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Verfahren zur isolierung von 2-keto-polyhydroxy-c(pfeil abwaerts)6(pfeil abwaerts)-carbonsaeuren, insbesondere von 2-keto-l-gulonsaeure aus waessrigen fermentationsaustraegen
DE3831071A1
Germany
- Other languages
English - Inventor
Joachim Dr Paust Ulrich Von Dr Deessen Hansgeorg Dr Ernst Michael Dr Schaper - Current Assignee
- BASF SE
Worldwide applications
Application DE19883831071 events
1988-09-13
1988-09-13
1989-08-31
1989-09-13
1990-03-15
Status
Withdrawn
Description
translated from
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung von auf fermentativem
Wege hergestellten 2-Keto-polyhydroxy-C6-carbonsäuren, insbesondere von so
hergestellter 2-Keto-L-gulonsäure aus wäßrigen Fermentationsausträgen
mittels Extraktion in Gegenwart von Aminen.
2-Keto-L-gulonsäure ist ein zentrales Zwischenprodukt bei der Herstellung
von Vitamin C. Vitamin C wurde bisher weltweit konventionell nach dem
sogenannten Reichsteinverfahren hergestellt. Bei diesem Verfahren handelt
es sich um einen vielstufigen Prozeß, der vor allem aufgrund der aufwen
digen Schutzgruppenchemie nicht mehr zeitgemäß ist.
Aus diesem Grunde hat es nicht an Versuchen gefehlt, Verfahren zur
Herstellung des begehrten Vitamin C auf biotechnologischer Basis zu
entwickeln, die weniger Reaktionsschritte aufweisen und bei denen die
Problematik geeigneter Schutzgruppen vermieden wird. Allen bisher
bekannten wichtigen biotechnologischen Verfahren gemeinsam ist die
Verwendung von D-Glucose als Ausgangsverbindung und die Bildung von
2-Keto-L-gluconsäure (2-KGS) als Vitamin-C-Vorstufe. Bekannte biotechno
logische Wege:
- a) Glucose → 2,5-Diketogluconsäure → 2-KGS → Vitamin C
- b) Glucose → L-Sorbose → 2-KGS → Vitamin C.
Da die 2-KGS in beiden Fällen durch Fermentation erzeugt wird, findet man
sie in wäßriger Lösung zusammen mit Biomasse vor. Für die Gewinnung reiner
L-Ascorbinsäure (Vitamin C) ist aber eine Isolierung der 2-KGS bzw. eine
Isolierung von deren Derivaten aus den Fermentationsausträgen unumgäng
lich.
Bei den meisten bisher bekannten fermentativen Verfahren wird der für die
Fermentation geeignete pH-Wert durch Zufügen eines Calciumsalzes ein
gestellt, wodurch 2-KGS in Form ihres Calciumsalzes in der wäßrigen
Fermentationsbrühe anfällt.
Nach Shionogi (vgl. JA-OS 5 20 66 684) wird aus dieser Lösung das Calcium
durch Zugabe von Natriumcarbonat als Calciumcarbonat gefällt und
abfiltriert, das Filtrat eingedampft und durch Zusatz von Methanol 2-KGS
als Natriumsalz ausgefällt. Die Ausbeute beträgt hierbei ca. 87%. Durch
Behandeln des Natriumsalzes mit HCl in einem Lösungsmittel werden nachein
ander NaCl und Vitamin C erhalten (vgl. EP-A 91 134). Die Umlagerung ver
läuft mit 72% Ausbeute.
Gemäß Verfahren von Takeda (vgl. JA-OS 7 50 22 113) erfolgt die Isolierung
von 2-KGS durch Ionenaustausch. Nach Veresterung der Säure wird mit
Natriummethylat zum Natriumascorbat in 86%iger Ausbeute umgelagert.
Nachteilig bei allen diesen Verfahren ist, daß große Fermentationsvolumina
bewegt werden müssen und daß Natriumketogulonat mit HCl zur Ascorbinsäure
sauer umgelagert wird, wobei eine große Menge Salz als unerwünschtes
Nebenprodukt entsteht. Entsprechend wird bei der alkalischen Umlagerung
des Esters Natriumascorbat erzeugt dessen Überführung in L-Ascorbinsäure
ebenfalls die Bildung großer Mengen Salz mit sich bringt, was aus umwelt
technischen und Kostengründen unerwünscht ist.
Es war daher die Aufgabe der Erfindung, ein möglichst einfaches Verfahren
zur Isolierung von 2-KGS aus wäßrigen Fermentationsausträgen zu ent
wickeln, bei dem die Nachteile des Standes der Technik nicht auftreten,
bei dem insbesondere die Bildung großer Mengen an Salzen entfällt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß 2-KGS in Gegenwart von
langkettigen lipophilen Aminen mit 15 bis 40 C-Atomen in einfacher Weise
durch Extraktion mit höheren Alkanolen aus der Fermentationsbrühe
abgetrennt werden kann, wenn man aus dem von Biomasse befreiten
Fermentationsaustrag unter den Extraktionsbedingungen durch Einleiten von
CO2 unter Druck in situ die enthaltenen Calciumionen abgetrennt, d.h. also
unter CO2-Druck arbeitet. Aus dem gebildeten 2-KGS-Amin-Addukt können dann
auf einfache Weise 2-KGS, 2-KGS-Salz oder 2-KGS-Ester gewonnen werden.
Aus US 44 44 881 ist zwar schon die Extraktion von Carbonsäuren aus deren
wäßrigen Lösungen der entsprechenden Calciumsalze mit Amincarbonaten
bekannt, jedoch handelt es sich hierbei
- 1) um einfache Säuren, wie Propionsäure, Buttersäure, Milchsäure und Citronensäure und
- 2) werden als geeignete Amine, insbesondere tertiäre Amine, wie Tributyl amin und Dicyclohexylmethylamin, genannt. Die langkettigen Amine, die für die Extraktion von 2-Ketogulonsäure besonders gut geeignet sind, wie Trioctylamin und Tridodecylamin werden ausgeschlossen. Bevorzugte Extraktionsmittel dieses Verfahrens sind chlorierte Kohlenwasser stoffe, wie Chloroform.
Die Anwendung der bekannten Extraktionsbedingungen auf die Gewinnung von
2-KGS aus Fermentationsausträgen lieferte keine oder nur sehr schlechte,
wirtschaftlich unakzeptable Ausbeuten an 2-KGS.
Dies dürfte einerseits in dem üblicherweise zu starker Emulsionsbildung
führenden stark polaren Charakter von 2-KGS
begründet sein (vgl. Polyhydroxyketocarbonsäure I), andererseits dadurch,
daß 2-KGS aufgrund der Oxo-Cyclo-Tautomerie (vgl. II mit zuckerähnlicher
Struktur und zuckerähnlichem Verhalten) zahlreiche Nebenreaktionen ein
gehen kann.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Extraktion von 2-Keto-poly
hydroxy-C6-carbonsäuren, insbesondere von 2-KGS, aus wäßrigen Fermenta
tionsausträgen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a) einen von Biomasse befreiten, die 2-Keto-polyhydroxy-C6-carbonsäure als Calciumsalz enthaltenden Fermentationsaustrag unter einem CO2-Druck von 10 bis 60 bar in Gegenwart von 2 bis 6, vorzugsweise 3,5 bis 5 Molequivalenten, bezogen auf die in dem Fermentationsaustrag enthaltene 2-Keto-polyhydroxy-C6-carbonsäure, an einem Amin mit insgesamt 15 bis 40 C-Atomen mit 1,5 bis 2,5, vorzugsweise 1,6 bis 2 Gew.-Teilen, bezogen auf das Amin eines C4- bis C8-Alkanols bei Temperaturen zwischen 20 und 80°C, vorzugsweise 55 bis 65°C extra hiert,
- b) das ausgefallene Calciumcarbonat abtrennt und
- c) das erhaltene 2-Keto-polyhydroxy-C6-carbonsäure-Addukt in die freie Carbonsäure oder deren Derivat spaltet bzw. überführt.
Als 2-Keto-polyhydroxy-C6-carbonsäure, die erfindungsgemäß aus sie ent
haltenden Fermentationsausträgen isoliert werden können, kommen insbe
sondere 2-Keto-L-gulonsäure, 2-Keto-D-gluconsäure und 2-Keto-galaktonsäure
in Betracht. Von besonderer Bedeutung ist das Verfahren für die Isolierung
der für die Herstellung von Vitamin C dringend benötigten 2-Keto-L-gulon
säure. Die Ketocarbonsäuren fallen bei ihrer fermentativen Herstellung im
allgemeinen in Fermentationsbrühen an, die zwischen 1 und 20 Gew.-%,
vorzugsweise etwa 7-12 Gew.-% der Carbonsäure enthalten. Bei der erfin
dungsgemäßen Extraktion unter CO2-Druck kann man wesentlich konzentrier
tere Lösungen einsetzen. Sehr vorteilhaft arbeitet man mit Lösungen, die
etwa 30 Gew.-% an 2-KGS enthalten. Verdünntere Fermentationsausträge
können dementsprechend eingeengt werden.
Vor dem Extraktionsprozeß wird aus diesen Fermentationsbrühen die Biomasse
in an sich bekannter Weise durch Abfiltrieren oder Zentrifugieren abge
trennt.
Zur Extraktion werden dem Fermentationsaustrag 2 bis 6, vorzugsweise etwa
3,5 bis 5 Molequivalente, bezogen auf die in dem Fermentationsaustrag
enthaltene 2-Keto-polyhydroxy-C6-carbonsäure, des Amins zugefügt. Als
Amine kommen langkettige, lipophile Amine mit aliphatischen, cycloali
phatischen und aromatischen Resten mit insgesamt 15 bis 40 C-Atomen in
Betracht. Genannt seien insbesondere Trioctylamin, Trilaurylamin,
Tri-tridecylamin, Tricaprylamin, käufliche Gemische aus Trilauryl- und
Dilaurylamin (Tridodecylamin) und Ditridecylamin.
Mit besonderem Vorteil arbeitet man mit handelsüblichem Trioctylamin,
Tridodecylamin oder Ditridecylamin.
Als eigentliche Extraktionsmittel dienen C4- bis C8-Alkanole, wie
n-Butanol, iso-Butanol, Pentanole, Hexanole, Heptanole und Octanole,
insbesondere Methylisobutylcarbinol, n-Butanol und iso-Butanol. Die
Alkanole verwendet man in Mengen von 1,5 bis 2,5, vorzugsweise 1,6 bis
2 Gew.-Teilen, bezogen auf das lipophile Amin. Die verwendete Gesamtmenge
an langkettigem Amin und Alkanol richtet sich im allgemeinen nach der
Zusammensetzung des Fermentationsaustrages. Durch einfache Vorversuche
kann für jeden Fall festgestellt werden, bei welcher Menge eine gute
Trennung erzielt werden kann und keine Emulsionsbildung auftritt. Größen
ordnungsmäßig arbeitet man mit einem Verhältnis von Fermenteraustrag zu
Extraktionsgemisch von etwa 0,15/1 bis 0,2/1, vorzugsweise 0,16 bis
0,18/1.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren fällt Calciumcarbonat aus dem
Reaktionsgemisch aus, das nach Abfiltrieren wieder in die Fermentations
stufe zur pH-Wert-Kontrolle zurückgeführt werden kann.
Hierdurch wird der bei einer gesonderten Abtrennung von Calcium auf
tretende Zwangsanfall von Calciumsulfat vermieden.
Zur Durchführung des Verfahrens wird die Calciumpolyhydroxy-C6-carbon
säure, insbesondere Calcium-Ketogulonat enthaltende Lösung, bzw. der von
Biomasse befreite und ggf. aufkonzentrierte Fermentationsaustrag mit dem
Gemisch aus dem langkettigen Amin und dem Alkanol versetzt, im Autoklaven
mit 10 bis 60 bar CO2 begast und bei einer Temperatur von 20 bis 80°C,
vorzugsweise 55 bis 65°C über einen Zeitraum von 5 bis 60 Stunden (h),
vorzugsweise etwa 10 bis 15 h, gerührt.
Die Extraktion kann im Chargen-(batch)-Betrieb, aber mit Vorteil auch
kontinuierlich (z.B. in einem Mixer-Settler) durchgeführt werden.
Nach dem Abtrennen des ausgefallenen Calciumcarbonats und der Phasen
trennung wird aus der das Wertprodukt als Amin-Addukt enthaltenden alko
holischen Phase unter vermindertem Druck der Alkohol destillativ entfernt.
Bei Verwendung von Butanolen wird das 2-KGS-Amin-Addukt beispielsweise aus
der Oberphase durch Abdestillieren des Alkohols bei etwa 10 bis 100 mbar,
vorzugsweise 15 bis 25 mbar, mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei 20
bis 50°C, vorzugsweise etwa 30°C isoliert. Der abdestillierte Alkohol kann
erneut zur Extraktion verwendet werden. Die Unterphase kann einer weiteren
Extraktion zugeführt werden.
Das bei der beschriebenen erfindungsgemäßen Extraktion anfallende
2-Keto-polyhydroxy-C6-Carbonsäure-Amin-Addukt kann auf verschiedene Weise
weiterverarbeitet werden. Der Einfachheit halber beschreiben wir im
einzelnen die Weiterverarbeitung der besonders wichtigen 2-KGS.
1. Zur Gewinnung von freier 2-Keto-L-gulonsäure kann man das
2-KGS-Amin-Addukt mit etwa 3 bis 8 Gew.-Teilen Test-benzin (Kp 155 bis
185°C), bezogen auf das 2-KGS-Amin-Addukt, versehen und bei Tempera
turen von 60 bis 120°C, vorzugsweise etwa 90°C, im Reaktionsgefäß für
10 bis 60 Minuten (min.), vorzugsweise etwa 30 min. rühren. Die aus
fallenden 2-KGS-Kristalle werden heiß abgesaugt. Man erzielt hierbei
Ausbeuten von etwa 94%. Das Amin kann in den Prozeß zurückgeführt
werden.
Das 2-KGS-Amin-Addukt kann aber auch mit Wasser bei Raumtemperatur
(RT) in die freie 2-KGS und Amin gespalten werden. Hierzu wird das
erhaltene 2-KGS-Amin-Addukt durch Behandeln mit 2 bis 20, vorzugsweise
etwa 10 Gew.-Teilen Wasser, bezogen auf das Addukt, bei Temperaturen
von 5 bis 50°C, vorzugsweise etwa 20°C in die freie 2-KGS und das
eingesetzte Amin gespalten, wozu im allgemeinen Reaktionszeiten von
etwa 10 bis 60 Minuten notwendig sind.
2. Zur Gewinnung von Alkalisalzen der 2-KGS wird das 2-KGS-Amin-Addukt im
allgemeinen mit der 2- bis 5fachen, vorzugsweise etwa 3fachen Ge
wichtsmenge an Wasser versetzt und das erhaltene Gemisch anschließend
mit einer Alkalihydroxidlösung titriert bis ein pH-Wert zwischen 9 und
12, vorzugsweise etwa 10 bis 11 erreicht ist. Das Amin kann aus dem
erhaltenen Gemisch beispielsweise mit Hexan extrahiert und nach
destillativem Entfernen des Hexans erneut verwendet werden. Aus der
wäßrigen Phase kann das Alkalisalz der 2-KGS durch Eindampfen in etwa
97%iger Ausbeute erhalten werden.
3. Zur Gewinnung von 2-KGS-Estern wird das 2-KGS-Amin-Addukt mit der 1,5-
bis 4fachen Gewichtsmenge einer etwa 2,5 N Lösung HCl in einem
C1- bis C5-Alkanol, vorzugsweise in Methanol und einem inerten
Lösungsmittel, wie Methylenchlorid versetzt und mehrere Stunden (h),
vorzugsweise etwa 12 h bei RT gerührt. Hierbei kristallisiert der sich
bildende Ester aus dem Reaktionsgemisch aus und kann durch Filtration
abgetrennt werden. Die Ausbeute an 2-KGS-methylester beträgt bei
diesem Verfahren etwa 95,9% der Theorie.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können 2-Keto-polyhydroxy-C6-
carbonsäuren, insbesondere die für die Herstellung von Vitamin C sehr
begehrte 2-Keto-L-gulonsäure, auf relativ einfache und wirtschaftlich
vorteilhafte Weise aus wäßrigen Fermentationsausträgen in reiner Form oder
in Form von ihren Salzen oder Estern isoliert werden. Die so erhaltene
2-KGS bzw. deren Derivate weisen eine hohe Reinheit auf und können auf
bekannte Weise in Vitamin C überführt werden.
Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern.
Die Versuche sind noch nicht optimiert.
Zu 15 ml einer wäßrigen Lösung enthaltend 3,8 g 2-KGS (gemäß HPLC) und
0,37 g Calciumionen (Titration mit Titriplex) wurde ein Gemisch aus 60 g
Isobutanol und 36 g (100 mMol, entsprechend 5,2 Molequivalenten)
Trioctylamin gegeben, die Mischung in einen Autoklaven gefüllt, 60 bar
CO2 aufgepreßt und das Reaktionsgemisch 12 h bei 60°C gerührt.
Anschließend wurde das erhaltene 3-Phasengemisch aus dem Autoklaven
entnommen, das ausgefallene CaCO3 abgesaugt und getrocknet (0,24 g). Die
Oberphase wurde nach Einengen am Rotationsverdampfer und Aufnehmen in
einem Gemisch aus 100 ml Hexan und 50 ml Wasser mit 0,1 nNaOH gegen
Phenolphthalein titriert.
In einen Autoklaven wurde zu 15 ml einer wäßrigen Lösung enthaltend 3,9 g
2-KGS (gemäß HPLC) und 0,37 g Calciumionen (nach Titration mit Titriplex)
ein Gemisch aus 61 g iso-Butanol und 24 g (69 mMol, entsprechend
3,5 Molequivalenten) Trioctylamin gegeben und das Reaktionsgemisch 60 h
bei 60°C und 60 bar CO2-Druck gerührt. Aufarbeitung analog Beispiel 1
einer Extraktionsausbeute von 37,9%. Die wäßrige Unterphase enthielt noch
1,6 g 2-KGS.
In einem Autoklaven wurde zu 15 ml einer wäßrigen Lösung enthaltend 3,9 g
2-KGS und 0,37 g Calciumionen eine Mischung aus 61 g n-Butanol und 36 g
(100 mMol, entsprechend 5,2 Molequivalenten) an Trioctylamin gegeben und
das Reaktionsgemisch 12 h bei 60°C und 60 bar CO2-Druck gerührt.
Aufarbeitung analog Beispiel 1 ergab 0,35 g CaCO3, 1,44 g 2-KGS, ent
sprechend einer Extraktionsausbeute von 36,9%. Die Unterphase enthielt
noch 2,24 g 2-KGS.
Claims (10)
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Claims (10)
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1. Verfahren zur Extraktion von 2-Keto-polyhydroxy-C6-carbonsäuren aus
wäßrigen Fermentationsausträgen, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) einen von der Biomasse befreiten, die 2-Keto-polyhydroxy-C6-car bonsäure als Calciumsalz enthaltenden Fermentationsaustrag unter einem CO2-Druck von 10 bis 60 bar, in Gegenwart von 2 bis 6 Molequivalenten, bezogen auf die in dem Fermentationsaustrag enthaltene 2-Keto-polyhydroxy-C6-carbonsäure, an einem Amin mit insgesamt 15 bis 40 C-Atomen mit 1,5 bis 2,5 Gew.-Teilen, bezogen auf das Amin eines C4- bis C8-Alkanols bei Temperaturen zwischen 20 und 80°C extrahiert,
- b) das ausgefallene Calciumcarbonat abtrennt und
- c) das erhaltene 2-Keto-polyhydroxy-C6-carbonsäure-Amin-Addukt in die freie Carbonsäure oder deren Derivat spaltet bzw. überführt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen
2-Keto-L-gulonsäure enthaltenden Fermentationsaustrag einsetzt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den
Fermentationsaustrag in Gegenwart von 3,5 bis 5 Molequivalenten,
bezogen auf die in dem Fermentationsaustrag enthaltene 2-Keto-L-gulon
säure, an einem langkettigen Amin extrahiert.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den
Fermentationsaustrag mit etwa 1,6 bis 2 Gew.-Teilen eines C4- bis
C8-Alkanols, bezogen auf das Amin extrahiert.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als
Amin Trioctylamin, Tridodecylamin oder Ditridecylamin verwendet.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als
C4- bis C8-Alkanol ein Butanol verwendet.
7. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das
erhaltene 2-Keto-L-gulonsäure-Amin-Addukt durch Erhitzen auf 60 bis
120°C in freie 2-Keto-L-gulonsäure und das eingesetzte Amin zurück
spaltet.
8. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das
erhaltene 2-Keto-L-gulonsäure-Amin-Addukt durch Behandeln mit 2 bis
20 Gew.-Teilen Wasser, bezogen auf das Addukt, bei Temperaturen von 5
bis 50°C, in die freie 2-Keto-L-gulonsäure und das eingesetzte Amin
spaltet.
9. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das
erhaltene 2-Keto-L-gulonsäure-Amin-Addukt mit einem Alkali- oder
Erdalkalihydroxid in das entsprechende Salz der 2-Keto-L-gulonsäure
überführt.
10. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das er
haltene 2-Keto-L-gulonsäure-Amin-Addukt mit einem Chlorwasserstoffgas
enthaltendem C1- bis C5-Alkanol, ggf. in einem inerten Lösungsmittel,
in den entsprechenden Alkanolester der 2-Keto-L-gulonsäure überführt.