DE3788650T2

DE3788650T2 - Sigma-gehirn-rezeptor-liganden und deren verwendung.

Info

Publication number: DE3788650T2
Application number: DE3788650T
Authority: DE
Inventors: John Keana; Mark Sonders; Eckard Weber
Original assignee: University of Oregon; Oregon State
Current assignee: University of Oregon; Oregon State
Priority date: 1986-07-10
Filing date: 1987-06-26
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2007-06-27
Also published as: JPH02500909A; JP2597329B2; JPH08225512A; WO1988000583A1; EP0314690A4; JP2528683B2; AU7701887A; US4709094A; DE3788650D1; EP0314690B1; EP0314690A1; AU605785B2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Guanidin- Verbindungen, die selektiv Sigma-Hirnrezeptoren binden, zur Herstellung von Arzneimitteln, die bei der Diagnose und Behandlung von mentalen Krankheiten nützlich sind, neuartige N,N'-disubstituierte Verbindungen, die derartige Wirkung und Verwendbarkeit haben und Arzneimittel, die diese beinhalten und Verfahren zur in vivo Bestimmung der Sigma-Hirnrezeptor-Bindungsaktivität von organischen Verbindungen.
Eine große Bandbreite substituierter Guanidine wird in der Patentliteratur offenbart. Zum Beispiel,
1,411,731 und 1,422,506 offenbaren Diphenylguanidin, 1,597,233 offenbart N-o-Tolyl-N'-phenylguanidin als Vulkanisationsbeschleuniger;
1,672,431 offenbart N,N'-Di-o-methoxyphenylguanidin als nützlich bei therapeutischen Zwecken, besonders in Form wasserlöslicher Salze;
1,730,338 offenbart N-p-Dimethyl-aminophenyl-N'- phenylguanidin als Vulkanisationsbeschleuniger;
1,795,738 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von N,N' -Dialkyl-disubstituierten Guanidinen, einschließlich N-Diethyl-N' -phenylguanidin, N-Diethyl-N- isoamylguanidin, N-Dimethyl-N-isoamylguanidin und N- Dimethyl-N-ethylguanidin;
1,850,682 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von disubstituierten Guanidin-Vulkanisationsbeschleunigern, die einen weiteren Substituenten am Imin-Stickstoffatom tragen;
2,145,214 offenbart die Verwendung von disubstituierten Guanidinen, zum Beispiel Diarylguanidinen, besonders Dixylylguanidin, als Parasiten vernichtende Mittel;
2,254,009 offenbart sym-Di-2-octyl-guanidin und 2,274,476 und 2,289,542 offenbaren sym-Di-2-cyclohexylguanidin als Insektizide und Mottenlarven-Repellentien;
2,633,474 offenbart 1,3-Bis(o-ethylphenyl)guanidin und 1,3-Bis(p-ethylphenyl)guanidin als Vulkanisationsbeschleuniger;
3,117,994 offenbart N,N',N''-trisubstituierte Guanidine und deren Salze als bakteriostatische Verbindungen;
3,140,231 offenbart N-Methyl- und N-Ethyl-N'-octylguanidine und deren Salze als antihypertonische Mittel;
3,252,816 offenbart verschiedene N-substituierte und unsubstituierte Cinnamyl-guanidine und allgemein die entsprechenden N'- und N''-alkyl-substituierten Verbindungen und deren Salze als als antihypertonische Mittel;
3,547,951 offenbart 1,3-Dioxolan-4-yl-alkylsubstituierte Guanidine, die antihypertonische Wirkung haben und offenbart Niederalkylreste, einschließlich der n-Butylgruppe, als möglichen Substituenten der anderen Aminogruppe.
3,270,054 offenbart N-2-Adamant-1-yl- und N-2- Homoadamant-1-yl-oxy-ethyl-thioethyl- und -aminoethylguanidin-Derivate, die mindestens zwei Niederalkylreste am N'- und/oder N''-Stickstoffatom tragen, als sympathicolytische und antivirale Mittel;
3,301,755 offenbart N-ethylenisch unsubstituierte Alkylguanidine und deren entsprechende N'- und/oder N''- Niederalkylverbindungen als hypoglycämische und antihypertonische Mittel;
3,409,669 offenbart N-Cyclohexylamino-(3,3-dialkylsubstituierte-propyl)-guanidine und deren entsprechende N'- Alkyl und/oder N''-Alkyl substituierte Verbindungen als hypotensive Mittel;
3,248,426 beschreibt (Beispiel 5) ein 1,3- disubstituiertes Guanidin, dessen Substituenten hydrophobe Kohlenwasserstoffreste sind, von denen der eine eine Naphthylmethyl- und der andere eine n-Butylgruppe ist;
3,639,477 offenbart Propoxyguanidin-Verbindungen, die anoretische Eigenschaften haben;
3,804,898 offenbart N-Benzcyclobutenyl- und N- Benzcyclobutenyl-alkyl-guanidine und deren entsprechende N'-alkyl und/oder N''-alkyl-substituierte Verbindungen, die hypotonische Eigenschaften aufweisen;
3,968,243 offenbart N-aralkyl-substituierte Guanidine und deren entsprechende N'-Alkyl-N''-alkyl- und N',N'-Aralkyl-Verbindungen als nützlich, bei der Behandlung Pulsarrhythmie;
3,975,533 offenbart o-Halo-benzyliden-aminoguanidine und deren Verwendung als Antidepressiva zur Überwindung psychischer Depressionen;
4,007,181 offenbart verschiedene N,N'- disubstituierte Guanidine, die am Imin-Stickstoffatom mit einer Adamantylgruppe substituiert sind und die antiarrhythmische und diuretische Wirkung besitzen;
4,051,256 offenbart N-Phenyl- und N-Pyridyl-N'- cycloalkyl-guanidine als antivirale Mittel;
4,109,014 offenbart N-Hydroxy-substituierte Guanidine und deren entsprechende N'-methyl-disubstituierte Guanidine als vasokonstriktorische Mittel;
4,169,154 offenbart die Verwendung von Guanidinen bei der Behandlung von Depressionen;
4,393,077 offenbart N-substituierte und unsubstituierte Phenyl-, N-substituierte Methyl-N'-unsubstituierte, monosubstituierte und disubstituierte-N''-unsubstituierte und substituierte Guanidine als Ganglienblocker; und
4,471,137 offenbart N,N,N',N''-Tetraalkylguanidine als sterisch gehinderte Basen, die bei der chemischen Synthese nützlich sind.
Als Beispiele anderer substituierter Guanidine, siehe zum Beispiel 1,422,506; 1,642,180; 3,159,676; 3,228,975; 3,248,426; 3,283,003; 3,320,229; 3,547,951; 3,639,477; 3,784,643; 3,975,533; 4,060,640; und 4,161,541.
Geluk, H.W., et al., J. Med. Chem., 12 (1969) 712 beschreibt die Synthese einer Vielzahl Adamantyldisubstituierter Guanidine als mögliche antivirale Mittel, einschließlich N,N'-Di-(adamantan-1-yl)guanidin Hydrochlorid, N-(Adamantan-1-yl)-N'-cyclohexyl-guanidin- Hydrochlorid und N-(Adamantan-1-yl)-N'-benzyl-guanidin- Hydrochlorid.
Wir fanden, daß bestimmte N,N'-disubstituierte Guanidine selektive Sigmarezeptor-Bindungsaktivität besitzen und zur Herstellung eines bei der Diagnose und Behandlung von Psychose nutzbaren Arzneimittels nützlich sind.
Bestimmte Benzomorphan-Opiate, wie N-Allylnormetazocin (SKF 10,047) und Cyclazocin, verursachen zusammen mit Analgetica Halluzinationen, Depersonalisationen, Rausch und andere psychotomimetische Wirkungen beim Menschen. Bei Affen, Hunden und Nagetieren verursachen die psychotomimetischen Opiate autonome Wirkungen und beeinflussen das Verhalten, in anderer Weise, als man es bei der Anwendung klassischer Opiate, wie Morphin oder opioiden Peptiden, beobachtet. Es wird angenommen, daß spezifische sigma-"opioid"-Rezeptoren im Hirn solche atypischen Wirkungen vermitteln. Martin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 197 (1976) 517-532. Es wird angenommen, daß die Sigmarezeptoren auch die psychotomimetischen Wirkungen von Phencyclidin [PCP, Angel Dust] vermitteln, oder alternativ, daß psychotomimetische Opiate als spezifische PCP Rezeptoren wirken. Zukin, R. S. & Zukin, R. S., Mol. Pharmacol., 20 (1981) 246-254; Shannon, H. E., J. Pharmacol. Exp. Ther. 225 (1983) 144-152; White, J. M. & Holtzman, S. G., Psychopharmacology, 80 (1983) 1-9; und Zukin et al., J. Neurochem., 46 (1986) 1032-1041. PCP ist eine Suchtdroge, die beim Menschen ein Verhaltenssyndrom verursacht, das dem bei schizophrener Psychose beobachteten ähnlich ist. Aniline, O. & Pitts, F. N. Jr., CRC Critical Rev. Toxical., 10 (1982) 145-177. Wegen der starken psychotomimetischen Wirkungen von Sigmaopiaten und PCP wird angenommen, daß Sigma-(und/oder PCP) Rezeptoren bei mentaler Krankheit, besonders Schizophrenie, eine Rolle spielen.
Eine systematische Untersuchung der Rolle von Sigmarezeptoren bei normaler oder abnormaler Hirnfunktion wurde durch das Fehlen spezifischer Sigmarezeptor- Bindungsassays und Bioassays verhindert. Die Entwicklung solcher spezifischer Assays erfordert gut charakterisierte, hochselektive und starke Sigmarezeptor-Liganden. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß Hirnmembranrezeptoren in vitro markiert werden können, mit (+)[³H] SKF 10,047, Su, T.P., J. Pharmacol. Exp. Ther., 223 (1982) 284-290; (+)[³H] Ethylketazocin, Tam, S.W., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 80 (1983) 6703-6707; oder mit (+)[³H] SKF 10,047, Tam, S.W. & Cook, L., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 81 (1984) 5618- 5627; Martin, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 231 (1984) 539-544; und Mickelson, M.M. & Lahti, R.A. Res. Commun. Chem. Pathol.Pharmacol., 47 (1985) 255, 263, wenn auch nicht selektiv, Gundlach et al., Eur. J. Pharmacol., 113 (1985) 465-466; und Largent B.L., Gundlach, A.L. & Snyder, S.H. J.Pharmacol. Exp. Ther., (1986) (im Druck)&sub1; und mit (+)[³H] 3-(3-Hydroxyphenyl)N-(1-propyl)piperidin ((+)[³H]3PPP), Largent et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 81 (1984) 4983-4987, das anscheinend selektiver für Sigmarezeptoren ist, als die anderen.
Nach anfänglichen in vitro Untersuchungen durch Martin und Mitarbeiter (1976), Keats und Telford, Keats, A.S. und Telford, J. "Analgesics: Clinical Aspects." In: Molecular Modification in Drug Design, R.F. Gould, ed., Advances in Chemistry Series #45 Amer. Chem. Soc., Wash. D.C. (1964), und Haertzen, Haertzen, C.A. Cyclazocin und Nalorphin on the Addiction Research Center Inventory (ARCI), Psychopharmacologia (Berl.) 18 (1970) 366-377, begannen viele Forscher die unterschiedlichen Opiatrezeptoren (u-Rezeptoren, kappa-Rezeptoren und sigma- Rezeptoren) in vitro zu charakterisieren.
Der erste Beleg für die Existenz eines separaten Sigmarezeptors in Reagenzglasversuchen lieferte Su (1982) in einem Artikel, der eine Etorphin-unzugängliche Bindungsstelle in Meerschweinchen-Hirnmembranen beschreibt, die anscheinend selektiv von tritiummarkiertem SKF-10,047 markiert wurde. Um die Tatsache zu umgehen, daß SKF-10,047 viele Opioidrezeptoren im Hirn markieren kann, führte Su sein Rezeptorbindungsassay, das tritiummarkiertes SKF- 10,047 verwendet, in Gegenwart eines Überschusses an unmarkiertem Etorphin durch. Etorphin ist ein sehr starker Opiatagonist-Arzneistoff, von dem bekannt ist, daß er an delta-Rezeptoren, u-Rezeptoren und kappa-Rezeptoren mit fast gleicher Stärke bindet. Su verwendete Etorphin, um alle u- kappa- und delta-Rezeptoren in einer Hirnmembranpräparation zu sättigen und gab dann tritiummarkiertes SKF-10,047 zu. Das ermöglichte ihm, eine Sigmabindungsstelle, die sich anscheinend von u- kappa- und delta-Rezeptoren unterschied, aufzufinden.
Der eigentliche Durchbruch bei der Identifizierung des Sigmarezeptors als separate Einheit, geschah, als Tam et al., (1984) zeigten, daß die vorangegangenen Probleme beim selektiven Markieren des Sigmarezeptors dadurch verursacht wurden, daß bei allen vorherigen Versuchen ein racemisches SKF-10,047 Präparat verwendet wurde. Tam zeigte, daß er bei Verwendung eines tritiummarkierten (+)- SKF-10,047 Isomers einen Sigmarezeptor, der sich von den u-, delta- und kappa-Opioidrezeptoren unterschied, selektiv markieren konnte. Auf der anderen Seite zeigte Tam, daß (-)-SKF-10,047 anscheinend die u- und kappa-Rezeptoren markierte, aber nicht die Sigmarezeptoren. Tam, S.W., Eur. J. Pharm. 109 (1985) 33-41. Diese Befunde wurden inzwischen bestätigt. (Martin et al., 1984). Weiterhin gibt es Belege aus Verhaltensexperimenten, Khazan et al., Neuropharm. 23 (1984) 983-987; Brady et al., Science 215 (1981) 178-180, das es das (+)-SKF-10,047 Isomer ist, das für die psychotomimetischen Wirkungen von SKF-10,047 allein verantwortlich ist.
Eines der wichtigsten Ergebnisse der biochemischen Charakterisierung des Sigmarezeptors war, daß dieser Rezeptor alle synthetischen Opiatarzneistoffe, von denen bekannt ist, daß sie halluzinogene und psychotomimetische Wirkung haben, bindet. Opiate, die in vivo keine psychotomimetische Wirkung zeigen, binden nicht an diesen Rezeptor. Als wichtigstes wurde gezeigt, daß der Sigmarezeptor neben halluzinogen wirkenden Opiatarzneistoffen auch viele antipsychotisch wirkenden Arzneistoffe bindet, die klinisch zur Behandlung von Halluzinationen bei schizophrenen Patienten verwendet werden. (Tam und Cook, 1984). Die anfänglichen Beobachtungen bezüglich antipsychotisch wirkender Arzneistoffe, die an den Sigmarezeptor binden (Su, 1982) wurden nach und nach ausgiebig von Tam und Cook (1984) bestätigt und erweitert, diese zeigten auch, daß bei Verwendung radioaktiv markierten Haloperidols, einem der stärksten antipsychotisch wirkenden Arzneistoffe in der klinischen Verwendung, etwa die Hälfte der Bindungsstellen in Hirnmembran-Präparaten wirklich Sigmarezeptoren sind, wogegen die andere Hälfte der Bindungsstellen scheinbar Dopaminrezeptoren sind. Es ist seit langem bekannt, daß die meisten antipsychotisch wirkenden Arzneistoffe auch Dopaminrezeptor-Antagonisten sind und früher ordnete man die positive Wirkung der antipsychotisch wirkenden Arzneistoffe bei psychotischen Patienten der Dopaminrezeptor-Blockierungswirkung dieser Arzneistoffe zu. Aus der Arbeit von Tam wird jedoch klar, daß viele klinisch verwendete psychotische Arzneistoffe auch an die Sigmastelle binden. Daher verursachen alle antipsychotischen Arzneistoffe, die in der einen oder andern Weise an den Sigmarezeptor binden, die positive Wirkung der Linderung von Halluzinationen. Zusammengenommen machen all diese Beobachtungen den Sigmarezeptor zu einem Hauptkandidaten, der an der Pathogenese mentaler Krankheit, besonders Schizophrenie, bei der Halluzinationen ein klinisches Hauptsymptom sind, beteiligt ist.
Die antipsychotisch und anti-schizophren wirkenden Arzneistoffe, die gegenwärtig verwendet werden, haben hauptsächlich auf Grund ihrer Wirkung auf Dopaminrezeptoren starke Nebenwirkungen. Die Nebenwirkungen umfassen oft irreversible Schädigung des extrapyramidalen Nervensystems, das Bewegungsfunktionen des Hirns kontrolliert. Patienten, die unter längerer Behandlung mit Antischizophrenie- Arzneistoffen stehen, entwickeln oft ein Syndrom, das permanente Schädigung ihrer Fähigkeit, koordinierte Bewegungen zu kontrollieren, umfaßt.
Wir haben eine neue Verbindungsklasse identifiziert, die an den Sigmarezeptor bindet.
Die vorstehenden Untersuchungen zeigten, daß die sigma-Bindungsstelle folgende Eigenschaften hat: 1) Stereoselektivität gegenüber rechtsdrehenden Benzomorphanopiaten und Unempfindlichkeit gegenüber Naloxon; 2) hohe Affinität gegenüber Haloperidol und mäßige bis hohe Affinität gegenüber antipsychotisch wirkenden Phenothiazin-Arzneistoffen, von denen man auch weiß, daß sie starke Dopaminrezeptor-Blocker sind; und 3) Unempfindlichkeit gegenüber Dopamin und Apomorphin. Dieses interessante Arzneistoff-Selektivitätsprofil verlangt nach einer eingehenden Analyse der Rolle des Sigmarezeptors bei normaler und abnormaler Hirnfunktion. Um dies zu erreichen, ist es wichtig, daß ein Spektrum hochselektiver und starker, Sigmarezeptor-aktiver Verbindungen zur Verfügung steht. Die Erfindung stellt solche Verbindungen und Verfahren zur Identifizierung anderer Arzneistoffe, die diese Aktivität haben, bereit.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, eine neue Verbindungsklasse bereitzustellen, die selektiv an die Sigmarezeptorstellen bindet und daher zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden kann, das bei der Diagnose und Behandlung von Psychose von Nutzen ist.
Ein andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer solchen Verbindung, die radioaktiv markiert ist und bei der in vitro - Untersuchung der Sigma-rezeptor- Bindungsaktivität organischer Verbindungen nützlich ist.
Ein weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der Sigmarezeptor-Bindungsaktivität organischer Verbindungen Ein weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines in vitro Verfahrens zum Auffinden von Prüf-Verbindungen, die Sigmarezeptor-Aktivität aufweisen und als antipsychotisch und antidepessiv wirkenden Arzneistoffe verwendbar sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist auch die Bereitstellung eines Arzneimittels, das zur Bestimmung der Beziehung von abnormalem Psychose-artigem Verhalten eines Säugers, der solches Verhalten zeigt, zu einer Dysfunktion des Sigmarezeptorsystems, verwendet werden kann.
Weitere Aufgaben der Erfindung werden dem Fachmann aus der Erfindung ersichtlich.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung tritiummarkierte N,N'-disubstituierte Guanidine der Formel
in der R und R' jeweils eine Adamantyl-, oder Cyclohexylgruppe oder einen monocyclischen, carbocyclischen Arylrest mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen bedeutet und in der mindestens eines der Ring-Kohlenstoffatome von R und R' mindestens ein Tritiumatom trägt.
Bevorzugt sind Verbindungen, worin
a) einer der Reste R und R' eine Adamantyl- und der andere eine 2-Methylphenylgruppe bedeutet,
b) einer der Reste R und R' eine Adamantyl- und der andere eine Cyclohexylgruppe bedeutet,
c) sowohl R als auch R' eine Adamantyl- oder beide eine Cyclohexylgruppe darstellen,
d) mindestens einer der Reste R und R' ein azidosubstituierter, carbocyclischer Arylrest ist.
In einem weiteren Aspekt, bezüglich Mittel, betrifft die Erfindung die Verwendung von Guanidin-Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels in Einheitsdosisform und angepaßt für die systemische Verabreichung beim Menschen, das pro Einheitsdosis eine wirksame Menge N,N'- disubstituiertes Guanidin enthält, in seiner wasserlöslichen, protonierten Form, die in vitro an isolierte Hirnmembran von Säugern gebundenes N,N'-Di-(4- [³H]-2-methylphenyl)guanidin verdrängt, zur Änderung der Sigmahirnrezeptor-modulierten Aktivität eines psychotisches Verhalten aufweisenden oder unter chronischen Depressionen leidenden Menschen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft N-(4-Azido-2- methylphenyl)-N-(2-methylphenyl)-guanidin.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft N,N'-Di-(4-halogen-2-methylphenyl)-guanidin.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung der Sigma-Hirnrezeptor Bindungsaktivität einer organischen Verbindung, das die Schritte umfaßt:
a) Das Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium eine bekannte Menge isolierter Hirnmembran von Säugern, die psychotomimetische Benzomorphan-Bindungsaktivität zeigt, mit einem Gemisch aus (i) tritiummarkiertem N,N'- disubstituiertem Guanidin, das selektiv Sigma-Hirnrezeptoren bindet, in einer bekannten Menge, die in der Lage ist an Sigmarezeptoren dieser Hirnmembran gebunden zu werden; und (ii) Variation bekannter Mengen einer wasserlöslichen organischen Verbindung, die auf Sigmarezeptor- Bindungsaktivität hin untersucht werden soll.
b) Abtrennung aller tritiummarkierten Verbindung, die nicht in Schritt a) an die Hirnmembran gebunden wurde von der Hirnmembran;
c) Bestimmung der Sigmarezeptor-Bindungsaktivität der organischen Verbindung aus dem molaren Verhältnis des Anteils von gebundener tritiummarkierter Verbindung, die in Schritt b) abgetrennt wurde, zum molaren Anteil der, in Schritt a) verwendeten, organischen Verbindung.
Die Erfindung betrifft ein weiteres Verfahren, nämlich ein in vitro Verfahren zum Auffinden von Antagonisten für halluzinogen wirkende Benzomorphane, die Sigmarezeptor-Bindungsaktivität zeigen, wobei das Verfahren das In-vitro-Zusammenbringen isolierter Maus-Samenleiter, deren Kontraktion als Reaktion auf elektrische Stimulation durch eine Verbindung, die Sigmarezeptor-Bindungsaktivität zeigt, verstärkt wurde, mit dem Antagonisten und Bestimmung jeder Umkehrung dieser Verstärkung umfaßt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Arzneimittels zur Bestimmung der Beziehung von abnormalem Psychose-artigem Verhalten bei einem Säuger, der solches Verhalten zeigt, zur Sigmarezeptor-Dysfunktion, umfassend die Verabreichung einer Sigma-Hirnrezeptor modulierenden Menge eines wasserlöslichen N,N'-disubstituierten Guanidins, das in vitro an die Hirnmembran des Säugers gebundenes N,N'-Di-(4-[³H]-2-methylphenyl)-guanidin ersetzt und ändernd auf die Sigma-Hirnrezeptor modulierte mentale Aktivität des Säugers wirkt.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft die Verwendung eines wasserlöslichen N,N'-disubstituierten Guanidins, das bezüglich der Sigmarezeptor-Bindungsaktivität eines halluzinogen wirkenden Benzomorphans als Antagonist wirkt und/oder das in vitro an Säuger- Hirnmembran gebundenes N,N'-Di-(4-[³H]-2-methylphenyl)guanidin ersetzt, vorzugsweise eine Verbindung der Formel (II), zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Menschen, die unter chronischen Depressionen oder einer psychotischen, mentalen Krankheit, verbunden mit Halluzinationen, zum Beispiel Schizophrenie, leiden.
Wir haben gefunden, daß die disubstituierten Guanidine dieser Erfindung Sigmarezeptor-Bindungsaktivität aufweisen, was durch deren Fähigkeit (+)-[³H]SKF 10,047 auf Meerschweinchen-Hirnmembran-Bindungsstellen zu ersetzen belegt wird. Wir fanden außerdem, daß ein [³H]-markiertes Derivat von einer dieser Verbindungen, besonders [³H]-1,3- Di-ortho-tolyl-guanidin (N,N'-Di-(4-[³H]-2-methylphenyl)guanidin), ([³H]-DTG), der folgenden Formel:
reversibel, sättigend, selektiv und mit hoher Affinität an Sigmarezeptor-Bindungsstellen von Meerschweinchen-Hirnmembran-Homogenisaten und auf Objektträger aufgebrachte Ratten- und Meerschweinchen-Hirnsektionen bindet. Wir haben bestätigt, daß (+)-[³H]3-PPP an die gleichen Stellen bindet. Die Verfügbarkeit der selektiven Sigma-Liganden dieser Erfindung ermöglicht die Charakterisierung von Sigmarezeptoren in vivo und in vitro.
Die bevorzugten N,N'-disubstituierten Guanidine der Erfindung sind die der Formel
in der R und R' jeweils einen Alkylrest mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen oder einen carboxylischen Arylrest mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, zum Beispiel bedeuten R und R', die gleich oder verschieden sein können, Alkylreste mit 4 oder mehr Kohlenstoffatomen, zum Beispiel 4 bis 12, bevorzugt ist ein geradkettiger Alkylrest, und besonders bevorzugt ein 4 bis 8 Kohlenstoffatom-Alkylrest, zum Beispiel eine Butyl-, Isobutyl-, tert-Butyl-, Amyl-, Hexyl- Octyl-, Nonyl- und eine Decylgruppe; ein Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel eine Cyclopropyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder eine Cycloheptylgruppe, 1,4-Methylen-cyclohexan, eine Adamantyl- Cyclopentylmethyl-, Cyclohexyl-methyl-, eine 1- oder 2- Cyclohexyl-ethyl- und eine 1-, 2- oder 3-Cyclohexylpropylgruppe; carboxylische Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylreste, zum Beispiel mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen und 1-3 einzelnen oder annelierten aromatischen Ringen, zum Beispiel Phenyl-, Benzyl-, 1- und 2-Phenylethyl-, 1-, 2-, oder 3-Phenylpropylgruppen; o-, m- oder p-Tolyl-, m,m'- Dimethylphenyl-, o-, m- oder p-Ethylphenyl-, m,m'- Diethylphenyl-, m-Methyl-m' -ethyl-phenyl- und o-Propylphenyl-, Naphtyl-, 2-Naphthyl und Biphenylgruppen.
Des weiteren können 1, 2, 3 oder mehr Substituenten, die im wesentlichen chemisch und physiologisch inert sind, verglichen mit der Guanidingruppe, in den Kohlenwasserstoffresten von R und R' vorhanden sein, zum Beispiel Alkylreste mit 1-8 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel eine Methyl- oder eine Ethylgruppe; ein Halogenatom, zum Beispiel Chlor, Brom, Iod, Fluor; eine Nitro-; eine Azido-; eine Cyano-; eine Isocyanat-; eine Amino-; eine Niederalkylamino-; eine Diniederalkylamino-; eine Trifluormethylgruppe; ein Alkoxyrest mit 1-8 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel eine Methoxy-, eine Ethoxy- und eine Propoxygruppe; ein Acyloxyrest, zum Beispiel ein Alkanoyloxyrest mit 1-8 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel eine Acetoxy- und eine Benzoxygruppe; ein Amidrest, zum Beispiel eine Acetamid-, eine N-Ethylacetamidgruppe; ein Carbamidrest, zum Beispiel eine Carbamyl-, eine N-Methylcarbamyl-, eine N,N'- Dimethylcarbamylgruppe; etc.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel (II), worin R und R' jeweils Phenylreste bedeuten, die nicht notwendigerweise identisch sein müssen, substituiert mit einem oder mehreren der vorstehenden Substituenten, zum Beispiel in der o-, m- oder p-Position oder der o-, p- oder m,m'-Position, falls der Phenylrest disubstituiert ist, oder R ist wie hier definiert und R' ist eine Adamantylgruppe. Spezielle Beispiele sind die, in denen R und R' beide Phenyl- oder p-Tolylgruppen bedeuten; R eine o-Tolyl- und R' eine p-Brom-o-tolyl-, eine p-CF&sub3;-o-Tolyl-, eine p-Iod-o-tolyl-, eine p-Iodphenyl-, eine p-Azido-otolyl-, eine Cyclohexyl- oder eine Adamantylgruppe darstellt; und R eine Phenylgruppe und R' eine p-Brom-otolyl-, eine p-Iod-o-tolyl-, eine m-Nitro-phenyl- oder eine p-Iod-phenylgruppe bedeutet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels in Einheitsdosisform und zur systemischen Anwendung beim Menschen angepaßt, das pro Einheitsdosis eine Menge, eines wasserlöslichen N,N'-disubstituierten Guanidins, das in vitro an isolierte Säuger-Hirnmembran gebundenes N,N'-Di-(4-[³H]-2-methylphenyl)-guanidin ersetzt, enthält, die wirksam ist, die Sigma-Hirnrezeptor modulierte Aktivität des Menschen zu verändern. Vorzugsweise ist das Guanidin eine Verbindung der Formel (I)
in der R und R' jeweils einen Alkylrest mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen, einen Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen oder einen carbocyclischen Arylrest mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen bedeutet. In den Arzneimitteln werden besonders die Guanidinverbindungen bevorzugt, in denen
a) mindestens einer der Reste R und R' eine o-Tolyl- oder ein Adamantylgruppe bedeutet,
b) mindestens einer der Reste R und R' eine o-Tolylgruppe bedeutet,
c) R und R' n-Butylgruppen darstellen,
d) R und R' o-Tolylgruppen darstellen,
e) R und R' Phenylgruppen darstellen,
f) R und R' 2-Methyl-4-brom-phenylgruppen darstellen,
g) R eine o-Tolylgruppe und R' eine p-Azido-o-tolylgruppe bedeutet,
h) R eine o-Tolylgruppe und R' eine Cyclohexylgruppe bedeutet,
i) R eine o-Tolylgruppe und R' eine Adamantylgruppe bedeutet,
j) sowohl R als auch R' Adamantylgruppen darstellen und
k) R eine Adamantylgruppe und R' eine Phenylgruppe bedeutet.
Die hochaktiven disubstituierten Guanidine der Erfindung, zum Beispiel DTG, haben im wesentlichen die gleiche Stereokonfiguration wie (+)3-PPP mit axialer Phenylgruppe und wie (+)-SKF-10,047 mit dem Piperidinring in schiefer Bootform und axialer N-Allylgruppe. Die Ähnlichkeit bezüglich der räumlichen Konfiguration von Verbindungen, die Sigmarezeptor-Bindungsaktivität zeigen, liefert ein Untersuchungsverfahren zur Vorhersage des möglichen Ausmaßes der Sigmarezeptor-Bindungsaktivität von anderen N,N'-disubstituierten Guanidinen.
Denkbare Äquivalente der vorstehenden Verbindungen, wobei einer oder beide Reste R und R' einen Carboxyl- Arylrest darstellet, sind jene in denen der Arylrest heterocyclisch ist, zum Beispiel eine 2- und 4-Pyridyl-, eine 2- und 3-N-Methyl-pyrrolyl-, eine 2- und 3-Furanyl-, eine 2- und 3-Thiofuranyl-, eine 2- und 3-Benzofuranyl-, eine 2-Benzoxazolylgruppe, etc.
Beispiele dieser Verbindungen, die isoliert und/oder hergestellt wurden und von denen man fand, daß sie die vorstehend beschriebene in vitro [³H-]DTG Verdrängungswirkung besitzen, sind N,N'-Dibutyl-guanidin, N,N'-Diphenyl-guanidin, N,N'-Di-o-tolyl-guanidin, N,N'-(2- Methyl-4-brom-phenyl)-guanidin und N,N'-Di-(2-methyl-4-iodphenyl)-guanidin, N-(2-Methyl-4-azido-phenyl)-N'-(2- methylphenyl)-guanidin und N-(Adamantyl)-N'-(2- methylphenyl)-guanidin.
Das Niveau der Sigmarezeptor-Aktivität von disubstituierten Guanidinen kann auch in vivo durch einen unterscheidenden Reiz-Eigenschafts-Test bestimmt werden, der Ratten verwendet, die darauf trainiert sind zwischen intraperitonealen Injektionen von Cyclazocin (2.0 mg/kg) und Kochsalzlösung, durch ein Einzelversuchs- Vermeidungsmuster mit Sitzungen zu jeweils 20 Versuchen, zu unterscheiden. Zum Beispiel waren DTG und DPG ein vollständiger Ersatz für Cyclazocin mit der gleichen Konzentration. (Holzman, S.G., Emeroy University, Atlanta, Georgia, private Mitteilungen).
Die Sigmarezeptor-Aktivität von Verbindungen in vivo kann auch durch ein Untersuchungsverfahren bestimmt werden, das das in vitro Zusammenbringen isolierter Maussamenleiter umfaßt, deren Kontraktion als Reaktion auf elektrische Stimulation durch eine Verbindung verstärkt wurde, bevorzugt ein halluzinogen wirkendes Sigma- Benzomorphan, zum Beispiel (+)-PPP, mit der Prüfverbindung in verschiedenen Konzentrationen und Bestimmung (Messung) des Anteils, wenn überhaupt, der Umkehrung dieser Verstärkung.
Obwohl die nachstehende Diskussion des von uns durchgeführten Experiments einen dieser selektiven Sigmarezeptor-Liganden betrifft, namentlich N,N'-Di-o-tolylguanidin (DTG), gelten vergleichsweise die Aktivität und Verwendbarkeit dieser Verbindung für die anderen disubstituierten Guanidinen, die mit in vitro an isolierte Meerschweinchen-Hirnmembran gebundenem N,N'-Di-(4-[³H]-2- methylphenyl)-guanidin konkurrieren und es in vitro ersetzen.
Bei der Ausführung des Verfahrens zur Messung der Sigmarezeptor-Bindungsaktivität der Erfindung wird eine bekannte Menge einer Säuger-Hirnmembran, zum Beispiel vom Menschen oder anderen Primaten, Schweinen, Nagern, zum Beispiel Ratte oder Meerschweinchen, mit (+)-SKF-10,047- und ähnlicher psychomimetischer Benzomorphan-Bindungsaktivität, in einem geeigneten wässerigen Transportmittel, zum Beispiel physiologischer Kochsalzlösung, mit einem Gemisch, in der Regel in einer Lösung in einem wässerigen Transportmittel aus (i) einem tritiummarkierten N,N'- disubstituierten Guanidin der Erfindung, das Sigmarezeptor-Bindungsaktivität zeigt, in einer Menge, die in der Lage ist vollständig an die vorstehend erwähnte Membranmenge gebunden zu werden, und (ii) einer wasserlöslichen organischen Verbindung, deren Sigmarezeptor- Aktivität zu prüfen ist, in bekannten Anteilen, die ausreichend variiert werden, um eine Dosis-Wirkungskurve zu erhalten, in Kontakt gebracht. Die Verfahren zur Erstellung einer Dosis-Wirkungskurve sind Standard und dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise kann man molare Mengen verwenden, die vom 10&supmin;³ bis zum 10³-fachen der molaren Menge an im Gemisch vorliegender tritiummarkierter Verbindung variieren können, zum Beispiel unter Verwendung von 10 bis 120 und vorzugsweise 30 bis 90 dieser Gemische.
Wenn die zu untersuchende organische Verbindung Sigmarezeptor-Bindungsaktivität zeigt, bleibt ein Teil der tritiummarkierten Verbindung, die in Abwesenheit der organischen Verbindung an die Membran binden würde, ungebunden und ist daher von der Membran abtrennbar. Die ungebunden gebliebene Menge ist proportional der Sigmarezeptor-Bindungsaktivität der organischen Verbindung und deren molaren Verhältnis zur tritiummarkierten Verbindung im Gemisch.
Die zwei Verbindungen können in jeder üblichen Gesamtkonzentration, zum Beispiel von 10&supmin;³ bis 10³ mM, angewendet werden.
Im nächsten Schritt wird die Membran aus der Lösung, in der Schritt (a) durchgeführt wurde, entfernt und frei von dieser gewaschen. Im nächsten Schritt wird die so von der Membran abgetrennte Menge tritiummarkierter Verbindung bestimmt, zum Beispiel durch Messung des gesamten Radioaktivitäts-Niveaus der abgetrennten Lösung und des Waschwassers und Vergleich dieser Radioaktivität mit der, die man erhält, wenn die vorstehenden Schritte mit der gleichen Menge tritiummarkierten N,N'-disubstituierten Guanidins in Abwesenheit der organischen Verbindung durchgeführt werden.
Im nächsten Schritt des Verfahrens wird die Aktivität der Sigmarezeptor-Bindungsaktivität der organischen Verbindung aus der so erhaltenen Dosis- Wirkungskurve bestimmt.
Man bevorzugt ein Verfahren, bei dem die Hirnmembran von Schweinen, Ratte, Mensch oder Meerschweinchen stammt.
Bevorzugt ist weiterhin ein Verfahren, bei dem die organische Verbindung ein N,N'-disubstituiertes Guanidin der Formel
ist, worin R und R' jeweils einen Alkylrest mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen oder einen carbocyclischen Arylrest mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen bedeuten.
Alle vorstehenden Schritte sind üblich und wurden im Stand der Technik bei anderen Arten von tritiummarkierten Verbindungen, die Sigma-rezeptor-Bindungsaktivität zeigen, angewendet. Das Verfahren der Erfindung ist jedoch insofern einmalig, als die tritiummarkierten, N,N'-disubstituierten Guanidine der Erfindung hochselektiv bei der Bindung durch die Sigmarezeptoren sind und daher nicht mit organischen Verbindungen konkurrieren, die an andere Hirnrezeptoren binden.
Diese disubstituierten Guanidine können leicht durch übliche chemische Reaktionen hergestellt werden, zum Beispiel, wenn R und R' gleich sind, durch Umsetzung des entsprechenden Amins mit Bromcyan. Weitere Verfahren, die angewendet werden können, umfassen die Umsetzung eines Amins mit einem vorgebildeten Alkyl- oder Allylcyanamid. Siehe Safer, S.R. et al., J. Org. Chem., 13 (1948) 924. Dieses Verfahren ist in unserem Labor das Verfahren der Wahl zur Herstellung 1,3-disubstituierter Guanidine, bei denen die Substituenten nicht gleich sind. Zu einer kürzlich bekannt gewordenen Synthese unsymmetrischer Guanidine siehe G.J. Durant et al., J. Med. Chem., 28 (1985) 1414 und C. A. Maryanoff et al., J. Org. Chem., 51 (1986) 1882.
Die in vitro Charakterisierung der Sigmarezeptoren war schwierig, wegen des Fehlens selektiver Arzneistoffliganden. Die meisten Benzomorphan-Opiate reagieren kreuzweise mit anderen (u, delta, kappa) Opioid-Rezeptoren und sind daher bei der Charakterisierung und Isolierung der Rezeptoren nur von begrenztem Wert. Pasternak et al.; J. Pharmacol. Exp. Ther. 219 (1981) 192-198; Zukin, R.S. & Zukin, S.R., Mol. Pharm. 20 (1981) 246-254; und Tam, S.W., Eur. J. Pharmacol. 109 (1985) 33-41. [³H]DTG bindet spezifisch und mit hoher Affinität an einzelne Klassen von Bindungsstellen in Meerschweinchen-Hirnmembranen. Die Bindungscharakteristika und das Arzneistoffspezifitätsprofil dieser Stellen stimmen mit denen überein, die für den Sigmarezeptor vorgeschlagen wurden, einschließlich 1) Naloxon-Unempfindlichkeit und Stereoselektivität für rechtsdrehende Isomere von Benzomorphan-Opiaten, wie (+)- SKF-10,047, (+)-Cyclazocin und (+)-Pentazocin; 2) hoher Affinität für Haloperidol und bestimmte antipsychotisch wirkende Phenothiazin-Arzneistoffe; 3) Stereoselektivität für (-)-Butaclamol; und 4) Unempfindlichkeit gegenüber Dopamin und Apomorphin. [³H]DTG ist eine, der lediglich zwei bekannten Verbindungen, die selektiv an Sigmastellen angreifen. Von der anderen Verbindung, (+)-[³H]3-PPP, die ursprünglich als Dopamin Autorezeptor-Agonist vorgeschlagen wurde, wurde kürzlich gezeigt, daß sie bei Rattenhirn- Bindungsassays Selektivität für Sigmastellen aufweist, Largent et al., (1984), siehe vorstehend. Diese Erkenntnisse werden durch unsere Experimente bei Meerschweinchen bestätigt und zeigen, daß [³H]DTG und (+)- [³H]3-PPP tatsächlich identische Rezeptor- Bindungscharakteristika und Arzneistoff- Selektivitätsprofile haben. Frühere Untersuchungen zeigten, daß Sigmastellen auch mit (±)-[³H]-SKF 10,047, (+)- [³H]Ethylketazocin und mit (+)-[³H]-SKF-10,047 markiert werden können. Diese Liganden sind jedoch nicht selektiv für Sigmastellen und erfordern die Gegenwart von geeigneten Drogen in den Bindungsassays um die kreuzweise reagierenden Nicht-sigma-bindungsstellen zu maskieren.
[³H]DTG hat eine Anzahl von Vorteilen als Sigmaligand. Es ist hochselektiv für Sigmastellen (anders als [³H]-SKF 10,047 und (+)-[³H]Ethylketazocin), besitzt einen hohen Grad an spezifischer Bindung (90-97% der Gesamtbindung) und besitzt eine relativ einfache chemische Struktur, die nicht chiral ist (anders als (+)-[³H]-3-PPP und die Benzomorphan-Opiate). Diese Eigenschaften machen es zu einer guten Ausgangsverbindung für die Synthese von Analogverbindungen für Struktur-Aktivitätsuntersuchungen und für die Gestaltung irreversibler Sigmarezeptor- Liganden, zum Beispiel Verbindungen der Formel (II), in der mindestens ein Rest von R und R' ein azido-substituierter carbocyclischer Arylrest ist.
Die mit [³H]DTG markierte Sigmastelle betrifft anscheinend nicht die konventionellen (u, delta, kappa) Opioid-Rezeptoren, da sie für Naloxon unempfindlich ist und Stereoselektivität für rechtsdrehende Isomere von Benzomorphan-Arzneistoffen zeigt. Dies ist eine umgekehrte Stereoselektivität verglichen mit Naloxon-empfindlichen Opioid-Rezeptoren, die Selektivität für linksdrehende Isomere von Opiaten aufweisen. Sigmarezeptoren sollten daher nicht als Sigma-"Opioid"-Rezeptoren bezeichnet werden. Die Arzneistoffselektivität der Sigmastellen für rechtsdrehende Isomere psychotomimetischer Opiatarzneistoffe korreliert jedoch gut mit dem pharmakologischen Profil von rechtsdrehenden gegenüber linksdrehenden Opiaten in Tierversuchen, die konzipiert wurden, um zwischen üblicher Opioid-Rezeptor-Aktivität und Sigma-(verhaltensmäßiger)-Aktivität von Benzomorphan-Drogen zu unterscheiden. Cowan, A., Life Sci. 28 (1981) 1559-1570; Brady, K.T. et al., Science 215 (1982) 178-180; und Khazan, N. et al., Neuropharmacol. 23 (1984) 983-987.
Autoradiographische Untersuchungen, die [³H]DTG verwenden, machen die Sigmastellen in auf Objektträgern aufgebrachten Hirnsektionen von Nagern sichtbar und bestätigen, daß Sigmastellen sich von u-, delta- und kappa- Opioid-Rezeptoren unterscheiden, da die Verteilung der [³H]DTG-Bindung von der Verteilung der u- delta- und kappa-Opioid-Rezeptoren deutlich verschieden ist. Die anatomische Verteilung der [³H]DTG-Bindungsstellen ist jedoch sehr ähnlich, wenn nicht identisch, mit der Verteilung der (+)-[³H]3-PPP Bindungsstellen, was weiter bestätigt, daß die zwei Radioliganden identische Bindungsstellen markieren. Die hohe Affinität der [³H]DTG- Bindungsstellen für Haloperidol und für bestimmte Phenothiazin-Antipsychotika (Tabelle I), die auch Dopamin- D&sub2;-Rezeptor-Antagonisten sind, wirft die Frage nach der Beziehung zwischen Sigmarezeptoren und Dopamin-D&sub2;- Rezeptoren auf. Die präsentierten Ergebnisse zeigen, daß die [³H]DTG-Stelle klar von den Dopamin-D&sub2;-Rezeptoren verschieden ist, weil die autoradiographische Verteilung des Dopaminrezeptors anders ist und weil Dopamin und Apomorphin nicht mit [³H]DTG-Bindungsstellen in Wechselwirkung stehen.
Weiterhin weist die Sigmastelle, die mit [³H] markiert ist, Stereoselektivität für (-)-Butaclamol auf, was einer umgekehrten Stereoselektivität verglichen mit Dopamin-D&sub2;-Rezeptoren, die für (+)-Butaclamol stereoselektiv sind, entspricht.
Die Haloperidol-empfindliche Sigmastelle, die mit [³H]DTG markiert ist, erwies sich als mäßig affin für das stark halluzinogen wirkende PCP in Konkurrenzversuchen. Dies stimmt mit den Erkenntnissen anderer überein, die (+)- [³H]-SKF-10,047, [³H]-(+)-SKF-10,047, oder (+)-[³H]3-PPP verwendeten um Sigmastellen zu markieren. In PCP Rezeptor- Bindungsassays markierte [³H]-PCP jedoch vorwiegend (aber nicht ausschließlich) eine Haloperidol-unempfindliche Bindungsstelle, von Zukin und Kollegen PCP/Sigma- Opiatrezeptor genannt, Zukin et al., (1981, 1986), siehe vorstehend, die von der Haloperidol-empfindlichen Sigmastelle, die mit [³H]DTG oder (+)-[³H]3-PPP markiert ist, getrennt vorliegt. [³H]DTG scheint dagegen ausschließlich Haloperidol-empfindliche Sigmastellen zu markieren, da alle spezifischen Bindungen durch Haloperidol ersetzbar sind und die anatomische Verteilung von [³H]DTG Bindungen von der Verteilung der PCP-Rezeptoren verschieden ist. Weiterhin ist unmarkiertes DTG in einem [³H]-PCP Bindungsassay faktisch inaktiv (S. William Tam, E.I. DuPont De Nemours & Co., Wilmington, Delaware, persönliche Mitteilung). Es gibt einige Kontroversen, welche der zwei Bindungsstellen für die Verursachung von Verhaltenseffekten bei PCP und psychotomimetischen Benzomorphan-Opiaten verantwortlich ist und daher dem Sigmarezeptor, der von Martin et al., (1976), siehe vorstehend, postuliert wurde, entspricht. Zukin und seine Mitarbeiter sagten, daß die Verhaltenseffekte von PCP und von psychotomimetischen Benzomorphan-Opiaten durch die Haloperidol-empfindliche PCP-Stelle vermittelt werden, an die Benzomorphan-Opiate mit mäßiger Affinität binden. Largent et al., (1986), siehe vorstehend, hält es für wahrscheinlich, daß die Verhaltenseffekte von PCP und psychotomimetischen Opiaten durch die Haloperidol-empfindliche Sigmastelle vermittelt werden. Da [³H]DTG ausschließlich die Haloperidolempfindliche Sigmastelle markiert und nicht signifikant mit der Haloperidol-unempfindlichen PCP-Stelle in Wechselwirkung steht, sollten Verhaltensuntersuchungen, die DTG oder andere symmetrisch substituierte Guanidine der Erfindung als prototypische Sigmaliganden verwenden, dieses Problem lösen.
Der möglicherweise wichtigste Gesichtspunkt der Erkenntnisse bezüglich Arzneistoff-Spezifität von Sigmastellen, der sich aus diesen und anderen Untersuchungen ergab, besteht in der Wechselwirkung dieser Stellen mit bestimmten, äußerst stark halluzinogen wirkenden Arzneistoffen (Haloperidol, Phenothiazine), die klinisch zur Behandlung von Schizophrenie verwendet werden. Dieses intersssante Arzneistoff-Selektivitäts-Profil erleichtert Untersuchungen, die auf die Erforschung der Rolle von Sigmarezeptoren bei antipsychotischer Arzneistoffwirkung und abnormaler Hirnfunktion abzielen. Die Verfügbarkeit von DTG und ähnlichen N,N'- disubstituierten Guanidinen, als selektive Sigmaliganden, sollte dazu dienen, solche Untersuchungen zu erleichtern.
Wie Guanidine allgemein und speziell N,N'-Diphenylguanidin sind die disubstituierten Guanidine der Erfindung, einschließlich die der Formel II, Beschleuniger bei der Vulkanisierung von Kautschuk, zum Beispiel Naturkautschuk und Epoxygruppen-enthaltender Acrylkautschuk, und können zu solchen Zwecken in der gleichen Weise wie N,N'-Diphenylguanidin verwendet werden. [³H]-DTG kann daher in einem vulkanisierten Gummigegenstand enthalten sein, zum Beispiel einem Reifenprofil, und die Verlustrate des Gummis durch Wasser kann durch die Verlustrate der Radioaktivität verfolgt werden.
Die Verbindungen der Erfindung haben hochselektive Affinität für den Sigmarezeptor. Demzufolge können sie einen Teil der Wirkungen der Benzomorphane besitzen, das heißt jener Wirkung, die durch Bindung an den Haloperidolempfindlichen Sigmarezeptor entstehen, aber nicht die, die durch Bindung von Benzomorphanen an andere Nicht-Sigmarezeptoren entstehen. Benzomorphane können zum Beispiel an Sigmarezeptoren wirken, um Mydriasis und Tachicardie und deren psychotomimetische Wirkungen zu verursachen. DTG ist daher ein wirksames Werkzeug, um die psychologischen Wirkungen zu zeigen, die durch den Sigmarezeptor vermittelt werden und die bis heute durch Wechselwirkung von Benzomorphanen mit Nicht-Sigmarezeptoren unklar geblieben waren. Weiterhin sind zumindest einige der Verbindungen aus Formel II, zum Beispiel N,N'-Diphenyl- und N,N'-Di-o-tolylguanidin, Antagonisten für Sigmarezeptoren in den Nervenenden der Maussamenleiter, wo Sigmarezeptoren die Freisetzung von Noradrenalin stimulieren (ein Phänomen, das von uns erkannt wurde und das ein neues Prüfverfahren für ZNS-Stimulantien und Hemmern liefert), und sind daher blutdrucksenkende (antihypertonische) Mittel. Andere Verbindungen der Formel II sind Agonisten und steigern daher den Blutdruck. Jene, die als Antagonisten für die Sigmarezeptor-Bindungsaktivität, zum Beispiel für die Sigmastellen des Maussamenleiters, von halluzinogen wirkenden Benzomorphanen, zum Beispiel (+)3-PPP und TCP, wirken, sind nützlich bei der Linderung von Symptomen einer psychotisch-mentalen Krankheit, zum Beispiel Schizophrenie, die mit Halluzinationen verbunden ist.
Bei der Ausführung der erfindungsgemäßen Behandlung, zum Beispiel der Behandlung eines Menschen, der unter einer mit Halluzinationen verbundenen psychotischmentalen Krankheit leidet, wird daher ein wasserlösliches N,N'-disubstituiertes Guanidin, das ein Antagonist für die Sigmarezeptor-Bindungsaktivität eines halluzinogen wirkenden Benzomorphans ist, in einer Menge verabreicht, die wirksam die Halluzinationen lindert. Das Guanidin ist vorzugsweise eine Verbindung der Formel II, in der R und R' jeweils gleich sind und jeweils einen Alkylrest mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen, einen Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen oder einen carbocyclischen Arylrest mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen darstellen. Unter einem bevorzugten Aspekt leidet der zu behandelnde Mensch unter Schizophrenie; unter einem anderen bevorzugten Aspekt ist die Verbindung N,N'-Di-(2-methylphenyl)guanidin, N-(Adamantyl)-N'-(cyclohexyl)-guanidin, N- (Adamantyl)-N'-(2-methylphenyl)-guanidin, N-Cyclohexyl-N'- (2-methylphenyl)-guanidin, N,N'-Di-(2-cyclohexyl)-guanidin oder N,N'-Di-(2-adamantyl)-guanidin.
N,N'-disubstituierte Guanidine, zum Beispiel der Formel I, können in agonistischer, antagonistischer oder invers agonistischer Weise bezüglich der prototypischen Sigma-Benzomorphane wirken. Von denen, die als Antagonisten wirken, kann man daher erwarten, daß sie Pupillengröße, Herzfrequenz und Geistestätigkeit in umgekehrter Richtung beeinflussen, wie sie von Benzomorphanen bewirkt werden, was in Standarduntersuchungen mit Labortieren bestimmt werden kann. Der Typ und das Ausmaß der Aktivität einer gegebenen Dosis jeder Verbindung kann in üblicher Weise durch Routineversuche bestimmt werden, die gut bekannte pharmakologische Vorschriften für jede der Aktivitäten verwenden; die entsprechenden Anzeichen, die mit der Dosis behandelbar sind, sind, basierend auf den pharmakologischen Ergebnissen, dem Fachmann bekannt. Die Verbindungen der Erfindung sind besonders bemerkenswert wegen ihrer antipsychotischen Aktivität bei der Behandlung psychotischer Zustände, zum Beispiel Schizophrenie, in Analogie zu den bekannten Mitteln Prolixin und Thorazin und bei der Diagnose Sigmarezeptor-vergifteter Bedingungen.
Das [³H]DTG der Erfindung ist nützlich als Testwerkzeug für Verbindungen, wie den disubstituierten Guanidinen der Erfindung, die selektive Liganden für die Sigmarezeptor-Bindungsstelle sind. Als solche sind sie zum Test von Verbindungen, die bei der Diagnose und Behandlung von Sigmarezeptor-vermittelten, halluzinogenen, mentalen Fehlordnungen nützlich sind, verwendbar. Eine solche Verbindung, die ein Agonist für einen vermeintlich natürlichen Liganden ist, wird zum Beispiel vorübergehend eine derartige mentale Fehlordnung verschlimmern, die das Ergebnis eines Überangebots des endogenen Liganden ist und wird eine mentale Fehlordnung lindern, die das Ergebnis einer abnormalen Insuffizienz des natürlichen Liganden ist. Das Gegenteil geschieht, wenn das disubstituierte Guanidin ein Antagonist für den vermeintlichen, endogenen Liganden ist. In jedem Fall bestätigt die temporäre Änderung der mentalen Fehlordnung durch den verabreichten Liganden, daß es sich um eine Krankheit handelt, die mit dem Sigmarezeptor in Zusammenhang steht, wodurch andere mögliche Gründe davon, zum Beispiel chemische Toxizität ausgeschlossen werden und die Behandlung der Erkrankung erleichtert wird.
[³H]DTG bindet auch an mit hoher Affinität an menschliche Hirnmembran-Rezeptoren, wie wir in unserem Labor bestimmt haben. Eine weitere Anwendung von [:H]DTG ist daher die Erforschung der Neurochemie mentaler Krankheit, durch Messung der Fluktuationen in der Rezeptordichte oder -Funktion in post-mortem Gewebe von Patienten, die Psycho- oder Neuropathologie zeigen, gegenüber Gewebe von normalen Menschen (nicht betroffene Kontrolle). Dieser Punkt kann durch Rezeptor-Bindungsassays und durch Autoradiographie untersucht werden.
Die Verbindungen der Erfindung können oral oder durch Injektion verabreicht werden, zum Beispiel intramuskulär, intraperitoneal oder intravenös. Die optimale Dosis kann in üblicher Weise bestimmt werden. Weil die meisten, wenn nicht alle der disubstituierten Guanidine, die in der Erfindung verwendet werden, selbst nicht wasserlöslich sind, werden sie gewöhnlich in ihrer protonierten Form verabreicht, zum Beispiel als pharmazeutisch verträgliches Salz einer organischen oder anorganischen Säure, zum Beispiel Hydrochlorid, Sulfat, Hemi-Sulfat, Phosphat, Nitrat, Acetat, Oxalat, Citrat, etc.
Die Verbindungen der Elfindung können im Gemisch mit üblichen Bindemitteln verwendet werden, das heißt mit pharmazeutisch verträglichen, organischen oder anorganischen Trägerstoffen, geeignet zur parenteralen, enteralen oder örtlichen Anwendung, die in nicht schädigender Weise mit der aktiven Verbindung reagieren. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Wasser, Salzlösungen, Alkohole, pflanzliche Öle, Polyethylenglycole, Gelatine, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, viskoses Paraffin, Duftöl, Fettsäure-monoglyceride und -diglyceride, Pentaerythrit-Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, etc. Die Arzneimittel können sterilisiert und bei Bedarf mit Hilfsmitteln gemischt werden, zum Beispiel Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffern, Farbstoffen, Geschmacksstoffen und/oder aromatisierenden Stoffen und dergleichen, die nicht in schädlicher Weise mit der aktiven Verbindung reagieren.
Zur parenteralen Anwendung sind besonders Lösungen geeignet, bevorzugt ölige oder wässerige Lösungen, genauso wie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, einschließlich Zäpfchen. Die übliche Einheitsdosisform sind Ampullen.
Zur enteralen Anwendung sind besonders Tabletten, Dragees oder Kapseln mit Talk und/oder Kohlenhydrat Träger oder Bindemittel oder dergleichen geeignet, wobei der Träger vorzugsweise Lactose und/oder Getreidestärke und/oder Kartoffelstärke ist. Ein Sirup, Elixier oder dergleichen kann verwendet werden, worin ein süßender Träger verwendet wird. Retardmittel können formuliert werden, einschließlich jenen, bei denen der Wirkstoff mit unterschiedlich abbaubaren Beschichtungen geschützt wird, zum Beispiel durch Mikroverkapselung, Mehrfachbeschichtung, etc.
Die Verbindungen der Erfindung werden im allgemeinen in Einheitsdosisform verabreicht, die etwa 0.1 bis 10³ mM des N,N'-disubstituierten Guanidins pro Einheitsdosis enthält.
Parenterale Verabreichung, zum Beispiel i.p. oder i.m., wird bevorzugt, die Verbindungen der Erfindung sind besonders wertvoll bei der Behandlung von Menschen, die von einer psychotischen Krankheit betroffen sind, zum Beispiel Schizophrenie. Dementsprechend können sie im wesentlichen in der gleichen Weise verwendet werden wie die üblichen bekannten Tranquilizer.
Man schätzt, daß die zur Zeit bevorzugten Mengen der verwendeten Wirkstoffe, entsprechend der spezifischen angewendeten Verbindung, der besonderen, formulierten Verbindung, dem Anwendungsweg und dem besonderen Anwendungsort variieren werden. Die optimale Verabreichungsfolge für einen gegebenen Verabreichungsplan kann leicht durch den Fachmann ermittelt werden, indem er übliche Dosisbestimmungs-Testverfahren, entsprechend den vorstehenden Richtlinien, ausführt.
Die Erfindung betrifft somit ein Arzneimittel in Einheitsdosisform und für die systemische Anwendung beim Menschen angepaßt, umfassend pro Einheitsdosis eine Menge wasserlöslichen N,N'-disubstituierten Guanidins, die in vitro an isolierte Säuger-Hirnmembran gebundenes N,N'-Di- (4-[³H]-2-methylphenyl)-guanidin verdrängt unter Änderung der Sigma-Hirnrezeptor modulierten Aktivität eines Menschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Arzneimittel für die orale Anwendung angepaßt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Arzneimittel für die parenterale Injektion angepaßt. Das Arzneimittel enthält vorzugsweise etwa 0.1 mg bis etwa 1 g des disubstituierten Guanidins pro Einheitsdosis.
Die Sigmarezeptor-Bindungsaktivität von N,N'-Di-otolyl-guanidin (DTG) wurde während Untersuchungen zur Reinigung und Charakterisierung eines endogenen Sigmarezeptor-Liganden gefunden. In der Anfangsphase dieser Arbeit wurden zahlreiche Extraktionslösungsmittel auf ihre Eignung geprüft, endogene Sigmarezeptor-Liganden aus Kuh- Hirn zu isolieren. Bestimmte Extraktionslösungsmittel (besonders Aceton) enthielten ein unbekanntes Material, das gut (+)-[³H]SKF 10,047 in Meerschweinchen-Hirnmembran Bindungsstellen ersetzte. Eine Rezeptorbindungs- Charakterisierung des Materials offenbarte, daß die Bindungsaktivität kompetitiv, reversibel und ziemlich stark war. Wegen der starken Sigmarezeptor-Bindungseigenschaften von drei in diesen Lösungsmitteln gefundenen Verbindungen, wurden diese Chemikalien bis zur Homogenität gereinigt, unter Verwendung verschiedener Umkehrphasen-HPLC Verfahren, und deren Struktur bestimmt. Ihre Struktur wurde durch eine Kombination verschiedener Verfahren bestimmt, einschließlich hochauflösender Massenspektroskopie, kernmagnetischer Resonanzspektroskopie und UV-Spektroskopie.
Einer dieser drei Sigmarezeptor-aktiven Stoffe, die aus den Extraktionslösungsmitteln gereinigt wurden, erwies sich als 1,3-Di-o-tolyl-guanidin (DTG).
Nach dessen Strukturbestimmung wurde synthetisches DTG in (+)-[³H]SKF 10,047 Bindungsassays geprüft und man fand, daß es (+)-[³H]SKF 10,047 in dessen Hirnmembran-Bindungsstellen mit einem Kd von 70 nM ersetzen kann. Der Austausch war kompetitiv und voll reversibel.
Die anderen zwei Verbindungen, die isoliert und charakterisiert wurden, waren Diphenylguanidin (DPG) und Dibutylguanidin (DBG), die beide in (+)-[³H]SKF 10,047 Bindungsassays aktiv waren.
Wegen der hohen Potenz von DTG und verwandten disubstituierten Guanidinen (+)-[³H]SKF 10,047 an dessen Bindungsstellen zu ersetzen, beschloß man ein tritiummarkiertes Derivat von DTG zu synthetisieren. Dazu reduzierte man N,N'-Di-(2-methyl-4-brom-phenyl)-guanidin mit Tritiumgas, das die zwei Bromatome durch Tritiumatome ersetzte, wobei man N,N'-Di-(p-[³H]-o-tolyl-guanidin, wie nachstehend beschrieben, erhielt.
Ohne weitere Ausarbeitung glaubt man, daß ein Fachmann, unter Verwendung vorstehender Beschreibung, die vorliegende Erfindung in ihrem ganzen Umfang anwenden kann. Die nachstehenden, bevorzugten, spezifischen Ausführungsformen sind daher als rein veranschaulichend zu betrachten und nicht begrenzend für den Rest der Offenbarung, in welcher Weise auch immer.
Im vorstehenden Text und den nachstehenden Beispielen sind alle Temperaturen unkorrigiert in Grad Celsius und alle Teile und Prozentangaben bezüglich des Gewichts angegeben, sofern nicht anders angezeigt.

Herstellungen

Allgemeine Verfahren. Schmelzpunkte sind unkorrigiert. NMR Spektren wurden auf einem General Elektric QE- 300 Spektrometer, das bei 300 MHz arbeitet, aufgenommen. Chemische Verschiebungen (5) sind in ppm angegeben, indem man das verbleibende Protonensignal des deuterierten Lösungsmittels (CHD&sub2;OD δ 3.300, CHCl&sub3;: δ 7.260, HDO δ 4.80) oder das ¹³C-Signal des Lösungsmittels (CD&sub3;OD δ 49.00, CDCl&sub3; δ 77.00) als Referenz verwendete. Alle Lösungsmittel waren "zur Synthese"-Qualität. Wo trockene Lösungsmittel gebraucht wurden, wurden diese vor Verwendung über CaH&sub2; oder Na destilliert.
Adamant-1-yl-cyanamid wurde mit Bromcyan in Et&sub2;O aus dem Amin hergestellt, wie früher von Geluk, N.W., et al., J. Med. Chem., 12 (1969) 712-716, beschrieben. (2- Methylphenyl)cyanamid wurde ähnlich hergestellt.
N,N'-Di-(adamant-1-yl)guanidinhydrochlorid wurde gemäß dem Verfahren von Geluk et al. hergestellt.

1. N'N'-Di-(4-brom-2-methylphenyl)-guanidin (4-Br-DTG)

Zu einer gerührten Lösung von Bromcyan (846 mg, 8.06 mmol) in destilliertem Wasser (70 ml) wurden in kleinen Portionen 2.997 g (16.11 mmol) 4-Brom-2- methylanilin (Aldrich, aus Ether-Pentan umkristallisiert) gegeben. Während der Zugabe bildete sich ein weißer Niederschlag. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei 80ºC gerührt. Nach 12-stündigem Kühlen bei 0ºC trennte sich ein klebriges, gelbes Öl ab und wurde verworfen. Die klare wäßrige Phase wurde auf 30 ml eingeengt. Der gebildete weiße Niederschlag wurde durch Erhitzen des Gemisches wieder gelöst. Dies wurde dann 12 Stunden bei 4ºC beiseite gestellt. Filtration ergab 430 mg weißen Feststoff. Eine 200 mg Portion wurde in 10 ml heißem Wasser gelöst und mit 5 ml 10%iger KOH-Lösung behandelt. Das Gemisch wurde mit CHCl: extrahiert und der Extrakt mit Kochsalzlösung gewaschen und dann getrocknet (MgSO&sub4;). Abdampfen des Lösungsmittels ergab 171 mg braunen Feststoff, der aus CHCl&sub3; umkristallisiert wurde, wobei man 120 mg (8%) 4-Br- DTG als kleine weiße Nadel erhielt: FP. 209-210º; NMR (300 MHz, CD&sub3;OD, TMS) delta 2.24 (s, 3), 7.12-7.25 (AB,2, J=8 Hz), 7.35 (s, 1); IR (KBr) 3460, 3340, 1630 cm&supmin;¹. Analyse berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub5;N&sub3;Br&sub2;: C, 45.37; H, 3.81; N, 10.58. Gefunden: C, 45.34; H, 3.56; N, 10.50.

2. [³H]-N'N'-Di-ortho-tolyl-guanidin ([³H]DTG)

25 mg (0.1 mmol) des so hergestellten 4-Br-DTG wurden der Amersham Corporation (Arlington Heights, Ill.) zur katalytischen Reduktion in Gegenwart von 20 Ci [³H]-Gas übergeben. 2 mCi Portionen des rohen, radioaktiven Produkts in jeweils 0.2 m 25%igem Ethanol wurden durch hochauflösende Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) an einer Vydac TP218 Octadeca-Kieselgel Säule gereinigt, indem man einen CH&sub3;CN-Gradienten (0-35% in 60 Minuten) in 0.1%iger Trifluoressigsäure zur Eluierung verwendete. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1 ml/min. Fraktionen von einer Minute Fluß wurden gesammelt. Gleiche Teile der Fraktionen wurden 100-fach verdünnt und 0.1 ul Teile der Originalfraktionen wurden mit 10 ml Scintillationsflüssigkeit verdünnt und in einem Scintillationsspektrometer ausgezählt. Die HPLC-Ausrüstung bestand aus 2 Waters HPLC-Pumpen, automatisiertem, elektronischen Gradientenkontrollgerät und einem Kratos UV- Spektrometer für variable Wellenlänge. Die Radioaktivität wurde als symmetrischer Hauptpeak ausgewaschen, der mit dem symmetrischen UV (220 nm) Absorptionspeak bei 41 Minuten zusammenfiel. Das ist die gleiche Elutionszeit, bei der authentisches, unmarkiertes DTG von der Säule in diesem RP- HPLC-System kommt. Die spezifische Aktivität von [³H]DTG wurde mit 52 Ci/mmol bestimmt, basierend auf der Menge DTG unter dem Haupt-UV-Absorptionspeak, wie er durch quantitative UV-Spektrophotometrie bestimmt wurde, und der Radioaktivitätsmenge, die mit diesem Peak zusammenhängt, die durch quantitative Flüssig-Scintillationsspektrometrie bestimmt wurde.

3. N-(2-Methyl-4-hisothiocyanatophenyl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin [Di-tolyl-Guanidin-Isothiocyanat (DIGIT)]

a. N-(2-Methyl-4-nitrophenyl)-N'-(2-methylphenyl)-guanidin Hydrochlorid und die entsprechende freie Base

Ein kräftig gerührtes Gemisch aus 2-Methylphenylcyanamid [1.107 g, 0.380 mmol, hergestellt aus o-Toluidin nach dem Verfahren von Safter, et al. (1948)] und 2-Methyl- 4-nitroanilin-Hydrochlorid in Chlorbenzol (45 ml) wurde 3 Stunden auf 90ºC erhitzt und dann auf 25ºC abgekühlt. Der erhaltene blaß-gelbe Niederschlag wurde gesammelt, mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und getrocknet, wobei man 2.284 g (91%) des Hydrochlorids des gewünschten Produkts erhielt (gemäß NMR rein). Eine 681 mg Probe wurde zweimal aus absolutem Ethanol umkristallisiert, wobei man 600 mg (88%) des gewünschten Produkts als blaß-gelbe Mikrokristalle erhielt, die für die nächsten Reaktionen geeignet sind: FP. 196- 200º; NMR (CD&sub3;OD, 300 MHz) 2.37 (s, 3), 2.47 (S, 3), 7.33- 7.40 (m, 4), 7.59 (d, 1), 8.18 (dd, 1), 8.27 (d, 1). Eine 473 mg Probe des Hydrochlorids wurde in 50 ml heißem Wasser gelöst, filtriert, auf 25ºC gekühlt und mit 5 ml 5 N NaOH behandelt. Der erhaltene hellgelbe Niederschlag der Titelverbindung (freie Base) wurde getrocknet (403 mg, 92%) und dann zweimal aus 95%igem Ethanol umkristallisiert, wobei man die analytische Probe als gelbe Plättchen erhielt: FP. 177-179º; NMR (CD&sub3;OD, 300 MHz) 2.31 (s, 6), 7.01-7.35 (m, 5), 7.98 (dd,1), 8.06 (d, 1). Analyse berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub6;N&sub4;O&sub2;: C, 63.37; H, 5.67; N, 19.71. Gefunden: C, 63.41; H, 5.42; N, 19.90.

b. N-(2-Methyl-4-aminophenyl)-N'-(2-methylphenyl)-guanidin- Hydrochlorid

Ein Parr-Hydrierungskolben wurde mit einer Lösung von N-(2-Methyl-4-nitrophenyl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin-Hydrochlorid (478 mg) in 30 ml absolutem Ethanol beschickt. 30% Pd auf Kohle (71 mg) wurden zugegeben und das Gemisch dann bei 60 psi und 25ºC 12 Stunden hydriert. Alle weiteren Operationen wurden unter Argonatmosphäre durchgeführt. Das Gemisch wurde zentrifugiert, durch Celit filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck auf 2 ml eingeengt. Ether (21 ml) wurde zugegeben und nach 4 Stunden bei 20ºC wurde der weiße Niederschlag gesammelt und getrocknet, wobei man 406 mg (78%) der Titelverbindung (Aminhydrochlorid) erhielt, die für die nächsten Reaktionen geeignet ist: FP. 232.5-234.5º; NMR (CD&sub3;OD,300 MHz) delta 2.22 (s, 3), 2.34 (s, 3), 6.60 (dd, 1), 6.66 (d, 1), 6.98 (d, 1), 7.26-7.38 (m, 4).

c. N-(2-Methyl-4-isothiocyanatophenyl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin Hydrochlorid (DIGIT)

NaOAc (1.767 g, 21.5 mmol) und HOAc (0.839 g, 14.0 mmol) wurden in trockenem Methanol so gelöst, daß das Endvolumen der Lösung 100 ml betrug. Ein 12.7 ml Teil dieser Lösung wurde zu 199 mg (0.686 mmol) N-(2-Methyl-4- aminophenyl)-N'-(2-methylphenyl)-guanidin Hydrochlorid unter Argonatmosphäre gegeben. Dann wurde Thiophosgen (54.7 ul, 86.7 mg, 0.754 mmol, frisch destilliert) in das gerührte Reaktionsgemisch gespritzt. Die Reaktion war nach dem Mischen, nach Kieselgel-DC (500 : 100 : 1, CHCl&sub3;-MeOH-HOAc) zu urteilen, vollständig. Wasser (20 ml) wurde zugegeben und das Gemisch unter vermindertem Druck auf 19 ml eingeengt.
Die folgenden Schritte wurden in schneller Folge durchgeführt, um mögliche Reaktionen der Isothiocyanatgruppe mit der freien Guanidin-Basengruppe eines anderen Moleküls zu minimieren. Das vorstehende 19 ml Konzentrat wurde auf 0ºC abgekühlt und mit eiskalter, gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (15 ml) behandelt. Das erhaltene Gemisch, das einen weißen Niederschlag enthielt, wurde mit CHCl: extrahiert (4*15 ml). Die vereinigten Extrakte wurden mit eiskalter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), durch Celit filtriert und auf 0ºC abgekühlt.
Anschließend wurde ein Überschuß HCl-Gas durch die farblose Lösung geleitet und dann die Lösung im Vakuum auf 25 ml eingeengt und Hexan (20 ml) zugegeben. Weitere viermal wurde das Gemisch aufkonzentriert und weiteres Hexan zugegeben. Eindampfen des endgültigen Gemisches bis zur Trockene ergab rohes Hydrochlorid 5 als einen gummiartigen Feststoff (263 mg, 115%). Dieser wurde in absolutem Ethanol (2 ml) aufgenommen und mit Ether (80 ml) verdünnt, wobei eine trübe, weiße Suspension erhalten wurde, aus der sich beim Stehen kleine Cluster weißer Nadeln bildeten. Diese Kristalle wurden zentrifugiert, mit Ether gewaschen (3* 5 ml) und getrocknet, wobei man 173 mg (76%) der Titelverbindung erhielt: FP. 195-197º (vorgeheiztes Bad); NMR (CD&sub3;OD, 300 MHz) delta 2.347 (s, 3), 2.351 (s, 3), 7.23 (d, 1), 7.31 (s, 1), 7.34 (d,1), 7.26-7.40 (m, 4); IR (KBr) 3466, 3138, 2927, 2152, 2119, 1646, 1631 cm&supmin;¹. Analyse berechnet für C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub7;ClN&sub4;S: C, 57.74; H, 5.15; N, 16.83. Gefunden: C, 57.60; H, 5.20; N, 16.64.
Eine dreifach tritiierte Form von DIGIT wird hergestellt, indem man von N-(2-Methyl-4-aminophenyl)-N'-(2- methylphenyl)-guanidin ausgeht, das durch katalytische Tritiierung (Amersham) von N-(2-Methyl-4-nitro-6- bromphenyl)-N'-(2-methyl-4,6-dibromphenyl)-guanidin hergestellt wird.
Die dreifach tritiierte Aminoverbindung wurde auch als direkte Vorstufe zur Herstellung der dreifach tritiierte Form der 4-Azido-Verbindung verwendet, deren Herstellung nachstehend beschrieben wird und die bei der Solubilisierung der Sigmarezeptoren verwendet wurde.

N-Adamantan-1-yl-N'-cyclohexylguanidin-HCl

Adamantan-1-yl-cyanamid (514 mg, 2.92 mmol) und Cyclohexylamin-Hydrochlorid (398 mg, 2.93 mmol) wurden zusammen fein vermahlen und 10 Minuten auf 200ºC erhitzt. Der erhaltene glasige Feststoff wurde pulverisiert und zweimal mit 50 ml kochender 5%iger HCl extrahiert. Das unlösliche Material wurde abfiltriert und getrocknet.
346 mg, FP. 264-270º (p.h.b. 240º). Beim Abkühlen der vereinigten wässerigen Extrakte auf 25ºC bildete sich ein weißer Niederschlag, der abfiltriert wurde, 56 mg. Vereinigte Rohausbeute: 44%.
Umkristallisation einer 50 mg Probe des Rohprodukts aus EtOH/Et&sub2;O ergab weiße Nadel (25 mg, FP. 269-271ºC (p.h.b. 2400), Lit. 268-269ºC). ¹H-NMR (CD&sub3;OD) 1.208-1.474 (m, 5HO, 1.744 (s, 9H), 1.967 (s, 8H), 2.119 (s, 3H), 3.434 (m, 1HO); ¹³C-NMR (CD&sub3;OD) (Breitbandentkoppelt) 25.55, 26.26, 30.96, 33.74, 36.74, 42.73.

N-Cyclohexyl-N'-(2-methylphenyl)guanidin

Eine Suspension von Cyclohexylamin-Hydrochlorid (310 mg, 2.28 mmol) und (2-Methylphenyl)cyanamid (365 mg, 2.76 mmol) in trockenem Chlorbenzol wurde 4 Stunden auf 125-135º erhitzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum unter Erhitzen abgedampft und der Rückstand zwischen CH&sub2;Cl&sub2; und 20*8 ml 10%iger HCl verteilt. Die wässerigen Extrakte wurden bis pH 9-9.5 alkalisch gemacht und der weiße Niederschlag, nach Stehen über Nacht bei 4ºC, gesammelt. Zwei Umkristallisationen aus EtOH/H&sub2;O ergaben 140 mg (22%) weißer Nadeln, FP. 145-146ºC, ¹H-NMR (CD&sub3;OD) 1.149- 2.054 (m, 10H, 2.164 (s, 3H), 3.50 (m, 1H), 6.875 (d, 1H, J=7.5 Hz), 6.968 (t, 1H, J=7.5 Hz), 7.118 (t, 1H, J=7.5 Hz), 7.177 (d, 1H, J=7.5 Hz). Analyse berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub1;N&sub3;: C, 72.69; H, 9.15; N, 18.16. Gefunden: C, 72.72; H, 9.24; N, 18.18.

N-(Adamantan-1-yl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin

Eine Suspension von Adamantan-1-yl-cyanamid (151 mg, 0.857 mmol) und o-Toluidin-Hydrochlorid (186 mg, 0.857 mmol) in trockenem Chlorbenzol wurde 4.5 Stunden auf 100-130º erhitzt. Das Chlorbenzol wurde im Vakuum unter Erhitzen abgedampft und der Rückstand (285 mg) in 18 ml Wasser aufgenommen. Ein gummiartiges, unlösliches Material wurde verworfen. Beim Einstellen des wässerigen Extraktes auf pH 9-9.5 bildete sich ein Niederschlag (194 mg, 71%).
Zweifaches Umkristallisieren aus EtOH/H&sub2;O ergab die analytische Probe, FP. 160-161ºC, ¹H-NMR (CD&sub3;OD) 1.742 (s, 6 HO), 2.050 (d, 6H, J=2.4 Hz), 2.029 (s, 3 HO), 6.956 (j, 1H, J=-8.1 Hz), 7.056 (t, 1H, J=-8.1 Hz), 7.168 (t, 1H, J=7.5 Hz), 7.213 (d, 1H, J=7.5 Hz). Analyse berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub5;N&sub3;: C, 76.28; H, 8.89; N, 14.83. Gefunden: C, 76.25; H, 8.86; N, 14.60.

N-(Adamantan-1-yl)-N'-(2-iodphenvl)guanidin-HCl

Adamantan-1-yl-cyanamid (299 mg, 1.70 mmol) und o- Iodanilin Hydrochlorid (433 mg, 1.70 mmol) wurden zusammen fein vermahlen und 10 Minuten auf 200º erhitzt. Der erhaltene schwarze, glasige Feststoff wurde pulverisiert und fünfmal aus EtOH/Et&sub2;O umkristallisiert. Die erhaltenen schwach blauen Nadeln (80 mg) wurden in 4 ml EtOH gelöst und über eine kurze (< 1 cm) Säule geschickt, die von unten nach oben mit Celit, Aktivkohle, aktivem Aluminiumoxid und Sand bepackt war. Das farblose Eluat wurde dann mit 5 ml Et&sub2;O verdünnt und über Nacht in einer Et&sub2;O-Diffusionskammer aufbewahrt. Die weißen Nadeln wurden abgesaugt, 40 mg, FP. 274-275ºC. Zugabe weiterer 5 ml Et&sub2;O ergab eine zweite Fraktion (31 mg) identischen Materials. Gesamtausbeute: 21%. ¹H-NMR (CD&sub3;OD) 1.779 (s, 6H) 2.090 (s, 6H), 2.165 (s, 3H), 7.168 (t, 1H, J=8.1 Hz), 7.388 (d, 1H, J=9.1 Hz), 7.503 (t, 1H, J=7.8 Hz), 8.004 (d, 1H, J=7.8 Hz).

N-(2-Methyl-4-azido-phenyl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin

N-(2-Methylphenyl)-N'-(2-methyl-4-aminophenyl)guanidin-Dihydrochlorid (112 mg, 0.341 mmol) wurde in 2 ml H&sub2;O und 100 ul konz. HCl (1.2 mmol) gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und eine Lösung von NaNO&sub2; (42 mg, 0.61 mmol) in 450 ul H&sub2;O zugegeben. Das Reaktionsgemisch färbte sich gelb und wurde 45 Minuten gerührt, bevor festes NaN&sub3; (43 mg, 0.661 mmol) auf einmal zugegeben wurde. Nach Beendigung der N:-Entwicklung wurde ein schaumiger Feststoff (11 mg) entfernt und verworfen.
Festes NaOH (96 mg, 2.41 mmol) wurde zugegeben und der hellgelbe Niederschlag mit Et&sub2;O extrahiert (3*5 ml). Eindampfen der vereinigten Et&sub2;O-Schichten ergab einen gelben Feststoff, der aus EtOH/H&sub2;O umkristallisiert wurde. NMR (CD&sub3;OD) 2.279 (s, 3H) 2.284 (s, 3H), 6.864 (dd, 1H, J=2.4 Hz, 8.4 Hz), 6.914 (d, 1H, J=2.1 Hz), 7.055 (td, 1H, J=1.8 Hz, 7.2 Hz), 7.136-7.229 (m, 4H).

N-(2-Methyl-4-nitro-6-bromphenyl)-N'-(2-methyl-4,6- dibromphenyl)guanidin

N-(2-Methyl-4-nitrophenyl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin (281 mg, 0.987 mmol) wurde als freie Base in 4 ml MeOH gelöst und in einem Eisbad gekühlt. N- Bromsuccinimid (frisch aus H&sub2;O umkristallisiert) (531 mg, 2.98 mmol) wurde innerhalb 15 Minuten in zwei Portionen zugegeben. Nach 1.5 Stunden wurde das braune, schlammige Reaktionsgemisch mit 4 ml MeOH verdünnt und auf 25ºC erwärmt. Ein brauner Feststoff (266 mg) wurde abfiltriert und aus Aceton/H&sub2;O umkristallisiert, wobei man braune Nadeln erhielt (2.6 mg, 42%, FP. 193-195ºC). Sublimation von einer 56 mg Probe dieser Kristalle bei 0.01 Torr und 170ºC ergab die analytische Probe als hellgelben, amorphen Feststoff (38 mg, FP. 210-213ºC). NMR (CD&sub3;OD) 2.357 (s, 3H) 2.488 (s, 3H), 7.444 (d, 1H, J=1.5 Hz), 7.669 (d, 1H, J=1.8 Hz), 8.033 (d, 1H, J=2.1 Hz), 8.267 (d, 1H, J=2.4 Hz). Analyse berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub3;Br&sub3;N&sub4;O&sub2;: C, 34.58; H, 2.52; N, 10.75. Gefunden: C, 34.64; H, 2.47; N, 10.65.

Eigenschaften der [¹H]DTG Bindung an Meerschweinchen

Hirnmembran

Die Synthese von [¹H]DTG ergab ein reines, homogenes Produkt von hoher spezifischer Radioaktivität (52 Ci/mmol). [³H]DTG band spezifisch, sättigend, reversibel und mit hoher Affinität an Meerschweinchen Hirnmembran. In einem typischen Experiment mit 0.9 nM [³H]DTG (30 000 cpm, 50% Zählausbeute) betrug die Gesamtbindung 2 700 cpm, während die unspezifische Bindung in Gegenwart von 10 uM DTG oder 10 uM Haloperidol 50-150 cpm betrug. Routinemäßig beobachtete man eine spezifische Bindung bis 90-97% der Gesamtbindung. Bei Raumtemperatur erreichte die Bindung von [²H]DTG nach 60-90 Minuten das Gleichgewicht und war voll reversibel nach Zugabe von 10 uM unmarkiertem DTG. Die spezifische Bindung war linear bei einer Gewebekonzentration zwischen 2-40 mg Gewebe (ursprüngliches Naßgewicht des Hirns pro Bestimmungsröhrchen). Die Bindung der Radioaktivität an die Glasfaserfilter in Abwesenheit von Membranen betrug 10-20 cpm. 10 minütiges Kochen der Membranen bei 100ºC vor dem Test verhinderte fast vollständig (90%) spezifische [³H]DTG Bindung ebenso, wie Behandlung der Membranen mit Trypsin und Pronase (0.01 mg/ml über 30 Minuten bei Raumtemperatur), was anzeigt, daß Proteinkomponenten für die Fähigkeit des Rezeptors zur Bindung wichtig sind.
Um die Gleichgewichts-Sättigungs-Bindung von [³H]DTG an Meerschweinchen-Hirnmembranen zu bestimmen, wurden die wie hier beschrieben präparierten Membranen mit [³H]DTG bei verschiedenen Konzentrationen von 0.3 mM bis 90 mM in 1 ml 50 mM Tris/HCl Puffer, pH 7.4, 120 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die erhaltenen Werte waren das Mittel aus vierfacher Bestimmung.
Eine Scatchard Analyse der Sättigungsdaten zeigt einen linearen Scatchard-Plot mit einem scheinbaren KD von 28 mM und einer maximalen Zahl von Bindungsstellen (Bmax) von 84 pmol/g Hirngewebe (ursprüngliches Naßgewicht). Die Analyse von Bindungsdaten mit dem Kurven-Einpaßprogramm LIGAND, Munson, P.J. & Rodbard, D., Anal. Biochem., 107, 220-239, zeigte hohe Kompatibilität mit einem Einzel- Bindungsstellen-Modell,

Radioliganden Bindungsassays

Gefrorene Meerschweinchen-Hirne (Pel-Freeze, Rogers, AK) wurden in 10 Volumen (w/v) 0.32M Saccharose homogenisiert, indem man einen Polytron Homogenisator verwendete. Das Homogenisat wurde bei 900*g 10 Minuten bei 4ºC rotiert. Der Überstand wurde gesammelt und bei 22 000*g 20 Minuten bei 4ºC rotiert. Das Pellet wurde in 10 Volumen 50 mM Tris/HCl Puffer, pH 7.4, resuspendiert, 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und weitere 20 Minuten bei 4ºC und 22 000*g rotiert. Das Pellet wurde dann in 10 Volumen 50 mM Tris/HCl Puffer, pH 7.4, resuspendiert und 10 ml Teile dieser Membran-Suspension, bei -70ºC gefroren, aufbewahrt, bis sie in Bindungsassays verwendet wurden. Man beobachtete keine Wirkungen der längeren Lagerung der Membranen (> 3 Monate) bei -70ºC auf die Zahl der Sigmarezeptoren oder Affinität für [³H]DTG Bindung.
Für Radiorezeptor-Assays wurden gleiche Teile der gefrorenen Membran-Suspension aufgetaut und zehnfach mit 50 mM Tris/HCl Puffer, pH 7.4, verdünnt. In 12*75 mm Polystyrol- oder Glas-Röhrchen wurden 0.8 ml Membran- Suspension, 0.1 ml [³H]DTG oder (+)-[³H]3-PPP und 0.1 ml unmarkierte Arzneistoffe oder Puffer gegeben, um eine Endkonzentration von 0.9 mM zu erhalten. Die Proteinkonzentration in dem 1 ml Inkubations-Endvolumen betrug 800 ug, entsprechend 32 mg Hirngewebe (ursprüngliches Naßgewicht). Als unspezifische Bindung wurde der Rest in Gegenwart von entweder 10 ug DTG oder Haloperidol für sowohl die [³H]DTG als auch für die (+)- [³H]3-PPP-Bindung definiert. Nach 90 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Membransuspension schnell unter Vakuum durch Whatman GF/B Glasfaserfilter, unter Verwendung einer Brandel-Zellenerntevorrichtung mit 48 Vertiefungen (Brandel Gaitherburg MD), filtriert. Die Filter wurden mit 3*5 ml eisgekühltem Tris/HCl Puffer (pH 7.4 bei Raumtemperatur) gewaschen. Die Filter wurden in jeweils 10 ml Cytoscint (Westchem Products, San Diego, CA) gelöst und die Radioaktivität wurde durch Flüssigscintillationsspektrometrie gemessen, bei einer Zählausbeute von 35-50%. Sättigungsdaten wurden mit einer Scatchard Analyse ermittelt, indem man sowohl EBDA McPherson, G.A., Computer Programs Biomed., 17 (1983) 107- 114, als auch LIGAND Munson, P.J. & Rodbard, D., Anal.
Biochem., 107 (1980) 220-239, Daten-Analyseprogramme auf IBM Personal Computer-AT verwendete. IC&sub5;&sub0; Werte wurden durch Kurvenverschiebung auf halblogarithmisch gerastertem Papier gefolgt von Interpolation bestimmt.

Arzneistoff Spezifität der [³H]DTG Bindung

Austauschexperimente wurden mit Arzneistoffen durchgeführt, die als typische Sigmaliganden betrachtet werden, ebenso mit Arzneistoffen, die als prototypische Liganden für einen anderen Neurotransmitter, Neuromodulator und Arzneistoffrezeptoren betrachtet werden. Diese Experimente zeigten, daß die [³H]DTG Bindungsstellen Stereoselektivität für rechtsdrehende Benzomorphanopiate und für (-)-Bataclamol aufweisen; nicht signifikant mit Arzneistoffen in Wechselwirkung stehen, die eine hohe Affinität für Acetylcholin, Benzodiazepin, GABA aufweisen, noch mit u, delta oder kappa Opioidrezeptoren; und daß sie eine hohe Affinität für Haloperidol und verschiedenen Arzneistoffen haben, die zur Klasse der Phenothiazin- Antipsychotica gehören (Haloperidol hatte die höchste Verdrängungswirkung aller geprüften Arzneistoffe); und daß sie mäßige Affinität für verschiedene andere Klassen psychoaktiver Drogen haben, die verschiedene tricyclische Antidepressiva, PCP und kappa-Opioidrezeptor-Liganden U50, 488H umfassen. TABELLE I Arzneistoff gegen Haloperidol Perphenazin (+)-Pentazocin (-)-Pentazocin (±)-Pentazocin (+)-Cyclazocin (-)-Cyclazocin Spiperon (-)-Butaclamol (+)-Butaclamol Trifluoperazin Triflupromazin Chlorpromazin Amitriptylin Imipramin Desipramin Nortriptylin Guanabenz Clonidin Cocain * IC&sub5;&sub0;, ist die molare Konzentration des Arzneistoffes, die man braucht um halbmaximalen Austausch von [³H]DTG am Sigmarezeptor zu bewirken. Das ist eine direkte Messung der Sigmarezeptor-Bindungsfähigkeit des Arzneistoffes. NB = nicht bestimmt.
Die vorstehenden IC&sub5;&sub0; Werte sind das Mittel aus 2-4 Einzelexperimenten (dreifach). Die folgenden Verbindungen bewirkten keinen signifikanten Austausch bei einer Konzentration von 10 uM: Scopolamin, 5-OH-Tryptamin, Diazepam, Bicucullin, Picrotoxin, Hexamethonium, Dopamin, Apomorphin, GABA, gamma-Guanidin-buttersäure, Morphin, DAGO, Metorphamid, Dynorphin A, [Leu&sup5;]-Enkephalin, beta- Endorphin, Naloxon, Guanidino-essigsäure, Creatin, Creatinin, 1,1-Dimethyl-guanidin, Methylguanidin, beta-Guanidinopropionsäure und Cimetidin.

Arzneistoffspezifität der [³H]DTG Bindung verglichen mit der (+)-[³H]3-PPP Bindung

Bein Vergleich der Arzneistoffspezifität der [³H]DTG Bindung gegenüber jener von (+)-[³H]3-PPP beim Meerschweinchen fand man, daß (+)-[³H]3-PPP spezifisch, sättigend (linearer Scatchard Plot), reversibel und mit hoher Affinität an Meerschweinchen-Hirnmembranen band (Ki= 30nM, Bmax=80 pmol/g frischem Hirngewicht). Das Arzneistoffspezifitätsprofil der (+)-[³H]3-PPP Bindung beim Meerschweinchen (TABELLE I) erwies sich als sehr ähnlich dem, wie es von der Ratte berichtet wird. Largent et al., (1984), siehe vorstehend. Weiterhin war das Arzneistoffspezifitätsprofil typischer Sigmarezeptor-aktiver Arzneistoffe in (+)-[³H]3-PPP- und [³H]DTG-Bindungsassays stark korrelierend (r=0.95; p ≤ 0.00001), was mit den zwei Verbindungen, die die selbe Stelle markieren, übereinstimmt.

Autoradioaraphische Untersuchungen

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-250 g) und NIH-Meerschweinchen (300-350 g) wurden getötet, ihre Hirne schnell entfernt und nach dem Verfahren von Herkenham und Pert, Herkenham, M. & Pert, C.B., J. Neuroscience 2 (1982) 1129-1149, für die Autoradiographie bearbeitet.
15 um dicke, auf Objektträgern aufgebrachte Hirnsektionen wurden 45 Minuten in 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH 8.0, 22ºC), die 1 mg/ml Rinderserum-Albumin (BSA) und 2 nM [³H]DTG enthielt, inkubiert. Benachbarte Sektionen wurden mit 10 uM Haloperidol oder 10 uM DTG inkubiert, um die unspezifische Bindung zu messen. Die Inkubationen wurde durch 4*2 Minuten Waschen in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4, 4ºC) mit 1 mg/ml BSA beendet, schnell im kalten Luftstrom getrocknet und in Röntgenkassetten mit [³H]-empfindlichem Film ([³H]-Ultrofilm, LKB) angeordnet. Die Filme wurden nach 6-8 Wochen entwickelt (D-19, Kodak).

Autoradioaraphische Sichtbarmachung der [³H]DTG-Bindung

Rezeptor-autoradiographische Untersuchungen an Meerschweinchen- und Ratten-Hirnsektionen, unter Verwendung von [³H]DTG, zeigten eine niedrige spezifische Bindungsdichte, diffus im grauen Material des Ratten- und Meerschweinchen-Hirns verteilt. Dieses homogene Bindungsmuster war von einer heterogenen Verteilung angereicherter Bindung in limbischen und sensomotorischen Strukturen überlagert. Das Bindungsmuster war beim Meerschweinchen besser zu unterscheiden, als bei der Ratte. Ähnliche Beobachtungen wurden von der (+)-[³H]3-PPP-Autoradiographie berichtet. Largent et al., (1986), siehe vorstehend. Die Beschreibung der [³H]DTG-Bindung stammt daher primär vom Meerschweinchen. In Vorderhirn waren die limbischen Strukturen, die von [³H]DTG mäßig bis dicht markiert wurden, das diagonale Broca-Band, das Septum, der Hypothalamus (besonders der paraventriculäre Kern), der anterodorsal thalamische Kern und die Zona Incerta. Die sensomotorischen thalamischen Kerne, die mäßig bis dicht markiert wurden, umfassen das thalamische Geschmacksrelais und reticuläre Kerne. Andere thalamische Kerne, die markiert wurden, waren die paraventriculären und Kerne der Habenula. Im Plexus der Chorioidea war sehr dichte Bindung zu sehen. Im Cortex besetzte die dichte [³H]DTG-Markierung Schicht III/IV des retrosplenialen Piriforms und der entorhinalen Cortices. Der Rest des Cortex enthielt ein niedriges Niveau homogener Bindung. Die Hippocampus- Ausbildung zeigte diskrete Bindung in der pyramidalen, granulären Zellschicht. Sensomotorische Gebiete des Mittelhirns wurden selektiv durch [³H]DTG markiert. Der oculomotorische Kern, und mehr in caudaler Richtung, der trochleare Kern wurden sehr dicht markiert und der obere Colliculus und rote Kern zeigten mäßiges Bindungsniveau. Andere markierte Mittelhirnkerne waren die dorsale Raphe, der interpedunculare Kern, die zentrale graue Substanz und die Substantia Nigra und Pars Compacta. Die selektive Markierung der Pars Compacta beim Meerschweinchen steht im Gegensatz zur niedrigen bis mäßigen Markierungsdichte, die innerhalb der Substantia Nigra der Ratte vorlag. Weiterhin fand man sehr dichte Markierung im subcommissuralen Organ. Im Hinterhirn war der Locus Coeruleus der am dichtesten markierte Kern. An [³H]DTG Bindungsstellen angereicherte, sensomotorische Kerne waren der trigeminale Motorkern, der Kern der Gesichtsnerven, der Kern des Solitärtrakts, der dorsale Motorkern des Vagus und der Kern des Hypoglossus. Man fand auch mäßige bis dichte Bindung innerhalb der grauen Substanz des Cerebellum und im reticularen Varolsbrückenkern.

Arzneistoffspezifität der [³H]AZ-DTG Bindung

Der haloperidol-empfindliche Sigmarezeptor bindet [³H]-(+)-3-[3-Hydroxyphenyl]-N-(1-propyl)piperidin ([³H]- (+)-3-PPP) und [³H]-1,3-Di-o-tolylguanidin ([³H]DTG) mit hoher Affinität. Um dessen Struktur zu klären, wurde Photoaffinitätsmarkierung des Sigmarezeptors aus Meerschweinchen-Hirn, unter Verwendung eines neuen, radioaktiven, photolabilen Derivats von DTG, [³H]-m-Azido- 1,3-di-o-tolylguanidin ([³H]AZ-DTG) durchgeführt. Im Dunklen bindet [³H]AZ-DTG reversibel und mit hoher Affinität (K=28 nM) an Sigmastellen in Hirnmembranen. Das Drogenspezifitätsprofil der [³H]AZ-DTG-Bindung an Hirnmembranen ist mit dem, der prototypischen Sigmaliganden [³H]DTG und [³H]-(+)-3-PPP identisch. Zur Photoaffinitätsmarkierung wurden Membran-Suspensionen, die Protease-Inhibitoren enthielten, im Dunklen mit [³H]AZ-DTG vorinkubiert, dann filtriert und über Whatman GF/B Glasfaserfilter gewaschen. Die Filter wurden dann 15 Minuten mit langwelligem UV-Licht bestrahlt. Filtergebundene Proteine wurden mit 50 mM Tris pH 7.4, 0.1% Natriumdodecylsulfat gelöst. Die solubilisierten Proteine wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Fluorographie der SDS-PAGE Gele zeigte, daß [³H]AZ-DTG selektiv in ein 29 kD Polypeptid eingebaut wurde. Die Markierung dieses Polypeptids wurde vollständig durch die Sigmaliganden DTG, (+)-3-PPP, (+)-Pentazocin und Haloperidol, bei Konzentrationen von 10 uM, blockiert, während die Markierung durch Morphin, Serotonin, Dopamin, Scopolamin oder GABA, bei der gleichen Konzentration, unbeeinflußt blieb. Diese Ergebnisse zeigen in erster Abschätzung die Größe der Bindungsuntereinheit des Haloperidol-empfindlichen Sigmarezeptors.

Vergrößerung der elektrisch hervorgerufenen Norepinephrinausschüttung in Maussamenleitern

Männliche Swiss Webster Mäuse, von 25-30 g Gewicht, wurden durch Decapitation getötet, ihre Samenleiter herauspräpariert, gereinigt und in 5 ml Organbädern, bei einer Ruhespannung von 250 mg, angeordnet. Die Gewebe wurden in modifizierter Krebs-Lösung konditioniert [Zusammensetzung (mM): NaCl 118, KCl 4.75, CaCl&sub2; 2.54, NaHCO&sub3; 25.0, KH&sub2;PO&sub4; 0.93, D-Glucose 11.0 und Naloxon HCl 0.001], die bei 37ºC gehalten und mit 95% O&sub2; und 5% CO&sub2; durchperlt wurde. Die Gewebe wurden mit einem Grass S88 Stimulator mit 0.1 Hz (supramaximale Spannung, 1 msec Dauer) mittels Platinringelektroden, die 2 cm auseinander waren, stimuliert und die Kontraktionen wurden isometrisch mit Grass FT .03-Wandlern, die an einem Grass Polygraphen angeschlossen waren, aufgezeichnet. Die agonistische Wirkung von Arzneistoffen wurde durch Anwendung einer einzelnen Dosis und Messung der Ausschlagshöhe bestimmt, sobald sich die Reaktion auf den Arzneistoff stabilisiert hatte, gefolgt vom Auswaschen des Arzneistoffes durch Überfließen. Für Untersuchungen, bei denen die NE Konzentration bestimmt wurde, benutzte man vorstehenden Ablauf mit folgenden Änderungen: Sechs Gefäße wurden parallel in einem 5 ml Bad mit einer Restspannung von 1.0 g angeordnet und die Gewebe verblieben 20 Minuten in Gegenwart des agonistischen Arzneistoffes und nach Beendigung wurde die Badflüssigkeit gesammelt, schnell auf Trockeneis gefroren und nachfolgend einer hochauflösenden Flüssigkeitschromatographie, mit elektrochemischer Detektion zur Analyse des NE-Gehalts, unterworfen.
(+)-3-PPP, TCP verursachte bei Anwendung auf die MVD Badlösung eine Vergrößerung der elektrisch hervorgerufenen Ausschlags-Amplitude, die schnell einsetzt, nach 2-5 Minuten ein stabiles Plateau erreicht und sich, nach Wegspülen der Verbindung, schnell umkehrt. Die Reaktion auf (+)-3-PPP wächst in einer dosisabhängigen Weise auf ein stabiles, reproduzierbares Maximum von 251.0 + 3.1 uM SEM (n=15) an. Die Reaktion auf TCP wächst auf ein Maximum von 338.2 + 27.4 uM SEM (n=12) mit einem EC&sub5;&sub0; von 27.6 + 3.2 uM SEM (n=12) an. Messung des NE Gehalts in der Badlösung, gefolgt von 20 Minuten Inkubation in Gegenwart von (+)-3-PPP zeigt einen signifikanten Anstieg auf 200 uM. Der NE-Gehalt stieg auch nach Inkubation mit 200 uM TCP signifikant an.

Funktionelle Sigmarezeptoren auf Noradrenergen Nervenenden der Maussamenleiter

(+)-3-PPP und TCP wirken in Maussamenleitern (MVD) verstärkend auf die elektrisch hervorgerufene Ausschüttung von NE. Die Rezeptorspezifität dieser Liganden, wie sie für die zentralen Bindungsstellen gezeigt wurde, läßt vermuten, daß sie in MVD an gesonderten Rezeptoren wirken, um eine gemeinsame Endreaktion hervorzurufen. Ein Mechanismus, der von Bartschat und Blaustein, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 83 (1966) 189-192, für die PCP Wirkung, die mit diesen Erkenntnissen übereinstimmt, vorgeschlagen wurde, ist die Inhibierung der spannungsregulierten, nicht-inaktivierenden K&spplus; Kanäle, was Wirkungspotentialverlängerung und Vergrößerung der Neurotransmitter-Ausschüttung zur Folge hat. Der Wirkmechanismus der Sigmarezeptoren wurde früher noch nicht charakterisiert. Wir fanden, daß MVD ein nützliches Modellsystem zur Identifizierung von kompetetiven Antagonisten an dieser Stelle liefert.
Die Sigmarezeptor-Bindungsstelle kann selektiv mit (+)-[³H]3-Hydroxyphenyl-N(1-propyl)-piperidin, ((+)-[³H]-3- PPP) und mit tritiummarkierten N,N'-disubstituierten Guanidinen, die Sigmarezeptor-Bindungsaktivität besitzen, zum Beispiel [³H]-1,3-Di-o-tolyl-guanidin ([³H]DTG), markiert werden. Die physiologische Funktion dieser Bindungsstelle war bisher unbekannt. Wir fanden, daß die (+)-3-PPP-Verstärkung der elektrisch stimulierten Ausschüttung von [³H]-Norepinephrin ([³H]NE) aus vorbeladenem Maussamenleiter (MVD) von N,N'- disubstituierten Guanidinen, die Antagonisten für halluzinogen wirkende sigma-Benzomorphane sind, kompetetiv antagonistisch beeinflußt wird, zum Beispiel durch DTG, mit einem KE von 29 nM und durch N,N'-Di-o-phenyl-guanidin (DPG), mit einem KE von 400 nM. Dies ist vergleichbar mit einem KD für DTG von 28 nM und einem Ki von 400 n für DTPG in Hirnmembran Bindungsassays. Das läßt vermuten, daß in den MVD funktionell aktive Sigmarezeptoren vorliegen, die eine Verstärkung der elektrisch stimulierten Norepinephrin- (NE)-Ausschüttung vermitteln und daß DTG und DPG kompetetive Antagonisten an den Sigmarezeptoren sind. Das Sigmarezeptor-Bindungsassay-System und die N,N'- disubstituierten Guanidin-Antagonisten der Erfindung sind nützliche Werkzeuge zur Bestimmung der Wirkung von Benzomorphanen und anderen Drogen für die Sigmarezeptoren und zur Untersuchung der physiologischen Rolle dieser Rezeptoren.
Wie vorstehend beschrieben, verursacht der selektive Sigmaligand (+)-3-PPP einen dosisabhängigen Anstieg der elektrisch stimulierten NE-Ausschüttung in den MVD, wie durch NE-Analyse der MVD-Organ-Badflüssigkeit, durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (RP-HPLC/EC)¹³, bestimmt wurde. Um diese präsynaptische Wirkung von (+)-3-PPP genauer zu untersuchen, haben wir die NE-Nervenenden der MVD durch 30- minütige Inkubation des Gefäßes mit [³H]NE (25 uCi/ml/4 Gefäße) in Krebs/Ringer Puffer, der 30 uM Desoxycorticosteronacetat enthielt (um die Aufnahme von [³H]NE in das glatte Muskelgewebe zu verhindern), bei 37ºC, mit stetem Durchperlen von 95% O&sub2;/5% CO&sub2;, vorbeladen. Pro Experiment wurden dann vier Gefäße einzeln in 5 ml Organbädern in 95% O&sub2;/5% CO&sub2; gesättigtem Krebs/Ringer Puffer angeordnet und bei 37ºC gehalten.
(+)-3-PPP verursacht eine dosisabhängige Verstärkung der elektrisch stimulierten [³H] NE Ausschüttung in die Badflüssigkeit. Wenn 10 uM DTG, ein selektiver Sigmarezeptor-Ligand, zusammen mit verschiedenen Dosen (+)- 3-PPP, zur Badflüssigkeit gegeben werden, wird die Wirkung von (+)-3-PPP auf die [³H]NE-Ausschüttung vollständig verhindert, was bestätigt, daß DTG ein Antagonist für die (+)-3-PPP-Wirkung auf die, mit der [³H]NE-Ausschüttung verbundenen, Freisetzung von Radioaktivität in den MVD ist. In Hirnmembran-Bindungsassays markieren sowohl (+)-[³H]-3- PPP als auch [³H]DTG selektiv die gleiche Bindungsstelle. Diese Bindungsstelle erfüllt die pharmakologischen Kriterien von Sigmarezeptoren dadurch, daß sie Affinität für Benzomorphan-Opiate zeigt, von denen bekannt ist, daß sie sigmaartige Verhaltenseffekte zeigen, aber keine für Morphin und andere klassische Opiate, die frei von sigmaartigen Verhaltenseffekten sind. Weiterhin ersetzt DTG kompetetiv (+)-[³H]-3-PPP und (+)-3-PPP ersetzt kompetetiv [³H]DTG an Sigma-Bindungsstellen. Da die Wirkung von (+)-3- PPP auf die Freisetzung von [³H] NE in den MVD durch Sigmarezeptoren vermittelt wird und da DTG ein Antagonist ist, wie durch die Tatsache belegt wird, daß DTG die Wirkung von (+)-3-PPP verhindert, ist der Antagonismus von DTG für (+)- 3-PPP kompetetiv, wie durch die Dosis/Wirkungs-Kurve der (+)-3-PPP Wirkung auf die Freisetzung von [³H]NE, in Gegenwart von 120 nM DTG, belegt wird, was zu einer fünffachen Verschiebung nach rechts führt, verglichen mit der Dosis/Wirkungs-Kontrollkurve von (+)-3-PPP, in Abwesenheit von DTG. Eine Schild-Analyse der Dosis/Wirkungs-Beziehung in Abwesenheit von DTG und in Gegenwart 70, 270 und 960 nM DTG ergab eine annähernd parallele Rechtsverschiebung der (+)-3-PPP Dosis/Wirkungs- Kurve. Der pA&sub2; Wert für den DTG Antagonismus, wie er sich aus dem Schild-Plot ergibt, entspricht einer Antagonist- Affinität (KE) von 29 nM. Die Schildsteigung betrug 0.85.
1,3-Diphenylguanidin (DPG) war für den Antagonismus der (+)-PPP-Wirkung auf die [³H]NE-Ausschüttung (verantwortlich). DPG bindet auch an die Sigmarezeptoren in Bindungsassays, hat aber eine geringere Affinität als DTG. 80 uM DTG ergeben eine vollständige Blockierung der (+)-3- PPP-Wirkung auf die [³H]NE-Ausschüttung, während 1.6 uM DPG eine Rechtsverschiebung der Dosis/Wirkungs-Kurve um das fünffache bewirken. Eine Schildanalyse bei 920, 3 600 und 12 800 nM ergab einen pA&sub2; Wert, der einem KE von 400 nM entspricht. Eine Anzahl von Kontrollexperimenten zeigte, daß die Wirkung von (+)-3-PPP jedem bekannten Mechanismus zuzuschreiben ist, der einen Anstieg der NE-Ausschüttung bewirkt, so Inhibierung der Aufnahme von NE oder alpha-2 adrenerge Rezeptorblockade.
Das Postulat, daß ein funktionell aktiver Rezeptor und die Wirkung (KE) eines kompetetiven Antagonisten in einem geeigneten Bioassay-System dessen Affinität (Kd) in einem geeigneten Bindungsassay entsprechen sollte, während die Wirkung eines Agonisten im Bioassay, verglichen mit dessen Affinität in einem Bindungsassay gewöhnlich niedriger ist, wird von dem hier beschriebenen Bindungsassaysystem erfüllt. Der KE-Wert für die zwei kompetetiven Antagonisten DTG und DPG entspricht beinahe perfekt ihren KD/Ki-Werten in einem Sigmarezeptor- Bindungsassay, das (+)-[³H]-3-PPP oder [³H]DTG verwendet, um die Rezeptoren in Hirnmembran-Suspensionen zu markieren. Dagegen ist der EC&sub5;&sub0; für die (+)-3-PPP Agonistwirkung drei Größenordungen kleiner als dessen Bindungsaffinität. Zusammengenommen belegen diese Erkenntnisse, daß die [³H]NE freisetzende Wirkung von (+)-3-PPP eine wirklich Rezeptorvermittelte Wirkung ist und daß die Rezeptoren, die diese Wirkung vermitteln, wahrscheinlich ähnlich oder identisch mit den Sigmarezeptoren sind, die in Hirnmembran- Suspensionen durch (+)-[³H]-3-PPP und [³H]DTG selektiv markiert werden.
Die vorstehenden Beispiele können mit ähnlichem Erfolg wiederholt werden, indem man die allgemein oder speziell beschriebenen Reaktanten und/oder Verfahrensbedingungen der Erfindung durch die, die in den vorstehenden Beispielen verwendet werden, ersetzt.

Claims

1. Verwendung eines N, N'-disubstituierten Guanidinderivats der Formel I

in der R und R', die gleich oder verschieden sein können, Alkylreste mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, Cycloalkylreste mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen, carbocyclische Arylreste, Alkarylreste oder Aralkylreste mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen bedeuten, wobei die Kohlenwasserstoffreste R und R' 1, 2 oder 3 der folgenden Substituenten tragen können: Alkylreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Chlor-, Brom-, Jod-, Fluoratome, Nitrogruppen, Azidogruppen, Cyanogruppen, Isocyanatgruppen, Aminogruppen, Niederalkylaminoreste, Di-Niederalkylaminoreste, Trifluormethylgruppen, Alkoxyreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Acyloxyreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Amidogruppen, N-Ethylacetamidogruppen, Carbamidogruppen, N-Methylcarbamylgruppen und N,N'-Dimethylcarbamylgruppen, oder von N-(2-Methyl-4-isothiocyanatphenyl)-N'-(2- methylphenyl)-guanidin für die Herstellung eines Arzneimittels, das für die Diagnose und Behandlung einer Psychose wertvoll ist.

2. N,N'-disubstituiertes Guanidinderivat der Formel I gemäß Anspruch 1

in der R und R' jeweils einen Alkylrest mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen, eine Adamantylgruppe, Cyclohexylgruppe oder einen carbocyclischen Arylrest mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen bedeuten und wobei mindestens einer der Ringkohlenstoffatome von R und R' mindestens ein Tritiumatom trägt.

3. Verbindung nach Anspruch 2, nämlich N,N'-Di-(4-[³H)-2- methylphenyl)-guanidin.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei in dem verwendeten Guanidinderivat R und R' jeweils einen Alkylrest mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen, einen Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen oder einen carbocyclischen Arylrest mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen bedeuten.

5. Verfahren zur Bestimmung der Sigma-Hirnrezeptor-Bindungsaktivität einer organischen Verbindung, umfassend die folgenden Schritte:

a) Inkontaktbringen in einem wäßrigen Medium einer bekannten Menge von isolierter Säugerhirnmembran, die psychotomimetische Benzomorphan-Bindungsaktivität aufweist, mit einem Gemisch aus (i) einem tritiummarkierten N,N'-disubstituierten Guanidin nach Anspruch 2, das selektiv Sigma-Hirnrezeptoren bindet, in einer Menge, von der man weiß, daß sie fähig ist, an die Sigmarezeptoren dieser Hirnmembran gebunden zu werden; und (ii) unterschiedliche bekannte Mengen einer wasserlöslichen organischen Verbindung, die auf Sigmarezeptor-Bindungsaktivität getestet werden soll;

b) Abtrennen der Hirnmembran von jeder tritiummarkierten Verbindung, die in Schritt a) nicht an die Hirnmembran gebunden wird;

c) Bestimmung der Sigmarezeptor-Bindungsaktivität der organischen Verbindung aus dem Molverhältnis des Anteils von gebundener tritiummarkierter Verbindung, die im Schritt b) abgetrennt wird, zur Molmenge der organischen Verbindung, die in Schritt a) eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die tritiummarkierte Verbindung ein disubstituiertes Guanidin der Formel

ist, wobei R und R' jeweils einen Alkylrest mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen oder carbocyclische Arylreste mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen bedeuten.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die tritiummarkierte Verbindung N,N'-Di-(4-[³H]-2-methylphenyl)-guanidin ist.

8. Verwendung nach Anspruch 1 oder 4, wobei das hergestellte Arzneimittel wertvoll zur Bestimmung der Beziehung von abnormalem psychoseähnlichem Verhalten in einem Säuger, der solch ein Verhalten zeigt, zur Dysfunktion des Sigmarezeptorsystems.

9. Verwendung nach Anspruch 1 oder 4, wobei das hergestellte Arzneimittel wertvoll für die Behandlung eines Menschen ist, der an einer Psychose, die mit Halluzination verbunden ist, leidet.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das verwendete disubstituierte Guanidin eine Verbindung der Formel

ist, in der R und R' jeweils gleich sind und einen Alkylrest mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen, einen Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen oder einen carbocyclischen Arylrest mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen bedeuten.

11. Verbindung gemäß der Definition in Formel I nach Anspruch 1, nämlich N-Cyclohexyl-N'-(2-methylphenyl)-guanidin.

12. Verbindung gemäß der Definition in Formel I nach Anspruch 1, nämlich N-(Adamantan-1-yl)-N'-2-jodphenylguanidin.

13. Verbindung gemäß der Definition in Formel 1 nach Anspruch 1, nämlich N-(Adamantan-1-yl)-N'-(2-methylphenyl)-guanidin.

14. Arzneimittel, umfassend die Verbindung nach Anspruch 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

15. Arzneimittel, umfassend die Verbindung nach Anspruch 12, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

16. Arzneimittel, umfassend die Verbindung nach Anspruch 13 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

17. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das N,N'-disubstituierte Guanidin N-Cyclohexyl-N'-(2-methylphenyl)-guanidin ist.

18. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das N,N'-disubstituierte Guanidin N-(Adamantan-1-yl)-N'-jodphenyl-guanidin ist.

19. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das N,N'-disubstituierte Guanidin N-(Adamantan-1-yl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin ist.

20. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das N,N'-disubstituierte Guanidin N-(Adamantan-1-yl)-N'-cyclohexyl-guanidin ist.

21. Verwendung nach Anspruch 4, wobei R eine Cyclohexylgruppe und R' eine o-Tolylgruppe ist.

22. Verwendung nach Anspruch 4, wobei R eine Adamantanylgruppe und R' eine Cyclohexylgruppe ist.

23. Verwendung nach Anspruch 4, wobei sowohl R als auch R' Adamantanylgruppen sind.

24. Verwendung nach Anspruch 4, wobei R eine Adamantanylgruppe und R' eine 2-Jodphenylgruppe ist.

25. Verwendung nach Anspruch 4, wobei R eine Adamantanylgruppe und R' eine o-Tolylgruppe ist.