DE3740520A1 - Rapid process for obtaining a factor VII preparation and its use - Google Patents
Rapid process for obtaining a factor VII preparation and its useInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer hochge reinigten Faktor-VII-Präparation aus menschlichem oder tierischem Plasma. Die Präparation aus menschlichem Pool-Plasma kann zur Be handlung von Blutgerinnungsstörungen verwendet werden.The invention relates to a method for obtaining a hochge purified factor VII preparation from human or animal Plasma. The preparation from human pool plasma can be used blood clotting disorders.
Faktor VII (MG=50 000 Dalton) ist ein einkettiges Vitamin-K ab hängiges Plasmaprotein, das sowohl im intrinsischen als auch im extrinsischen Gerinnungssystem wirkt und eine Schlüsselrolle in der Initiation der Blutgerinnung spielt. Broze, G. J. and Majerus, P. W. J. Biol. Chem. 255, 1242-1247, 1980, and Methods of Enzymo logy 80, 229-236, 1981. Rao, L. V. M., Rapaport, S. I. and Bejaj, S. P. Blood 68, 685-691, 1986. Osterud, B. Scand. J. Haematol. 32, 337-345, 1984.Factor VII (MG = 50,000 daltons) is a single-chain vitamin K ab pending plasma protein that is found in both intrinsic and extrinsic coagulation system and plays a key role in the initiation of blood clotting. Broze, G.J. and Majerus, P. W. J. Biol. Chem. 255, 1242-1247, 1980, and Methods of Enzymo logy 80, 229-236, 1981. Rao, L.V. M., Rapaport, S.I. and Bejaj, S. P. Blood 68, 685-691, 1986. Osterud, B. Scand. J. Haematol. 32, 337-345, 1984.
Bei der Initiation des extrinsischen Systems der Blutgerinnung wirkt das einkettige Faktor-VII-Molekül nur auf seine Substrate, Gerinnungsfaktor IX und X, wenn Gewebethromboplastin vorhanden ist. Gewebethromboplastin, ein membranständiges Glykoprotein, das selbst keine enzymatische Aktivität besitzt, fungiert hierbei als Kofaktor. In Analogie zu den Faktoren II, IX und X wird die Fak tor-VII-Gerinnungsaktivität durch proteolytische Verdauung erheb lich gesteigert. Die Faktoren Xa und Thrombin spalten das Faktor- VII-Molekül durch Proteolyse einer einzigen Peptidbindung in eine durch eine Disulfidbrücke verknüpfte leichte und eine schwere Peptidkette. Das Faktor-VII-Molekül wird auf diese Weise ohne Ab spaltung eines Peptids durch Proteolyse aktiviert. Eine Isolation von Faktor VII aus humanem Plasma ist schwierig, da er nur in einer Konzentration von 0.1 µg/ml im Plasma vorkommt und ver glichen mit den Faktoren II, IX oder X, die eine biologische Halbwertszeit von etwa 12 Stunden besitzen, nur 6-8 Stunden aktiv im Plasma vorzufinden ist. At the initiation of the extrinsic system of blood coagulation the single-chain factor VII molecule only acts on its substrates, Coagulation factors IX and X if tissue thromboplastin is present is. Tissue thromboplastin, a membrane-bound glycoprotein that itself has no enzymatic activity, acts as Cofactor. In analogy to factors II, IX and X, the fac Tor VII clotting activity increased by proteolytic digestion increased. The factors Xa and thrombin split the factor VII molecule by proteolysis of a single peptide bond into one light and heavy linked by a disulfide bridge Peptide chain. The factor VII molecule is in this way without Ab cleavage of a peptide activated by proteolysis. Isolation of factor VII from human plasma is difficult because it is only found in a concentration of 0.1 µg / ml occurs in the plasma and ver compared with factors II, IX or X, which are biological Have half-life of around 12 hours, active only 6-8 hours is found in the plasma.
Verfahren zur Faktor-VII-Präparation wurden von verschiedenen Au toren beschrieben. Bei diesen Verfahren wird der Faktor VII schrittweise aus menschlichem bzw. bovinem Plasma isoliert. Als Ausgangsmaterial für die Faktor-VII-Präparation verwendeten alle Autoren ein an Bariumcitrat adsorbiertes, Faktor-VII-aktives Material, welches nach Elution direkt verwendet oder von einigen Autoren noch fraktionierter Ammoniumsulfatfällung verwendet wurde.Methods for factor VII preparation have been described by various Au gates described. Factor VII gradually isolated from human or bovine plasma. Used as starting material for factor VII preparation all authors have a factor VII active adsorbed on barium citrate Material used directly after elution or by some Authors still used fractionated ammonium sulfate precipitation has been.
In dem folgenden Text werden die nachstehenden Abkürzungen verwendet:The following abbreviations are used in the following text used:
Abkürzungen:Abbreviations:
DEAE: Diäthylaminoäthyl
EACA: ε-amino-n-Capronsäure
EDTA: Äthylendiamintetraacetat
FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography
HIC: Hydrophobe Interaktions-Chromatography
PEG: Polyäthylenglykol. Mol.-Gewicht 3350
PMSF: Phenylmethansulfonylfluorid
QAE: Quarternäres aminoäthyl
SBTI: Soja-Bohnen-Trypsin-Inhibitor
SDS: Dodecylhydrogensulfat Natriumsalz.DEAE: diethylaminoethyl
EACA: ε- amino-n-caproic acid
EDTA: ethylenediaminetetraacetate
FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography
HIC: Hydrophobic Interaction Chromatography
PEG: polyethylene glycol. Mol. Weight 3350
PMSF: phenylmethanesulfonyl fluoride
QAE: Quaternary aminoethyl
SBTI: Soybean trypsin inhibitor
SDS: Dodecyl hydrogen sulfate sodium salt.
Die Aufreinigung des Materials erfolgte bei den verschiedenen Autoren durch unterschiedliche Verfahren:The cleaning of the material was carried out at the various Authors through different procedures:
Durch Chromatographie an Benzamidin- und Heparin-Agarose und prä parative SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Kiesel, W. and Davie, E. W. Biochem. 14, No. 22, 4928-4934, 1975). Durch Ionen austauschchromatographie an DEAE- und QAE-Sephadex und Gelfiltration an S-100 Sephadex oder ACA 44 (Bronze, G. J. and Majerus, P. W. J. Biol. Chem. 255, 1242-1247, 1980, und Methods of Enzymology 80, 229-236, 1981) bzw. durch präparative SDS-Polyacrylamid Gel elektrophorese (Bajaj, S. P. Rapaport, S. I. and Brown, S. F. J. Biol. Chem. 256, 253-259, 1981). Durch Chromatographie and DEAE- und Sulfopropyl-Sephadex (Rao, L. V. M. and Bejaj, S. P. Analyt. Biochem. 136, 357-361, 1984), oder durch Immunoaffini tätschromatographie und anschließender Gelfiltration an Sephadex- 200 (Bach, R., Oberdick, J. and Nemerson, Y., Blood 63, 393-398, 1984).By chromatography on benzamidine and heparin agarose and pre parative SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Kiesel, W. and Davie, E. W. Biochem. 14, No. 22, 4928-4934, 1975). Through ions exchange chromatography on DEAE and QAE Sephadex and gel filtration to S-100 Sephadex or ACA 44 (bronze, G. J. and Majerus, P. W. J. Biol. Chem. 255, 1242-1247, 1980, and Methods of Enzymology 80, 229-236, 1981) or by preparative SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Bajaj, S.P. Rapaport, S.I. and Brown, S.F. J. Biol. Chem. 256, 253-259, 1981). By chromatography and DEAE and sulfopropyl Sephadex (Rao, L.V. M. and Bejaj, S.P. Analyte. Biochem. 136, 357-361, 1984), or by Immunoaffini chromatography and subsequent gel filtration on Sephadex 200 (Bach, R., Oberdick, J. and Nemerson, Y., Blood 63, 393-398, 1984).
Die erwähnten Verfahren sind zeitaufwendig, umständlich, und füh ren nicht immer zu hochgereinigten Faktor-VII-Präparationen. Außerdem ist die Endreinigung großer Mengen an Faktor VII durch präparative SDS-Gelelektrophorese (Bejaj, S. P., Rapaport, S. I. and Brown, S. F. J. Biol. Chem. 256, 253-259, 1981) technisch nur schwer durchführbar. Ebenfalls ist die Faktor-VII-Reinigung mittels Immunoaffinitätschromatographie (Bach, R., Oberdick, J. and Nemerson, Y. Blood 63, 393-398, 1984) technisch unvorteilhaft, da bei größeren Faktor-VII-Präparationen, stets größere Mengen eines monospezifisch gegen Faktor VII gerichtetes Antiserum vorhanden sein muß. Dieses spezifisch gegen Faktor VII gerichtete Antiserum muß unter Verwendung hochgereinigten Faktor-VII-Antigens konti nuierlich (auch bei Verwendung von monoklonalen Antikörpern) nachproduziert werden, da erfahrungsgemäß Immunoaffinitätssäulen durch Verschmutzung und Inaktivierung nur eine relativ kurze Standzeit haben.The methods mentioned are time consuming, cumbersome, and lead not always to highly purified factor VII preparations. Furthermore is the final cleaning of large quantities of factor VII preparative SDS gel electrophoresis (Bejaj, S. P., Rapaport, S. I. and Brown, S.F. J. Biol. Chem. 256, 253-259, 1981) technically only difficult to carry out. Factor VII cleaning is also possible Immunoaffinity chromatography (Bach, R., Oberdick, J. and Nemerson, Y. Blood 63, 393-398, 1984) technically disadvantageous because with larger factor VII preparations, always larger amounts of one monospecific antiserum directed against factor VII have to be. This specific anti-factor VII antiserum must be continuous using highly purified factor VII antigen Nuclear (even when using monoclonal antibodies) be reproduced, as experience shows that immunoaffinity columns due to pollution and inactivation only a relatively short one Have standing time.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß man den Faktor VII schneller als nach den Verfahren des Standes der Technik, aus menschlichem und tierischem Plasma gewinnen kann. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur schnellen Isolation von Faktor VII aus menschlichem oder tierischem Plasma unter Verwendung hochauflösender Chromatographieschritte mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) gekennzeichnet durch die im Pa tentanspruch wiedergegebenen Maßnahmen.It was surprisingly found that factor VII faster than according to the methods of the prior art human and animal plasma. Subject of Invention is therefore a method for the rapid isolation of Factor VII from human or animal plasma using High-resolution chromatography steps using FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) characterized by the in Pa Measures reproduced.
Ausgangsmaterial für das Isolationsverfahren ist eine Faktor-VII- Präparation, welche durch Adsorption des Faktor VII an Bariumcitrat und nachfolgender Elution durch Polyäthylenglykol konzentriert und an DEAE-Sephadex und Sephadex-200 chromatographiert wird. The starting material for the insulation process is a factor VII Preparation by adsorption of factor VII on barium citrate and subsequent elution by polyethylene glycol and chromatographed on DEAE-Sephadex and Sephadex-200 becomes.
Hochgereinigter Faktor VII kann in kurzen Trennzeiten mit hoher Trennqualität bei Raumtemperatur durch Chromatographie an einem starken Anionenaustauscher mit hoher Kapazität auf Mono Bead- Basis (HPLC/FPLC) Mono Q HR 5/5, gefolgt von einer hochauflösenden hydrophoben Interaktionschromatographie (HPLC/FPLC) an z. B. Phenyl- bzw. Alkyl-SuperoseTH(Pharmacia) oder Hi-Propyl-Wide- PoreTH(Baker) erhalten werden. Die ermittelten Bedingungen können auch bei konventionellen Anionenaustauschern wie z. B. Q- Sepharose Fast Flow (Pharmacia) verwendet werden, wenn größere Probemengen aufgearbeitet werden sollen, keine präparative HPLC- Ionenaustauschersäule "Mono Q"TM-Säule oder z. B. Alkyl-Phenyl- SuperoseTM(Pharmacia) zur Verfügung steht und längere Trennzeiten in Kauf genommen werden können.Highly purified factor VII can be obtained in short separation times with high separation quality at room temperature by chromatography on a strong anion exchanger with high capacity on a mono bead basis (HPLC / FPLC) Mono Q HR 5/5, followed by high resolution hydrophobic interaction chromatography (HPLC / FPLC) e.g. B. Phenyl or alkyl Superose TH (Pharmacia) or Hi-Propyl-Wide-Pore TH (Baker) can be obtained. The conditions determined can also with conventional anion exchangers such. B. Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) can be used if larger sample quantities are to be processed, no preparative HPLC ion exchange column "Mono Q" TM column or z. B. Alkyl-Phenyl-Superose TM (Pharmacia) is available and longer separation times can be accepted.
12 Liter menschlichem Plasma, welches 10 mM an EDTA, EACA, Benzamidin und PMSF war, wird 5 g Natriumcitrat und 60 mg Soja- Bohnen-Trypsin-Inhibitor zugesetzt.12 liters of human plasma containing 10 mM EDTA, EACA, benzamidine and was PMSF, 5 g sodium citrate and 60 mg soy Bean trypsin inhibitor added.
Dem Überstand wird nach 15minütiger Zentrifugation bei 4500 g und 4°C langsam, innerhalb einer Stunde, 960 ml einer 1 molaren Ba riumchloridlösung bei 4°C zugetropft. Das sich unter Rühren bei 4°C bildende Präzipitat wird nach einer Stunde durch 15minütige Zentrifugation bei 4500 g und 4°C abzentrifugiert. Das Präzipitat wird in der Kälte mit einer Lösung, welche 2 mM an Barium chlorid, 200 mM an NaCl, 25 mM an Benzamidin, 1 mM an PMSF, 50 mM an Tris/HCL ist und 300 mg SBTI enthält, bei einem pH von 8,3 2mal gewaschen.The supernatant is centrifuged at 4500 g for 15 minutes 4 ° C slowly, within one hour, 960 ml of a 1 molar Ba rium chloride solution added dropwise at 4 ° C. That with stirring 4 ° C forming precipitate is after one hour by 15 minutes Centrifugation at 4500 g and centrifuged at 4 ° C. The precipitate in the cold with a solution containing 2 mM barium chloride, 200 mM in NaCl, 25 mM in benzamidine, 1 mM in PMSF, 50 mM of Tris / HCL and contains 300 mg SBTI, at a pH of 8.3 twice washed.
Die Elution des an Bariumcitrat adsorbierten Materials wird durch Resuspendierung des Präzipitats mit einer Lösung, welche 200 mM an EDTA, 25 mM an Benzamidin, 1 mM an PMSF, 150 mM an Natriumci trat, 100 mM an Tris/HCL ist und 300 mg SBTI enthält, bei einem pH von 7.4 in der Kälte erreicht.The elution of the material adsorbed on barium citrate is carried out by Resuspend the precipitate with a solution containing 200 mM on EDTA, 25 mM on benzamidine, 1 mM on PMSF, 150 mM on sodium ci occurred, is 100 mM Tris / HCL and contains 300 mg SBTI in one pH reached 7.4 in the cold.
Es wird festes Polyäthylenglykol (MG 3350) unter Rühren bis zu einer Endkonzentration von 4% (w/v) zugefügt und 45 Minuten bei 4°C gerührt. Nach einer 20minütigen Zentrifugation bei 4500 g wird der Bodensatz verworfen und dem Überstand unter Rühren festes PEG bis zu einer Endkonzentration von (35% w/v) zugefügt und nach 60minütigem Rühren bei 4°C, 20 Minuten bei 4500 g zentrifugiert. Der Bodensatz wird mit einer Lösung, welche 100 mM an Natriumphosphat, 1 mM an Benzamidin, 0.5 mM an PMSF ist, bei einem pH-Wert von 6.0 in der Kälte gelöst und gegen den selben Puffer dialysiert. Das dialysierte Material wird an DEAE-Sephadex A-50 (Säule: 4,8 cm×60 cm) adsorbiert, gewaschen und mittels eines linearen Natriumchlorid-Gradienten (150 mM-500 mM NaCl) bei einem pH-Wert von 6.0 chromatographiert.It becomes solid polyethylene glycol (MW 3350) with stirring up to added to a final concentration of 4% (w / v) and at 45 minutes 4 ° C stirred. After centrifugation at 4500 g for 20 minutes the sediment is discarded and the supernatant is stirred solid PEG was added to a final concentration of (35% w / v) and after stirring for 60 minutes at 4 ° C, 20 minutes at 4500 g. The sediment is mixed with a solution containing 100 mM Sodium phosphate, 1 mM of benzamidine, 0.5 mM of PMSF, at a pH of 6.0 dissolved in the cold and against the same Dialyzed buffer. The dialyzed material is sent to DEAE-Sephadex A-50 (column: 4.8 cm × 60 cm) adsorbed, washed and by means of a linear sodium chloride gradient (150 mM-500 mM NaCl) chromatographed at pH 6.0.
Faktor-VII-Aktivität eluiert bei 250 mM NaCl.Factor VII activity elutes at 250 mM NaCl.
Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und mittels eines Ultra filters auf 10 ml konzentriert und angefüllt mit Sephadex-200 (Säure: 2,5 cm×130 cm) in einem Puffer, welcher 50 mM an Tris/HCl pH 8.0, 1 M an NaCl, 1 mM an EDTA und 1 mM an PMSF ist, chromatographiert.The active fractions are collected and using an Ultra filters concentrated to 10 ml and filled with Sephadex-200 (Acid: 2.5 cm × 130 cm) in a buffer containing 50 mM Tris / HCl pH 8.0, 1 M on NaCl, 1 mM on EDTA and 1 mM on PMSF, chromatographed.
Faktor VII enthaltene Proben werden vereinigt, mittels eines Ultra filters konzentriert und nach Dialyse gegen 20 mM Tris/HCl Puffer pH 7.5, welcher 1 mM an Benzamidin ist, an einen starken Anionenaustauscher auf Mono-Bead-Basis (FPLC Mono Q HR 5/5 Phar macia), gebunden und mittels eines in die FPLC-Anlage (Pharmacia) einprogrammierten linearen Natriumchloridgradienten (100 mM NaCl bis 500 mM NaCl) bei einem pH-Wert von 7.5 chromatographiert.Samples containing factor VII are pooled using an Ultra filters concentrated and after dialysis against 20 mM Tris / HCl Buffer pH 7.5, which is 1 mM of benzamidine, to a strong one Mono-bead-based anion exchanger (FPLC Mono Q HR 5/5 Phar macia), bound and by means of a in the FPLC system (Pharmacia) programmed linear sodium chloride gradient (100 mM NaCl up to 500 mM NaCl) at a pH of 7.5.
Faktor-VII-Aktivität eluiert bei 330-350 mM NaCl.Factor VII activity elutes at 330-350 mM NaCl.
(Gesamtchromatographiedauer etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur).(Total chromatography time about 40 minutes at room temperature).
Aktive Fraktionen werden durch Ultrafiltration, konzentriert gegen einen 50-mM-Natriumphosphatpuffer pH 7.0, welche 1.2 M an Ammo niumsulfat und 1 mM an Benzamidin ist, dialysiert und an eine FPLC Phenyl-Superose Säule HR 5/5 (Pharmacia) adsorbiert. Chromatographiert wurde in Natriumphosphatpuffer mittels eines programmierten linearen Ammoniumsulfat/Äthylenglykolgradienten.Active fractions are concentrated by ultrafiltration a 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0, which 1.2 M an Ammo nium sulfate and 1 mM of benzamidine, dialyzed and to an FPLC Phenyl-Superose column HR 5/5 (Pharmacia) adsorbed. Was chromatographed in sodium phosphate buffer using a programmed linear ammonium sulfate / ethylene glycol gradient.
Anfangsbedingungen, Puffer A:Initial conditions, buffer A:
50 mM Natriumphosphat pH 7.0
1.2 M Ammoniumsulfat
1 mM Benzamidin50 mM sodium phosphate pH 7.0
1.2 M ammonium sulfate
1mM benzamidine
Endbedingungen, Puffer B:Final conditions, buffer B:
50 mM Natriumphosphat pH 7.0
0.0 M Ammoniumsulfat/1% v/v Äthylenglykol
1 mM Benzamidin.50 mM sodium phosphate pH 7.0
0.0 M ammonium sulfate / 1% v / v ethylene glycol
1mM benzamidine.
Faktor-VII-Aktivität eluiert bei 100% Puffer B (Gesamtchromato graphiedauer etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur).Factor VII activity elutes at 100% buffer B (total chromato graph duration about 40 minutes at room temperature).
Während des gesamten Faktor-VII-Reinigungsverfahrens wurde nach jedem Reinigungsschritt die Aktivität des erhaltenen Materials durch einen einstufigen Gerinnungstest mittels Faktor-VII-Man gelplasma bestimmt, sowie die chemische Reinheit des Materials durch analytische SDS-Gelelektrophorese mit Silberfärbung der Gele verfolgt.During the entire factor VII purification process, the activity of the material obtained in each cleaning step by a one-step coagulation test using factor VII-Man gel plasma determined, as well as the chemical purity of the material by analytical SDS gel electrophoresis with silver staining Gels chased.
Das bei der hydrophoben Interaktionschromatographie eluierte Material, welches Faktor-VII-Aktivität besitzt, zeigt nur eine Proteinbande mit einem apparenten Molekulargewicht von (50 000) Dalton unter nicht reduzierenden Bedingungen in einem mit Silber gefärbten SDS-Polyacrylamidgel.That eluted in hydrophobic interaction chromatography Material that has factor VII activity shows only one Protein band with an apparent molecular weight of (50,000) Dalton under non-reducing conditions in one with silver stained SDS polyacrylamide gel.
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- 1987-11-30 DE DE19873740520 patent/DE3740520A1/en not_active Withdrawn
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