DE4015735A1

DE4015735A1 - NUCLEOSIDES AS SYNTHONES FOR RNA SYNTHESIS

Info

Publication number: DE4015735A1
Application number: DE4015735A
Authority: DE
Inventors: Volker Prof Dr Erdmann; Mathias Prof Dr Sprinzl; Karsten Dr Henco
Original assignee: DIAGEN INST MOLEKULARBIO
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1990-05-16
Filing date: 1990-05-16
Publication date: 1991-11-21
Also published as: WO1991018002A1

Abstract

Nucleosides are disclosed having formula (I), in which, when B represents guanine or 8-haloguanine, R<1> is an amidine protecting group, in particular the dimethylaminomethylene group (DMM) at the N<2> position of the purine group; R<2> is an alkylsilyl group or methyl group or hydrogen (H); R<3> is a triethylammonium H-phosphonate group, a hydrogen atom or a phosphoramidite group; R<4> is a substituted trityl protecting group or H, or when B represents adenine or 8-azidoadenine, R<1> is an amidine protecting group, in particular the dimethylaminomethylene group (DMM) at the N<6> position of the purine group and R<2>, R<3> and R<4> have the same meanings as when B represents guanine. These compounds are useful as synthones for the chemical synthesis of RNA. When the DMM-protected purine bases adenine and guanine are used, coupling yields above 95 % are obtained.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleoside der FormelThe present invention relates to nucleosides of the formula

als Synthone für die RNA-Synthese sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäuren.as synthons for RNA synthesis and a method for the production of ribonucleic acids.

Neben der Desoxyribonukleinsäure als Träger der genetischen Information spielen die Ribonukleinsäuren eine wichtige Rolle bei der Proteinsynthese im Organismus. Die Ribonukleinsäuren sind ebenfalls ein wichtiges Werkzeug in der Gentechnologie, beispielsweise bei der Aufklärung von Proteinsequenzen über klonierte DNA, da zunächst die mRNA der entsprechenden Proteine isoliert wird, um sogenannte cDNA-Bänke anzulegen. Bei der Suche nach den gewünschten Klonen bedient man sich häufig der Hybridisierungstechnik mit komplementären, synthetisch hergestellten Nukleinsäuren. Anders als bei Desoxyribonukleinsäuren stellt jedoch die synthetische Herstellung von Ribonukleinsäuren ein großes präparatives Problem dar. Ein Grund hierfür liegt in der zusätzlichen Hydroxygruppe des Zuckerrests (Ribose) in der Ribonukleinsäure. Daher ist eine komplizierte Schutzgruppenstrategie erforderlich. Längeren RNA-Strängen wird in Zukunft auch therapeutische Bedeutung zukommen. Bei dem sogenannten antisense RNA-Konzept werden synthetische Gegenstrang-RNA in Zellen eingeschleust, um durch Doppelstrangbildung zum Beispiel virale mRNA biologisch funktionslos zu machen. Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet wird den sogenannten Ribozymen zugeschrieben. Dabei handelt es sich um RNA mit enzymatischen Aktivitäten, deren Einsatz in vivo und in vitro vorstellbar ist.In addition to deoxyribonucleic acid as the carrier of the genetic The ribonucleic acids provide information important role in protein synthesis in the organism. Ribonucleic acids are also an important tool in genetic engineering, for example in education of protein sequences via cloned DNA since first isolated the mRNA of the corresponding proteins to create so-called cDNA banks. When searching after the desired clones one often uses the Hybridization technology with complementary, synthetic prepared nucleic acids. Unlike with deoxyribonucleic acids represents the synthetic manufacture of ribonucleic acids is a major preparative problem One reason for this is the additional Hydroxy group of the sugar residue (ribose) in the ribonucleic acid. Therefore, it is a complicated protecting group strategy required. Longer RNA strands will be in The future will also have therapeutic significance. In which so-called antisense RNA concept are synthetic Counter-stranded RNA introduced into cells by double-stranding for example viral biological mRNA to make it inoperable. Another important area of application is attributed to the so-called ribozymes. This is RNA with enzymatic activities, their use in vivo and in vitro is conceivable is.

Um eine Synthese auch längerer RNA-Stränge wirtschaftlich vertretbar zu gestalten, ist es erforderlich, möglichst hohe Ausbeuten der einzelnen Reaktionsschritte der RNA-Synthese zu erzielen. Interessant sind Ausbeuten von höher als 95% pro Reaktionsschritt. Problematisch hierbei ist die Abspaltung der Schutzgruppen. Stawinski, J. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16, 9285-9289, beschreibt Schutzgruppen für automatische RNA-Synthesen, wobei Guanin mit der Isobutyryl-Schutzgruppe an Position N² des Purinsystems geschützt ist. Die Abspaltung der Gruppe erfolgt unvermeidbar bei 55°C. Es tritt unter diesen Bedingungen störend die Abspaltung der Silylschutzgruppen an der 2′-O-Position des Riboserests auf. Zum Beispiel wird die 2′-O-t-Butyldimethylsilylgruppe abgespalten. Dies wäre nur bei Anwendung milderer Bedingungen vermeidbar. Wu, T. et al. (1989), Nucl. Acids Res. 17, 3501-3517, bedient sich der aus der DNA-Chemie bekannten Phenoxyacetylschutzgruppe (Schulhof, J. C. et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15, 397-416), um eine Ausbeutesteigerung zu erzielen. Dies gelingt bei der RNA-Synthese nur bedingt. Die Ausbeute beläuft sich lediglich auf 25 bis 35%. Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist die schwierige Aufarbeitung der phenoxyacetylierten Monomere.To synthesize longer RNA strands economically to make it acceptable, it is necessary, if possible high yields of the individual reaction steps of RNA synthesis. Yields are interesting of higher than 95% per reaction step. Problematic here is the splitting off of the protective groups. Stawinski, J. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16, 9285-9289, describes protection groups for automatic RNA syntheses, using guanine with the isobutyryl protecting group is protected at position N² of the purine system. The split-off of the group is inevitable at 55 ° C. Under these conditions, it occurs disruptively Cleavage of the silyl protecting groups at the 2′-O position of the ribose residue. For example, the 2'-O-t-butyldimethylsilyl group cleaved. This would only be the case with Avoid application of milder conditions. Wu, T. et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17, 3501-3517 the phenoxyacetyl protective group known from DNA chemistry (Schulhof, J.C. et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15, 397-416) in order to increase the yield. This is only partially successful with RNA synthesis. The Yield is only 25 to 35%. A Another disadvantage of this method is the difficult one Working up of the phenoxyacetylated monomers.

Es ist bei der Schutzgruppenstrategie zu beachten, daß ausgehend von den jeweiligen Ribonukleosiden zunächst die nukleophilen Stickstoffatome des Purinrests blockiert werden müssen, woraufhin dann die Hydroxygruppen des Zuckerrests, der Ribose, chemisch modifiziert werden.With the protection group strategy it should be noted that starting from the respective ribonucleosides first blocked the nucleophilic nitrogen atoms of the purine residue then the hydroxy groups of the sugar residue, the ribose, can be chemically modified.

Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Ribonukleinsäuren. Das Verfahren soll wirtschaftlich, selektiv und bei der automatischen RNA-Herstellung einsetzbar sein. Ein weiteres technisches Problem ist die Bereitstellung verbesserter Synthone für die RNA-Herstellung, nämlich der an den entsprechenden N-Atomen geschützten Purinreste Adenyl und Guanosyl. Ein weiteres technisches Problem ist die Stabilität der zur automatisierten RNA-Synthese verwendeten Synthone. So entwickelten Ogilvie et al. eine automatisierte RNA- Synthese, die mit einer durchschnittlichen Kopplungseffizienz von 96% arbeitet. Dabei verwendeten sie die Phosphoramidit-Chemie (Usman, N. et al. (1987), J. Am. Chem. Soc. 109, 7845-7854; Ogilvie, K. K. et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5764-5768; Perreault, J.-P. et al. (1989), Eur. J. Biochem. 186, 87-93; Lehmann, C. et al. (1989), Nucl. Acids Res. 17, 2379-2390; Iwai, S. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16, 9443-9456). Nachteilig an dieser Methodik tritt die Labilität der Synthone in Erscheinung. Es ist nicht möglich, die Ausgangschemikalien zu lagern bzw. sie wiederzugewinnen, denn bei der Synthese von RNA müssen große Überschüsse der Reagenzien verwendet werden, um überhaupt befriedigende Ausbeuten zu erzielen. Das gilt auch für die bei DNA hochreaktiven Phosphoramidite. Die O-Funktion der RNA setzt die Reaktivität der Phosphoramidite in der Kopplungsreaktion herab. Im Gegensatz zu Desoxyribonukleotiden muß vor der Aktivierung der 3′-O-Funktion die 2′-O-Funktion geschützt werden. Das 2′,3′-Isomerengemisch stellt bei der Verwendung bekannter Schutzgruppen ein nur sehr mühsam zu trennendes Gemisch dar. Die Schwierigkeiten beruhen zum Beispiel auf Löslichkeitsproblemen bei der präparativen Chromatographie. The technical problem underlying the invention is the provision of a manufacturing process of ribonucleic acids. The process should be economical, selective and in automatic RNA production be applicable. Another technical problem is to provide improved synthons for the RNA production, namely that of the corresponding N-atom protected purine residues adenyl and guanosyl. Another technical problem is the stability of the synthons used for automated RNA synthesis. For example, Ogilvie et al. an automated RNA Synthesis with an average coupling efficiency of 96% works. They used the Phosphoramidite chemistry (Usman, N. et al. (1987), J. Am. Chem. Soc. 109, 7845-7854; Ogilvie, K.K. et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5764-5768; Perreault, J.-P. et al. (1989), Eur. J. Biochem. 186, 87-93; Lehmann, C. et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17, 2379-2390; Iwai, S. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16, 9443-9456). A disadvantage of this methodology is the instability of the Synthone in appearance. It is not possible to use the source chemicals to store or recover them, because in the synthesis of RNA large surpluses are required of the reagents used to be satisfactory at all To achieve yields. This also applies to the at DNA highly reactive phosphoramidites. The O function of the RNA sets the reactivity of the phosphoramidites in the Coupling reaction down. In contrast to deoxyribonucleotides must be activated before the 3'-O function the 2′-O function are protected. The 2 ', 3'-isomer mixture represents when using known protecting groups is a very difficult to separate mixture Difficulties are based, for example, on solubility problems in preparative chromatography.

Die Synthone für die RNA-Synthese, die diese technischen Probleme lösen, sind Nukleoside der FormelThe synthons for RNA synthesis that this technical Solving problems are nucleosides of the formula

wobei, wennwhere if

B = Guanin oder 8-Haloguanin,
R¹ eine Amidinschutzgruppe, insbesondere die Dimethylaminomethylengruppe (DMM) an Position N² des Purinrests,
R² eine Alkylsilylgruppe oder Methoxygruppe oder Wasserstoff (H),
R³ eine Triethylammonium H-Phosphonatgruppe, ein Wasserstoffatom oder eine Phosphoramiditgruppe,
R⁴ eine substituierte Tritylschutzgruppe oder H ist,B = guanine or 8-haloguanine,
R¹ is an amidine protecting group, especially the dimethylaminomethylene group (DMM) at position N² of the purine residue,
R² is an alkylsilyl group or methoxy group or hydrogen (H),
R³ is a triethylammonium H-phosphonate group, a hydrogen atom or a phosphoramidite group,
R⁴ is a substituted trityl protecting group or H,

und wobei, wenn
B = Adenin oder 8-Azidoadenin,
R¹ eine Amidinschutzgruppe, insbesondere die Dimethylaminomethylengruppe (DMM) an N⁶ des Purinrests ist und
R², R³ und R⁴ wie bei B = Guanin sind.and where if
B = adenine or 8-azidoadenine,
R¹ is an amidine protecting group, especially the dimethylaminomethylene group (DMM) at N⁶ of the purine residue and
R², R³ and R⁴ are as for B = guanine.

Vorzugsweise weisen die Nukleoside als Alkylsilylgruppe den t-Butyldimethylsilylrest und als substituierte Tritylgruppe den 4,4′-Dimethoxytritylrest auf. Gegenstand der Erfindung sind somit auch Ribonukleinsäuren aus mindestens zwei Ribonukleinsäure-Nukleosiden enthaltend als Nukleosid mindestens eine der Verbindungen nach der oben angegebenen Formel.The nucleosides preferably have an alkylsilyl group the t-butyldimethylsilyl radical and as a substituted trityl group the 4,4'-Dimethoxytritylrest on. object The invention thus also ribonucleic acids containing at least two ribonucleic acid nucleosides as nucleoside at least one of the compounds according to the formula given above.

Zur Herstellung der Verbindungen der Formel wird die DMM-Gruppe in die A/G-Nukleoside eingeführt. Danach wird die 5′-Position der Ribose mit einer Tritylschutzgruppe geschützt, gefolgt von der Silylierung an 2′-Position der Ribose, Tritylierung der 5′-Funktion sowie Phosphonierung an 3′-Position. Das Verfahren kann vorzugsweise als sogenannte Eintopfreaktion durchgeführt werden, wobei mit dem entsprechenden Nukleosid des Adenins oder Guanins begonnen wird und die Schutzgruppen schrittweise angefügt werden.To prepare the compounds of the formula DMM group introduced into the A / G nucleosides. After that the 5'-position of the ribose with a trityl protecting group protected, followed by silylation at the 2′-position the ribose, tritylation of the 5'-function as well Phosphonation at the 3'-position. The method can preferably carried out as a so-called one-pot reaction be, with the corresponding nucleoside of adenine or guanine is started and the protecting groups be added gradually.

Nach der Einfügung der Dimethylaminomethylengruppe an N²-Position des Guanosins und N⁶-Position des Adenosins können die resultierenden N-geschützten Nukleoside in einfacher Weise durch klassische 4,4′-Dimethoxytritylgruppen geschützt werden. die 2′-Hydroxygruppe der Ribose wird vorzugsweise durch die t-Butyldimethylsilylgruppe blockiert. Anschließende Silylierung des 5′-O- (4,4′-Dimethoxytrityl)-N²-Dimethylaminomethylenguanosins ergab überwiegend (zu 68%) die gewünschte 2′-O-silylierte Verbindung, die in einfacher Weise an Silicagel in einem Laufmittelgemisch von Chloroform/2-Propanol als Elutionsmittel gereinigt werden konnte. Die Dimethylaminomethylen (DMM)-Schutzgruppe kann durch Behandlung mit wäßrigem Ammoniak/Methanol vorzugsweise bei Raumtemperatur während einer Zeit von vorzugsweise 20 Stunden abgespalten werden. Der Reaktionsverlauf kann durch UV-Spektroskopie bei 300 nm verfolgt werden. Während dieser Reaktion sind die anderen Schutzgruppen stabil, und kein anderes Reaktionsprodukt konnte nachgewiesen werden. Die Behandlung mit wäßriger Ammoniak/Ethanol- Lösung bei Raumtemperatur für die Dauer von 20 Stunden stellt ebenfalls eine Bedingung dar, die für die Abspaltung der Schutzgruppen bei RNA-Oligonukleotiden Anwendung finden kann. Die 2′-O-t-Butyldimethylsilylgeschützte RNA ist unter diesen Bedingungen stabil. Für die Herstellung des entsprechenden Adenosinderivats geht man entsprechend vor. Die Herstellung der beiden geschützten Purinderivate verläuft ohne Umwege und kann als Eintopfreaktion durchgeführt werden, indem man mit den entsprechenden Nukleosiden beginnt und schrittweise durch Zugabe der entsprechenden Reagenzien bei dem leicht zu trennenden Gemisch aus den 2′- und 3′-silylierten Verbindungen endet.After the insertion of the dimethylaminomethylene group N² position of guanosine and N⁶ position of adenosine can the resulting N-protected nucleosides in simple way through classic 4,4'-dimethoxytrityl groups to be protected. the 2'-hydroxy group of ribose is preferably by the t-butyldimethylsilyl group blocked. Subsequent silylation of the 5′-O- (4,4'-Dimethoxytrityl) -N²-dimethylaminomethylene guanosine predominantly (68%) gave the desired 2′-O-silylated Compound that is easily attached to silica gel a solvent mixture of chloroform / 2-propanol as Eluent could be cleaned. The dimethylaminomethylene (DMM) protection group can by treatment with aqueous ammonia / methanol preferably at room temperature for a period of preferably 20 hours be split off. The course of the reaction can by UV spectroscopy can be followed at 300 nm. While this reaction the other protecting groups are stable, and no other reaction product could be detected will. Treatment with aqueous ammonia / ethanol Solution at room temperature for 20 hours also represents a condition for the spin-off of protecting groups in RNA oligonucleotides Can find application. The 2'-O-t-butyldimethylsilylprotected RNA is stable under these conditions. For the preparation of the corresponding adenosine derivative you proceed accordingly. The making of the two protected purine derivatives are straightforward and can be carried out as a one-pot reaction by using the corresponding nucleosides begins and gradually by adding the appropriate reagents to the easy to separate mixture of the 2'- and 3'-silylated Connections ends.

Ein bedeutender Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen sei an dieser Stelle erwähnt. Die Geschwindigkeit der Abspaltung der N⁴-Benzoylschutzgruppe des Cytidins ist sehr ähnlich der entsprechenden Hydrolysegeschwindigkeit der Dimethylaminomethylen(DMM)-Schutzgruppe von Purinen. Dadurch wird die Verwendung des klassischen Synthons N⁴-Benzoylcytidin als Partner in der Synthese von RNA in besonders vorteilhafter Weise ermöglicht.An important advantage of the compounds according to the invention should be mentioned at this point. The speed the cleavage of the N⁴-benzoyl protective group of the cytidine is very similar to the corresponding hydrolysis rate the dimethylaminomethylene (DMM) protective group of purines. This eliminates the use of the classic Synthons N⁴-benzoylcytidine as a partner in Synthesis of RNA made possible in a particularly advantageous manner.

Die Tabelle 1 zeigt besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen.Table 1 shows particularly preferred according to the invention Links.

Tabelle 1 Table 1

Diese geschützten Nukleoside wurden in an sich bekannter Weise in die entsprechenden H-Phosphonate überführt (Stawinski, J. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16, 9285-9298). Die Verbindungen wurden mittels Dünnschichtchromatographie, UV-Spektroskopie und ¹H-NMR charakterisiert. Die wichtigsten kernresonanzspektroskopischen Daten sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.These protected nucleosides became known per se Conversion to the corresponding H-phosphonates (Stawinski, J. et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 9285-9298). The compounds were determined by means of thin layer chromatography, Characterized by UV spectroscopy and 1 H-NMR. The main nuclear magnetic resonance spectroscopic Data are summarized in Table 2.

Tabelle 2 Table 2

Für die Reinheitsanalyse bezüglich der Isomere der geschützten Nukleoside und Nukleotide sind die H2′- und H3′-Signale von großem diagnostischem Wert. Die Zusammenfügung der DMM-H-Phosphonate zu Oligoribonukleotiden wurde vorzugsweise mit 1-Adamantancarbonylchlorid als Kondensationsmittel durchgeführt. Kopplungsausbeuten von <95% wurden mit einem 10- bis 30fachen molaren Überschuß der Reagenzien und 5 bis 30 Minuten Kopplungszeit erzielt. Vorzugsweise wurden bei einem 20fachen molaren Überschuß an Reagenzien und einer Reaktionszeit von 15 Minuten eine Kopplungsausbeute von 97% erreicht. Eine Abspaltung der Schutzgruppen konnte mit wäßrigem Ammoniak/Ethanol erreicht werden. Vorzugsweise wurde das Gemisch 20 Stunden lang dieser Mischung ausgesetzt. Die Hydrolyse der 2′-Schutzgruppe durch Verwendung von vorzugsweise Tetrabutylammoniumfluorid erwies sich als vorteilhaft. Die Geschwindigkeit dieser Schutzgruppenabspaltung kann mittels Umkehrphasen-HPLC (reversed phase) verfolgt werden. Ein homogenes, völlig von Schutzgruppen befreites Oligoribonukleotid kann vorzugsweise nach 12stündiger Inkubation bei Raumtemperatur mittels Gelpermeationschromatographie und Ionen austauscherchromatographie isoliert werden. Gewünschtenfalls kann der letzte Reinigungsschritt mittels HPLC-Chromatographie durchgeführt werden.For the purity analysis regarding the isomers of the protected Nucleosides and nucleotides are the H2′- and H3'-signals of great diagnostic value. The assembly the DMM-H-phosphonates to oligoribonucleotides was preferably with 1-adamantane carbonyl chloride as Condensing agent carried out. Coupling yields of <95% were with a 10- to 30-fold molar Excess reagents and 5 to 30 minutes coupling time achieved. Preferably 20 times molar excess of reagents and a reaction time coupling efficiency of 97% in 15 minutes reached. The protective groups could be split off with aqueous ammonia / ethanol can be achieved. Preferably the mixture was exposed to this mixture for 20 hours. Hydrolysis of the 2'-protecting group through use of preferably tetrabutylammonium fluoride turn out to be beneficial. The speed of this Deprotection can be done by reverse phase HPLC (reversed phase) are tracked. A homogeneous, totally deprotected oligoribonucleotide can preferably after 12 hours of incubation at room temperature using gel permeation chromatography and ions exchange chromatography can be isolated. If desired can the last cleaning step by means of HPLC chromatography can be performed.

Die Fig. 1 zeigt das Ergebnis der Analyse mit Poly acrylamidgelelektrophorese verschiedener Rna-Moleküle. Rohprodukt von verschiedenen RNA-Oligonukleotiden, welche durch chemische Synthese erhalten wurden, verglich man mit einer aus natürlicher Quelle stammenden RNA und einem chemisch synthetisierten DNA-Oligonukleotid (zum Beispiel Sequenz der Mikrohelix^Ala, 5′-GGGGCUAUAGCUCUAGCUCCACCA-3′). Es ergibt sich, daß die enzymatisch und chemisch hergestellten Oligoribonukleotide vergleichbare Reinheit aufweisen. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, daß die Mobilität der Oligoribonukleotide während der Polyacrylamidgelelektrophorese stark abhängig ist von der Sekundärstruktur der Moleküle. Die Fig. 1 enthält 6 Proben, wobei Fig. 1 shows the result of the analysis with poly acrylamide gel electrophoresis of various Rna molecules. The crude product of various RNA oligonucleotides, which were obtained by chemical synthesis, was compared with an RNA from a natural source and a chemically synthesized DNA oligonucleotide (for example, sequence of the microhelix ^Ala , 5′-GGGGCUAUAGCUCUAGCUCCACCA-3 ′). It turns out that the enzymatically and chemically produced oligoribonucleotides are of comparable purity. In this connection it should be mentioned that the mobility of the oligoribonucleotides during polyacrylamide gel electrophoresis is strongly dependent on the secondary structure of the molecules. The Fig. 1 contains 6 samples,

- in column 1 synthetic RNA oligonucleotide crude product the sequence mentioned,
- in column 2 DNA oligonucleotide (18mer) as a marker,
- in column 3 41mer (RNA) from natural source as Marker,
- in column 4 synthetic RNA (7mer),
- in column 5 synthetic RNA (11mer) and
- in column 6 synthetic RNA (7mer)

aufgetragen ist. Dabei treten durch unterschiedliche Konformere gegebenenfalls mehrere Banden auf. is applied. Do this by different If necessary, conform several bands.

Das chemisch synthetisierte 24mer kann durch Alanin-tRNA-Synthetase aus E. coli aminoacyliert werden. Die Ausbeute der Aminoacylierung bei Verwendung eines nicht aufgearbeiteten Reaktionsproduktes ohne chromatographische Reinigung beträgt etwa 16%, wie Fig. 2 zeigt. Dies ist in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die von Ogilvie et al. (Ogilvie, K. K. et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5764-5768; Perreault, J.-P. et al. (1989), Eur. J. Biochem. 186, 87-93) gefunden wurden, die eine synthetische E. coli tRNA^fMet herstellten. Die chemische RNA-Synthese ist gegenüber der enzymatischen vorteilhaft, da sie es ermöglicht, kleinere Nukleotide, mit Isotopen markierte Nukleotide oder Derivate der natürlichen Nukleotide zur Affinitätsmarkierung sowie für spektroskopische Studien einzufügen. Insbesondere betrifft dies 8-Bromoguanin und 8-Azidoadenin als Affinitätsliganden für spezifische Bindungsproteine sowie Inosin und 5-Bromuracil als quervernetztendes Reagenz. Nur mit synthetischen Methoden lassen sich an spezifischen Positionen gezielt bestimmte Analoga der natürlichen Nukleoside einbauen. Mit enzymatischen Methoden läßt sich nur ein statistischer, generalisierter Einbau dieser Analoga realisieren. Nicht abzuschätzen sind darüber hinaus die Einsatzmöglichkeiten synthetisch herstellbarer RNA-Moleküle in Gen- und Biotechnologie.The chemically synthesized 24mer can be aminoacylated by E. coli alanine tRNA synthetase. The yield of the aminoacylation when using an unprocessed reaction product without chromatographic purification is approximately 16%, as shown in FIG. 2. This is in good agreement with the results reported by Ogilvie et al. (Ogilvie, KK et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5764-5768; Perreault, J.-P. et al. (1989), Eur. J. Biochem. 186, 87- 93) were found which produced a synthetic E. coli tRNA ^fMet . Chemical RNA synthesis is advantageous over enzymatic one because it enables the insertion of smaller nucleotides, nucleotides labeled with isotopes or derivatives of natural nucleotides for affinity labeling and for spectroscopic studies. In particular, this relates to 8-bromoguanine and 8-azidoadenine as affinity ligands for specific binding proteins, and inosine and 5-bromouracil as a cross-linking reagent. Specific synthetic analogues of natural nucleosides can only be incorporated at specific positions using synthetic methods. Only a statistical, generalized incorporation of these analogs can be achieved with enzymatic methods. In addition, the possible uses of synthetically producible RNA molecules in gene and biotechnology cannot be estimated.

In überraschend vorteilhafter Weise macht sich die Einführung der DMM-Gruppe auf die Abtrennbarkeit der in 2′- und 3′-geschützten Verbindungen bemerkbar.The introduction is surprisingly advantageous of the DMM group on the separability of the in 2'- and 3'-protected compounds noticeable.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.The following examples illustrate the invention described.

Die Nukleoside wurden von Pharma-Waldhof, Phenoxyacetylchlorid von Janssen, abs. Pyridin, HPLC-Acetonitril, abs. Dichlormethan, N,N-Dimethylformamiddiethylacetal, 4,4′-Dimethoxytritylchlorid, t-Butyldimethylchlorsilan, puriss. Imidazol, Triethylamin (puriss.) von Fluka bezogen und ohne weitere Reinigungsschritte eingesetzt. Phosphortrichlorid wurde als 2M-Lösung in Dichlormethan von Aldrich bezogen. CPG-Basis mit Spacer wurden gemäß Usman, N. et al. (1987), J. Am. Chem. Soc. 109, 7845-7854, aus 5′-O-4,4′-Dimethoxytriphenylmethyl-N-substituierten Ribonukleosiden (35 bis 50 µMol/l g) präpariert. 2′-O-(t-Butyldimethylsilyl)-5′-O-(4,4′-Dimethoxytrityl)- Uridin-3′-H-Phosphonat und 2′-O-(t-Butyldimethylsilyl)- 5′-O-(4,4′-Dimethoxytrityl)-N⁴-Benzoylcytidin-3′-H-Phosphonat wurden synthetisiert nach bekannten Vorschriften (Stawinski, J. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16, 9285-9298). Dünnschichtchromatographie wurde an DC-Kieselgel-Alufolien von Fluka durchgeführt; als Fließmittel dienten s₁=Chloroform/Isopropanol (9 : 1), S₂=Chloroform/ Methanol (9 : 1), S₃=Toluol/Ethylacetat (2 : 1). Die Säulen chromatographie wurde an Kieselgel 60 der Firma Fluka durchgeführt. Dimethoxytrityl-enthaltende Verbindungen wurden detektiert nach Entwicklung der Dünnschichtplatten in Salzsäuredampf. Protonenkernresonanzspektren wurden auf einem Bruker AC300-Spektrometer vermessen. Die Signale beziehen sich auf Deuterochloroform als internen Standard. UV-Spektren wurden auf einem Shimadzu UV-160 (UV/Vis) bestimmt. Die HPLC-Analytik wurde auf einem Beckman System-Gold 180 Pump Model 167 Multiwave- length-UV-Detector gefahren. ür die automatische RNA-Synthese stand ein DNA-Synthesizer von AB/381A von Applied Biosystems zur Verfügung. Adamantancarbonylchlorid und 1M Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran wurden von Fluka bezogen. Dichloressigsäure in Methylenchlorid und Pyridin/Acetonitril (1 : 1, v/v) stammen von Applied Biosystems.The nucleosides were from Pharma-Waldhof, phenoxyacetyl chloride from Janssen, abs. Pyridine, HPLC acetonitrile, Section. Dichloromethane, N, N-dimethylformamide diethylacetal, 4,4'-dimethoxytrityl chloride, t-butyldimethylchlorosilane, puriss. Imidazole, triethylamine (puriss.) Purchased from Fluka and used without further cleaning steps. Phosphorus trichloride was used as a 2M solution in dichloromethane obtained from Aldrich. CPG base with spacer were according to Usman, N. et al. (1987), J. Am. Chem. Soc. 109, 7845-7854, from 5'-O-4,4'-dimethoxytriphenylmethyl-N-substituted Ribonucleosides (35 to 50 µmol / l g) prepared. 2'-O- (t-butyldimethylsilyl) -5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) - Uridine-3'-H-phosphonate and 2'-O- (t-butyldimethylsilyl) - 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -N⁴-benzoylcytidine-3'-H-phosphonate were synthesized according to known regulations (Stawinski, J. et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 9285-9298). Thin layer chromatography was carried out on TLC silica gel aluminum foil performed by Fluka; served as flow agent s₁ = chloroform / isopropanol (9: 1), S₂ = chloroform / Methanol (9: 1), S₃ = toluene / ethyl acetate (2: 1). The pillars Chromatography was carried out on silica gel 60 from Fluka carried out. Dimethoxytrityl containing compounds were detected after development of the thin-film plates in hydrochloric acid vapor. Proton nuclear magnetic resonance spectra were measured on a Bruker AC300 spectrometer. The signals refer to deuterochloroform as internal standard. UV spectra were on a Shimadzu UV-160 (UV / Vis) determined. The HPLC analysis was on a Beckman System Gold 180 Pump Model 167 Multiwave length UV detector driven. for automatic RNA synthesis was a DNA synthesizer from AB / 381A from Applied Biosystems available. Adamantane carbonyl chloride and 1M tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran were sourced from Fluka. Dichloroacetic acid in methylene chloride and pyridine / acetonitrile (1: 1, v / v) are from Applied biosystems.

Example 1 Synthesis of 2'-O- (t-butyldimethylsilyl) -5'-O- (4,4'-di methoxytrityl) -N²-dimethylaminomethylene guanosine (Ia)

Eine Suspension von wasserfreiem Guanosin (10 mMol) in N,N-Dimethylformamid (25 ml) und N,N-Dimethylformamid diethylacetal (6 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Zur klaren Lösung wurde 1 ml Wasser gegeben, und nach 5 Minuten wurde die Lösung mit 100 ml Pyridin verdünnt und im Vakuum zu einem sirupösen Rückstand eingeengt. Es wurden 30 ml Pyridin zugesetzt sowie 11 mMol 4,4′-Dimethyoxytritylchlorid. Die Mischung wurde 10 Minuten gerührt und über Nacht belassen. 1 ml Methanol wurde zugesetzt, und nach 10 Minuten wurde die Mischung im Ölpumpenvakuum eingeengt, bis sich ein Schaum bildete. 20 ml Pyridin und 26 mMol Imidazol wurden zugesetzt, 10 Minuten gerührt und t-Butyldimethylchlorsilan (13 mMol) zugesetzt und für eine weitere Stunde gerührt. Das Gemisch wurde mit 60 ml Chloroform/ 30 ml Wasser ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wurde mit 10 ml Chloroform extrahiert, die kombinierten Chloroformextrakte mit 30 ml Toluol verdünnt und eingeengt bei Raumtemperatur. Der Rückstand wurde mit 30 ml Toluol verdünnt und nochmals eingeengt. Restliches Lösungsmittel wurde im Ölpumpenvakuum abgezogen. Der verbliebene Schaum wurde in 20 ml Chloroform mit 0,5% (v/v) gelöst und auf eine 400 ml Silicagelsäule aufgetragen, die im gleichen Lösungsmittel äquilibriert war. Man eluierte mit Chloroform/Triethylamin (99,5/0,5) in 250 ml-Portionen mit einem steigenden Gehalt an Isopropanol von 1%, 2%, 3%, 5% und 6%. Die DMT-positiven Fraktionen wurden 50 ml-weise aufgefangen und mittels Dünnschichtchromatographie im Laufmittel S₁ kontrolliert. Die Fraktionen 12 bis 17 enthielten reines Ia, erhalten nach Einengen und weiterem Einengen mit 5,1 g Chloroform (68% Ausbeute, bezogen auf Guanosin). Die Fraktionen 20 bis 22 ergaben 1,8 g (24%) an unerwünschtem Isomer Ib (R_F-S₁ 0,58).A suspension of anhydrous guanosine (10 mmol) in N, N-dimethylformamide (25 ml) and N, N-dimethylformamide diethylacetal (6 ml) was stirred at room temperature overnight. 1 ml of water was added to the clear solution, and after 5 minutes the solution was diluted with 100 ml of pyridine and concentrated in vacuo to a syrupy residue. 30 ml of pyridine and 11 mmol of 4,4′-dimethyoxytrityl chloride were added. The mixture was stirred for 10 minutes and left overnight. 1 ml of methanol was added and after 10 minutes the mixture was concentrated in an oil pump vacuum until a foam formed. 20 ml of pyridine and 26 mmol of imidazole were added, stirred for 10 minutes and t-butyldimethylchlorosilane (13 mmol) was added and stirred for a further hour. The mixture was shaken with 60 ml chloroform / 30 ml water. The aqueous phase was extracted with 10 ml of chloroform, the combined chloroform extracts diluted with 30 ml of toluene and concentrated at room temperature. The residue was diluted with 30 ml of toluene and concentrated again. Residual solvent was removed in an oil pump vacuum. The remaining foam was dissolved in 20 ml chloroform at 0.5% (v / v) and applied to a 400 ml silica gel column which was equilibrated in the same solvent. The mixture was eluted with chloroform / triethylamine (99.5 / 0.5) in 250 ml portions with an increasing isopropanol content of 1%, 2%, 3%, 5% and 6%. The DMT-positive fractions were collected 50 ml-wise and checked by means of thin layer chromatography in the mobile phase S 1. Fractions 12 to 17 contained pure Ia, obtained after concentration and further concentration with 5.1 g of chloroform (68% yield, based on guanosine). Fractions 20 to 22 gave 1.8 g (24%) of undesired isomer Ib (R _F -S₁ 0.58).

Example 2 2'-O- (t-butyldimethylsilyl) -5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) - N⁶-dimethylaminoethylene adenosine (IIa)

Die Verbindung wurde, ausgehend von 10 mMol Adenosin, nach demselben Schema wie (Ia) präpariert. Die Endreinigung wurde mit demselben Anfangslaufmittel in 250 ml-Portionen durchgeführt bei jeweils steigenden Mengen von 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,25% und 1,5% an Isopropanol. Die jeweils gesammelten Fraktionen enthielten 3,6 g (50%) von IIa (R_F-S₁ 0,80) und 2,1 g (29%) des Isomers IIb (R_F-S₁ 0,77).The compound was prepared from 10 mmoles of adenosine according to the same scheme as (Ia). The final cleaning was carried out with the same initial solvent in 250 ml portions with increasing amounts of 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%, 1.25% and 1.5% of isopropanol. The fractions collected in each case contained 3.6 g (50%) of IIa (R _F -S₁ 0.80) and 2.1 g (29%) of the isomer IIb (R _F -S₁ 0.77).

Example 3 Preparation of the H-phosphonates (Ic, IIc)

Die Verbindungen wurden in gering abweichender Form nach Froehler, B. C. et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14, 5399-5407, präpariert. Eine Lösung von 30 mMol Imidazol in 75 ml Methylenchlorid wurde unter Rühren auf Eis gekühlt, und 2M Phosphortrichlorid in Dichlormethan (4,32 ml) wurden per Spritze unter Rühren zugesetzt, gefolgt von einer Zugabe von 4,2 ml Triethylamin. Die Mischung wurde für 15 Minuten gerührt und dann die Lösung des geschützten Ribonukleosids (2 mMol, zuvor mit 10 ml Acetonitril eingedampft) in 25 ml Methylenchlorid über 20 Minuten tropfenweise zugefügt. Nach einer Stunde zeigte die Dünnschichtchromatographie im Laufmittelsystem S₃, daß die Ausgangssubstanz vollständig reagiert hatte. 20 ml Wasser wurden zugesetzt und die Mischung für 5 Minuten gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt, die wäßrige Phase mit 40 ml Chloroform extrahiert und die vereinigten Extrakte mit Toluol verdünnt und eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform/Triethylamin (99 : 1,8 ml) aufgenommen und auf eine 100 ml Silicagelsäule, die mit gleichem Lösungsmittel äquilibriert war, aufgetragen. Die Elution wurde 100 ml-weise durchgeführt mit Startlösung, nacheinander auf 5%, 10%, 15% und 25% Methanol eingestellt. Die geeigneten Fraktionen wurden eingeengt und der Rückstand zweimal mit Chloroform aufgenommen, eingeengt, im Ölpumpenvakuum getrocknet und das Triethylammoniumsalz des H-Phosphonates Ic bzw. IIc als glasiger Schaum erhalten (Ic: 1,46 g=79%, R_F-S₃ 0,55), (IIc: 1,55 g=86%, R_F-S₃ 0,68).The compounds were found in a slightly different form according to Froehler, BC et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14, 5399-5407. A solution of 30 mmole of imidazole in 75 ml of methylene chloride was cooled with stirring on ice, and 2M phosphorus trichloride in dichloromethane (4.32 ml) was added by syringe with stirring, followed by the addition of 4.2 ml of triethylamine. The mixture was stirred for 15 minutes and then the solution of the protected ribonucleoside (2 mmol, previously evaporated with 10 ml of acetonitrile) in 25 ml of methylene chloride was added dropwise over 20 minutes. After an hour, the thin layer chromatography in the eluent system S₃ showed that the starting substance had reacted completely. 20 ml of water was added and the mixture was stirred for 5 minutes. The organic phase was separated, the aqueous phase extracted with 40 ml of chloroform and the combined extracts diluted with toluene and concentrated. The residue was taken up in chloroform / triethylamine (99: 1.8 ml) and applied to a 100 ml silica gel column equilibrated with the same solvent. The elution was carried out 100 ml-wise with starting solution, successively adjusted to 5%, 10%, 15% and 25% methanol. The appropriate fractions were concentrated and the residue was taken up twice with chloroform, concentrated, dried in an oil pump vacuum and the triethylammonium salt of H-phosphonate Ic or IIc obtained as a glassy foam (Ic: 1.46 g = 79%, R _F -S₃ 0, 55), (IIc: 1.55 g = 86%, R _F -S₃ 0.68).

Example 4 Automatic RNA synthesis

Die H-Phosphonate wurden in 50% Pyridin/Acetonitril zu einer Konzentration von je 0,1 M gelöst. Frisch sublimiertes Adamantancarbonylchlorid wurde gleichfalls in 50% Pyridin/Acetonitril gelöst in einer Endkonzentration von 0,4 M. Alle Lösungen wurden vor Gebrauch durch einen Teflonfilter filtriert. Die automatische Oligo ribonukleotidsynthese wurde gemäß Herstellerprogramm auf einem AB/381A durchgeführt, das auf die Synthese von DNA aus H-Phosphonatsynthonen ausgelegt war. Die Kopplungszeit wurde von einer Minute für die DNA-Synthese auf 20,6 Minuten für die RNA-Synthese gesteigert. Dies wurde erreicht durch 6 aufeinanderfolgende Pulse von 6 Sekunden einer 1 : 1-Mischung (v/v) der 0,1 M H-Phophonat- und 0,4 M Adamantancarbonylchloridlösung auf die CPG-Trägersäule (1,1 ml/min Flußrate), gekoppelt mit 1 µMol Starternukleosid. Nach jedem Puls wurde ein Warteschritt von 200 Sekunden eingelegt.The H-phosphonates were added in 50% pyridine / acetonitrile dissolved in a concentration of 0.1 M. Freshly sublimated Adamantane carbonyl chloride was also found in 50% pyridine / acetonitrile dissolved in a final concentration of 0.4 M. All solutions were pre-used filtered a Teflon filter. The automatic oligo Ribonucleotide synthesis was according to the manufacturer's program performed on an AB / 381A that is based on the synthesis of DNA from H-phosphonate synthons was designed. The Coupling time was one minute for DNA synthesis increased to 20.6 minutes for RNA synthesis. This was achieved by 6 consecutive pulses 6 seconds of a 1: 1 mixture (v / v) of the 0.1 M H-phophonate and 0.4 M adamantane carbonyl chloride solution the CPG support column (1.1 ml / min flow rate) with 1 µmol starter nucleoside. After each pulse there was a Wait for 200 seconds.

Example 5 Deprotection and purification of an RNA oligonucleotide (Mini-RNA ^Ala )

Die Abspaltung des rohen Oligoribonukleotids vom CPG-Träger und die Schutzgruppenabspaltung wurden in einem Schritt vorgenommen. Der CPG-Träger wurde mit 2 ml Ethanol/35% NH₃ (1 : 3, v/v) für 20 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Nach Filtration wurde die resultierende gelbliche Lösung zur Trockne eingeengt. Das verbleibende farblose 2′-blockierte Oligoribonukleotid wurde in 2 ml 1M Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran gelöst und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3, 6, 9 und 12 Stunden wurden 10 µl Aliquots entnommen und auf Nucleosil C-4 HPLC (Macherey & Nagel, 4,6 mm×25 cm, 300 Å, 5 µ Partikel) analysiert (Gradient 70 Minuten, 100%, 50 mM Triethylacetat/Essigsäure pH 7,3 bis 100% Acetonitril). Nach 12 Stunden waren die 2′-Schutzgruppen vollständig entfernt (singuläre HPLC Peak). Die rohe mini-RNA^Ala wurde wiederum über Biogel-P6 entsalzt. Eine weitere Reinigung der RNA wurde in Teilen an Sepharose A25 in einem Puffer von 400 mM NaCl, 20 mM Natriumacetat pH 5,2 und 10 mM MgCl₂ durchgeführt. Die Elution wurde mit 1 M NaCl, 20 mM Natriumacetat pH 5,2 und 10 mM MgCl₂ durchgeführt. Die Entsalzung erfolgte wie bereits beschrieben. Die gelelektrophoretische Analytik wurde bei 12,5 V/cm auf einem 20%igen Polyacrylamidgel in 7 M Harnstoff ausgeführt (89 mM Tris, 89 mM H₃BO₃, 2,5 mM EDTA, pH 8,2).The cleavage of the crude oligoribonucleotide from the CPG support and the deprotection were carried out in one step. The CPG carrier was treated with 2 ml of ethanol / 35% NH₃ (1: 3, v / v) for 20 hours at room temperature. After filtration, the resulting yellowish solution was evaporated to dryness. The remaining colorless 2'-blocked oligoribonucleotide was dissolved in 2 ml of 1M tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran and incubated at room temperature. After 3, 6, 9 and 12 hours, 10 μl aliquots were removed and analyzed on Nucleosil C-4 HPLC (Macherey & Nagel, 4.6 mm × 25 cm, 300 Å, 5 μ particles) (gradient 70 minutes, 100%, 50 mM triethyl acetate / acetic acid pH 7.3 to 100% acetonitrile). After 12 hours the 2′-protecting groups were completely removed (singular HPLC peak). The crude mini-RNA ^Ala was again desalted using Biogel-P6. A further purification of the RNA was carried out in parts on Sepharose A25 in a buffer of 400 mM NaCl, 20 mM sodium acetate pH 5.2 and 10 mM MgCl₂. The elution was carried out with 1 M NaCl, 20 mM sodium acetate pH 5.2 and 10 mM MgCl₂. Desalination was carried out as already described. The gel electrophoretic analysis was carried out at 12.5 V / cm on a 20% polyacrylamide gel in 7 M urea (89 mM Tris, 89 mM H₃BO₃, 2.5 mM EDTA, pH 8.2).

Example 6 Functional test of the synthetic RNA aminoacylation of the mini-RNA ^Ala

Die Aminoacylierung wurde in 150 mM Tris/HCl pH 7,6, 50 mM Kaliumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM ATP, 5 mM β-Mercaptoethanol, 300 µM [¹⁴C]-Alanin (162 Ci/Mol) in Gegenwart von 0,3 A₂₆₀-Einheiten an mini-RNA^Ala und 50 µg Ala-tRNA-Synthetase (E. coli) durchgeführt, Totalvolumen 100 µl, 37°C. 10 µl Aliquots wurden nach entsprechenden Zeiten (Abb. 2) entnommen und auf Whatman 3MM-Filtern analysiert. Trichloressigsäure-fällbare radioaktive Fraktionen wurden im Beckman-Scintillationszähler bestimmt (LS 1801). Die Alanyl-tRNA^Ala- Synthetase aus E. coli (spezifische Aktivität 57,5 u/mg; 1 Unit katalysiert die Bildung von 1 nMol Ala-tRNA^Ala bei 37°C in einer Minute) wurde isoliert nach Hill, K. und Schimmel. P. (1989), Biochemistry 28, 2577-2586.The aminoacylation was carried out in 150 mM Tris / HCl pH 7.6, 50 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 1 mM ATP, 5 mM β-mercaptoethanol, 300 μM [11 C] alanine (162 Ci / mol) in the presence of 0. 3 A ₂₆₀ units carried out on mini-RNA ^Ala and 50 µg Ala-tRNA synthetase (E. coli), total volume 100 µl, 37 ° C. 10 µl aliquots were removed after appropriate times ( Fig. 2) and analyzed on Whatman 3MM filters. Trichloroacetic acid precipitable radioactive fractions were determined in the Beckman scintillation counter (LS 1801). The alanyl tRNA ^Ala synthetase from E. coli (specific activity 57.5 u / mg; 1 unit catalyzes the formation of 1 nmol Ala tRNA ^Ala at 37 ° C. in one minute) was isolated according to Hill, K. and Schimmel . P. (1989), Biochemistry 28, 2577-2586.

Die Fig. 2 zeigt Aminoacylierung in Gegenwart (-▲-) und Abwesenheit (-⚫-) chemisch synthetisierter mini- RNA^Ala mit Alanyl-tRNA-Synthetase aus E. coli und [¹⁴C]-Alanin mit der in Beispiel 6 angegebenen spezifischen Radioaktivität. Bei den angegebenen Zeiten wurden 10 µl Aliquots aus dem Reaktionsgemisch entnommen und die Gesamtradioaktivität der mit Trichloressigsäure fällbaren Radioaktivität gemessen. Figs. 2 shows aminoacylation in the presence of (- ▲ -) and absence (-⚫-) chemically synthesized RNA mini- ^Ala alanyl-tRNA synthetase from E. coli and [¹⁴C] alanine with the procedure given in Example 6 specific radioactivity . At the times indicated, 10 μl aliquots were removed from the reaction mixture and the total radioactivity of the radioactivity precipitated with trichloroacetic acid was measured.

Claims

1. Nucleosides of the formula where if B = guanine or 8-haloguanine,
R¹ is an amidine protecting group, especially the dimethyl aminomethylene group (DMM) at position N² of the purine residue,
R² is an alkylsilyl group or methoxy group or hydrogen (H),
R³ is a triethylammonium H-phosphonate group, a hydrogen atom or a phosphoramidite group,
R⁴ is a substituted trityl protecting group or H, and where B = adenine or 8-azidoadenine,
R¹ is an amidine protecting group, especially the dimethyl aminomethylene group (DMM) on N⁶ of the purine residue and
R², R³ and R⁴ are as for B = guanine.

2. Nucleosides according to claim 1, wherein the alkylsilyl group R² t-butyldimethylsilyl and / or the substituted trityl group 4,4'-dimethoxytrityl is.

3. Ribonucleic acids from at least two ribonucleic acid Nucleosides containing at least one as a nucleoside of the compounds according to claim 1 or 2, wherein the monomers about the oxygen atoms on carbon atom C-5 one and linked to carbon atom C-3 of the other are, so that the corresponding radicals R³ = R⁴ each correspond to half of the PO₂ bridge.

4. Ribonucleic acids according to claim 3, wherein the RNA messenger RNA is.

5. Ribonucleic acids according to claim 4, wherein the messenger RNA is suitable for the synthesis of proteins.

6. Process for the preparation of the compounds according to a of claims 1 to 5, wherein the amidine protecting group, especially DMM group introduced into the A / G nucleosides then the 5′-position of ribose with a Trityl protecting group is protected, the 2'-position of the Ribose silylated and the 3'-position phosphonated becomes.

7. The method according to claim 6, wherein the reaction as a so-called One-pot reaction is designed, starting with the corresponding nucleoside of adenine or guanine and step-by-step production of the synthons for RNA synthesis.

8. Process for the preparation of ribonucleic acids under Use at least one connection according to one of the Claims 1 or 2.

9. The method of claim 8, wherein the DMM-H-Phophonate condensed in the presence of 1-adamantane carbonyl chloride the protective groups for 10 to 30 hours, preferably 20 hours exposure to aqueous ammoniacal Ethanol solution, the 2′-O protecting groups by 5- to 15-hour, preferably 12-hour exposure of tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran at room temperature at 15 to 30 ° C, preferably 20 to 25 ° C are removed and the crude product chromatographically is cleaned.

10. The method according to any one of claims 8 or 9, wherein between the respective parliamentary groups be freed from salt.

11. The method according to any one of claims 8 to 10, wherein the RNA is messenger RNA.

12. Medicament containing RNA according to one of claims 3 until 5.

13. Medicament according to claim 12, wherein the RNA antisense RNA, is a ribozyme and / or binds protein-specifically.

14. Use of the RNA according to one of claims 3 to 5 as mRNA for protein synthesis, as antisense RNA, as ribozyme and / or as a specific ligand of RNA-binding Proteins, where appropriate by appropriate chemical groups covalently bound to the protein becomes.

15. Use of the RNA according to one of claims 3 to 5 for Manufacture of a drug for the treatment of genetic related and / or infectious diseases through intracellular complexation of complementary nucleic acid in biologically inoperable doubles strand structures or by ribozyme-enzymatic inactivation the one that triggers the corresponding disease specific nucleic acids.