DE3707227A1 - Quantitative analysis of analyte concn. or enzyme activity in liq. - by photometric determn. of reaction velocity of a coloured prod. formed in presence of analyte or enzyme - Google Patents

Quantitative analysis of analyte concn. or enzyme activity in liq. - by photometric determn. of reaction velocity of a coloured prod. formed in presence of analyte or enzyme

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DE3707227A1 DE19873707227 DE3707227A DE3707227A1 DE 3707227 A1 DE3707227 A1 DE 3707227A1 DE 19873707227 DE19873707227 DE 19873707227 DE 3707227 A DE3707227 A DE 3707227A DE 3707227 A1 DE3707227 A1 DE 3707227A1
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Yoshikazu Amano
Kazuya Kawasaki
Harumi Katsuyama
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Abstract

In the quantitative analysis of the concn. of an analyte or of the activity of an enzyme contained in a liq. sample, the reaction velocity is assayed by the photometric determn. of a coloured prod. which is formed in at least 2 steps in the presence of an analyte or enzyme. In the 1st step (1), a correlation equation is set up between an optical density of a coloured prod., which is measured at the moment To after the starting-time of the reaction, and a value of the decrease of the optical density during the time To and a given time T or an average value of the decrease of the optical density per unit time. At least 2 reference solns. are used, contg. an initial cpd. of the reaction for the analysis or an intermediate prod. in a known concn. or activity. (2) The values of the optical density of a coloured prod., prepd. by the effect of the analyte or of the enzyme in the liq. sample at the time to after the starting-time of the reaction and at the time t after the to, are measured. (3) The value of the optical density at the time to is introduced into the correlation-equation above, so as to calculate value of the variation delta at the time t. (4) The concn. of the analyte or the activity of the enzyme in the liq. sample is determined quantitatively by an assay of the reaction velocity. The value delta above is used as correlation-value for varying the optical density between twofold measurement in step (2), to and to + t. USE - The determn. of the concn. or of the activity of a specific component in a liq. sample, e.g. blood, is important in clinical tests. E.g. the enzyme activity value of blood can be used to localise a diseased position and the extent of the illness. The determn. of the concns. of amino-transferase and aspartite-transferase in blood is useful for the diagnosis of liver diseases.

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur quantitativen Analyse der Konzentration eines Analyten bzw. eines zu bestimmenden Stoffes oder der Aktivität eines Enzyms, der bzw. das in einer flüssigen Probe enthalten ist, durch photometrische Bestimmung eines gefärbten Produkts, das durch Reaktion in Gegenwart eines Analyten bzw. eines zu bestimmenden Stoffes erzeugt wird.The invention relates to an improved method for quantitative Analysis of the concentration of an analyte or one substance to be determined or the activity of an enzyme, contained in a liquid sample photometric determination of a colored product, the by reaction in the presence of an analyte or one to be determined Is produced.

Die Bestimmung der Konzentration oder der Aktivität einer spezifischen Komponente in einer flüssigen Probe, wie Blut, ist bei klinischen Tests von besonderer Wichtigkeit. So wird zum Beispiel der Wert der Enzymaktivität von Blut dazu verwendet, eine erkrankte Stelle zu lokalisieren und das Ausmaß der Erkrankung abzuschätzen.Determining the concentration or activity of a specific component in a liquid sample, such as blood, is of particular importance in clinical tests. So for example, the value of the enzyme activity of blood used to locate a diseased area and that Assess the extent of the disease.

In großem Ausmaß wird ein Verfahren zur quantitativen Analyse der Konzentration eines Analyten bzw. eines zu bestimmenden Stoffes oder der Aktivität eines Enzyms, der bzw. das in einer flüssigen Probe enthalten ist, durch photometrische Bestimmung eines gefärbten Produkts, das durch Reaktion in Gegenwart eines Analyten erzeugt wird, angewendet. Reagenzien, die dazu imstande sind, gefärbte Produkte in Gegenwart eines Analyten (mit Einschluß von Enzymen) zu erzeugen, d. h. Farbindikatoren, werden in mehrere Gruppen eingeordnet. Unter diesen ist ein Leukofarbstoff, d. h. eine Substanz, die durch Einwirkung von in Gegenwart eines Analyten gebildeten Hydroperoxids eine Farbe entwickelt, von besonderem Wert, und zwar insbesondere zur Analyse von Analyten, die normale Werte mit niedrigem Niveau, zum Beispiel von Enzymen, zeigen. Dies deswegen, weil der aus dem Leukofarbstoff gebildete Farbstoff einen relativ hohen Absorptionskoeffizienten ergibt. Ein Farbindikator dieser Art hat aber den Nachteil, daß der erzeugte Farbstoff instabil ist und während der Meßperiode leicht verblaßt. Dieses Verblassen des Farbstoffs gibt einen negativen Fehler, wodurch die Genauigkeit der Analyse bei der Bestimmung der Enzymaktivität aufgrund eines Assays der Reaktionsgeschwindigkeit herabgesetzt wird.To a large extent, a method for quantitative analysis the concentration of an analyte or one to be determined Substance or the activity of an enzyme that contained in a liquid sample by photometric Determination of a colored product by reaction generated in the presence of an analyte. Reagents, who are able to present colored products generate an analyte (including enzymes), d. H. Color indicators are classified into several groups. Under this is a leuco dye, i.e. H. a substance by Exposure to hydroperoxide formed in the presence of an analyte developed a color, of particular value, and especially for analyzing analytes, the normal values with a low level, for example of enzymes. This is because the one formed from the leuco dye Dye gives a relatively high absorption coefficient. However, a color indicator of this type has the disadvantage that the dye produced is unstable and during the measurement period  slightly faded. This fading of the dye gives a negative error, reducing the accuracy of the Analysis when determining enzyme activity based on a Assays of the reaction rate is reduced.

Der Assay der Reaktionsgeschwindigkeit umfaßt die Messung von Veränderungen, die durch die Reaktion erzeugt werden, zum Beispiel der Veränderung der optischen Dichte eines Farbindikators in konstanten Intervallen, beispielsweise alle zehn Sekunden, und den Erhalt der Konzentration oder Aktivität unter Verwendung einer Eichkurve, die zuvor unter Verwendung einer Referenzlösung mit bekannter Konzentration oder Aktivität des Analyten bzw. des zu bestimmenden Stoffes hergestellt worden ist.The reaction rate assay involves measurement of changes created by the reaction for example the change in the optical density of a color indicator at constant intervals, for example all ten seconds, and maintaining concentration or activity using a calibration curve previously using a reference solution with a known concentration or activity of the analyte or of the substance to be determined has been manufactured.

Zum quantitativen Assay von Komponenten, die in Körperflüssigkeiten enthalten sind, insbesondere zum Assay der Aktivität eines Enzyms, wird im allgemeinen der Assay der Reaktionsgeschwindigkeit angewendet. Beispiele für Enzyme, die für den Geschwindigkeitsassay geeignet sind, sind Lipase, Amylase, γ-Glutamyl-Transpeptidase (GGT), alkalische Phosphatase (ALP), Alanin-Aminotransferase (ALT), Aspartat-Transferase (AST), Kreatin-Kinase (CPK), Lactat-Dehydrogenase (LDH) und Colin-Esterase (CLE). Der Assay der Reaktionsgeschwindigkeit kann auch auf andere Analyten als Enzyme angewendet werden. So werden beispielsweise Analysen von Glucose und Harnstoffstickstoff durch den Assay der Geschwindigkeit in CELALIZER (Warenzeichen, Ames Corp., USA) durchgeführt.For the quantitative assay of components in body fluids are included, especially for assaying the activity of an enzyme, is generally used to assay the rate of reaction applied. Examples of enzymes that suitable for the speed assay are lipase, Amylase, γ-glutamyl transpeptidase (GGT), alkaline phosphatase (ALP), alanine aminotransferase (ALT), aspartate transferase (AST), creatine kinase (CPK), lactate dehydrogenase (LDH) and Colin Esterase (CLE). The reaction rate assay can also be applied to analytes other than enzymes will. For example, analyzes of glucose and urea nitrogen by the assay of speed in CELALIZER (trademark, Ames Corp., USA).

Der Assay bzw. die Bestimmung der Konzentrationen von ALT und AST in Blut ist für die Diagnose von Lebererkrankungen von Wert. Die Aktivität von ALT wird durch die Stufen der Herstellung von Brenztraubensäure durch Reaktion eines Substrats und ALT, der Erzeugung von Hydroperoxid durch Umsetzung der gebildeten Brenztraubensäure und Pyruvatoxidase und der Messung einer Farbe eines Farbindikators, die in Antwort auf Hydroperoxid in Gegenwart von Peroxidase erzeugt wird, bestimmt. Die Aktivität von AST wird durch die Stufen der Herstellung von Oxaloessigsäure, wobei als Substrat Asparaginsäure und α-Ketoglutarsäure verwendet wird, die Umwandlung der Oxaloessigsäure in Brenztraubensäure und der Behandlung der Brenztraubensäure in der gleichen Weise zur Analyse von ALT bestimmt.The assay or the determination of the concentrations of ALT and AST in blood is for the diagnosis of liver disease Value. The activity of ALT is determined by the stages of manufacture of pyruvic acid by reaction of a substrate and ALT, the production of hydroperoxide by reaction the pyruvic acid and pyruvate oxidase formed and  measuring a color of a color indicator in response on hydroperoxide in the presence of peroxidase is generated. The activity of AST is determined by the Stages of the production of oxaloacetic acid, using as a substrate Aspartic acid and α-ketoglutaric acid is used the conversion of oxaloacetic acid into pyruvic acid and treating pyruvic acid in the same way destined for analysis of ALT.

Bei der Analyse der oben schriebenen Methoden gibt die dem Blut eigene Brenztraubensäure (d. h. die ursprünglich im Blut enthaltene Brenztraubensäure) zusätzlich zu der Farbe, die durch die analytische Reaktion erzeugt wird, ebenfalls eine Färbung. Die Farbbildung, die durch die Anwesenheit der bluteigenen Brenztraubensäure bewirkt wird, terminiert vor der Farbbildung, die durch Wirkung von ALT bewirkt wird. Man geht daher davon aus, daß die auf die bluteigene Brenztraubensäure zurückzuführende Farbbildung die Farbbildung, die durch die Gegenwart von ALT bewirkt wird, nur in einem geringen Ausmaß beeinflußt. Es ist jedoch bestätigt worden, daß die bluteigene Brenztraubensäure die Farbbildung, die durch die Gegenwart von ALT bewirkt wird, nicht in einem geringen Ausmaß beeinflußt, sondern die Farbbildung, wie in dem System beobachtet wird, tatsächlich vermindert. Dies ist vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen, daß, da das Ausmaß des Verblassens des Farbstoffs von der Gesamtmenge des erzeugten Farbstoffs abhängt, das Verblassen in der Stufe der Messung der Reaktionsgeschwindigkeit in dem Fall hoch ist, in dem die Gesamtmenge des Farbstoffs groß ist, im Vergleich zu dem Fall, in dem die bluteigene Brenztraubensäure fehlt oder nur in geringer Menge vorhanden ist.When analyzing the methods described above, this gives the Blood's own pyruvic acid (i.e. the one originally found in Blood-containing pyruvic acid) in addition to the color, generated by the analytical reaction, too a coloring. The color formation caused by the presence of the blood's own pyruvic acid is terminated before the color formation caused by the effect of ALT. It is therefore assumed that the on the blood's own pyruvic acid color formation to be returned the color formation, caused by the presence of ALT, only in one influenced to a small extent. However, it has been confirmed that the blood's own pyruvic acid causes the color formation, the caused by the presence of ALT, not in a small amount Extent affected, but the color formation, as in observed in the system is actually diminished. This is probably due to the fact that since the extent of the dye fading from the total amount of generated dye depends on the fading in the stage the measurement of the reaction speed in the case high in which the total amount of the dye is large in comparison to the case where the blood's own pyruvic acid missing or only available in small quantities.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine verbesserte Methode zur quantitativen Analyse der Konzentration eines Analyten bzw. eines zu bestimmenden Stoffes oder der Aktivität eines Enzyms, der bzw. das in einer flüssigen Probe enthalten ist, auf der Basis des Assays der Reaktionsgeschwindigkeit durch photometrische Bestimmung eines gefärbten Produkts zur Verfügung zu stellen, wobei das gefärbte Produkt durch Reaktion in mindestens zwei Stufen in Gegenwart des Analyten bzw. des zu bestimmenden Stoffes oder des Enzyms erzeugt wird. Bei dem angestrebten Analysenverfahren soll der negative Fehler, der auf eine Variierung oder ein Verblassen des Farbstoffs im Lauf der Zeit zurückzuführen ist, vermindert sein.The object of the invention is therefore an improved method for quantitative analysis of the concentration of an analyte or a substance to be determined or the activity of a Enzyme contained in a liquid sample  based on the reaction rate assay photometric determination of a colored product is available to put, the colored product by reaction in at least two stages in the presence of the analyte or of the substance or enzyme to be determined. In the desired analytical method, the negative Failure due to variation or fading of the dye can be reduced over time.

Durch die Erfindung soll weiterhin ein verbessertes Verfahren zur quantitativen Analyse der Enzymaktivität in einer flüssigen Probe auf der Basis der Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit durch photometrische Bestimmung eines gefärbten Produkts zur Verfügung gestellt werden, welches gefärbte Produkt durch Reaktion in mindestens zwei Stufen in Gegenwart eines Enzyms auf dem Weg über Brenztraubensäure erzeugt wird.The invention is also intended to provide an improved method for quantitative analysis of enzyme activity in one liquid sample based on the determination of the reaction rate by photometric determination of a colored Product which is colored Product by reaction in at least two stages in the presence of an enzyme produced on the way via pyruvic acid becomes.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur quantitativen Analyse der Konzentration eines Analyten oder der Aktivität eines Enzyms, der bzw. das in einer flüssigen Probe enthalten ist, auf der Grundlage eines Assays der Reaktionsgeschwindigkeit durch photometrische Bestimmung eines gefärbten Produkts, das durch Reaktion in mindestens zwei Stufen in Gegenwart eines Analyten oder Enzyms erzeugt wird, gelöst, das durch folgende Stufen gekennzeichnet ist:This object is achieved by a method for quantitative analysis of the concentration of an analyte or the activity of an enzyme in a liquid Sample is included, based on an assay of Reaction rate by photometric determination of a colored product by reaction in at least two stages are generated in the presence of an analyte or enzyme is solved, which is characterized by the following stages:

  • (1) Herstellung einer Korrelationsgleichung zwischen einer optischen Dichte eines gefärbten Produkts, die zum Zeitpunkt T 0 nach der Startzeit der Reaktion gemessen worden ist, und einem Wert der Abnahme der optischen Dichte während der Zeit T 0 und einer gegebenen Zeit T oder einem mittleren Wert der Verminderung der optischen Dichte pro Zeiteinheit, wobei mindestens zwei Referenzlösungen verwendet werden, die eine Ausgangsverbindung der Reaktion für die Analyse oder ein Zwischenprodukt in einer bekannten Konzentration oder Aktivität enthalten, (1) Establishing a correlation equation between an optical density of a colored product measured at time T 0 after the start time of the reaction and a value of the decrease in optical density during time T 0 and a given time T or an average value the reduction in optical density per unit time, using at least two reference solutions containing a starting compound of the reaction for analysis or an intermediate in a known concentration or activity,
  • (2) Messung der Werte der optischen Dichte eines gefärbten Produkts, hergestellt durch Einwirkung des Analyten oder des Enzyms in der flüssigen Probe zur Zeit t 0 nach der Startzeit der Reaktion und zur Zeit t nach der Zeit t 0, und(2) measurement of the optical density values of a colored product prepared by the action of the analyte or the enzyme in the liquid sample at time t 0 after the start time of the reaction and at time t after the time t 0 , and
  • (3) Einführung des Wertes der optischen Dichte zur Zeit t 0 in die obige Korrelationsgleichung, um einen Wert der Variation Δ zur Zeit t zu errechnen,(3) introducing the value of the optical density at time t 0 into the above correlation equation to calculate a value of the variation Δ at time t ,
  • (4) quantitative Bestimmung der Konzentration des Analyten oder der Aktivität des Enzyms in der flüssigen Probe auf der Basis eines Assays der Reaktionsgeschwindigkeit, wobei der obige Wert Δ als Korrelationswert für die Variierung der optischen Dichte zwischen zweifacher Messung in Stufe (2), t 0 und t 0 + t verwendet wird.(4) quantitative determination of the concentration of the analyte or the activity of the enzyme in the liquid sample on the basis of an assay of the reaction rate, the above value Δ being the correlation value for the variation of the optical density between two measurements in step (2), t 0 and t 0 + t is used.

Durch die Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur quantitativen Analyse der Konzentration eines Analyten bzw. eines zu bestimmenden Stoffes oder der Aktivität eines Enzyms, der bzw. das in einer flüssigen Probe enthalten ist, aufgrund der Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit durch photometrische Bestimmung eines gefärbten Produkts, das durch Umsetzung in mindestens zwei Stufen in Gegenwart eines Analyten oder Enzyms erzeugt worden ist, zur Verfügung gestellt, das durch die folgenden Stufen gekennzeichnet ist:The invention also provides a method for quantitative Analysis of the concentration of an analyte or one substance to be determined or the activity of an enzyme which or that is contained in a liquid sample due to the determination of the reaction rate by photometric Determination of a colored product by implementation in at least two stages in the presence of an analyte or enzyme has been generated, characterized by the following levels:

  • (1) Herstellung einer Korrelationsgleichung zwischen einer optischen Dichte eines gefärbten Produkts, die zum Zeitpunkt T 0 nach der Startzeit der Reaktion gemessen worden ist, und einem Wert der Abnahme der optischen Dichte während der Zeit T 0 und einer gegebenen Zeit T oder einem mittleren Wert der Verminderung der optischen Dichte pro Zeiteinheit, wobei mindestens zwei Referenzlösungen verwendet werden, die eine Ausgangsverbindung der Reaktion für die Analyse oder ein Zwischenprodukt in einer bekannten Konzentration oder Aktivität enthalten,(1) Establishing a correlation equation between an optical density of a colored product measured at time T 0 after the start time of the reaction and a value of the decrease in optical density during time T 0 and a given time T or an average value the reduction in optical density per unit time, using at least two reference solutions containing a starting compound of the reaction for analysis or an intermediate in a known concentration or activity,
  • (2) Messung der Werte der optischen Dichte eines gefärbten Produkts, hergestellt durch Einwirkung des Analyten oder des Enzyms in der flüssigen Probe zur Zeit T 0 nach der Startzeit der Reaktion und zur Zeit t nach der Zeit T 0, und(2) measurement of the optical density values of a colored product prepared by the action of the analyte or the enzyme in the liquid sample at time T 0 after the start time of the reaction and at time t after the time T 0 , and
  • (3) Einführung des Wertes der optischen Dichte zur Zeit T 0 in die obige Korrelationsgleichung, um einen Wert der Variation Δ zur Zeit t zu errechnen,(3) introducing the value of the optical density at time T 0 into the above correlation equation to calculate a value of the variation Δ at time t ,
  • (4) quantitative Bestimmung der Konzentration des Analyten oder der Aktivität des Enzyms in der flüssigen Probe auf der Basis eines Assays der Reaktionsgeschwindigkeit, wobei der obige Wert Δ als Korrelationswert für die Variierung der optischen Dichte zwischen zweifacher Messung in Stufe (2), T 0 und T 0 + t verwendet wird.(4) quantitative determination of the concentration of the analyte or the activity of the enzyme in the liquid sample on the basis of an assay of the reaction rate, the above value Δ being the correlation value for the variation of the optical density between two measurements in step (2), T 0 and T 0 + t is used.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:The invention will become more apparent from the accompanying drawings explained; show it:

Fig. 1 ein Diagramm, das ein Beispiel für eine Korrelationskurve angibt, und Fig. 1 is a diagram indicating an example of a correlation curve, and

Fig. 2 ein Diagramm mit Beispielen für Eichkurven. Fig. 2 is a diagram with examples of calibration curves.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Bestimmung der Aktivität von ALT durch die Stufen der Erzeugung von Brenztraubensäure durch Reaktion eines Substrats mit ALT, die Erzeugung von Hydroperoxid durch Umsetzung der so gebildeten Brenztraubensäure und Pyruvatoxidase und Messung der Färbung eines Farbindikators, die in Ansprechung auf das Hydroperoxid im allgemeinen in Gegenwart von Peroxidase erzeugt worden ist, angewendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch auf die Bestimmung der Aktivität von AST durch die Stufen der Erzeugung von Oxaloessigsäure, wobei als Substrat Asparaginsäure und α-Ketoglutarsäure verwendet werden, der Umwandlung der Oxaloessigsäure in Brenztraubensäure und Behandlung der Brenztraubensäure in der oben beschriebenen Weise zur Analyse von ALT geeignet.The method according to the invention can be used to determine the activity of ALT through the stages of pyruvic acid production by reacting a substrate with ALT, the generation of hydroperoxide by reacting the so formed Pyruvic acid and pyruvate oxidase and measurement of the color a color indicator in response to the hydroperoxide generally produced in the presence of peroxidase has been applied. The method according to the invention is also based on determining the activity of AST the stages of production of oxaloacetic acid, using as a substrate Aspartic acid and α-ketoglutaric acid can be used the conversion of oxaloacetic acid into pyruvic acid and Treatment of pyruvic acid in the above described Suitable for analyzing ALT.

Die oben beschriebene Reaktion in mindestens zwei Stufen bedeutet, bezogen auf die oben erwähnte Bestimmung der Aktivität von ALT, folgendes:The above-described reaction in at least two stages means based on the above-mentioned determination of the activity from ALT, the following:

  • (1) eine Stufe der Erzeugung von Brenztraubensäure durch Reaktion eines Substrats von ALT,(1) a stage of pyruvic acid production Reaction of a substrate from ALT,
  • (2) eine Stufe der Erzeugung von Hydroperoxid durch Wirkung der erzeugten Brenztraubensäure und Pyruvatoxidase und(2) a step of hydroperoxide generation by action the pyruvic acid and pyruvate oxidase produced and
  • (3) eine Stufe der Entwicklung eines Farbindikators in Ansprechung auf das Hydroperoxid in Gegenwart von Peroxidase.(3) a stage of developing a color indicator in Response to hydroperoxide in the presence of peroxidase.

Bezogen auf die Bestimmung der Aktivität von AST, kann die Reaktion in mindestens zwei Stufen wie folgt beschrieben werden:Based on the determination of the activity of AST, the Reaction described in at least two stages as follows will:

  • (1) eine Stufe der Erzeugung von Oxaloessigsäure, wobei als Substrat Asparaginsäure und α-Ketoglutarsäure verwendet werden,(1) a step of generating oxaloacetic acid, where aspartic acid and α-ketoglutaric acid used as substrate will,
  • (2) eine Stufe der Umwandlung der Oxaloessigsäure in Brenztraubensäure,(2) a step of converting oxaloacetic acid to Pyruvic acid,
  • (3) eine Stufe der Erzeugung von Hydroperoxid durch Wirkung der erzeugten Brenztraubensäure und von Pyruvatoxidase und(3) a step of producing hydroperoxide by action the pyruvic acid produced and pyruvate oxidase and
  • (4) eine Stufe der Entwicklung eines Farbindikators in Ansprechung auf das Hydroperoxid in Gegenwart von Peroxidase.(4) a stage of developing a color indicator in Response to hydroperoxide in the presence of peroxidase.

Bei der Messung der Aktivität von ALT oder AST kann das Zwischenprodukt, das in Stufe (1) verwendet wird (welches in der Referenzlösung enthalten ist), Brenztraubensäure oder Hydroperoxid sein. Brenztraubensäure wird bevorzugt, da sie in Form von stabilen Kristallen verfügbar ist. When measuring the activity of ALT or AST, the intermediate, used in step (1) (which in of the reference solution), pyruvic acid or Be hydroperoxide. Pyruvic acid is preferred as it is available in the form of stable crystals.  

Die in Stufe (1) verwendete Referenzlösung wird vorzugsweise so hergestellt, daß sie Viskositäts- und andere Eigenschaften hat, die denjenigen der flüssigen Probe ähnlich sind. So wird zum Beispiel die Referenzlösung in Form einer Proteinlösung (zum Beispiel Albuminlösung) hergestellt, wenn die flüssige Probe eine Körperflüssigkeit ist.The reference solution used in step (1) is preferred Manufactured to have viscosity and other properties which is similar to that of the liquid sample are. For example, the reference solution is in the form of a Protein solution (for example albumin solution) made when the liquid sample is a body fluid.

In Stufe (1) werden mindestens zwei Referenzlösungen verwendet, die sich voneinander hinsichtlich der Konzentration unterscheiden. Die Anzahl der Referenzlösungen wird vorzugsweise erhöht, um die Verläßlichkeit der Korrelationsgleichung der Stufe (2) zu erhöhen.In stage (1) at least two reference solutions are used, that differ from each other in terms of concentration. The number of reference solutions is preferred increases the reliability of the correlation equation to increase the level (2).

Im Falle der Verwendung eines Trockenanalysenelements wird die Referenzlösung vorzugsweise in einer Menge in einem Bereich, der durch die Natur des Elements definiert wird, vorzugsweise in der gleichen Menge wie die flüssige Probe, beim praktischen Meßvorgang fleckförmig aufgetragen. Die Meßbedingungen, wie Temperatur, Meßvorrichtung etc., werden vorzugsweise dahingehend konditioniert, daß sie im wesentlichen mit den tatsächlichen analytischen Bedingungen übereinstimmen.In the case of using a dry analysis element the reference solution preferably in an amount in a range, which is defined by the nature of the element, preferably in the same amount as the liquid sample practical measuring process applied in spots. The measurement conditions, such as temperature, measuring device etc. are preferred conditioned to be essentially agree with the actual analytical conditions.

In Stufe (1) wird die Zeit T 0 vorzugsweise so eingestellt, daß sie mit der Zeit identisch ist, wenn eine erste Messung eines gefärbten Produkts bei tatsächlichen Messungen durchgeführt wird.In step (1) the time T 0 is preferably set so that it is identical to the time when a first measurement of a colored product is carried out on actual measurements.

Hinsichtlich der Bildung der Korrelationsgleichung bestehen keine speziellen Beschränkungen. Die Korrelationsgleichung wird vorzugsweise in Form einer Funktion oder einer algebraischen Funktion der mittleren Verminderung der optischen Dichte pro Zeiteinheit (zum Beispiel Δ OD/min) während der Zeit T 0 und der späteren Zeit T ausgedrückt. Die Funktion wird in Form einer sekundären bis quinären Funktion bevorzugt. Ansonsten kann die Funktion in der Form einer Exponential- oder logarithmischen Funktion sein. There are no special restrictions on the formation of the correlation equation. The correlation equation is preferably expressed in the form of a function or an algebraic function of the average reduction in optical density per unit time (for example Δ OD / min) during the time T 0 and the later time T. The function is preferred in the form of a secondary to quinary function. Otherwise, the function can be in the form of an exponential or logarithmic function.

Die Messung in Stufe (2) erfolgt durch Bestimmung der optischen Dichte zur Startzeit t 0 der Reaktion und der Zeit t 0 + t unter den Bedingungen, daß die Reaktionslösung oder das Trockenanalysenelement in einen Inkubator mit konstanter Temperatur, vorzugsweise im Bereich von ±0,2°C, eingebracht wird. Der Inkubator und die photometrische Meßvorrichtung können kombiniert werden, um eine integrale Vorrichtung zu bilden.The measurement in stage (2) is carried out by determining the optical density at the start time t 0 of the reaction and the time t 0 + t under the conditions that the reaction solution or the dry analysis element is placed in an incubator at constant temperature, preferably in the range of ± 0, 2 ° C, is introduced. The incubator and photometric measuring device can be combined to form an integral device.

Der Wert der optischen Durchlässigkeitsdichte oder der optischen Reflexionsdichte zur Zeit t 0 nach der Zugabe oder fleckförmig erfolgenden Aufbringung einer flüssigen Probe, die einen Analyten enthält, oder einer Referenzlösung, die den gleichen Analyten enthält (zum Beispiel eines Kontrollserums), wird in die oben genannte Korrelationsgleichung eingeführt, um die Verminderung der optischen Dichte zur Zeit t 0 + t zu erhalten. In dem Fall, daß die Korrelationsgleichung in Form einer Funktion der mittleren Verminderung der optischen Dichte pro Zeiteinheit (zum Beispiel Δ OD/min) während der Zeit T 0 und der späteren Zeit T vorliegt, wird der Wert erhalten, indem man (Δ OD/min) · t verwendet.The value of the optical transmittance density or the optical reflection density at time t 0 after the addition or spotting of a liquid sample containing an analyte or a reference solution containing the same analyte (e.g., a control serum) is given in the above Correlation equation introduced to obtain the reduction in optical density at time t 0 + t . In the event that the correlation equation is in the form of a function of the average reduction in optical density per unit time (for example, Δ OD / min) during time T 0 and the later time T , the value is obtained by ( Δ OD / min) · t used.

Es besteht keine Notwendigkeit, daß die Zeit T 0 in Stufe (1) und die Zeit t 0 in Stufe (2) gleich sind. Jedoch genügen vorzugsweise die Zeiten den folgenden Bedingungen: T 0 ≦ t 0 ≦ωτ T 0 + T. Die Zeit T 0 + t in Stufe (1) und die Zeit t 0 + t genügen vorzugsweise den folgenden Bedingungen: t 0 + t ≦ T 0 + T. Die am meisten bevorzugte Bedingung ist wie folgt: T 0 = t 0, T 0 + T ≦ t 0 + t.There is no need for the time T 0 in stage (1) and the time t 0 in stage (2) to be the same. However, the times preferably satisfy the following conditions: T 0 ≦ t 0 ≦ ωτ T 0 + T. The time T 0 + t in stage (1) and the time t 0 + t preferably satisfy the following conditions: t 0 + t ≦ T 0 + T. The most preferred condition is as follows: T 0 = t 0 , T 0 + T ≦ t 0 + t .

Bei der Bestimmung der Enzymaktivität wird die Eichkurve im allgemeinen dadurch hergestellt, daß die Werte der Enzymaktivität gegen die Werte der optischen Dichte, die bei einem gefärbten Produkt (zum Beispiel einem Farbstoff) gemessen werden, aufgetragen werden. Die Eichkurve kann erstellt werden, indem man zwei oder mehr Referenzlösungen verwendet, die einen Wert der Enzymaktivität haben, der durch eine Standardanalyse auf der Basis eines Standardnaßsystems bestimmt worden ist, indem man die Lösungen zu einer Reagenzlösung oder umgekehrt gibt oder die Lösungen auf ein trockenes analytisches Element fleckförmig aufbringt, photometrisch mindestens zweimal in einem geeigneten Intervall (t) der gebildeten Färbungen mißt und die Veränderung der optischen Dichte oder eine mittlere Veränderung der optischen Dichte pro Zeiteinheit erhält.When determining enzyme activity, the calibration curve is generally established by plotting enzyme activity values against optical density values measured on a colored product (e.g. a dye). The calibration curve can be created using two or more reference solutions that have a level of enzyme activity determined by standard analysis based on a standard wet system, by adding the solutions to a reagent solution or vice versa, or the solutions to a dry one applies the analytical element in spots, measures photometrically at least twice in a suitable interval ( t ) of the colorations formed and receives the change in optical density or an average change in optical density per unit of time.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Korrelationswert für die auf die obige Weise gemessenen Werte der optischen Dichte erstellt, wobei die in Stufe (1) erstellte Korrelationsgleichung verwendet wird. Der Korrelationswert wird sodann in die oben erwähnte Veränderung der optischen Dichte oder die mittlere Veränderung der optischen Dichte pro Zeiteinheit eingeführt, um die Werte in entsprechender Weise in Beziehung zu setzen. Die Eichkurve wird sodann erstellt, wobei die Enzymaktivität der Referenzlösung und die so in Beziehung gebrachte Veränderung der optischen Dichte oder der mittleren optischen Dichte pro Zeiteinheit in Betracht gezogen werden. Bei diesem Vorgehen werden mindestens zwei Referenzlösungen mit voneinander unterschiedlichen Konzentrationen verwendet. Für die Erhöhung der Verläßlichkeit der Eichkurve wird vorzugsweise die Anzahl der Referenzlösungen erhöht.When carrying out the method according to the invention a correlation value for those measured in the above manner Optical density values are created, whereby those in step (1) created correlation equation is used. The correlation value will then change to the above mentioned change in optical density or the mean change in optical Density per unit of time introduced to the values in corresponding Way to relate. The calibration curve is then created, taking the enzyme activity of the reference solution and the change in optical so related Density or the average optical density per unit of time be considered. With this procedure, at least two reference solutions with different ones Concentrations used. For increasing reliability the calibration curve is preferably the number of Reference solutions increased.

Die Referenzlösung, die zur Erstellung der Eichkurve herangezogen wird, wird vorzugsweise so hergestellt, daß sie Viskositäts- und andere Eigenschaften hat, die denjenigen der flüssigen Probe ähnlich sind. So wird beispielsweise die Referenzlösung in Form einer Proteinlösung (zum Beispiel Albuminlösung) hergestellt, wenn die flüssige Probe eine Körperflüssigkeit ist. Die Referenzlösung kann leicht aus einer im Handel erhältlichen Standardenzymprobe hergestellt werden. Humanserum ist gleichfalls geeignet. Die Messung kann durch Bestimmung der optischen Dichte zum Startzeitpunkt der Reaktion t 0 und zum Zeitpunkt t 0 + t bei den Bedingungen erfolgen, daß die Reaktionslösung oder das trockene analytische Element beispielsweise in einem Inkubator mit konstanter Temperatur, vorzugsweise im Bereich von ±0,2°C, eingebracht werden. Der Inkubator und die photometrische Meßvorrichtung können unter Bildung einer integralen bzw. einteiligen Vorrichtung kombiniert werden.The reference solution used to create the calibration curve is preferably made to have viscosity and other properties similar to those of the liquid sample. For example, the reference solution is prepared in the form of a protein solution (for example albumin solution) if the liquid sample is a body fluid. The reference solution can be easily prepared from a commercially available standard enzyme sample. Human serum is also suitable. The measurement can be carried out by determining the optical density at the start time of the reaction t 0 and at the time t 0 + t under the conditions that the reaction solution or the dry analytical element, for example in an incubator with a constant temperature, preferably in the range of ± 0.2 ° C. The incubator and the photometric measuring device can be combined to form an integral or one-piece device.

Im Falle der Verwendung eines trockenen analytischen Elements wird die Referenzlösung vorzugsweise in einer Menge in einem Bereich, der durch die Natur des analytischen Elements definiert wird, vorzugsweise in der gleichen Menge wie die Flüssigkeitsprobe, beim praktischen Meßvorgang fleckförmig aufgebracht. Die Meßbedingungen, beispielsweise hinsichtlich Temperatur, Meßvorrichtung etc., werden vorzugsweise so eingestellt, daß sie mit den tatsächlichen analytischen Bedingungen übereinstimmen.In case of using a dry analytical element the reference solution is preferably in an amount in an area determined by the nature of the analytical element is defined, preferably in the same amount like the liquid sample, spotted in the practical measuring process upset. The measurement conditions, for example with regard to Temperature, measuring device etc. are preferred set to match the actual analytical Conditions match.

Die erste Meßzeit zwischen den mindestens zwei vorgesehenen Meßvorgängen wird vorzugsweise so eingestellt, daß sie mit der Zeit identisch ist, wenn eine erste Messung eines gefärbten Produkts bei tatsächlichen Messungen durchgeführt wird, und sie wird weiterhin so eingestellt, daß sie mit der Zeit T 0, die in Stufe (1) eingestellt wird, identisch ist.The first measuring time between the at least two intended measuring processes is preferably set so that it is identical to the time when a first measurement of a colored product is carried out on actual measurements, and it is further set so that it takes place with the time T 0 , which is set in stage (1) is identical.

Hinsichtlich der Form der Korrelationsgleichung bestehen keine speziellen Begrenzungen. Die Korrelationsgleichung wird vorzugsweise in der Form einer Funktion, vorzugsweise in Form einer algebraischen Funktion, der Enzymaktivität in Kombination mit der mittleren Veränderung der optischen Dichte pro Zeiteinheit (zum Beispiel Δ OD/min) während der Zeit T 0 und der späteren Zeit T ausgedrückt, welche entsprechend der vorliegenden Erfindung korrigiert wird. Die Funktion liegt vorzugsweise in einer Form, ausgewählt aus sekundären bis quinären Funktionen, vor. Ansonsten kann die Funktion in Form einer exponentiellen Funktion oder einer logarithmischen Funktion vorliegen.There are no special restrictions on the form of the correlation equation. The correlation equation is preferably expressed in the form of a function, preferably in the form of an algebraic function, of the enzyme activity in combination with the mean change in the optical density per unit time (for example Δ OD / min) during the time T 0 and the later time T , which is corrected according to the present invention. The function is preferably in a form selected from secondary to quinary functions. Otherwise, the function can be in the form of an exponential function or a logarithmic function.

Die Korrelationsgleichung und/oder die Eichkurve können in einer Meßvorrichtung (d. h. Analysator) gedächtnishaft gespeichert werden.The correlation equation and / or the calibration curve can be in a measuring device (i.e. analyzer) stored in memory will.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.The invention is illustrated in the examples.

Beispiel 1example 1

Auf einen farblosen transparenten Polyethylenterephthalatfilm (Dicke: 180 µm) mit einer Gelatineunterschicht wurde in einer Menge von 156 ml/m2 eine wäßrige Lösung der folgenden Zusammensetzung (a) aufgeschichtet und getrocknet, um eine Reagenzschicht zu bilden, die eine Dicke nach dem Trocknen von 15 µm hatte.On a colorless transparent polyethylene terephthalate film (thickness: 180 µm) with a gelatin subbing layer in an amount of 156 ml / m 2, an aqueous solution of the following composition (a) was coated and dried to form a reagent layer having a thickness after drying 15 µm.

Zusammensetzung (a):Composition (a):

Gelatine190 g Oberflächenaktives Mittel
(Oberflächenaktives Mittel 10G, Ollin Corp.)8 g Peroxidase150.000 I. E. FAD240 mg TPP1.000 mg Pyruvatoxidase150.000 I. E. Farbstoff
2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)- 4-phenethyl-5-
(4-dimethylaminophenyl)- imidazol3 g Wasser1.360 g (Verdünnte NaOH wurde zugegeben, um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen).Gelatine 190 g surfactant
(10G surfactant, Ollin Corp.) 8 g peroxidase 150,000 IU FAD240 mg TPP 1,000 mg pyruvate oxidase 150,000 IU dye
2- (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) -4-phenethyl-5-
(4-dimethylaminophenyl) imidazole 3 g water 1,360 g (Dilute NaOH was added to adjust the pH to 7.0).

Auf die Reagenzschicht wurde in einer Menge von 60 ml/m2 eine wäßrige Lösung der folgenden Zusammensetzung (b) aufgeschichtet und getrocknet, um eine klebende Schicht zu bilden, die eine Dicke nach dem Trocknen von 3 µm hatte.An aqueous solution of the following composition (b) was coated on the reagent layer in an amount of 60 ml / m 2 and dried to form an adhesive layer having a thickness of 3 µm after drying.

Zusammensetzung (b):Composition (b):

Gelatine40 g Oberflächenaktives Mittel
(Oberflächenaktives Mittel 10G, Ollin Corp.)1,6 g Wasser600 g (Verdünnte NaOH wurde zugegeben, um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen.)Gelatin 40 g surfactant
(10G surfactant, Ollin Corp.) 1.6 g water 600 g (Dilute NaOH was added to adjust the pH to 7.0.)

Auf die gesamte Oberfläche der klebenden Schicht wurde Wasser in einer Menge von ungefähr 30 g/m2 aufgebracht, um die klebende Schicht zu benetzen. Ein feiner Wollstoff (Hohlraumvolumen: 9,8 µl/m2) aus Polyester wurde auf die nasse klebende Schicht unter schwachem Druck auflaminiert und getrocknet, wodurch eine Ausbreitungsschicht gebildet wurde.Water was applied to the entire surface of the adhesive layer in an amount of approximately 30 g / m 2 to wet the adhesive layer. A fine woolen fabric (void volume: 9.8 µl / m 2 ) made of polyester was laminated onto the wet adhesive layer under light pressure and dried, thereby forming a spreading layer.

Auf das Tuch (Ausbreitungsschicht) wurde in einer Menge von 100 ml/m2 eine wäßrige Lösung der folgenden Zusammensetzung (c) aufgeschichtet und getrocknet, wodurch ein integrales analytisches Mehrschichtelement zur Analyse von ALT gebildet wurde.An aqueous solution of the following composition (c) was coated on the cloth (spreading layer) in an amount of 100 ml / m 2 and dried, thereby forming an integral multilayer analytical element for analysis of ALT.

Zusammensetzung (c):Composition (c):

Trishydroxymethylaminomethan2,2 g Monokaliumphosphat4,5 g Natrium-α-ketoglutalat4,0 g Hydroxypropylmethylcellulose
(Metholose 90 SH 100, hergestellt von
Shinetshu Chemical Industry Co., Ltd.)8,7 g Oberflächenaktives Mittel
Polyoxyethylenoctylphenylether27 g Titandioxid (Rutil)2,4 g Wasser880 g (Verdünnte NaOH wurde zugegeben, um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen).Trishydroxymethylaminomethane 2.2 g monopotassium phosphate 4.5 g sodium α-ketoglutalate 4.0 g hydroxypropyl methyl cellulose
(Metholose 90 SH 100 manufactured by
Shinetshu Chemical Industry Co., Ltd.) 8.7 g of surfactant
Polyoxyethylene octylphenyl ether 27 g titanium dioxide (rutile) 2.4 g water 880 g (dilute NaOH was added to adjust the pH to 7.5).

Auf das analytische Element wurden 10 µl 7%iges Humanserumalbumin (HSA), das die in Tabelle I angegebene Konzentration von Lithiumbrenztraubensäure enthielt, fleckförmig aufgebracht. Das analytische Element wurde in einem geschlossenen Gefäß bei 37°C 2,5 Minuten lang gehalten, um die optische Dichte des Elements bei einer Wellenlänge von 640 nm zu messen, und es wurde eine weitere Minute lang bis 3,5 Minuten gehalten, während welcher Zeit die Veränderung der optischen Dichte in der gleichen Weise gemessen wurde. Die Beziehung zwischen beiden Werten wurde durch eine sekundäre Funktion angenähert. Die Ergebnisse der Messungen sind in Tabelle I zusammengestellt und in Fig. 1 illustriert. Die angenäherte Gleichung ist wie folgt:10 μl of 7% human serum albumin (HSA), which contained the concentration of pyruvic acid listed in Table I, was applied in spots to the analytical element. The analytical element was kept in a closed vessel at 37 ° C for 2.5 minutes to measure the optical density of the element at a wavelength of 640 nm, and was held for another minute to 3.5 minutes during which Time the change in optical density was measured in the same way. The relationship between the two values was approximated by a secondary function. The results of the measurements are compiled in Table I and illustrated in FIG. 1. The approximate equation is as follows:

Δ/min = 0,213475 [OD (2,5 min)]2 - 0,093031 [OD (2,5 min)] ≦λτ 0,004088 (A)
 Δ / min = 0.213475 [ OD (2.5 min)] 2 - 0.093031 [ OD (2.5 min)] ≦ λτ 0.004088 (A)

Tabelle I Table I

Auf das analytische Element zur Bestimmung der ALT-Aktivität wurden 10 µl eines Kontrollserums, das eine bekannte ALT-Aktivität enthielt, fleckförmig aufgebracht. Das Element wurde einem geschlossenen Gefäß 2,5 Minuten lang bei 37°C gehalten, und die optische Dichte des Elements wurde bei einer Wellenlänge von 640 nm gemessen. Es wurde eine weitere Minute lang bis 3,5 Minuten gehalten, während welcher Zeit die Veränderung der optischen Dichte in der gleichen Weise gemessen wurde. Auf der Grundlage der Messung wurde eine provisorische Eichkurve (Fig. 2-(1)) hergestellt.10 .mu.l of a control serum, which contained a known ALT activity, was applied in spots to the analytical element for determining the ALT activity. The element was kept in a closed vessel at 37 ° C for 2.5 minutes and the optical density of the element was measured at a wavelength of 640 nm. It was held for an additional minute to 3.5 minutes during which time the change in optical density was measured in the same way. A provisional calibration curve ( Fig. 2- (1)) was produced on the basis of the measurement.

Der Wert von OD (2,5 min), gemessen bei 2,5 Minuten, wurde in die obige Gleichung (A) eingeführt, um Δ/min zu erhalten. Die Werte für OD (2,5 min) und Δ/min sind in Tabelle II zusammengestellt.The value of OD (2.5 min) measured at 2.5 minutes was introduced into the equation (A) above to obtain Δ / min. The values for OD (2.5 min) and Δ / min are summarized in Table II.

Tabelle II Table II

Der obige Δ/min-Wert wurde als Korrelationswert verwendet, um die Werte zu korrigieren, die zwischen 2,5 min und 3,5 min gemessen worden waren. Als Ergebnis wurde die korrigierte Eichkurve gemäß Fig. 2-(2) erhalten.The above Δ / min value was used as a correlation value to correct the values measured between 2.5 minutes and 3.5 minutes. As a result, the corrected calibration curve according to Fig. 2- (2) was obtained.

Beispiel 2Example 2

Auf das analytische Element zur Bestimmung der ALT-Aktivität, hergestellt in Beispiel 1, wurden 10 µl eines Kontrollserums mit einer ALT-Aktivität von 60 E/l und Brenztraubensäure mit der in Tabelle III angegebenen Konzentration fleckförmig aufgebracht. Das Element wurde in einem geschlossenen Gefäß 2,5 min bei 37°C gehalten, und die optische Dichte des Elements wurde bei einer Wellenlänge von 640 nm gemessen. Es wurde eine weitere Minute bis 3,5 Minuten gehalten, während welcher Zeit die Veränderung der optischen Dichte in der gleichen Weise gemessen wurde. Die Werte wurden unter Verwendung der Eichkurve in den Aktivitätswert von ALT umgewandelt. Bei dieser Umwandlung wurden beide Eichkurven, nämlich die unkorrigierte Kurve (Fig. 2-(1)) und die korrigierte Kurve (Fig. 2-(2)), verwendet. Die Werte sind in Tabelle III zusammengestellt.10 μl of a control serum with an ALT activity of 60 U / l and pyruvic acid with the concentration given in Table III were spotted on the analytical element for determining the ALT activity, produced in Example 1. The element was kept in a closed vessel at 37 ° C for 2.5 minutes and the optical density of the element was measured at a wavelength of 640 nm. An additional minute to 3.5 minutes was held during which time the change in optical density was measured in the same way. The values were converted to the activity value of ALT using the calibration curve. In this conversion both calibration curves, namely the uncorrected curve ( Fig. 2- (1)) and the corrected curve ( Fig. 2- (2)), were used. The values are summarized in Table III.

Tabelle III Table III

Aus den Ergebnissen der Tabelle III wird ersichtlich, daß die nichtkorrigierte Eichkurve negative Fehler für die gemessenen Werte der ALT-Aktivität gibt, wenn die Brenztraubensäurekonzentration (entsprechenden der bluteigenen Brenztraubensäure) zunimmt, während der korrigierte Eichkurve durch die Anwesenheit von Brenztraubensäure nicht beeinflußt wird.From the results of Table III it can be seen that the uncorrected calibration curve has negative errors for the measured Values of ALT activity are there when the pyruvic acid concentration (corresponding to the blood's own pyruvic acid) increases during the corrected calibration curve not affected by the presence of pyruvic acid becomes.

Claims (5)

1. Verfahren zur quantitativen Analyse der Konzentration eines Analyten oder der Aktivität eines Enzyms, der bzw. das in einer flüssigen Probe enthalten ist, auf der Grundlage eines Assays der Reaktionsgeschwindigkeit durch photometrische Bestimmung eines gefärbten Produkts, das durch Reaktion in mindestens zwei Stufen in Gegenwart eines Analyten oder Enzyms erzeugt wird, gekennzeichnet durch die Stufen.
  • (1) Herstellung einer Korrelationsgleichung zwischen einer optischen Dichte eines gefärbten Produkts, die zum Zeitpunkt T 0 nach der Startzeit der Reaktion gemessen worden ist, und einem Wert der Abnahme der optischen Dichte während der Zeit T 0 und einer gegebenen Zeit T oder einem mittleren Wert der Verminderung der optischen Dichte pro Zeiteinheit, wobei mindestens zwei Referenzlösungen verwendet werden, die eine Ausgangsverbindung der Reaktion für die Analyse oder ein Zwischenprodukt in einer bekannten Konzentration oder Aktivität enthalten,
  • (2) Messung der Werte der optischen Dichte eines gefärbten Produkts, hergestellt durch Einwirkung des Analyten oder des Enzyms in der flüssigen Probe zur Zeit t 0 nach der Startzeit der Reaktion und zur Zeit t nach der Zeit t 0, und
  • (3) Einführung des Wertes der optischen Dichte zur Zeit t 0 in die obige Korrelationsgleichung, um einen Wert der Variation Δ zur Zeit t zu errechnen,
  • (4) quantitative Bestimmung der Konzentration des Analyten oder der Aktivität des Enzyms in der flüssigen Probe auf der Basis eines Assays der Reaktionsgeschwindigkeit, wobei der obige Wert Δ als Korrelationswert für die Variierung der optischen Dichte zwischen zweifacher Messung in Stufe (2), t 0 und t 0 + t verwendet wird.
1. A method of quantitatively analyzing the concentration of an analyte or the activity of an enzyme contained in a liquid sample based on an assay of the reaction rate by photometrically determining a colored product by reaction in at least two steps in the presence of an analyte or enzyme is generated, characterized by the steps.
  • (1) Establishing a correlation equation between an optical density of a colored product measured at time T 0 after the start time of the reaction and a value of the decrease in optical density during time T 0 and a given time T or an average value the reduction in optical density per unit time, using at least two reference solutions containing a starting compound of the reaction for analysis or an intermediate in a known concentration or activity,
  • (2) measurement of the optical density values of a colored product prepared by the action of the analyte or the enzyme in the liquid sample at time t 0 after the start time of the reaction and at time t after the time t 0 , and
  • (3) introducing the value of the optical density at time t 0 into the above correlation equation to calculate a value of the variation Δ at time t ,
  • (4) quantitative determination of the concentration of the analyte or the activity of the enzyme in the liquid sample on the basis of an assay of the reaction rate, the above value Δ being the correlation value for the variation of the optical density between two measurements in step (2), t 0 and t 0 + t is used.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß t 0 in Stufe (2) mit T 0 in Stufe (1) identisch ist.2. The method according to claim 1, characterized in that t 0 in stage (2) with T 0 in stage (1) is identical. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß t 0 in Stufe (2) mit T 0 in Stufe (1) identisch ist und daß t in Stufe (2) mit T in Stufe (1) identisch ist.3. The method according to claim 1, characterized in that t 0 in stage (2) with T 0 in stage (1) is identical and that t in stage (2) with T in stage (1) is identical. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verfahrensweise einschließt, in der eine vorbestimmte Menge der flüssigen Probe auf ein trockenes analytisches Element aufgebracht wird und die Konzentration des Analyten oder die Aktivität des Enzyms photometrisch bestimmt wird, wobei die Referenzlösung auf das analytische Element aufgebracht wird, um eine Korrelationsgleichung gemäß Stufe (1) herzustellen, die flüssige Probe auf das analytische Element aufgebracht wird, um die Variierung der optischen Dichte Δ zu errechnen, und die Variierung Δ als Korrelationswert für die Variierung der optischen Dichte zwischen den Zeiten t 0 und t 0 + t verwendet wird.4. The method according to claim 1, characterized in that it includes a procedure in which a predetermined amount of the liquid sample is applied to a dry analytical element and the concentration of the analyte or the activity of the enzyme is determined photometrically, the reference solution on the analytical element is applied to prepare a correlation equation according to step (1), the liquid sample is applied to the analytical element to calculate the variation of the optical density Δ , and the variation Δ as a correlation value for the variation of the optical density between the times t 0 and t 0 + t is used. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Herstellung einer Eichkurve einschließt, wobei mindestens zwei Referenzlösungen mit verschiedenen bekannten Enzymaktivitäten verwendet werden, wobei die Variierung der optischen Dichte pro Zeiteinheit zwischen den Zeiten t 0 und t 0 + t unter Verwendung der in Stufe (1) hergestellten Korrelationsgleichung korrigiert wird und die Enzymaktivität unter Verwendung der korrigierten Eichkurve bestimmt wird.5. The method according to claim 1, characterized in that it includes the preparation of a calibration curve, wherein at least two reference solutions with different known enzyme activities are used, the variation of the optical density per unit time between times t 0 and t 0 + t using the the correlation equation produced in step (1) is corrected and the enzyme activity is determined using the corrected calibration curve.
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