DE4041554A1

DE4041554A1 - Measuring sedimentation kinetics of blood cells, etc. - using centrifuge with continuous photometric recording system

Info

Publication number: DE4041554A1
Application number: DE19904041554
Authority: DE
Inventors: Aribert Dr Komanns; Anke Komanns
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-12-22
Filing date: 1990-12-22
Publication date: 1991-05-02
Also published as: DE4041554C2

Abstract

Sedimentation kinetics of blood cells, haemagglutinates or antigen-antibody complexes are measured by (a) pipetting the test sample and reagents into separate chambers of a thermostatted cuvette-rotor system, (b) combing the sample and reagents under centrifugal force, (c) mixing the sample and reagents by means of mechanical or ultrasonic vibration, and (d) recording the sedimentation-induced increase in light transmission or decrease in light reflection simultaneously in all the measuring chambers under continuous centrifugation by means of stepwise radial photometer, reflectometers or line diodes ('Zeilendioden') or by means of a radially mobile photometer or reflectometer.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrich tung zur Messung der Sedimentationskinetik von Blutzel len, Hämagglutinaten und Antigen-Antikörper-Komplexen unter Einwirkung von Zentrifugalkräften.The invention relates to a method and a Vorrich device for measuring the sedimentation kinetics of blood cells len, hemagglutinates and antigen-antibody complexes under the influence of centrifugal forces.

Wird Vollblut durch Natriumcitratzusatz antikoaguliert und anschließend in geeigneten Küvetten bei 80-200 g zentrifugiert, so sedimentieren in kurzer Zeit die Ery throzyten, während die Thrombozyten und teils auch die Leukozyten aufgeschwemmt werden. Nach längerem Zentrifu gationsvorgang werden die Thrombozyten unter der Einwir kung zentrifugationsbedingter Scherkräfte spontan akti viert. Es bilden sich kleine Aggregate aus, die unter Einwirkung der Zentrifugalbeschleunigung ebenfalls sedi mentieren. Durch Zugabe von aggregationsauslösenden Sub stanzen zum Vollblut bilden sich unmittelbar Aggregate aus. Dadurch wird zum einen die Sedimentation der Ery throzyten beschleunigt. Andererseits werden während des Zentrifugationsschrittes nur noch die nicht aktivierten Thrombozyten primär aufgeschwemmt. Die Rate nicht akti vierter Thrombozyten ist wiederum von der Konzentration der aggregationsauslösenden Substanzen abhängig. Die Se dimentation der Erythrozyten ist mit einer Lichtttrans missionszunahme im Überstand verbunden. Die Sedimenta tion der Thrombozyten bzw. der Aggregate geht mit einer weiteren Lichttransmissionszunahme einher. Anhand dieser optischen Eigenschaften soll sowohl die Sedimentations kinetik der Erythrozyten als auch die Sedimentationski netik der Thrombozyten in Abhängigkeit von der Zentrifu galbeschleunigung und von der Konzentration der aggrega tionsauslösenden Substanzen gemessen werden.Whole blood is anticoagulated by the addition of sodium citrate and then in suitable cuvettes at 80-200 g centrifuged, the Ery sediment in a short time throcytes, while the platelets and sometimes also the Leukocytes can be suspended. After a long centrifuge gation process, the platelets under the centrifugation-induced shear forces act spontaneously fourth. Small aggregates form, the under Influence of centrifugal acceleration also sedi mentate. By adding aggregation-triggering sub Punching into whole blood forms aggregates immediately out. As a result, the sedimentation of the Ery throcytes accelerated. On the other hand, during the Centrifugation step only those not activated Platelets primarily washed up. The rate is not active fourth platelet is again of concentration dependent on the substances that trigger aggregation. The Se The red blood cells are dimentated with a light trans increase in missions in the supernatant. The sedimenta tion of the platelets or the aggregates goes with one further light transmission increase. Based on this optical properties are said to include both the sedimentation kinetics of erythrocytes as well as sedimentation platelet netics as a function of centrifugation gall acceleration and from the concentration of the aggrega tion-triggering substances are measured.

Im Rahmen von Hämagglutinationsuntersuchungen, z. B. bei der Blutgruppenserologie, werden Erythrozytenaufschwem mungen mit spezifischen Antiseren des ABO-, Rhesus- oder Kellsystems zusammengebracht. Treffen antigentragende Erythrozyten auf zugehörige Antikörper, kommt es zur Häm agglutination und damit verbunden zur schnellen Sedimen tation der Hämagglutinate. Treffen hingegen nichtzuge hörige Antigene und Antikörper zusammen, bleibt diese Reaktion aus und die Erythrozyten sedimentieren nur sehr langsam. Sowohl die Sedimentation der Erythrozyten als auch der Hämagglutinate geht mit einer Lichttransmis sionsänderung einher. Anhand dieser optischen Eigen schaft kann sowohl die Sedimentationskinetik der Ery throzyten als auch der Hämagglutinate in Abhängigkeit von der Zentrifugalbeschleunigung gemessen werden. Die Meßergebnisse ermöglichen im Anschluß eine Zuordnung der Blutgruppen.As part of hemagglutination examinations, e.g. B. at blood group serology, erythrocyte growth with specific antisera of ABO, Rhesus or Kellsystems brought together. Meeting antigenic Erythrocytes on associated antibodies, it comes to heme agglutination and related to rapid sediments tion of the hemagglutinates. However, do not hit trains related antigens and antibodies together, this remains Reaction off and the erythrocytes only sediment very much slowly. Both the sedimentation of the erythrocytes and the hemagglutinate also works with a light transmission change associated with. Based on this optical property The sedimentation kinetics of the Ery throcytes as well as the hemagglutinates depending measured by centrifugal acceleration. The Measurement results then allow an assignment of the Blood types.

Bisher sind keine Verfahren zur Messung der Sedimenta tionszeit von Blutzellen, Hämagglutinaten und Antigen-An tikörper-Komplexen unter Einwirkung von Zentrifugalkräf ten beschrieben worden.So far there are no methods of measuring sediment time of blood cells, hemagglutinates and antigen-An antibody complexes under the influence of centrifugal force ten have been described.

Dagegen wurde von Norman G. Anderson bereits in den sechziger Jahren in Analytical Biochemistry, Vol. 23, 207-218 (1968) unter dem Titel "Analytical Techniques for Cell Fraktions" und in Science, Vol. 166, 317-324 (1969) unter dem Titel "Computer Interfaced Fast Analyzers" das Prinzip der Zentrifugalanalyse beschrieben. Dieses Prin zip beruht darauf, daß das Mischen von Probe und Reagenz, die zuerst in verschiedenen Zellen fraktioniert lagern, im Rahmen klinisch-chemischer Untersuchungen unter Ein fluß der Zentrifugalkraft in einem Zentrifugalrotor er folgt, der randnah eine Anzahl von Meßkammern aufweist, die das Reaktionsergebnis zu messen gestatten, während der Rotor noch in Bewegung ist, die Zentrifugalkraft also noch einwirkt. Insbesondere war auf diese Weise möglich, innerhalb kürzester Zeit eine erhebliche Anzahl von glei chen Untersuchungen parallel nebeneinander her ablaufen und ausmessen zu lassen.By contrast, Norman G. Anderson 1960s in Analytical Biochemistry, Vol. 23, 207-218 (1968) under the title "Analytical Techniques for Cell Fractions "and in Science, Vol. 166, 317-324 (1969) under the title "Computer Interfaced Fast Analyzers" Principle of centrifugal analysis described. That prin zip is based on the fact that the mixing of sample and reagent, which are first stored fractionally in different cells, as part of clinical-chemical investigations under one flow of centrifugal force in a centrifugal rotor follows, which has a number of measuring chambers near the edge, which allow the reaction result to be measured while the rotor is still moving, i.e. the centrifugal force still acts. In particular, it was possible in this way within a very short time a significant number of the same examinations run side by side in parallel and have it measured.

In vielen folgenden Patentanmeldungen, z. B. US 41 35 883, US 37 13 775, DE 30 44 385 A1, DE 33 14 961 A1, wurden im Zuge der Weiterentwicklung dieses Analysenprinzips vor allem die Form der Rotoren immer komplizierter gestaltet. Ferner wurde auch dem Aspekt der exakten Rotortemperie rung zunehmende Bedeutung zugemessen. In US 37 13 775 ist zudem der Einsatz von Vollblut im Sinne eines weiteren Automatisierungsschrittes vorgesehen. Dabei findet in ei ner integrierten Zentrifuge lediglich eine Fraktionierung der zellulären Bestandteile vom Serum statt. Nicht vorge sehen sind hingegen die technischen Voraussetzungen zur gleichzeitigen Messung der Sedimentationskinetik.In many of the following patent applications, e.g. B. US 41 35 883, US 37 13 775, DE 30 44 385 A1, DE 33 14 961 A1, were in In the course of the further development of this analytical principle especially the shape of the rotors is becoming more and more complicated. The aspect of exact rotor temperature was also considered of increasing importance. In US 37 13 775 is also the use of whole blood in the sense of another Automation step provided. It takes place in egg integrated centrifuge only a fractionation of cellular components from the serum. Not featured on the other hand, you can see the technical requirements for simultaneous measurement of sedimentation kinetics.

Alle bisherigen Zentrifugalanalysensysteme sind somit speziell ausgelegt auf die mechanisierte Bestimmung kli nisch-chemischer Kenngrößen. Mit anderen Worten wird wäh rend der Messung nur die über der gesamten Meßkammer gleichmäßig auftretende Extinktionsänderung als Meßgröße erfaßt und in entsprechende Substanzkonzentrationen umge rechnet. Dagegen wird durch den Anemldungsgegenstand ein auf die Durchführung von Sedimentationsuntersuchungen ausgerichtetes Verfahren und eine entsprechende Vor richtung vorgestellt.All previous centrifugal analysis systems are thus specially designed for mechanized determination kli niche chemical parameters. In other words, will rend only the measurement over the entire measuring chamber Evenly occurring change in extinction as a measured variable recorded and converted into corresponding substance concentrations calculates. In contrast, the subject of registration is a on the conduct of sedimentation studies aligned procedure and a corresponding pre direction presented.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine automa tische Messung der Sedimentationskinetik von Blutzellen, Hämagglutinaten und Antigen-Antikörper-Komplexen unter Einwirkung von Zentrifugalkräften zu ermöglichen.The invention has for its object an automa table measurement of sedimentation kinetics of blood cells, Hemagglutinates and antigen-antibody complexes below To allow the action of centrifugal forces.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß primär voneinander getrenntes Untersuchungsmaterial und Reagenz in einem temperierten Küvettenrotorsystem durch Anzentrifugieren in der Meßkammer zusammengeführt wird. In der darauffolgenden Inkubationsphase wird eine sponta ne schwerkraftbedingte Sedimentation durch einen Ultra schallvibrator, der bei langsamer Drehbewegung des Küvet tenrotorsystems nacheinander auf alle Meßküvetten ein wirkt, verhindert. Nach Ablauf der Inkubationsphase er folgt der eigentliche Meßvorgang bei mittlerer Zentrifu galbeschleunigung. Dabei ermöglichen vertikal angeordnete Lichtschlitze über der Basis der Küvettenlager die photo metrische Messung der Lichttransmission bei Rotorpassage. Das Photometer ist in einer Anordnung über Schrittmotor radiär beweglich und erlaubt eine Messung der sedimenta tionsbedingten Transmissionssprünge innrhalb der gesam ten Meßkammer im zeitlichen Verlauf. Die Sedimentations- Zeit-Diagramme werden erfaßt und zur Auswertung der Sedi mentationskinetik von Blutzellen, Hämagglutinaten und An tigen-Antikörper-Komplexen herangezogen.The object is achieved in that primary test material and Reagent in a temperature-controlled cuvette rotor system Centrifugation is brought together in the measuring chamber. In the subsequent incubation phase, a sponta ne gravity-related sedimentation by an Ultra sound vibrator, when the cuvette rotates slowly tenrotorsystems one after the other on all measuring cells works, prevents. After the incubation period he follows the actual measuring process with a medium centrifuge gall acceleration. This allows vertically arranged Slits of light above the base of the cuvette bearing the photo metric measurement of light transmission at rotor passage. The photometer is arranged via a stepper motor radially movable and allows a measurement of the sedimenta tion-related transmission jumps within the total th measuring chamber over time. The sedimentation Time diagrams are recorded and used to evaluate the Sedi mentation kinetics of blood cells, hemagglutinates and An tigen-antibody complexes.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen in der automatischen Registrierung und Verarbeitung der Meßwerte und in der im Vergleich zur manuellen Durchführung gerin gen Fehlerbreite.The advantages achieved by the invention are automatic registration and processing of the measured values and in comparison to manual execution error range.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeich nung dargesellt und wird im folgenden näher beschrieben.An embodiment of the invention is in the drawing tion and is described in more detail below.

Fig. I zeigt einen Querschnitt durch eine erfindungsge mäße Meßvorrichtung, wobei in erster Linie die Neuheiten bzw. die erfinderischen Aspekte herausgestellt werden. Fig. I shows a cross section through a measuring device according to the invention, primarily the novelties or the inventive aspects are emphasized.

Fig. II zeigt den Reaktionsablauf in den Meßküvetten wäh rend der verschiedenen Phasen des Meßvorganges. Fig. II shows the course of the reaction in the measuring cuvettes during the various phases of the measuring process.

In Fig. I ist ein Rotor (2) befestigt auf der Achse eines Schrittmotors (1) dargestellt. Der Rotor ist in einer zy linderförmigen Einfassung (4) positioniert, die peltier elementgesteuert (5) beheizt wird. An den Rotorenden be finden sich rinnenartige Aussparungen zur Aufnahme von Meßküvetten (3). Gleichzeitig sind vertikal über der Ba sis der Küvettenlager Schlitze eingefräst. Diese Schlitze ermöglichen einerseits über ein Photometer (7, 9) eine Messung der Lichttransmission während der Rotorpassage. Außerdem kann ein Ultraschallsender (6) über sie eine Vi brationswirkung auf den Reaktionsansatz ausüben.In Fig. I a rotor ( 2 ) is shown attached to the axis of a stepper motor ( 1 ). The rotor is positioned in a cylindrical barrel ( 4 ), which is heated in an element-controlled manner ( 5 ). At the rotor ends there are trough-like recesses for receiving measuring cells ( 3 ). At the same time, slots are milled vertically above the base of the cell storage. On the one hand, these slits enable a measurement of the light transmission during the rotor passage via a photometer ( 7, 9 ). In addition, an ultrasonic transmitter ( 6 ) can exert a bration effect on the reaction mixture.

Das Photometer besteht aus einer Photometerhalterung (11), einer Lichtquelle (7) und einem Lichtsensor (9). Es ist beweglich gelagert und über eine Zahnstange (8) und einen Schrittmotor (10) radiär verschiebbar. Während der Messung können die Meßdaten über einen AD-Wandler ei ner Zentraleinheit zugeführt werden, die gleichzeitig über Schrittmotortreiber eine Schrittmotoransteuerung übernimmt.The photometer consists of a photometer holder ( 11 ), a light source ( 7 ) and a light sensor ( 9 ). It is movably mounted and radially displaceable via a rack ( 8 ) and a stepper motor ( 10 ). During the measurement, the measurement data can be supplied via an AD converter to a central unit, which at the same time takes over a stepper motor control via stepper motor drivers.

In Fig. II ist der Sedimentationsvorgang in Meßküvetten simuliert. In der Küvette links oben ist die Situation bei Rotorstillstand wiedergegeben. Dabei lagert der Reak tionsansatz der Schwerkraft folgend am Küvettenboden. In den Küvetten rechts oben, links unten und rechts unten ist die zunehmende Sedimentation unter Zentrifugalbe schleunigung dargestellt. Insbesondere kommen sedimenta tionsbedingte Transmissionssprünge zur Geltung.In Fig. II the sedimentation process is simulated in measuring cuvettes. The situation when the rotor is at a standstill is shown in the top left of the cuvette. The reaction approach is based on gravity on the bottom of the cuvette. The increasing sedimentation under centrifugal acceleration is shown in the cuvettes at the top right, bottom left and bottom right. In particular, sedimentation-related transmission jumps come into play.

Claims

1. The method and device for measuring the sedimentation kinetics of blood cells, hemagglutinates and anti-gene-antibody complexes under the influence of centrifugal forces, characterized in that test material and reagents are pipetted into a chambered temperature-controlled cuvette rotor system via a pipetting mechanism, then by centrifugation are brought together and whirled up and mixed by mechanical or ultrasonic vibrations and in a last step the sedimentation-related increase in light transmission or decrease in reflection approximately simultaneously in all measuring chambers during continuous centrifugation via one or more gradually radially arranged photometers, reflectometers or row diodes or is detected by a radially movable photometer or reflectometer.

2. Device for performing the method according to claim 1, characterized by a motor or stepper motor benes ( 1 ) rotor system ( 2 ) with channel-like recesses for receiving measuring cells ( 3 ) at the rotor ends, by a device for temperature control or cooling ( 4, 5 ) the cuvettes, through a pipetting system for the supply of test material and reagent, through an ultrasonic transmitter ( 6 ) at the level of the cuvette store, which enables the test material to be whirled up and mixed, and by a stationary or radially movable photometer or reflectometer ( 7, 8, 9, 10, 11 ) at the level of the measuring chambers, which allows measurement of the light transmission or light reflection.

3. Device for performing the method according to An saying 1, characterized by a cuvette ring made of plastic, e.g. B. a disposable item with its central opening is placed on the axis of a rotor by a Pi Pet system for feeding test material and reagent, by a cooling device or Temperature control of the cuvette rim, using an Ultra sound transmitter at the level of the cell storage and through a stationary or radially movable photometer or Re flectometer at the level of the cuvette base.

4. Apparatus according to claim 2 or 3, characterized in that the rotor system ( 2 ) or the cuvette ring is positioned in a cylindrical casing ( 4 ), the material of which has a high Wärmeleitfä ability and whose temperature controls peltierelementge ( 5 ) is set.

5. Apparatus according to claim 2 or 3, characterized in that the photometer from a monochromatic light source ( 7 ), for. B. in the form of a laser, from a light sensor ( 9 ), for. B. in the form of a photomultiplier, a photoresistor, a photo transistor or a photocell, and consists of a photo meter holder ( 11 ).

6. Apparatus according to claim 2 or 3, characterized in that the photometer or reflectometer on a rack ( 8 ) attached stepper motor driven ( 10 ) can be moved radially to align the rotor system or the cuvette ring.

7. The device according to claim 2 or 3, characterized in that the cuvettes ( 3 ) or cuvette rings used have separate sample holder, reagent and measuring chambers.

8. The device according to claim 2 or 3, characterized by an integrated washing position for Cleaning the pipetting system and to avoid Procrastination reactions.

9. The device according to claim 2 or 3, characterized in that in the pipetting system Automatic pick-up and drop mechanism of pipette tips is integrated and thus by Pi pette change between pipetting steps a Ver dragging reaction is avoided.

10. The device according to claim 2 or 3, characterized in that the dispenser of the pipette systems has a Hamilton, the volumes up to 20 µl can be dosed with sufficient accuracy.

11. The device according to claim 2 or 3, characterized by heated incubator blocks for opening taking test material and reagents into which Magnetic stirrer systems are integrated.