DE4021063A1 - NEW SS GALACTOSIDASE SUBSTRATES FOR THE CEDIA - Google Patents

NEW SS GALACTOSIDASE SUBSTRATES FOR THE CEDIA

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DE4021063A1
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Abstract

Compound of the general formula <IMAGE> in which R represents CF3 or CN, and processes for their preparation and use as beta -galactosidase substrate, in particular in a CEDIA system.

Description

Die Messung niedrigkonzentrierter Analyten in Körperflüssigkeiten wie z. B. Blut, Serum oder Urin erfordert hochempfindliche Testmethoden, wie sie z. B. in Immunoassays angeboten werden. Das Nachweissystem von bestimmten Immunotests beruht darauf, daß im Detektionsschritt die Reaktion des Markerenzyms β-Galactosidase mit einem chromogenen Enzymsubstrat erfolgt. Die Extinktion des freigesetzten Farbstoffs gibt dann einen direkten Hinweis auf die Menge des nachzuweisenden Analyten. Zur Erreichung hoher Sensitivität ist der Einsatz empfindlicher Enzymsubstrate erforderlich, die sowohl bezüglich ihrer enzymatischen Spaltung als auch in den spektralen Eigenschaften des freizusetzenden Chromophors den testspezifischen Anforderungen genügen.The measurement of low-concentration analytes in body fluids such as As blood, serum or urine requires highly sensitive Test methods, such as. B. offered in immunoassays become. The detection system of certain immunoassays is based in that in the detection step, the reaction of the marker enzyme β-galactosidase with a chromogenic enzyme substrate he follows. The extinction of the liberated dye gives then a direct indication of the amount of evidence Analytes. To achieve high sensitivity is the use sensitive enzyme substrates are required, both in terms of their enzymatic cleavage as well as in the spectral Characteristics of the chromophore to be released from the test-specific Requirements met.

Der CEDIA beruht auf der Asszoziierung von zwei enzymatisch inaktiven β-Galactosidase-Fragmenten zu einem aktiven Gesamtenzym. Diese beiden Fragmente, ein sogenannter Enzymdonor und Enzymakzeptor, sind durch gentechnische Verfahren herstellbar. Für den CEDIA geeignete Donoren und Akzeptoren sind im US-Patent 47 08 929 offenbart.The CEDIA is based on the association of two enzymatically inactive β-galactosidase fragments to an active whole enzyme. These two fragments, a so-called enzyme donor and Enzyme acceptor can be produced by genetic engineering methods. For the CEDIA suitable donors and acceptors are in U.S. Patent 4,708,929.

Der CEDIA beruht darauf, daß ein Hapten kovalent an den Enzymdonor gebunden wird, und zwar auf eine Weise, daß die spontane Reassoziierung der Enzymfragmente zu einem aktiven Enzym nicht behindert wird. Bei Bindung eines haptenspezifischen Antikörpers an das Konjugat aus Hapten und Enzymdonor wird jedoch die Komplementation von Enzymdonor und -akzeptor inhibiert. Der haptenspezifische Antikörper reguliert somit die Menge der sich bildenden aktiven β-Galactosidase. Diese wird photometrisch durch die Hydrolyse entsprechender chromogener Substrate quantitativ bestimmt. Eine ausführlichere Beschreibung des CEDIA-Systems und seiner möglichen Anwendung ist einem Artikel von Khanna und Worthy (American Clinical Laboratory, October 1989) zu entnehmen. The CEDIA relies on a hapten covalently attached to the enzyme donor is bound, in a way that the spontaneous reassociation of the enzyme fragments into an active one Enzyme is not hindered. When binding a haptenpezifischen Antibody to the conjugate of hapten and enzyme donor However, the complementation of enzyme donor and acceptor inhibited. The hapten-specific antibody thus regulates the amount of active β-galactosidase that forms. These becomes photometrically more chromogenic by the hydrolysis Determined substrates quantitatively. A more detailed one Description of the CEDIA system and its possible application is an article by Khanna and Worthy (American Clinical Laboratory, October 1989).  

Das Kriterium für die Qualität eines chromogenen Substrats für den CEDIA wird anhand des dynamischen Meßbereiches ausgedrückt, der sich besonders durch die Steigung einer durch zwei Kalibratoren resultierenden Eichkurve beschreiben läßt. Dazu ist es wichtig, daß das Substrat (a) einen hohen Extinktionskoeffizienten und (b) eine hohe enzymatische Spaltrate durch die β-Galactosidase aufweist.The criterion for the quality of a chromogenic substrate for the CEDIA is expressed by the dynamic range, especially due to the slope of a through describe two calibrators resulting calibration curve. For this, it is important that the substrate (a) has a high extinction coefficient and (b) a high enzymatic cleavage rate by the β-galactosidase.

Das US-Patent 47 08 929 offenbart 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid als chromogenes Enzymsubstrat für den CEDIA. Ein erheblicher Nachteil dieses Substrats ist jedoch seine geringe Sensitivität. Für die Bestimmung niedrigkonzentrierter Analyten in einer Lösung bestand daher ein Bedürfnis, verbesserte chromogene Substrate zu entwickeln.US Pat. No. 4,708,929 discloses 2-nitrophenyl-.beta.-D-galactopyranoside as a chromogenic enzyme substrate for the CEDIA. On However, a significant disadvantage of this substrate is its low Sensitivity. For the determination of low concentration Analytes in a solution therefore had a need to be improved to develop chromogenic substrates.

Als verbesserte β-Galactosidase-Substrate werden in der EP-A-2 92 169 2-Halogen-4-nitrophenylgalactoside beschrieben. Für einen Einsatz im CEDIA werden diese Substanzen allerdings nicht in Betracht gezogen.As improved β-galactosidase substrates are described in EP-A-2 92 169 2-Halogen-4-nitrophenylgalactosides described. For a use in the CEDIA, however, these substances not considered.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, verbesserte β-Galactosidasesubstrate, insbesondere zur Verwendung im CEDIA zu entwickeln.The object of the present invention was to provide improved β-galactosidase substrates, especially for use in the CEDIA to develop.

Erfindungsgemäß werden als verbesserte β-Galactosidase-Substrate Verbindungen der allgemeinen Formel I bereitgestellt,According to the invention are as improved β-galactosidase substrates Compounds of the general formula I are provided,

worin R CF₃ oder CN bedeutet. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden als 2-Trifluormethyl-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid bzw. 2-Cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid bezeichnet. wherein R is CF₃ or CN. The compounds of the invention are as 2-trifluoromethyl-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside or 2-cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside designated.  

Weiterhin ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung. Günstigerweise geht man von einer Ausgangsverbindung der allgemeinen FormelFurthermore, an object of the present invention is a Process for the preparation of a compound according to the invention. Conveniently, starting from a starting compound of general formula

aus, worin R CF₃ oder CN bedeutet. In diese Verbindung II wird eine Nitrogruppe in p-Stellung zur Hydroxygruppe am aromatischen Ring eingeführt, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formelin which R is CF₃ or CN. In this compound II is a nitro group in p-position to the hydroxy group on introduced aromatic ring, so that a compound of general formula

erhält. Die Verbindung III kann anschließend mit Silberoxid und Acetobromgalactose umgesetzt werden, wobei ein acetyliertes β-D-Galactopyranosid entsteht. Durch Abspaltung der Acetylgruppen erhält man das Endprodukt I.receives. The compound III can subsequently with silver oxide and acetobromogalactose are reacted, with an acetylated one β-D-galactopyranoside is formed. By cleavage of the acetyl groups you get the final product I.

Zur Herstellung von 2-Trifluormethyl-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid nitriert man zunächst 2-Trifluormethylphenol mit einem Gemisch aus konzentrierter Salpeter- und Schwefelsäure und gewinnt das entstehende 2-Trifluormethyl-4-nitrophenol. Dieses wird mit Silberoxid und Acetobromgalactose umgesetzt. Durch diese Reaktion entsteht ein acetyliertes Produkt, das durch Behandlung mit Alkali (z. B. Natriummethylat) unter Abspaltung der Acetylgruppen in das Endprodukt überführt werden kann. For the preparation of 2-trifluoromethyl-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside first nitrated with 2-trifluoromethylphenol a mixture of concentrated nitric and sulfuric acid and recover the resulting 2-trifluoromethyl-4-nitrophenol. This is reacted with silver oxide and acetobromogallactose. This reaction produces an acetylated product, the by treatment with alkali (eg sodium methylate) Cleaved the acetyl groups in the final product can be.  

2-Cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid ist durch ein analoges Verfahren erhältlich. Dazu geht man von 2-Hydroxybenzonitril aus, das zu 2-Hydroxy-5-nitro-benzonitril mit einem Gemisch aus konzentrierter Schwefel- und Salpetersäure umgesetzt wird. Das entstehende Produkt wird wiederum mit Silberoxid und Acetobromgalactose umgesetzt, wobei ein acetyliertes Zwischenprodukt entsteht. Daraus wiederum ist das Endprodukt durch Acetylgruppenabspaltung erhältlich.2-cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside is characterized by a analogous method available. This is done by 2-hydroxybenzonitrile from that to 2-hydroxy-5-nitro-benzonitrile with a mixture of concentrated sulfuric and nitric acid is implemented. The resulting product will turn with Reacted with silver oxide and acetobromogalactose, being an acetylated Intermediate product is formed. That in turn is that End product by Acetylgruppenabspaltung available.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind insbesondere zur Verwendung als β-Galactosidase-Substrat geeignet. Dabei ist besonders bevorzugt, wenn die β-Galactosidase aus 2 Polypeptidfragmenten besteht, die nur bei Assoziation enzymatisch aktiv sind, während sie alleine im wesentlichen keine enzymatische Aktivität besitzen. Unter "im wesentlichen keine enzymatische Aktivität" ist zu verstehen, daß die enzymatische Restaktivität der einzelnen β-Galactosidase-Fragmente für eine Interferenz mit dem CEDIA zu gering ist. Derartige β-Galactosidase-Donor- und Akzeptor-Fragmente sind im US-Patent 47 08 929 offenbart. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als β-Galactosidase-Substrate in einem CEDIA-System. Dabei ergeben sich die besten Ergebnisse in einem T4-CEDIA-Test, wobei Tyroxin T4 als kovalent an den Enzymdonor gebundenes Hapten verwendet wird (siehe US-Patent 47 08 929).The compounds according to the invention are in particular for Use as β-galactosidase substrate suitable. It is particularly preferred when the β-galactosidase consists of 2 polypeptide fragments which is enzymatic only at association while they are essentially essentially enzymatic ones, they are active Own activity. By "essentially no enzymatic Activity "is to be understood that the enzymatic Residual activity of the individual β-galactosidase fragments for interference with the CEDIA is too low. Such β-galactosidase donor and acceptor fragments are in the US patent 47 08 929 discloses. Most preferred is the use the compounds of the invention as β-galactosidase substrates in a CEDIA system. This results in the best Results in a T4-CEDIA test, with Tyroxin T4 being covalent hapten bound to the enzyme donor is used (see US Patent 47 08 929).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probelösung mit einem CEDIA-System, wobei man als Nachweisenzym β-Galactosidase und als β-Galactosidase-Substrat 2-Trifluormethyl-4- nitrophenyl-β-D-galactopyranosid und/oder 2-Cyano-4-nitrophenyl- β-D-galactopyranosid verwendet.Another object of the invention is further a method for detecting an analyte in a sample solution with a CEDIA system, where as a detection enzyme β-galactosidase and as β-galactosidase substrate 2-trifluoromethyl-4- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside and / or 2-cyano-4-nitrophenyl β-D-galactopyranoside used.

Ferner beinhaltet die Erfindung auch ein Reagenz zur Bestimmung eines Analyten mit einem CEDIA-System, wobei man als β-Galactosidase-Substrat 2-Trifluormethyl-4-nitrophenol-β-D-galactopyranosid oder/und 2-Cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid verwendet.Furthermore, the invention also includes a reagent for determination an analyte with a CEDIA system, which is called β-galactosidase substrate 2-trifluoromethyl-4-nitrophenol-β-D-galactopyranoside  and / or 2-cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside used.

Vergleicht man die erfindungsgemäßen neuen Substrate mit dem im CEDIA bislang eingesetzten o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid, so findet man, daß die erfindungsgemäßen Substrate bezüglich ihrer enzymatischen Spaltrate und der Sensitivität gegenüber dem Substrat gemäß dem Stand der Technik deutlich überlegen sind.Comparing the new substrates of the invention with the o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside previously used in CEDIA, it is thus found that the substrates according to the invention in terms of their enzymatic cleavage rate and sensitivity relative to the substrate according to the prior art are superior.

Weiterhin wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Substrate auch dem 2-Chlor-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid gemäß EP-A 2 92 169 überlegen sind.Furthermore, it was found that the substrates of the invention also the 2-chloro-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside according to EP-A 2 92 169 are superior.

Die Erfindung soll im weiteren durch die folgenden Beispiele erläutert werden.The invention will be further illustrated by the following examples be explained.

Beispiel 1example 1 Herstellung von 2-Cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosidPreparation of 2-cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside 1) 2-Hydroxy-5-nitro-benzonitril1) 2-hydroxy-5-nitrobenzonitrile

Zu 24 g (0,2 mol) 2-Hydroxy-benzonitril in 20 ml Wasser tropft man innerhalb von einer Stunde bei 10°C eine Lösung aus 70 ml 40%iger Salpetersäure und 10 ml konz. Schwefelsäure. Anschließend rührt man 24 Stunden bei 20°C und schüttelt dann mit 100 ml Ethylacetat aus. Nach dem Eindampfen des organischen Lösungsmittels wird der feste Rückstand noch 2× mit je 500 ml kochendem n-Hexan extrahiert. Die Aufreinigung erfolgt durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Kieselgel 60; Elutionsmittel Ethylacetat).To 24 g (0.2 mol) of 2-hydroxybenzonitrile in 20 ml of water is added dropwise within 1 hour at 10 ° C, a solution from 70 ml of 40% nitric acid and 10 ml conc. Sulfuric acid. Then it is stirred for 24 hours at 20 ° C and shakes then with 100 ml of ethyl acetate. After evaporation of the of organic solvent, the solid residue is still 2 × extracted with 500 ml of boiling n-hexane. The purification is carried out by column chromatography on silica gel (silica gel 60; Eluent ethyl acetate).

Nach Eindampfen des Lösungsmittels und Kristallisation aus Ethylacetat/Toluol erhält man 2 g des Produktes als weiße Kristalle.After evaporation of the solvent and crystallization from Ethyl acetate / toluene gives 2 g of the product as white Crystals.

DC (Kieselgel 60; Ethylacetat): RF = 0,11
UV-Spektrum (in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0):
λmax = 376 nm (ε = 15 700 l/molcm).TLC (Kieselgel 60; ethyl acetate): RF = 0.11
UV spectrum (in 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0):
λ max = 376 nm (ε = 15 700 l / molcm).

2) 2-Cyano-4-nitrophenyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosid2) 2-cyano-4-nitrophenyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranoside

Eine Lösung aus 1 g (6,1 mmol) 2-Hydroxy-5-nitro-benzonitril in 200 ml trockenem Acetonitril wird mit 1,5 g (6,6 mmol) Silberoxid versetzt und 3 Stunden bei 20°C gerührt. Anschließend gibt man bei gleicher Temperatur eine Lösung von 2,7 g (6,6 mmol) Acetobromgalactose in 80 ml trockenem Acetonitril dazu und läßt 16 Stunden bei Raumtemperatur rühren. Die Silbersalze filtriert man über einen Seitzfilter ab und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Das Rohprodukt wird aus Aceton/Wasser umkristallisiert.A solution of 1 g (6.1 mmol) of 2-hydroxy-5-nitro-benzonitrile in 200 ml of dry acetonitrile with 1.5 g (6.6 mmol) Silver oxide added and stirred at 20 ° C for 3 hours. Subsequently at the same temperature give a solution of 2.7 g (6.6 mmol) of acetobromogallactose in 80 ml of dry acetonitrile and allowed to stir for 16 hours at room temperature. The silver salts are filtered off via a Seitz filter and The filtrate is evaporated to dryness. The crude product is out Reconstituted acetone / water.

Ausbeute: 2,9 g (96%)
DC (Kieselgel 60; Toluol/Ethylacetat = 2/1): RF = 0,27.Yield: 2.9 g (96%)
TLC (Kieselgel 60; toluene / ethyl acetate = 2/1): RF = 0.27.

3) 2-Cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid3) 2-cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside

2,9 g (5,8 mmol) des acetylierten Produktes aus 2) wird in 10 ml absolutem Methanol gelöst und mit 4 ml einer gesättigten Natriummethylatlösung versetzt. Man läßt bis zur vollständigen Umsetzung (ca. 1 Stunde, DC-Kontrolle) bei 20°C rühren, filtriert den Niederschlag ab, wäscht mit wenig kaltem Methanol und trocknet bei 40°C im Vakuum.2.9 g (5.8 mmol) of the acetylated product from 2) is dissolved in 10 ml Dissolved absolute methanol and saturated with 4 ml Sodium methylate solution added. It is allowed to complete Stir reaction (about 1 hour, TLC check) at 20 ° C, The precipitate is filtered off, washed with a little cold methanol and dried at 40 ° C in vacuo.

Ausbeute: 1,0 g (53%)
DC (Kieselgel 60; Chloroform/Methanol = 3/1): RF = 0,35
1H-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 8,70 (d, J = 3 Hz; 1H), 8,49 (dd, J = 3 Hz, 9 Hz; 1H), 7,55 (d, J = 9 Hz; 1H), 5,36-5,26 (m; 2H), 4,94 (d, J = 7 Hz; 1H), 4,70-4,60 (m; 2H), 3,75-3,40 (m, 6H)
Massenspektrum: m/e = 326 (neg. FAB). Yield: 1.0 g (53%)
TLC (Kieselgel 60, chloroform / methanol = 3/1): RF = 0.35
1H-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 8.70 (d, J = 3 Hz, 1H), 8.49 (dd, J = 3 Hz, 9 Hz, 1H), 7, 55 (d, J = 9Hz, 1H), 5.36-5.26 (m, 2H), 4.94 (d, J = 7Hz, 1H), 4.70-4.60 (m, 2H ), 3.75-3.40 (m, 6H)
Mass spectrum: m / e = 326 (neg. FAB).

Beispiel 2Example 2 Herstellung von 2-Trifluormethyl-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosidPreparation of 2-trifluoromethyl-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside 1) 2-Trifluormethyl-4-nitrophenyl1) 2-trifluoromethyl-4-nitrophenyl

Zu einer Suspension aus 10 g (0,06 mol) 2-Trifluormethylphenol in 30 ml Wasser gibt man unter Eiskühlung innerhalb einer Stunde 20 ml (0,18 mol) 40%ige wäßrige Salpetersäure. Man läßt noch 2 Stunden bei 20°C rühren und schüttelt anschließend mit 100 ml Ethylacetat aus. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen und das Produkt mittels Säulenchromatographie über Kieselgel aufgereinigt (Kieselgel 60; Elutionsmittel Ethylacetat/Petrolether = 1/3).
DC (Kieselgel 60; Ethylacetat/Toluol = 1/2): RF = 0,4420 ml (0.18 mol) of 40% strength aqueous nitric acid are added to a suspension of 10 g (0.06 mol) of 2-trifluoromethylphenol in 30 ml of water with ice cooling within one hour. The mixture is stirred for 2 hours at 20 ° C and then shaken with 100 ml of ethyl acetate. After drying the organic phase over sodium sulfate, the solvent is stripped off on a rotary evaporator and the product purified by column chromatography on silica gel (silica gel 60, eluent ethyl acetate / petroleum ether = 1/3).
TLC (Kieselgel 60; ethyl acetate / toluene = 1/2): RF = 0.44

Die Fraktionen werden gesammelt und am Rotationsverdampfer unter Vakuum eingedampft. Zur weiteren Aufreinigung und Kristallisation wird das Produkt in 100 ml Wasser gelöst und mit 1 N HCl auf pH 2 gestellt. Nach 24 Stunden bei 4°C werden die ausgefallenen Kristalle abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und bei 40°C unter Vakuum getrocknet.The fractions are collected and on a rotary evaporator evaporated under vacuum. For further purification and crystallization the product is dissolved in 100 ml of water and washed with 1N HCl to pH 2. After 24 hours at 4 ° C, the precipitated crystals filtered off, with a little cold water washed and dried at 40 ° C under vacuum.

Ausbeute: 2,3 g (19%)
DC: (Kieselgel 60; Ethylacetat): RF = 0,11
UV-Spektrum (in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0): λmax = 384 nm (ε = 18 800 l/molcm).Yield: 2.3 g (19%)
TLC: (silica gel 60; ethyl acetate): RF = 0.11
UV spectrum (in 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0): λ max = 384 nm (ε = 18,800 l / molcm).

2) 2-Trifluormethyl-4-nitrophenyl 2,3,4,6-tetra-o-acetyl-β-D-galactopyranosid2) 2-trifluoromethyl-4-nitrophenyl 2,3,4,6-tetra-o-acetyl-β-D-galactopyranoside

Die Herstellung erfolgt aus 2 g (9,7 mmol) 2-Trifluormethyl-4-nitrophenol, 4,11 g (10 mmol) Acetobromgalactose und 2,32 g (10 mmol) Silberoxid analog Beispiel 1.2.The preparation is carried out from 2 g (9.7 mmol) of 2-trifluoromethyl-4-nitrophenol, 4.11 g (10 mmol) of acetobromogallactose and 2.32 g (10 mmol) of silver oxide analogously to Example 1.2.

Ausbeute: 2 g (38%)
DC (Kieselgel 60, Toluol/Ethylacetat = 2/1): RF = 0,35.Yield: 2 g (38%)
TLC (silica gel 60, toluene / ethyl acetate = 2/1): RF = 0.35.

3) 2-Trifluormethyl-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid3) 2-trifluoromethyl-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside

2,0 g (3,7 mmol) der acetylierten Verbindung aus 2) wird in 10 ml absolutem Methanol gelöst und mit 4 ml einer gesättigten Natriummethylatlösung versetzt. Man läßt 1 Stunde bei 20°C rühren, neutralisiert mit saurem Ionenaustauscher (Dowex 50 WX 8, H+) und dampft im Vakuum bis zur Trockne ein. Die Aufreinigung erfolgt durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Elutionsmittel Chloroform/Methanol = 3/1).2.0 g (3.7 mmol) of the acetylated compound from 2) is dissolved in Dissolved 10 ml of absolute methanol and saturated with 4 ml Sodium methylate solution added. It is allowed to 1 hour Stir at 20 ° C, neutralized with acidic ion exchanger (Dowex 50 WX 8, H +) and evaporated to dryness in vacuo. The purification is carried out by column chromatography on silica gel (Eluent chloroform / methanol = 3/1).

Ausbeute: 0,25 g (18%)
DC (Kieselgel 60; Chloroform/Methanol = 3/1): RF 0,5
1H-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 8,50 (dd, J = 3 Hz, 9 Hz; 1H), 8,39 (d, J = 3 Hz; 1H), 7,58 (d, J = 9 Hz; 1H), 5,30-5,05 (m; 2H), 5,03-4,83 (m; 1H), 4,80-4,55 (m; 2H), 3,82-3,40 (m; 6H).Yield: 0.25 g (18%)
TLC (Kieselgel 60, chloroform / methanol = 3/1): RF 0.5
1H-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 8.50 (dd, J = 3 Hz, 9 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 3 Hz, 1H), 7, 58 (d, J = 9Hz, 1H), 5.30-5.05 (m, 2H), 5.03-4.83 (m, 1H), 4.80-4.55 (m, 2H) , 3.82-3.40 (m; 6H).

Beispiel 3Example 3

Vergleich der erfindungsgemäßen Substrate 2-Cyano-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (2-CN-4-NPG), 2-Trifluormethyl-4- nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (2-CF3-4-NPG) mit den bereits bekannten Substraten 2-Chlor-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (2-Cl-4-NPG) und 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (oNPG). Comparison of the substrates according to the invention 2-cyano-4-nitrophenyl-.beta.-D-galactopyranoside (2-CN-4-NPG), 2-trifluoromethyl-4- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (2-CF3-4-NPG) with the already known substrates 2-chloro-4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (2-Cl-4-NPG) and 2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG).  

1. Wellenlängen der Absorptionsmaxima der Farbstoffe und die zugehörigen Extinktionskoeffizienten (ε)1. wavelengths of the absorption maxima of the dyes and the associated extinction coefficients (ε)

gemessen in 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 am Absorptionsmaximum des Farbstoffs.measured in 0.1 mol / l potassium phosphate buffer, pH 7.0 at the absorption maximum of the dye.

2. Sensitivitätsvergleich der Substrate bzw. ihrer enzymatischen Spaltrate2. Sensitivity comparison of the substrates or their enzymatic fission rate

Ermittelt wurde die Extinktionänderung pro Minute (mE/min) im Bereich des Absorptionsmaximums (s. Tabelle 1) des jeweiligen Farbstoffes unter Verwendung identischer Mengen des Enzyms β-Galactosidase, genaue Bedingungen siehe Beispiel 4 Punkt II) a) und b).The extinction change per minute (mE / min) was determined in the range of the absorption maximum (see Table 1) of the respective Dye using identical amounts of Enzyme β-galactosidase, for exact conditions see Example 4 Point II) a) and b).

3. Bewertung im T4/CEDIA (CEDIA mit Tyroxin T4 als Hapten und monoklonalen Antikörpern gegen Tyroxin T4)3. Evaluation in T4 / CEDIA (CEDIA with Tyroxin T4 as hapten and monoclonal antibodies to tyroxine T4)

Die Testbedingungen waren wie in Beispiel 4, Punkt I) a) und b). Kriterium für die Bewertung der einzelnen Substrate war die Steigung der Eichkurve. Diese wurde wie in Beispiel 4, Punkt III) a) beschrieben, ermittelt.The test conditions were as in example 4, point I) a) and b). Criterion for the evaluation of the individual substrates was the slope of the calibration curve. This became as in Example 4, Item III) a) described determined.

Beispiel 4Example 4 Untersuchung von Substrat-Analogen für CEDIA Tests-MethodenInvestigation of substrate analogues for CEDIA testing methods

Zwei Testmethoden wurden verwendet.Two test methods were used.

1) Aktivität im T4/CEDIA-Test,
2) Wirksamkeit als Substrate für β-Galactosidase.1) activity in the T4 / CEDIA test,
2) Activity as substrates for β-galactosidase.

I) Durchführung des T4/CEDIA-TestsI) Perform the T4 / CEDIA test

(Definitionen: EA = Enzym Acceptor; ED = Enzym Donor; EA₂₂ = klonierter Enzym-Akzeptor für CEDIA; ED₄ = klonierter Enzym Donor für CEDIA).(Definitions: EA = Enzyme Acceptor; ED = Enzyme Donor; EA₂₂ = cloned enzyme acceptor for CEDIA; ED₄ = cloned enzyme Donor for CEDIA).

Die Begriffe EA₂₂ und ED₄ werden gemäß US-Patent Nr. 47 08 929 verwendet. Dort sind auch die Aminosäure-Sequenzen dieser Polypeptide offenbart. The terms EA₂₂ and ED₄ are described in US Pat. 47 08 929 used. There are also the amino acid sequences of these polypeptides.  

a) Reagenziena) Reagents

1) EA Puffer: - NaH₂PO₄ (20 mmol/l), Na₂HPO₄ (30 mmol/l), [Ethylenbis(oxyethylennitrilo)]tetraessigsäure (EGTA) (18 mmol/l), Sucrose (25 mmol/l), Mg(OAc)₂ (9,67 mmol/l), 4- Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) (150 mmol/l), NaCl (400 mmol/l), L-Methionin (10 mmol/l), Pluronic L-101 (0,05%), Tween 20 (0,05%)m, Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (0,2%), Dithiothreitol (DTT) (0,05 mmol/l), NaN₃ (23 mmol/l). pH 7,4.1) EA buffer: - NaH₂PO₄ (20 mmol / l), Na₂HPO₄ (30 mmol / l), [Ethylenebis (oxyethylenenitrilo)] tetraacetic acid (EGTA) (18 mmol / l), sucrose (25 mmol / l), Mg (OAc) ₂ (9.67 mmol / l), 4- Morpholine propane sulfonic acid (MOPS) (150 mmol / L), NaCl (400 mmol / L), L-methionine (10 mmol / L), Pluronic L-101 (0.05%), Tween 20 (0.05%) m, hydroxypropyl-β-cyclodextrin (0.2%), dithiothreitol (DTT) (0.05 mmol / L), NaN₃ (23 mmol / L). pH 7.4.

2) ED Puffer: - NaH₂PO₄ (42 mmol/l), Na₂HPO₄ (8 mmol/l), NaCl (400 mmol/l), MOPS (0,02 mmol/l), EGTA (10 mmol/l), Tween 20 (0,05%), Pluronic L-101 (0,05%), N-Lauroylsarcosin (0,03%), DTT (0,05 mmol/l), NaN₃ (23 mmol/l). pH 6,5.2) ED buffer: - NaH₂PO₄ (42 mmol / l), Na₂HPO₄ (8 mmol / l), NaCl (400 mmol / L), MOPS (0.02 mmol / L), EGTA (10 mmol / L), Tween 20 (0.05%), Pluronic L-101 (0.05%), N-lauroyl sarcosine (0.03%), DTT (0.05 mmol / L), NaN₃ (23 mmol / L). pH 6.5.

3) EA Reagenz: - Im EA Puffer wurden 546 U/ml EA₂₂, 63 nmol/l monoklonaler Antikörper <T4< (kommerziell erhältlich z. B. von Western Chemical Research Corp., Denver, Colorado, USA, siehe US 47 08 929) und 800 µmol/l ANS (8-Anilinonaphthalin-l-sulfonsäure, Ammoniumsalz) eingesetzt.3) EA Reagent: In the EA buffer 546 U / ml EA₂₂, 63 nmol / l monoclonal antibody <T4 <(commercially available eg from Western Chemical Research Corp., Denver, Colo., USA, see US 47 08 929) and 800 μmol / l ANS (8-anilinonaphthalene-l-sulfonic acid, Ammonium salt) used.

4) ED-Reagenz: - Im ED Puffer wurden als Analyt 115 nmol/l ED₄-Tyroxin T4 Konjugat (Herstellung entsprechend ED-Tyroxin-Konjugat nach US-Patent 47 08 929), und das jeweils getestete β-Galactosidase-Substrat (1 mg/ml) eingesetzt.4) ED reagent: - 115 nmol / l as analyte in the ED buffer ED₄-tyroxine T4 conjugate (preparation according to ED-tyroxine conjugate according to US Patent 47 08 929), and the respectively tested β-galactosidase substrate (1 mg / ml).

b) Methodeb) Method

Der T4/CEDIA wurde auf einem Hitachi 704 Automatic Analyzer mit den folgenden Reagenzmengen und unter den angegebenen Bedingungen durchgeführt:The T4 / CEDIA was powered by a Hitachi 704 Automatic Analyzer with the following reagent amounts and below Conditions performed:

Probenvolumen|12 µlSample volume | 12 μl Reagenz 1 (ED₄-Konjugat + Substrat)Reagent 1 (ED₄ conjugate + substrate) 235 µl235 μl Reagenz 2 (EA₂₂ + MAK)Reagent 2 (EA₂₂ + MAK) 135 µl135 μl GesamvolumenTOTAL volume 382 µl382 μl Meßwellenlängemeasuring wavelength 376/415 nm376/415 nm Temperaturtemperature 37°C37 ° C

ΔE/min wurde im Intervall 9-10 Min. gemessen. ΔE / min was measured at intervals of 9-10 min.  

II) EnzymaktivitätII) enzyme activity a) Reagenziena) Reagents

1) 0,05M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0
2) 10 mmol/l Magnesiumchlorid-Lösung
3) 69,8% (v/v) Mercaptoethanol-Lösung
4) β-Galactosidase (Boehringer Mannheim GmbH, Bestell-Nr. 105 031), 0,3 U/ml in Lösung a)
5) Substrat, 5,9 mg/ml in Lösung a).1) 0.05 M potassium phosphate buffer, pH 7.0
2) 10 mmol / l magnesium chloride solution
3) 69.8% (v / v) mercaptoethanol solution
4) β-galactosidase (Boehringer Mannheim GmbH, Order No. 105 031), 0.3 U / ml in solution a)
5) Substrate, 5.9 mg / ml in solution a).

b) Methodeb) Method

Vorinkubation: folgende Substanzen wurden in Plastik-Küvetten pipettiert:Pre-incubation: the following substances were placed in plastic cuvettes Pipette:

ΔE/min wurde aus dem linearen Bereich berechnetΔE / min was calculated from the linear range

III) Auswertung der Test-ErgebnisseIII) Evaluation of the test results a) CEDIA-Testa) CEDIA test

Für alle Substrate wurden Eichkurven produziert. Von diesen Kurven wurden die Steigungen verglichen.For all substrates calibration curves were produced. Of these Curves were compared to the slopes.

Steigung ausgedrückt als prozentualer Wert des 2-Nitrophenyl-β-galactosids (= 100%) für T4/CEDIASlope expressed as the percentage of 2-nitrophenyl-β-galactoside (= 100%) for T4 / CEDIA

Claims (9)

1. Verbindung der allgemeinen Formel worin R CF₃ oder CN bedeutet.1. Compound of the general formula wherein R is CF₃ or CN. 2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel worin R CF₃ oder CN bedeutet, durch Nitrierung am aromatischen Ring in eine Verbindung der Formel überführt, die entstehende Verbindung III mit Silberoxid und Acetobromgalactose umsetzt und das Endprodukt durch Acetylgruppen-Abspaltung gewinnt. 2. A process for the preparation of a compound according to claim 1, characterized in that a starting compound of the general formula wherein R is CF₃ or CN, by nitration on the aromatic ring in a compound of formula converts the resulting compound III with silver oxide and Acetobromgalactose and the final product by acetyl group cleavage wins. 3. Verfahren zur Herstellung von 2-Trifluormethyl-4-nitrophenyl- β-D-galactopyranosid, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsverbindung 2-Trifluormethylphenol einsetzt.3. Process for the preparation of 2-trifluoromethyl-4-nitrophenyl β-D-galactopyranoside, characterized, that as starting compound 2-trifluoromethylphenol starts. 4. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung von 2-Cyano-4- nitro-phenyl-β-D-galactopyranosid, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsverbindung 2-Hydroxybenzonitril einsetzt.4. The method according to claim 2 for the preparation of 2-cyano-4 nitro-phenyl-β-D-galactopyranoside, characterized, that as starting compound 2-hydroxybenzonitrile starts. 5. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 als β-Galactosidase-Substrat.5. Use of a compound according to claim 1 as a β-galactosidase substrate. 6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die β-Galactosidase aus zwei Polypeptid-Fragmenten besteht, die bei Assoziation enzymatisch aktiv sind, die aber alleine im wesentlichen keine enzymatische Aktivität besitzen.6. Use according to claim 5, characterized, the β-galactosidase consists of two polypeptide fragments which are enzymatically active in association, the but essentially no enzymatic activity alone have. 7. Verwendung nach Anspruch 6 in einem CEDIA-System.7. Use according to claim 6 in a CEDIA system. 8. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probelösung mit einem CEDIA-System, wobei man als Nachweisenzym β-Galactosidase verwendet, dadurch gekennzeichnet, daß man als β-Galactosidase-Substrat 2-Trifluormethyl- 4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid oder/und 2-Cyano-4- nitrophenyl-β-D-galactopyranosid verwendet. 8. Method for detecting an analyte in a sample solution with a CEDIA system, using as a detection enzyme uses β-galactosidase, characterized, that as β-galactosidase substrate 2-trifluoromethyl 4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside or / and 2-cyano-4- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside used.   9. Reagenz zum Nachweis eines Analyten in einer Probelösung mit einem CEDIA-System, wobei das Nachweisenzym β-Galactosidase ist, dadurch gekennzeichnet, daß es als β-Galactosidase-Substrat 2-Trifluormethyl- 4-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid oder/und 2-Cyano-4- nitrophenyl-β-D-galactopyranosid enthält.9. Reagent for detection of an analyte in a sample solution with a CEDIA system, where the detection enzyme is β-galactosidase is characterized, that it acts as β-galactosidase substrate 2-trifluoromethyl- 4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside or / and 2-cyano-4- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside.
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