they touched exclusively ago by Gewebekulturreagentien. Auch diese durch geringe LPS-Mengen hervorgerufene Toxizität konnte durch Polymyxin neutralisiert werden. These caused by small amounts of LPS toxicity could be neutralized by polymyxin.

Die vorliegende Erfindung kann ferner bei der Transfektion von Patientenzellen ex vivo von Vorteil sein, wenn die Zellpopulation mit geringen Mengen LPS verunreinigt ist. The present invention may also be in the transfection of patient cells ex vivo advantageous when the cell population is contaminated with small amounts of LPS. Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist die Herstellung von Krebsvakzinen, bei der dem Patienten Tumorzellen entnommen, ex vivo mit einer für ein immunstimulierendes Polypeptid kodierenden DNA transformiert und dem Patienten als Impfung verabreicht werden. An example of such an application is the production of cancer vaccines in which taken from the patient tumor cells, transformed ex vivo with a coding for an immunostimulatory polypeptide DNA and are administered to the patient as a vaccine.

Bei therapeutischen Anwendungen kann die LPS bindende Substanz als Bestandteil der Zusammensetzung vorliegen, die die Funktion des Transfektions- bzw. Infektionsmediums hat und somit zusammen mit den Transfektionskomponenten auf die Zellen aufgebracht werden. In therapeutic applications, the LPS may be binding substance as part of the composition which has the function of transfection or infection medium and are thus applied to the cells together with transfection components. Sie kann auch als wirksame Komponente einer Arzneimittelzubereitung vorliegen, die dem Transfektionsmedium vor der Transfektion zugesetzt oder auch getrennt von der Transfektionszusammensetzung, z. They can also be present as an effective component of a pharmaceutical preparation which is added to the transfection media prior to transfection or separated from the transfection, z. B. vor der Transfektion, verabreicht wird. B. is administered prior to transfection. In ihrer einfachsten Form ist eine solche Zubereitung eine Lösung der LPS bindenden Substanz, wobei die Zubereitung außerdem übliche Zusatzstoffe enthalten kann; In its simplest form, such a preparation is a solution of the LPS-binding substance, said composition may also contain conventional additives; Methoden zur Formulierung pharmazeutischer Zubereitungen sind dem Fachmann bekannt. Methods of formulating pharmaceutical preparations are well known in the art. Sie können einschlägigen Handbüchern, z. You can handbooks such. B. Remington′s Pharmaceutical Sciences, 1980, entnommen werden. , Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980 be taken.

Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt Arzneimittel, enthaltend als wirksame Komponente eine LPS bindende Substanz, für die Anwendung bei einer therapeutischen Behandlung, bei der Fremdmaterial in die Zelle eingebracht wird. The invention thus relates in a further aspect pharmaceutical composition is introduced comprising as an effective component a LPS binding substance for use in a therapeutic treatment, wherein the foreign material into the cell. Bevorzugt ist das Fremdmaterial eine Nukleinsäure, insbesondere DNA. Preferably, the foreign material is a nucleic acid, especially DNA.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung von LPS bindenden Substanzen für die Herstellung von Arzneimitteln zur Anwendung vor und/oder gleichzeitig und/oder nach der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Transfektion oder Infektion mit DNA oder RNA. The present invention relates in a further aspect, the use of LPS binding substances for the preparation of medicaments for application before and / or simultaneously and / or after the treatment of the human or animal body by transfection or infection with DNA or RNA.

Diese therapeutischen Behandlungen umfassen neben viralen Gentransfermethoden bevorzugt gentherapeutische Maßnahmen, wie sie im Übersichtsartikel von Cotten und Wagner, 1993, beschrieben sind, einschließlich solcher Methoden, bei denen inhibierende Nukleinsäuremoleküle, wie Antisense-RNAs, Ribozyme oder dafür kodierende DNA- Moleküle angewendet werden, um Zellfunktion spezifisch zu inhibieren. These therapeutic treatments include not only viral gene transfer methods preferred gene therapeutic measures, as described in the review article by Cotten and Wagner, 1993, including those methods in which inhibitory nucleic acid molecules such as antisense RNAs, ribozymes, or coding for DNA molecules are used to to inhibit cell function-specific.

Figurenübersicht LIST OF FIGURES

Fig. 1 Einfluß des Endotoxingehaltes der DNA auf die Expression von IL-2 in humanen Melanomzellen, Fig. 1 influence the endotoxin content of the DNA for the expression of IL-2 in human melanoma cells,

Fig. 2 Verringerung der Toxizität von LPS bei der Transfektion von primären humanen Fibroblasten durch Polymyxin B, Fig. 2 reducing the toxicity of LPS in the transfection of primary human fibroblasts by polymyxin B,

Fig. 3 Wirkungsweise von Polymyxin B bei Konzentrationen von 30 µg/ml bis 0.03 µg/ml, Fig. 3 of action of polymyxin B at concentrations of 30 ug / mL to 0.03 ug / ml,

Fig. 4 Wirkung von Polymyxin B während und nach der Transfektion, Fig. 4 Effect of polymyxin B during and after transfection,

Fig. 5 Zusammenhang zwischen der Freisetzung von Lactatdehydrogenase und Transfektionseffizienz in Gegenwart von Polymyxin B, Fig. 5 correlation between the release of lactate dehydrogenase and transfection in the presence of polymyxin B,

Fig. 6 Blockierung der durch natürliche LPS- Verunreinigungen von Plasmid-DNA bedingten Toxizität durch Polymyxin B, Fig. 6 blocking the natural LPS caused by contaminants from plasmid DNA toxicity by polymyxin B,

Fig. 7 Blockierung der LPS-Toxizität in primären humanen Atemwegsepithelzellen durch Polymyxin B, Fig. 7 blocking of LPS toxicity in primary human airway epithelial cells by polymyxin B,

Fig. 8 Blockierung der durch LPS aus Gewebekulturreagentien verursachten Toxizität durch Polymyxin B in Nabelvenendothelzellen, Fig. 8 blocking the toxicity caused by LPS from Gewebekulturreagentien by polymyxin B in Nabelvenendothelzellen,

Fig. 9 Blockierung der durch LPS induzierten Toxizität durch Polymyxin E. Fig. 9 blocking LPS-induced toxicity by polymyxin E.

In den folgenden Beispielen, die die vorliegende Erfindung illustrieren, wurden, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden angewendet. In the following examples, which illustrate the present invention, the following materials and methods were, unless otherwise stated, apply.

a) Plasmid-Konstrukte a) Plasmid constructs i) pCMVL i) pCMVL

Die Konstruktion des Plasmids ist in der WO 93/07 283 beschrieben. The construction of the plasmid is described in WO 93/07 283rd

ii) pGShIL-2tet ii) pGShIL-2tet

Für das Plasmid, das die für humanes IL-2 kodierende Sequenz enthält, wurde von dem Vektor pWS2 ausgegangen: Das Plasmid pHβAPr-1 (Gunning et al, 1987) wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten. For the plasmid containing the DNA coding for human IL-2 sequence, was based on the vector PWS2: Plasmid pHβAPr-1 (Gunning et al, 1987) was cut with BamHI and EcoRI. Mittels Agarosegel- Reinigung wurde ein 2.5 kb Fragment isoliert, das das Ampicillin-Restistenzgen und den Replikationsursprung von pBR322 sowie das SV40-Polyadenylsierungssignal enthält. By agarose gel purification was isolated a 2.5 kb fragment containing the ampicillin resistance gene and the origin of replication of pBR322 and SV40 Polyadenylsierungssignal. Dieses Fragment wurde mit dem CMV- Promotor/Enhancer ligiert, das als ein 0.7 kb PCR- Fragment vom Vektor pAD-CMVI (beschrieben in der EP-A 393 438) amplifiziert und EcoRI/BamHI verdaut worden war. This fragment was ligated with the CMV promoter / enhancer, which as a 0.7 kb PCR fragment from the vector pAD-CMVi (described in EP-A 393 438) and cloned was digested EcoRI / BamHI. Das erhaltene Plasmid wurde pWS genannt. The plasmid obtained was called PWS. Die für humanes IL-2 kodierende cDNA wurde als PCR-Fragment vom Plasmid pIL2-50A (Taniguchi et al, 1983), der die für humanes IL-2 kodierende cDNA enthält, erhalten. The encoding human IL-2 cDNA was used as a PCR fragment from plasmid pIL2-50A (Taniguchi et al, 1983), which contains the sequence coding for human IL-2 cDNA was obtained. Das PCR-Fragment wurde in den mittels SalI/BamHI-Verdau geöffneten Vektor pWS ligiert und somit pWS2 erhalten. The PCR fragment was ligated in the opened by SalI / BamHI digestion and thus obtained vector pWS PWS2.

Eine IL-2-Kassette, enthaltend den CMV- Enhancer/Promotor, die für IL-2 kodierende Sequenz und die SV40-PolyA-Sequenz, wurde mittels PCR unter Vorlage von pWS2 erhalten. An IL-2 cassette, containing the CMV enhancer / promoter, the DNA coding for IL-2 sequence and the SV40 polyA sequence was obtained by PCR using template of PWS2. Das PCR-Produkt wurde einem Restriktionsenzymverdau mit EcoRI unterworfen und in die EcoRI/SmaI-Stelle des Plasmids pUC19 (Pharmacia) hineinkloniert. The PCR product was subjected to restriction enzyme digestion with EcoRI and cloned into the EcoRI / SmaI site of the plasmid pUC19 (Pharmacia) hineinkloniert. Das erhaltene Plasmid wurde pGShIL-2 genannt. The plasmid obtained was called pGShIL-2. Als Quelle für das Tetracyclin-Resistenz-Gen und Teile der "upstream" Region des β-Lactanase-Gens (Ampicillin-Resistenz-Gen) diente das Plasmid pBR327 (Soberon et al, 1980), das mit SspI und Aval verdaut worden war. As the source of the tetracycline resistance gene and parts of the "upstream" region of the β-Lactanase gene (ampicillin resistance) gene, the plasmid pBR327 was used (Soberon et al, 1980), which had been digested with SspI and Aval. Zusammen mit einem EcoRI/Aval-Adaptor wurde die isolierte tet-Sequenz in die EcoRI/SspI-Stelle von pGShIL-2 kloniert. Together with a EcoRI / Aval adapter, the isolated tet sequence was cloned into the EcoRI / SspI site of pGShIL-2. Die IL-2-Kassette des resultierenden Klons pGShIL-2tet/amp wurde sequenziert; The IL-2 cassette of the resulting clone pGShIL-2tet / amp was sequenced; daraufhin wurde die amp-Sequenz mit Eam11051 und SspI herausgeschnitten und das Plasmid religiert. then the amp sequence was cut out with Eam11051 and SspI and religated the plasmid. Das erhaltene Plasmid wurde mit pGShIL-2tet bezeichnet. The resulting plasmid was designated pGShIL-2tet.

b) DNA-Präparation b) DNA preparation

Die Plasmide wurden zunächst im Bakterienstamm E.coli DH5α in Gegenwart von 100 µg/ml Ampicillin (pCMVL) bzw. Tetracyclin (pGShIL-2tet) in LB-Medium gezüchtet. The plasmids were initially in the bacterial strain E. coli DH5a in the presence of 100 ug / ml ampicillin (pCMVL) or tetracycline (pGShIL-2tet) grown in LB medium. Die Übernachtkultur wurde zentrifugiert und daraus die DNA wie folgt präpariert: Die CsC1- Dichtegradientenzentrifugation wurde nach der von Cotten et al, 1993, beschriebenen Methode durchgeführt. The overnight culture was centrifuged and the resulting DNA prepared as follows: The CsC1- density gradient centrifugation was performed by the method described by Cotten et al, 1993, Method. Dazu wurde der Bakterienniederschlag von 1 l Kultur in 10 ml 20%iger (Gew./Vol.) Saccharose, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7.5 (Lösung 1) auf Eis 10 min lang inkubiert. For this purpose, the bacteria culture precipitate of 1 l in 10 ml of 20% (wt./vol.) Sucrose was 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7.5 (solution 1) and incubated on ice for 10 minutes. Anschließend wurden 2.2 ml Lysozym (10 mg/ml in Lösung 1) für weitere 10 min auf Eis beigegeben, dann wurden 5 ml 0.2 M EDTA, pH 7 hinzugefügt, die Probe 10 min auf Eis inkubiert und abschließend 10 ml 2%iges (Vol./Vol.) Triton X-114, 60 mM EDTA und 40 mM Tris, pH 7.5 beigegeben, gefolgt von 15 min Inkubation auf Eis. Subsequently, 2.2 ml of lysozyme (10 mg / ml in solution 1) for a further 10 min were added on ice, then 5 ml 0.2 M EDTA, pH 7 was added, the sample 10 min on ice, incubated and, finally, 10 ml of 2% (vol ./Vol.) Triton X-114, 60 mM EDTA and 40 mM Tris, pH 7.5 added, followed by 15 min incubation on ice. Dieses Lysat wurde dann 30 min zentrifugiert (Sorvall SS34, 17K) und dem Überstand (26 ml Anfangsvolumen) 28.5 g CsC1 und 400 µl Ethidiumbromid (10 µg/ml) beigegeben. This lysate was then centrifuged for 30 min (Sorvall SS34, 17K) and the supernatant (26 ml initial volume) is added to 28.5 g CsC1 and 400 ul of ethidium bromide (10 ug / ml). Dieses Material wurde über 18 h in einem Beckman VTi50-Rotor bei 49 000 rpm, 20°C zentrifugiert. This material was over 18 hours in a Beckman VTi50 rotor at 49 000 rpm, centrifuged 20 ° C. Die untere der beiden Ethidium-reichen Banden wurde gesammelt und nochmals, direkt in einem Beckman VTi65- Rotor, über 4 h bei 63 000 rpm und 20°C zentrifugiert. The lower of the two ethidium-rich bands was collected and again centrifuged directly in a Beckman VTi65- rotor for 4 h at 63 000 rpm and 20 ° C. Die Ethidium-reiche Bande wurde wieder geerntet, mit CsC1-gesättigtem Isopropanol extrahiert, bis die rosa Farbe verschwunden war, ausgiebig gegen TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4), gemischt mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5, dialysiert und mit 3 Volumina Ethanol bei -20°C gefällt. The ethidium-rich band was harvested again extracted with CsC1-saturated isopropanol, until the pink color had disappeared extensively against TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4), mixed with 1/10 volume of 3 M sodium acetate pH 5 , dialyzed and precipitated with 3 volumes of ethanol at -20 ° C. Der gewonnene DNA- Niederschlag wurde weiter behandelt mit RNase A, Proteinase K, Phenol/Chloroform und Chloroform, noch einmal gefällt und das endgültige DNA-Pellet in TE aufgenommen und mittels optischer Absorption quantitativ bestimmt, wobei von der Annahme ausgegangen wurde, daß 0.05 mg/ml DNA bei 260 nm eine Absorption von 1 aufweist. The DNA precipitate obtained was further treated with RNase A, proteinase K, phenol / chloroform and chloroform, again precipitated and added to the final DNA pellet was resuspended in TE, and quantitated by means of optical absorption, it was starting from the assumption that 0.05 mg / ml DNA at 260 nm has an absorption of Figure 1.

c) DNA-Reinigung von LPS c) DNA purification of LPS i) Triton X-114-Extraktion i) Triton X-114 extraction

Um ein homogenes Präparat des Detergens zu erhalten, wurde Triton X-114 (Sigma) drei 0°C/30°C- Temperaturzyklen, wie von Bordier, 1981, beschrieben, unterworfen. To obtain a homogeneous preparation of the detergent, Triton X-114 (Sigma) was three 0 ° C / 30 ° C temperature cycles as described by Bordier, 1981, subjected described. Die Extraktion der Lipopolysaccharide von der DNA-Probe wurde, in Abwandlung publizierter Methoden (Aida und Pabst, 1990; Manthorpe et al, 1993) wie folgt durchgeführt: Die DNA-Probe (0.5-1.5 mg/ml in 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 (TE)) wurde auf 0.3 M Natriumacetat (pH 7.5) gebracht. The extraction of the lipopolysaccharide from the DNA sample was published in modification methods (Aida and Pabst, 1990; Manthorpe et al, 1993) carried out as follows: The DNA sample (0.5-1.5 mg / ml in 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 (TE)) (in 0.3 M sodium acetate pH 7.5) was placed. Dann wurde 3 µl Triton X-114 pro 100 µl DNA-Lösung beigegeben, die Proben in einem Vortex kräftig gemischt und 10 min auf Eis inkubiert. Then, 3 .mu.l Triton X-114 per 100 .mu.l of DNA solution was added, the samples mixed vigorously in a vortex and incubated on ice for 10 min. Damit sich die beiden Phasen trennen können, wurden die Proben 5 min bei 30°C aufbewahrt, in einer vorgewärmten Eppendorf-Zentrifuge 2 min bei 2000 rpm zentrifugiert und die wässerige Phase in ein frisches Eppendorf-Röhrchen gegeben. Thus, the two phases can separate, the samples were kept for 5 min at 30 ° C, centrifuged in a preheated Eppendorf centrifuge for 2 min at 2000 rpm and, if the aqueous phase to a fresh eppendorf tube. Diese Extraktion wurde noch zweimal durchgeführt und die schließlich erhaltene wässerige Phase mit 0.6 Volumina Isopropanol bei Raumtemperatur gefällt, das Präzipitat mittels Zentrifugation gewonnen, zweimal mit 80% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet, in TE wieder aufgenommen und die Menge bestimmt. This extraction was further conducted twice, and the aqueous phase finally obtained was precipitated with 0.6 volumes of isopropanol at room temperature, the precipitate recovered by centrifugation, washed twice with 80% ethanol washed, air-dried, taken up in TE, and the amount. Dazu wurde die Probe mit RNase A, Proteinase K, Phenol/Chloroform und Chloroform behandelt, wieder gefällt und das endgültige DNA-Pellet in TE suspendiert und die Absorption bei 260 nm bestimmt, wobei von der Annahme ausgegangen wurde, daß eine Konzentration von 0.05 mg/ml DNA den Absorptionswert 1 hat. For this purpose the sample with RNase A, proteinase K, phenol / chloroform and chloroform was treated again precipitated and the final DNA pellet was suspended in TE and the absorbance at 260 nm was starting from the assumption that a concentration of 0.05 mg / ml DNA has the absorption value. 1 (Diese Methode wurde für die in den Beispielen einsetzte DNA verwendet.) (This method was used for which began in Examples DNA.)

ii) Polymyxin-Chromatographie ii) polymyxin chromatography

Ein Volumen Polymyxinharzschlamm (Affi-Prep-Polymyxin, Biorad), das dem Volumen der DNA-Probe entsprach, wurde kurz mit drei Volumina 0.1 N NaOH versetzt, anschließend wurde dreimal mit fünf Harzvolumina TE gewaschen. A volume Polymyxinharzschlamm (Affi-Prep Polymyxin, Biorad) which corresponded to the volume of the DNA sample was briefly mixed with three volumes of 0.1 N NaOH, and then was washed three times with five resin volumes of TE. Das pelletierte Harz wurde mit den DNA-Proben (in TE 0.8-1.2 mg/ml) wieder aufgenommen und die Mischung über Nacht bei 4°C gerührt. The pelleted resin was added in TE (0.8-1.2 mg / ml) again with the DNA sample and the mixture incubated overnight at 4 ° C stirring. Dann wurde die Probe auf eine mit 0.1 NaOH vorbehandelte Wegwerfsäule gegeben und mit TE gewaschen. Then, the sample was placed on a pre-treated with 0.1 NaOH disposable column, and washed with TE. Das Eluat wurde gesammelt, das Harz mit einem weiteren Volumen TE gewaschen und das Eluat mit der Waschflüssigkeit vereinigt. The eluate was collected, the resin was washed with a further volume of TE and pooled the eluate with the washing liquid. Die DNA dieser gepoolten Probe wurde mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5 und 2 Volumen Ethanol gefällt. The DNA of this pooled sample was precipitated with 1/10 volume of 3 M sodium acetate pH 5 and 2 volumes of ethanol. Die Weiterbehandlung des Präzipitats und die DNA-Bestimmung wurden durchgeführt, wie oben beschrieben. The further processing of the precipitate and the DNA determination were performed as described above. (Diese Methode wurde im Vorversuch verwendet.) (This method was used in the initial test.)

d) LPS-Präparat d) LPS-preparation

Es wurde ein kommerziell erhältliches LPS-Präparat aus Escherichia coli (0111:B4, Sigma) verwendet. There was a commercially available preparation LPS from Escherichia coli: used (0111 B4, Sigma). Das Präparat wurde zu 10 mg/ml in LPS-freiem Wasser gelöst und vor der Herstellung von Serienverdünnungen in LPS- freiem Wasser 5 min lang sonikiert (SONOREX-Bad, 360 W). The preparation was dissolved to 10 mg / ml in LPS-free water and prior to the preparation of serial dilutions in LPS-free water for 5 min sonicated (SONOREX bath, 360 W). Die endgültigen Verdünnungen wurden vor der Verwendung 5 min lang sonikiert. The final dilutions were sonicated minutes before use. 5

Die LPS-Assays wurden mit dem BioWhittaker-Assay durchgeführt (chromogener Limulus-Assay; Iwanaga, 1993), wobei festgestellt wurde, daß alle verwendeten Reagentien LPS-frei waren (< 0.1 Endotoxineinheiten/50 µl Lösung). The LPS assays were performed with the BioWhittaker assay was performed (Limulus chromogenic assay; Iwanaga, 1993), it was found that all the reagents used were LPS-free (<0.1 endotoxin units / 50 ul solution).

e) Adenovirus-Präparation e) adenovirus preparation

Das E4-defiziente Adenovirus 5, d11014 (Bridge und Ketner, 1989) wurde in der komplementierenden Zellinie W162 (Weinberg und Ketner, 1983) gezüchtet. The E4-deficient adenovirus 5, d11014 (Bridge and Ketner, 1989) was grown (Weinberg and Ketner, 1983) in the complementing cell line W162. Pellets von infizierten Zellen wurden zu 2 ml/2 × 10⁷ Zellen in 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert und drei Gefrier-/Auftauzyklen (flüssiger Stickstoff, 37°C) unterworfen. Pellets of infected cells were added to 2 ml / 2 × 10⁷ cells in 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) was suspended and subjected to three freeze / thaw cycles (liquid nitrogen, 37 ° C). Die Suspension wurde dann mit einem gleichen Volumen Freon, im Vortex gemischt und 10 min lang bei 3000 rpm (Heraeus Sepatech, 2705 Rotor) zentrifugiert. The suspension was then mixed with an equal volume of Freon, mixed in a vortex and for 10 minutes at 3000 rpm (Heraeus Sepatech 2705 rotor). Die wäßrige (obere) Phase wurde aufgehoben, und die Freonphase wurde mit 1/5 Volumen 20 mM HEPES, pH 7.4 im Vortex behandelt und nochmals zentrifugiert. The aqueous (upper) phase was removed and the freon was pH treated with 1/5 volume of 20 mM HEPES 7.4 in a vortex and centrifuged again. Die wäßrigen Phasen wurden vereinigt, in ein Beckman VTi50 Zentrifugenröhrchen (15 ml/Röhrchen) überführt und mit 15 ml 1.2 g/cm³ CsC1/20 mM HEPES, pH 7.4 und 7 ml 1.45 g/cm³ CsC1, 20 mM HEPES pH 7.4 unterschichtet. The aqueous phases were combined, in a Beckman VTi50 centrifuge tubes (15 ml / tube) was transferred with 15 ml 1.2 g / cm³ CsC1 / 20 mM HEPES, pH 7.4 and 7 ml underlayered 1:45 g / cc CsC1, 20 mM HEPES pH 7.4. Die Proben wurden 40 min lang bei 20°C in einem Beckman VTi50 Rotor bei 49 000 rpm zentrifugiert. The samples were centrifuged for 40 min at 20 ° C in a Beckman VTi50 rotor at 49 000 rpm. Die untere opaleszierende Bande von reifen Viruspartikeln bei 1.34 bis 1.35 g/cm³ (gemessen mittels Brechungsindex) und die obere Bande (unreife Teilchen bei 1.31 bis 1.32 g/cm³) wurden getrennt gesammelt und einer Gleichgewichtszentrifugation (mehr als 4 h) bei 63 000 rpm in einem VTi65 Rotor unterworfen. The lower opalescent band of mature viral particles at 1:34 to 1:35 g / cc (measured by refractive index) and the upper band (immature particles at 1:31 to 1:32 g / cc) were collected separately and equilibrium centrifugation (over 4 h) at 63 000 rpm subjecting in a VTi65 rotor. Die opaleszenten Virusbanden (entweder 1.31 g/cm³ unreife oder 1.34 g/cm³ reife) wurden geerntet. The opalescent viral bands (either 1.31 g / cc or immature 1:34 g / cc mature) were harvested. Die Biotinylierung der erhaltenen Viruspartikel mit N-hydroxysuccinimid-Biotin (Pierce), die Inaktivierung mit 8-Methoxypsoralen/UVA und die Reinigung mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Pharmacia PDIO-Säule, equilibriert mit HBS/40% Glyzerin wurden durchgeführt, wie in der WO 93/07 283 bzw. von Wagner et al, 1992, und Cotten et al, 1992, beschrieben. The biotinylation of the virus particles obtained with N-hydroxysuccinimide-biotin (Pierce), the inactivation with 8-methoxypsoralen / UVA and purification by gel filtration using a Pharmacia PDIO column equilibrated with HBS / 40% glycerol were performed as described in WO described 93/07 283 or by Wagner et al, 1992, and Cotten et al., 1992, Die Virusproben wurden quantitativ über die Proteinkonzentration bestimmt (Biorad Bradford Assay mit BSA als Standard) analysiert, wobei die Beziehung 1 mg/ml Protein = 3.4 × 10¹² Adenoviruspartikel/ml (Lemay et al, 1980) verwendet wurde. The virus samples were quantitatively analyzed on the protein concentration determined (Biorad Bradford assay with BSA as a standard), the relationship 10¹² adenovirus particles / ml (Lemay et al, 1980) was used 1 mg / ml protein = 3.4 x.

f) Transfektionskomplexe f) Transfection

Die modifizierten Adenoviruspartikel (8 µl, 1 × 10¹² Partikel/ml) wurden in 150 µl HBS verdünnt und mit 1 µg StrpL (Streptavidin-modifiziertes Polylysin, hergestellt wie in der WO 93/07 283 beschrieben) in 150 µl HBS 30 min bei Raumtemperatur gemischt. The modified adenovirus (8 uL, 1 × 10¹² particles / ml) were diluted in 150 .mu.l HBS with 1 .mu.g StrpL (streptavidin-modified polylysine, prepared as described in WO 93/07 283), in 150 .mu.l HBS for 30 minutes at room temperature mixed. Aliquots von 6 µg Plasmid- DNA wurden mit steigenden Mengen an LPS in 100 µl gemischt. Aliquots of 6 .mu.g of plasmid DNA were mixed with increasing amounts of LPS in 100 ul. Die DNA-Lösungen wurden daraufhin 30 min mit der Adenovirus/StrpL-Lösung bei Zimmertemperatur gemischt. The DNA solutions were then mixed for 30 minutes with the adenovirus / StrpL solution at room temperature. Abschließend wurde ein 100 µl Aliquot HBS, enthaltend 5 µg TfpL, hergestellt wie in der WO 93/07 283 beschrieben, jeder Probe beigegeben, gefolgt von 30 min bei Raumtemperatur. Finally, a 100 ul aliquot of HBS containing 5 .mu.g TfpL, prepared as described in WO 93/07 283, added to each sample, followed by 30 min at room temperature. Von den so erhaltenen 500 µl Transfektionsmedium wurde je 1/10 pro Vertiefung einer Zellkulturplatte, enthaltend 20 000 Zellen, verwendet. From the thus obtained 500 ul per transfection was 1/10 per well of a cell culture plate containing 20,000 cells are used.

g) Zellkulturen g) Cell Cultures i) Humanfibroblasten i) Human Fibroblasts

Nach der chirurgischen Entfernung wurden Hautbiopsien in 4°C DMEM, enthaltend 10% FCS, 2 mM Glutamin und Gentamycin, gegeben. After surgical removal, skin biopsies were fixed in 4 ° C DMEM containing 10% FCS, 2 mM glutamine and gentamycin. Die Biopsien wurden in einer Gewebekultureinrichtung ausgiebig mit Pinzette und chirurgischem Messer im laminaren Luftstrom in sterilen 6 cm Plastikschalen zerkleinert. The biopsies were minced in a tissue culture device using forceps and a surgical blade in a laminar air flow in sterile 6 cm plastic dishes. Dann wurden 3 ml DMEM, enthaltend 20% FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika beigegeben, und die Kultur in einen 37°C Brutschrank gegeben. Then, 3 ml of DMEM containing 20% ​​FCS, added to 2 mM glutamine and antibiotics, and, if the culture in a 37 ° C incubator. Nach 10 Tagen wurde das Medium durch DMEM, enthaltend 10% FCS, ausgetauscht. After 10 days, the medium was replaced with DMEM containing 10% FCS, replaced. Dann wurde das Medium weiter 2 × wöchentlich gewechselt. Then, the medium was changed further 2 times weekly. 4 Wochen nach Beginn der Kultur wurden die Zellen, die aus den Gewebsfragmenten herausgewachsen waren, trypsinisiert und für die Transfektion in neue Kulturschalen ausplattiert. 4 weeks after the start of culture, the cells that had grown out of the tissue fragments were trypsinized and plated for transfection into new culture dishes. Es wurden primäre Kulturen aus Passage 5-10 verwendet. There were used primary cultures from passage 5-10. Die Fibroblasten wurden transfiziert, wie von Wagner et al, 1992, beschrieben. The fibroblasts were transfected as described by Wagner et al., 1992,

ii) Humane Melanomzellen ii) Human melanoma cells

Primäre humane Melanomzellen wurden isoliert und in RPMI 1640-Medium (Gibco/BRL), ergänzt mit 100 IU/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 1% Natriumpyruvat und 10% hitzeinaktiviertem FCS, kultiviert. Primary human melanoma cells were isolated and cultured in RPMI 1640 medium (Gibco / BRL) supplemented with 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1% sodium pyruvate and 10% heat inactivated FCS.

iii) Humane Atemwegsepithelzellen iii) A human airway epithelial cells

Humane Atemwegsepithelzellen wurden, wie von Van Scott et al, 1986, beschrieben, aus Nasenpolypen isoliert. Human airway epithelial cells were prepared as described by Van Scott et al, 1986, isolated from nasal polyps. Die Zellen wurden auf Standardzellkulturplatten, überzogen mit humanem Plazentakollagen (Sigma, Kat. Nr. C 7521) in Bronchienepithelzell-Wachstumsmedium (BEGM, Promocell, Kat. Nr. C-2106) gezüchtet. The cells were grown on standard tissue culture plates coated with human placental collagen (Sigma, cat. No. C 7521) grown in Bronchienepithelzell growth medium (BEGM, PromoCell, cat. No. C-2106).

iv) Humane Nabelvenenendothelzellen iv) Human umbilical vein endothelial cells

Humane Nabelvenenendothelzellen (HUVECs) wurden bezogen von CellSystems (Kirklandt, Washington) und auf 0.1% Gelatine-überzogenen Zellkulturschalen gezüchtet. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were purchased bred by Cell Systems (Kirklandt, Washington) and 0.1% gelatin-coated cell culture dishes.

h) Expressionsmessung h) measuring expression i) Luciferase-Assay i) luciferase assay

Die Herstellung von Zellextrakten, die Standardisierung des Proteingehalts sowie die Bestimmung der Luciferaseaktivität wurden durchgeführt, wie von Zenke et al, 1990, Cotten et al, 1990, bzw. in der EP 388 758 beschrieben. The preparation of cell extracts, standardization of the protein content and determination of the luciferase activity were carried out as described by Zenke et al, 1990, Cotten et al, 1990, or in EP 388,758.

ii) IL-2 Assay ii) IL-2 Assay

Die Expression von interleukin-2 wurde mit Hilfe eines Bioassays bestimmt, wie von Karasuyama und Melchers, 1988, beschrieben. The expression of interleukin-2 was determined using a bioassay as described by Karasuyama and Melchers, 1988. Zusätzlich wurde die IL-2 Produktion unter Verwendung des IL-2 ELISA-Kits von Becton Dickinson (Katalog Nr. 30 032) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt. In addition, the IL-2 production using IL-2 ELISA kit from Becton Dickinson was (catalog no. 30032) following the manufacturer's protocol.

Vorversuch preliminary experiment Einfluß des Endotoxingehaltes der DNA auf die Expression von IL-2 in primären humanen Melanomzellen Influence of the endotoxin content of the DNA for the expression of IL-2 in primary human melanoma cells

Primäre humane Melanomzellen ( 2 × 10⁵ Zellen/6 cm Kulturschale) wurden mit 6 µg des nach verschiedenen Methoden gereinigten Plasmids, entsprechend den Angaben in Fig. 1, transfiziert. Primary human melanoma cells (2 x 10⁵ cells / 6 cm culture dish) were transfected as indicated in Fig. 1, with 6 ug of the purified plasmid by several methods. Der Endotoxingehalt der Plasmidpräparation vor der Reinigung ist in der Fig. jeweils als dunkel schraffierter Balken dargestellt. The endotoxin content of plasmid preparation before cleaning is always shown as a dark shaded bar in FIG.. Nach der Reinigung mittels Polymyxinharz oder Extraktion mit Triton X-114 enthielten alle Präparate weniger als 0.1 EU Lipopolysaccharid/6 µg DNA. After purification by Polymyxinharz or extraction with Triton X-114, all preparations contained less than 0.1 EU lipopolysaccharide / 6 .mu.g DNA. Der IL-2-Gehalt wurde mittels ELISA im Zellüberstand gemessen, die in Fig. 1 angegebenen Werte bedeuten Einheiten/10⁶ Zellen und 24 h. The IL-2 content was measured by ELISA in the cell supernatant, the values indicated in Fig. 1 denote units / 10⁶ cells and 24 h.

Beispiel 1 example 1 Verringerung der Toxizität von LPS bei der Transfektion von primären humanen Fibroblasten durch Polymyxin B Reducing the toxicity of LPS in the transfection of primary human fibroblasts by polymyxin B

Zunächst wurde die Toxizität von LPS beim Gentransfer mittels Adenovirus-unterstützter Rezeptor-vermittelter Endozytose in primäre Humanfibroblasten untersucht. First, the toxicity of LPS in gene transfer using adenovirus assisted receptor-mediated endocytosis was examined in primary human fibroblasts. Der Gehalt an LPS, bezogen auf 6 µg DNA, ist in Fig. 2 angegeben. The content of LPS, based on 6 .mu.g of DNA is indicated in Fig. 2. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die Luciferasemessung durchgeführt. 24 h after transfection, the cells were harvested and performed Luciferasemessung. Mit steigendem LPS-Gehalt der DNA sank die Genexpression um beinahe 2 Zehnerpotenzen ab. With increasing LPS content of the DNA gene expression plummeted by nearly two orders of magnitude. Die zerfetzte Morphologie der Zellen, die einem hohen LPS-Gehalt ausgesetzt waren, stand im Einklang mit den niedrigen Expressionswerten ( Fig. 2, obere Tafel). The shredded morphology of the cells that were exposed to a high LPS content was consistent with the low expression levels (Fig. 2, upper panel).

Als nächstes wurden die Zellen denselben DNA/Adenovirus/LPS-Komplexen in Gegenwart zunehmender Mengen Polymyxin B (Polymyxin B-Sulfat, Sigma, Kat. Nr. P 4932) ausgesetzt. Next, the cells were the same DNA / adenovirus / LPS complexes in the presence of increasing amounts of polymyxin B (Polymyxin B Sulfate, Sigma, cat. No. P 4932) exposed. Polymyxin war sowohl während als auch nach der Transfektion in den jeweils angegebenen Konzentrationen im Medium zugegen, dh daß das 3 h nach der Transfektion ausgetauschte frische Medium die jeweilige Konzentration an Polymyxin enthielt. Polymyxin was present both during and after the transfection in the specified concentrations in the medium, that is, that the 3 h post-transfection exchanged fresh medium containing the respective concentration of polymyxin. Eine typische antibiotische Konzentration von Polymyxin B ist 1000 Einheiten/ml. A typical concentration of antibiotic polymyxin B is 1000 units / ml. Bei einer spezifischen Aktivität von 7500 Einheiten/mg entspricht dies einer Konzentration von 133 µg/ml Polymyxin B. Es zeigte sich, daß in Gegenwart von 3, 10 und 30 µg/ml Polymyxin B kaum Unterschiede in der Expression auftreten. At a specific activity of 7500 units / mg, this corresponds to a concentration of 133 ug / ml polymyxin B. It was found that polymyxin B occur in the presence of 3, 10 and 30 ug / ml hardly any differences in the expression. Dies zeigt, daß das Antibiotikum von diesen Zellen toleriert wird. This shows that the antibiotic from these cells is tolerated. Polymyxin B erlaubt in allen drei verwendeten Konzentrationen erfolgreiche Transfektionen mit Virus/DNA-Komplexen, die LPS-Verunreinigungen aufweisen, wobei gegen 100 ng LPS/6 µg DNA vollständiger Schutz eintritt (vgl. die Proben 2, 5, 8 und II) und die Schutzwirkung gegen 1000 ng LPS/6 µg DNA beinahe vollständig ist (vgl. die Proben 3, 6, 9 und 12). Polymyxin B allowed in all three concentrations used successful transfection with virus / DNA complexes have the LPS impurities, against 100 ng LPS / 6 .mu.g DNA, complete protection occurring (see FIG. Samples 2, 5, 8 and II) and the protective effect against LPS 1000 ng / 6 .mu.g DNA is almost completely (see FIG. samples 3, 6, 9 and 12). (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von zwei Transfektionen.) (The values ​​shown in Fig. Are average values ​​of two transfections.)

Beispiel 2 example 2 Analyse der Wirkungsweise von Polymyxin bei Konzentrationen von 30 g/ml bis 0.03 µg/ml Analysis of the mode of action of polymyxin at concentrations of 30 g / ml to 0.03 ug / ml

Die minimale Konzentration von Polymyxin, die erforderlich ist, um die LPS-Toxizität zu neutralisieren, wurde mittels ähnlichen Titrationen wie in Beispiel 1 ermittelt. The minimum concentration of polymyxin, which is required to neutralize the LPS toxicity was determined by similar titration as in Example. 1 Es wurde festgestellt, daß eine vollständige Neutralisierung eines Gehalts von 100 oder 1000 ng LPS/6 µg DNA in den DNA-Komplexen mit 10 µg/ml Polymyxin B erhalten wird. It has been found that a complete neutralization of a content of 100 or 1000 ng LPS / 6 .mu.g DNA is obtained in the DNA complexes with 10 ug / ml of polymyxin B. Mit 3 bis 0.3 µg/ml Polymyxin B wurde nur eine teilweise Neutralisierung der Toxizität erhalten, bei niedrigeren Konzentrationen wurde eine nur sehr geringe Neutralisierung beobachtet. 3 to 0.3 g / ml polymyxin B only partial neutralization of the toxicity was obtained at lower concentrations only very low neutralization was observed. Aus einem Gehalt an 0.6 µg DNA in den Transfektionsansätzen ergibt sich, daß DNA-Komplexe, die LPS in Konzentrationen von 100 oder 1000 ng/6 µg DNA in einem Volumen von 0.25 ml 10 bis 100 ng LPS enthalten. For a content of 0.6 microgram of DNA in the transfection mixtures shows that DNA complexes, the LPS present in concentrations of 100 or 1000 ng / 6 .mu.g DNA in a volume of 0.25 ml of 10 to 100 ng LPS. Die durch Polymyxin bewirkte Neutralisierung begann sich bei 1 µg/ml und darunter zu verschlechtern. That caused by polymyxin neutralization began at 1 ug / ml and worsen under. Das entspricht einem Erfordernis von 250 ng Polymyxin zur Neutralisierung von 10 bis 100 ng LPS. This corresponds to a requirement of 250 ng polymyxin to neutralize from 10 to 100 ng LPS. Der Überschuß an Antibiotikum im Medium dürfte erforderlich sein, um ausreichende intrazelluläre Polymyxinkonzentrationen für die Neutralisierung zu gewährleisten. The excess of antibiotic in the medium is likely to be necessary to ensure sufficient intracellular Polymyxinkonzentrationen for neutralization. Das Ergebnis der Titration ist in Fig. 3 dargestellt: wo in der Figur angegeben, war Polymyxin B, und zwar sowohl während als auch nach den Transfektionen, anwesend. The result of the titration is shown in Fig. 3: where indicated in the figure, was polymyxin B, both during and after the transfections, present. Es wurden jeweils Doppeltransfektionen vorgenommen. In each case made Doppeltransfektionen. Die Luciferasewerte (Messung 24 h nach der Transfektion) sind für jede Polymyxinkonzentration ausgedrückt als Prozentsatz des Werts der Kontrollprobe. Luciferase (measured 24 h after transfection) are expressed for each Polymyxinkonzentration as a percentage of the value of the control sample.

Beispiel 3 example 3 Untersuchung der Wirkung von Polymyxin B während und nach der Transfektion Studying the effect of polymyxin B during and after transfection

In den vorangegangenen Beispielen war Polymyxin sowohl während der Transfektion als auch danach, bis zur Zellernte für den Luciferaseassay, im Kulturmedium enthalten. In the foregoing examples polymyxin was both during transfection and thereafter, until the cell harvesting for the luciferase assay, the culture medium included. Da aufgrund der Vorversuche angenommen wurde, daß das für die Toxizität von LPS verantwortliche Ereignis dessen mit dem Adenovirus gemeinsamer Eintritt in die Zelle ist, sollte die Schutzfunktion von Polymyxin B lediglich während des Kontaktes der Zellen mit den Transfektionskomplexen erforderlich sein. Since it was assumed due to the preliminary experiments that the person responsible for the toxicity of LPS event whose common with the adenovirus entry into the cell, the protective function of polymyxin B only during the contact of the cells with the transfection should be necessary. Um diese Annahme zu bestätigen, wurden primäre Fibroblastenkulturen den LPS-enthaltenden Transfektionskomplexen in Abwesenheit von Polymyxin (Proben 1-4) sowie in Gegenwart von Polymyxin B einerseits nur während der Transfektion (dazu wurden die Proben nach der Transfektion mit frischem Medium versetzt, das frei war von Polymyxin B; Proben 9-12) und andererseits zusätzlich nach der Inkubation (dazu wurden die Proben mit frischem Medium versetzt, das identische Mengen Polymyxin B enthielt wie das Transfektionsmedium; Proben 5-8) mit den Transfektionskomplexen ausgesetzt. To confirm this assumption, primary fibroblast cultures were the LPS-containing transfection complexes in the absence of polymyxin (samples 1-4) and in the presence of polymyxin B on the one hand (only during the transfection, the samples were added after transfection with fresh medium containing free was of polymyxin B; samples 9-12) and on the other hand, addition (after incubation, the samples were treated with fresh medium containing identical amounts of polymyxin B contained as the transfection, samples 5-8) exposed to the transfection. Die erhaltene Luciferaseexpression wurde 24 h nach der Transfektion gemessen. Luciferase expression was measured 24 h after transfection. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 4 dargestellt: Es zeigte sich, daß die Anwesenheit von 30 µg/ml Polymyxin B ausschließlich während der Transfektion nahezu dieselbe Schutzwirkung hat wie die fortgesetzte Gegenwart des Antibiotikums über den Zeitpunkt nach der Transfektion hinaus. The result of these experiments is shown in Fig. 4: It was found that the presence of 30 ug / ml of polymyxin B only during transfection has almost the same protective effect as the continued presence of the antibiotic on the time after transfection addition. (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von zwei Transfektionen.) (The values ​​shown in Fig. Are average values ​​of two transfections.)

Beispiel 4 example 4 Zusammenhang zwischen der Freisetzung von Lactatdehydrogenase und Transfektionseffizienz in Gegenwart von Polymyxin B Relationship between the release of lactate dehydrogenase and transfection in the presence of polymyxin B

In den in Beispiel 1 durchgeführten Versuchen wurde festgestellt, daß die Morphologie von Zellen, die mit LPS-enthaltenden DNA-Komplexen transfiziert worden sind, mit der Zelltoxizität im Einklang steht, die die Abnahme der Genexpression hervorruft. In the experiments carried out in Example 1 experiments it was found that the morphology of cells that have been transfected with LPS-containing DNA complexes, associated with the cell toxicity in line, which causes the decrease of gene expression. Da das zytoplasmatische Enzym Lactatdehydrogenase (LDH) ins umgebende Medium freigesetzt wird, wenn Zellen eine Nekrose oder Apoptose durchmachen, ist die einfache Messung der LDH-Aktivität im Zellmedium ein Indikator für die Zelltoxizität. Since the cytoplasmic enzyme lactate dehydrogenase (LDH) is released into the surrounding medium when cells undergo necrosis or apoptosis, the simple measurement of the LDH activity in the cell medium is an indicator for cell toxicity. Es wurde eine inverse Korrelation zwischen der Freisetzung von LDH ins Medium und dem erfolgreichen Transfer des Luciferasegens gefunden ( Fig. 5, Proben 1-4), wobei Zunahmen von LDH im Medium mit einem beträchtlichen Abfall der Luciferasegenexpression zusammenfielen. There was an inverse correlation between the release of LDH into the medium and the successful transfer of the luciferase gene found (Fig. 5, samples 1-4), wherein coincided increases of LDH in the medium with a considerable decrease of the luciferase gene. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Beispiele 1 und 2, blockierte die Gegenwart von 10 oder 30 µg/ml Polymyxin B (Polymyxin B war nur während der Transfektion im Medium enthalten) die durch LPS induzierte Abnahme des Gentransfers ( Fig. 5, Proben 5-12). In accordance with the results of Examples 1 and 2, the presence of blocked 10 or 30 ug / ml of polymyxin B (Polymyxin B was only during the transfection included in the medium), the LPS-induced loss of gene transfer (Fig. 5, samples 5- 12). In Übereinstimmung der Blockierung der Toxizität durch Polymyxin blockiert die Gegenwart von Polymyxin die durch LPS induzierte Freisetzung von LDH ( Fig. 5, Proben 5-12). In accordance blocking the toxicity of Polymyxin the presence of polymyxin (Fig. 5, samples 5-12) blocks the LPS-induced release of LDH. (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von zwei Transfektionen.) (The values ​​shown in Fig. Are average values ​​of two transfections.)

Der LDH-Assay wurde durchgeführt, indem Aliquots des Zellkulturmediums (5 bis 50 µl) zu den angegebenen Zeiten nach der Transfektion entfernt und mit 500 µl LD-L-Reagens (Sigma, Kat. Nr. 228-10) gemischt wurden. The LDH assay was carried out by adding aliquots of the cell culture medium (5 to 50 .mu.l) is removed at the indicated times after transfection and mixed with 500 .mu.l LD-L reagent (Sigma, cat. No. 228-10) were mixed. Die Proben wurden bei 37°C 45 min inkubiert und die Absorption bei 340 nm gegen einen LD-L-Blindwert gemessen. The samples were incubated at 37 ° C for 45 min and the absorbance at 340 nm against a LD-L-blank value measured.

Beispiel 5 example 5 Blockierung der durch natürliche LPS-Verunreinigungen von Plasmid-DNA bedingten Toxizität durch Polymyxin B Blocking the natural LPS caused by impurities of plasmid DNA toxicity by polymyxin B

In den vorangegangenen Beispielen wurde LPS-freie DNA, der absichtlich bekannte Mengen von definierten LPS- Präparaten zugesetzt worden waren, verwendet. In the preceding examples, was used LPS-free DNA, known amounts of the intentionally defined LPS preparations had been added. In diesem Beispiel wurde untersucht, ob die Toxizität von LPS- Verunreinigungen, wie sie in DNA-Präparaten typischerweise gefunden werden, durch Polymyxin B blockiert werden kann. In this example it was examined whether the toxicity of LPS impurities, as found in DNA preparations typically, can be blocked by polymyxin B. Zu diesem Zweck wurde LPS-freies Luciferaseplasmid mit einem Überschuß an DNA-Plasmid gemischt, das mittels Qiagen-Methode mit einem Plasmid- DNA-Harz (Diagen) ohne Behandlung zwecks Entfernung von LPS erhalten wurde. For this purpose, LPS-free Luciferaseplasmid was mixed with an excess of DNA-plasmid with a plasmid DNA-resin by Qiagen method (Qiagen) was obtained without treatment for removal of LPS. Diese DNA enthielt somit diejenige molekulare Form von LPS, wie sie in einer Plasmid-DNA- Präparation typischerweise gefunden wird. This DNA thus contained the one molecular form of LPS, such as is found in a plasmid DNA preparation typically. Die eingesetzte DNA-Probe enthielt ca. 16 ng LPS/6 µg DNA; The DNA sample used contained about 16 ng LPS / 6 .mu.g DNA; das entspricht 6.4 ng/ml während der Transfektion. which corresponds to 6.4 ng / ml during the transfection. Wie aus Fig. 6 ersichtlich ist, wurde mit diesem Präparat nur ein schwacher DNA-Transport erhalten ( Fig. 6, Probe 1), jedoch eine beinahe 10-fache Erhöhung erreicht, wenn während der Transfektion 3 µg/ml Polymyxin B zugegen waren ( Fig. 6, Probe 2). As shown in Fig. 6 it is seen was with this preparation only a faint DNA delivery was obtained (Fig. 6, sample 1), but reaches a nearly 10-fold increase when 3 ug / ml of polymyxin B were present during transfection ( Fig. 6, sample 2). Bei höheren Antibiotikumkonzentrationen wurde keine weitere Verbesserung beobachtet. At higher antibiotic concentrations no further improvement was observed. Die 3 µg/ml Polymyxin bedeuten einen beinahe 500-fachen Massenüberschuß gegenüber der erhaltenen LPS-Konzentration während der Transfektion. 3 ug / ml polymyxin mean a nearly 500-fold mass excess of the resulting LPS concentration during the transfection. (Die in der Fag. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von drei Transfektionen.) (The values ​​shown in Fag. Are average values ​​of three transfections.)

Beispiel 6 example 6 Blockierung der LPS-Toxizität in primären humanen Atemwegsepithelzellen durch Polymyxin B Blocking of LPS toxicity in primary human airway epithelial cells by polymyxin B

Primäre humane Atemwegsepithelzellen wurden mit LPS enthaltenden Transfektionskomplexen behandelt, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, und zwar einerseits in Abwesenheit, andererseits in Gegenwart von 10 µg/ml Polymyxin B während der Transfektion. Primary human airway epithelial cells were treated with LPS containing transfection complexes, as described in the previous examples, namely on the one hand in the absence, on the other hand, in the presence of 10 ug / ml of polymyxin B during transfection. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die Luciferaseexpression gemessen. 48 h after transfection, the cells were harvested and luciferase expression measured. Es zeigte sich, daß die Gegenwart von LPS in den DNA-Komplexen einen scharfen Abfall in der Genexpression hervorruft ( Fig. 7, Proben 1-4). It was found that the presence of LPS in the DNA complexes a sharp decrease in the gene expression causes (Fig. 7, samples 1-4). Die durch die verwendeten LPS- Konzentrationen hervorgerufene Toxizität kann durch Polymyxin B weitgehend blockiert werden ( Fig. 7, Proben 5-8). Caused by the used concentrations LPS toxicity may be largely blocked by polymyxin B (Fig. 7, samples 5-8). (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von drei Transfektionen.) (The values ​​shown in Fig. Are average values ​​of three transfections.)

Beispiel 7 example 7 Blockierung der durch LPS aus Gewebekulturreagentien verursachten Toxizität durch Polymyxin B in Nabelvenenendothelzellen Blocking the toxicity caused by LPS from Gewebekulturreagentien by polymyxin B in umbilical vein endothelial cells

Humane Nabelvenenendothelzellen wurden nach dem Standardprotokoll transfiziert. Human umbilical vein endothelial cells were transfected according to the standard protocol. Es zeigte sich, daß diese Zellen empfindlich auf die Anwesenheit von LPS in den Komplexen sind; It was found that these cells are sensitive to the presence of LPS in the complexes; vgl. see. Fig. 8, Probe 1, in der der Komplex kein LPS enthielt, mit den Proben 2, 3 und 4, in denen LPS in Mengen von 10, 100 und 1000 ng/6 µg DNA enthalten war. Fig. 8, sample 1, in which the complex contained no LPS, with the samples 2, 3 and 4, in which was contained in amounts of 10, 100 and 1000 ng / 6 .mu.g DNA LPS. Die Transfektionseffizienz war jedoch sogar bei Verwendung von LPS-freier DNA gering. However, the transfection efficiency was low even when using LPS-free DNA. Um festzustellen, daß dies durch eine Toxizität verursacht wird, die von den Gewebekulturreagentien stammt, wurden die in der Fig. angegebenen Polymyxin B-Mengen eingesetzt, die im Medium sowohl während als auch nach der Transfektion zugegen waren. In order to determine that this is caused by toxicity, which comes from the Gewebekulturreagentien, the polymyxin B-quantities indicated in FIG. Were used which were present both during and after the transfection in the medium. Es zeigte sich, daß die Gegenwart von 10 µg/ml Polymyxin B einen 5-6-fachen Anstieg in der Genexpression bewirkt (vgl. die Proben 1 und 5). It was found that the presence of 10 ug / ml polymyxin B caused a 5-6 fold increase in gene expression (see FIG. Samples 1 and 5). Höhere Konzentrationen von Polymyxin B waren weniger wirksam. Higher concentrations of polymyxin B were less effective.

Beispiel 8 example 8 Blockierung der durch LPS induzierten Toxizität durch Polymyxin E Blocking LPS induced toxicity by polymyxin E

Die in diesem Beispiel durchgeführten Versuche wurden prinzipiell genauso durchgeführt wie die in Beispiel 2 beschriebenen, mit dem Unterschied, daß statt Polymyxin B Polymyxin E (Colistin-Methansulfonat, Sigma, Kat. Nr. C 1511) verwendet wurde und daß dieses nur während der Transfektion zugegen war. The tests carried out in this example, tests were carried out in principle the same as those described in Example 2, with the difference that instead of polymyxin B polymyxin E (colistin methanesulfonate, Sigma, cat. No. C 1511) was used and that this only during transfection was present. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 9 dargestellt. The result of these experiments is shown in Fig. 9. Es zeigte sich, daß Polymyxin E die Fähigkeit hat, LPS in einer Menge von 100 ng/6 µg DNA in ähnlicher Weise wie Polymyxin B zu blockieren. It was found that polymyxin E has the ability to block LPS in an amount of 100 ng / 6 .mu.g DNA in a manner similar to polymyxin B. Im Gegensatz zu Polymyxin B konnte jedoch Polymyxin E eine LPS-Verunreinigung von 1000 ng/6 µg DNA nicht neutralisieren (die scheinbare Stimulierung bei 30 µg Polymyxin E/ml (Proben 4-6) ist eher auf eine deutliche Inhibierung der Kontrollprobe (30 µg Polymyxin E/ml, kein LPS) als auf eine Stimulierung der Probe, die 100 ng LPS/6 µg DNA enthielt, zurückzuführen). In contrast to Polymyxin B, however, polymyxin E 6 ug DNA could LPS contamination of 1000 ng / not neutralize (the apparent stimulation at 30 ug polymyxin E / ml (Samples 4-6) is more likely (to a significant inhibition of the control sample 30 ug polymyxin due U / ml, no LPS) as a stimulating the sample containing 100 ng LPS / 6 .mu.g DNA).

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Claims (12)

  1. 1. Verfahren zur Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere für die Aufnahme von Fremdmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß man die durch Lipopolysaccharid induzierte Toxizität, wie sie insbesondere bei der Aufnahme von Fremdmaterial auftritt, neutralisiert, indem man die Zellen mit einer Substanz behandelt, die Lipopolysaccharid bindet und dessen Toxizität für die Zellen blockiert. 1. A method of treating eukaryotic cells, especially for the inclusion of foreign material, characterized in that neutralization induced by lipopolysaccharide toxicity, as occurs in particular in the absorption of foreign material, by treating the cells with a substance that lipopolysaccharide binds and blocks its toxicity to the cells.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdmaterial eine Nukleinsäure, insbesondere DNA ist. 2. The method according to claim 1, characterized in that the foreign matter, a nucleic acid, DNA in particular.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit der Lipopolysaccharid bindenden Substanz behandelt, während man das Fremdmaterial in die Zelle einbringt. 3. The method of claim 1 or 2, characterized in that treating the cells with lipopolysaccharide-binding substance, while introducing the foreign matter into the cell.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipopolysaccharid bindende Substanz als Bestandteil eines Transfektions- oder Infektionsmediums auf die Zellen aufbringt. 4. The method according to claim 3, characterized in that the binding substance is applied as part of a lipopolysaccharide transfection or infection medium on the cells.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipopolysaccharid bindende Substanz Polymyxin B ist. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the lipopolysaccharide binding substance is polymyxin B.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipopolysaccharid bindende Substanz Polymyxin E ist. 6. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the lipopolysaccharide binding substance is polymyxin E.
  7. 7. Zusammensetzung für die Behandlung von Zellen für die Aufnahme von Fremdmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Lipopolysaccharid bindende Substanz enthält. 7. A composition for the treatment of cells for inclusion of foreign material, characterized in that it contains a lipopolysaccharide binding substance.
  8. 8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem das in die Zelle aufzunehmende Fremdmaterial sowie die Komponenten enthält, die die Aufnahme des Fremdmaterials in die Zellen bewirken. 8. The composition according to claim 7, characterized in that it further comprises the male into the cell foreign material as well as the components that cause uptake of the foreign material into the cells.
  9. 9. Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdmaterial DNA ist. 9. The composition according to claim 7 or 8, characterized in that the foreign matter is DNA.
  10. 10. Zusammensetzung nach Anspruch 7 bis 9 in Form eines Arzneimittels. 10. The composition of claim 7 to 9 in the form of a medicament.
  11. 11. Zusammensetzung nach Anspruch 7 bis 9 in Form eines Zellkulturmediums. 11. The composition of claim 7 to 9 in the form of a cell culture medium.
  12. 12. Verwendung von Lipopolysaccharid bindenden Substanzen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Anwendung vor und/oder gleichzeitig mit und/oder nach der Behandlung von menschlichen oder tierischen Zellen durch Transfektion oder Infektion mit einer Nukleinsäure, insbesondere DNA. 12. The use of lipopolysaccharide binding substances for the preparation of medicaments for application before and / or simultaneously with and / or after the treatment of human or animal cells by transfection or infection with a nucleic acid, especially DNA.
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