DE3912046A1 - New luminescent dyes - of cyanine, merocyanine or styryl type, contg. sulpho gps., useful for labelling components in aq. media - Google Patents

New luminescent dyes - of cyanine, merocyanine or styryl type, contg. sulpho gps., useful for labelling components in aq. media

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DE3912046A1 DE19893912046 DE3912046A DE3912046A1 DE 3912046 A1 DE3912046 A1 DE 3912046A1 DE 19893912046 DE19893912046 DE 19893912046 DE 3912046 A DE3912046 A DE 3912046A DE 3912046 A1 DE3912046 A1 DE 3912046A1
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Abstract

(A) Luminescent dyes of formula (I)-(III) are new; where X and Y = O, S or CMe2; m = 1-4; at least one of R1-R7 contains a NCS, NCO, mono- or dichlorotriazinyl; mono- or dihalopyridyl, mono- or dihalodiazinyl, maleimido, aziridinyl, halosulphonyl, halocarbonyl, succinimidyloxycarbonyl, sulphosuccinimidyloxycarbonyl, imido ester, hydrazino, azidonitrophenyl, N3, 3-(2-pyridyldithio)propionamido, COCHO or CHO gp.; at least one of R8 and R9 contains a sulpho gp., opt. in salt form, bonded to an aromatic ring; apart from the above characteristics, R1-R9 are not specifically defined; the significance of the dotted lines is not defined, but in subsidiary claims the left-hand dotted line represents an o-phenylene or 1, 2-naphthylene gp. in (I)-(III) and the right-hand dotted line represents an o-phenylene or 1, 2-naphthylene gp. in (I) and completes and 2-Z-hexahydro-4, 6-dioxo-5-pyrimidylidene gp. in (II), where Z = O or S. (B) New prods. are prepd. by reacting a component contg. an amine, CHO, SH or OH gp. with a water-soluble sulphoindolenin- or naphthosulphoindolenin-based polymethine dye contg. at least one substit. covalently reactive with the amine, CHO, SH or OH gp. The individual dye mols. on the reaction prod. have a mean molar extinction coefft. of at least 50,000 l/mol-cm and a mean quantum efficiency of at least 2% and have absorption and emission maxima in the 400-850 nm range in aq. media. USE/ADVANTAGE - The process may be used to label proteins, nucleic acids, drugs, toxins, cells, particles, plastics or glass surfaces, polymer membranes, etc., for use in assay or flow cytometry systems. The SO3H gps. increase the water-solubility of the dyes and reduce luminescence quenching due to dye/dye interactions.

Description

Cyanin-Farbstoffe und damit verwandte Polymethin-Farbstoffe mit lichtabsorbierenden Eigenschaften sind bereits in photographischen Filmen verwendet worden. Cyanine dyes and related polymethine dyes with light-absorbing properties have been used in photographic films. Obgleich solche Farbstoffe lichtabsorbierende Eigenschaften erfordern, benötigen sie keine Lumineszenz-(Fluoreszenz- oder Phosphoreszenz-)Eigenschaften. Although such dyes require light-absorbing properties, they do not require luminescence (fluorescence or phosphorescence) properties. Cyanin-Farbstoffe mit Lumineszenz-Eigenschaften haben bislang eine nur sehr eingeschränkte Verwertung erfahren. Cyanine dyes having luminescence properties have so far experienced a very limited utilization. Eine solche Verwendung ist beispielsweise die Markierung der Sulfhydrylgruppe von Proteinen. Such a use is, for example, the labeling of the sulfhydryl group of proteins. In einem Bericht, Salama, G., Waggoner, AS und Abramson J., wird unter dem Titel "Sulfhydrylreagens-Farbstoffe lösen die rasche Freisetzung von Ca 2+ aus Sarcoplasmin-Reticulum-Bläschen (SR)" aus Biophysical Journal, 47, 456a (1985), festgestellt, daß Cyanin-Chromophore mit einer Iodacetylgruppe zur Bildung von kovalenten Bindungen mit Sulfhydrylgruppen auf dem Sarcoplasmin-Reticulum-Protein bei einem pH-Wert von 6,7, um die Ca 2+ -Freisetzung auszulösen, verwendet wurden. In a report, Salama, G., Wagoner, AS and Abramson J., "Sulfhydrylreagens dyes solve the rapid release of Ca 2+ from Sarcoplasmin reticulum vesicles (SR)" under the title of Biophysical Journal, 47, 456a (1985) found that cyanine chromophores have a iodoacetyl group to form covalent bonds with sulfhydryl groups on the Sarcoplasmin reticulum protein at a pH value of 6.7 to initiate the Ca 2+ release used. In dem Bericht heißt es auch, daß Fluoreszenz-Farbstoffe dazu verwendet wurden, um diese Proteine zu markieren und zu isolieren. The report also states that fluorescent dyes have been used to highlight these proteins and isolate.

In einem Bericht von Waggoner, AS, Jenkins, PL, Carpenter, JP und Gupta, R. mit dem Titel "Kinetik von Konformationsveränderungen in einem Bereich des Rhodopsin-Moleküls, von der Retinyliden-Bindungsstelle entfernt" in Biophysical Journal, 33, 292a (1981), stellen die Autoren fest, daß die Sulfhydrylgruppe auf dem F1-Bereich von Vieh-Rhodopsin mit einem Cyanin-Farbstoff mit einer Absorption bei 660 nm kovalent markiert worden ist. In a report by Wagoner, AS, Jenkins, PL, Carpenter, JP and Gupta, R., entitled "Kinetics of conformational changes in one area of ​​the rhodopsin molecule from the retinylidene binding site removed" in Biophysical Journal, 33, 292a ( 1981), the authors state that the sulfhydryl group is has been marked on the F1 region of cattle rhodopsin with a cyanine dye having an absorbance at 660 nm covalently. Auch gemäß diesem Bericht werden Cyanin-Farbstoffe zum spezifischen Markieren der Sulfhydrylgruppe eines Proteins verwendet. Also according to this report cyanine dyes are used for specific labeling of the sulfhydryl group of a protein. Die Verwendung von Fluoreszenz- Farbstoffen wird jedoch in diesem Bericht nicht beschrieben. The use of fluorescent dyes is not described in this report.

Ein Artikel mit der Überschrift "Internationaler Workshop über die Anwendung von Fluoreszenz-Photobleichungstechniken auf Probleme der Zellbiologie" von Jacobson K., Elson E., Koppel D., Webb W. in Fed. An article entitled "International Workshop on the application of fluorescence photobleaching techniques to problems of cell biology" Jacobson K. Elson E. Paddock D., Webb W. Fed. Proc. Proc. 42: 72-79 (1983), berichtet über eine Artikel, der von A. Waggoner eingereicht wurde. 42: 72-79 (1983) reported an article that was submitted by A. Wagoner. Dieser bezieht sich auf Fluoreszenz-Sonden vom Cyanintyp, die an Proteine konjugiert werden können und die im tieferen Rotbereich des Spektrums angeregt werden können. This relates to fluorescent probes type dye that can be conjugated to proteins and can be excited in the deep red region of the spectrum.

In den obengenannten drei Berichten werden als einzige Cyanin- Sonden nur solche erwähnt, die sich kovalent spezifisch an die Sulfhydrylgruppe eines Proteins anheften. In the above three reports mention only those which are attached covalently binds specifically to the sulfhydryl group of a protein as the only cyanine probes. Die einzige speziell genannte Cyaninverbindung ist eine solche, die eine Iodacetylgruppe aufweist, welche Gruppe bewirkt, daß der Cyanin-Farbstoff gegenüber der Sulfhydrylgruppe kovalent reaktiv wird. The only specifically mentioned cyanine compound is one which has an iodoacetyl group, which group causes the cyanine dye with respect to the sulfhydryl group is covalently reactive. In keinem der oben angegebenen Berichte wird die kovalente Reaktion eines Cyanin-Farbstoffs mit irgendeinem anderen Material als einem Protein oder mit irgendeiner anderen Gruppe auf einem Protein als einer Sulfhydrylgruppe beschrieben. In none of the reports indicated above, the covalent reaction of a cyanine dye with at least one other material is described as a protein or with any other group on a protein than one sulfhydryl group.

Viele Nicht-Proteinmaterialien haben jedoch keine Sulfhydrylgruppen, und viele Proteine weisen keine genügende Anzahl von Sulfhydrylgruppen auf, um diese Gruppen für die Zwecke der Fluoreszenz-Sondierung geeignet zu machen. However, many non-protein materials do not have sulfhydryl groups, and many proteins do not have sufficient number of sulfhydryls to make these groups for the purposes of fluorescent probes suitable. Dazu kommt noch, daß Sulfhydrylgruppen (-SHSH-) leicht zu Disulfiden (-SS-) in Gegenwart von Luft oxidiert werden und daher für die kovalente Anheftung an eine Fluoreszenz-Sonde nicht mehr verfügbar werden. Add to this that sulfhydryl (-SHSH-) easy to disulfide (-SS-) are oxidized in the presence of air, it will no longer be available for covalent attachment to a fluorescent probe.

Erfindungsgemäß wurden nun Cyanin- und damit verwandte Polymethin- Farbstoffe entwickelt, die Substituentengruppen besitzen, die unter geeigneten Reaktionsbedingungen nicht nur mit Sulfhydrylgruppen, sondern auch mit Amin-(-NH₂-)- und Hydroxy- (-OH-)Gruppen oder anderen Gruppen, wie Aldehyd-(-CHO-)Gruppen, auf Proteinen und anderen Materialien kovalent reaktiv sind, um eine Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Erfassung dieser Materialien zu ermöglichen. According to the invention have now been cyanine and related polymethine dyes developed which have substituent groups that under suitable reaction conditions not only with sulfhydryl groups, but also with Amin - (- NH₂ -) - and hydroxy (-OH) groups or other groups, as aldehyde - (- CHO) groups on proteins and other materials are covalently reactive to enable fluorescence and phosphorescence detection of those materials. Durch die Erfindung werden erhebliche Vorteile gegenüber der Verwendung der Iodacetyl- Cyanin-Farbstoffe nach dem Stand der Technik und ihrer spezifischen Reaktivität mit Sulfhydrylgruppen realisiert. Through the invention considerable advantages over the use of the iodoacetyl cyanine dyes are realized according to the prior art and their specific reactivity with sulfhydryl groups. Amin- und Hydroxygruppen herrschen in Proteinen und anderen Materialien stärker vor als Sulfhydrylgruppen, und sie sind stabiler. Amine and hydroxyl groups prevail in proteins and other materials more than before sulfhydryl groups, and they are more stable. Wenn daher Fluoreszenz-Cyanin-Farbstoffe zur Erfassung des Vorhandenseins von bestimmten Proteinen verwendet werden, wird ein stärkeres Fluoreszenz- oder Phosphoreszenz-Lichtintensitätssignal abgegeben, weil eine größere Anzahl von Farbstoffmolekülen an das zu sondierende Protein angeheftet werden kann. Therefore, when fluorescent cyanine dyes for detection of the presence of certain proteins may be used, a stronger fluorescence or phosphorescence light intensity signal is output, because a larger number of dye molecules to the protein to be probed can be attached. Weiterhin werden Amin- und Hydroxygruppen leichter an Komponenten, die markiert werden sollen, wie Polymerteilchen, die von Natur aus weder Sulfhydryl-, Amin- oder Hydroxygruppen enthalten, angeheftet. Furthermore, amine and hydroxyl groups are easier to components that are to be marked as polymer particles that naturally contain either sulfhydryl, amine or hydroxyl groups attached.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem Lumineszenz- Cyanin-Farbstoffe, die eine Gruppe enthalten, die mit Amingruppen oder Hydroxygruppen oder anderen reaktionsfähigen Gruppen kovalent sind, dazu verwendet werden, um Proteine oder andere Materialien mit einer Amin- oder Hydroxygruppe oder einer anderen Gruppe, die dazu imstande ist, sich mit dem Farbstoff in einem Gemisch umzusetzen, verwendet, so daß das Vorhandensein und das Ausmaß des markierten Proteins oder des anderen Materials erfaßt werden kann, nachdem die markierten Komponenten durch chromatographische Methoden abgetrennt worden sind. The invention also relates to a method in which luminescence cyanine dyes which contain a group that is covalently bonded to amine groups or hydroxyl groups or other reactive groups may be used to make proteins or other materials with an amine or hydroxyl or other group that is capable of reacting with the dye in a mixture is used, so that the presence and the extent of the labeled protein or other material can be detected after the selected components have been separated by chromatographic methods. Nach den oben angegebenen Druckschriften wurde offenbar die Sulfhydrylgruppe speziell deswegen für die kovalente Reaktion ausgewählt, weil sich auf einem Proteinmolekül so wenige dieser Gruppen befinden und weil in manchen Fällen die Sulfhydrylgruppe in der Funktion des Proteins eine signifikante Rolle spielt. After the above documents apparently the sulfhydryl group was especially so selected for covalent reaction because there are on a protein molecule so few of these groups and because the sulfhydryl group plays a significant role in some cases in the function of the protein. Die Autoren konnten daher annehmen, daß der spezielle Ort einer Sulfhydrylgruppe auf einer Proteinstruktur festgestellt werden kann. The authors could therefore assume that the particular location of a sulfhydryl group can be found on a protein structure. Gemäß diesen Druckschriften wurde der für die Sulfhydrylgruppe spezifische Farbstoff auch als Sonde verwendet, um Strukturveränderungen in einem speziellen Protein zu erfassen oder zu erzeugen. According to these publications the specific dye for the sulfhydryl group was also used as a probe to detect structural changes in a particular protein or produce. Um eine Veränderung der Lichtabsorption durch den Farbstoff oder das durch die Farbstoffbindung freigesetzte Calciumion zu interpretieren, war es erforderlich, zu wissen, wo die Sonde gebunden ist. In order to interpret a change in the light absorption by the dye or released by the dye binding calcium ion, it was necessary to know where the probe is bound.

Da auf den meisten Proteinmolekülen so wenige Sulfhydrylgruppen sind, können diese Gruppen nicht genügend zahlreich sein, um eine angemessene Gesamtlumineszenz für Erfassungsuntersuchungen zu ergeben. There are so few sulfhydryl groups on most protein molecules, these groups may not be sufficient in number to provide adequate total luminescence for detection tests. Demgegenüber sind Amin- und Hydroxygruppen signifikant zahlreicher, und sie sind auf einem Proteinmolekül weit dispergiert, wodurch es ermöglicht wird, daß eine Fluoreszenz-Sonde an vielfache Stellen auf dem Molekül angefügt wird, wodurch eine Interpretation der Lichtabsorptions- und Fluoreszenzveränderungen durch Erleichterung der Erfassung des Proteins ausgeschlossen wird. By contrast, amine and hydroxy groups significantly more numerous, and they are widely dispersed on a protein molecule, thus making it possible that a fluorescent probe is added to multiple sites on the molecule, thereby an interpretation of the light absorption and fluorescence changes due to facilitate the detection of the is protein excluded.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Markierung mit Lumineszenz- Polymethin-Cyanin- und verwandten Polymethin-Farbstoffen, wie Merocyanin- und Styryl-Farbstoffen, von Proteinen und anderen Materialien mit Einschluß von Nucleinsäuren, DNA, Arzneimitteln, Toxinen, Blutzellen, mikrobiellen Materialien, Teilchen, Kunststoff- oder Glasoberflächen, Polymermembranen etc. an einer Amin- oder Hydroxystelle auf den genannten Materialien. The present invention relates to the labeling with luminescent polymethine cyanine and related polymethine dyes such as merocyanine and styryl dyes, proteins and other materials including nucleic acids, DNA, drugs, toxins, blood cells, microbial materials, particles, plastic or glass surfaces, polymer membranes, etc. in an amine or hydroxy site on the said materials. Die Farbstoffe sind vorteilhafterweise in einem wäßrigen oder einem anderen Medium, in dem das markierte Material enthalten ist, löslich. The dyes are advantageously in an aqueous or other medium, to which the labeled material is contained soluble. Die vorliegende Erfindung betrifft ein zweistufiges Markierungsverfahren zusätzlich zu einem einstufigen Markierungsverfahren. The present invention relates to a two-step labeling methods in addition to a one-step labeling method. Bei dem zweistufigen Markierungsverfahren kann eine primäre Komponente, wie ein Antikörper, an Stellen darauf mit Einschluß von Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylstellen, markiert werden, und die markierte Komponente wird als Sonde für die sekundäre Komponente, wie ein Antigen, für das der Antikörper spezifisch ist, verwendet. In the two-step labeling methods may be a primary component such as an antibody can be labeled at sites thereon with inclusion of amine, hydroxy, aldehyde or Sulfhydrylstellen, and the labeled component as a probe for the secondary component, such as an antigen, for which the antibody is specific can be used.

Gemäß dem oben diskutierten Stand der Technik wurde die Spezifizität der Stelle der Anheftung durch eine Cyanin-Sonde dadurch erhalten, daß eine Sonde verwendet wurde, die gegenüber einer Sulfhydrylgruppe kovalent reaktiv ist. According to the above discussed prior art, the specificity of the site of attachment was obtained by a cyanine probe in that a probe is used which is covalently reactive with a sulfhydryl group. Gemäß dem erfindungsgemäßen zweistufigen Verfahren können Cyanin- und damit verwandte Sonden in einer ersten Stufe mit Amin-, Aldehyd-, Sulfhydryl-, Hydroxy- oder anderen Gruppen auf einer ersten Komponente, wie einem Antikörper, umgesetzt werden, worauf der Antikörper die gewünschte Spezifizität in einer zweiten Komponente, wie einem Antigen, in einer zweiten oder Anfärbungsstufe erhalten kann, wobei die Spezifizität durch die Antigenstelle der Anheftung an den Antikörper bestimmt wird. According to the inventive two-stage process cyanine and related probes can be implemented on a first component, such as an antibody, in a first stage with amine, aldehyde, sulfhydryl, hydroxyl or other groups, whereupon the antibodies of the desired specificity in a second component, such as an antigen, can be obtained in a second or Anfärbungsstufe, wherein the specificity is determined by the antigen site of attachment to the antibody.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Lumineszenz-Polymethin- Cyanin-Verbindungen und damit verwandte Verbindungen, die Gruppen enthalten, die sie in die Lage versetzen, kovalent an Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylgruppen auf einem Targetmolekül angeheftet zu werden. The present invention also relates to luminescence polymethine cyanine compounds and related compounds that contain groups that they enable to be covalently attached to amine, hydroxy, aldehyde or sulfhydryl groups on a target molecule. Die Erfindung richtet sich weiterhin auf monoklonale Antikörper und andere Komponenten, die mit diesen Lumineszenz-Cyanin-Verbindungen markiert sind und die dazu imstande sind, Sonden für Antigene zu sein. The invention is further directed to monoclonal antibodies and other components that are labeled with these luminescent cyanine compounds and which are capable of being probes for antigens. Wenn das Target eine Zelltype ist, dann kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, die Menge der markierten Antikörper zu messen, die an die genannte Zelltype angeheftet ist. If the target is a cell type, then the present invention can be used to measure the amount of labeled antibody which is attached to said cell type. Die Messung kann in der Weise erfolgen, daß man die relative Helligkeit oder Abschwächung der Lumineszenz der Zellen erfaßt. The measurement can be done in such a way that it detects the relative lightness or attenuation of luminescence of the cells.

Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, die Konzentration eines bestimmten Proteins oder einer anderen Komponente in einem System zu bestimmen. The present invention can be used to determine the concentration of a particular protein or other component in a system. Wenn die Anzahl der reaktiven Gruppen auf einem Protein, das mit einer Sonde umgesetzt werden kann, bekannt ist, dann ist die Fluoreszenz pro Molekül bekannt, und die Konzentration dieser Moleküle in dem System kann anhand der Gesamt-Lumineszenzintensität des Systems ermittelt werden. If the number of reactive groups on a protein which can be reacted with a probe is known, the fluorescence per molecule is known, and the concentration of these molecules in the system can be determined based on the total luminescence of the system.

Das Verfahren kann dazu angewendet werden, um eine Vielzahl von Proteinen oder anderen Materialien in einem System quantitativ zu bestimmen, indem man alle eines Gemisches von Proteinen in dem System markiert und sodann die markierten Proteine durch irgendwelche Maßnahmen, wie chromatographische Maßnahmen, abtrennt. The method can be applied thereto to determine a variety of proteins or other materials in a system quantitatively by labeling all of a mixture of proteins in the system, and then the labeled proteins by any means, such as chromatographic steps is separated. Die Menge der abgetrennten Proteine, die lumineszieren, kann bestimmt werden. The amount of the separated proteins are luminescent can be determined. In chromatographischen Erfassungssystemen kann der Ort des Farbstoffs auf dem markierten Material ermittelt werden. In chromatographic detection systems, the location of the dye on the labeled material can be detected.

Die Erfindung kann auch dazu verwendet werden, um die Anzahl von verschiedenen Zellen, die mit einem Antikörper etikettiert sind, zu bestimmen. The invention can also be used to determine the number of different cells that are labeled with an antibody. Diese Bestimmung kann in der Weise erfolgen, daß man eine Vielzahl von Typen der Zellen in einem System etikettiert und sodann die etikettierten Zellen außerhalb des Systems abtrennt. This determination may be made in such a way that a plurality of types of labeled cells in a system, and then the labeled cells are separated outside of the system. Auch können die etikettierten Zellen von nichtetikettierten Zellen außerhalb des Systems abgetrennt werden. The labeled cells can be separated from nichtetikettierten cells outside the system.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Multiparameter-Verfahren, bei dem eine Vielzahl von Lumineszenz-Cyanin- oder verwandten Farbstoffen verwendet wird, die jeweils an eine Vielzahl von verschiedenen primären Komponenten, wie Antikörpern, angeheftet sind, wobei jeder Farbstoff für eine unterschiedliche sekundäre Komponente, wie ein Antigen, spezifisch ist, um jeden einer Vielzahl der genannten Antigene in einem Gemisch von Antigenen zu identifizieren. Another embodiment of the present invention, in which a plurality of luminescent cyanine or related dyes is used, each connected to a plurality of different primary components, such as antibodies are attached, each dye for a different secondary a multi-parameter method, component such as an antigen is specific to identify each of a plurality of the above antigens in a mixture of antigens. Gemäß dieser Ausführungsform wird jeder der genannten Antikörper gesondert mit einem Farbstoff mit verschiedener Lichtabsorption und verschiedenen Lumineszenzwellenlängen- Eigenschaften als der Farbstoff, der zur Markierung der anderen Sonden verwendet wird, markiert. According to this embodiment, each of said antibodies is separately with a dye having different light absorption and various Lumineszenzwellenlängen- properties than the dye used to label the different probes labeled. Sodann werden alle markierten Antikörper zu einem zu analysierenden biologischen Präparat gegeben, das sekundäre Komponenten, wie Antigene, enthält, welche jeweils durch bestimmte markierte Antikörper angefärbt werden können. Then, given any labeled antibody to an analyte biological preparation containing secondary components, such as antigens, which can be stained by each specific labeled antibodies. Irgendwelche nichtumgesetzten Farbstoffmaterialien können aus dem Präparat beispielsweise durch Auswaschen entfernt werden, wenn sie die Analyse stören. Any unreacted dye materials can be removed from the preparation, for example by washing out when they interfere with the analysis. Das biologische Präparat wird sodann einer Vielzahl von Anregungswellenlängen ausgesetzt, wobei jede verwendete Anregungswellenlänge die Anregungswellenlänge eines bestimmten konjugierten Farbstoffs ist. The biological specimen is then exposed to a wide range of excitation wavelengths, each excitation wavelength used is the excitation wavelength of a particular conjugated dye. Ein Lumineszenz-Mikroskop oder ein anderes Lumineszenz-Erfassungssystem, wie ein Fließ-Cytometer oder ein Fluoreszenz-Spektrophotometer, das Filter oder Monochrometer zur Auswahl der Strahlen der Anregungswellenlänge und zur Auswahl der Wellenlängen der Lumineszenz aufweist, wird dazu verwendet, um die Intensität der Strahlen der Emissionswellenlänge, die der Anregungswellenlänge entspricht, zu bestimmen. comprises a luminescent microscope or other luminescence detection system, such as a flow cytometer or fluorescence spectrophotometer, the filter or monochrometer to select the rays of the excitation wavelength and to select the wavelengths of the luminescence, is used to control the intensity of the beams to determine the emission wavelength corresponding to the excitation wavelength. Die Intensität der Lumineszenz bei Wellenlängen, die der Emissionswellenlänge eines bestimmten konjugierten Farbstoffs entspricht, zeigt die Menge des Antigens an, die an den Antikörper gebunden ist, an den der Farbstoff angefügt ist. The luminescence intensity at wavelengths corresponding to the emission wavelength of a particular conjugated dye indicates the amount of the antigen which is bound to the antibody to which the dye is added. In bestimmten Fällen kann eine einzige Wellenlänge der Anregung dazu verwendet werden, um Lumineszenz von zwei oder mehreren Materialien in einem Gemisch zu erregen, wobei jede Fluoreszenz bei einer verschiedenen Wellenlänge und die Menge jeder markierten Art dadurch gemessen werden kann, daß man ihre individuelle Fluoreszenzintensität bei der jeweiligen Fluoreszenzwellenlänge erfaßt. In certain cases a single wavelength of excitation can be used to excite luminescence from two or more materials in a mixture, each fluorescence at a different wavelength and the quantity of each labeled species can be measured by reacting at their individual fluorescence intensity the respective fluorescence wavelength detected. Gewünschtenfalls kann eine Lichtabsorptions-Erfassungsmethode angewendet werden. If desired, a light absorption detection method can be applied. Das erfindungsgemäße Zweistufen-Verfahren kann auf ein beliebiges System angewendet werden, bei dem ein mit einem Farbstoff konjugiertes primäres Material und dem Farbstoff ge- oder Lichtabsorptions-Erfassungssystem verwendet wird, um das Vorhandensein eines anderen Materials zu erfassen, auf das das Konjugat aus dem primären Material in dem Farbstoff gerichtet ist. The two-stage process of the invention can be applied to any system in which a conjugated with a dye primary material and the dye bought or light-absorption detection system is used to detect the presence of another material to which the conjugate of the primary material is directed in the dye. So kann beispielsweise der Farbstoff an ein Fragment von DNA oder RNA konjugiert sein, um ein mit Farbstoff konjugiertes DNA- oder RNA-Fragment zu bilden, das sodann auf einen Hauptstrang von DNA oder RNA gerichtet wird, zu dem das Stück komplementär ist. For example, the dye may be conjugated to a fragment of DNA or RNA to form a conjugated dye with DNA or RNA fragment which is then directed to a main strand of DNA or RNA, to which the piece is complementary. Das gleiche Testverfahren kann dazu verwendet werden, um das Vorhandensein von irgendeinem komplementären Hauptstrang von DNA zu erfassen. The same test procedure can be used to detect the presence of any complementary main strand of DNA.

Die erfindungsgemäßen Cyanin- und damit verwandten Farbstoffe sind besonders gut für die Analyse eines Gemisches von Komponenten geeignet, bei dem Farbstoffe einer Vielzahl von Anregungs- und Emissionswellenlängen erforderlich sind, weil spezielle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe synthetisiert werden können, die einen weiten Bereich von Anregungs- und Emissionswellenlängen haben. The cyanine invention and its related dyes are particularly well suited for the analysis of a mixture of components suitable are required in the dyes a variety of excitation and emission wavelengths because special cyanine and related dyes can be synthesized a wide range of have excitation and emission wavelengths. Spezielle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe mit spezifischen Anregungs- und Emissionswellenlängen können synthetisiert werden, indem die Anzahl der Methingruppen variiert wird oder indem die Cyanin-Ringstrukturen modifiziert werden. Specific cyanine and related dyes having specific excitation and emission wavelengths can be synthesized by the number of methine groups is varied, or by the cyanine ring structures are modified. Auf diese Weise ist es möglich, Farbstoffe mit besonderen Anregungswellenlängen zu synthetisieren, um einer besonderen Anregungs-Lichtquelle, wie einem Laser, zum Beispiel einem HeNe-Laser oder einem Diodenlaser, zu entsprechen. In this way, it is possible to synthesize dyes having particular excitation wavelengths to correspond to a particular excitation light source such as a laser, for example a HeNe laser or a diode laser.

Die Erfindung betrifft die kovalente Reaktion von hochlumineszenten und hochlichtabsorbierenden Cyanin- und damit verwandten Farbstoffmolekülen unter Reaktionsbedingungen mit Amin-, Hydroxy-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder anderen Gruppen auf Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren, derivatisierten Nucleinsäuren, Lipiden, bestimmten anderen biologischen Molekülen, biologischen Zellen sowie nichtbiologischen Materialien, beispielsweise löslichen Polymeren, Polymerteilchen, Polymeroberflächen, Polymermembranen, Glasoberflächen und anderen Teilchen und Oberflächen. The invention relates to the covalent reaction of highly luminescent and hochlichtabsorbierenden cyanine and related dye molecules under reaction conditions to amine, hydroxy, aldehyde, sulfhydryl or other groups on proteins, peptides, carbohydrates, nucleic acids, derivatized nucleic acids, lipids, certain other biological molecules, biological cells, as well as non-biological materials such as soluble polymers, polymeric particles, polymer surfaces, polymer membranes, glass surfaces and other particles and surfaces. Da die Lumineszenz hochempfindliche optische Techniken umfaßt, kann die Anwesenheit dieser Farbstoff-"Etiketten" erfaßt und selbst dann quantitativ bestimmt werden, wenn das "Etikett" nur in sehr geringen Mengen vorhanden ist. Since the luminescence comprises highly sensitive optical techniques, the presence of this dye can be detected "labels" and even then quantitatively determined if the "tag" only in very small quantities is present. Somit können die Farbstoffmarkierungs- Reagentien dazu verwendet werden, die Menge eines Materials, das markiert worden ist, zu messen. Thus, the Farbstoffmarkierungs- reagents can be used to measure the amount of a material, which has been labeled. Die am besten geeigneten Farbstoffe sind hochlichtabsorbierend ( ε = 70 000 bis 250 000 l/mol-cm oder höher) und sehr lumineszent, und sie haben Quantenausbeuten von mindestens 5% bis 80% oder mehr. The most suitable dyes are highly light absorbent = 70,000 to 250,000 l / mol-cm or higher) and very luminescent and they have quantum yields of at least 5% to 80% or more. Die qualitativen Eigenschaften betreffen die Farbstoffe selbst und Farbstoffe, die an ein markiertes Material konjugiert sind. The qualitative properties relate to the dyes themselves and dyes that are conjugated to a labeled material.

Eine wichtige Anwendung für diese Farbmarkierungs-Reagentien ist die Herstellung von lumineszierenden monoklonalen Antikörpern. An important application for this color labeling reagents is the production of luminescent monoclonal antibodies. Monoklonale Antikörper sind Proteinmoleküle, die sich sehr eng und sehr spezifisch an bestimmte chemische Stellen oder "Marker" auf Zelloberflächen oder innerhalb von Zellen binden. Monoclonal antibodies are protein molecules that bind very tightly and very specifically to certain chemical sites or "markers" on cell surfaces or within cells. Diese Antikörper besitzen daher eine enorme Forschungseignung und klinische Eignung zur Identifizierung von bestimmten Zelltypen (zum Beispiel HLA-Klassifizierung, T-Zell-Subsets, Bakterien- und Virenklassifizierung etc.) und erkrankte Zellen. Therefore, these antibodies have enormous research and clinical suitability suitability to identify certain cell types (for example, HLA-class, T-cell subsets, bacterial and viral classification etc.) and diseased cells. In der Vergangenheit ist die Menge des an eine Zelle gebundenen Antikörpers dadurch quantitativ bestimmt worden, daß man den Antikörper auf verschiedene Weise markiert hat. In the past, the amount of cell-bound antibody was determined quantitatively, that has marked the antibody in various ways. Das Markieren ist mit einer radioaktiven Markierung (Radioimmuno-Assay), einem Enzym (ELISA-Techniken) oder einem Fluoreszenz-Farbstoff (gewöhnlich Fluorescein, Rhodamin, Texasrot® oder Phycoerythrin) bewerkstelligt worden. The labeling is with a radioactive label (radioimmunoassay), an enzyme (ELISA techniques) or a fluorescent dye (usually fluorescein, rhodamine, or phycoerythrin Texasrot®) been accomplished. Die meisten Hersteller und Anwender von klinischen Antikörper- Reagentien möchten von den mit der Verwendung von radioaktiven Tracern inhärenten Problemen wegkommen, so daß die Lumineszenz als eine der vielversprechendsten Alternativen angesehen wird. Most manufacturers and users of clinical antibody reagents want to get away from the inherent with the use of radioactive tracers problems, so that the luminescence is considered one of the most promising alternatives. Tatsächlich liefern nunmehr viele Firmen mit Fluorescein, Texasrot®, Rhodamin und Phycoerythrin markierte monoklonale Antikörper. In fact, now provide many companies with fluorescein, Texasrot®, rhodamine and phycoerythrin labeled monoclonal antibodies.

In den letzten Jahren ist die optische/elektronische Instrumentierung für die Erfassung von fluoreszierenden Antikörpern auf Zellen komplizierter geworden. In recent years, the optical / electronic instrumentation for the detection of fluorescent antibodies has become more complicated on cells. So kann beispielsweise die Fließ-Cytometrie dazu verwendet werden, um die Menge von fluoreszierendem Antikörper auf individuellen Zellen mit einer Rate von bis zu 5000 Zellen pro Sekunde zu bestimmen. For example, the flow cytometry can be used to determine the amount of fluorescent antibodies to individual cells at a rate of up to 5000 cells per second. Auch mikroskopische und Lösungs-Fluoreszenztechniken haben Fortschritte erzielt. Even microscopic and solution fluorescence techniques have made progress. Diese Instrumente können eine Fluoreszenz bei vielen Wellenlängen des UV-, sichtbaren und nahen IR-Bereichs des Spektrums erregen. These instruments may be fluorescence at many wavelengths of UV, visible and near IR-energize region of the spectrum. Doch können die meisten der derzeit verfügbaren, verwendbaren Fluoreszenz-Markierungs- Reagentien nur im 400- bis 580-nm-Bereich des Spektrums angeregt werden. However, most of the currently available, useful fluorescent labeling reagents can be excited only in the 400 to 580 nm region of the spectrum. Die Ausnahmen sind einige der Pigmente vom Phycobiliprotein-Typ, die aus Meeresorganismen isoliert worden sind und die kovalent an Proteine angeheftet werden können. The exceptions are some of the pigments from the phycobiliprotein-type, which have been isolated from marine organisms and which can be covalently attached to proteins. Diese können bei etwas niedrigeren Wellenlängen angeregt werden. This can be excited at slightly lower wavelengths. Es gibt daher ein großes Spektralfenster im Bereich von 580 bis ungefähr 900 nm, wo es notwendig ist, daß neue Markierungs-Reagentien zur Markierung von biologischen und nichtbiologischen Materialien verfügbar werden, wobei die Analyse mit der derzeit verfügbaren Instrumentierung durchgeführt werden soll. Therefore, there is a large spectral windows in the range from 580 to about 900 nm, where it is necessary that new labeling reagents for labeling of biological and non-biological materials are available, wherein the analysis of the currently available instrumentation to be carried out. Neue Reagentien, die in diesem Spektralbereich anregbar sind, würden es ermöglichen, Multifarb- Lumineszenzanalysen von Markern auf Zellen durchzuführen, da Antikörper mit verschiedenen Spezifizitäten jeweils mit einem verschieden gefärbten Fluoreszenz-Farbstoff markiert werden könnten. New reagents that are excitable in this spectral range, would allow to perform Multifarb- Lumineszenzanalysen of markers on cells that antibodies with different specificities could be each labeled with a different colored fluorescence dye. Somit könnte das Vorhandensein von mehreren Markern gleichzeitig für jede analysierte Zelle bestimmt werden. Thus, the presence of several markers could be determined for each cell analyzed simultaneously.

Die Erfindung betrifft auch lumineszierende (fluoreszierende oder phosphoreszierende) Cyanin-, Merocyanin- und Styryl- Farbstoffe selbst, die an biologische und nichtbiologische Materialien kovalent angeknüpft werden können. The invention also relates to luminescent (fluorescent or phosphorescent) cyanine, merocyanine and styryl dyes themselves, which can be covalently linked to biological and non-biological materials. Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe werden für die Zwecke dieser Erfindung als mit Cyanin-Farbstoffen verwandt angesehen. Merocyanine and styryl dyes are considered used for the purposes of this invention with cyanine dyes. Die neuen Markierungs-Reagentien selbst, jedoch insbesondere dann, wenn sie mit einer markierten Komponente konjugiert sind, können durch Licht von ersten definierten Wellenlängen, zum Beispiel durch Licht in Wellenlängenbereichen des Spektrums von 450 bis 900 nm, angeregt werden. The new labeling reagents itself, however, particularly when they are conjugated with a labeled component, can be excited by light from the first defined wavelengths, for example, light in wavelength regions of the spectrum 450-900 nm. Die Hintergrund-Fluoreszenz von Zellen erfolgt im allgemeinen bei einer niedrigen Wellenlänge. The background fluorescence of cells is generally carried out at a low wavelength. Daher werden sich die Markierungs-Reagentien gegenüber der Hintergrund-Fluoreszenz unterscheiden. Therefore, the labeling reagents will be different compared to the background fluorescence. Von besonderem Interesse sind die Derivate, die Licht bei 633 nm absorbieren, da sie durch billige, intensive, stabile und langlebige HeNe- Laserquellen angeregt werden können. Of particular interest are derivatives that are light absorbing at 633 nm, as they can be encouraged by cheap, intense, stable and durable HeNe laser sources. Licht von zweiten definierten Wellenlängen, das durch die markierte Komponente fluoresziert oder phosphoresziert wird, kann sodann erfaßt werden. Light from the second-defined wavelengths that is fluoresced by the labeled component or phosphorescent, can then be detected. Das fluoreszierte oder phosphoreszierte Licht hat im allgemeinen eine größere Wellenlänge als das Anregungslicht. The fluoresced light or phosphorescent generally has a longer wavelength than the excitation light. In der Erfassungsstufe kann ein Lumineszenz-Mikroskop verwendet werden, das einen Filter zur Absorption von Streulicht der Anregungswellenlänge und zum Durchgang der Wellenlänge hat, die der Lumineszenz entspricht, die der jeweiligen Farbstoffmarkierung entspricht, die mit der Probe verwendet wird. In the detecting step, a luminescence microscope can be used which has a filter for the absorption of scattered light of the excitation wavelength and for passage of the wavelength corresponding to the luminescence, which is used with the sample corresponding to the respective dye marker. Ein derartiges optisches Mikroskop ist zum Beispiel in der US-PS 46 21 911 beschrieben. Such an optical microscope is described, for example in US-PS 46 21 911th

Nicht alle Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe sind lumineszierend. Not all cyanine and related dyes are luminescent. Jedoch schließen die erfindungsgemäßen Farbstoffe solche Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe ein, die lumineszierend sind. However, dyes of the invention include those cyanine and related dyes which are luminescent. Sie sind relativ photostabil, und viele sind in der Reaktionslösung, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung, löslich. They are relatively photostable and many are in the reaction solution, preferably an aqueous solution containing soluble. Die konjugierten Farbstoffe selbst, jedoch insbesondere, wenn sie mit einer markierten Komponente konjugiert sind, haben molare Extinktionskoeffizienten ( ε ) von mindestens 50 000 und vorzugsweise mindestens 100 000 Liter pro mol-cm. The conjugated dyes themselves, but in particular when they are conjugated with a labeled component, have molar extinction coefficient (ε) of less than 50 000 and preferably at least 100 000 liters per mole-cm. Der Extinktionskoeffizient ist ein Maß der Fähigkeit der Moleküle, Licht zu absorbieren. The extinction coefficient is a measure of the ability of the molecules to absorb light. Die erfindungsgemäßen konjugierten Farbstoffe haben Quantenausbeuten von mindestens 2% und vorzugsweise mindestens 10%. The conjugated dyes of the invention have quantum yields of at least 2% and preferably at least 10%. Dazu absorbieren und emittieren die erfindungsgemäßen konjugierten Farbstoffe Licht im Spektralbereich von 400 bis 900 nm und vorzugsweise im Spektralbereich von 600 bis 900 nm. For this purpose absorb and emit conjugated dyes of light in the spectral range from 400 to 900 nm and preferably in the spectral range from 600 to 900 nm.

Arylsulfonierte Farbstoffe Arylsulfonierte dyes

Es wurde nun gefunden, daß die hierin beschriebenen Arylsulfonat- oder Arylsulfonsäure-Farbstoffe ihrer Natur nach stärker fluoreszierend sind und verbesserte Photostabilitäts- und Wasserlöslichkeitseigenschaften haben als ähnliche Farbstoffe ohne Arylsulfonat- oder Arylsulfonsäuregruppen. It has now been found that arylsulfonate or arylsulfonic acid dyes described herein are by their nature fluorescent stronger and improved water solubility and Photostabilitäts- have as similar dyes without arylsulfonate or Arylsulfonsäuregruppen. Die hierin verwendeten Bezeichnungen Arylsulfonat oder Arylsulfonsäure sollen Arylsulfonsäuregruppen oder Arylsulfonatgruppen bezeichnen, wobei die genannten Gruppen an aromatische Ringstrukturen angefügt sind, mit Einschluß einer einzigen aromatischen Ringstruktur oder einer kondensierten Ringstruktur, beispielsweise einer Naphthalinstruktur. The terms aryl sulfonate or aryl sulfonic acid used herein are intended to designate Arylsulfonsäuregruppen or arylsulfonate groups, said groups are attached to aromatic ring structures, with the inclusion of a single aromatic ring structure or a fused ring structure, for example, a naphthalene. Die einzige aromatische Ringstruktur oder die kondensierte aromatische Ringstruktur kann in Polymethin-, Cyanin-, Merocyanin- oder Styryl-Farbstoffen vorhanden sein. The only aromatic ring structure or condensed aromatic ring structure may be present in polymethine, cyanine, merocyanine or styryl dyes.

Viele Farbstoffe mit planaren Molekularstrukturen mit Einschluß von üblichen Cyanin-Farbstoffen neigen dazu, in wäßriger Lösung Dimere und Aggregate höherer Ordnung zu bilden, und zwar insbesondere dann, wenn gleichfalls anorganische Salze vorhanden sind, wie es beispielsweise in gepufferten Lösungen und physiologischer Kochsalzlösung der Fall ist. Many dyes with planar molecular structures with inclusion of conventional cyanine dyes tend to form in aqueous solution dimers and higher order aggregates, particularly when also inorganic salts are present, as for example in buffered solutions and physiological saline solution of the case , Diese Aggregate haben gewöhnlich Absorptionsbanden, die zu der kurzen Wellenlängenseite der Monomerabsorption verschoben sind, und sie sind im allgemeinen sehr schwach fluoreszierende Arten. These units typically have absorption bands that are shifted to the short wavelength side of Monomerabsorption, and they are generally very weak fluorescent species. Die Tendenz der Cyanin-Farbstoffe, in wäßriger Lösung leicht Aggregate zu bilden, ist insbesondere in der Photographie gut bekannt (West, W., und Pierce S., J. Phys. Chem., 69: 2894 (1965); Sturmer, DM, Spec. Top in Heterocyclic Chemistry, 30 (1974)). The tendency of cyanine dyes, easy to form aggregates in aqueous solution, is well known (especially in photography West, W. and S. Pierce, J. Phys Chem, 69: 2894 (1965); Sturmer, DM.. , Spec. Top in Heterocyclic Chemistry, 30 (1974)).

Viele Farbstoffmoleküle und insbesondere Cyanin-Farbstoffmoleküle neigen dazu, in wäßriger Lösung Aggregate zu bilden. Many dye molecules, and particularly cyanine dye molecules tend to form aggregates in aqueous solution. Es ist gefunden worden, daß die Arylsulfonat-Farbstoffe eine minimale Neigung haben, diese Aggregate zu bilden. It has been found that the arylsulfonate dyes have a minimal tendency to form these aggregates. Bei Verwendung zur Bildung von fluoreszierenden Markierungs-Reagentien haben die Arylsulfonat-Farbstoffe eine verminderte Neigung, Aggregate zu bilden, wenn sie mit hohen Oberflächendichten an Proteine oder andere Moleküle, wie Antikörper, gebunden werden. When used for formation of fluorescent labeling reagents which arylsulfonate dyes have to form a reduced tendency aggregates when they are bound with high surface densities of proteins or other molecules such as antibodies. Die Tendenz eines bestimmten Farbstoffmoleküls, Aggregate in einer Salzlösung (zum Beispiel 150 mM Natriumchlorid- Lösung) zu bilden, kann als Maß der Neigung des gleichen Farbstoffmoleküls zur Bildung von Aggregaten auf der Oberfläche von Proteinen genommen werden. The tendency of a particular dye molecule aggregates in a saline solution (for example, 150 mM sodium chloride solution) to form, can be taken as a measure of the inclination of the same dye molecule to form aggregates on the surface of proteins. Für Farbstoffmoleküle wird es daher angestrebt, daß sie eine minimale Neigung haben, in wäßrigen Salzlösungen Aggregate zu bilden. For dye molecules, it is therefore desirable to have a minimal tendency to form aggregates in aqueous salt solutions. Die Werte der Fig. 2 zeigen, daß ein bestimmter arylsulfonierter Farbstoff selbst bei hohen Konzentrationen in wäßriger Salzlösung nur eine niedrige Neigung hat, Aggregate zu bilden. The values of Fig. 2 indicate that a particular arylsulfonierter dye has only a low tendency even at high concentrations in an aqueous saline solution, to form aggregates.

Die Fig. 1 zeigt das Monomer-Absorptionsspektrum und das Dimer-Absorptionsspektrum eines typischen Cyanin-Farbstoffs, gelöst in einem wäßrigen Puffer. Fig. 1 shows the absorption spectrum monomer and the dimer-absorption spectrum of a typical cyanine dye dissolved in an aqueous buffer. Der zur Erzeugung dieser Spektren verwendete Farbstoff, N,N′-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin, weist keine Arylsulfonatgruppen auf und bildet selbst bei Konzentrationen im submillimolaren Bereich leicht Dimere. The dye used to generate these spectra, N, N'-di-sulfobutyl-indodicarbocyanine, has no arylsulfonate groups and forms even at concentrations in the submillimolar range easily dimers. Das Dimer-Spektrum wurde aus den Spektren des Farbstoffs bei verschiedenen Konzentrationen errechnet (vgl. die Methode von West und Pearce, 1965). The dimer spectrum was from the spectra of the dye at different concentrations calculated (see. The method of West and Pearce, 1965). Bei einer 3-mM-Konzentration in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung waren die Absorptionen der Monomer- und Dimerbanden etwa gleich. At a 3 mM concentration in phosphate buffered saline, the absorptions of the monomer and dimer bands were approximately equal.

Das Spektrum des verbesserten Sulfoindodicarbocyanins, N,N′- Diethyl-indodicarbocyanin-5,5′-disulfonsäure, ist in Fig. 2 gezeigt. The spectrum of the enhanced Sulfoindodicarbocyanins, N, N'-diethyl-5,5'-disulfonic acid indodicarbocyanine is shown in Fig. 2. Dieser Farbstoff zeigte bei Konzentrationen bis zu 10 mM kein Anzeichen einer Aggregation in der Kochsalzlösung. This dye showed no sign of aggregation in the saline solution at concentrations up to 10 mM.

Üblicherweise wird die Wirksamkeit, mit der sich ein bestimmter reaktiver Farbstoff an ein Protein, beispielsweise einen Antikörper, kuppelt, unter definierten Reaktionsbedingungen bestimmt. Typically, the efficiency with which a certain reactive dye to a protein such as an antibody, coupling, as determined under defined reaction conditions. Der getestete Farbstoff war der Bis-N-hydroxysuccinimidester von N,N′-Di-carboxypentyl-indodicarbocyanin-5,5′- disulfonsäure. The tested dye was the bis-N-hydroxysuccinimide ester of N, N'-di-carboxypentyl-indodicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid. Die Fig. 3 zeigt, daß dieser aktive Sulfocyanin- Farbstoff-Ester sich wirksam mit Schaf-Immunoglobulin in einem Carbonat-Puffer bei einem pH-Wert von 9,2 umsetzt, wodurch kovalent markierte Antikörpermoleküle gebildet werden, die ein Molverhältnis von Farbstoff zu Antikörper im Bereich von weniger als 1 bis mehr als 20, je nach den relativen Farbstoff- und Antikörperkonzentrationen, in der Reaktionslösung haben. FIG. 3 shows that this active ester Sulfocyanin- dye reacts effectively with sheep immunoglobulin in a carbonate buffer at a pH of 9.2, thereby covalently labeled antibody molecules are formed which have a molar ratio of dye to antibody in the range from less than 1 to more than 20, depending on the relative dye and antibody concentrations, have in the reaction solution. Die Neigung der linearen kleinsten Quadrate der Werte zeigen, daß unter diesen Bedingungen die Markierungswirksamkeit dieses Farbstoffs etwa 80% ist. The slope of the linear least squares of the values ​​show that under these conditions, the labeling efficiency of this dye is about 80%. Bei ähnlichen Untersuchungen setzte sich Fluorescein-isothiocyanat (FITC) mit einer Wirksamkeit von etwa 20% um. Similar studies sat fluorescein isothiocyanate (FITC) to with an efficiency of about 20%.

Die Reaktivität des aktiven Esters des neuen Sulfoindodicarbocyanin- Farbstoffs wurde dadurch untersucht, daß Schaf-Immunoglobulin (IgG) markiert wurde. The reactivity of the active ester of the new Sulfoindodicarbocyanin- dye was investigated by the fact that sheep immunoglobulin (IgG) was marked. Das Protein (4 mg/ml) wurde in 0,1 m Carbonat-Puffer (pH = 9,2) aufgelöst. The protein (4 mg / ml) was dissolved in 0.1 M carbonate buffer (pH = 9.2). Aliquote Teile des reaktiven Farbstoffs, gelöst in wasserfreiem Dimethylformamid, wurden zu den Proteinproben gegeben, um die ursprünglichen Molverhältnisse Farbstoff : Protein zu ergeben. Aliquots of the reactive dye, dissolved in anhydrous dimethylformamide were added to the protein samples to the original molar ratios of dye: protein yield. Nach 30 Minuten wurde das Protein von dem unkonjugierten Farbstoff durch Gel-Permeationschromatographie (Sephadex G-50) abgetrennt. After 30 minutes the protein from the unconjugated dye by gel permeation chromatography (Sephadex G-50) was separated. Die resultierenden Molverhältnisse Farbstoff : Protein wurden spektrophotometrisch bestimmt, und sie sind in Fig. 3 dargestellt. The resulting mole ratios of dye: protein were determined spectrophotometrically, and they are shown in Fig. 3.

Bei niedrigen Verhältnissen von Farbstoff zu Protein zeigen die Absorptionsspektren der markierten Proteine Banden, die eng den Spektren des freien monomeren Farbstoffs entsprechen. At low ratios of dye to protein, the absorption spectra of the labeled proteins bands that correspond closely to the spectra of free monomeric dye show. Bei Antikörpermolekülen, die stark markiert worden sind (hohe Verhältnisse Farbstoff : Protein) oder die mit Farbstoffen mit großer Neigung zur Aggregation in wäßrigen Lösungen markiert worden sind, wird oft festgestellt, daß sie neue Absorptionspeaks haben, die bei kürzeren Wellenlängen erscheinen als die Absorptionsbanden des monomeren Farbstoffs in wäßriger Lösung. In antibody molecules that have been heavily labeled (high ratios dye: protein), or which have been labeled with dyes with great tendency to aggregate in aqueous solutions, it is often found that they have new absorption peaks appear at shorter wavelengths than the absorption bands of the monomeric dye in aqueous solution. Die Wellenlänge des neuen Absorptionspeaks fällt häufig in einen Bereich, der für das Dimer-Absorptionsspektrum des Farbstoffs charakteristisch ist (vgl. Fig. 1). The wavelength of the new absorption peaks frequently falls in a range which is characteristic for the dimer absorption spectrum of the dye (see. Fig. 1).

Stärker markierte Antikörper haben höhere Verhältnisse von kurzen zu langen Wellenlängen-Absorptionspeaks. More labeled antibodies have higher ratios of short to long wavelength absorption peaks. Dieser kürzere Wellenlängen-Absorptionspeak kann in Fig. 4 bei ungefähr 590 nm gesehen werden. This shorter wavelength absorption peak can be seen in Fig. 4 at around 590 nm. Der längere Wellenlängenpeak (bei 645 nm) in Fig. 4 ist auf monomere Farbstoffmoleküle zurückzuführen, die an den Antikörper gebunden sind. The longer wavelength peak (at 645 nm) in Fig. 4 due to monomeric dye molecules that are bound to the antibody. Das Markierungs-Reagens, das verwendet wurde, um das Antikörper-Absorptionsspektrum in Fig. 4 herzustellen (der Bis-N-hydroxysuccinimidester von N,N′-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin-5,5′-essigsäure) besitzt keine Arylsulfonatgruppen und bildet leicht in wäßrigen Salzlösungen und auf Antikörpern, mit denen er umgesetzt worden ist, Dimere. Forms to prepare the antibody-absorption spectrum in Fig. 4 (the bis-N-hydroxysuccinimide ester of N, N'-di-sulfobutyl-indodicarbocyanine-5,5'-acetic acid) has no arylsulfonate groups and the labeling reagent that has been used, easily in aqueous salt solutions and antibodies with which it has been reacted, dimers. Von entscheidender Bedeutung ist es, daß die Fluoreszenz-Anregungsspektren dieser Antikörper zeigen, daß die Anregung der markierten Antikörper beim kurzen Wellenlängenpeak nicht proportional so viel Fluoreszenz erzeugt wie es bei einer Anregung beim längeren Wellenlängenpeak der Fall ist. Of crucial importance is that the fluorescence excitation spectra of these antibodies show that the excitation of the labeled antibody at the short wavelength peak is not generated in proportion as much fluorescence as is the case with an excitation at the longer wavelength peak. Diese Beobachtung steht in Übereinstimmung mit der Idee, daß der kürzere Wellenlängen-Absorptionspeak auf die Bildung von nichtfluoreszierenden Dimeren und Aggregaten auf den Antikörpermolekülen zurückzuführen ist. This observation is in agreement with the idea that the shorter wavelength absorption peak is due to the formation of non-fluorescent dimers and aggregates on the antibody molecules.

Es wurde gefunden, daß das zum Erhalt der Werte der Fig. 3 verwendete Markierungs-Reagens, bestehend aus einem Arylsulfonat- Cyanin-Farbstoff, auf den Antikörpermolekülen nicht ohne weiteres aggregiert. It was found that the Fig for obtaining the values are not aggregated. 3 labeling reagent used, consisting of an arylsulfonate cyanine dye to the antibody molecules readily. Dies ergibt sich aus dem erheblich kleineren Absorptionspeak bei Wellenlängen, bei denen charakteristischerweise Dimere absorbieren (vgl. Fig. 5). This arises from the significantly smaller absorption peak at wavelengths at which characteristically absorb dimers (see. Fig. 5). Dies ist deswegen von Wichtigkeit, weil Antikörper und andere Proteine, die mit diesen "nichtaggregierenden" Markierungs-Reagentien markiert worden sind, stärker fluoreszierende markierte Proteine ergeben sollten. This is so important because antibodies and other proteins, which have been labeled with these "nichtaggregierenden" labeling reagents more should arise, fluorescent labeled proteins. Tatsächlich ergeben die Arylsulfocyanine selbst dann glänzend fluoreszierende Antikörper, wenn das mittlere Verhältnis Farbstoff pro Antikörper relativ hoch ist (vgl. Fig. 6). In fact, the Arylsulfocyanine arise even shiny fluorescent antibody when the average ratio of dye per antibody is relatively high (see. Fig. 6).

Schaf-Immunoglobulin (IgG), das mit einem Carboxyindodicarbocyanin- Farbstoff markiert worden ist, ist in Fig. 4 gezeigt. Sheep immunoglobulin (IgG), which has been labeled with a Carboxyindodicarbocyanin- dye is shown in Fig. 4. Die Fig. 5 zeigt das Protein, das mit dem neuen Sulfiindodicarbocyanin- Farbstoff konjugiert worden ist. FIG. 5 shows the protein that has been conjugated with the new Sulfiindodicarbocyanin- dye. Die Anwesenheit von erhöhtem Dimeren (vgl. Fig. 1) in der erstgenannten Probe ist offensichtlich. The presence of elevated dimers (Fig. See FIG. 1) in the former sample is evident. Obgleich das Molverhältnis Farbstoff : Protein bei beiden Präparaten ungefähr gleich war, war das in Fig. 5 dargestellte Protein erheblich stärker fluoreszierend als die in Fig. 4 gezeigte Probe. Although the molar ratio of dye. Protein was about the same for both preparations, the protein shown in Figure 5 was much more fluorescent than the sample shown in Fig. 4.

Um glänzende bzw. hell fluoreszierende Antikörper oder andere Proteine, die mit Fluoreszenz-Farbstoffen markiert worden sind, zu erhalten, ist es von Wichtigkeit, daß die mittlere Quantenausbeute pro Farbstoffmolekül auf dem Protein so hoch wie möglich ist. In order to obtain bright or bright fluorescent antibodies or other proteins that have been marked with fluorescent dyes, it is important that the average quantum yield per dye molecule on the protein is as high as possible. Es ist allgemein festgestellt worden, daß, wenn die Oberflächendichte der Farbstoffmoleküle auf dem Protein zunimmt (dh, wenn das Verhältnis von Farbstoff zu Protein zunimmt), dann die mittlere Quantenausbeute der Farbstoffe vermindert wird. It has generally been found that when the surface density of the dye molecules on the protein increases (ie, when the ratio of dye to protein increases), then the average quantum yield of the dyes is reduced. Dieser Effekt ist manchmal dem Auslöschen zugeschrieben worden, das als Ergebnis einer Farbstoff- Farbstoff-Wechselwirkung auf der Oberfläche von stärker markierten Proteinen stattfindet. This effect has sometimes been attributed to the erasure, which takes place as a result of a dye-dye interaction on the surface of more labeled proteins. Die Bildung von nichtfluoreszierenden Dimeren auf Proteinoberflächen kann mit Sicherheit zu diesem Auslöschen beitragen. The formation of non-fluorescent dimers on protein surfaces can certainly contribute to this extinction. Die Fig. 6 zeigt, daß die mittlere Quantenausbeute eines Arylsulfocyanin-Farbstoffs langsam abnimmt, wenn das Farbstoff/Protein-Verhältnis zunimmt (Kurve mit Diamantensymbolen). Fig. 6 shows that the average quantum yield of a dye Arylsulfocyanin slowly decreases when the dye / protein ratio increases (curve with diamond symbols). Demgegenüber zeigt die Kurze mit den runden Symbolen, daß eine sehr rasche Abnahme der mittleren Quantenausbeute für das Konjugat eines Nicht-Arylsulfocyanin-Farbstoffs (N,N′-Di-sulfobutyl-indodicarbocyanin- 5-isothiocyanat) stattfindet, wenn das Farbstoff/ Protein-Verhältnis zunimmt. In contrast, the short shows with round symbols that a very rapid decrease in the mean quantum yield of the conjugate of a non-Arylsulfocyanin dye (N, N'-di-sulfobutyl-indodicarbocyanin- 5-isothiocyanate) takes place when the dye / protein ratio increases. Daher ergibt der in Fig. 6 gezeigte Sulfocyanin-Farbstoff stärker glänzend fluoreszierende Antikörper als der andere Farbstoff, und zwar insbesondere im Markierungsbereich von 1 bis 10 Farbstoffmolekülen pro Antikörpermolekül. Therefore, the sulfocyanine dye shown in Fig. 6 results in more shiny fluorescent antibodies as the other dye, especially in the marking range 1-10 dye molecules per antibody molecule.

Die mittlere Fluoreszenz-Quantenausbeute der einzelnen Farbstoffmoleküle auf den markierten Proteinen ist ein Maß des von diesen Biomolekülen erhältlichen Fluoreszenzsignals. The mean fluorescence quantum yield of the single dye molecules on the labeled proteins is a measure of the fluorescence signal available from these biomolecules. Werte von Schaf-Immunoglobulin (IgG), das mit dem neuen Sulfoindodicarbocyanin- Farbstoff in phosphatgepufferter Kochsalzlösung markiert worden war, sind in der Kurve mit Diamantensymbolen der Fig. 6 gezeigt. Values of sheep immunoglobulin (IgG) which had been labeled with the new Sulfoindodicarbocyanin- dye in phosphate buffered saline, FIG. 6 are shown in the curve with diamond symbols. Die Kurve mit runden Symbolen der Fig. 6 zeigt Proteine, die mit einem reaktiven Indodicarbocyaninisothiocyanat- Farbstoff zum Vergleich markiert worden sind. The curve with circular symbols of Fig. 6 shows proteins that have been marked with a reactive dye Indodicarbocyaninisothiocyanat- for comparison. In Fig. 6 stellen die Quantenausbeuten bei einem Verhältnis Farbstoff/Protein von Null die Werte für die Methylamin-Addukte der reaktiven Farbstoffe (freier Farbstoff) im Puffer dar. In FIG. 6, the quantum yields represent the values for the methylamine adducts of the reactive dyes (free dye) in the buffer at a ratio dye / protein of zero.

Hintergrund-Verfahren Background method

Lumineszenz-Sonden sind wertvolle Reagentien für die Analyse und Trennung von Molekülen und Zellen und für die Erfassung und quantitative Bestimmung von anderen Materialien. Luminescent probes are valuable reagents for the analysis and separation of molecules and cells and for the detection and quantitative determination of other materials. Eine sehr kleine Anzahl von lumineszierenden Molekülen kann unter optimalen Umständen erfaßt werden. A very small number of luminescent molecules can be detected under optimal circumstances. Barak und Webb sehen weniger als 50 Fluoreszenz-Lipid-Analoge im Zusammenhang mit der LDL-Rezeption von Zellen unter Verwendung einer SIT-Kamera, J. Cell. Barak and Webb see less than 50 fluorescent lipid analogs related to the LDL reception of cells using a SIT camera, J. Cell. Biol. 90: 595-605 (1981). Biol. 90: 595-605 (1981). Die Fließ-Cytomerie kann dazu verwendet werden, um weniger als 10 000 Fluoresceinmoleküle zu erfassen, die mit Teilchen oder bestimmten Zellen assoziiert sind (Muirhead, Horan und Poste, Bio/Technology 3: 337-356 (1985)). The flow-Cytomerie can be used to detect fewer than 10 000 fluorescein molecules that are associated with particles or certain cells (Muirhead, Horan and Poste, Bio / Technology 3: 337-356 (1985)). Einige spezielle Beispiele für die Anwendung von Fluoreszenz-Sonden sind (1) die Identifizierung und Trennung von Subpopulationen von Zellen in einem Gemisch von Zellen durch die Techniken der Fluoreszenz-Fließ-Cytometrie, der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung und der Fluoreszenz- Mikroskopie; Some specific examples of the use of fluorescent probes are (1) the identification and separation of subpopulations of cells in a mixture of cells by the techniques of fluorescence flow cytometry, fluorescence-activated cell sorting, and fluorescence microscopy; (2) die Bestimmung der Konzentration einer Substanz, die sich an eine zweite Art bindet (zum Beispiel Antigen-Antikörper-Reaktionen), bei der Technik des Fluoreszenz-Immunoassays; (2) determining the concentration of a substance, which binds to a second type (for example, antigen-antibody reactions) in the technique of fluorescence immunoassay; (3) die Lokalisierung von Substanzen in Gelen und anderen unlöslichen Trägern durch die Techniken der Fluoreszenz-Anfärbung. (3) localization of substances in gels and other insoluble supports by the techniques of fluorescence staining. Diese Techniken werden von Herzenberg et al., "Cellular Immunology", 3. Auflage, Kapitel 22; These techniques are described by Herzenberg et al, "Cellular Immunology", 3rd edition, Chapter 22. Blackwell Scientific Publications, 1978 (Fluoreszenz- aktiviertes Zellsortieren); Blackwell Scientific Publications, 1978 (fluorescence-activated cell sorting); und von Goldman, "Fluorescence Antibody Methods", Academic Press, New York, 1968 (Fluoreszenz- Mikroskopie und Fluoreszenz-Anfärbung); and Goldman, "Fluorescence Antibody Methods", Academic Press, New York, 1968 (fluorescence microscopy and fluorescence staining); und in "Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences", herausgegeben von Taylor et al., Alan Liss Inc., 1986, beschrieben. and described in "Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences", edited by Taylor et al., Alan Liss Inc., 1986.

Bei der Verwendung von Fluoreszenzmitteln für die obigen Zwecke bestehen hinsichtlich der Wahl des Fluoreszenzmittels viele Beschränkungen. When using fluorescent agents for the above purposes are made as to the choice of the fluorescer many restrictions. Eine Beschränkung besteht in den Absorptions- und Emissionseigenschaften des Fluoreszenzmittels, da viele Liganden, Rezeptoren und Materialien in der Testprobe, zum Beispiel Blut, Urin, Cerebrospinal-Flüssigkeit, fluoreszieren und die genaue Bestimmung der Fluoreszenz der fluoreszierenden Probe stören. A limitation consists in the absorption and emission characteristics of the fluorescer since many ligands, receptors, and materials in the test sample, such as blood, urine, cerebrospinal fluid fluoresce and interfere with the accurate determination of the fluorescence of the fluorescent sample. Diese Erscheinung wird als Autofluoreszenz oder Hintergrund-Fluoreszenz bezeichnet. This phenomenon is called autofluorescence or background fluorescence. Ein weiterer Gesichtspunkt ist die Fähigkeit des Fluoreszenzmittels, mit Liganden und Rezeptoren und anderen biologischen und nichtbiologischen Materialien zu konjugieren, und der Effekt einer solchen Konjugation auf das Fluoreszenzmittel. Another aspect is the ability of the fluorescer to conjugate with ligands and receptors, and other biological and non-biological materials, and the effect of such conjugation on the fluorescer. In vielen Situationen kann die Konjugierung an ein anderes Molekül zu einer wesentlichen Veränderung der Fluoreszenz- Eigenschaften des Fluoreszenzmittels führen und in manchen Fällen sogar die Quantenleistung des Fluoreszenzmittels wesentlich zerstören oder vermindern. In many situations, the conjugation can lead to a significant change in the fluorescence properties of the fluorescent agent, and even substantially destroy or reduce in some cases the quantum power of the fluorescent agent to another molecule. Es ist auch möglich, daß die Konjugierung mit dem Fluoreszenzmittel die Funktion des zu markierenden Moleküls inaktiviert. It is also possible that the conjugation with the fluorescent agent inactivates the function of the molecule to be labeled. Eine dritte Erwägung liegt in der Quantenleistung des Fluoreszenzmittels, die für eine empfindliche Erfassung hoch sein sollte. A third consideration is the quantum power of the fluorescent agent, which should be high for a sensitive detection. Eine vierte Erwägung ist die Lichtabsorptionsfähigkeit oder der Extinktionskoeffizient des Fluoreszenzmittels, der so groß wie möglich sein sollte. A fourth consideration is the light absorptivity or the extinction coefficient of the fluorescent agent, which should be as large as possible. Von Wichtigkeit ist auch, ob sich die Fluoreszenzmoleküle miteinander umsetzen, wenn sie sich in enger Nähe befinden, was zu einem Selbstauslöschen führen würde. Of importance is whether the fluorescent molecules put together when they are in close proximity, which would lead to a Selbstauslöschen. Eine weitere Befürchtung geht dahin, ob eine nichtspezifische Bindung des Fluoreszenzmittels an andere Verbindungen oder Behälterwände entweder selbst oder in Verbindung mit der Verbindung, an die das Fluoreszenzmittel konjugiert wird, erfolgt. Another concern is whether a non-specific binding of the fluorescer to other compounds or container walls, either by themselves or in conjunction with the compound to which the fluorescer is conjugated occurs.

Die Anwendbarkeit und der Wert der oben beschriebenen Methoden sind eng an die Verfügbarkeit von geeigneten fluoreszierenden Verbindungen gekoppelt. The applicability and value of the methods described above are closely tied to the availability of suitable fluorescent compounds. Insbesondere besteht ein Bedarf an fluoreszierenden Substanzen, die in dem längeren Wellenlängenbereich des sichtbaren Bereichs (Gelb bis nahes Infrarot) emittieren, da die Anregung dieser Chromophoren weniger Autofluoreszenz und auch vielfache Chromophoren ergibt, die bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren, die gleichzeitig analysiert werden können, wenn die gesamten sichtbaren und die nahen Infrarotbereiche des Spektrums verwendet werden können. In particular, there is a need for fluorescent substances that emit in the longer wavelength region of the visible region (yellow to near infrared), since the excitation of these chromophores gives less autofluorescence and multiple chromophores which fluoresce at different wavelengths can be analyzed simultaneously when the entire visible and near infrared regions of the spectrum can be used. Fluorescein, eine weit verwendete fluoreszierende Verbindung, ist eine geeignete Emissionsverbindung im grünen Bereich, obgleich bei bestimmten Immunoassays und Zellanalysensystemen die Hintergrund-Autofluoreszenz, welche durch Anregung bei Fluorescein-Absorptionswellenlängen erzeugt wird, die Empfindlichkeit der Erfassung beschränkt. Fluorescein, a fluorescent compound widely used, is a suitable compound emission in the green range, although the background autofluorescence, which is generated by excitation at fluorescein absorption wavelengths, limited the sensitivity of detection for certain immunoassays and cell analysis systems. Jedoch hat sich das herkömmliche rotfluoreszierende Markierungsmittel Rhodamin als weniger wirksam als Fluorescein erwiesen. However, the conventional red fluorescent marker rhodamine has proven to be less effective than fluorescein. Texasrot® ist ein geeignetes Markierungsmittel, das bei 578 nm angeregt werden kann und maximal bei 610 nm fluoresziert. Texasrot® is a suitable labeling agent that can be excited at 578 nm and a maximum fluorescence at 610 nm.

Phycobiliproteine haben einen wichtigen Beitrag wegen ihres hohen Extinktionskoeffizienten und der hohen Quantenausbeute gemacht. Phycobiliproteins have made an important contribution because of their high extinction coefficients and high quantum yield. Diese Chromophor enthaltenden Proteine können kovalent an viele Proteine gebunden werden, und sie werden in Fluoreszenz-Antikörper-Assays in der Mikroskopie und der Fließ-Cytometrie verwendet. This chromophore-containing proteins can be covalently attached to many proteins, and they are used in fluorescent antibody assays in microscopy and flow cytometry. Die Phycobiliproteine haben jedoch folgende Nachteile: (1) die Protein-Markierungsverfahrensweise ist relativ komplex; However, phycobiliproteins have the following disadvantages: (1) the protein labeling procedure is relatively complex; (2) die Protein-Markierungsleistung ist gewöhnlich nicht hoch (typischerweise ein Mittel von 0,5 Phycobiliprotein-Moleküle pro Protein); (2) the protein label performance is usually not high (typically an average of 0.5 phycobiliprotein molecules per protein); (3) das Phycobiliprotein ist ein Naturprodukt, und seine Herstellung und Reinigung ist komplex; (3) the phycobiliprotein is a natural product, and its preparation and purification is complex; (4) die Phycobiliproteine sind teuer; (4) the phycobiliproteins are expensive; (5) es sind keine Phycobiliproteine als Markierungs- Reagentien verfügbar, die weiter zum roten Bereich des Spektrums als Allophycocyanin fluoreszieren, welches maximal bei 680 nm fluoresziert; (5) there are no available as phycobiliproteins labeling reagents which fluoresce further to the red region of the spectrum as allophycocyanin, which fluoresces maximally at 680 nm; (6) die Phycobiliproteine sind chemisch relativ instabil; (6) the phycobiliproteins are chemically relatively unstable; (7) sie sind leicht einer Photobleichung unterworfen; (7) they are easily subjected to photobleaching; (8) die Phycobiliproteine sind große Proteine mit Molekulargewichten im Bereich von 33 000 bis 240 000, und sie sind größer als viele Materialien, die markiert werden sollen, wie Metabolite, Arzneimittel, Hormone, derivatisierte Nucleotide und viele Proteine mit Einschluß von Antikörpern. (8) the phycobiliproteins are large proteins with molecular weights ranging from 33,000 to 240,000, and they are bigger than many materials which are to be marked, such as metabolites, drugs, hormones, derivatized nucleotides and many proteins with inclusion of antibodies. Der letztgenannte Nachteil ist von besonderer Wichtigkeit, da Antikörper, Avidin, DNA-Hybridisierungs-Sonden, Hormone und kleine Moleküle, die mit den großen Phycobiliproteinen markiert sind, nicht dazu imstande sein können, sich an ihre Targets wegen sterischer Begrenzungen zu binden, die durch die Größe des konjugierten Komplexes auferlegt werden. The latter disadvantage is of particular importance because antibodies, avidin, DNA hybridization probes hormones and small molecules that are marked with the big phycobiliproteins may not be able to avoid to bind to their targets because of steric constraints caused by the size of the complex conjugate may be imposed. Die Bindungsrate von Konjugaten an Targets ist gegenüber niedermolekularen Konjugaten langsam. The retention rate of conjugates of targets is slow compared to low molecular weight conjugates.

Durch andere Techniken, wie Histologie, Cytologie, Immunoassays, würden auch erhebliche Vorteile durch die Verwendung eines Fluoreszenzmittels mit hoher Quanteneffizienz, Absorptions- und Emissionseigenschaften bei längeren Wellenlängen und mit einfacher Durchführung der Konjugierung, die von einer nichtspezifischen Interferenz im wesentlichen frei sind, erfahren. By other techniques such as histology, cytology, immunoassays, considerable advantages through the use of a fluorescent agent with a high quantum efficiency, absorption and emission characteristics at longer wavelengths, and with easy implementation of conjugation, which are free of non-specific interference essentially would learn.

Gemäß der Erfindung werden reaktive fluoreszierende arylsulfonierte Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe mit relativ großen Extinktionskoeffizienten und hohen Quantenausbeuten zum Zwecke der Erfassung und quantitativen Bestimmung von markierten Komponenten verwendet. According to the invention, reactive fluorescent arylsulfonierte cyanine and related dyes having relatively large extinction coefficients and high quantum yields can be used for the purpose of detection and quantitative determination of selected components.

Fluoreszierende Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe können zur Markierung von biologischen Materialien, wie Antikörpern, Antigenen, Avidin, Streptavidin, Proteinen, Peptiden, derivatisierten Nucleotiden, Kohlenhydraten, Lipiden, biologischen Zellen, Bakterien, Viren, Blutzellen, Gewebezellen, Hormonen, Lymphokinen, biologischen Spurenmolekülen, Toxinen und Arzneimitteln, verwendet werden. Fluorescent cyanine and related dyes to label biological materials such as antibodies, antigens, avidin, streptavidin, proteins, peptides, derivatized nucleotides, carbohydrates, lipids, biological cells, bacteria, viruses, blood cells, tissue cells, hormones, lymphokines, biological will trace molecules, toxins and drugs used. Fluoreszenz-Farbstoffe können auch zur Markierung von nichtbiologischen Materialien, wie löslichen Polymeren und Polymeren und Glasteilchen, Arzneimitteln, Leitern, Halbleitern, Glas- und Polymeroberflächen, Polymermembranen und anderen festen Teilchen, verwendet werden. Fluorescent dyes may also be used for marking non-biological materials such as soluble polymers and polymers and glass particles, drugs, conductors, semiconductors, glass and polymer surfaces, polymer membranes and other solid particles. Die zu markierende Komponente kann auch in einem Gemisch mit anderen Materialien vorliegen. The component may also be marked in a mixture with other materials. Das Gemisch, in dem die Markierungsreaktion stattfindet, kann ein flüssiges Gemisch, insbesondere ein wäßriges Gemisch, sein. The mixture in which the labeling reaction takes place can be a liquid mixture, in particular an aqueous mixture. Die Erfassungsstufe kann mit dem Gemisch in flüssigem oder trockenem Zustand, beispielsweise einem Objektträger, durchgeführt werden. The detection step can be carried out with the mixture in liquid or dry state, for example a slide.

Erfindungsgemäß ist es erforderlich, daß Cyanin-Farbstoffe durch die Einarbeitung einer reaktiven Gruppe in das Cyaninmolekül modifiziert werden. According to the invention it is necessary that cyanine dyes are modified by the incorporation of a reactive group in the Cyaninmolekül. Diese reaktive Gruppe heftet sich kovalent an ein Ziel- bzw. Targetmolekül, vorzugsweise an eine Amin- oder Hydroxystelle, und in manchen Fällen an eine Sulfhydryl- oder Aldehydstelle. This reactive group attached covalently to a target or target molecule, preferably to an amine or hydroxy site, and in some cases to a sulfhydryl or Aldehydstelle. Die Erfindung verwendet auch die Modifizierung oder Verwendung von Cyanin- und damit verwandten Farbstoffstrukturen, um ihre Löslichkeit in der Testflüssigkeit zu erhöhen, um (1) ihre Handhabung bei Markierungsreaktionen leichter zu machen, (2) die Aggregation des Farbstoffs auf der Oberfläche der zu markierenden Proteine zu verhindern helfen und (3) die nichtspezifische Bindung von markierten Materialien an biologische Materialien und an Oberflächen und die Assayvorrichtung zu verhindern helfen. The invention also uses the modification or the use of cyanine and related dye structures in order to increase its solubility in the test liquid to make (1) their handling during labeling reactions easier to be labeled (2) aggregation of the dye on the surface of help to prevent the nonspecific binding of labeled materials to biological materials and surfaces and assay device help prevent proteins, and (3).

Die Cyanin- und die damit verwandten Farbstoffe bieten einen wichtigen Vorteil über derzeit verfügbare fluoreszierende Markierungs-Reagentien. The cyanine and its related dyes offer an important advantage over currently available fluorescent labeling reagents. Zum ersten sind Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe synthetisiert worden, die in einem Bereich des Spektrums von 400 bis nahezu 1100 nm absorbieren und emittieren. For the first cyanine and related dyes have been synthesized which absorb and in a region of the spectrum from 400 to almost 1100 nm emit. Somit können reaktive Derivate dieser Farbstoffe für Assays hergestellt werden, die eine gleichzeitige Messung einer Anzahl von markierten Materialien erfordern. Thus can be prepared for assays that require simultaneous measurement of a number of labeled materials reactive derivatives of these dyes. Die Vielfarben-(oder Multiparameter-)analyse dieser Art kann im Interesse der Einfachheit, der Kostenwirksamkeit oder zur Bestimmung von Verhältnissen von verschiedenen markierten Arten auf jedem Teilchen in einem komplexen Gemisch von Teilchen zweckmäßig sein (zum Beispiel der Verhältnisse von Antigen-Markern auf individuellen Blutzellen in einem komplexen Gemisch durch Multiparameter-Fließ-Cytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie). The multicolor (or multiparameter) analysis of this type may in the interests of simplicity, cost-effectiveness or for the determination of ratios of different labeled species on each particle in a complex mixture of particles suitably (for example, the ratios of antigen markers on individual blood cells in a complex mixture by multi-parameter flow cytometry or fluorescence microscopy). Zum zweiten absorbieren und fluoreszieren viele Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe stark. To absorb second and many cyanine and related dyes fluoresce strongly. Zum dritten sind viele Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe relativ photostabil, und sie bleichen nicht ohne weiteres im Fluoreszenz-Mikroskop. Third, many cyanine and related dyes are relatively photostable and they do not bleach easily in the fluorescence microscope. Zum vierten können Cyanin- und damit verwandte Derivate hergestellt werden, die einfache und wirksame Kupplungs-Reagentien sind. For the fourth cyanine and related derivatives can be prepared, the simple and efficient coupling reagents. Zum fünften sind viele Strukturen und synthetische Verfahrensweisen verfügbar, und die Klasse der Farbstoffe ist vielfältig. The fifth many structures and synthetic procedures are available and the class of dyes is versatile. Es können daher viele Strukturmodifikationen durchgeführt werden, um die Reagentien mehr oder weniger wasserlöslich zu machen. Therefore, many structural modifications are made to make the reagents, more or less water soluble. Ihre Ladung kann verändert werden, so daß sie das Molekül nicht stören, an das sie angefügt sind, wodurch die nichtspezifische Bindung reduziert werden kann. Their charge can be changed so that they do not interfere with the molecule to which they are attached, whereby the non-specific binding can be reduced. Zum sechsten sind im Gegensatz zu den Phycobiliproteinen die Cyanin-Farbstoffe relativ klein (Molekulargewicht = 1000), so daß sie nicht nennenswerterweise mit der Fähigkeit des markierten Moleküls sterisch interferieren, ihre Bindungsstelle rasch zu erreichen oder ihre Funktion auszuüben. For the sixth, the cyanine dyes are relatively small (molecular weight = 1000) in contrast to the phycobiliproteins, so that they do not appreciably legally interfere sterically with the ability of the labeled molecule to reach its binding site quickly or to exert their function.

Somit bringen Cyanin-Farbstoff-Markierungsmittel viele potentielle Vorteile mit sich. Thus, cyanine dye labeling means bring many potential advantages. Diese Farbstoffe können dazu verwendet werden, um ein oder mehrere Komponenten in einer Flüssigkeit, insbesondere einer wäßrigen Flüssigkeit, selektiv zu markieren. These dyes can be used to selectively select one or more components in a liquid, particularly an aqueous liquid. Die markierten Komponenten können sodann durch optische oder Lumineszenzmethoden erfaßt werden. The selected components can then be detected by optical or luminescence. Alternativ kann die markierte Komponente dazu verwendet werden, um eine zweite Komponente anzufärben, für die sie eine starke Affinität besitzt. Alternatively, the labeled component can be used to stain a second component, for which it has a strong affinity. Die Anwesenheit der zweiten Komponente wird sodann durch optische oder Lumineszenzmethoden festgestellt. The presence of the second component is then detected by optical or luminescence. In diesem Fall wird der Farbstoff mit einer Amin-, Hydroxy-, Aldehyd- oder Sulfhydrylgruppe auf der markierten Komponente umgesetzt. In this case, the dye with an amine, hydroxy, aldehyde or sulfhydryl group is converted to the labeled component. So kann beispielsweise die markierte Komponente ein Antikörper sein, und die angefärbte Komponente, für die sie eine starke Affinität hat, kann eine biologische Zelle, ein Antigen oder ein Hapten oder eine biologische Zelle oder ein Teilchen, das das genannte Antigen oder Hapten enthält, sein. Thus, the labeled component can, for example, be an antibody and the stained component for which it has a strong affinity, a biological cell, an antigen or a hapten or a biological cell or a particle containing the said antigen or hapten to be , Gemäß einem weiteren Beispiel ist die markierte Komponente Avidin, und die angefärbte Komponente kann ein biotinyliertes Material sein. According to another example, the labeled component avidin, and the stained component may be a biotinylated material. Auch können Lectine, die mit Polymethin-Cyanin-Farbstoffen konjugiert sind, dazu verwendet werden, um spezielle Kohlenhydratgruppen zu erfassen und quantitativ zu bestimmen. Also can be used to lectins conjugated with polymethine cyanine dyes to detect specific carbohydrate groups and quantify. Weiterhin können Lumineszenz- Cyanin- und damit verwandte Farbstoffe an Fragmente von DNA oder RNA angeheftet werden. Furthermore, luminescent cyanine and related dyes can be attached to fragments of DNA or RNA. Die markierten Fragmente von DNA oder RNA können als Fluoreszenz-Hybridisierungssonden verwendet werden, um das Vorhandensein und die Menge von spezifischen komplementären Nucleotid-Sequenzen in Proben, die DNA oder RNA enthalten, zu identifizieren. The labeled fragments of DNA or RNA can be used as fluorescent hybridization probes to identify the presence and amount of specific complementary nucleotide sequences in samples containing DNA or RNA. Auch kann der Farbstoff an ein Hormon oder an einen Liganden (zum Beispiel ein Hormon, ein Protein, ein Peptid, ein Lymphokin, einen Metaboliten) angefügt werden, das bzw. der danach an einen Rezeptor angefügt wird. Also, the dye to a hormone or to a ligand (for example, a hormone, a protein, a peptide, a lymphokine, metabolite) can be attached, or that is thereafter attached to a receptor.

Für andere Zwecke in Patentschriften beschriebene reaktive Cyanin-Farbstoffe described in patents for other purposes reactive cyanine dyes

Gemäß den US-PS 43 37 063 (Miraha et al.), 44 04 289, 44 05 711 und 44 14 325 (Masuda et al.) ist eine Vielzahl von Cyanin-Farbstoffen synthetisiert worden, die aktive N-Hydroxysuccinimidester- Gruppen enthalten. According to US-PS 43 37 063 (Miraha et al.), 44 04 289, 44 05 711 and 44 14 325 (Masuda et al.) Discloses a variety of cyanine dyes have been synthesized, the active N-hydroxysuccinimide ester groups contain , Diese Patente zeigen, daß diese Reagentien als photographische Sensibilisatoren verwendet werden können. These patents show that these reagents can be used as photographic sensitizers. Die möglichen Fluoreszenz-Eigenschaften dieser Reagentien sind in den Patenten nicht genannt. The possible fluorescence properties of these reagents are not mentioned in the patents. Tatsächlich sind auch für diese Prozesse keine Fluoreszenz-Eigenschaften erforderlich. In fact, no fluorescence properties are also required for these processes. Die meisten der in diesen Patentschriften genannten Farbstoffe sind nur schwach fluoreszierend, und sie sind nicht besonders photostabil. Most referred to in these patents dyes are only weakly fluorescent, and they are not particularly photostable. Weiterhin sind ihre Löslichkeitseigenschaften für viele Anwendungszwecke nicht optimal, die eine Fluoreszenzerfassung von markierten Materialien beinhalten würden. Furthermore, their solubility properties are not optimal for many applications that would include a fluorescence detection of labeled materials.

In der GB-PS 15 29 202 (Exekiel et al.) werden zahlreiche Cyanin-Farbstoffderivate beschrieben, die als kovalent reagierende Moleküle verwendet werden. In GB-PS 15 29 202 (Exekiel et al.) Many cyanine dye derivatives are described, which are used as covalently reacting molecules. Die in diesen Reagentien verwendete reaktive Gruppe ist eine Azingruppe, zu der Mono- und Dichlortriazingruppen gehören. The reactive group used in these reagents is an azine group, belong to the mono and Dichlortriazingruppen. Diese Druckschrift bezieht sich auf die Entwicklung und die Verwendung dieser Reagentien als Sensibilisatoren für photographische Filme. This publication refers to the development and use of these reagents as sensitizers for photographic films. Für dieses Verfahren ist keine Fluoreszenz erforderlich, und die meisten der darin beschriebenen Reagentien sind nicht fluoreszierend. no fluorescence is required for this process, and most of the reagents described therein are not fluorescent. Schließlich bezieht sich diese Druckschrift nicht auf die Entwicklung und Verwendung von reaktiven Cyanin-Farbstoffen zum Zwecke der Erfassung und quantitativen Bestimmung von markierten Materialien. Finally, this document does not relate to the development and use of reactive cyanine dyes for the purpose of detection and quantitative determination of labeled materials.

Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden zum kovalenten Anheften von lumineszierenden Cyanin- und cyaninartigen Farbstoffen an biologische Materialien, nichtbiologische Materialien und Makromoleküle und Teilchen, damit diese Materialien lumineszierend markiert werden. The present invention relates to methods for covalently attaching luminescent cyanine and cyanine dyes to biological materials, non-biological materials and macromolecules and particles, so that these materials are marked luminescent. Auf diese Weise kann das markierte Material durch Lumineszenz-Erfassungsmethoden erfaßt und/oder quantitativ bestimmt werden. In this way, the labeled material can be detected by luminescence detection methods and / or quantitatively determined.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erfassung einer Komponente in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zu der genannten Flüssigkeit einen Farbstoff zusetzt, der aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffen ausgewählt ist und der in der Flüssigkeit löslich ist und einen Substituenten enthält, damit er mit Amin- und Hydroxygruppen und möglicherweise mit Aldehyd- und Sulfhydrylgruppen auf der genannten Komponente kovalent reaktiv wird, so daß die genannte Komponente markiert wird. The invention relates to a method for detecting a component in a liquid, which is characterized in adding a dye to said liquid which is selected from the group consisting of cyanine, merocyanine and styryl dyes and in the liquid is soluble and containing a substituent, so that it is covalently reactive with amine and hydroxyl groups and possibly with aldehyde and sulphydryl groups on said component such that said component is selected. Die markierte Komponente wird sodann durch Lumineszenz- oder Lichtabsorptionsmethoden erfaßt und/oder quantitativ bestimmt. The labeled component is then detected by luminescence or light absorption techniques and / or quantitatively determined. Wenn die markierte Komponente ein Antikörper, ein DNA-Fragment, ein Hormon, ein Lymphokin oder ein Arzneimittel ist, dann kann die markierte Komponente dazu verwendet werden, um das Vorhandensein einer zweiten Komponente, an die es gebunden wird, zu identifizieren, worauf die zweite Komponente erfaßt und/oder quantitativ bestimmt werden kann. If the labeled component is an antibody, a DNA fragment, a hormone, a lymphokine or a drug, the labeled component can be used to identify the presence of a second component to which it is bound, and then the second component can be detected and / or quantified.

Jede beliebige Lumineszenz- oder Lichtabsorptions-Erfassungsstufe kann angewendet werden. Any luminescence or light absorbance detection stage can be applied. So kann beispielsweise die Erfassungsstufe eine optische Erfassungsstufe sein, bei der die Flüssigkeit mit Licht von ersten definierten Wellenlängen bestrahlt wird. Thus, the detection stage may be an optical detection stage, for example, in which the liquid is irradiated with light of first defined wavelengths. Licht mit zweiten definierten Wellenlängen, das durch die markierte Komponente fluoresziert oder phosphoresziert wird, wird hierauf erfaßt. Light having the second defined wavelengths that is fluoresced by the labeled component or phosphorescence is detected thereto. Die Erfassung kann auch durch optische Lichtabsorption erfolgen. The recording can also be done by optical light absorption. So kann beispielsweise die Erfassungsstufe in der Weise durchgeführt werden, daß man Licht mit ersten definierten Wellenlängen durch die Flüssigkeit leitet und sodann die Wellenlänge des Lichts, das durch die Flüssigkeit hindurchgelassen wird, bestimmt. Thus, the detection step can be carried out in the manner, for example, by passing light having first defined wavelengths through the liquid and then the wavelength is allowed to pass through the liquid of the light is determined.

Gewünschtenfalls kann die Erfassungsstufe auch eine chemische Analyse umfassen, um chemisch eine Anheftung des Cyanins oder eines verwandten Chromophors an die Komponente zu erfassen. If desired, the detection step may also include a chemical analysis in order to detect a chemical attachment of the cyanine chromophore or related to the component.

Die Grundstrukturen der Cyanin-, Merocyanin- und Styryl-Farbstoffe, die modifiziert werden können, um kovalente Markierungs- Reagentien zu erzeugen, sind nachfolgend gezeigt: The basic structures of cyanine, merocyanine and styryl dyes which can be modified to produce covalent labeling reagents are shown below:

Spezifischere Beispiele von Polymethin-Cyanin-Farbstoffen sind wie folgt: More specific examples of polymethine cyanine dyes are as follows:

In diesen Strukturen sind In these structures
X und Y aus der Gruppe X and Y selected from the group

ausgewählt; selected;
Z ist aus der Gruppe O und S ausgewählt und Z is selected from the group O and S, and
m ist eine ganze Zahl, die aus der Gruppe bestehend aus 1, 2, 3 und 4 ausgewählt ist. m is an integer which is selected from the group consisting of 1, 2, 3 and 4. FIG.

In den obigen Formeln bestimmt die Anzahl der Methingruppen zum Teil die Anregungsfarbe. In the above formulas, the number of methine groups determines the color excitation part. Die cyclischen Azinstrukturen können auch zum Teil die Anregungsfarbe bestimmen. The cyclic Azinstrukturen can determine the excitation color even partially. Oftmals tragen höhere Werte von m zu einer gesteigerten Lumineszenz und Absorption bei. Often carry higher values of m in in increased luminescence and absorption. Bei Werten von m oberhalb 4 wird die Verbindung instabil. At values above m 4, the connection becomes unstable. Eine weitere Lumineszenz kann durch Modifikationen der Ringstrukturen verliehen werden. Another luminescence can be conferred by modifications of the ring structures. Wenn m = 2, dann ist die Anregungswellenlänge etwa 650 nm, und die Verbindung ist sehr stark fluoreszierend. If m = 2, then the excitation wavelength is about 650 nm, and the connection is very strong fluorescent. Maximale Emissionswellenlängen sind im allgemeinen 15 bis 100 nm höher als die maximalen Anregungswellenlängen. Maximum emission wavelengths are higher than the maximum excitation wavelength generally 15 to 100 nm.

Mindestens einer, vorzugsweise nur einer, und möglicherweise zwei oder mehr der genannten Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ in jedem Molekül ist bzw. sind eine reaktive Gruppe zur Anheftung des Farbstoffs an die markierte Komponente. At least one, preferably only one, and possibly two or more of said groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ is in each molecule, or are a reactive group for attachment of the dye to the labeled component. Für bestimmte Reagentien kann mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ auf jedem Molekül auch eine Gruppe sein, die die Löslichkeit des Chromophors erhöht oder die Selektivität der Markierung der markierten Komponente beeinträchtigt oder die Position der Markierung der markierten Komponente durch den Farbstoff beeinträchtigt. For certain reagents, at least one of the groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ may also be a group on each molecule that increases the solubility of the chromophore or affect the selectivity of the labeling of the labeled component or the position of the marking of the impaired labeled component by the dye.

In den genannten Formeln umfaßt mindestens eine der genannten Gruppen R₈, R₉ (wenn vorhanden) und R₁₀ (wenn vorhanden) mindestens eine Sulfonatgruppe. In the abovementioned formulas at least one of said groups R₈, R₉ (if any), and R₁₀ (if present) comprises at least one sulfonate group. Die Bezeichnung Sulfonat soll Sulfonsäure einschließen, da die Sulfonatgruppe nur eine ionisierte Sulfonsäure darstellt. The term sulfonate shall include sulfonic acid because the sulfonate group represents only one ionized sulfonic acid.

Reaktive Gruppen, die direkt oder indirekt an den Chromophor angefügt werden können, um die Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ zu bilden, können reaktive Gruppierungen einschließen, beispielsweise Gruppen, die Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Mono- oder Dihalogen- substituiertes Pyridin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Diazin, Maleimid, Aziridin, Sulfonylhalogenid, Säurehalogenid, Hydroxysuccinimidester, Hydroxysulfosuccinimidester, Imidoester, Hydrazin, Azidonitrophenyl, Azid, 3-(2- Pyridyldithio)-proprionamid, Glyoxal und Aldehyd enthalten. Reactive groups that can be attached to the chromophore either directly or indirectly, to form the groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ may include reactive moieties such as groups containing isothiocyanate, isocyanate, monochlorotriazine, dichlorotriazine, include mono- or dihalo-substituted pyridine, mono- or dihalo-substituted diazine, maleimide, aziridine, sulfonyl halide, acid halide, hydroxysuccinimide ester, hydroxysulfosuccinimide ester, imido ester, hydrazine, azidonitrophenyl, azide, 3- (2-pyridyldithio) -proprionamid, glyoxal and aldehyde ,

Spezielle Beispiele für die Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇, die besonders gut für Markierungskomponenten mit verfügbaren Amino-, Hydroxy- und Sulfhydrylgruppen geeignet sind, sind die folgenden Gruppen: Specific examples of the groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇, which are particularly well suited for labeling components with available amino, hydroxy and sulfhydryl groups, the following groups:

wobei mindestens eines von Q oder W eine Austrittsgruppe, wie I, Br, Cl, ist: wherein at least one of Q or W is a leaving group such as I, Br, Cl,:

Spezielle Beispiele von Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇, die besonders gut zum Markieren von Komponenten mit verfügbaren Sulfhydrylgruppen geeignet sind und die in einem Zweistufen-Verfahren zur Markierung von Antikörpern verwendet werden können, sind die folgenden Gruppen: Specific examples of groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇, which are particularly well suited for labeling components with available sulphydryl groups and which can be used in a two-step process for labeling antibodies, the following groups:

worin Q eine Austrittsgruppe, wie I oder Br, ist: wherein Q is a leaving group such as I or Br, is:

worin n 0 oder eine ganze Zahl ist. wherein n is 0 or an integer.

Spezielle Beispiele für die Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇, die besonders gut zum Markieren von Komponenten durch lichtaktiviertes Vernetzungsverknüpfen geeignet sind, sind die folgenden Gruppen: Specific examples of the groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇, which are especially useful for labeling components by light-activated crosslinking linking, the following groups:

Zum Zwecke der Erhöhung der Wasserlöslichkeit oder der Verminderung einer unerwünschten nichtspezifischen Bindung der markierten Komponente an ungeeignete Komponenten in der Probe oder zur Verminderung von Reaktionen zwischen zwei oder mehreren reaktiven Chromophoren auf der markierten Komponente, was zum Auslöschen der Fluoreszenz führen könnte, können die Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ aus den gut bekannten polaren und elektrisch geladenen chemischen Gruppen ausgewählt werden. For the purpose of increasing water solubility or reducing an undesirable non-specific binding of the labeled component to inappropriate components in the sample or to reduce reactions between two or more reactive chromophores on the labeled component which might lead to quenching of fluorescence, the groups R₁ can be selected from the well known polar and electrically charged chemical groups R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇. Beispiele hierfür sind -EF, wobei F Hydroxy, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, substituiertes Amino oder quaternäres Amino ist und wobei E eine Abstandsgruppe, wie -(CH₂) n - ist, wobei n 0, 1, 2, 3 oder 4 ist. Examples are -EF where F is hydroxy, sulphonate, sulphate, carboxylate, substituted amino or quaternary amino, and where E is a spacer group, such as - (CH₂) n -, wherein n is 0, 1, 2, 3 or. 4 Geeignete Beispiele sind zum Beispiel Alkylsulfonat, -(CH₂)₃SO³⊖ und (CH₂)₄-SO³⊖. Suitable examples are, for example, alkyl sulfonate, - (CH₂) ₃SO³⊖ and (CH₂) ₄-SO³⊖.

Die Polymethinkette der Lumineszenz-Farbstoffe gemäß der Erfindung kann auch eine oder mehrere cyclische chemische Gruppen enthalten, die Brücken zwischen zwei oder mehreren der Kohlenstoffatome der Polymethinkette bilden. The polymethine dyes of the luminescence according to the invention may also contain one or more cyclic chemical groups that form bridges between two or more of the carbon atoms of the polymethine chain. Diese Brücken könnten dazu dienen, die chemische oder die Photostabilität des Farbstoffs zu erhöhen, und sie könnten dazu verwendet werden, die Absorptions- und Emissionswellenlängen des Farbstoffes zu verändern oder seinen Extinktionskoeffizienten oder seine Quantenausbeute zu verändern. These bridges could serve to increase the photostability of the dye chemical or, and they could be used to alter the absorption and emission wavelengths of the dye or change its extinction coefficient or its quantum yield. Verbesserte Löslichkeitseigenschaften könnten durch diese Modifizierung erhalten werden. Improved solubility properties could be obtained by this modification.

Erfindungsgemäß kann die markierte Komponente aus folgenden Substanzen ausgewählt werden: Antikörpern, Proteinen, Peptiden, Enzymsubstraten, Hormonen, Lymphokinen, Metaboliten, Rezeptoren, Antigenen, Haptenen, Lectinen, Avidin, Streptavidin, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Nucleinsäuren, Deoxynucleinsäuren, derivatisierten Nucleinsäuren, derivatisierten Deoxynucleinsäuren, DNA-Fragmenten, RNA-Fragmenten, derivatisierten DNA-Fragmenten, derivatisierten RNA-Fragmenten, natürlichen Arzneimitteln, Virusteilchen, Bakterienteilchen, Viruskomponenten, Hefekomponenten, Blutzellen, Blutzellkomponenten, biologischen Zellen, nichtzellulären Blutkomponenten, Bakterien, bakteriellen Komponenten, natürlichen und synthetischen Lipidbläschen, synthetischen Arzneimitteln, Giften, umweltverschmutzenden Stoffen, Polymeren, Polymerteilchen, Glasteilchen, Glasoberflächen, Kunststoffteilchen, Kunststoffoberflächen, Polymermembranen, Leitern und Halbleitern. According to the invention the labeled component may be selected from the following substances: antibodies, proteins, peptides, enzyme substrates, hormones, lymphokines, metabolites, receptors, antigens, haptens, lectins, avidin, streptavidin, toxins, carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides, nucleic acids, Deoxynucleinsäuren, derivatized nucleic acids, derivatized Deoxynucleinsäuren, DNA fragments, RNA fragments, derivatized DNA fragments, derivatized RNA fragments, natural medicines, virus particles, Bakterienteilchen, virus components, yeast components, blood cells, blood cell components, biological cells, non cellular blood components, bacteria, bacterial components, natural and synthetic lipid vesicles, synthetic drugs, poisons, environmental pollutants, polymers, polymer particles, glass particles, glass surfaces, plastic particles, plastic surfaces, polymer membranes, conductors and semiconductors.

Ein Cyanin oder ein damit verwandter Chromophor kann auch hergestellt werden, der, wenn er mit einer Komponente umgesetzt wird, Licht bei 633 nm absorbieren kann. A cyanine or a chromophore related thereto can also be prepared, which, when reacted with a component that can absorb light at 633 nm. In der Erfassungsstufe kann ein Helium-Neon-Laser verwendet werden, der Licht bei dieser Wellenlänge des Spektrums emittiert. In the detection stage, a helium-neon laser can be used that emits light at this wavelength of the spectrum. Auch kann ein Cyanin- oder damit verwandter Farbstoff hergestellt werden, der, wenn er mit einer Komponente umgesetzt wird, Licht maximal zwischen 700 nm und 900 nm absorbieren kann. A cyanine or related thereto dye can be prepared which, when reacted with a component that can absorb light maximum between 700 nm and 900 nm. In diesem Fall kann in der Erfassungsstufe eine Laserdiode verwendet werden, die Licht in diesem Bereich des Spektrums emittiert. In this case, a laser diode can be used in the acquisition stage, which emits light in this region of the spectrum.

Selektivität selectivity

Die oben angegebenen reaktiven Gruppen sind relativ spezifisch für die Markierung bestimmter funktioneller Gruppen auf Proteinen und anderen biologischen oder nichtbiologischen Molekülen, Makromolekülen, Oberflächen oder Teilchen, vorausgesetzt, daß geeignete Reaktionsbedingungen mit Einschluß von geeigneten pH-Bedingungen angewendet werden. The reactive groups provided above is relatively specific for the labeling of certain functional groups on proteins and other biological or non-biological molecules, macromolecules, particles or surfaces, provided that appropriate reaction conditions are used with the inclusion of suitable pH conditions.

Eigenschaften der reaktiven Cyanin-, Merocyanin- und Styryl- Farbstoffe und ihrer Produkte Properties of the reactive cyanine, merocyanine and styryl dyes and their products

Die Spektraleigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe werden durch die hierin beschriebene Funktionalisierung nicht nennenswert verändert. The spectral properties of the dyes of the invention are not significantly changed by the herein described functionalization. Die Spektraleigenschaften der markierten Proteine und der anderen Verbindungen sind gleichfalls nicht sehr verschieden von denjenigen des Grund-Farbstoffmoleküls, das nicht an ein Protein oder ein anderes Material konjugiert worden ist. The spectral properties of the labeled proteins and of the other compounds are also not very different from those which has not been conjugated to a protein or other material of the basic dye molecule. Die hierin beschriebenen Farbstoffe haben, allein oder an ein markiertes Material konjugiert, im allgemeinen große Extinktionskoeffizienten ( ε = 100 000 bis 250 000), hohe Quantenausbeuten so hoch wie 0,4 in bestimmten Fällen, und sie absorbieren und emittieren Licht im Spektralbereich von 400 bis 900 nm. Somit sind sie von besonderem Wert als Markierungs-Reagentien für die Lumineszenz- Erfassung. Have dyes described herein conjugated to a labeled material alone or, in general, large extinction coefficients = 100,000 to 250,000), high quantum yields as high as 0.4, in some cases, and they absorb and emit light in the spectral range of 400 to 900 nm. Thus, they are of particular value as labeling reagents for luminescence detection.

Optische Erfassungsmethoden Optical detection methods

Zur Erfassung bzw. Bestimmung einer markierten oder gefärbten Komponente kann jede beliebige Methode angewendet werden. For the detection or determination of a marked or colored component, any method can be used. Die Erfassungsmethode kann eine Lichtquelle verwenden, die das Gemisch, welches das markierte Material enthält, mit Licht mit ersten definierten Wellenlängen bestrahlt. The detection method may employ a light source which irradiates the mixture containing the labeled material with light having first defined wavelengths. Bekannte Vorrichtungen werden verwendet, die Licht mit zweiten Wellenlängen erfassen, welches Licht durch das Gemisch hindurchgelassen worden ist oder das durch das Gemisch fluoresziert oder luminesziert wird. Known devices are used, detect the light with the second wavelength, which light has been transmitted through the mixture or is fluoresced by the mixture or luminesces. Solche Erfassungsvorrichtungen sind beispielsweise Fluoreszenz-Spektrometer, Absorptions-Spektrophotometer, Fluoreszenz-Mikroskope, Lichtdurchlässigkeits- Mikroskope und Fließ-Cytometer, optische Fasersensoren und Immunoassay-Instrumente. Such detection devices are, for example, fluorescence spectrometer, absorption spectrophotometer, fluorescence microscopes, microscopes and flow cytometers light transmission, optical fiber sensors and immunoassay instruments.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch chemische Analysenmethoden verwendet werden, um die Anheftung des Farbstoffs an die markierte Komponente oder die markierten Komponenten zu erfassen. In the inventive method and chemical analysis methods can be used to detect the attachment of the dye to the labeled component, or the selected components. Beispiele für chemische Analysenmethoden sind die Infrarot-Spektrometrie, die NMR-Spektrometrie, die Absorptions-Spektrometrie, die Fluoreszenz-Spektrometrie, die Massen-Spektrometrie und die Chromatographie. Examples of chemical analysis methods are the infrared spectrometry, NMR spectrometry, the absorption spectrometry, fluorescence spectrometry, which mass spectrometry and chromatography.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. The invention is illustrated in the examples.

Beispiel 1 example 1 Effekt des pH-Werts auf die Konjugierung von Sulfoindodicarbocyanin mit Protein Effect of pH on the conjugation of protein with Sulfoindodicarbocyanin

Proben von Schaf- γ -Globulin (4 mg/ml) in 0,1 m Carbonat-Puffern (pH = 8,5, 8,9 und 9,4) wurden bei Raumtemperatur mit einem 10fachen molaren Überschuß des folgenden aktiven Sulfoindodicarbo- cyaninesters ( m = 2) vermischt. (4 mg / ml) samples of sheep γ-globulin in 0.1 M carbonate buffer (pH = 8.5, 8.9 and 9.4) at room temperature with a 10 fold molar excess of the following active Sulfoindodicarbo- cyaninesters (m = 2) are mixed.

Zu geeigneten Zeitpunkten, die sich von 5 Sekunden bis 30 Minuten erstreckten, wurden Proteinproben von nichtkovalent angeheftetem Farbstoff durch Gel-Permeationschromatographie auf Sephadex® G-50 abgetrennt. At appropriate times, which ranged from 5 seconds to 30 minutes, protein samples were separated from non-covalently attached thereto a dye by gel permeation chromatography on Sephadex G-fiftieth Die maximale Markierung des Proteins erfolgte nach 10 Minuten und ergab End-Molverhältnisse von Farbstoff/Protein von 5,8, 6,4 und 8,2 für die Proben, die bei pH-Werten von 8,5, 8,9 bzw. 9,4 inkubiert worden waren. The maximum labeling of the protein was carried out after 10 minutes to give final molar ratios of dye / protein of 5.8, 6.4 and 8.2 for the samples at pH values ​​of 8.5, 8.9 and 9 , 4 had been incubated. Die Zeiten, die erforderlich waren, um ein Farbstoff/ Protein-Verhältnis von 5 und Quantenausbeuten der Produkte bei den verschiedenen pH-Werten zu ergeben, sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: The times were required to give a dye / protein ratio of 5 and quantum yields of the products at the various pH values ​​are summarized in the following table:

Diese Werte zeigen, daß die Protein-Markierung mit diesem Farbstoff bei einem pH-Wert von 9,4 besser ist als bei einem pH-Wert von unterhalb 9. In dem Puffer mit höherem pH-Wert war die Konjugierungsreaktion sehr rasch, doch war die Markierungswirksamkeit ausgezeichnet, und das Produkt war stärker fluoreszierend. These values ​​show that the protein label with this dye at a pH value of 9.4 is better than at a pH below 9. In the buffer of higher pH, the conjugation reaction was very rapid, but it was the labeling efficiency excellent, and the product was stronger fluorescent. Der Wert der Quantenausbeute gibt die mittlere Quantenausbeute pro Farbstoffmolekül auf dem markierten Protein wieder. The value of the quantum yield is the average quantum yield per dye molecule to the labeled protein again.

Beispiel 2 example 2 Konjugation des aktiven Sulfoindocarbocyaninesters mit Protein The conjugation of the active protein with Sulfoindocarbocyaninesters

Schaf- γ -Globulin (1 mg/ml), gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4, wurde mit 0,1 m Natriumcarbonat auf einen pH-Wert von 9,4 eingestellt. Sheep γ-globulin (1 mg / ml) dissolved in phosphate buffered saline (PBS) with a pH of 7.4, was adjusted to a pH of 9.4 with 0.1 M sodium carbonate. Ein Cyanin-Farbstoff-Markierungsmittel (Struktur in Beispiel 1, m = 1) wurde zu aliquoten Teilen dieser Proteinlösung zugegeben, um verschiedene Molverhältnisse von Farbstoff/Protein zu ergeben. A cyanine dye labeling means (structure in Example 1, m = 1) was added to aliquots of this protein solution, to give various mole ratios of dye / protein. Nach 30minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Gemische durch Gel-Permeationschromatographie auf Sephadex® G-50 unter Elution mit PBS aufgetrennt. After 30 minutes incubation at room temperature, the mixtures were fractionated by gel permeation chromatography on Sephadex G-50, eluting with PBS. Das Molverhältnis der Farbstoffe, die kovalent an die Proteine in den Produkten angeheftet worden waren, war 1,2, 3,5, 5,4, 6,7 und 11,2 für Anfangsverhältnisse von Farbstoff/Protein von 3, 6, 12, 24 bzw. 30. The molar ratio of the dyes were covalently attached to the proteins in the products was 1.2, 3.5, 5.4, 6.7 and 11.2 for initial proportions of dye / protein of 3, 6, 12, 24 and 30 respectively.

Beispiel 3 example 3 Markierung von AECM-Dextran mit einem Sulfoindodicarbocyanin Labeling of AECM-dextran with a Sulfoindodicarbocyanin

N-Aminoethyl-carboxamidomethyl-(AECM-)Dextran mit einem Mittelwert von 16 Aminogruppen pro Dextranmolekül wurde aus Dextran mit einem mittleren MW von 70 000 synthetisiert (Inman, JK, J. Immunol. 114: 704-709 (1975)). N-aminoethyl-carboxamidomethyl- (AECM-) Dextran with an average of 16 amino groups per dextran molecule was synthesized from dextran with an average MW of 70 000 (Inman, JK, J. Immunol. 114: 704-709 (1975)). Ein Teil des AECM-Dextrans (1 mg/250 µl), gelöst in 0,1 m Carbonat-Puffer, mit einem pH-Wert von 9,4 wurde zu 0,2 mg des aktiven Sulfoindodicarbocyaninesters (Struktur in Beispiel 1, m = 2) gegeben, wobei ein Farbstoff/Protein-Molverhältnis von 10 erhalten wurde. A portion of the AECM-dextran (1 mg / 250 .mu.l) dissolved in 0.1 M carbonate buffer, with a pH of 9.4 was added to 0.2 mg of the active Sulfoindodicarbocyaninesters (structure in Example 1, m = 2) where a dye / protein molar ratio was obtained from the 10th Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Das Dextran wurde sodann von nichtkonjugiertem Farbstoff durch Sephadex® G-50-Gel-Permeationschromatographie unter Verwendung von Ammoniumacetat (50 mM) als Elutions-Puffer abgetrennt. The dextran was then from unconjugated dye by Sephadex® G-50 gel permeation chromatography using ammonium acetate (50 mM) separated as elution buffer. Ein Durchschnitt von 2,2 Farbstoffmolekülen war kovalent an jedes Dextranmolekül gebunden. An average of 2.2 dye molecules covalently bound to each dextran molecule.

Beispiel 4 example 4 Markierung eines spezifischen Antikörpers mit aktivem Sulfoindodicarbocyaninester Marking of a specific antibody with active Sulfoindodicarbocyaninester

Gegen Murin IgG spezifisches Schaf- γ -Globulin (1 mg/ml) in 0,1 m Carbonat-Puffer (pH = 9,4) wurde mit dem aktiven Sulfoindodicarbocyaninester (Struktur in Beispiel 1, m = 2) mit einem Verhältnis von 8 Farbstoffmolekülen pro Proteinmolekül vermischt. Against murine IgG specific sheep globulin γ (1 mg / ml) in 0.1 M carbonate buffer (pH = 9.4) was treated with the active Sulfoindodicarbocyaninester (structure in Example 1, m = 2) with a ratio of 8 mixed dye molecules per protein molecule. Nach 30minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde das Markierungsgemisch durch Gelfiltration auf Sephadex® G-50, das mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,4) ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgetrennt. After 30 minutes of incubation at room temperature, the labeling mixture was separated by gel filtration on Sephadex® G-50 that had been equilibrated with phosphate buffered saline (pH = 7.4). Das gewonnene Protein enthielt einen Mittelwert von 4,5 Farbstoffmolekülen, die kovalent an jedes Proteinmolekül angeheftet waren. The recovered protein contained a mean of 4.5 dye molecules were covalently attached to each protein molecule.

Beispiel 5 example 5 Anfärbung und mikroskopische Sichtbarmachung von Human- Lymphozyten mit Sulfoindodicarbocyanin-Farbstoff, der an Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper konjugiert war Staining and microscopic visualization of human lymphocytes with Sulfoindodicarbocyanin dye conjugated to sheep anti-mouse IgG antibodies

Frisch isolierte periphere Blutlymphozyten wurden bei 0°C 30 Minuten lang mit Maus-Anti- β 2-Mikroglobulin (0,25 µg/10⁶ Zellen) behandelt. Freshly isolated peripheral blood lymphocytes were treated for 30 minutes at 0 ° C with mouse anti-β 2 microglobulin (0.25 ug / 10⁶ cells). Die Zellen wurden zweimal mit DMEM-Puffer gewaschen und sodann mit dem mit Sulfoindodicarbocyanin markierten Schaf-Anti-Maus-IgG-Antikörper (1 µg/10⁶ Zellen) behandelt. The cells were washed twice with DMEM buffer, and then with the labeled with Sulfoindodicarbocyanin sheep anti-mouse IgG antibody treated (1 ug / 10⁶ cells). Nach 30minütiger Inkubierung bei 0°C wurde überschüssiger Antikörper durch Zentrifugieren der Zellen entfernt, und die Zellen wurden erneut zweimal mit DMEM-Puffer gewaschen. After 30 min incubation at 0 ° C excess antibody was removed by centrifugation of the cells, and the cells were again washed twice with DMEM buffer. Aliquote Teile der Zellen wurden auf Objektträgern zur Analyse durch Fluoreszenz-Mikroskopie befestigt. Aliquots of the cells were mounted on slides for analysis by fluorescence microscopy. Unter dem Mikroskop wurden die Lymphozyten auf dem Objektträger mit Licht mit 610 bis 630 nm bestrahlt, und die Fluoreszenz bei 650 bis 700 nm wurde mit einer rotempfindlichen verstärkten COHU-Fernsehkamera erfaßt, welche an einen Bilddigitalisierer und einen Fernsehmonitor angeschlossen war. Under the microscope, the lymphocytes were irradiated with light on the slide 610 to 630 nm, and the fluorescence at 650 to 700 nm was detected by a red-sensitive reinforced COHU television camera which was connected to a frame grabber and a television monitor. Die nach dieser Methode angefärbten Zellen zeigten unter dem Mikroskop eine Fluoreszenz. The stained by this method cells showed fluorescence under a microscope. In einem Kontrollexperiment wurde die Verwendung des primären Maus-Anti- β 2-Mikroglobulin-Antikörpers weggelassen, doch wurde die Färbung und die Analyse sonst wie oben beschrieben durchgeführt. In a control experiment, the use of the primary mouse anti-β 2 microglobulin antibody was omitted, but the staining and analysis was carried out otherwise as described above. Die Kontrollprobe zeigte unter dem Mikroskop keine Fluoreszenz, was darauf hinweist, daß der mit Sulfoindodicarbocyanin markierte Schaf-Anti-Maus-Antikörper keine signifikante nichtspezifische Bindung an Lymphozyten ergibt. The control sample showed no fluorescence under the microscope, indicating that the labeled with Sulfoindodicarbocyanin sheep anti-mouse antibody does not result in significant non-specific binding to lymphocytes.

Claims (51)

  1. 1. Verfahren zum Markieren einer Komponente einer wäßrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man 1. A method of labeling a component of an aqueous liquid, characterized in that
    • (a) zu der die genannte Komponente enthaltenden Flüssigkeit einen Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe Cyanin, Merocyanin und Styryl-Farbstoffe, der an einen aromatischen Kern angeheftet mindestens eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe enthält, zusetzt, wobei der genannte Farbstoff mit der genannten Komponente reaktiv ist, und (A) to which said component-containing liquid contains a luminescence dye from the group of cyanine, merocyanine and styryl dyes which attached to an aromatic nucleus at least one sulfonic acid or sulfonate group added, wherein said dye with said component reactive is and
    • (b) den Farbstoff mit der genannten Komponente umsetzt, so daß der Farbstoff die genannte Komponente markiert. (B) reacting the dye with said component so that the dye marks the mentioned component.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff mehr als eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe enthält. 2. The method according to claim 1, characterized in that the dye contains more than one sulfonic acid or sulfonate group.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff einen Substituenten enthält, um ihn mit einer Amin-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe auf der genannten Komponente kovalent reaktiv zu machen, und daß sich der genannte Farbstoff mit einer oder mehreren der genannten Gruppen umsetzt. 3. The method according to claim 1, characterized in that said dye contains a substituent in order to make it covalently reactive with an amine, aldehyde, sulfhydryl or hydroxy group on said component, and that said dye having one or reacting more of said groups.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe die Wasserlöslichkeit des Farbstoffs erhöht. 4. The method according to claim 1, characterized in that the sulfonic acid or sulfonate group increases the water solubility of the dye.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe die Farbstoff/Farbstoff-Wechselwirkungen vermindert, die ein Auslöschen der Fluoreszenz induzieren. 5. The method according to claim 1, characterized in that the sulfonic acid or sulfonate reduces the dye / dye interactions that induce a quenching of fluorescence.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein Cyanin-Farbstoff ist. 6. The method according to claim 1, characterized in that the dye is a cyanine dye.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein Merocyanin-Farbstoff ist. 7. The method according to claim 1, characterized in that the dye is a merocyanine dye.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente aus der Gruppe Antikörper, Proteine, Peptide, Enzymsubstrate, Hormone, Lympokine, Metabolite, Rezeptoren, Antigene, Haptene, Lectine, Toxine, Kohlenhydrate, Oligosaccharide, Polysaccharide, Nucleinsäuren, Deoxynucleinsäuren, derivatisierte Nucleinsäuren, derivatisierte Deoxynucleinsäuren, DNA-Fragmente, RNA-Fragmente, derivatisierte DNA-Fragmente, derivatisierte RNA-Fragmente, natürliche Arzneimittel, Virusteilchen, Viruskomponenten, Hefekomponenten, Blutzellen, Blutzellkomponenten, biologische Zellen, nichtzelluläre Blutkomponenten, Bakterien, Bakterienkomponenten, natürliche und synthetische Lipid-Bläschen, synthetische Arzneimittel und natürliche Arzneimittel, Gifte, umweltverschmutzende Stoffe, Polymeren, Polymerteilchen, Glasteilchen, Glasoberflächen, Kunststoffteilchen, Kunststoffoberflächen, Polymermembranen, Leiter und Halbleiter ausgewählt ist. 8. A method according to claim 1, characterized in that the component from the group antibodies, proteins, peptides, enzyme substrates, hormones, Lympokine, metabolites, receptors, antigens, haptens, lectins, toxins, carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides, nucleic acids, Deoxynucleinsäuren, derivatized nucleic acids, derivatized Deoxynucleinsäuren, DNA fragments, RNA fragments, derivatized DNA fragments, derivatized RNA fragments, natural drugs, virus particles, virus components, yeast components, blood cells, blood cell components, biological cells, non cellular blood components, bacteria, bacterial component, natural and synthetic lipid vesicles, synthetic drugs, natural drugs, poisons, environmental pollutants, polymers, polymer particles, glass particles, glass surfaces, plastic particles, plastic surfaces, polymer membranes, conductors and semiconductors is selected.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufe der optischen Erfassung der genannten markierten Komponente einschließt. 9. The method according to claim 1, characterized in that it includes the step of optical detection of the labeled component mentioned.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Erfassungsstufe die Bestrahlung der markierten Komponente mit Licht und die anschließende Erfassung des Lichts, das durch die genannte markierte Komponente fluoresziert wird, umfaßt. 10. A method according to claim 9, characterized in that the detection stage comprises the said irradiation with light of the labeled component and the subsequent detection is fluoresced by said labeled component of the light.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Erfassungsstufe die Lichterregung mit einem Laser einschließt. 11. A method according to claim 9, characterized in that the acquisition stage includes the said excitation light with a laser.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der genannten Erfassungsstufe die Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet wird. 12. The method according to claim 9, characterized in that the fluorescence microscopy is used in said detection step.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der genannten Erfassungsstufe die Fließ-Cytometrie verwendet wird. 13. The method according to claim 9, characterized in that the flow cytometry is used in said detection step.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erfaßte Komponente quantitativ bestimmt wird. 14. The method according to claim 9, characterized in that said detected component is quantitatively determined.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff ein Styryl- Farbstoff ist. 15. The method according to claim 1, characterized in that said dye is a styryl dye.
  16. 16. Verfahren zum Markieren einer Komponente in einer wäßrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man 16. A method of labeling a component in an aqueous liquid, characterized in that
    • (a) zu der die genannte Komponente enthaltenden Flüssigkeit einen Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe Polymethin- Farbstoffe auf Sulfoindolenin-Grundlage und Naphthosulfoindolenin- Grundlage, der mindestens eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe angeheftet an einen oder mehrere Ringe eines heterocyclischen Kerns enthält, zusetzt, wobei der genannte Farbstoff gegenüber der genannten Komponente reaktiv ist; (A) to which said component-containing liquid has a luminescent dye is selected from the group consisting of polymethine dyes Sulfoindolenin-based and Naphthosulfoindolenin- basis, the attached at least one sulfonic acid or sulfonate group attached to one or more rings contains a heterocyclic nucleus, is added, wherein said dye with respect to said component is reactive;
    • (b) den genannten Farbstoff mit der genannten Komponente umsetzt, so daß der genannte Farbstoff die genannte Komponente markiert; (B) reacting said dye with said component so that said dye marking the called component; und daß man and in that
    • (c) die genannte markierte Komponente durch optische Methoden erfaßt. (C) detecting said labeled component by optical methods.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff mehr als eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe enthält. 17. The method according to claim 16, characterized in that said dye contains more than one sulfonic acid or sulfonate group.
  18. 18. Verfahren zum Markieren einer ersten Komponente und Verwendung der markierten ersten Komponente zur Bindung mit einer zweiten Komponente, um eine markierte zweite Komponente zu bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man 18. A method of labeling a first component and using the labeled first component to bind with a second component to form a labeled second component, characterized in that
    • (a) zu einer wäßrigen Flüssigkeit, die die genannte erste Komponente enthält, einen Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe Cyanin, Merocyanin und Styryl-Farbstoffe, der mindestens eine an einen aromatischen Kern angefügte Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe enthält, zusetzt, wobei der Farbstoff gegenüber der ersten Komponente reaktiv ist; (A) to an aqueous liquid containing said first component, a luminescent dye is selected from the group consisting of cyanine, merocyanine and styryl dyes which contains at least one attached to an aromatic ring sulfonic acid or sulfonate group added, wherein the dye against is reactive to the first component;
    • (b) den genannten Farbstoff mit der genannten ersten Komponente umsetzt, so daß der genannte Farbstoff durch Lumineszenz die genannte erste Komponente markiert, wodurch eine markierte erste Komponente erhalten wird; (B) reacting said dye with said first component such that said dye is marked by luminescence said first component, thereby obtaining a labeled first component;
    • (c) die genannte markierte erste Komponente an die genannte zweite Komponente anbindet, um eine markierte zweite Komponente zu bilden; (C) linking the said labeled first component to said second component to form a labeled second component; und daß man and in that
    • (d) die genannte markierte zweite Komponente durch eine optische Methode erfaßt. (D) said labeled second component is detected by an optical method.
  19. 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff mehr als eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe enthält. 19. The method according to claim 18, characterized in that said dye contains more than one sulfonic acid or sulfonate group.
  20. 20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Komponente ein Antikörper ist und daß die zweite Komponente eine Substanz aus der Gruppe Antigene, Haptene, biologische Zellen, Viren und Teilchen, die ein Antigen und ein Hapten tragen, ist. 20. The method according to claim 18, characterized in that the first component is an antibody and that the second component is a substance from the group of antigens, haptens, biological cells, viruses, and particles carrying an antigen and a hapten.
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein Lectin ist und daß die genannte zweite Komponente eine Substanz aus der Gruppe Kohlenhydrate, makromolekulare Stoffe, die ein Kohlenhydrat tragen, und Zellen, die ein Kohlenhydrat tragen, ist. 21. The method according to claim 18, characterized in that said first component is a lectin and in that said second component is a substance from the group of carbohydrates, macromolecular substances which carry a carbohydrate, and cells carrying a carbohydrate.
  22. 22. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente Avidin oder Streptavidin ist und daß die genannte zweite Komponente ein biotinyliertes Material ist. 22. The method according to claim 18, characterized in that said first component is avidin or streptavidin and in that said second component is a biotinylated material.
  23. 23. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein DNA-Fragment ist und daß die genannte zweite Komponente ein komplementärer Strang von DNA oder RNA ist. 23. The method according to claim 18, characterized in that said first component is a DNA fragment, and that said second component is a complementary strand of DNA or RNA.
  24. 24. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein RNA-Fragment ist und daß die genannte zweite Komponente ein komplementärer Strang von DNA oder RNA ist. 24. The method according to claim 18, characterized in that said first component is a RNA fragment and that said second component is a complementary strand of DNA or RNA.
  25. 25. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein Ligand aus der Gruppe Hormone, Proteine, Peptide, Lymphokine und Metabolite ist und daß die genannte zweite Komponente ein Rezeptor ist. 25. The method according to claim 18, characterized in that said first component is a ligand selected from the group hormones, proteins, peptides, lymphokines and metabolites and in that said second component is a receptor.
  26. 26. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente ein Polymerteilchen ist, das eine Substanz aus der Gruppe Antikörper, Nucleinsäure-Fragmente, Arzneimittel, Toxine, Hormone, Metabolite, biologische Zellen, Bakterien, Virusteilchen, Antigene und Haptene enthält und daß die genannte zweite Komponente ein entsprechendes Antigen, eine komplementäre Nucleinsäure-Sequenz, ein Antikörper oder ein Rezeptor ist. 26. The method according to claim 18, characterized in that said first component is a polymer, which contains a substance from the group of antibodies, nucleic acid fragments drugs, toxins, hormones, metabolites, biological cells, bacteria, virus particles, antigens and haptens and in that said second component is a corresponding antigen, a complementary nucleic acid sequence, an antibody or a receptor.
  27. 27. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite Komponente ein Antikörper ist. 27. The method according to claim 18, characterized in that said second component is an antibody.
  28. 28. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte erste Komponente eine Substanz aus der Gruppe Antigene, Haptene oder Zellen, die ein Antigen oder Hapten enthalten, und Teilchen, die ein Antigen oder Hapten enthalten, ist und daß die genannte zweite Komponente ein Antikörper ist. 28. The method according to claim 18, characterized in that said first component is a substance from the group of antigens, haptens, or cells containing an antigen or hapten, and particles containing an antigen or hapten, and that said second component is an antibody.
  29. 29. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff sich mit einer Amin-, Hydroxy- oder Sulfhydrylgruppe auf der ersten Komponente umsetzt. 29. The method according to claim 18, characterized in that said dye is reacted with an amine, hydroxyl or sulfhydryl group on the first component.
  30. 30. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sich der genannte Farbstoff mit einer Aldehydgruppe auf der genannten ersten Komponente umsetzt. 30. The method according to claim 18, characterized in that said dye having an aldehyde group on said first component reacts.
  31. 31. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff ein Cyanin- Farbstoff ist und sich mit einer Amin- oder Hydroxygruppe auf der genannten ersten Komponente umsetzt. 31. The method according to claim 18, characterized in that said dye is a cyanine dye and reacts with an amine or hydroxy group on said first component.
  32. 32. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff ein Cyanin- Farbstoff ist und sich mit einer Aldehyd- oder Sulfhydrylgruppe auf der genannten ersten Komponente umsetzt. 32. The method according to claim 18, characterized in that said dye is a cyanine dye and reacts with an aldehyde or sulfhydryl group on said first component.
  33. 33. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite Komponente aus der Gruppe Blutzellen, Gewebezellen, Bakterien, Viren, Chromosomen, DNA, RNA, Toxine, Arzneimittel, Hormone und Polymerteilchen ausgewählt ist. 33. The method according to claim 18, characterized in that said second component is selected from the group consisting of blood cells, tissues, cells, bacteria, viruses, chromosomes, DNA, RNA, toxins, drugs, hormones and polymer selected.
  34. 34. Lumineszenzphotostabiles Reaktionsprodukt aus einer Komponente, die eine Amin-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder Hydroxylgruppe enthält und einen in Wasser löslichen Farbstoff aus der Gruppe Polymethin-Farbstoffe auf Sulfoindolenin- Grundlage und Naphthosulfoindolenin-Grundlage, der mindestens einen Substituenten enthält, um ihn gegenüber der genannten Amin-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder Hydroxylgruppe auf der genannten Komponente kovalent reaktiv zu machen, wobei die individuellen Farbstoff-Moleküle auf dem genannten Reaktionsprodukt einen mittleren molaren Extinktionskoeffizienten von mindestens 50 000 l pro mol-cm, eine mittlere Quantenausbeute von mindestens 2% haben und Licht maximal im 400- bis 850-nm-Bereich absorbieren und emittieren, wenn sich die markierte Komponente in einer wäßrigen Umgebung befindet. 34. Lumineszenzphotostabiles reaction product of a component which contains an amine, aldehyde, sulfhydryl or hydroxyl group and a water-soluble dye is selected from the group consisting of polymethine dyes Sulfoindolenin- basis and Naphthosulfoindolenin-based containing at least one substituent to him with respect to said amine, aldehyde, sulfhydryl or hydroxyl group on said component to make covalently reactive with the individual dye molecules on said reaction product an average molar extinction coefficient of at least 50 000 l per mole-cm, a mean quantum yield of have at least 2% and a maximum of absorbing light in the 400 to 850 nm region and emit when the labeled component is in an aqueous environment.
  35. 35. Reaktionsprodukt nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Komponente ein Antikörper ist. 35. A reaction product according to claim 34, characterized in that said component is an antibody.
  36. 36. Reaktionsprodukt nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Komponente aus der Gruppe Proteine, Peptide, Arzneimittel, Toxine, Metabolite, Lymphokine, Kohlenhydrate, Lipide, Blutzellen, Bakterienteilchen, Virenteilchen, Antigene, Haptene, Polymerteilchen, Glasoberflächen und Polymeroberflächen ausgewählt ist. 36. A reaction product according to claim 34, characterized in that said component from the group of proteins, peptides, drugs, toxins, metabolites, lymphokines, carbohydrates, lipids, blood cells, Bakterienteilchen, viral particles, antigens, haptens, polymer, glass surfaces, and polymer surfaces selected ,
  37. 37. Reaktionsprodukt nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite Komponente ein DNA- oder RNA-Fragment ist. 37. A reaction product according to claim 22, characterized in that said second component is a DNA or RNA fragment.
  38. 38. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Farbstoff aus der Gruppe: ausgewählt ist, wobei 38. The method according to claim 1, characterized in that said dye is selected from the group: is selected, wherein
    X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind; X and Y are selected from the group;
    m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist; m is an integer from group 1, 2, 3 and 4;
    mindestens eine der genannten Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Pyridin, Mono- oder Dihalogen- substituiertes Diacin, Maleimid, Aziridin, Sulfonylhalogenid, Säurehalogenid, Hydroxysuccinimidester, Hydroxysulfosuccinimidester, Imidoester, Hydrazin, Azidonitrophenyl, Azid, 3-(2-Pyridyl-dithio)-propionamid, Glyoxal und Aldehyd enthält; at least one of said groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ least one moiety selected from the group isothiocyanate, isocyanate, monochlorotriazine, dichlorotriazine, mono- or dihalogen substituted pyridine, mono- or dihalo substituted Diacin, maleimide, aziridine, sulfonyl halide, acid halide, hydroxysuccinimide ester, hydroxysulfosuccinimide ester, imido ester, hydrazine, azidonitrophenyl, azide, 3- (2-pyridyl dithio) -propionamide, glyoxal and aldehyde contains; und wobei and wherein
    mindestens eine der genannten Gruppen R₈ und R₉ mindestens eine Arylsulfonyl- oder Arylsulfonat-Gruppierung enthält. at least one of said groups R₈ and R₉ contains at least one arylsulfonyl or aryl sulfonate moiety.
  39. 39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe: enthält, wobei mindestens eines von Q oder W aus der Gruppe Cl, Br und I ausgewählt ist und wobei n den Wert Null hat oder eine beliebige ganze Zahl ist. 39. A method according to claim 38, characterized in that at least one of the groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ least one moiety selected from the group: containing at least one of Q or W from the group Cl, Br and I is selected, and wherein n has a value of zero or an arbitrary integer.
  40. 40. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der genannten Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe: enthält. 40. The method according to claim 38, characterized in that at least one of said groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ least one moiety selected from the group: contains.
  41. 41. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der genannten Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ auch mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe Hydroxy, Sulfonat, Sulfat, Carboxylat und substituierte Amin- oder quaternäre Amingruppen enthält. 41. The method according to claim 38, characterized in that at least one of said groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ and at least one group selected from hydroxy, sulfonate, sulfate, carboxylate and substituted amine or quaternary amine groups contains.
  42. 42. Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe: wobei 42. luminescent dye from the group: wherein
    X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind; X and Y are selected from the group;
    m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist; m is an integer from group 1, 2, 3 and 4;
    mindestens eine der genannten Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Mono- oder Dihalogen-substituiertes Pyridin, Mono- oder Dihalogen- substituiertes Diacin, Maleimid, Aziridin, Sulfonylhalogenid, Säurehalogenid, Hydroxysuccinimidester, Hydroxysulfosuccinimidester, Imidoester, Hydrazin, Azidonitrophenyl, Azid, 3-(2-Pyridyl-dithio)-propionamid, Glyoxal und Aldehyd enthält; at least one of said groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ least one moiety selected from the group isothiocyanate, isocyanate, monochlorotriazine, dichlorotriazine, mono- or dihalogen substituted pyridine, mono- or dihalo substituted Diacin, maleimide, aziridine, sulfonyl halide, acid halide, hydroxysuccinimide ester, hydroxysulfosuccinimide ester, imido ester, hydrazine, azidonitrophenyl, azide, 3- (2-pyridyl dithio) -propionamide, glyoxal and aldehyde contains; und wobei and wherein
    mindestens eine der genannten Gruppen R₈ und R₉ mindestens eine Arylsulfonyl- oder Arylsulfonat-Gruppierung enthält. at least one of said groups R₈ and R₉ contains at least one arylsulfonyl or aryl sulfonate moiety.
  43. 43. Lumineszenz-Farbstoff nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß er wasserlöslich ist. 43. luminescent dye according to claim 42, characterized in that it is water soluble.
  44. 44. Lumineszenz-Farbstoff nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß er in Wasser einen molaren Extinktionskoeffizienten von mindestens 50 000 l pro mol-cm, eine Quantenausbeute von mindestens 2% hat und daß er im Spektralbereich von 400 bis 900 nm Licht absorbiert und emittiert. 44. luminescent dye according to claim 42, characterized in that it has a molar extinction coefficient of at least 50 000 l per mole-cm, a quantum yield of at least 2% in water, and that it absorbs in the spectral range from 400 to 900 nm light and emits ,
  45. 45. Lumineszenz-Farbstoff nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß er in Wasser einen molaren Extinktionskoeffizienten von mindestens 100 000 l pro mol-cm, eine Quantenausbeute von mindestens 10% hat und daß er im Spektralbereich von 600 bis 900 nm Licht absorbiert bzw. emittiert. 45. luminescent dye according to claim 42, characterized in that it has a molar extinction coefficient of at least 100 000 liters per mole-cm, a quantum yield of at least 10% in water, and that it absorbs in the spectral range from 600 to 900 nm light or emitted.
  46. 46. Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe: worin 46. ​​luminescent dye from the group: wherein
    X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind; X and Y are selected from the group;
    Z aus der Gruppe O und S ausgewählt ist; Z is selected from the group O and S is selected;
    m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist und wobei mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe: enthält, wobei m is an integer from group 1, 2, 3 and 4 and wherein at least one of the groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ least one moiety selected from the group:, said
    mindestens eines von Q oder W aus der Gruppe I, Br und Cl ausgewählt ist und n 0 oder eine ganze Zahl ist; at least one of Q or W from the group I, Cl and Br, and n is 0 or an integer; und wobei and wherein
    mindestens eine der genannten Gruppen R₈ und R₉ (wenn vorhanden) mindestens eine Sulfonat-Gruppierung enthält. at least one of said groups R₈ and R₉ (if any) containing at least one sulfonate moiety.
  47. 47. Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe: wobei 47. luminescent dye from the group: wherein
    X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind; X and Y are selected from the group;
    Z aus der Gruppe O und S ausgewählt ist; Z is selected from the group O and S is selected;
    m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist; m is an integer from group 1, 2, 3 and 4;
    mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe: enthält, wobei at least one of the groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ least one moiety selected from the group:, said
    n 0 oder eine ganze Zahl ist; n is 0 or an integer; und wobei and wherein
    mindestens eine der genannten Gruppen R₈, R₉, R₁₀ (wenn vorhanden) und R₁₁ (wenn vorhanden) mindestens eine Sulfonsäure oder Sulfonatgruppierung enthält. at least one of said groups R₈, R₉, R₁₀ (if any), and R₁₁ (if present) contains at least one sulfonic acid or Sulfonatgruppierung.
  48. 48. Lumineszenz-Farbstoff aus der Gruppe: wobei 48. luminescent dye from the group: wherein
    X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind; X and Y are selected from the group;
    m eine ganze Zahl aus der Gruppe 1, 2, 3 und 4 ist; m is an integer from group 1, 2, 3 and 4;
    mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ mindestens eine Gruppierung aus der Gruppe: enthält; at least one of the groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ least one moiety selected from the group: includes; und wobei and wherein
    mindestens eine der Gruppen R₈ und R₉ mindestens eine Arylsulfonsäure- oder Arylsulfonat-Gruppierung enthält. at least one of R₈ and R₉ contains at least one Arylsulfonsäure- or arylsulfonate grouping.
  49. 49. Lumineszenz-Farbstoff nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ auch Gruppierungen zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit und zur Verminderung der nichtspezifischen Bindung enthält, wobei die Gruppierungen aus Hydroxy-, Sulfonat-, Sulfat-, Carboxylat- und substituierten Amin- oder quaternären Amingruppen ausgewählt sind. 49. luminescent dye according to claim 42, characterized in that at least one of the groups R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ and R₇ also contains groups to increase water solubility and to reduce the non-specific binding, wherein the groupings of hydroxy , sulfonate, sulfate, carboxylate and substituted amine or quaternary amine groups are selected.
  50. 50. Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein mit einem Sulfocyanin-Farbstoff markiertes Material mit einem oder mehreren weiteren fluoreszierenden Materialien, die alle Licht signifikant bei einer einzigen Erregungswellenlänge absorbieren, jedoch bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren, vermischt und sodann alle der genannten fluoreszierenden Materialien mit einer einzigen Wellenlänge von Licht anregt und sodann die Menge von jedem der genannten fluoreszierenden Materialien quantitativ bestimmt, indem man ihre individuellen Fluoreszenzsignale bei ihren verschiedenen Fluoreszenz-Wellenlängen erfaßt. 50. The method, characterized in that, however, fluoresce labeled with a sulfocyanine dye material having one or more other fluorescent materials which absorb all of the light significantly at a single excitation wavelength at different wavelengths, are mixed and then all of the fluorescent materials mentioned with stimulates a single wavelength of light and then quantitatively determining the amount of each of said fluorescent materials by detecting its individual fluorescence signals at their different fluorescence wavelengths.
  51. 51. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß das mit dem Sulfocyanin-Farbstoff markierte Material ein Antikörper oder eine DNA-Hybridisierungssonde ist. 51. The method according to claim 50, characterized in that the labeled with the sulfocyanine dye material is an antibody or a DNA hybridization probe.
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