DE4141178A1 - New nucleic acid sequencing method - using one labelled nucleotide at one time in cycles comprising elongation, wash, label detection and removal of the label, then repeating - Google Patents

New nucleic acid sequencing method - using one labelled nucleotide at one time in cycles comprising elongation, wash, label detection and removal of the label, then repeating

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DE4141178A1
DE4141178A1 DE4141178A DE4141178A DE4141178A1 DE 4141178 A1 DE4141178 A1 DE 4141178A1 DE 4141178 A DE4141178 A DE 4141178A DE 4141178 A DE4141178 A DE 4141178A DE 4141178 A1 DE4141178 A1 DE 4141178A1
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EUROPAEISCHES LABORATORIUM fur MOLEKULARBIOLOGIE (EMBL) 6900 HEIDELBERG DE
EUROP LAB MOLEKULARBIOLOG
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    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA

Abstract

Claimed is a nucleic acid (NA) sequencing method in which a double strand of an at least partially single stranded template NA is synthesised starting from a double stranded NA piece or a primer by (i) incubation of the NA with a DNA elongation mixt. including a polymerase and one of the four nucleotides which is labelled, (ii) sepg. the NA from the elongation mixt., (iii) detection of any labelled nucleotide insertions, (iv) removal of the label if there had been an insertion, and repeating (i)-(iv) for all four nucleotides separately. Pref., the NA is anchored to a fixed phase such as biotin/avidin. USE/ADVANTAGE - Very long NAs and small amts. of NAs can be detected with a high accuracy since each DNA mol. contributes to the labelling. The limited capacity of gel matrixes is overcome so that any length of NA can be sequenced. Even if a wrong nucleotide had been incorporated the wrong signal is removed so that it does not influence further sequencing.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren. The invention relates to a method for sequencing nucleic acids.

Sequenzierungen von Nukleinsäuren zählen heutzutage in bio chemischen Laboratorien zu den täglichen Routineaufgaben. Sequencing of nucleic acids are nowadays in organic chemistry laboratories to the daily routine tasks. Dabei werden Sequenzierungen normalerweise nach einer der beiden Standardsequenzierungstechniken durchgeführt, nämlich entweder der chemischen Abbaumethode nach Maxam-Gilbert, oder aber der enzymatischen Komplementärstrangsynthese-Methode nach Sanger. In this sequencing are normally carried out by one of two standard sequencing techniques, namely either the chemical degradation method of Maxam-Gilbert, or the enzymatic complementary strand synthesis method according to Sanger. Gegenwärtig bekannte automatisierte Sequen zierungsmethoden nach der Sanger-Methode verwenden für die Markierung entweder endmarkierte Primer oder aber markierte Terminator-ddNTPs. Currently known automated Sequen zierungsmethoden by the Sanger method to use for the label, either end-labeled primers or labeled terminator ddNTPs. Bei den Standardsequenzierungstechniken werden die markierten Fragmente auf einem nach der Größe trennenden Medium, z. In the standard sequencing techniques, the labeled fragments are separated on a separating medium on the size of such. B. einem Polyacrylamidgel, aufgetrennt und über die Markierung bestimmt. As a polyacrylamide gel, and determined by the marker. Markierungen sind hierbei radioaktive Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen etc.. Die Trennkapazität der Gelmatrix limitiert hierbei die Auflösung und die Länge der DNA-Sequenz, welche bestimmt werden kann. Markings are in this case of radioactive labels, fluorescent labels etc .. The separation capacity of the gel matrix in this case limits the resolution and the length of DNA sequence that can be determined.

Dem sind mit den bisher bekannten Systemen eindeutig Grenzen gesetzt. The are set with the previously known systems clearly limits. Da eben Sequenzierungen jedoch so häufig durchge führt werden, ist es auf alle Fälle wünschenswert, Verbesse rungen gegenüber den bekannten Methoden zu ermöglichen. Since just sequencing but so often leads Runaway be, it is desirable in any case, IMPROVE balances due from the known methods allow.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfah ren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, bei dem auch sehr lange Nukleinsäuresequenzen bestimmt werden können und bei dem auch bereits sehr kleine Mengen an Nu kleinsäure zu eindeutigen Ergebnissen führen. Object of the present invention, therefore, a procedural reindeer for sequencing nucleic acids provide, at the very long nucleic acid sequences can be determined and the already very small amounts of nucleic acid lead to clear results.

Gelöst wird diese Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfah ren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, bei dem man zu einer zu sequenzierenden, zumindest teilweise einzelsträngigen Nukleinsäure als Template-Strang mit Hilfe einer geeigneten Polymerase und allen vier Nukleotiden, ausgehend von einem Primer oder einem doppelsträngigen Teilstück, Schritt für Schritt einen Komplementärstrang synthetisiert, wobei man markierte Nukleotide verwendet, und welches folgende Schritte umfaßt: This object is achieved by the inventive procedural ren for sequencing nucleic acids, in which to be sequenced to a, at least partially single-stranded nucleic acid as a template strand using a suitable polymerase and all four nucleotides, starting from a primer or a double-stranded portion, step synthesized by step a complementary strand, using labeled nucleotides, and comprising the steps of:

  • (1) Inkubieren der mit dem Primer versehenen oder teilweise doppelsträngigen Nukleinsäure mit einer Inkubationsmi schung, bestehend aus einer Polymerase, einer der vier Nukleotidarten in markierter Form und anderen für die Kettenpolymerisation benötigten Substanzen, wobei ein markiertes Nukleotid in den wachsenden Komplementär strang eingebaut wird in dem Fall, daß das nächste auf dem Template-Strang vorhandene Nukleotid zu dem verwen deten markierten Nukleotid komplementär ist, (1) incubating the provided with the primer or partially double-stranded nucleic acid with a Inkubationsmi research consisting of a polymerase, one of the four Nukleotidarten in labeled form and other substances required for the chain polymerization, wherein a labeled nucleotide into the growing complementary is incorporated continuously in the case that the next present on the template strand nucleotide USAGE to the Deten labeled nucleotide is complementary,
  • (2) Trennen der gegebenenfalls um ein Nukleotid verlängerten Nukleinsäure von der Inkubationsmischung von Schritt ( 1 ) und Durchführung eines oder mehrerer Waschschritte in an sich bekannter Weise, (2) separating the possibly extended by one nucleotide nucleic acid from the incubation mixture of step (1) and performing one or more wash steps in a known manner,
  • (3) Bestimmen des Einbaus eines Nukleotids anhand seiner Markierung, und (3) determining incorporation of a nucleotide by its marking, and
  • (4) falls der Einbau eines markierten Nukleotids erfolgt ist, Entfernen der Markierung, (4) if the incorporation of a labeled nucleotide is done, remove the marker,

wobei die Schritte (1) bis (4) jeweils cyclisch für alle vier Nukleotidarten durchgeführt werden. wherein steps (1) to (4) are each cyclic performed for all four Nukleotidarten.

Der ganz neue Ansatz, welcher zum erfindungsgemäßen Verfahren geführt hat, liegt darin, daß hier für die Komplementär strangbildung nur eine Art von Nukleotid und zwar in markier ter Form angeboten wird. The whole new approach, which has led to the present process is that here for the complementary strand formation only one kind of nucleotide, and is indeed offered in marking ter shape. Ist hier also die nächste auf dem Templatestrang vorliegende Base komplementär zu dem in der Inkubationsmischung vorhandenen markierten Nukleotid, erfolgt der Einbau des Nukleotids mitsamt seiner Markierung durch die Polymerase. so here's the next on the template strand base present complementary labeled to the present in the incubation mixture nucleotide, the incorporation of the nucleotide takes place together with its label by the polymerase. Im Rahmen der Erfindung wird als Polymerase eine solche eingesetzt, welche fähig ist, das markierte Nukleotid in den wachsenden Komplementärstrang einzubauen. In the present invention, such is used as a polymerase which is capable to incorporate the labeled nucleotide into the growing complementary strand. Abhängig von der Art der zu bestimmenden Nukleinsäure können hier also die bekannten Polymerasen, wie DNA-Polymerase, z. Depending on the type of nucleic acid to be determined so you will known polymerases, such as DNA polymerase, eg. B. T7 DNA-Poly merase, verwendet werden. B. T7 DNA poly merase, be used. Als zu bestimmende Nukleinsäuren sind nicht nur DNA-Fragmente, sondern auch RNAs geeignet. As the subject nucleic acids not only DNA fragments, but also RNAs are suitable. Für den Fall, daß nun also ein markiertes Nukleotid eingebaut wird, wird dies über die Markierung festgestellt und damit der Rückschluß auf die komplementäre Base im Templatestrang ermöglicht. In the event that now thus a labeled nucleotide is incorporated, this is detected via the label and therefore the return path allows the complementary base in the template strand.

Ist die Base auf dem Templatestrang nicht komplementär zu dem angebotenen markierten Nukleotid, erfolgt kein Einbau und es wird kein Markierungssignal erhalten. Is the base on the template strand not complementary to the labeled nucleotide offered, will be no installation and is not obtained mark signal.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird weiterhin durch die nach folgende Entfernung der Markierung für den Fall, bei dem der Einbau eines markierten Nukleotids stattgefunden hat, gekenn zeichnet. The inventive method is characterized by further labeled in the following by removal of the marker in the case in which the incorporation of a labeled nucleotide has occurred. Mit "Entfernung der Markierung" ist im Rahmen der Erfindung gemeint, daß die Nukleinsäure in einer Weise behan delt wird, daß das Markierungssignal verschwindet. By "removal of the label" is meant in the context of the invention that the nucleic acid is behan punched in such a way that the marker signal disappears. Dies be deutet jedoch nicht, daß chemisch eine Abspaltung des mar kierenden Molekülteils stattfinden muß, es ist ua auch eine Bleichung mit einem starken Laser im Fall einer Fluoreszenz markierung denkbar (siehe z. BB Scalettar et al., Biophys. J. 53, 215 (1988) oder Mathies, RA Stryer, L., Single- Molecule Fluorescence Detection: A Feasibility Study using Phycoerythrin. Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, S. 129-140 (1986) Alan R. Liss, Inc.). This, however, be not indicated that chemical cleavage of the mar kierenden part of the molecule has to take place, it is, inter alia, also a bleaching with a strong laser in the case of a fluorescent marker feasible (see, for example. BB Scalettar et al., Biophys. J. 53, 215 (1988) or Mathies, RA Stryer, L., single Molecule Fluorescence Detection. A feasibility study using phycoerythrin Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, pp 129-140 (1986) Alan R. Liss, Inc.). Es ist in jedem Fall aber unerläßlich, daß während des Schritts (4) durch die Entfernung der Markierung das markierte Nukleotid nicht chemisch so modifiziert wird, daß die Anpolymerisation des nächsten zum Templatestrang komplementären Nukleotids verhindert wird. However, it is essential in each case that the labeled nucleotide is not chemically modified so during the step (4) by removal of the label, that the incipient polymerization of the next complementary to the template strand nucleotide is prevented.

Wird im erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise bei der Bestimmung einer DNA-Sequenz als nächste Base nach dem Primer oder partiellen Doppelstrang markiertes dATP eingebaut, er gibt sich aufgrund des Markierungssignals, welches von dem Kontrollsignal der DNA ohne Markierung abweicht, für den Templatestrang an dieser Position, daß die Base T vorhanden ist. If in the inventive method for example in the determination of a DNA sequence labeled as the next base after the primer or partial double strand dATP incorporated, it is due to the marker signal, which differs from the control signal of the DNA without marking, for the template strand at this position, that the base T is present. Sind auf dem Templatestrang mehrere gleiche Basen, hier also Tymidin, vorhanden, werden im Komplementärstrang ent sprechend viele Adenosinmoleküle eingebaut, wodurch sich ein entsprechend stärkeres Markierungssignal ergibt. Are on the template strand several identical bases, so here thymidine, present, many adenosine molecules are incorporated in the complementary strand accordingly, which results in a correspondingly stronger marker signal.

Derselbe Schritt, der beispielsweise für das markierte Nu kleotid Adenosin in der Inkubationsmischung von Schritt (1) beschrieben wurde, wird aufeinanderfolgend cyclisch für alle Nukleotidarten durchgeführt. The same step that has been described, for example, the labeled Nu kleotid adenosine in the incubation mixture of step (1) is sequentially performed for all cyclic Nukleotidarten. So wird für jede Base auf dem Templatestrang letztendlich das komplementäre markierte Nu kleotid angeboten, in die Kette eingebaut, wobei aufgrund der Entfernung der Markierung nach jedem entsprechenden Einbau nur jeweils das letzte eingebaute markierte Nukleotid ein Signal erzeugt. Thus, ultimately offered kleotid the complementary labeled Nu for each base on the template strand, incorporated into the chain wherein a signal generated due to the removal of the marker after each respective mounting in each case only the last built-labeled nucleotide. Aus diesem Grund ist das Markierungssignal nicht akkumulativ und die Genauigkeit des Verfahrens sehr groß. For this reason, the marker signal is not accumulative and the accuracy of the method is very large.

Fig. 1 zeigt mit Hilfe eines Flußdiagramms schematisch den Ablauf des Verfahrens. Fig. 1 shows with the aid of a flow chart diagram of the course of the process.

Im Rahmen der Erfindung ist es bevorzugt, eine einzelsträngi ge Nucleinsäure zur Sequenzierung zu verwenden und in 5′-3′- Richtung vor die zu sequenzierende Sequenz ein Oligonukleotid als Primer anzuhybridisieren. In the present invention, it is preferable to use a einzelsträngi ge nucleic acid for sequencing and anzuhybridisieren in 5'-3 'direction in front of the sequence to be sequenced, an oligonucleotide as a primer.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die zu sequenzierende Nukleinsäure vor Schritt (1) an eine feste Phase gebunden. In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid to be sequenced prior to step (1) is bound to a solid phase. Dies ermöglicht es, insbesondere in automa tisierten Systemen, die Nukleinsäure leicht in die für die verschiedenen Schritte benötigten Lösungen und Mischungen einzutauchen und auch von diesen Lösungen leicht wieder zu trennen. This makes it possible, particularly in automatic tisierten systems easily immerse the nucleic acid required for the various steps solutions and mixtures and easy to separate by these solutions again.

Es ist dabei wichtig, daß die feste Phase keinen oder nur wenig Background für das Markierungssignal abgibt, z. It is important here that the solid phase emits little or no background for the flag signal, for. B. muß, falls Fluoreszenz als Markierung verwendet wird, die feste Phase aus einem Material bestehen, das nicht im selben Wel lenlängenemissionsbereich fluoresziert wie die Fluoreszenz markierung der verwendeten Nukleotide. B. must, if fluorescence is used as the label, the solid phase composed of a material that does not fluoresce in the same Wel lenlängenemissionsbereich as the fluorescent labeling of the nucleotides used.

Die Verankerung der Nukleinsäure an der festen Phase kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen, vorzugsweise er folgt die Verankerung über ein spezifisches Bindepaar, dessen einer Partner mit der festen Phase verbunden ist und dessen anderer Partner an die Nukleinsäure gebunden ist. The anchoring of the nucleic acid to the solid phase can be effected by methods known per se, preferably it follows the anchoring via a specific binding pair one partner of which is linked to the solid phase and the other partner is bound to the nucleic acid. Besonders bevorzugt wird hier als spezifisches Bindepaar im Rahmen der Erfindung das System Biotin/Avidin oder Biotin/Streptavidin verwendet, wobei wiederum vorzugsweise Avidin bzw. Streptavi din an die feste Phase nach an sich bekannten Methoden gebun den ist und die Nukleinsäure durch Biotin modifiziert ist. Particular preference is given here as a specific binding pair in the present invention, the system uses biotin / avidin or biotin / streptavidin, again preferably avidin or streptavidin to the solid phase by known methods din TIALLY to and the nucleic acid is modified by biotin.

Als feste Phase sind alle Materialien geeignet, die inert gegenüber den Substanzen in den verwendeten Lösungen sind, eine Fixierung der Nukleinsäure erlauben und, wie oben er wähnt, nicht mit der Markierung differieren. As the solid phase, all materials are suitable which are inert to the substances in the solutions used, allow a fixation of the nucleic acid and, as above, he imagines not differ with the marking. Als bevorzugte Beispiele können hier Glas, eine Polymermembran oder Polymer- oder Glaskügelchen, sogenannte beads, genannt werden. As preferred examples you will glass, a polymer membrane or polymer or glass beads, are so-called beads, called.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man anstelle von Nukleinsäuren in an eine Festphase fixierter Form ein Durchflußsystem für die Schritte (1) bis (4), bei dem die Nukleinsäure in Lösung bleibt und mit Hilfe von Filtern und/oder Kapillaren von den jeweils verwendeten anderen Substanzen getrennt wird. In a further preferred embodiment of the invention is used instead of nucleic acids in fixed to a solid phase form a continuous flow for the steps (1) to (4), wherein the nucleic acid remains in solution and by means of filters and / or capillaries of the respective used and other substances being separated.

Als Markierung in den Nukleotiden wird im Rahmen der Erfin dung vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung verwendet. As a marker in nucleotides is under the dung OF INVENTION preferably a fluorescent label used. Hier bei können insbesondere Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden, wie sie in der deutschen Patentanmeldung P 41 25 745 beschrieben sind. Here with fluorescent labels can be used, in particular, as described in the German patent application P 41 25 745th Auch die sogenannte "time resolved fluorescence" kann vorteilhaft als Markierung verwendet wer den. The so-called "time resolved fluorescence" can advantageously as a marker who uses the.

Im Rahmen der Erfindung werden als Nukleotide Deoxyribonu kleotide verwendet. In the context of the invention are used as nucleotides Deoxyribonu kleotide. In einer weiteren bevorzugten Ausgestal tung der Erfindung können jedoch auch Dideoxyribonukleotide oder sogenannte "gefangene" (caged)" Nukleotide (sz B. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Richard P. Haugland, 1989, Molecular Probes, Inc., Eugene, USA oder Matthews and Kricka, Analyt.Biochem. 169, 1 (1988)) verwendet werden. Auch ein Nukleotid erscheint geeignet, bei dem an die 3′OH-Gruppe der Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist (Krayevsky A., BBA, 1986, 868, S. 136). Hieraus ergibt sich, daß jeweils nur ein Dideoxyribonukleotid o. ä. eingebaut wer den kann, da die Polymerase durch diese sogenannten Termina toren keine Möglichkeit mehr hat, die Kette weiter zu verlän gern, auch wenn das der nächsten Base auf dem Templatestrang entsprechende Nukleotid vorhanden ist. Dies bedeutet, daß auch wenn gleiche Basen mehrfach auf dem Templatestrang nach einander vorkommen, jeweils nur in einem Inkubationsschritt ein Nukleotid eingebaut wird. Dies kann zur Genauigkeit In a further preferred Ausgestal the invention processing but can also Dideoxyribonukleotide or so-called "captive" (caged) "nucleotides (see, eg, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Richard P. Haugland, 1989, Molecular Probes, Inc., Eugene, United States or Matthews and Kricka, Analyt. 169, 1 (1988)) may be used. also, a nucleotide appears to be suitable, in which coupled to the 3'OH-group of the fluorescent dye (Krayevsky A., BBA, 1986, 868, S . 136). it follows that only one Dideoxyribonukleotid o. ä. installed who to, since the polymerase factors by these so-called Termina has no way the chain further longer side like, even if the next base on the template strand corresponding nucleotide is present. This means that even if the same bases appear more than once on the template strand to another, only in an incubation step, a nucleotide is incorporated. This can lead to accuracy der Methode beitragen. contribute to the method. Nach der Bestimmung der Markierung wird das Dideoxynukleotid dann in ein "dNTP-ähnliches polymerisa tionsverlängerbares Nukleotid" überführt. After the determination of the label, the dideoxynucleotide is then transferred to a "dNTP similar polymerisation tionsverlängerbares nucleotide". Die Termination der Komplementärstrangsynthese wird dadurch aufgehoben und der nächste Cyclus der Schritte (1) bis (4) kann erfolgen. The termination of the complementary strand synthesis is thereby canceled and the next cycle of steps (1) to (4) can take place. Es wird jedoch durch die Verwendung von Dideoxyribonukleotiden auch ein nochmals vereinfachtes Verfahren ermöglicht, bei dem alle vier Nukleotidarten als Dideoxyribonukleotide eingesetzt werden, wobei jedoch die vier verschiedenen Dideoxys jeweils auch verschiedene Fluoreszenzmarkierungen aufweisen. However, it is by the use of Dideoxyribonukleotiden a further simplified process allows, in which all four Nukleotidarten be used as Dideoxyribonukleotide, except that four different Dideoxys each also have different fluorescent labels. Welches der Dideoxynukleotide dann tatsächlich in den wachsenden Komplementärstrang eingebaut wurde, kann in Schritt (3) des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand der vorhandenen Markie rung festgestellt werden. Which of dideoxynucleotides was actually incorporated into the growing complementary strand, in step (3) of the process according to the invention can be determined on the basis of existing Markie tion. Diese bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bedeutet daher noch eine wesentliche Arbeitserleichterung und Beschleunigung des Se quenzierungsverfahrens. This preferred embodiment of the inventive method is therefore still represents a significant workload and accelerate the Se quenzierungsverfahrens.

Im Rahmen der Erfindung ist es bevorzugt, die Nukleinsäure vor der Sequenzierung zu denaturieren. In the present invention, it is preferred to denature the nucleic acid prior to sequencing. Des weiteren ist es bevorzugt, jeweils nach Schritt (3) oder (4) mit einem dem verwendeten markierten Nukleotid von Schritt (1) entsprechen den nicht markierten Nukleotid eventuell vorhandene Lücken im Komplementärstrang auf zufüllen. Furthermore, it is preferred in each case after step (3) or (4) with a labeled nucleotide that used in step (1) correspond to the non-labeled nucleotide may be present in the gaps on complementary strand zufüllen. Auch diese Maßnahme soll die Genauigkeit der Methode noch weiter erhöhen. Also this measure is to further increase the accuracy of the method. Da ja natürlich im erfindungsgemäßen Verfahren nicht nur ein Molekül DNA bestimmt wird, sondern derer viele für die Bestimmung und die Erzeugung eines detektierbaren Signals nötig sind, kann es auch vorkommen, daß in manchem Strang der richtige Einbau eines Nukleotids fälschlicherweise unterbleibt. Since of course not only a molecule of DNA is determined in the present process, but many of those are necessary for the determination and the generation of a detectable signal, it can also happen that in some strand of the correct installation of a nucleotide omitted by mistake. Dann könnte auch in der Folge das wiederum nächste Nukleotid nicht einge baut werden, diese Nukleinsäuren würden also für die weitere Signalgebung ausfallen. Then the next turn nucleotide could not subsequently be built, these nucleic acids would therefore fail for further signaling. Mit einem nicht markierten Nukleotid werden daher eventuelle Fehlstellen nochmals ausgefüllt, so daß für alle Nukleinsäuren gleiche Ausgangsbedingungen für den nächsten Zyklus der Schritte (1) bis (4) mit dem nächsten Nukleotid gegeben sind. Therefore, with a non-labeled nucleotide any voids are filled again, so that the same for all the nucleic acids starting conditions for the next cycle of steps (1) to (4) are given to the next nucleotide.

Bei Verwendung einer Festphasengebundenen Nukleinsäure zur Sequenzierung ist es auch möglich, mehrere und zwar sehr viele Nukleinsäuren gleichzeitig zu bestimmen. When using a solid phase bound nucleic acid sequencing, it is also possible to determine more specifically many nucleic acids simultaneously. Hierzu werden auf eine feste Phase in räumlicher Trennung die zu sequenzie renden Nukleinsäuren verankert und diese gleichzeitig mit den verschiedenen Inkubationsmischungen und Lösungen behandelt. For this purpose, the nucleic acids to sequenzie leaders be anchored to a solid phase in spatially separated and treated them simultaneously with the various incubation mixtures and solutions. Dabei kann man im verkleinerten Maßstab eine Art Mikrostruk tur herstellen und auf einem solchen "DNA-Chip" im Mikromaß stab (siehe Fig. 2) Hunderte bis Tausende von DNA-Proben gleichzeitig sequenzieren. It can be produced in a reduced scale a kind of micro structure and structural bar on such a "DNA chip" in Mikromaß (see Fig. 2) to sequence hundreds to thousands of DNA samples simultaneously. Die DNA kann dabei durch eine Art automatisierte und computergesteuerte Zellenmikroinjektion auf der festen Phase verankert werden. The DNA can then be anchored by a kind of automated and computer-controlled cell microinjection on the solid phase. Auch hier sind jedoch alle anderen an sich bekannten Verankerungsarten möglich. Again, however, all other are possible in a conventional anchor types. Des weiteren kann die Nukleinsäure auch am Boden einer Mikroti terplatte verankert werden und die Lösungen und Inkubations mischungen in die Vertiefungen eingebracht und wieder entfernt werden. Furthermore, the nucleic acid also the bottom of a microtiter terplatte be anchored and the incubation mixtures and solutions in the wells introduced and removed again.

Wie bereits vorher erwähnt, ist es im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugt, die Sequenzierung in einem Automaten durchzuführen. As previously mentioned, it is particularly preferred in the invention to carry out the sequencing in a vending machine. Dabei kann zur Bestimmung der Markierung ins besondere eine Charge Coupled Device (CCD) Kamera verwendet werden. It can be used for the determination of the label in particular a Charge Coupled Device (CCD) camera.

Das erfindungsgemäße Verfahren, welches eine gänzlich neue Technik zur Sequenzierung von DNA darstellt, ohne die Notwen digkeit der Auftrennung auf Agarose- oder Polyacrylamidgelen stellt eine schnelle und äußerst genaue Möglichkeit dar, Nukleinsäuren zu sequenzieren. The inventive method, which is an entirely new technology for sequencing DNA, without the Notwen speed separation on agarose or polyacrylamide gels is a fast and extremely accurate way to sequence nucleic acids. Bereits die Bestimmung von sehr kleinen Mengen an Nukleinsäuren, um ein vielfaches weni ger als bei den bisherigen Methoden, ist möglich, da jedes DNA-Molekül zum Markierungssignal beiträgt, während sich bei den bisherigen Methoden eine statistische Verteilung von Fragmenten der Nukleinsäure und damit für jedes zu bestimmen de Nukleotid nur ein Bruchteil der Ausgangsmenge von Nuklein säuren zur Verfügung steht. Even the determination of very small amounts of nucleic acids by a multiple LESS than with previous methods is possible because each DNA molecule contributes to the marker signal, while in the previous methods, a random distribution of fragments of the nucleic acid and thus for each to determine de nucleotide only a fraction of the initial amount of nucleic acids is available.

Die Genauigkeit der Methode basiert auf der Tatsache, daß die Extension der polymerisierten Kette unterbrochen wird, sobald das Polymeraseenzym bei einer Base auf dem Templatestrang ankommt, die nicht in der Inkubationsmischung mit den mar kierten Nukleotiden, mit welcher die Nukleinsäure inkubiert wird, vorhanden ist. The accuracy of the method is based on the fact that the extension of the polymerized chain is interrupted as soon as the polymerase enzyme arrives at a base on the template strand that is not present in the incubation mixture with the mar-labeled nucleotides with which the nucleic acid is incubated. Theoretisch kann es zwar zum falschen Einbau einer Base kommen, wodurch sich ein geringes Back groundsignal ergeben würde, jedoch wird nach dem Markierungs entfernungsschritt (4) auch die falsche Markierung entfernt, weshalb das falsche Signal nicht akkumulieren kann, was die Auflösung nach einigen Zyklen beeinträchtigen könnte. Theoretically, it can indeed come to the incorrect installation of a base, to give a little back would give ground signal, however, after marking removal step (4) the wrong mark away, making the wrong signal to accumulate not know what affect the resolution after several cycles could. Aus diesem Grund ist der Background im erfindungsgemäßen Verfah ren sehr gering und die Genauigkeit der Sequenzbestimmung entsprechend hoch. For this reason, the background in the novel procedural ren is very low and the accuracy of the sequencing correspondingly high.

Um die Genauigkeit der Sequenzbestimmung nochmals weiter zu erhöhen, kann die zu bestimmende Nukleinsäureprobe in vier Teilproben aufgetrennt werden und dann jeweils alle Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens mit jeweils den vier Nu kleinsäurealiquots durchgeführt werden. To further increase the accuracy of the sequence determination again, to be determined nucleic acid sample may be separated into four aliquots and each then all the steps of the inventive method are carried out with each of the four Nu kleinsäurealiquots. Die Sequenz wird dann nicht nur über das positive Signal aus der einen Probe be stimmt, in der der Einbau eines markierten Nukleotids statt gefunden hat, sondern auch über das Fehlen eines Signals in den Proben, welche mit den anderen drei markierten Nukleo tiden inkubiert wurden. The sequence is then true not only about the positive signal from a sample be where the incorporation of a labeled nucleotide has taken place, but also about the absence of a signal in the samples which were incubated tiden with the other three marked nucleo.

Zusammenfassend bietet das erfindungsgemäße Verfahren eine schnelle und leicht automatisierbare Möglichkeit, mit großer Genauigkeit die Sequenz von Nukleinsäuren auch bei Vorhanden sein nur ganz geringer Mengen derselben zuverlässig festzu stellen. In summary, the inventive method provides a fast and easy automated way to festzu represent the sequence of nucleic acids even at presence only very small amounts with great accuracy the same reliable.

Die folgenden Figuren erläutern die Erfindung weiter: The following figures illustrate the invention:

Fig. 1 zeigt ein Flußschema für das erfindungsgemäße Ver fahren, Fig. 1 shows a flow scheme for the inventive Ver drive,

Fig. 2 zeigt die Anordnung vieler verschiedener Nu kleinsäuren, hier DNA-Moleküle, auf einer festen Phase im Mikromaßstab zur gleichzeitigen Prozessie rung. Fig. 2 shows the arrangement of many different nucleic acids, here DNA molecules tion on a solid phase in the micro scale for simultaneous Prozessie.

Fig. 3 zeigt die Detektion des Einbaus von Fluorescein-12- dUTP durch Klenow-DNA-Polymerase. Fig. 3 shows the detection of incorporation of fluorescein-12-dUTP by Klenow DNA polymerase.

Claims (17)

1. Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, bei dem man zu einer zu sequenzierenden, zumindest teilweise einzelsträngigen Nukleinsäure als Template-Strang mit Hilfe einer geeigneten Polymerase und allen vier Nukleo tiden, ausgehend von einem Primer oder einem doppel strängigen Teilstück, Schritt für Schritt einen Komplementärstrang synthetisiert, wobei man markierte Nukleotide verwendet, und welches folgende Schritte umfaßt: 1. A method for sequencing nucleic acids, in which to be sequenced to a, tides at least partially single-stranded nucleic acid as a template strand using a suitable polymerase and all four nucleo, starting from a primer or a double-stranded portion, step by step, a complementary strand synthesized using using labeled nucleotides, and comprising the steps of:
  • (1) Inkubieren der mit dem Primer versehenen oder teil weise doppelsträngigen Nukleinsäure mit einer Inku bationsmischung, bestehend aus einer Polymerase, einer der vier Nukleotidarten in markierter Form und anderen für die Kettenpolymerisation benötigten Substanzen, wobei ein markiertes Nukleotid in den wachsenden Komplementärstrang eingebaut wird in dem Fall, daß das nächste auf dem Template-Strang vor handene Nukleotid zu dem verwendeten markierten Nu kleotid komplentär ist, (1) incubating the provided with the primer or partially double-stranded nucleic acid with a Inku bationsmischung consisting of a polymerase, one of the four Nukleotidarten in labeled form and other substances required for the chain polymerization, wherein a labeled nucleotide is incorporated into the growing complementary strand in the case that the next marked on the template strand before handene nucleotide to that used Nu is kleotid komplentär,
  • (2) Trennen der gegebenenfalls um ein Nukleotid verlän gerten Nukleinsäure von der Inkubationsmischung von Schritt (1) und Durchführung eines oder mehrerer Waschschritte in an sich bekannter Weise, (2) separating the optionally Longer side a nucleotide siege nucleic acid from the incubation mixture of step (1) and performing one or more wash steps in a known manner,
  • (3) Bestimmen des Einbaus eines Nukleotids anhand sei ner Markierung, und (3) determining incorporation of a nucleotide is based ner mark, and
  • (4) falls der Einbau eines markierten Nukleotids er folgt ist, Entfernen der Markierung, (4) if the incorporation of a labeled nucleotide he follows, removing the label,
wobei die Schritte (1) bis (4) jeweils cyclisch für alle vier Nukleotidarten durchgeführt werden. wherein steps (1) to (4) are each cyclic performed for all four Nukleotidarten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu sequenzierende Nukleinsäure vor Schritt (1) an einer festen Phase verankert wird. 2. The method of claim 1, characterized in that the nucleic acid to be sequenced prior to step (1) is anchored to a solid phase.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verankerung über ein spezifisches Bindepaar erfolgt, dessen einer Partner mit der festen Phase ver bunden ist und dessen anderer Partner an die Nukleinsäu re gebunden ist. 3. The method according to claim 2, characterized in that the anchoring via a specific binding pair is carried out one partner of which is linked with the solid phase and the other partner ver re to the nucleic is bound.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisches Bindepaar das System Bio tin/Avidin oder Biotin/Streptavidin verwendet. 4. The method according to claim 3, characterized in that as a specific binding pair system the organic tin / avidin or used biotin / streptavidin.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als feste Phase Glas, eine Polymermembran oder Polymer- oder Glaskügelchen (beads) verwendet. 5. The method according to any one of claims 2 to 4, characterized in that there is used as a solid phase of glass, a polymer membrane or polymeric or glass beads (beads).
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Primer ein Oligonukleotid vor die zu se quenzierende Sequenz anhybridisiert. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that hybridized as primers an oligonucleotide prior to se quenzierende sequence.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Schritte (1) bis (4) ein Durchflußsystem verwendet, bei dem die Nukleinsäure in Lösung bleibt und mit Hilfe von Filtern oder/und Kapillaren von anderen Substanzen getrennt wird. 7. The method of claim 1 or 6, characterized in that one uses for steps (1) to (4) a flow-through system in which the nucleic acid remains in solution and is separated by means of filters and / or capillaries of other substances.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierung der Nukleotide eine Fluoreszenz markierung verwendet. 8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that there is used as a marker of the nucleotides a fluorescent label.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nukleotide Deoxyribonukleotide verwendet. 9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that there is used as nucleotides deoxyribonucleotides.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nukleotide Dideoxyribonukleotide verwendet und diese nach erfolgter Bestimmung der Markierung in Schritt (3) oder gegebenenfalls nach Schritt (4) in De oxyribonukleotid-ähnliche polymerisationsverlängerbare Nukleotide überführt. 10. A method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that there is used as nucleotides Dideoxyribonukleotide and that after determining the label in step (3) or optionally of step (4) converted oxyribonukleotid-like polymerisationsverlängerbare nucleotides in De.
11. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man alle vier Nukleotidarten mit jeweils verschiede nen Fluoreszenzmarkierungen zusammen in einer Inkuba tionsmischung in Schritt (1) einsetzt und die Unter scheidung der eingebauten Nukleotide über deren Markie rung erfolgt. 11. A method according to claim 11, characterized in that each Various NEN fluorescent labels together in a Inkuba all four Nukleotidarten tion mixture in step (1) is used and the bottom of the nucleotides incorporated on their Markie tion decision is carried out.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nukleinsäure vor der Sequenzierung denatu riert. 12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the nucleic acid riert of denaturation prior to sequencing.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Schritt (3) oder (4) mit einem dem verwen deten markierten Nukleotid von Schritt (1) entsprechen den nicht markierten Nukleotid eventuell vorhandene Lücken im Komplementärstrang auffüllt. 13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that after step (3) or (4) with a used does the labeled nucleotide of step (1) correspond to the non-labeled nucleotide any existing gaps in the complementary strand filling.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man auf der festen Phase mehrere zu sequenzierende Nukleinsäuren in räumlicher Trennung voneinander veran kert und diese simultan sequenziert. 14. A method according to any one of claims 1 to 6 and 8 to 13, characterized in that kert more nucleic acids to be sequenced in spatial separation from each other veran on the solid phase and these sequenced simultaneously.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Schritte (1) bis (3) und gegebenenfalls (4) in einem Automaten durchführt. 15. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that one carries out the steps (1) to (3), and optionally (4) in a vending machine.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung der Markierung eine Charge Coupled Device (CCD) Camera verwendet. 16. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for determining the label is a Charge Coupled Device (CCD) camera is used.
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