DE3783835T2 - Verfahren und geraet zur einschaetzung der agglutination. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bewertung eines Agglutinationsmusters in einem diagnostischen Test, und insbesondere eine Vorrichtung zur Bewertung eines Agglutinationsmusters in einer indirekten passiven Agglutinationsmethode.
• In einer indirekten passiven Agglutinationsmethode immunologischer Reaktionen, d. h. der sogenannten Mikrotiter-Methode, wurden allgemein Messungen sehr kleiner Mengen von Immun-Bestandteilen durch Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Agglutination auf einer Mikroplatte verwendet. Das Vorliegen oder Fehlen der Agglutination wurde visuell beurteilt. Bei dieser Beurteilung wird eine Reaktantenverteilung in jeder Vertiefung als Fläche eines Abschnitts, die eine niedrigere Lichtintensität als ein vorbestimmter Wert aufweist, erhalten; sie wird mit einem positiven Referenz-Agglutinationsmuster oder einem negativen Referenz-Agglutinationsmuster verglichen, und/oder ihr Verhältnis zu den Zuständen angrenzender Vertiefungen wird berücksichtigt. Daher hat diese Methode derartige Nachteile, daß die visuelle Bewertung eine hohe Geschicklichkeit notwendig macht, daß aufgrund einer empfindlichen Bewertungsmethode ein individueller Unterschied durch das beurteilende Bedienungspersonal besteht, und daß die Reproduzierbarkeit im allgemeinen schlecht ist.
• Eine Automatisierung dieser visuellen Bewertung durch eine Vorrichtung kann nicht nur eine Arbeitskraft eliminieren, sondern auch die Meßgenauigkeit weitgehend verbessern. Obwohl eine Agglutinationsreaktion Vorzüge, wie z. B. eine Anzahl von anzuwendenden Testgegenständen, eine einfache Durchführung, eine hohe Empfindlichkeit und eine breite Anpassung für die Verarbeitung vieler Proben, aufweist, hat sie immer noch den Nachteil, daß die abschließende Beurteilung nicht automatisiert werden kann. Deshalb ist es bei einem diagnostischen Test sehr wichtig, diesen Nachteil zu beheben und eine genaue automatische Bewertungsmethode der Agglutinationsreaktion und eine Vorrichtung zur Durchführung derselben zu entwickeln, um beachtlich zu den medizinischen Entwicklungen beizutragen.
• Jedoch ist es in Verbindung mit den komplizierten Faktoren anspruchsvoll und wirtschaftlich kostspielig, ein Agglutinationsmuster durch dieselbe Beurteilung in einem Gerät visuell zu beurteilen, was gegenwärtig erreicht worden ist, und es fehlt ihm an Praktikabilität. So ist es technisch wichtig, die Bewertung, die mit einer automatischen Testvorrichtung erhalten wird, mit der visuellen Bewertung so genau wie möglich in Übereinstimmung zu bringen, während man die Anzahl der Bewertungsfaktoren bei der automatischen Bewertung begrenzt. Herkömmliche automatische Bewertungsvorrichtungen, die bisher vorgeschlagen wurden, setzen Photometer ein, um ein Lichtabsorptionsvermögen eines Mittelpunkts einer jeden Vertiefung einem Agglutinationsmuster entsprechen zu lassen oder um das Verhältnis einer Lichtmenge, die um das Zentrum der Vertiefung abgefallen ist, zu jener, die am peripheren Rand des Zentrums der Vertiefung abgefallen ist, einem Agglutinationsmuster gleichzusetzen. Diese Vorrichtungen wurden jedoch als Hilfsmittel der visuellen Beurteilung verwendet, und es gibt keine Vorrichtung, die eine mit der visuellen Bewertung kompatible Leistung aufweist.
• Da die herkömmliche Vorrichtung Vertiefungen einzeln mißt, ist sie bei Messungen zeitaufwendig und benötigt ein Mittel zum Bewegen einer Platte, die eine Anzahl von Vertiefungen hat.
• Die herkömmliche automatische Bewertungsvorrichtung verwendet ein Transmissionslicht, und Proben einer Agglutinationsreaktion enthalten nicht nur Serum, sondern auch verschiedene Proteine. Diese Bestandteile werden von der Agglutinationsreaktion unabhängig abgelagert, so daß die gesamte Lösung in einer gewissen Umhüllung vorliegt.
• Dieses Phänomen tritt in einer komplizierten Kombination von Probenserum und Reagenzlösung auf und kann nicht mehr ignoriert werden, insbesondere, wenn eine lange Zeit verstrichen ist, seitdem die Probe mit dem Reagenz oder Protein gemischt wurde und/oder die Salzkonzentration hoch ist. In der herkömmlichen Vorrichtung wird die Menge an verwendbarem Transmissionslicht aufgrund der diffusen Reflexion des Lichts durch eine Ablagerung deutlich reduziert. So entsprechen die Menge des Transmissionslichts und eine Agglutinationsreaktion einander nicht korrekt, und eine genaue Bewertung des Agglutinationsmusters ist in der herkömmlichen automatischen Agglutinationsbewertungsvorrichtung vom Typ einer Umwandlung von einer Konzentration in eine Lichttransmission unmöglich.
• Da das Transmissionslicht vom Reaktanten nur einmal absorbiert wird, während es eine Vertiefung vertikal durchläuft, neigt der resultierende Kontrast in der herkömmlichen Vorrichtung dazu, unscharf-unklar zu werden.
• Um die Nachteile der obigen herkömmlichen Vorrichtung zu eliminieren, haben die vorliegenden Erfinder eine Hochgeschwindigkeitsvorrichtung zur automatischen Bewertung von Agglutinationen in einer Mehrzahl von Vertiefungen in einer stationären Mikroplatte durch Anordnung einer Fernsehkamera und einer Lichtquelle auf derselben Seite der Mikroplatte und Aufnehmen des optischen Zustands der Mikroplatte dadurch vorgeschlagen (Japanische Patentanmeldung Nr. 57880/1985).
• Diese Vorrichtung weist auf einen Plattenhalter zum Auflegen der Mikroplatte, eine Fernsehkamera und eine Lichtquelle, die über dem Plattenhalter angeordnet sind, welcher eine Bildeingabeeinheit, die das die Mikroplatte passierende Transmissionslicht reflektieren kann, und einen Bildprozessor zur Bewertung des Agglutinationszustands durch Verarbeitung eines von der Fernsehkamera eingegebenen Bildsignals einschließt.
• In dieser Agglutinationsbewertungsvorrichtung strahlt die Lichtquelle einheitliches Licht auf die jeweiligen Vertiefungen der Mikroplatte und daher die verdünnten Lösungen in den Vertiefungen ab. Die Intensität des Lichts ist so ausgewählt, daß, wenn eine derartige Trübung existiert, ein nachweisbarer Bereich der Reaktantenkonzentration mit demjenigen ohne Trübung zusammenfällt. Andererseits wird es, nachdem es die verdünnte Lösung durchlief, während es vom Reaktanten absorbiert wurde, von den Böden der Vertiefungen oder einer um sie herum angeordneten reflektierenden Platte reflektiert und passiert wieder die verdünnte Lösung, während es vom Reaktanten wieder absorbiert wird. Deshalb wird der Bildkontrast, der durch das durch die jeweiligen Abschnitte fallende Licht gebildet wird, gemäß der Konzentration des Reaktanten intensiviert. Das Licht aus den Vertiefungen wird von der Fernsehkamera aufgenommen, um optische Information von allen Vertiefungen zu erhalten. Die optische Information wird als Bildsignal von der Fernsehkamera zum Bildprozessor übermittelt, der das Signal verarbeitet, um das Agglutinationsmuster zu bewerten.
• Gemäß dieser Vorrichtung wird der Einfluß der Trübung auf einen zufriedenstellenden Bereich eliminiert. Wenn jedoch die Lichtmenge in jeder Vertiefung erhöht werden soll, um genügend Kontrast lediglich durch die Beleuchtung von oben zu liefern, muß die Stärke der Lichtquelle extrem erhöht werden, was eine Erhöhung der Wärmeerzeugung verursacht. So ist es notwendig, eine Kühleinrichtung, wie z. B. einen Ventilator, zu installieren, was die Vorrichtung zusätzlich zum hohen Stromverbrauch kompliziert und teuer werden läßt. Da die dynamische Reichweite der Fernsehkamera begrenzt ist, kann die Lichtmenge bis zu einem Niveau erhöht werden, bei dem die Helligkeit der oberen Oberfläche der Mikroplatte vorbestimmt wird. In einem solchen Fall kann das Innere der Vertiefungen nicht ausreichend hell sein. Ferner kann ein Bild der Lichtquelle auf der Flüssigkeitsoberfläche in der Vertiefung erscheinen, das einem Agglutinationsbild überlagert sein kann, was die Messung manchmal schwierig werden läßt.
• Ein herkömmliches Bildverarbeitungsverfahren zur Verarbeitung des Bildsignals von der Fernsehkamera im Bildprozessor soll nur das Bild eines eingegebenen zu messenden Objektes extrahieren und eine Fläche, die Länge der Peripherie und den Winkel des extrahierten Bildes und die Anzahl der Bilder messen. In einem Verfahren zum Extrahieren eines zu messenden Bildes wird die Extraktion durchgeführt, indem man dem Bild, das eine niedrigere Intensität als ein vorbestimmter Wert aufweist, die Intensität "0" und dem Bild, das eine höhere Intensität als der Wert aufweist, die maximale Intensität des Intensitätsbereichs zuordnet (binärisierendes Verfahren), wenn es einen Intensitätsunterschied zwischen dem zu messenden Bild und dem anderen Bild gibt. Oder es kann durchgeführt werden, indem man ein Profil eines zu messenden Bildes durch Differenzieren eines Unterschieds zwischen dem zu messenden Bild und einem Hintergrund extrahiert, um den Intensitätsgradienten zu erhalten, wobei man Punkte des größten Gradienten erhält und die Punkte verbindet. WO-A-84/04391 lehrt die Bestimmung der Fläche eines Objektmusters durch Differential-Randerfassung als Kriterium zum Nachweis des Vorhandenseins eines Agglutinationsmusters.
• Bei diesen Verfahren ist es jedoch notwendig, daß zwischen dem zu messenden Bild und dem anderen Teil ein Intensitätsunterschied klar existiert und daß das Licht einheitlich ist.
• Um diesen Anforderungen zu genügen, wird die Vorrichtung kostspielig, und die dadurch durchzuführende Bewertung muß mit der visuellen Bewertung kompatibel sein, da die in einer derartigen Vorrichtung zu verwendenden Faktoren auf eine viel kleinere Anzahl als die in der visuellen Bewertung verwendete begrenzt sind.
• Das Verfahren zur Extraktion eines Profils eines Bildes durch Differenzieren eines Intensitätsunterschieds ist im allgemeinen schwierig. Spezieller ist die Luminanz eines Abschnitts in einer Vertiefung, in der das Agglutinationsmuster gebildet wird, zwischen dem Agglutinationsmuster und dem übrigen scheibenähnlichen Abschnitt der Peripherie des Agglutinationsmusters unterschiedlich, weil das Transmissionslicht von unten durch das Agglutinationsmuster unterbrochen wird und das Licht von oben dadurch weniger reflektiert wird als die Reflexion von der Mikroplatte selbst. Da ein Abschnitt der oberen Oberfläche der Mikroplatte, in dem es keine Vertiefung gibt, flach ist, erreicht von unten durch diesen hindurchgehendes Licht die Fernsehkamera direkt, und Licht von oben wird reflektiert, und erreicht die Fernsehkamera. Da der Rand der Vertiefung in der Form schräg abgesenkt ist, wird andererseits Licht von unten teilweise reflektiert, und der reflektierte Teil kann die Fernsehkamera nicht erreichen, und Licht von oben wird ebenfalls teilweise reflektiert und führt dadurch zu der besagten Reduktion des Lichts zur Fernsehkamera. Daher tritt ein Intensitätsunterschied zwischen dem flachen Teil der Mikroplatte und dem Rand der Vertiefung auf. So werden in der Bewertung der Agglutination der Mikroplatte zwei Ränder des Agglutinationsmusters und der Vertiefung als Bilder extrahiert. Ferner kann, wenn in der Vertiefung ein Defekt besteht, ein Intensitätsunterschied bei einem derartigen Defekt erscheinen. Wenn ein Meßgegenstand, ein Meßdatum, eine Plattennummer auf der oberen Oberfläche der Mikroplatte zur Unterscheidung dieser Mikroplatte von den anderen angegeben sind, werden diese ebenfalls extrahiert.
• Wie oben beschrieben, war es schwierig, durch ein an sich bekanntes Bildverarbeitungsverfahren eine Fläche eines Agglutinationsmusters in einer Vertiefung genau zu erhalten.
• Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Methode und eine Vorrichtung zur Bewertung eines Agglutinationsmusters bereitzustellen, die die oben erwähnten Probleme umgehen und die das Agglutinationsmuster mit derselben Genauigkeit automatisch bewerten können, wie sie durch eine visuell bewertende Fachkraft erhalten wird.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dies mittels einer Methode und einer Vorrichtung, wie sie beansprucht sind, erreicht.
• Die vorliegende Erfindung macht von der Tatsache Gebrauch, daß für jede Vertiefung ein Agglutinationsmuster, ungeachtet der Bildschärfe seines Profils, kreisförmig ist, daß die Bildleuchtdichte (Luminanz) im Mittelpunkt eines Kreises am niedrigsten ist und mit einer Entfernung vom Mittelpunkt höher wird, und daß für die Mikroplatte ein Abstand zwischen angrenzenden Vertiefungen konstant ist.
• Wenn die mittlere Position der Vertiefung bestimmt ist, kann das Profil des Agglutinationsmusters durch Differenzieren der Bildleuchtdichte von der mittleren Position radial nach außen selektiv extrahiert werden, wobei radiale Punkte, an denen der Differentialkoeffizient am höchsten ist, nachgewiesen und diese Punkte verbunden werden. Um die Positionierungsbeziehung zwischen der Fernsehkamera und der Mikroplatte körperlich konstant zu halten, muß die Vorrichtung aus Präzisionsteilen zur Positionierung der Mikroplatte zusammengesetzt sein, was verursacht, daß die Größe und das Gewicht der Vorrichtung extrem erhöht sind. Außerdem wird die Meßgenauigkeit ungenau, wenn aufgrund von Alterungsveränderung eine körperliche Verschiebung auftritt.
• Deshalb wird in der vorliegenden Erfindung an einer Basis zum Auflegen der Mikroplatte eine Positionieröffnung gebildet, die Koordinaten der Öffnung werden gemessen, und die mittlere Position jeder Vertiefung- der Mikroplatte, und folglich die mittlere Position eines Agglutinationsmusters, wird danach aus den Koordinaten bestimmt, so daß, selbst wenn die relative Position der Fernsehkamera und der Mikroplatte leicht verschoben ist, der Mittelpunkt des Agglutinationsmusters durch, Berechnung genau erhalten werden kann. Diese Methode ist sehr wichtig, um die Größe und das Gewicht der Vorrichtung zu reduzieren, und sie ist effektiv, um die Leistung über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten. Das Profil des Agglutinationsmusters, das durch Verwendung der Zentralposition erhalten wird, wird genau erhalten, indem man die Punkte, an denen die Luminanz sich mit dem maximalen Differentialkoeffizient von "dunkel" zu "hell" verändert, erfaßt. Deshalb kann die Rauschkomponente beachtlich verringert werden, und so ist die Einheitlichkeit der Beleuchtung der Vorrichtung nicht immer notwendig.
• Die erfindungsgemaße Agglutinationsbewertungsvorrichtung, wie sie durch Ansprüche 4 und 5 definiert ist, weist eine Bildeingabeeinheit auf, die einen lichtdurchlässigen Plattenhalter zum Plazieren einer Mikroplatte, eine Lichtquelle und eine Fernsehkamera, die vorgesehen ist, um Licht von der auf den Plattenhalter aufgelegten Mikroplatte zu empfangen, und einen Bildprozessor zum Verarbeiten eines von der Fernsehkamera eingegebenen Bildsignals zur Bewertung des Agglutinationszustands einschließt. Der Plattenhalter ist perforiert, um die Positionieröffnungen für das genaue Positionieren der Vertiefungen mittlere Position jeder Vertiefung durch Licht, das durch die Positionieröffnung hindurchgeht und teilt dann das Bild jeder Vertiefung in mehrere Sektoren, erhält in jedem Sektor einen Differentialwert eines jeden Bildelements aus einer Summe von Luminanzunterschieden zwischen dem Element und den äußeren Bildelementen, vergleicht die Differentialwerte der Bildelemente in jeder Richtung und zählt die Anzahl der Bildelemente in jeder radialen Richtung, die in sich zwei von jenen mit den größten Werten aufweist, um eine Agglutinationsfläche zu erhalten.
• Der Bildprozessor hat eine Video-Eingangseinheit zum Empfangen eines Ausgangs aus der Fernsehkamera, einen digitalen Bildspeicher zum Aufzeichnen der Daten der Bildelemente, eine Video-Ausgangseinheit zum Einspeisen des Speicherinhalts in einen Computer wie erforderlich, und einen Mikrocomputer für die Verarbeitung, um den Ausgang der Video-Ausgangseinheit zu errechnen, und weist ferner einen Video-Eingangs-Kontrollbildschirm und einen Drucker zum Aufzeichnen der errechneten Ergebnisse auf.
• Der Bildprozessor kann das Bild der Vertiefung radial in mindestens vier oder mehr Segmente unterteilen, und die Anzahl der Unterteilungen kann erhöht werden, solange der differenzierte Wert, der später beschrieben werden soll, richtig bestimmt werden kann. Der intrinsische Differentialwert, der für jedes Bildelement bestimmt werden soll, ist eine Summe von Werten, die erhalten wird durch Reduzieren eines Luminanzwertes von den Luminanzwerten der Bildelemente, die außerhalb des bestimmten Bildelements angeordnet sind. Die außerhalb eines Bildelements angeordneten Bildelemente werden in Abhängigkeit von der Anzahl der Segmente und der Position davon in Zahl und Stellung geeignet verändert.
• Die Differentialwerte der jeweiligen Bildelemente werden sequentiell in einer Richtung, die horizontal, vertikal oder schräg sein kann, verglichen.
• Die Richtung des Lichts von der Lichtquelle der erfindungsgemäßen Agglutinationsbewertungsvorrichtung kann willkürlich sein, vorausgesetzt, daß es die Vertiefungen der Mikroplatte einheitlich beleuchtet. Die optische Information, die der Fernsehkamera geliefert wird, wird in Form von Bildsignalen zum Bildprozessor übermittelt, der wiederum die Bildleuchtdichte der Bildelemente differenziert, um die Ränder der Agglutinationsabschnitte zu finden, die Bildelemente zwischen den Rändern zu zahlen und sie mit einem Referenzwert zu vergleichen.
Zeichnungen
• Fig. 1 bis 5 sind Ansichten einer Methode zur Bestimmung eines Profils einer Agglutination, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird;
• Fig. 6 ist eine Ansicht eines Aufbaus einer Vorrichtung zur Bestimmung eines Kriteriums in einem erfindungsgemäßen Verfahren;
• Fig. 7 ist ein Diagramm eines Kriteriums zum Nachweis eines Treponema Pallidum Antikörpers, das durch die Vorrichtung von Fig. 6 erhalten wurde;
• Fig. 8 ist ein Diagramm eines Kriteriums zum Nachweis von Hepatitis B Oberflächen-Antikörper, das durch die Vorrichtung von Fig. 6 erhalten wurde; und
• Fig. 9 ist ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung zur Bewertung gemäß dem Kriterium.
• Ein Verfahren zur Bestimmung des Agglutinationsrandes wird ausführlicher unter Bezugnahme auf Fig. 1 bis 5 beschrieben werden. Ein Plattenhalter 5 wird aus einem durchsichtigen Kunststoff gebildet, und seine obere Oberfläche weist, wie in Fig. 1 gezeigt, im wesentlichen konische Aussparungen 6 zur Aufnahme der Vertiefungen 8 einer Mikroplatte 7 an genauen Positionen auf.
• In Fig. 2 werden Positionieröffnungen 9 an den Positionen, die den Spitzen eines Rechtecks entsprechen, perforiert, und Licht geht durch den Plattenhalter 5 vertikal nach oben hindurch.
• Eine Hauptlichtquelle (nicht gezeigt) ist über dem Plattenhalter 5 vorgesehen. Eine Hilfslichtquelle von geringerer Stärke als die Hauptlichtquelle kann unter dem Plattenhalter 5 vorgesehen werden.
• Die Koordinaten der Positionieröffnungen 9 werden verwendet, um die Zentralposition jeder Vertiefung zu bestimmen. Unter der Annahme, daß die Positionen der Positionieröffnungen an den Koordinaten von 9&sub1;(x&sub1;,y&sub2;), 9&sub2;(x&sub2;,y&sub2;), 9&sub3;(x&sub3;,y&sub3;) und 9&sub4;(x&sub4;,y&sub4;) liegen, ist in Fig. 2 eine Linie, die die Positionieröffnungen 9&sub1; und 9&sub2; verbindet, durch Y&sub1;=a&sub1;x+b&sub1; ausgedrückt. Ahnlich werden jeweils drei Geraden Y&sub2;, Y&sub3; und Y&sub4;, die die Positionieröffnungen 9&sub3; und 9&sub4;, 9&sub1; und 9&sub3; und 9&sub2; und 9&sub4; verbinden, erhalten, und somit werden insgesamt vier Linien erhalten.
• Dann werden die Geraden Y&sub1; und Y&sub2; in jeweils 11 gleiche Segmente unterteilt, um 12 Teilungspunkte k&sub1;, . . . k&sub1;&sub2; und h&sub1;, . . . h&sub1;&sub2; zu erhalten. Dann werden jeweils 12 Linien y&sub1;, . . . y&sub1;&sub2;, die diese Punkte horizontal verbinden, erhalten.
• Ferner werden Teilungspunkte m&sub1;, . . . m&sub8; und n&sub1;, . . . n&sub8; der übrigen Geraden Y&sub3; und Y&sub4; erhalten, und 8 Geraden x&sub1;, . . . x&sub8; zur Verbindung dieser Punkte werden erhalten.
• Dann werden die Kreuzungspunkte der Geraden y&sub1;, . . . y&sub1;&sub2; und der Geraden x&sub1;, . . . x&sub8; erhalten, die als Mittelpunkte der Vertiefungen verwendet werden.
• Wie in Fig. 3 gezeigt, wird ein Bild jeder Vertiefung radial in 8 Sektoren S&sub1;, S&sub2;, . . . S&sub8; unterteilt, und die Differentialwerte der Bildelemente in den Sektoren S&sub1;, . . . S&sub8; werden jeweils bestimmt. Der Differentialwert jedes Bildelements ist eine Summe von Unterschieden in der Luminanz zwischen dem Bildelement und den jeweils angrenzenden drei Bildelementen, dies von dem in Rede stehenden Bildelement radial nach außen angeordnet sind. Im Sektor S&sub1; sind Bildelemente, die an die linke Seite, schräge obere linke Seite und schräge untere linke Seite eines Bildelements angrenzend angeordnet sind, mit letzterem in der Bildleuchtdichte zu vergleichen, und eine Summe der Unterschiede ist als der Differentialwert des in Frage stehenden Bildelements zu bestimmen. Im Sektor S&sub2; werden Bildelemente, die an die obere Seite, linke Seite und schräge obere linke Seite eines Bildelements angrenzend angeordnet sind, in der Bildleuchtdichte mit letzterem zusammengesetzt, und eine Summe der Unterschiede ist als dessen Differentialwert zu bestimmen, und so weiter.
• Fig. 4 veranschaulicht die Differentialwerte der Bildelemente des Sektors S&sub2;. In Fig. 4 bezeichnen die Symbole A bis F und die Ziffern I bis VI die Reihen und Säulen des Sektors, und die Zahl, die jedem Bildelement oben links angefügt ist, gibt die Intensitäten an. Wenn beispielsweise der Differentialwert des Bildelements D-III, das eine Intensität von "32" aufweist, betrachtet wird, ist ein Differentialwert dieses Bildelements 37, weil die Intensitäten der Bildelemente D-II, C-II und C-III, die das Element D-III außen umgeben jeweils "44", "47" und "42", d. h., 12 (=44-32) + 15 (=47-32) + 10 (=42-32) = 37, sind. Somit ist der Differentialwert jedes Bildelements bestimmt.
• Wenn die Differentialwerte der jeweiligen Bildelemente bestimmt sind, werden die Differentialwerte der Bildelemente, die auf einer Linie ausgerichtet sind, miteinander verglichen, um zwei Bildelemente, die die zwei größten Werte in dieser Linie aufweisen, als den Rand der Agglutination definierend zu ermitteln. Das heißt, wenn Differentialwerte wie in Fig. 5 gezeigt angegeben sind, werden zwei Bildelemente, zum Beispiel in Linien, die den größten Wert 38 aufweisen, als den Rand definierend bestimmt, und in der Linie f werden die Bildelemente mit den Werten 34 und 33 als den Rand definierend ermittelt. Ahnlich wird, wenn die Ränder für alle Linien ausgewählt sind, der gesamte Rand so, wie er durch eine dicke durchgehende Linie in Fig. 5 bezeichnet ist. In Fig. 5 zeigen die strichpunktierten Linien die tatsächlichen Ränder des Agglutinationsbereichs an. Die Anzahl der Bildelemente innerhalb des Randes wird gezählt, und die Agglutinationsfläche wird mit einem Referenzwert verglichen.
• Dies ist sehr effektiv zur Eingrenzung des Profils des Differentialbildes. Jedoch wird es immer noch durch den Kontrast des Originalbildes beeinflußt. Wie oben beschrieben, wird der Kontrast aufgrund der Reagenstypen und -lose, der Schwankung in einem optischen System, das eine Lichtquelle einschließt, und der Schwankungen in der Blutlösung unscharf.
• Wie oben beschrieben, ist es bei der genauen Agglutinationsbewertung unbedingt erforderlich, die Schwankung des Bildkontrasts über eine Anzahl von Agglutinationsbildern vollständig zu beseitigen.
• Nach der erfindungsgemäßen Methode, wie sie durch Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, wird eine Bildelement-Verteilung mit einem Luminanzniveau ungleich Null mit Hilfe eines Mikrocomputers betrachtet. Eine Standardabweichung der Verteilung wird erhalten und wird durch ein mittleres Luminanzniveau geteilt, um einen Variationskoeffizienten CV zu erhalten. Da der CV keine auf Kontrastschwankung zurückzuführende Faktoren enthält, kann das dadurch verursachte Problem völlig beseitigt werden. Die auf diese Weise erhaltenen CV-Werte werden in der Fläche (Anzahl der Bildelemente) geplottet, um eine Verteilung für spezielle Gegenstände zu erhalten, die von visuell beurteilenden Fachkräften bewerteten Ergebnisse für dieselben Gegenstände werden auf die CV-Verteilung superponiert, um die die Bewertungsgrenze zu bestimmen, die in einem Computerspeicher gespeichert wird. Ein weiteres Agglutinationsbild für dieselben Gegenstände und dieselbe Fläche, welche mit den Daten im Computerspeicher verglichen und gemäß den Positionen ihrer CV-Werte automatisch bewertet werden, wird ähnlich erhalten.
• Im einzelnen wird die Standard-Abweichung S durch die folgende Gleichung erhalten, worin das Bildelement, das ein Intensitätsniveau von Null oder höher aufweist, im Differentialbild durch Xi bezeichnet ist.
• worin n die Anzahl der Bildelemente ist.
• Der CV-Wert wird durch die folgende Gleichung erhalten:
• CV = S/ ·100
• worin der Intensitätsniveau-Wert ist.
• Dieser CV wird nicht durch Kontrastschwankung beeinflußt.
• Wenigstens mehrere Agglutinationsbilder werden für eine spezielle Agglutinationsreaktion hergestellt, und Original-Videobilder davon werden durch die oben erwähnte Methode differenziert, um ihr Profil zu bestimmen. Die Fläche und die CV-Werte davon werden wie oben beschrieben erhalten, und die CV-Werte werden beispielsweise in einem orthogonalen Koordinatensystem auf eine Ordinatenachse geplottet, und die Fläche wird auf eine Abszissenachse geplottet. Gleichzeitig werden dieselben Agglutinationsbilder von mindestens mehreren visuell beurteilenden Fachkräften bewertet, die Ergebnisse der visuellen Beurteilung werden auf das Muster superponiert, um die Regionen zu definieren, in denen positives Muster und negatives Muster vorliegt. Die positiven und negativen Regionen liegen aneinander angrenzend vor, wobei sie sich teilweise überlappen. Die Regionen können durch eine Gerade die so gezogen ist, daß der überlappte Teil auf ein Minimum reduziert wird, getrennt werden, und diese Gerade wird als Grenze zwischen positiven und negativen Agglutinationsregionen, die in einem Speicher als Referenzdaten der spezifischen Agglutinationsreaktion gespeichert sind, verwendet. Danach werden in ähnlicher Weise Plottings für Agglutinationsbilder, die nicht für visuelle Bewertung verarbeitet werden, mit der gespeicherten Referenz verglichen, um ihre positiven oder negativen Regionen zu bestimmen. So kann die Bewertung, die eine hohe Korrelation für das Ergebnis der visuellen Bewertung hat, ungeachtet des Kontrasts des Originalbildes durchgeführt werden.
Beispiel 1:
• Fig. 6 ist eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zur Durchführung der erfindungsgemäßen Methode. In Fig. 6 wird ein Agglutinationsbild auf einer Mikroplatte 7 durch eine geeignete Beleuchtung als Videobild in einer Fernsehkamera 12 in einem Bildspeicher 13 gespeichert, und das gespeicherte Videobild wird als Differentialbild differenziert, dann wird eine Fläche des Profils des Bildes durch einen Bildprozessor 1,5 erhalten.
• Die Standardabweichung S des Bildelements, dessen Intensitätsniveau Null oder höher ist, wird durch einen Standardabweichungsrechner 16 aus dem erhaltenen Profil und der Fläche des Bildes erhalten, und sein CV wird ferner durch einen CV-Rechner 17 erhalten. Dieser CV wird zusammen mit der durch den Bildprozessor 15 erhaltenen Fläche auf einen Plotter 18 angewendet, und wird auf einen Graphen geplottet, der zum Beispiel eine Ordinate als CV und eine Abszisse als Fläche aufweist. Dieses Verfahren wird für eine Anzahl von Proben ausgeführt, und der CV und die Flächen der Bilder werden als Muster auf dem Graphen gespeichert.
• Dasselbe Agglutinationsbild wird von mehreren visuell beurteilenden Bedienern bewertet, die bewerteten Ergebnisse werden dem Plotter 18 eingegeben, um auf das Muster auf dem Graphen superponiert zu werden. Als Folge werden die Muster auf dem Graphen teilweise überlagert, um in positive und negative Muster unterteilt zu werden.
• Eine Gerade zur Unterteilung der positiven und negativen Regionen mit minimierter überlappender Region wird durch eine eine Grenzlinie bestimmende Vorrichtung 20 bestimmt, und wird in einem Speicher 21 gespeichert.
• Fig. 7 zeigt die Ergebnisse einer Hämagglutinationsreaktion mit Treponema Pallidum Antikörper (TP) als Testgegenstand, die durch Verarbeitung von 800 Proben, die als geeignete Potentiale aufweisend anzusehen sind, unter Verwendung von "SERODIA®TP" (hergestellt von Fujirebio Inc.) erhalten wurden. Fig. 8 zeigt die ähnlichen Ergebnisse des Hepatitis B Oberflächen-Antigens unter Verwendung von "SERODIA®HBs" (hergestellt von Fujirebio Inc., Japan). In Fig. 7 und 8 sind die Agglutinationsbilder, die durch die visuelle Beurteilung als positiv bewertet wurden, mit " " geplottet, die Agglutinationsbilder, die durch die visuelle Bewertung als negativ bewertet wurden, sind mit " " geplottet, und die überlappten sind mit " " gekennzeichnet. Die Unterteilung mit der Geraden durch die die Grenzlinie bestimmende Vorrichtung 20 wird vorzugsweise in der Region, die die Plots " " einschließt ausgeführt, um die Region zu minimieren. Mit anderen Worten, die Steigung einer Geraden sollte empirisch gemäß dem Verteilungsmuster ausgewählt werden.
• Die automatische Bewertung der Agglutinationsreaktion durch das gespeicherte Bewertungskriterium wird mit Bezugnahme auf Fig. 9 beschrieben werden. In Fig. 9 wird das Agglutinationsbild von einer Fernsehkamera 12 in einem Bildspeicher 13 gespeichert und wird durch einen Bildprozessor verarbeitet, um seine Fläche zu bestimmen, die Fläche wird zusammen mit dem durch einen Standardabweichungsrechner 15 und einen Variationskoeffizientenrechner 17 erhaltenen CV von einem Plotter 18 geplottet, von einem Komparator 22 mit dem im Speicher 21 gespeicherten Kriterium wie in dem in Fig. 6 gezeigten Fall verglichen, um zu beurteilen, ob die Agglutination positiv ist oder nicht.
• Der oben erwähnte Arbeitsvorgang wird in Form von Testansätzen durchgeführt werden.
• Die Koinzidenzrate und Reproduzierbarkeit des Nachweises von Hepatitis B Oberflächen-Antigen (HBs) und Treponema pallidum Antikörper (TP), die erhalten wurden, indem man zehnmal den oben beschriebenen Arbeitsvorgang für 800 Proben durchführte, sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Versuch Koinzidenzrate mit visueller Bewertung (mit 1 Vertiefung Unterschied) Gleichzeitige Reproduzierbarkeit
• Aus der obigen Tabelle ist klar, daß das erfindungsgemäße Kriterium und die visuelle Beurteilung durch eine bewertende Fachkraft bemerkenswert übereinstimmen. Eine zufriedenstellende Reproduzierbarkeit wird ebenfalls gezeigt.
• Konstruktive Einzelheiten der erfindungsgemäßen Vorrichtung können vom Fachmann ohne weiteres verstanden werden. Die in Fig. 6 und 9 gezeigte Vorrichtung kann leicht integriert oder teilweise gemeinsam benutzt werden.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung, wie sie oben beschriebenen wird, kann die Agglutination vollständig ohne den Einfluß der Kontrastschwankungen des Agglutinationsbildes bewertet werden und kann auch schnell durchgeführt werden. Außerdem kann die Bewertungsgenauigkeit zuverlässig zumindest in der durch eine visuell bewertende Fachkraft erhältlichen Bewertungsgenauigkeit gehalten werden.

Claims (5)

1. Methode zum Nachweis der Anwesenheit von Agglutination in einem Testmuster, welche die folgenden Schritte umfaßt:

(i) Bestimmen eines Plots von Referenzmustern und

(ii) Bewerten des Testmusters in Bezug auf den Referenzplot;

wobei der Referenzplot-Bestimmungsschritt die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Speichern von Videobildern mehrerer Agglutinations-Referenzmuster,

(b) Differenzieren der Videobilder, um die Konturen oder Profile der Muster aufzuzeigen,

(c) Bestimmen der Fläche der Profile der Muster,

(d) Bestimmen der Standardabweichung

der n Bildelemente vom Nicht-Null-Luminanzgrad xi und somit eines Variationskoeffizienten

CV = S/ ·100

für jedes Muster,

(e) Plotten der Beziehung zwischen dem Variationskoeffizienten und den Profilflächen der jeweiligen Muster in Form von Punkten mit kartesischen Koordinaten, welche den Variationskoeffizienten bzw. die Fläche repräsentieren,

(f) Input von visueller Auswertung der mehreren Referenz-Agglutinationsmuster um die geplotteten Punkte als positiv, d. h. Vorhandensein von Agglutination, oder negativ, d. h. Abwesenheit von Agglutination, zu bezeichnen,

(g) Bestimmen einer geraden Linie auf dem Relationsplot, um eine Bewertungsgrenze von minimaler Überlappung zwischen positiven und negativen Punkten zu schaffen,

(h) Speichern der Bewertungsgrenzlinie,

und wobei der Testmuster-Bewertungsschritt die folgenden Schritte umfaßt:

Ausführen der Schritte (a) bis (e) für das Testmuster und Klassifizieren des Testmusters als positiv oder negativ entsprechend seiner Fläche, CV-Koordinaten in Bezug auf die Bewertungsgrenzlinie.

2. Methode nach Anspruch 1, worin der Schritt (b) die Schritte des Unterteilens der Videobilder in Teilsektoren und Bestimmen des Helligkeitsunterschieds zwischen den Bildelementen des Videobildes in jedem Sektor und anderen Bildelementen, die radial nach außen von jedem Bildelement vorhanden sind, umfaßt.

3. Methode nach Anspruch 1 oder 2, worin der Schritt (c) den Schritt des Bestimmens eines ersten und eines zweiten Bildelementes in jeder horizontalen Scanning-Linie umfaßt, welche die beiden signifikantesten Unterschiedswerte aufweisen, als jene, welche das Profil darstellen

4. Vorrichtung zur Durchführung der Methode nach Anspruch 1, umfassend einen lichtdurchlässigen Plattenhalter (5) zum Auflegen einer Mikroplatte (7), welcher mit Positionieröffnungen (9) zum Positionieren der Zentralposition jeder Vertiefung (8) der Mikroplatte (7) perforiert ist, eine auf dem Plattenhalter angeordnete Lichtquelle, eine TV-Kamera zum Empfangen des von der auf dem Plattenhalter aufgebrachten Mikroplatte nach oben abgestrahlten Lichts, einen Bildspeicher (13) zum Speichern des Output-Bildes der TV-Kamera, einen Prozessor (15) zum Differenzieren des gespeicherten Bildes, um die Profile der Bilder und die Flächen der profilierten Bilder zu bestimmen, eine Einrichtung (16, 17) zur Bestimmung des Variationskoeffizienten CV gemäß Schritt (d) von Anspruch 1, einen Plotter (18) zum Plotten der Beziehung zwischen dem Variationskoeffizienten und den profilierten Flächen, Einrichtungen (18, 20, 21) zur Durchführung der Schritte (f), (g) und (h) von Anspruch 1 und einen Komparator (22) zum Vergleichen eines Testmusterwertes mit der gespeicherten Bewertungsgrenzlinie.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, worin der Prozessor die Zentralposition jeder Vertiefung (8) mit Hilfe des durch die Positionieröffnungen (9) tretenden Lichts bestimmt, dann das Bild jeder Vertiefung (8) in mehrere radial von der Zentralposition unterteilt, den aus der Differenz der Intensitäten der äußeren Bildelemente in den unterteilten Bereichen totalisierten Wert als differenzierten Wert jedes Bildelements differenziert, nacheinander die differenzierten Werte der Bildelemente vergleicht und die Anzahl der Bildelemente zwischen den beiden signifikantesten differenzierten Werten zählt.