DE406963C

DE406963C - Process for the preparation of the basic phosphorus substance of milk casein in chemically pure form

Info

Publication number: DE406963C
Application number: DEG58664D
Authority: DE
Original assignee: Chemische Ind Ges; GESELLSCHAFT fur CHEMISCHE INDUSTRIE; Gesellschaft fuer Chemische Industrie in Basel CIBA
Current assignee: Chemische Ind Ges; GESELLSCHAFT fur CHEMISCHE INDUSTRIE; BASF Schweiz AG
Priority date: 1923-01-25
Filing date: 1923-03-13
Publication date: 1924-12-03

Description

Verfahren zur Darstellung der phosphorhaltigen Grundsubstanz des Milchcaseins in chemisch reiner Form. Für diese Anmeldung ist gemäß dem Unionsvertrage vom 2. Juni igii die Priorität auf Grund der Anmeldung in der Schweiz vom 25. Januar 1923 beansprucht. Seitdem L u b a w i n (Ber. X, S. 2237 [18771) bewiesen hat, daß der Phosphorgehalt des Caseins nicht auf beigemengte Mineralphosphate zurückzuführen ist, nimmt ' man allgemein an, daß der Phosphor im Casein organisch gebunden ist.Process for the preparation of the basic phosphorus substance of milk casein in chemically pure form. According to the Union Treaty of 2. Juni igii the priority due to the registration in Switzerland from January 25, 1923 claimed. Since then L u b a w i n (Ber. X, p. 2237 [18771) has proven that the The phosphorus content of casein cannot be attributed to added mineral phosphates it is generally assumed that the phosphorus in casein is organically bound.

Man glaubte längere Zeit, daß hier eine nucleinartige prosthetische Gruppe vorliege, welche man mit dem Namen Para- oder Pseudonucleinsäure belegte. Es gelang aber trotz vieler Bemühungen nicht, eine derartige Säure vom Casein zu trennen. S a 1 k o w s k i (vgl. Zeitschrift f. physiolog. Ch. 32 [1901], S.2¢5) beschrieb zwar als eine Paranucleinsäure eine Substanz, die er aus den Pepsinverdauungsprodukten abscheiden konnte. Diese Säure zeigte aber Eiweißreaktion und sollte eher als ein wasserlösliches Paranuclein bezeichnet werden. Übrigens handelte es sich nicht um eine definierte Verbindung, da die Analysenwerte für das Eisensalz und die freie Säure miteinander gar nicht stimmten. S a 1 k o w s k i bemerkte dabei nicht, daß seine Präparate größere Mengen Mineralphosphorsäure enthielten, denn die von ihm zum Nachweis der letzteren gewählte Reaktion, Fällung mit Chlorbarium und Ammaniak, versagte bei den Verdauungsprodukten des Caseins.For a long time it was believed that this was a nucleus-like prosthetic Group is present, which has been assigned the name para or pseudonucleic acid. In spite of many efforts, however, it was not possible to obtain such an acid from casein separate. S a 1 k o w s k i (cf. magazine f. Physiolog. Ch. 32 [1901], p.2 ¢ 5) described as a paranucleic acid a substance that he obtained from pepsin digestion products could deposit. However, this acid showed a protein reaction and should rather than a water-soluble paranuclein are called. Incidentally, it wasn't a defined connection, as the analysis values for the iron salt and the free Acid didn't match at all. S a 1 k o w s k i did not notice that his preparations contained greater amounts of mineral phosphoric acid than his to prove the latter reaction chosen, precipitation with chlorobarium and ammaniac, failed the digestive products of casein.

Auch R e h (Hofmeister's Beiträge z. chem. Physiol. und Pathologie, XI [19o8], S. i) beging denselben Fehler bei der Darstellung der Uranverbindung seiner »Polypeptidphosphorsäure« aus den Pepsinverdauungsprodukten des Caseins. Er wählte als Ausgangsstoff technisches Caseiil, welches bekanntlich mindestens 30 Prozent seines Phosphors in Form von Mineralphosphaten enthält. Diese müßten unbedingt bei der Fällung mit Uranacetat mitausfallen. In Gegenwart von Mineralphosphaten fällt dieses Reagens auch Peptone aus.R eh (Hofmeister's contributions to chem. Physiol. And Pathology, XI [19o8], p. I) also made the same mistake when presenting the uranium compound of its "polypeptide phosphoric acid" from the pepsin digestion products of casein. He chose technical casein as the starting material, which is known to contain at least 30 percent of its phosphorus in the form of mineral phosphates. These would have to fall out with the precipitation with uranium acetate. In the presence of mineral phosphates, this reagent also precipitates peptones.

Mit anscheinend mehr Recht nimmt P 1 i m -mer (The Biochemical Journal VII [19i3], S. 73) an, daß die Phosphorsäure im Casein, an Aminosäuren gebunden sei. Er beobachtete, daß einprozentige Natronlauge im Thermostaten bei q.0° fast sämtliche Phosphorsäure vom Casein abspaltet, was mit Phosphorsäureestern der mehrwertigen Alkohole nicht geschieht. Ebenso labil sind jedoch die Hexosephosphorsäuren gegenüber verdünnter Natronlauge- Das Vorhandensein einer eiweißfreien prosthetischen Phosphorgruppe im Casein erscheint daher doch nicht völlig ausgeschlossen.Apparently P 1 im -mer (The Biochemical Journal VII [19i3], p. 73) assumes that the phosphoric acid in casein is bound to amino acids. He observed that one percent sodium hydroxide solution in the thermostat at q 0 ° separates almost all phosphoric acid from the casein, which does not happen with phosphoric acid esters of polyhydric alcohols. However, the hexose phosphoric acids are just as unstable compared to dilute sodium hydroxide solution. The presence of a protein-free prosthetic phosphorus group in casein therefore does not appear to be completely ruled out.

Als völlig neu muß folglich die Feststellung betrachtet werden, daß das Casein einen einzigen phosphorhaltigen Kern aufweist, in welchem 4 Phosphor- und 18 Stickstoffatome enthalten sind, und daß es möglich ist, durch ein einfaches Verfahren diese phosphorhaltige Grundsubstanz aus den mit Pankreasfermenten erhaltenen Verdauungsprodukten des Caseins in chemisch reiner Form und so gut wie quantitativ abzuscheiden. Dieses Verfahren, bildet .den Gegenstand der vorliegenden Erfindung: Im Patent 401272 wurde gezeigt, daß man nach Trypsinverdauung des technischen Caseins in schwach alkalischem Medium (vgl. auch Zeitschrift für physiol. Chem. 42 [19041, S. 538) fast den gesamten in ihm -enthal'enen Phosphor in Form eines löslichen Calciumsalzes abscheiden kann. Das technische Casein enthält aber viel Mineralphosphate, woraus für die Darstellung der chemisch reinen Verbindung eine sehr bedeutende Schwierigkeit entsteht. Die meisten Fällungsmittel der ersteren scheiden auch die letztere ab, und die in Wasser sonst unlöslichen Erdalkaliphosphate lösen sich merkwürdigerweise leicht in den wäßrigen Lösungen der Erdalkalisalze der organischen Verbindung. Anderseits hemmt die Gegenwart von größeren Mengen Alkaliphosphat die Trypsinwirkung und verhindert zum Teil den vollständigen Abbau der phosphorhaltigen Grundsubstanz des Caseins.The discovery that casein has a single phosphorus-containing nucleus containing 4 phosphorus and 18 nitrogen atoms must therefore be regarded as completely new, and that it is possible to use a simple process to extract this phosphorus-containing basic substance from the digestive products obtained with pancreatic enzymes of casein in chemically pure form and as good as quantitatively separated. This process forms the subject of the present invention: In patent 401272 it was shown that after trypsin digestion of technical casein in a weakly alkaline medium (cf. also Zeitschrift für Physiol. Chem. 42 [19041, p. 538), almost the entire in it can deposit phosphorus in the form of a soluble calcium salt. The technical casein, however, contains a lot of mineral phosphates, from which a very significant difficulty arises for the preparation of the chemically pure compound. Most of the precipitating agents of the former also separate the latter, and the alkaline earth phosphates, which are otherwise insoluble in water, surprisingly dissolve easily in the aqueous solutions of the alkaline earth salts of the organic compound. On the other hand, the presence of larger amounts of alkali metal phosphate inhibits the trypsin effect and partially prevents the complete breakdown of the phosphorus-containing basic substance of casein.

Es wurde nun gefunden, daß Alkalicarbonate die Eigenschaft besitzen, schon in der Kälte die Schwermetallsalze der in Frage kommenden phosphorhaltigen Verbindungen umzusetzen und in lösliche Alkalisalze überzuführen. Metallphosphat bleibt bei der Behandlung mit Alkalicarbonaten ungelöst. Die Trennung der Mineralphosphorsäure von der organischen Verbindung mittels Alkalicarbonaten gestaltet sich sehr einfach und ist quantitativ. Beispiel. io kg technisches Milchcasein werden in 8o 1 auf 40° vorgewärmtem Leitungswasser aufgeschlämmt. Man setzt 62o g wasserfreies Natriumcarbonat, boo g Natriumbicarbonat, 5oo g fein gemahlene Bauchspeicheldrüse oder 25 g Trypsin und aoo ccm Toluol zu und läßt unter fortwährendem Rühren zwei Tage bei 40° und dann noch weiter 24 Stunden in der Kälte stehen. Man filterpreßt und fällt mit Bleizucker und Bleiessig vollständig aus. Der Bleiniederschlag, welcher sämtliche Phosphorverbindungen der Lösung enthält, wird abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und ausgepreßt.It has now been found that alkali carbonates have the property of converting the heavy metal salts of the phosphorus-containing compounds in question even in the cold and converting them into soluble alkali salts. Metal phosphate remains undissolved when treated with alkali carbonates. The separation of the mineral phosphoric acid from the organic compound by means of alkali carbonates is very simple and quantitative. Example. 10 kg of technical milk casein are slurried in 8o 1 of tap water preheated to 40 °. 62o g of anhydrous sodium carbonate, 500 g of sodium bicarbonate, 500 g of finely ground pancreas or 25 g of trypsin and 100 cc of toluene are added and the mixture is left to stand in the cold for two days at 40 ° and then for a further 24 hours while stirring continuously. It is filter-pressed and completely precipitated with lead sugar and lead acetic acid. The lead precipitate, which contains all the phosphorus compounds in the solution, is filtered off, washed thoroughly with water and squeezed out.

Um nun die organischen Phosphorverbindungen zu entbleien und vom Bleiphosphat zu trennen, zerreibt man den Bleiniederschlag fein mit etwas Wasser und setzt unter Rühren eine zoprozentige Natriumcarbonatlösung so lange zu, bis Phenolphtaleinpapier schwach rosa anschlägt. Man verbraucht gewöhnlich etwa 2i,.'21 Natriumcarbonatlösung. Die entstandene Lösung wird dann vom ungelösten, Bleicarbonat und Bleiphosphat scharf getrennt und einer zweiten Verdauung mit Trypsin unterworfen, nach Zusatz von ioog I Natriumbicarbonat und 5 g Trypsin. Nach 24 Stunden ist die Lösung zur weiteren Behandlung bereit. Man setzt der filtrierten Lösung, welche auf 61 gebracht wird, iol 95prozentigen Alkohol zu und läßt das als öl ausgeschiedene Natriumsalz der reinen Phosphorverbindung absitzen. Man hebert den obenstehenden Alkohol ab, das öl wird in Wasser gelöst, mit Bleizucker gefällt, das Bleisalz filtriert, gewaschen und mit Schwefelwasserstoff entbleit. Die vom Bleisulfid getrennte saure Lösung wird mit einem Luft-Strom vom Schwefelwasserstoff befreit, bei niedriger Temperatur im Vakuum konzentriert und mit vier Volumen starkem Alkohol gefällt. Die schneeweiße Fällung wird filtriert, mit Alkohol nachgewaschen und im Vakuum bei niedriger Temperatur getrocknet und gepulvert. Sie stellt den reinen phosphorhaltigen Kern des Caseins dar. Statt mit Bleizucker kann man die Lösung des öles auch mit Kupferacetat oder mit einem Quecksilbersalz ausfällen, ferner statt Natriumcarbonat Ammonium- oder Kaliumcarbonat verwenden, ohne daß hierdurch am Ergebnis etwas geändert wird.In order to now remove the lead from the organic phosphorus compounds and from the lead phosphate To separate, one grinds the lead precipitate finely with a little water and puts it under Stir in a 10% sodium carbonate solution until phenolphthalein paper faint pink. About twenty-one hundred and twenty-one sodium carbonate solution is usually consumed. The resulting solution becomes sharp from the undissolved lead carbonate and lead phosphate separated and subjected to a second digestion with trypsin, after adding ioog I sodium bicarbonate and 5 g of trypsin. After 24 hours the solution is ready for further use Treatment ready. The filtered solution, which is brought to 61, is added iol 95 percent alcohol and leaves the sodium salt precipitated as an oil sit with pure phosphorus compound. One siphons off the above alcohol, that Oil is dissolved in water, precipitated with lead sugar, the lead salt is filtered and washed and defleaded with hydrogen sulfide. The acidic solution separated from the lead sulfide is freed from hydrogen sulfide with a stream of air at low temperature concentrated in vacuo and precipitated with four volumes of strong alcohol. The snow-white one Precipitation is filtered, washed with alcohol and in vacuo at low temperature dried and powdered. It represents the pure phosphorus-containing core of casein instead of lead sugar, the solution of the oil can also be made with copper acetate or precipitate with a mercury salt, also ammonium or ammonium instead of sodium carbonate Use potassium carbonate without changing the result.

Durch Neutralisation der freien Säure mit Alkalien oder Erdalkalien und nachheriges Eintrocknen im Vakuum - gegebenenfalls nach Ausfällung mit Alkohol - erhält man die Alkali- und Erdalkalisalze der Verbindung. Zur Darstellung des Natriumsalzes kann unmittelbar das obige öl im Vakuum eingetrocknet werden. Durch Ursetzung des Natrium-Salzes mit löslichen Eisensalzen stellt man j das Eisensalz der organischen Phosphorverbindung dar.By neutralizing the free acid with alkalis or alkaline earths and subsequent drying in vacuo - if necessary after precipitation with alcohol - the alkali and alkaline earth salts of the compound are obtained. To represent the Sodium salt, the above oil can be dried directly in vacuo. By The iron salt is substituted for the sodium salt with soluble iron salts the organic phosphorus compound.

Die auf angegebene Weise dargestellte Verbindung läßt sich durch Trypsin nicht weiter abbauen und durch Fraktionierung nicht in verschiedene Teile zerlegen. Sie muß als der organische Phosphorkern des Caseins betrachtet werden. Sie stellt ein weißes amorphes Pulver dar, welches in Wasser klar i löslich, in Alkohol und anderen organischen, Lösungsmitteln wenig bzw. unlöslich ist. Die wäßrige Lösung reagiert neutral auf Kongorot, I sauer auf Methylorange und Lackmus. Zur Neutralisation auf Methylorange braucht man etwa vier Äquivalente und zur Rosa-; färbung von Phenolphtalein genau 14 Äquivalente Natronlauge.The compound shown in the manner indicated can be trypsinized do not break down further and do not break them down into different parts by fractionation. It must be regarded as the organic phosphorus nucleus of casein. She poses a white amorphous powder, which is clearly soluble in water, in alcohol and other organic solvents is little or insoluble. The aqueous solution reacts neutrally to Congo red, I acidic to methyl orange and litmus. For neutralization on methyl orange you need about four equivalents and on pink; coloring of phenolphthalein exactly 14 equivalents of caustic soda.

' Die wäßrige Lösung der Säure trübt sich nicht beim Zusatz von Magnesiamixtur, auch nicht nach längerem Stehen. Molybdänflüssigkeit ruft in konzentrierter Lösung der Säure eine rein weiße Fällung, in verdünnter Lösung keinen Niederschlag hervor. Kupferacetat ergibt eine hellblaue, Bleiacetat und Quecksilbersalze eine weiße, Silbernitrat und Eisen-Chlorid keine Fällung. Die mit Natronlauge neutralisierte Lösung der Säure gibt dagegen einen weißen Niederschlag mit Silbernitrat und .einen gelben mit Eisensalzen.The aqueous solution of the acid becomes cloudy not at Addition of magnesia mixture, not even after long periods of standing. Molybdenum liquid in a concentrated solution of the acid produces a pure white precipitate, in a dilute solution no precipitation emerged. Copper acetate gives a light blue, lead acetate and mercury salts a white, silver nitrate and iron chloride no precipitation. The neutralized with caustic soda Solution of the acid, however, gives a white precipitate with silver nitrate and .eine yellow with iron salts.

Die Alkalisalze der Verbindung haben ein glasartiges Aussehen, die Erdalkalisalze sind weiße, amorphe, leicht in Wasser lösliche Pulver.The alkali salts of the compound have a vitreous appearance, which Alkaline earth salts are white, amorphous powders that are easily soluble in water.

Die Verbindung gibt eine schöne rosa Biuretreaktion; die Millonsche und Xanthoproteinreaktion sind völlig negativ, ebenso die Reaktion von M o 1 i s c h. Gleichwohl scheint die Verbindung eine Kohlenhydratgruppe zu besitzen. Kocht man sie einige Stunden unter Rückfluß mit konzentrierter Salzsäure und destilliert nachher die letztere ab, so geht gleichzeitig ein Produkt über, das zwar mit Anilinacetat keine Furfurolreaktion gibt, aber mit Phloroglucin ein rotes Phloroglucid ausfällt. Das Destillat reduziert Fehlingsche Lösung.The compound gives a beautiful pink biuret reaction; the Millonsche and xanthoprotein reactions are completely negative, as is the reaction of M o 1 i s c h. However, the compound appears to have a carbohydrate group. Cooks they are refluxed with concentrated hydrochloric acid and distilled for a few hours after the latter, a product passes over at the same time, although it does contain aniline acetate there is no furfural reaction, but with phloroglucinol a red phloroglucid precipitates. The distillate reduces Fehling's solution.

Die Verbindung ist gegenüber Mineralsäuren in der Kälte, gegenüber Ammoniak und Natriumbicarbonat.unter q.0° ziemlich widerstandsfähig. Ätzkali sowie Bariumhydroxyd spalten bei gewöhnlicher Temperatur allmählich die Hälfte der Phosphorsäure, bei Siedehitze fast augenblicklich sämtliche Phosphorsäure ab.The compound is opposite to mineral acids in the cold, as opposed to Ammonia and sodium bicarbonate. Quite resistant below 0 °. Caustic potash as well Barium hydroxide gradually split half of the phosphoric acid at ordinary temperature, at the boiling point all phosphoric acid is removed almost instantly.

Die 5,86 Prozent Phosphor enthaltende Verbindung soll zu therapeutischen Zwecken, insbesondere zur Phosphortherapie, verwendet werden.The compound containing 5.86 percent phosphorus is said to be therapeutic Purposes, in particular for phosphor therapy, are used.

Die Verteilung des Stickstoffs im Molekül nach Hydrolyse mit 25prozentiger Schwefelsäure ist folgende: ,etwa 16 Prozent Amid-, 1z Prozent Basen- und 72 Prozent Aminstickstoff. Dies zwingt dazu, in der Verbindung vier Atome Phosphor und 18 Atome Stickstoff anzunehmen.The distribution of nitrogen in the molecule after hydrolysis with 25 percent sulfuric acid is as follows: about 16 percent amide, 1z percent base and 72 percent amine nitrogen. This forces us to assume four atoms of phosphorus and 18 atoms of nitrogen in the compound.

Claims

PATENT CLAIM: Process for the production of the basic substance containing phosphorus of milk casein in chemically pure form, characterized in that the in known way by digesting milk casein. with pancreatic ferments in weak filtered digestive fluid obtained from an alkaline medium with heavy metal salts fails, the heavy metal salt precipitation for the purpose of removing the heavy metal from the organic phosphorus compound and separation of the latter from mineral phosphoric acid treated with alkali carbonate solution, the resulting solution of alkali salts the organic phosphorus compound of a second digestion with pancreatic ferments exposed for a short time, mixed with alcohol, the deposited alkali salt the chemically pure compound dissolves in water, precipitates with a heavy metal salt, the precipitation with hydrogen sulfide freed from the metal, the solution thus obtained the free acid falls with alcohol and brings the precipitate to dryness.