DE4001154A1 - Verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren - Google Patents

Verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren

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Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Nukleinsäuren, ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, welches dieses Herstellungsverfahren umfaßt, Reagenzien zur Durchführung dieser Verfahren, sowie eine Nuklein­ säure, welche in den genannten Verfahren hergestellt wird.
Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren haben sich in der klini­ schen Diagnostik immer mehr zu einer empfindlichen Alternative zu Immuntests, beispielsweise auf dem Gebiet der Humandiagnostik, wie z. B. Virusdiagnostik und Bakteriendiagnostik, erwiesen. Jedoch auch in der Lebensmitteldiagnostik und der Histologie finden Ver­ fahren zum Nachweis von Nukleinsäuren Verwendung. In diesen Ver­ fahren wird das die nachzuweisende Nukleinsäure enthaltende Material mit einer zu der nachzuweisenden Nukleinsäure komplemen­ tären Nukleinsäure in Kontakt gebracht. Die Bildung eines Nuklein­ säurehybrids kann anschließend auf verschiedene Weise sichtbar gemacht werden. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der DE-A-28 01 582 oder der US-A-43 58 535 beschrieben.
Diese Verfahren sind jedoch zum Nachweis sehr geringer Mengen an Nukleinsäure weniger gut geeignet. Zur Verbesserung dieser Verfah­ ren wurde in der EP-A-02 00 362 vorgeschlagen, die nachzuweisende Nukleinsäure in einem der Hybridisierungsreaktion vorangehenden Schritt durch ein in-vitro-System zu vermehren. Dazu wird der Probe pro nachzuweisendem Nukleinsäure-Einzelstrang mindestens ein sogenannter Primer zugesetzt. Durch eine enzymatische Ver­ längerungsreaktion wird zu jedem der Nukleinsäure-Einzelstränge ausgehend von dem Primer durch Reaktion mit Mononukleotiden ein zu der template-Nukleinsäure komplementärer Nukleinsäurestrang gebil­ det. Diese Reaktion kann mehrmals hintereinander durchgeführt wer­ den, wobei auch die neu gebildeten Nukleinsäurestränge vermehrt werden können. Wie die oben geschilderten Verfahren des Standes der Technik hat auch dieses Verfahren den Nachteil, daß im Anschluß an die Vermehrungsreaktion eine Hybridisierungsreaktion mit einer markierten Nukleinsäure ausgeführt wird.
In der EP-A-03 24 474 wird ein Blotting-Verfahren vorgeschlagen, bei dem wegen des Einbaus eines markierten Mononukleotids in die neu gebildeten Nukleinsäure auf eine Hybridisierung mit einer markier­ ten Nukleinsäuresonde verzichtet werden kann. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß die Nukleinsäuren mittels Gelchromato­ graphie aufgetrennt werden. Dies ist apparativ aufwendig und zeit­ intensiv.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und insbesondere einfachere und weniger Schritte erfordernde besonders empfindliche Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mindestens eines Primers an eine template-Nukleinsäure und enzymatische Verlängerung des Primers zu einem zu der nachzuweisenden Nukleinsäure komplementä­ ren Nukleinsäurestrang durch Reaktion mit mindestens vier ver­ schiedenen Arten von Mononukleotiden, wobei der komplementäre Nukleinsäurestrang zwei oder mehr zur Immobilisierung befähigende Gruppen und ein oder mehrere nachweisbare Gruppen trägt. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, ein Reagenz zur Herstellung von Nukleinsäuren, ein Reagenzkit zum Nachweis von Nukleinsäuren und eine in einem der obigen Verfahren hergestellte Nukleinsäure.
template-Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind insbesondere DNA und RNA prokaryontischer oder eukaryontischer Herkunft. Dazu gehören auch virale und bakterielle Nukleinsäuren sowie Nukleinsäuren von Viroiden. Sie können einzel- oder doppelsträngig sein.Es kann sich um episomale Nucleinsäuren, wie Plasmide, oder genomische, chromosomale Nukleinsäuren handeln. Die Nukleinsäuren können für einen bestimmten Organismus oder eine Gruppe von Organismen charakteristisch sein. Es kann sich bei den Nukleinsäuren auch um schon vorbehandelte Nukleinsäuren handeln, beispielsweise um mittels Restriktionsenzymen geschnittene Nukleinsäuren. Im Falle von RNA kann vorher cDNA hergestellt werden. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die Nukleinsäuren vor der Durchführung der Reaktion in einzelsträngiger Form vorliegen oder in einzelsträngige Form gebracht werden.
Als template-Nukleinsäuren werden im folgenden die in der Probe vorliegenden speziellen Nukleinsäuren, auf die sich die Nachweis­ oder Herstellungsreaktion stützen soll, bezeichnet.
Die Nukleinsäure kann gereinigt vorliegen oder in einem Gemisch auch mit anderen Nukleinsäuren vorhanden sein, die nicht nachge­ wiesen oder benutzt werden sollen.
Diese Nukleinsäuren können in einer festen oder flüssigen, vorbe­ handelten oder nicht-vorbehandelten Probe enthalten sein. Bevor­ zugt sind die Nukleinsäuren in einer Probe enthalten, die durch Lyse eines Organismus, beispielsweise einer Zelle, erhalten wird und die eine Reihe verschiedenster Verbindungen, unter anderem auch andere Nukleinsäuren, enthält.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Nukleinsäuren wird die Probe, welche eine template-Nuklein­ säure enthält, unter geeigneten Bedingungen mit mindestens einem, bevorzugt einem Primer pro Nukleinsäureeinzelstrang versetzt. Dieser Primer ist bevorzugt ein Oligonukleotid von 12 bis 60, ins­ besondere 15 bis 30 nt (Nukleotiden) Länge. Der Primer kann mit einem bestimmten Bereich der template-Nukleinsäure hybridisieren. Dies ist möglich, wenn der Primer eine Nukleotidsequenz aufweist, welche im wesentlichen komplementär ist zu einem Bereich der template-Nukleinsäure.
Der Primer ist bevorzugt aus Deoxyribonukleotiden oder Ribonukleo­ tiden aufgebaut, wobei diese Nukleotide modifiziert oder unmodifi­ ziert sein können. Bevorzugt sind die meisten Nukleotide des Primers unmodifiziert.
Unmodifizierte Nukleotide sind die natürlich vorkommenden Nukleo­ tide, beispielsweise Adenosin, Guanosin, Thymidin, Uridin und Cytidin. Modifizierte Nukleotide sind Nukleotidanaloge, wie 7- Desazaadenosin oder 7-Desazaguanosin, oder Derivate der genannten unmodifizierten Nukleotide, die eine zur Immobilisierung befähi­ gende (immobilisierbare) oder eine nachweisbare Gruppe enthalten.
Zur Immobilisierung befähigende Gruppen sind beispielsweise chemi­ sche Gruppen, die kovalent, beispielsweise über eine chemische oder eine Photoreaktion an eine feste Phase gebunden werden können, oder Gruppen bzw. Molekülteile, die über gruppenspezifi­ sche Wechselwirkungen von einem anderen Molekül oder Molekülteil erkannt und gebunden werden können. Solche Gruppen sind daher z. B. Haptene, Antigene und Antikörper, Glykoproteine, beispiels­ weise Lectine, oder auch die Bindungspartner von Bindeproteinen, wie Biotin oder Iminobiotin. Bevorzugt sind Haptene und Vitamine, besonders bevorzugt sind Biotin oder Steroide, wie Digoxigenin.
Nachweisbare Gruppen sind beispielsweise kovalent gebundene, direkt nachweisbare Gruppen oder Molekülteile, wie Radioisotope, Fluoreszenzfarbstoffe oder chromophore Substanzen, oder auch Gruppen, die über eine nachgeschaltete Reaktion indirekt nachweis­ bar sind. Dazu gehören insbesondere solche biospezifischen Gruppen, wie sie auch oben für die zur Immobilisierung befähigende Gruppen beschrieben sind. Besonders bevorzugt ist Digoxigenin.
Der Primer kann eine oder mehrere solche zur Immobilisierung befä­ higende oder nachweisbare Gruppen enthalten. Er kann auch sowohl eine oder mehrere zur Immobilisierung befähigende als auch eine oder mehrere nachweisbare Gruppe beinhalten. Bevorzugt enthält der Primer gar keine dieser Gruppen.
Solche Primer können auf dem Fachmann bekannte Weise hergestellt werden, beispielsweise durch chemische Synthese analog zu WO 84/03 285 oder durch enzymatischen Einbau analog zu EP-A-00 63 879. Die Modifizierung kann an den Primer an beliebiger Stelle ange­ bracht sein, bevorzugt jedoch nicht am 3′-Ende. Möglich ist, bei­ spielsweise die Modifizierung am 5′-Ende (beispielsweise nach Molecular Cloning, S. 239 (1982) Ed. Maniatis et al., CSH) oder/und über die Nukleobasen, beispielsweise über einene-Amino­ capronsäurelinker und/oder über Random-priming nach Feinberg et al. (Anal. Biochem. 132, 6 (1983)). Prinzipiell sind auch alle Primer geeignet, die in der EP-A-02 00 362 beschrieben sind.
Die Bedingungen, unter welchen eine Hybridisierung des Primers mit dem dazu passenden Teil der template-Nukleinsäure stattfindet, sind dem Fachmann beispielsweise aus der EP-A-02 00 362 bekannt. Sie richten sich nach der Länge des Primers sowie dem Ausmaß der Komplementarität.
Der Primer sollte insbesondere an seinem 3′-Ende mindestens ein Nukleotid aufweisen, welches zu dem entsprechenden Nukleotid der template-Nukleinsäure komplementär ist. Der Primer kann, bevorzugt am 5′-Ende, außerdem eine Nukleotidsequenz enthalten, die nicht komplementär zu der template-Nukleinsäure ist. Er kann auch Erken­ nungsstellen für Enzyme, beispielsweise Polymerasen, enthalten; es können dazu auch Proteine gebunden sein.
Die Nukleotidsequenz des Primers wird so gewählt, daß die Einzel­ strang-Nukleotidsequenz der template-Nukleinsäure nach der Hybri­ disierung über das 3′-Ende des Primers hinausgeht.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Nuklein­ säuren wird die aus template-Nukleinsäure und Primer gebildete Hybrid-Nukleinsäure am 3′-Ende des Primers verlängert, indem ein zu dem oben genannten einzelsträngigen Bereich der template- Nukleinsäure komplementäres an den Primer anschließendes Nuklein­ säurestück gebildet wird. Es kann hierbei analog zur EP-A-02 00 362 vorgegangen werden. Dort wird die Verlängerung mittels vierer Mononukleotidtriphosphate beschrieben.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden als Mononukleotidtriphospha­ te neben nicht modifizierten auch modifizierte Nukleotidtriphos­ phate eingesetzt. Modifizierte Nukleotidtriphosphate sind die Triphosphate der oben geschilderten modifizierten Nukleotide. Beispiele solcher modifizierter Mono-Nukleotidtriphosphate sind Digoxigenin-dUTP (EP-A-03 24 474) oder Biotin-dUTP. Als modifizierte Nukleotidtriphosphate können in der Verlängerungsreaktion gleich­ zeitig solche Nukleotidtriphosphate, die eine zur Immobilisierung befähigende Gruppe tragen, und solche Nukleotidtriphosphate einge­ setzt werden, die eine nachweisbare Gruppe tragen. Bei der zur Immobilisierung befähigenden Gruppe und der nachweisbaren Gruppe handelt es sich hier bevorzugt um unterschiedliche Gruppen. Bei einer Verlängerung um mehr als ca. 30-50 Nukleotide kann durch Einhaltung bestimmter Versuchsbedingungen gewährleistet werden, daß mehrere zur Immobilisierung befähigende Gruppen in die neu gebildete Nukleotidsequenz eingebaut werden. Bevorzugt sind nicht alle Nukleotidtriphosphate modifiziert. Besonders bevorzugt ist der Fall, daß neben den 4 natürlichen Nukleotidtriphosphatarten eine Nukleotidtriphosphatart in modifizierter Form eingesetzt wird.
Die unmodifizierte Menge des Nukleotidtriphosphats, das auch in modifizierter Form eingesetzt wird, wird bevorzugt um die Menge an eingesetztem modifiziertem Nukleotidtriphosphat verringert, sodaß die Gesamtmenge dieser Nukleotidtriphosphatart ungefähr erhalten bleibt. Die Menge der verschiedenen Mononukleotidtriphosphatarten ist jeweils ungefähr gleich und dem Fachmann bekannt. Sie beträgt beispielsweise bei Verlängerung analog zu EP-A-02 00 362 bevorzugt 100 µM-300 µM, besonders bevorzugt ca. 200 µM.
Über folgende Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, Nukleinsäuren herzustellen, welche mindestens eine nachweisbare, und zwei oder mehr zur Immobilisierung befähigende Gruppen beinhalten und zu mindestens einem Teil einer template- Nukleinsäure komplementär sind:
  • - Einsatz eines Primers, der mindestens eine nachweisbare Gruppe enthält, und einer Nukleotidtriphosphatart, die eine immobili­ sierbare Gruppe enthält. Dabei kann der Primer zusätzlich noch eine oder mehrere immobilisierbare Gruppen enthalten und außer­ dem eine Nukleotidtriphosphatart eingesetzt werden, die eine nachweisbare Gruppe enthält. Bevorzugt sind jedoch die Ausfüh­ rungsformen, bei denen der Primer nicht zusätzlich eine nach­ weisbare Gruppe aufweist.
  • - Einsatz eines Primers, der mindestens eine immobilisierbare Gruppe enthält, und Nukleotidtriphosphaten, die eine nachweis­ bare Gruppe enthalten, sowie Nukleotidtriphosphaten, die ein außerdem noch eine nachweisbare Gruppe enthalten.
  • - Einsatz eines Primers, welcher mehr als eine immobilisierbare Gruppe enthält, und Nukleotidtriphosphaten, die eine Nukleotidtriphosphate eingesetzt werden, die eine immobilisierbare Gruppe enthalten.
  • - Einsatz eines Primers, der keine immobilisierbare und keine nachweisbare Gruppe enthält, und Nukleotidtriphosphaten, die eine nachweisbare Gruppe enthalten, sowie Mononukleotidtri­ phosphaten, die eine immobilisierbare Gruppe enthalten. Dieser Fall ist bevorzugt, da hier eine Reaktion zur Modifizierung des Primers wegfällt. Außerdem ist durch den Einbau sowohl nach­ weisbarer als auch immobilisierbarer Mononukleotide gewähr­ immobilisierbaren Gruppen und mindestens eine nachweisbare Gruppe enthält. Ein weiterer Vorteil dieser Variante ist die erheblich erleichterte Abtrennbarkeit der gebildeten Nuklein­ säuren von nicht umgesetzten Primern.
Als Enzym zur Verlängerung des Primers kommen die Enzyme in Frage, die DNA- bzw. RNA-abhängige DNA- oder RNA-Polymerasen- Aktivität aufweisen. Bevorzugt sind thermostabile DNA- Polymerasen. Dazu gehört beispielsweise Taq-DNA-Polymerase oder Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase.
Die Verlängerungsreaktion endet im allgemeinen bevorzugt am 5′- Ende der template-Nukleinsäure. Sie kann jedoch gewünschtenfalls auch schon vorzeitig durch Verwendung von Stopreagenzien abgebrochen werden. Gegebenenfalls wird zum Schluß das neugebildete Nukleinsäurestück an das Oligonukleotid ligiert, beispielsweise über die Ligasereaktion.
Durch die enzymkatalysierte Reaktion wird der Primer unter Verwen­ dung von modifizierten und unmodifizierten Mononukleotidtri­ phosphaten um ein Nukleinsäurestück verlängert, das komplementär zu dem entsprechenden Teil der template-Nukleinsäure ist. Die neu entstandene Nukleinsäure enthält dann zwei oder mehr zur Immobili­ sierung befähigende Gruppen und eine oder mehr nachweisbare Gruppen. Es hat sich herausgestellt, daß es sehr vorteilhaft ist, wenn zwei oder mehr zur Immobilisierung befähigende Gruppen in einem Strang der neu gebildeten Nukleinsäure enthalten sind. Ins­ besondere können solche Nukleinsäuren effizienter immobilisiert werden als solche, die nur eine solche Gruppe aufweisen. Dies erleichtert eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an template- Nukleinsäure durch genauere Quantifizierung der neu gebildeten Nukleinsäuren.
Die Zahl der nachweisbaren Gruppen in jedem neugebildeten Strang ist bevorzugt größer als 1 und besonders bevorzugt weist ca. jedes 5. bis 30. Nukleotid eine nachweisbare Gruppe auf.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können beispielsweise Nuklein­ säuren hergestellt werden, die eine Länge von 100 bis 8000 bp auf­ weisen. Sie ist jedoch praktisch nur begrenzt durch das Enzymsystem, welches die Verlängerung ausführt.
Je nach weiterer Anwendung der Amplifikationsprodukte kann die Polymerase beispielsweise durch Phenolisierung abgereinigt werden. Bei alleiniger Analytik im Southernblot, Dot Blot oder in der MTP ist dies nicht notwendig.
Bevorzugt werden die neugebildeten Nukleinsäuren als Doppel- oder als Einzelstrang von den nicht umgesetzten Mononukleotidtri­ phosphaten und Primern durch Gelchromatographie, an Affinitäts­ materialien oder durch Fällung abgetrennt. Dabei ist das erfindungsgemäße Verfahren, welches ohne mit einer immobilisier­ baren Gruppe modifizierten Primer arbeitet, besonders vorteilhaft, da die Abtrennung der neu gebildeten Nukleinsäuren von unmodifi­ zierten Primern an Festphasen, die die immobilisierbare Gruppe binden, besonders einfach ist.
Die gebildeten Nukleinsäuren können gewünschtenfalls von der template-Nukleinsäure getrennt werden, beispielsweise durch Dena­ turierung des Doppelstrangs oder über eine Replacement-Reaktion. Die neu gebildeten Nukleinsäuren können Gegenstand weiterer Reaktionen sein, beispielsweise von Fragmentierungen durch Restriktionsenzyme, wie in der EP-A-03 00 796. Sie können auch selbst als template-Nukleinsäure zur Bildung von Nukleinsäuren in dem oben geschilderten erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden; diese Nukleinsäuren sind dann wiederum mindestens zum Teil zu ihnen komplementär und zu der ursprünglichen template- Nukleinsäure homolog. Als Primer muß dann anstelle einer zur template-Nukleinsäure komplementären Nukleotidsequenz ein mit der neu gebildeten Nukleinsäure hybridisierbarer Primer eingesetzt werden. Ansonsten muß er die oben geschilderten Bedingungen erfüllen. Da auch die ursprüngliche template-Nukleinsäure wieder als Matrize für die Bildung einer neuen Nukleinsäure zur Verfügung steht, ergibt sich eine zumindest annähernd exponentielle Vermehrung der beiden neu gebildeten Nukleinsäurestränge, wenn jede der Nukleinsäuren auf erfindungsgemäße Weise eingesetzt wird. Dies kann in einzelnen Temperatur- oder/und Reagenzzyklen, aber auch homogen geschehen. Prinzipiell kann die Reaktion zu jedem Zeitpunkt durch Zugabe von Stopreagenzien (beispielsweise EDTA) gestoppt werden. Außerdem ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren dahingehend zu modifizieren, daß analog zu EP-A-02 01 184 nach einiger Zeit sogenannte "nested" Primer eingesetzt werden. Von diesem Zeitpunkt an wird dann nur noch ein Teil der bisher neu hergestellten Nukleinsäuresequenz amplifiziert.
Die Verfahren können auch so geführt werden, daß die zum Einbau zur Verfügung stehende Menge an zur Immobilisierung befähigendem Nukleotidtriphosphat in den letzten Reaktionszyklen limitiert wird. Dies hat den Vorteil, daß die nichteingebauten Bio-Nukleoti­ de zum größten Teil in der Reaktion verbraucht sind, daher nicht mehr mit den biomarkierten Amplifikationsprodukten um SA-Bindungs­ stellen konkurrieren. Daher ist eine vorgeschaltete Abtrennung der nichteingebauten Nukleotide (Säule oder Fällung) nicht mehr not­ wendig.
Als template-Nukleinsäuren für das erfindungsgemäße Verfahren können auch Nukleinsäuren bzw. Fragmente davon eingesetzt werden, wie sie als Ergebnis von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, beispielsweise der EP-A-03 10 229, der EP-A-03 00 796, der WO 88/10 315, der EP-A-02 01 184, der EP-A-03 29 822, der EP-A-02 72 098 oder der EP-A-03 03 155 entstehen. In diesen Fällen ist es möglich, sogar mit nur einmaliger Ausführung der Verlängerungsreaktion gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine große Menge an erfin­ dungsgemäß modifizierten Nukleinsäuren herzustellen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens stellt die Durchführung des Verfahrens gemäß EP-A-02 01 184 unter Verwen­ dung zweier unterschiedlich markierter Mononukleotidtriphosphate, beispielsweise Biotin-16-dUTP (immobilisierbar, Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4045-49 (1983)) und Digoxigenin-11- dUTP (nachweisbar) dar.
Als Versuchsbedingungen hierzu haben sich als besonders zweckmäßig erwiesen:
Volumen der Reaktion: 50-100 µl; Konzentration des markierten Primers 200 nM-1 µM; Gesamtkonzentration der dNTP-Arten: 100-300 µM; Taq-DNA-Polymerase: 1-3 U oder eine andere thermo­ stabile Polymerase; Puffer: 30-100 mM KCl; 5-20 nM Tris, pH 8.2-8.7 bei RT; 0,5-2 mM MgCl2; gegebenenfalls Stabilisatoren wie Gelatine oder Nuklease-freies BSA; PCR-Zyklen: 20-60, bevorzugt 20-30; Denaturierung: vor dem Start 2-10′, 92-95°C (fakultativ; wenn hochkomplexe DNA), während PCR 1-5′, 92-95°; Primer Hybridi­ sierung 1-5′, 35-55°C, Elongation: 1-10′, 65-75°C, bevorzugt 3′. Trennung der nicht eingebauten dNTP′s und Primer-Moleküle von den gebildeten Nukleinsäuren am Ende der PCR: Sephadex G 75 oder G 100 (Pharmacia) oder Streptavidin-Festphase (beispielsweise gemäß DE- A-38 17 716). Die modifizierten dNTP′s können schon ab dem 1. Zyklus, aber auch erst in den letzten 3-5 Zyklen zugegeben werden. Letztere Vorgehensweise empfiehlt sich bei limitierender Zugabe von Bio-dUTP. Mengenverhältnis der für jeden Einzelstrang spezifi­ schen Primer zueinander bevorzugt ca. 1 : 1. Verhältnis Dig-dUTP:. Bio-dUTP:dTTP von 3 : 3 : 1 bis 1 : 1 : 3, bevorzugt 1 : 1 : 2 bis 1 : 1 : 1. Ver­ hältnis Dig-dUTP (bzw. Bio-dUTP):dTTP (bei Verwendung eines modi­ fizierten Primers): 3 : 1 bis 1 : 3 bevorzugt 1 : 2.
Die oben angegebenen Werte sind Richtwerte. Ein Fachmann kann ohne weiteres erkennen, ob im Einzelfall auch davon abweichende Bedin­ gungen möglich sind.
Es war überraschend, daß es möglich war, auf erfindungsgemäße Weise Nukleinsäure herstellen zu können, die besser immobilisier­ bar sind als erwartet und den Vorteil haben, auf einfache Weise quantitativ nachgewiesen werden zu können.
Diese Vorteile können besonders gut in Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren angewendet werden. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Bildung eines zu mindestens einem Teil eines Stranges der nachzu­ weisenden Nukleinsäure komplementären Stranges, Bindung der gebil­ deten Nukleinsäure an eine feste Phase und Nachweis der gebildeten Nukleinsäure, wobei der komplementäre Strang durch Hybridisierung mindestens eines Primers an eine template-Nukleinsäure und enzyma­ tische Verlängerung des Primers zu einem zu der template-Nuklein­ säure komplementären Nukleinsäurestrang durch Reaktion mit verschiedenen Arten, bevorzugt mindestens vier Arten , von Mononukleotiden unter Verwendung der nachzuweisenden Nukleinsäure als template-Nukleinsäure gebildet wird und der komplementäre Nukleinsäurestrang zwei oder mehr zur Immobilisierung befähigende Gruppen und eine oder mehr nachweisbare Gruppen trägt.
Als template-Nukleinsäure des erfindungsgemäßen Herstellungsver­ fahrens dient dabei die nachzuweisende Nukleinsäure bzw. ein Teil davon, die gegebenenfalls wie oben beschrieben, vorbehandelt, bei­ spielsweise amplifiziert wurde.
Die als Ergebnis des Verfahrens gebildeten Nukleinsäurestränge können anschließend in sehr einfacher Weise nachgewiesen werden. Dazu können Doppelstränge gewünschtenfalls in Einzelstränge gespalten werden. Die gebildeten doppelt modifizierten Nuklein­ säuren können beispielsweise gelchromatographisch nachgewiesen werden. Bevorzugt werden sie jedoch mit einer geeigneten Festphase in Kontakt gebracht und dort immobilisiert.
Die Art der Festphase richtet sich nach der zur Immobilisierung befähigenden Gruppe. Ist die immobilisierbare Gruppe beispielswei­ se ein Hapten, dann kann eine Festphase verwendet werden, die an ihrer Oberfläche Antikörper gegen dieses Hapten aufweist. Ist die immobilisierbare Gruppe ein Vitamin, wie z. B. Biotin, dann kann die Festphase bindende Proteine, wie Avidin oder Streptavidin immobilisiert enthalten. Die Immobilisierung über eine Gruppe an der modifizierten Nukleinsäure ist besonders vorteilhaft, da sie unter milderen Bedingungen stattfinden kann als beispielsweise Hybridisierungsreaktionen.
Bevorzugt wird zur Immobilisierung der gebildeten Nukleinsäuren die Reaktionsmischung nach Beendigung des Verfahrens zur Herstel­ lung der Nukleinsäuren in ein Gefäß gefüllt, welches an seiner Oberfläche mit der immobilisierbaren Gruppe reagieren kann. Das Gefäß kann beispielsweise eine Küvette oder eine Miktrotiterplatte sein. Es ist jedoch auch möglich, eine Festphase in Form eines porösen Materials, wie einer Membran, eines Gewebes oder eines Vlieses, zu verwenden, auf welche die Reaktionsmischung aufgegeben wird. Ebenso ist die Verwendung von Perlen, sogenannten beads, möglich.
Nach einer Inkubationszeit, während der die Immobilisierungs­ reaktion stattfindet, wird die flüssige Phase aus dem Gefäß, dem porösen Material oder den pelletierten beads entfernt. Die Fest­ phase kann anschließend mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden, da die Bindung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure an der Festphase sehr fest ist.
Die Menge der an die Festphase gebundenen modifizierten Nuklein­ säure kann auf im Prinzip bekannte Weise bestimmt werden, wobei sich die durchzuführenden Schritte nach der Art der nachweisbaren Gruppe richten. Bei direkt nachweisbaren Gruppen, beispielsweise Fluoreszenzlabeln, wird die Menge an Label fluorometrisch bestimmt. Ist die nachweisbare Gruppe ein Hapten, so wird die modifizierte Nukleinsäure bevorzugt mit einem markierten Anti­ körper gegen das Hapten umgesetzt, wie analog in der EP-A-03 24 474 beschrieben. Die Markierung kann beispielsweise eine Enzymmarkie­ rung, wie β-Galaktosidase, alkalische Phosphatase oder Peroxidase sein. Im Fall der Enzymmarkierung wird die Menge an Nukleinsäure über die meist photometrische, chemoluminometrische oder fluorome­ trische Verfolgung einer Reaktion des Enzyms mit einem chromoge­ nen, chemoluminogenen oder fluorogenen Substrat gemessen.
Bei indirekt nachweisbaren Gruppen können die erforderlichen Reagenzien (beispielsweise ein gegen ein Hapten gerichteter markierter Antikörper) auch schon vor dem Waschschritt zu der Reaktionsmischung zugegeben werden.
Der Nachweis der Nukleinsäure kann sowohl qualitativ als auch quantitativ geführt werden. Im Falle einer quantitativen Auswer­ tung hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, mindestens einen Vergleichsversuch mit einer Probe bekannten Nukleinsäuregehalts durchzuführen. Auch die Erstellung einer Eichkurve ist möglich und empfehlenswert.
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann auf allen in der EP-A- 02 00 362 genannten Gebieten eingesetzt werden. Auch in der Virus- und Bakteriendiagnostik gemäß EP-A-02 29 701 und EP-A-01 31 052 ist das Verfahren einsetzbar.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens umfaßt die besonders bevorzugte Ausführungsform des Herstellungsverfahrens und eine anschließende Detektion der neu gebildeten Nukleinsäure. Für die Detektion haben sich folgende Rahmenbedingungen als besonders vorteilhaft erwiesen: Abtrennung der gebildeten Nukleinsäuren an einer Streptavidin- Oberfläche (DE-A-38 17 716) 1 bis 4 Stunden bei 37°C; Waschen mit Puffer; Inkubation mit Lösung eines AK gegen Digoxigenin, der mit alkalischer Phosphatase markiert ist; Waschen mit Puffer; Inkuba­ tion 4-Methylumbelliferyl-Phosphat, 0,05 bis 0,2 M; Messen in einem Fluoreszenzmeter; Vergleich gegen eine Eichkurve.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine einzel- oder doppel­ strängige Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie 1 oder mehrere nachweisbare Gruppen und 2 oder mehr zur Immobilisierung befähigende Gruppen in einem Nukleinsäurestrang aufweisen. Diese modifizierten Nukleinsäuren haben beispielsweise den Vorteil, daß sie sehr fest an geeigneten Festphasen immobilisierbar sind. Sie können unter Verwendung einer template-Nukleinsäure in erfindungs­ gemäßer Weise hergestellt werden. Sie können jedoch auch auf andere Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Transskrip­ tion analog zu DE-A-37 26 934, wenn entsprechende Mononukleotidtri­ phosphate (immobilisierbare und nachweisbare Gruppen) eingesetzt werden. Oft sind hierzu keine Primer erforderlich.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind Reagenzkits zur Durchfüh­ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Nuklein­ säuren. Eines dieser Reagenzkits enthält in getrennten Behältern
  • - ein erstes Mononukleotidtriphosphat, das eine nachweisbare Gruppe trägt
  • - ein zweites Mononukleotidtriphosphat, welches eine zu Immobili­ sierung befähigende Gruppe trägt und
  • - ein Enzym, welches unter Verwendung einer template-Nukleinsäure und vier Mononukleotiden eine zu der template-Nukleinsäure kom­ plementäre Nukleinsäure bilden kann.
Außerdem enthält es bevorzugt alle sonstigen Reagenzien, die zur Verlängerung von Primern zu Nukleinsäuren, die zu einem Nuklein­ säurestrang komplementär sind, benötigt werden. Dazu gehören ins­ besondere mindestens ein Primer, welcher für die nachzuweisende Nukleinsäure oder Nukleinsäurespezies spezifisch ist, sowie alle übrigen Mononukleotidtriphosphate. Außerdem kann es als Hilfsstof­ fe geeignete pH-Puffer-Substanzen, Denaturierungslösungen und Waschlösungen enthalten.
Es enthält außerdem bevorzugt eine spezifische Nukleotid-Sequenz, welche mit dem Primer hybridisieren kann, als Kontrolle.
Gegebenenfalls enthält das Reagenzkit auch die Reagenzien, welche zur Bestimmung der nachweisbaren Gruppe erforderlich sind. Im Falle der Verwendung von Haptenen ist beispielsweise bevorzugt ein markierter Antikörper in einem getrennten Behälter enthalten.
Ein anderes Reagenzkit enthält in getrennten Behältern:
  • - mindestens einen zu der nachzuweisenden Nukleinsäure im wesent­ lichen komplementären Primer, welcher zwei oder mehr zur Immo­ bilisierung befähigende Gruppen trägt,
  • - mindestens ein Mononukleotidtriphosphat, welches eine nachweis­ bare Gruppe trägt und
  • - ein Enzym, welches unter Verwendung einer template-Nukleinsäure eines Primers und vier Mononukleotiden eine zur template­ nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure bilden kann.
Auch es enthält bevorzugt alle sonstigen Reagenzien, die zur Ver­ längerung von Primern zu Nukleinsäuren benötigt werden. Dazu gehö­ ren hier insbesondere die übrigen Mononukleotidtriphosphate. Auch die genannten Hilfsstoffe, Kontrollnukleinsäuren und Reagenzien zum Nachweis der Gruppe sind bevorzugt darin enthalten.
Fig. 1 zeigt das Ergebnis einer Bestimmung von Nukleinsäuren nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Diese Ergebnisse können auch als Eichkurve verwendet werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläu­ tert:
Polymerase-chain-reaction (PCR) mit zwei verschiedenen modifizierten Mononukleotidtriphosphaten
Verdünnungen von 10 ng-100 ag des Plasmids pSPT18neo (template- Nukleinsäure, Herstellung gemäß Beck et al. in Gene 19 : 327-336 (1982)) werden für die PC-Reaktion gemäß EP-A-02 00 362 verwendet. pSPT18neo enthält die Sequenz des Neomycin(neo)-Gens in einem 940 bp SmaI-BglI-Fragment in der SmaI-BamHI-Site von pSPT18. Das spezifisch amplifizierte Fragment in den Plasmid-Verdünnungen ent­ spricht also 2,3 ng-23 ag. Die Reaktion wird mit in diesem Plasmid die Neo-Sequenz flankierenden T7- und SP6-Promotor spezi­ fischen Primern (Boehringer Mannheim, Best. Nr. 11 75 122 und 902152) gestartet. In einem Volumen von 50 µl werden 30 PCR-Zyklen in KCl, 50 mM; Tris HCl, pH 8,5, 10 mM; MgCl2, 1,5 mM; Gelatine, 100 °/ml; dATP, 200 µM; dCTP, 200 µM; dGTP, 200 µM; dTTP, 100 µM; Digoxigenin-11-2′-desoxyuridin-5′-dUTP (Dig-11- dUTP, EP-A-03 24 474), 50 µM; Biotin-16-2′-desoxyuridin-5′- triphosphat (Bio-16-dUTP, Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 10 93 070), 50 µM; mit T7-Promotor-spezifischem Primer, 300 nM; und SP6-Promotor-spezifischem Primer, 300 nM; mit den angegebenen pSPTl8neo-Verdünnungen und 2,5 U Thermus aguaticus (Taq)-DNA-Poly­ merase durchgeführt.
Zyklen: Denaturierung: 2′ 92°C
Primer-Hybridisierung: 2′ 42°C
Elongation: 2′ 75°C.
Die PCR wird in einem Thermocycler durchgeführt. (DNA-Thermal- Cycler Perkin Elmer Cetus). Die Reaktionsvolumina sind zum Schutz vor Evaporation mit 30 µl Paraffin bedeckt.
Nach der PC-Reaktion werdendie PCR-Produkte mit 5 µl 4 M LiCl ver­ setzt und in 250 µl Äthanol 30′ bei -70°C gefällt, bei 15 000 g 5′ pelletiert, zweimal mit 70% Äthanol gewaschen, getrocknet, in 50 µl Tris, pH 7,5, 10 mM aufgenommen und in eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte pipettiert. Die Bindung der Biotin- Digoxigenin-markierten Moleküle an die Streptavidin-Festphase wird bei 37 oC 2 Stunden durchgeführt. Nach der Wandbindungsreaktion wird mit 2× SSC 3×10′ bei 37°C und mit Konjugat-Puffer (Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM; NaCl 0,9%; BSA, 1%; Pluronic T68, 0,5%) einmal 10′ bei 37°C gewaschen. Anschließend wird mit 40 U <Digoxigenin<- Alkalische Phosphatase-Konjugat 30′ bei 37°C inkubiert und darauf folgend 5× mit je 200 µl Tris HCl, 100 mM; und NaCl, 150 mM gewa­ schen. Zuletzt wird 30′ bei 37°C mit 4-Methylumbelliferyl-Phosphat (0,1 mM) inkubiert und im Dynatech Microfluor-Reader gemessen.
In Fig. 1 wird die Detektion von je 1/5 des Amplifikations­ ansatzes im Streptavidin-Tube gezeigt. Aufgetragen ist das FLuoreszenzsignal gegen die Konzentration an template-Nuklein­ säure. Signale zwischen 100 und 500 fg sind ohne weiteres meßbar.
Beispiel 2 PCR mit mehrfach modifizierten Primern
Die PCR wird mit dem gleichen Target in denselben Konzentrationen wie in Beispiel 1 durchgeführt. In der PC-Reaktion werden 30 Zyklen in KCl, 50 mM; Tris HCl, pH 8,5, 10 mM; MgCl2, 1,5 mM; Gelatine 100 µg/ml; dATP, 200 µM, dCTP, 200 µM; dGTP, 200 µM; dTTP, 133 µM; Dig-11-dUTP, 66 µM; mit T7-Promotor-spezifischen Primern, mehrfach Biotin-markiert 300 nM; und SP6-Promotor-spezi­ fischem Primer, mehrfach Biotin-markiert, 300 nM; mit den in Beispiel 1 angegebenen pSPT18neo-Verdünnungen und 2,5 U Taq-DNA- Polymerase bei gleichen Zyklusprofilen durchgeführt. Nach PCR wird das Reaktionsvolumen mit Tris, pH 8,5, 10 mM; auf 300 µl aufge­ füllt, in einer Sephadex G75-Säule bei 2000 rpm 5′ zentrifugiert und das Eluat mit 30 µl 4 M LiCl in 750 µl Äthanol 30′ bei -70°C gefällt, ebenso zentrifugiert und resuspendiert wie in Beispiel 1.
Die Detektionsreaktion mit <Digoxigenin<-Alkalische Phosphatase- Konjugat wird wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Herstellung von mehrfach biotin-markierten Primern:
5′-Mehrfach-markierte Oligonukleotide werden mittels Festphasen­ synthese durch schrittweise Reaktion mit entsprechend geschützten w-Hydroxyalkyl- (gemäß EP-A-02 92 128) und 5-Aminoallyl-2′-desoxy­ uridin-N,N-dialkylaminomethoxy-phosphinen hergestellt. Die nach­ folgende Umsetzung mit Biotin-N-hydroxysuccinimidester liefert mehrfach markierte Oligonukleotide.
Beispiel 3 Bindung mehrfach Biotin-markierter Nukleinsäuren an Streptavidin
Sandwich-Hybridisierungs-Experimente werden mit rekombinanter Hepatitis-B-Virus (HBV) DNA als template (0, 1, 5, 10, 20, 40 und 80 ng), einem HBV-spezifischen Digoxigenin-markierten Oligonukleo­ tid (40 Nukleotide, Digoxigenin-Markierung mit einem Digoxigenin- Molekül während Synthese) als Nachweisprobe und als Fangprobe ent­ weder mit einem einfach Biotin-markiertem HBV-spezifischen Oligo­ nukleotid (40 Nukleotide) oder einem sequenzgleichen mehrfach Biotin-markierten Oligonukletid (8 Biotinmoleküle/Oligonukleotid) durchgeführt. Die template-DNA wird vor der Hybridisierung 10 min. bei 100°C denaturiert und danach sofort auf Eis gebracht. Je 200 ng der Fang- bzw. Nachweisoligonukleotide werden in Natrium­ phosphat, pH 6,8, 50 mM; 2×SSC (NaCl, 300 mM; Na3-Citrat 30 mM); 5× Denhardt′sche Lösung (0,1% Polyvinylpyrrolidon; 0,1% Bovines Serumalbumin; 0,1% Ficoll 400) und mit den angegebenen Mengen an rekombinanter HBV-DNA in einem Gesamtvolumen von 200 µl im Strept­ avidin-beschichteten Tube 60 min bei 37°C hybridisiert.
Danach wird 2×10 min bei 37°C mit 200 µl SSC, 2×/SDS, 0,2% und 1× mit 0,9% NaOH 10 min bei 37°C gewaschen. Anschließend folgt 30 min Inkubation mit 200 µl <Digoxigenin<-Meerrettich-Peroxidase- Konjugat (150 U/ml) bei 37°C in Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM; NaCl 0,9%; BSA, 1%; Pluronic T68 0,5% und 5× Waschen mit 0,9% NaCl. Anschließend wird mit 0,1% 2,2-Azino-di-(3- ethylbenzthiazolin-sulfonat (6)) (ABTS, BM Nr. 7 56 407) in 200 µl ABTS-Puffer (BM-Nr. 11 12 597) inkubiert und die Extinktion bei 405 nm gemessen.
In Tabelle I ist zu sehen, daß die meßbare Extinktion (d. h. die Zahl der vorhandenen Streptavidin-gebundenen Sandwichmoleküle) bei Verwendung von mehrfach-markierten Fangprobes höher ist (bei sonst völlig identischen Bedingungen). Das weist auf eine effizientere Bindung der mehrfach Biotin-markierten Moleküle hin.
Tabelle 1

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren durch Hybridisie­ rung mindestens eines Primers an eine template-Nukleinsäure und enzymatische Verlängerung des Primers zu einem zu der template-Nukleinsäure komplementären Nukleinsäurestrang durch Reaktion mit verschiedenen Arten von Mononukleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß der komplementäre Nukleinsäurestrang zwei oder mehr zur Immobilisierung befähigende Gruppen und eine oder mehr nachweisbare Gruppen trägt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß min­ destens eine Art von Mononukleotiden eine nachweisbare Gruppe und die gleiche oder mindestens eine andere Art von Mono­ nukleotiden eine zur Immobilisierung befähigende Gruppe trägt.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Primer ein oder mehrere zur Immobili­ sierung befähigende Gruppe trägt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Primer mindestens zwei immobilisierbare Gruppen trägt und eine Art von Mononukleotiden eine nachweisbare Gruppe trägt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sowohl die hergestellte Nukleinsäure als auch die ursprüngliche template-Nukleinsäure als template-Nuklein­ säuren zur Bildung weiterer Nukleinsäuren eingesetzt werden.
6. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Bildung eines zu mindestens einem Teil eines Stranges der nachzuweisenden Nukleinsäure komplementären Stranges, Bindung der gebildeten Nukleinsäure an eine feste Phase und Nachweis der gebildeten Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß der komplementäre Strang durch Hybridisierung mindestens eines Primers an eine template-Nukleinsäure und enzymatische Verlängerung des Primers zu einem zu der template-Nukleinsäure im wesentlichen komplementären Nukleinsäurestrang durch Reaktion mit ver­ schiedenen Arten von Mononukleotiden unter Verwendung der nachzuweisenden Nukleinsäure als template-Nukleinsäure gebil­ det wird und der komplementäre Nukleinsäurestrang zwei oder mehr zur Immobilisierung befähigende Gruppen und eine oder mehr nachweisbare Gruppen trägt.
7. Reagenz zur Herstellung von Nukleinsäuren, enthaltend ein Mononukleotidtriphosphat, welches eine nachweisbare Gruppe trägt, und ein Mononukleotidtriphosphat, welches eine zur Immobilisierung befähigende Gruppe trägt.
8. Reagenzkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, enthaltend in getrennten Behältern:
  • - ein erstes Mononukleotidtriphosphat, das eine nachweisbare Gruppe trägt
  • - ein zweites Mononukleotidtriphosphat, welches eine zu Immo­ bilisierung befähigende Gruppe trägt und
  • - ein Enzym, welches unter Verwendung einer template-Nuklein­ säure und vier Mononukleotiden eine zu der template- Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure bilden kann.
9. Reagenzkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, enthaltend in getrennten Behältern:.
  • - mindestens einen zu der nachzuweisenden Nukleinsäure im wesentlichen komplementären Primer, welcher zwei oder mehr zur Immobilisierung befähigende Gruppen trägt,
  • - mindestens ein Mononukleotidtriphosphat, welches eine nach­ weisbare Gruppe trägt und
  • - ein Enzym, welches unter Verwendung einer template-Nuklein­ säure eines Primers und vier Mononukleotiden eine zur template-Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure bilden kann.
10. Einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie eine oder mehrere nachweisbare Gruppen und zwei oder mehr zur Immobilisierung befähigende Gruppen in einem Nukleinsäurestrang aufweist.
11. Reagenzkit gemäß Ansprüchen 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem eine Kontrollnukleinsäure enthält.
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