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DE3027105C2
DE3027105C2 DE19803027105 DE3027105A DE3027105C2 DE 3027105 C2 DE3027105 C2 DE 3027105C2 DE 19803027105 DE19803027105 DE 19803027105 DE 3027105 A DE3027105 A DE 3027105A DE 3027105 C2 DE3027105 C2 DE 3027105C2
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Fumimaro Utsunomiya Jp Takaku
Katsuhiro Yokohama Jp Ogasa
Morio Kuboyama
Nobuya Tokio/Tokyo Jp Yanai
Muneo Kodaira Jp Yamada
Yoshiteru Tokio/Tokyo Jp Watanabe
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    • C12N1/38Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/535Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulo­ poetischer Stammzellen stimulierenden Faktors, nachstehend als Colony stimulating factor (CSF) bezeichnet, gemäß Anspruch 1. Dieser Faktor ist ein Arzneistoff, der zur Behandlung von Granulo­ zytopenie beim Menschen eingesetzt werden kann. Die Unter­ ansprüche nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Es ist bekannt, daß CSF eine Schlüsselfunktion bei der Granulopoesis und der Bildung von Monozyten und/oder Makro­ phagen in vivo hat, CSF wirkt im menschlichen Körper auf die Blutstammzellen, welche die Mutterzellen für die Granulo­ zyten, Monozyten und Makrophagen darstellen; vgl. D. Metcalf, Experimental Haematology, Bd. 1 (1973), S. 185 bis 201. Der Vorschlag der Verwendung von CSF als Arzneistoff zur Behand­ lung von Granulozytopenie stammt von T. Fumimaro, Igaku no Ayumi (Progress in Medical Science), Bd. 95, Nr. 2 (1975), S. 41 bis 50. Bisher wurde jedoch CSF als Arzneistoff nicht eingesetzt, weil der Mechanismus der Bildung von Granulo­ zyten, Monozyten und Makrophagen in vivo kompliziert ist, das Verhalten von CSF dabei noch teilweise unbekannt ist und es schwierig war, große Mengen CSF in pharmakologisch annehmbarer Qualität herzustellen.

CSF kann auch als Diagnostikum verwendet werden. Es ist bekannt, daß die Bestimmung der Anzahl von auf CSF-reagierenden Zellen in Knochenmarkzellen von erheblicher Bedeutung für die Prognose von Patienten ist, die an myelogener Leukämie leiden; vgl. Nakao und Takaku, Proliferation and Differantia­ tion of Blood Cells - Fundamental and Clinical Aspects, S. 29, Verlag Kagaku Hyoron-sha Co., Japan, 1975. CSF eignet sich als Reagens (Bezugsstimulator) für diesen Zweck. Ebenso wie im vorstehenden Fall der Verwendung als Arznei­ stoff ist CSF auch zur Diagnose bis jetzt nicht eingesetzt worden, weil es schwierig war, größere Mengen mit ausrei­ chender Qualität für diagnostische Zwecke herzustellen.

Zur Herstellung von CSF, das unmittelbar auf die Stammzellen wirkt, sind verschiedene Verfahren bekannt, beispiels­ weise die Züchtung von Leukozyten aus menschlichem peripherem Blut (G.B. Price und Mitarb., Biochemical Journal, Bd. 148 (1975), S. 209 bis 217), menschlichen Plazentazellen (vgl. A.W. Burges und Mitarb., Blood, Bd. 49, Nr. 4 (1977), S. 573 bis 583) oder bestimmten Krebszellen, die CSF bilden (vgl. N. Osawa und Mitarb., Acta Hematologica Japonica, Bd. 42, Nr. 2 (1979), S. 237). Möglicherweise sind von den vorstehend beschriebenen Verfahren die Verfahren von Price und Mitarb. und Burges und Mitarb. zur Herstellung von CSF für pharmazeutische Zwecke geeignet. Die üblichen Ver­ fahren unter Verwendung von Leukozyten oder menschlichen Plazentazellen sind jedoch lediglich Labormethoden zur Gewinnung kleiner Mengen CSF, und sie sind zur technischen Herstellung von CSF ungeeignet. Weiterhin muß zur Herstellung von CSF nach dem bekannten Verfahren das Medium zur Züchtung der Zellen Serum enthalten. In Abwesenheit von Serum wird nämlich kein CSF gebildet. In der Regel wird Rinderserum oder fetales Kälberserum verwendet. Zur Vermeidung von Neben­ wirkungen (Sensibilisierung und anaphylaktischer Schock) durch diese Fremdproteine in den Medien ist es erforderlich, die Proteine nach der Vermehrung der Zellen abzutrennen oder menschliches Serum zu verwenden. Die Abtrennung dieser Proteine aus dem gebildeten CSF im Medium ist umständlich und schwierig, und die Verwendung von menschlichem Serum ist teuer.

Die Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von CSF zu entwickeln, das in technischem Umfang durchführbar ist und CSF liefert, das sich zur Behandlung von Granulozytopenie in der Humanmedizin ohne Nebenwirkungen und als Reagens zur Diagnose von myelogener Leukämie eignet.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Das aus menschlichem Urin isolierte, erfindungsgemäß verwendete Glykoprotein, welches die Bildung von menschlichen Granulozyten stimuliert (nachstehend als Glykoproteid H bezeichnet), ist in der DE-OS 29 10 745 beschrieben. Ein Glykoproteid, welches die Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten stimuliert, nachstehend als Glykoproteid M bezeichnet, das aus menschlichem Urin isoliert wird, ist als ein Sialinsäure enthaltendes Glykoproteid beschrieben; vgl. Stanley und Metcalf, Australien Journal of Experimental Biological Medical Science, Bd. 47 (1969), S. 467 bis 483, Stanley und Mitarb., Federation Proceedings, Bd. 34, Nr. 13 (1975), S. 2272-2278 und Laukel et al., Journal of Cellular Physiology, Bd. 94 (1978), S. 21 bis 30.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete synthetische Zellkulturmedium kann ein übliches synthetisches Medium für Gewebekulturen oder Zellkulturen sein, beispielsweise McCoy′s 5A-Medium (T.A. McCoy, M. Maxwell und P.F. Kruse, Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Bd. 100 (1959), S. 115 bis 118), Nährgemisch HAMF-10 (R.G. Ham, Exp. Cell Res., Bd. 29, S. 515 bis 526), RPMI-1640 (vgl. S. Iwakata, J.T. Grace Jr., N.Y.J. of Med., Bd. 64 (1964), S. 2279 bis 2282) oder ein durch Aminosäuren ergänztes Eagle′s MEM Medium (vgl. H. Eagle, Science Bd. 130 (1959), S. 432.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend näher beschrieben.

(1) Isolierung der Monozyten und Makrophagen

Mittels einer heparinisierten Spritze wird venöses Blut von gesunden Versuchspersonen entnommen, in ein steriles Reagensglas abgefüllt und 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsschritte werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Nach dem Stehen wird die obere Leukozyten enthaltende Schicht abgetrennt, einmal mit einem synthetichen Gewebe-Kultur­ medium gewaschen und danach einer Dichte- Gradientenzentrifugation unterworfen (vgl. T. Mahmood und W.A. Robinson, Blood, Bd. 51, Nr. 5 (1978), S. 879 bis 887), um die Leukozytenschicht in eine Schicht zu fraktionieren, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten sowie eine wei­ tere Granulozyten enthaltende Schicht enthält. Die erstgenannte Schicht wird isoliert. Es wird eine Zellfraktion erhalten, die in einem synthetischen Gewebekulturmedium suspendiert wird. Nachstehend wird dieses Gewebekulturmedium kurz als Medium bezeichnet. Die Zellsuspension wird zentrifugiert und der erhaltene Überstand verworfen. Die erhaltenen sedimentierten Zellen werden mit dem gleichen Medium mindestens zweimal gewaschen. Hierauf werden die gewaschenen Zellen in einem geringen Volumen des gleichen Mediums sus­ pendiert. Ein Teil der erhaltenen Suspension wird entnommen und die Zahl der Zellen mittels eines automatischen Blutzellenzählgeräts bestimmt. Das Zahlenverhältnis von Monozyten und Makrophagen zu Lymphozyten wird unter dem Mikroskop an einem Ausstrich bestimmt, der nach Wright- Giemsa gefärbt ist. Die Zellensuspension wird in einer Petrischale aus Glas oder Kunststoff so verteilt, daß die Zahl der Inokula (Monozyten und Makrophagen) dem vorge­ schriebenen Wert entspricht, vorzugsweise 10⁵ bis 10⁷ pro Petrischale. Sodann wird ein synthetisches Gewebekultur­ medium zugegeben, das mit 5 bis 20 Volumprozent Serum ergänzt ist. Hierauf läßt man die Petrischale 2 Stunden an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid bei 37°C stehen. Während dieser Zeit verankern sich die Monozyten und Makro­ phagen an der Bodenfläche der Petrischale, während die Lymphozyten im Medium suspendiert bleiben. Das Medium wird sodann verworfen und die Petrischale wird mehrmals mit einem Medium ohne Serum oder mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Nach dieser Behandlung ist der größte Teil der Lymphozyten abgetrennt, während die Monozyten und Makrophagen am Boden der Petrischale haften. Die mikroskopische Unter­ suchung ergibt, daß mindestens 95% der Zellen, die am Boden der Petrischale haften, Monozyten und Makrophagen sind, und ihre Zahl 10⁵ bis 10⁷ pro Petrischale beträgt.

(2) Züchtung bzw. Vermehrung der Monozyten und Makrophagen

Die Petrischale mit den Monozyten und Makrophagen wird mit einem synthetischen Medium versetzt, das gegebenenfalls mit Serum ergänzt ist und das mindestens 0,1 µg/ml Medium Glyko­ proteid (H) oder eine Glykoproteid (H) enthaltende Fraktion oder mindestens 500 Einheiten/ml Medium Glykoproteid (M) oder eine Glykoproteid (M) enthaltende Fraktion enthält. Die Einsaatdichte der Monozyten und Makrophagen beträgt mindestens 10⁵/ml Medium. Das beimpfte Medium wird 1 bis 7 Tage bei 37°C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid inkubiert. Dabei wird CSF in das Medium abgegeben. Das verwendete synthetische Medium ist das vorstehend erwähnte Gewebekulturmedium.

Die optimalen Bedingungen zur Herstellung von CSF nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hinsichtlich Züchtungsdauer, Menge des zugesetzten Glykoproteids, Einsaatdichte, Menge des zugesetzten Serums und Art des verwendeten Mediums werden nachstehend in den Ausführungsbeispielen noch näher beschrieben.

Zur Herstellung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird erfindungsgemäß ein Medium verwendet, das durch menschliches Serum ergänzt ist, oder es wird ein serumfreies Medium ver­ wendet, um Sensibilisierung und anaphylaktischen Schock durch Fremdproteine zu vermeiden. Zur Herstellung von CSF für diagnostische Zwecke kann andererseits ein Medium ver­ wendet werden, das durch Rinderserum oder fetales Kälber­ serum ergänzt ist. Ferner ist es möglich, auch Kulturflaschen anstelle von Petrischalen zu verwenden. Schließlich können die vermehrten Monozyten und Makrophagen auch wieder­ holt verwendet werden.

(3) Glykoproteide

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Glykoproteide werden aus menschlichem Urin isoliert. Sie stimulieren die Bildung menschlicher Granulozyten oder Mäusemakrophagen und Granulozyten. Es kann auch eine Fraktion verwendet werden, die diese Glykoproteide enthält.

Daß zur Stimulierung der Bildung menschlicher Granulozyten geeignete Glykoproteid kann nach der JP-OS 1 40 707/79 und der entsprechenden DE-OS 29 10 745 gewonnen werden. Das Ver­ fahren ist nachstehend erläutert.

Frischer Urin von gesunden Versuchspersonen wird mit verdünnter Säure oder Base auf einen pH-Wert von 6 bis 9, vor­ zugsweise 7 bis 8 eingestellt und zur Abtrennung von Ver­ unreinigungen zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird mit einem Silicium enthaltenden Adsorptionsmittel, beispiels­ weise Kieselgel, Kieselgel-Magnesiumsilikat, Diatomeenerde, Quarzglas oder Bentonit, behandelt, und die adsorbierten Bestandteile werden mit einer alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von mindestens 9 eluiert. Die zum Eluieren verwendete alkalische Lösung ist nicht kritisch. Vorzugsweise wird eine wäßrige Lösung von Ammoniak oder Natriumhydroxid in einer Konzentration von 0,3 bis 1,5 molar verwendet. Das erhaltene Eluat wird auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und mit einem Neutralsalz, beispielsweise Ammoniumsulfat, bis zu einer Sättigung von 70% versetzt, um die aktive Substanz auszusalzen. Es wird eine das Glykoproteid enthaltende Roh­ fraktion gewonnen.

Die erhaltene Rohfraktion wird in einer geringen Menge einer alkalischen Lösung gelöst, durch Ultrafiltration von nieder­ molekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht bis höchsten 10 000 befreit und sodann zur Abtrennung der in der Lösung enthaltenen Verunreinigungen mit einem Kationenaustauscher behandelt, beispielsweise mit Carboxymethyldextran, Carboxymethylcellulose oder Phosphorcellulose. Vor dieser Behandlung mit dem Kationenaustauscher werden sowohl die das Glykoproteid enthaltende Rohfraktion als auch der Ionenaus­ tauscher mit einer vorzugsweise 0,01 bis 0,15 molaren Puffer­ lösung auf einen pH-Wert von 6 bis 8 äquilibriert, damit die Behandlung mit dem Austauscher bei nahezu neutralem pH-Wert durchgeführt werden kann. Der größte Teil des Glykoproteids wird vom Ionenaustauscher nicht adsorbiert. Nach dem Konzen­ trieren des Eluats wird das Konzentrat mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 8 äquilibriert und in einen Anionenaustauscher, beispielsweise DEAE-Cellulose gegeben, der mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, um das Glykoproteid an dem Anionenaustauscher zu adsorbieren. Hieraus wird das adsorbierte Glykoproteid mittels einer linearen Konzentrationsgradientenlösung einer 0,1 bis 0,3 molaren Salzlösung, beispielsweise einer Natriumchloridlösung, eluiert. Das Glykoproteid wird bei einer Salzkonzentration von mindestens 0,1 molar eluiert, jedoch ist eine genaue Abtrennung schwierig. Die Eluatfraktionen bei 0,1 bis 0,3 molarer Salzkonzentration werden vereinigt. Erforderlichenfalls wird die vereinigte Fraktion entsalzt und konzentriert. Diese Fraktion wird als Fraktion A bezeichnet. Die Fraktion A kann als solche im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Die Glykoproteidfraktion kann auch durch Adsorption an einem Anionenaustauscher und stufenweises Eluieren mit einer 0,1 bis 0,3 molaren Salzlösung gereinigt werden, bevor man diese Fraktion der Eluierung mit einem linearen Konzentrations­ gradienten unterwirft.

Zur weiteren Reinigung wird die Fraktion A der Gelchromato­ graphie an einem stark vernetzten Polymergel mit einem Wasser­ aufnahmewert von 10 bis 20 ml/g, beispielsweise Sephadex G-150 oder Biogel P-100, unterworfen. Die aktiven Substanzen werden mit einem 0,05 bis 0,1 molarem Salzpuffer entwickelt und Fraktionen mit einem relativen Ausflußwert von 1,11 bis 1,60, vorzugsweise 1,11 bis 1,45, werden gesammelt, entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Diese Fraktion wird als Fraktion B bezeichnet.

Die auf diese Weise erhaltene Fraktion B kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Das relative Ausflußvolumen ist das Verhältnis Ve : Vo, wobei Ve das erforderliche Volumen des Lösungsmittels ist, um die Substanz in der Säule zu eluieren, und Vo das Leervolumen der Gelsäure darstellt.

Zur weiteren Reinigung wird das erhaltene Präparat in einer verdünnten Pufferlösung mit einem Salzgehalt von 1,0 bis 2,0 molar, beispielsweise einer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0 gelöst, die 1,0 bis 2,0 molar an Natriumchlorid ist. Die Lösung wird der Affini­ tätschromatographie an einem Zucker-affinen Adsorptions­ mittel, beispielsweise Concanavalin A - Sepharose 4B, unter­ worfen, das mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Das an der Affinitätssäule adsorbierte Glykoproteid wird mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eluiert, die 1,0 bis 2,0 molar an Salz ist und die 20 bis 100 mMol eines Saccharids, beispiels­ weise α-Methyl-D-glukosid, enthält. Die das Glykoproteid ent­ haltenden Fraktionen werden vereinigt, erforderlichenfalls ent­ salzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Diese Fraktion kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Zur weiteren Reinigung wird die erhaltene Fraktion der präparativen Zonenelektrophorese unterworfen. Als Trägermedium wird beispielsweise ein Polyacrylamidgel oder Agargel vom pH-Wert 7,0 bis 9,0 verwendet. Es wird eine hochgereinigte Glykoproteidfraktion aus dem Trägermedium durch Eluieren mit einer kalten verdünnten Salzlösung erhalten. Diese Fraktion wird entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Dieses gereinigte Glykoproteid kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Glykoproteid, das die Bildung von Mäusegranulozyten und Makrophagen stimuliert, ist ebenfalls in den vorstehend erwähten Druckschriften beschrieben. Die präparativen Verfahren von Stanley und Metcalf, Stanley und Mitarb. und Laukel und Mitarb. sind nach­ stehend in den Beispielen 6, 5 und 7 im einzelenn beschrieben.

Die biologische Aktivität der Glykoproteidpräparate gegenüber Knochenmarkzellen der Maus wird auf die nachstehend beschriebene Weise bestimmt und in Einheiten ausgedrückt. 1 ml McCoy′s 5A Medium, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, 0,3% Agar und 1×10⁵ Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C 57 Bl/6J, wird mit 0,1 ml des zu bestimmenden Glyko­ proteids bzw. einer Glykoproteidfraktion versetzt. Das auf diese Weise hergestellte, das Glykoproteid enthaltende Medium wird in eine Petrischale aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 35 mm gegeben und 7 Tage bei 37°C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid inkubiert. Danach wird die Zahl der einzelnen Kolonien, die jeweils mindestens 50 Zellen enthalten, unter dem Mikroskop bestimmt. Die biologische Aktivität einer Probe, die eine Kolonie bildet, entspricht einer Einheit. Zur Bestimmung des Reinigungsgrades einer Glykoproteidprobe wird die spezifische Aktivität nach folgender Gleichung berechnet:

Die spezifische Aktivität nimmt mit fortschreitender Reini­ gung zu. Das dem Medium zugesetzte Glykoproteid bzw. die Glykoproteidfraktion kann ein gereinigtes Präparat mit hoher spezifischer Aktivität sein. Vorzugsweise wird ein Präparat mit niedrigerer Aktivität eingesetzt, das während der Reinigung erhalten wird.

Das Glykoproteid (H) wird dem Medium in einer Menge von mindestens 0,1 µg, vorzugsweise 10 bis 100 µg/ml Medium zugesetzt, während das Glykoproteid (M) dem Medium in einer Menge von mindestens 500 Einheiten, vorzugsweise mindestens 1000 Einheiten pro ml Medium zugegeben wird.

(4) Gewinnung der aktiven Substanz aus dem Medium

Das CSF enthaltende Medium wird von der Petrischale entfernt und 5 bis 10 Minuten bei 1000 bis 2000 g zentrifugiert. Es wird ein Überstand erhalten, der hochaktives CSF enthält.

Dieser Überstand eignet sich zur Herstellung eines Reagens oder eines Bezugsreagens zur Bestimmung der Bildung von Kolonien menschlicher granulopoetischer Stammzellen. Zu diesem Zweck wird die Aktivität des Überstandes derart einge­ stellt, das 0,1 ml des Überstandes eine CSF-Aktivität auf­ weist, die zur Bildung von mindestens 100 menschlichen Granulozytenkolonien ausreicht. Die Lösung wird durch ein Membranfilter filtriert, aseptisch in ein Gefäß abgefüllt und luftdicht verschlossen. Es wird ein flüssiges Reagens erhalten. Ein Reagens in Pulverform kann durch Gefriertrocknen des erhaltenen sterilen Filtrats unter aseptischen Bedin­ gungen hergestellt werden.

Für pharmazeutische Zwecke wird das unter Verwendung eines serumfreien Mediums erhaltene konditionierte Medium oder ein durch menschliches Serum ergänztes Medium gegen Wasser dialysiert und durch Membranfiltration sterilisiert. Erfor­ derlichenfalls wird das Filtrat konzentriert, aseptisch in ein Gefäß abgefüllt und luftdicht verschlossen. Es wird ein Präparat in flüssiger Form erhalten. Zur Herstellung von Präparaten in Pulverform wird die dialysierte Lösung durch Membranfiltration sterilisiert und unter aseptischen Bedin­ gungen gefriergetrocknet.

Zur weiteren Behandlung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird der vorstehend erwähnte Überstand in eine hochmolekulare Fraktion (Molekulargewicht oberhalb 5000 oder 10 000) und eine niedermolekulare Fraktion (Molekulargewicht unter 5000 oder 10 000) mittels einer Ultrafiltrationsmembran (Molekular­ gewichtschnitt 5000 oder 10 000) getrennt. Beide Fraktionen enthalten zwar CSF, doch liegen in der hochmolekularen Fraktion mindestens 90% des CSF vor.

Ein pharmazeutisches Präparat kann durch Konzentrieren der niedermolekularen Fraktion unter vermindertem Druck herge­ stellt werden. Das Konzentrat der hochmolekularen Fraktion wird in einer 0,01 bis 0,1 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0 gelöst und mit einem Anionenaustauscherharz, beispielsweise DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex behandelt, die mit dieser Pufferlösung äquilibriert worden sind. Das CSF wird am Austauscherharz adsorbiert und sodann mit einer 0,1 bis 0,3 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0 eluiert. Es wird ein gereinigtes Produkt erhalten.

Das erhaltene Eluat kann durch Konzentrieren und anschließende Molekularsieb-Chromatographie durch Gelfiltration weiter gereinigt werden. Als Gel für die Gelfiltration kommen bei­ spielsweise Sephadex G 150, Biogel P-100 und Ultragel AcA-44 in Frage.

Bei der Herstellung von CSF in einem serumfreien Medium kann die Behandlung mit einem Anionenaustauscherharz entfallen, und die Reinigung erfolgt unmittelbar durch Gelchromato­ graphie. Eine geeignete Entwickler-Pufferlösung bei der Gel­ chromatographie ist eine 0,01 bis 0,3 molare Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0. Die bei der Gelfiltration erhaltenen CSF-aktiven Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet. Es wird ein gereinigtes CSF- Präparat erhalten.

Die auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen gereinigten CSF-Präparate werden durch Immunelektrophorose unter Ver­ wendung von menschlichem Antiserum und Rinderantiserum auf verunreinigende Proteine untersucht. Spuren an menschlichen Globulin-ähnlichen Proteinen und Serumalbumin und Globulin- ähnlichen Proteinen, die vermutlich aus dem fetalen Kälber­ serum stammen, werden in CSF-Präparaten gefunden, die aus einem durch fetales Kälberserum ergänztem Medium stammen. Da praktisch keine derartigen Eiweißkörper in CSF-Präparaten feststellbar sind, die in dem serumfreien Medium herge­ stellt wurden, können diese Präparate unmittelbar als Arznei­ stoffe verwendet werden, da sie keine Nebenwirkungen verur­ sachen.

Zur Injektion können die flüssigen Präparate als solche ver­ wendet werden, während die pulverförmigen Präparate in sterilem pyrogenfreiem Wasser, steriler physiologischer Kochsalz­ lösung oder ähnlichen Lösungen zunächst gelöst werden müssen. Diese Präparate können Patienten zur Behandlung von Granulozytopenie gegeben werden. Die Tagesdosis beträgt mindestens 77,8 mg/kg Körpergewicht.

Versuchsbeispiel 1 Bestimmung der Inkubationszeit (1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen und Herstellung des Glykoproteids

Monozyten und Makrophagen werden auf die nachstehend in Beispiel 1 (1) beschriebene Weise isoliert. Die bei dem Experiment verwendeten Glykoproteide werden auf die nach­ stehend in Beispiel 1 (2) und Beispiel 5 (2) beschriebene Weise hergestellt. Das gemäß Beispiel 1 (2) hergestellte Glykoproteid (H) war ein stark gereinigtes Produkt der letzten Reinigungsstufe, während das gemäß Beispiel 5 (2) hergestellte Glykoproteid (M) ein Produkt von Standard­ reinheit (spezifische Aktivität 180 000) war.

(2) Inkubation der Monozyten und Makrophagen

Zwei Medien mit jeweils 100 µg/ml Glykoproteid (H) und 2 glykoproteidfreie Medien werden hergestellt. Für die Medien wird serumfreies McCoy′s 5A-Medium sowie ergänztes McCoy′s 5A-Medium mit 20% fetalem Kälberserum verwendet.

Jede Petrischale, die am Boden haftende Monozyten und Makrophagen enthält, wird mit jeweils einem der vier genannten Medien in einer Menge von 10⁶ Monozyten und Makro­ phagen pro ml Medium versetzt. Jedes Medium wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (3) inkubiert. Vor der Inku­ bation sowie nach Inkubationszeiten von 1, 3, 5 und 7 Tagen werden vorbestimmte Volumina des Mediums jeder Petrischale entnommen.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wird wiederholt, jedoch wird das Glykoproteid (M) in einer Menge von 1000 Ein­ heiten/ml Medium anstelle des Glykoproteids (H) verwendet.

(3) Bestimmung von CSF im konditionierten Medium

Die CSF-Aktivität jedes konditionierten Mediums wird anhand der Bildung von Kolonien menschlicher Knochenmarkzellen bestimmt. Das Knochenmark wird vom Brustbein (Sternum) einer gesunden Versuchsperson mittels einer heparinisierten Spritze nach Sternumpunktur entnommen. Sodann wird das ent­ nommene Knochenmark 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert, um das "buffy coat" zu isolieren. Das "buffy coat" wird mit McCoy′s 5A Medium gewaschen, in McCoy′s 5A Medium, das 20% Serum enthält, suspendiert, in einer Petrischale ausgebreitet und mit mehreren mg/ml Medium pulverisiertem und sterili­ siertem Carbonyleisen versetzt. Danach wird die Petrischale 1 bis 2 Stunden bei 37°C in einen Inkubator eingestellt. Danach werden die phagozytischen Zellen, die die Carbonyl­ eisenteilchen phagozytierten, am Boden der Petrischale mittels eines Magneten fixiert und die überstehende Zellsuspension wird isoliert. Die suspendierten Zellen sind nicht anhaftende, nicht phagozytierende Knochenmarkzellen, die zur Bestim­ mung der CSF-Aktivität benutzt werden. Diese Knochemark­ zellen werden durch Zentrifugieren gewaschen und in einem kleinen Volumen des Mediums suspendiert. Die Zahl der kern­ haltigen Zellen in der Suspension wird nach Behandlung mit Essigsäure-Gentianaviolett-Farbstoff gezählt.

Die nicht anhaftenden, nicht phagozytierenden kernhaltigen Zellen werden in McCoy′ 5A Medium übertragen, das 0,3% Agar und 20% fetales Kälberserum enthält. Die Einsaatdichte beträgt 2×10⁵ Zellen pro ml Medium. Nach Zugabe des konditio­ nierten Mediums in einer Menge von 0,1 ml/ml Medium wird das beimpfte Medium 10 Tage bei 37°C an feuchter, 5% Kohlen­ dioxid enthaltender Luft inkubiert. Nach der Inkubation wird die Zahl der Kolonien unter den entstandenen Zellaggregaten unter einem Mikroskop gezählt. Der Ausdruck Kolonie bedeutet hier ein Zellaggregat, das mindestens 40 Zellen enthält. Die CSF-Aktivität wird ausgedrückt durch die Anzahl der Kolonien.

Sie ist ein Maß für die Bildung von CSF. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß durch Zusatz des Glyko­ proteids die CSF-Bildung am dritten Tag der Inkubation ihr Maximum erreicht. Bei dem 20% fetales Kälberserum enthaltenden Medium ist die CSF-Bildung deutlich höher in Gegen­ wart des Glykoproteids als in Abwesenheit des Glykoproteids (übliches Verfahren). Im serumfreien Medium wird CSF nach Zusatz des Glykoproteids gebildet, während CSF in Abwesen­ heit des Glykoproteids kaum entsteht.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß bei der Herstellung von CSF durch Züchtung und Vermehrung von Monozyten und Makrophagen in vitro die Glykoproteide die Bildung von CSF stimulieren, unabhängig davon, ob das Medium Serum ent­ hält. Es wurde ferner festgestellt, daß die Inkubations­ dauer 3 bis 7 Tage, vorzugsweise 3 Tage beträgt. Wenn keine Monozyten und Makrophagen eingeimpft werden, kann keine CSF- Aktivität im konditionierten Medium beobachtet werden, unabhängig davon, ob das Glykoproteid vorliegt.

Versuchsbeispiel 2 Versuche mit unterschiedlichen Mengen Glykoproteid

Durch Zusatz der Glykoproteide (H) und (M) wie im Versuchs­ beispiel 1 zu McCoy′s 5A Medium, ergänzt mit 20% fetalem Kälberserum sowie serumfreien McCoy′s 5A Medium werden Medien hergestellt. Im Fall des Glykoproteids (H) werden 0,1, 1,0, 10,0 bzw. 100 µg/ml Medium zugegeben. Im Fall des Glykoproteids (M) werden 100, 500, 1000 bzw. 2000 Einheiten/ml Medium zugegeben. Jedes Medium wird schließlich in die Petrischale gegeben, die an ihrem Boden anhaftende Monozyten und Makrophagen enthält. Sodann werden die Petri­ schalen 3 Tage in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 inkubiert. Die CSF-Aktivität jedes konditionierten Mediums wird wie im Versuchsbeispiel 1 bestimmt, um die CSF-Bildung festzustellen. Zum Vergleich werden Proben verwendet, die durch Inkubieren jedes Mediums ohne Zusatz von Glyko­ proteid erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß mit zunehmenden Mengen an Glykoproteid die CSF-Bildung ansteigt. Aus diesen Ergeb­ nissen sowie den in Tabelle I mitgeteilten Ergebnissen (nach dreitägiger Inkubation) ist ersichtlich, daß die CSF- Bildung durch die Gegenwart von 0,1 µg Glykoproteid (H) oder 500 Einheiten Glykoproteid (M) pro 1 ml Medium deutlich erhöht ist. Im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt daher die Menge des zugesetzten Glykoproteids pro 1 ml Medium mindestens 0,1 µg, vorzugsweise 10 bis 100 µg bei Verwendung von Glykoproteid (H) und mindestens 500 Einheiten, vorzugs­ weise mindestens 1000 Einheiten Glykoproteid (M).

Versuchsbeispiel 3 Versuche mit unterschiedlicher Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen

Das Versuchsbeispiel 1 wird wiederholt. Es wird eine Reihe von konditionierten Medien erhalten, jedoch beträgt die Ein­ saatdichte an Monozyten und Makrophagen 0, 10³, 10⁴, 10⁵ bzw. 10⁶/ml. 1 µg Glykoproteid (H) bzw. 500 Einheiten Glyko­ proteid (M) werden zu 1 ml McCoy′s 5A Medium gegeben, das mit 20% fetalem Kälberserum ergänzt ist, bzw. zu 1 ml serum­ freiem McCoy′s 5A Medium. Die Inkubationsdauer beträgt 3 Tage. Die erhaltenen konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität untersucht, um die Bildung von CSF in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 zu bestimmen. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt:

Tabelle III

Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß in jedem Fall große Mengen CSF gebildet werden, wenn die Einsaatdichte mindestens 10⁵ Zellen/ml beträgt. Im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt daher die Einsaatdichte mindestens 10⁵ Monozyten und Makrophagen pro 1 ml Medium.

Versuchsbeispiel 4 CSF-Produktion in verschiedenen Medien

Hinsichtlich der CSF-Produktion werden vier verschiedene handelsübliche Gewebekulturmedien oder Zellkulturmedien mitein­ ander verglichen. Als Medien werden McCoy′s 5A Medium, Nährge­ misch HAMF-10, RPMI-1640 und Eagle′s MEM Medium ergänzt mit Aminosäuren verwendet. Jedes dieser Medien, die nicht durch Serum ergänzt sind, wird mit 1,0 µg/ml Glykoproteid (H) bzw. 500 Einheiten/ml Glykoproteid (M) versetzt. Die erhaltenen Medien werden 3 Tage in gleicher Weise wie in Versuchs­ beispiel 1 inkubiert. Hierauf werden die erhaltenen konditionierten Medien in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 auf CSF-Bildung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß sämtliche vier Medien für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind. Die CSF- Bildung ist im MEM Medium etwas niedriger als in den anderen Medien.

Versuchsbeispiel 5 Versuche mit Medium mit unterschiedlichen Mengen Serum

Auf die gleiche Weise wie in Versuchsbeispiel 1 werden konditionierte Medien hergestellt, McCoy′s 5A Medium wird mit 0, 5, 10, 20 oder 30% menschlichem Serum oder fetalem Kälberserum versetzt. Beide Seren werden 30 Minuten auf 58°C erhitzt. Sodann werden 1 µg/ml Medium des Glykoproteids (H) bzw. 500 Einheiten/ml Medium Glykoproteid (M) zugesetzt. Die Einsaatdichte des Monozyten Makrophagen in jedes Medium be­ trägt 10⁵/ml und die Inkubationsdauer 3 Tage. Die erhaltenen konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität in gleicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung von CSF zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammen­ gefaßt.

Tabelle V

Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß mit zunehmender Menge an Serum die Bildung von CSF ansteigt. Erfindungsgemäß kann CSF in einem serumfreien Medium gebildet werden, doch kann das Medium mit Rinderserum oder fetalem Kälberserum versetzt werden, um größere Mengen CSF für diagnostische Zwecke herzustellen. Die wirksame Menge an zugesetztem Serum beträgt mindestens 5%, vorzugsweise mindestens 10%.

Versuchsbeispiel 6 Versuche mit einer Glykoproteid-Fraktion und einer hochgereinigen Fraktion

In den Versuchsbeispielen 1 bis 5 wird gereinigtes Glyko­ proteid als aktive Substanz mit einer stimulierenden Wirkung bei der Bildung menschlicher Granulozyten (Fall I) und andererseits Glykoproteid von Standardreinheit (spezifische Aktivität 180 000) als aktive Substanz mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten (Fall II) verwendet. Im vorliegenden Versuchsbeispiel soll gezeigt werden, daß im erfindungsgemäßen Verfahren ein halb­ gereinigtes Präparat anstelle des gereinigten Glykoproteids im Fall I und eine weniger gereinigte Fraktion sowie ein hochgereinigtes Präparat anstelle des Glykoproteids von Standardreinheit im Fall II verwendet werden kann.

Die verwendeten glykoproteidhaltigen Fraktionen entsprechend Fall I sind die Fraktionen A und B, deren Herstellung nach­ stehend in Beispiel 1 beschrieben ist. Diese Fraktionen werden zu serumfreiem McCoy′s 5A Medium in Mengen von 0, 0,5, 1,0, 5,0 bzw. 10 mg/ml entsprechend 0, 8,3, 16,6, 83,3 bzw. 166,6 µg/ml Medium ausgedrückt als aktives Glyko­ proteid in der Fraktion und in Mengen von 0, 41, 7, 83,4, 417 und 834 µg/ml Medium ausgedrückt als aktives Glykoproteid in der Fraktion B zugesetzt. Die Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen in jedes Medium beträgt 10⁵/ml und die Inkubationsdauer 3 Tage. Es werden konditionierte Medien durch Inkubieren unter sonst gleichen Bedingungen wie im Versuchs­ beispiel 1 erhalten.

Da die Fraktionen A und B menschliches Serumalbumin enthalten, das im Urin vorliegt, werden Vergleichsproben durch Zusatz von menschlichem Serumalbumin zu McCoy′s 5A Medium in einer Menge entsprechend der Menge zugesetzt, die auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten Medien ent­ halten ist. Die Inkubationsbedingungen sind die gleichen, wie sie vorstehend beschrieben sind.

Jedes konditionierte Medium wird auf CSF-Aktivität in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung von CSF nachzuweisen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt.

Wie im Fall II ist das Glykoproteidpräparat im vorliegenden Versuchsbeispiel die Fraktion C (spezifische Aktivität 21 000), die Fraktion D (spezifische Aktivität 54 000) sowie das hochgereinigte Präparat (spezifische Aktivität 1 240 000), dessen Herstellung in Beispiel 5 beschrieben ist. Die konditionierten Medien werden auf die vorstehend im Zusammenhang mit Fall I beschriebene Weise hergestellt, jedoch werden die Fraktionen C und D sowie das hochgereinigte Präparat (vgl. Beispiel 5) den Medien jeweils in Mengen von 0, 100, 500, 1000 und 2000 Einheiten/ml Medium anstelle der beschriebenen Mengen der Fraktionen A und B (vgl. Bei­ spiel 1) zugesetzt. Die Vergleichsversuche mit menschlichem Serumalbumin entfallen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt.

Tabelle VI

Einfluß des Reinheitsgrades des Glykoproteids mit stimulierender Wirkung auf die Bildung menschlicher Granulozyten.

Die CSF-Bildung in einem Medium, dem die Fraktion A oder B zugesetzt wird, ist höher als im Vergleichsmedium. Dies zeigt, daß das Glykoproteid die CSF-Bildung anregt. Im Ver­ gleich mit dem in Tabelle II gezeigten Beispiel, bei dem 10 µg/ml Glykoproteid dem serumfreien Medium zugesetzt wurden, ist in dem in Tabelle VI gezeigten Beispiel die CSF-Bildung höher. In diesem Beispiel wurden 0,5 mg/ml der Fraktion A (8,3 µg/ml Glykoproteid) zugesetzt. Dies ist eine geringe Menge Glykoproteid. Dies scheint auf dem Einfluß von Serum­ albumin und anderen unbekannten Bestandteilen des mensch­ lichen Urins zu beruhen, die der Fraktion A vorliegen.

Wenn man das Medium mit zugesetzter Fraktion A mit dem Medium mit zugesetzter Fraktion B hinsichtlich der CSF- Bildung vergleicht, ist ersichtlich, daß bei einer zugesetzten Menge von 0,5 oder 1,0 mg/ml beide Fraktionen etwa ver­ gleichbar sind, daß jedoch bei höheren Konzentrationen der Fraktion B die CSF-Bildung niedriger ist. Dies beruht ver­ mutlich darauf, daß der Gehalt an menschlichem Serumalbumin aus Urin in der Fraktion A größer ist als in der Fraktion B und der Zusatz der Fraktion B in Mengen von mehr als 5 mg/ml eine zu starke Zugabe von Glykoproteid bewirkt. Unter Berücksichtigung aller dieser Ergebnisse bestehen Gründe zu der Annahme, daß unter das Serumalbumin, das im menschlichen Urin enthalten ist, und das Glykoproteid eine syner­ gistische Wirkung bei der Bildung von CSF ausüben, und daß eine maximale CSF-Bildung erhalten wird, wenn das Medium mit etwa 100 µg/ml Glykoproteid versetzt wird.

Bei Verwendung des Glykoproteids mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten (Fall II) ist aus Tabelle VI folgendes ersichtlich: Die CSF-Bildung nimmt etwa proportional der Menge an dem Medium zugesetztem Glykoproteid zu. Im Vergleich mit den in Tabelle II gezeigten Ergebnissen unter Verwendung eines serumfreien Mediums ist die CSF-Bildung im vorliegenden Ver­ such höher, wenn die Fraktion C oder D verwendet wird, obwohl die Menge des dem Medium zugesetzten Glykoproteids die gleiche ist wie im vorhergehenden Fall. Dies beruht anscheinend auf dem Einfluß unter anderem des Serumalbumins, das in den Fraktionen C und D enthalten ist, die aus mensch­ lichem Urin stammen. Aus den Ergebnissen, die bei Verwendung von hochgereinigtem Glykoproteid erhalten werden, ist ersichtlich, daß zwar die CSF-Produktion mit zunehmender Menge an Glykoproteid ansteigt, der Anstieg jedoch geringer ist als bei Verwendung der Fraktionen C und B und dem Präparat von Standardreinheit (Tabelle II). Aus den vorstehenden Ergebnissen kann man schließen, daß in serumfreien Medien das Serum­ albumin und andere Substanzen aus menschlichem Urin die gleiche Rolle spielen, wie das Serum im Hinblick auf die CSF-Produktion.

In jedem Falle ist es deshalb im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft, dem Medium ein rohes Glykoproteid anstelle eines gereinigten Glykoproteids zuzusetzen. Bei Verwen­ dung eines rohen Glykoproteidpäparats wird es in einer Menge von mindestens 0,1 µg/ml Medium im Fall I oder in einer Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium im Fall II ein­ gesetzt.

Versuchsbeispiel 7 Bestimmung der wirksamen Dosis und der akuten Toxizität von CSF

Die wirksame Dosis und die akute Toxizität (LD₅₀) des erfin­ dungsgemäß hergestellten CSF werden an Tieren folgendermaßen bestimmt.

Ein Gemäß Beispiel 3 hergestelltes konditioniertes Medium wird durch Membranfiltration sterilisiert und sodann durch eine Ultrafiltrationsmembran (molekulare Trenngrenze: 10 000) filtriert, hierauf konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet. Es wird CSF in Pulverform erhalten. Nach der im Vergleichsbeispiel 1 beschriebenen Bestimmungsmethode beträgt die Zahl der Koloniebildung bei menschlichen Knochen­ markzellen 4500/mg. Zum Vergleich wird der Versuch mit Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C3H/He wiederholt. Die Zahl der Koloniebildung mit Knochenmarkzellen der Maus beträgt 7000/mg.

80 sechs Wochen alte männliche Mäuse des Stammes C3H/He mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g werden will­ kürlich in 16 Untergruppen von jeweils 5 Tieren unterteilt. Die Untergruppen werden willkürlich zusammengestellt, und es werden vier Gruppen von jeweils vier Untergruppen gebildet.

Das auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellte CSF wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Es werden drei Lösungen mit 1 mg/0,1 ml (für die Gruppe I), 2 mg/0,1 ml (für die Gruppe II) und 4 mg/0,1 ml (für die Gruppe III) hergestellt. Die Mäuse werden subkutan mit der Lösung in einer Tagesdosis von 0,1 ml/Maus an fünf aufein­ anderfolgenden Tagen gespritzt. Nach 1, 3, 7 und 11 Tagen nach Beginn der Verabreichung werden Blutproben aus fünf Mäusen einer Untergruppe jeder Gruppe entnommen (die Unter­ gruppen, denen Blut entnommen wurde, wurden für den weiteren Versuch nicht mehr verwendet). Die Zahl der Leukozyten in den periphären Blutgefäßen wird mittels eines automatischen Blutzellenzählgerätes bestimmt. Die Zahl der Granulozyten wird unter dem Mikroskop nach Wright-Giemsa-Färbung gezählt, um die Zunahme der Zahl der Leukozyten und Granulozyten nach CSF- Gabe zu bestimmen. Eine Gruppe (Gruppe I), der 0,1 ml sterile physiologische Kochsalzlösung ohne CSF gegeben wurde, wird in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben behandelt und als Kontrollgruppe verwendet. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

Tabelle VII

Anmerkung:
1. Die Zahlenwerte bedeuten die Zahl der Blutzellen pro 1 mm³ Blut×10-2.
2. Die angegebenen Werte sind die Durchschnittswerte von jeweils 5 Mäusen.

Im Vergleich zur Kontrollgruppe I zeigt die Gruppe II nach CSF-Gabe eine nahezu zweifache Zunahme der Zahl der Leuko­ zyten und eine nahezu dreifache Zunahme der Zahl der Granulo­ zyten 11 Tage nach Versuchsbeginn (6 Tage nach Beendigung der Gabe). Im Vergleich mit der Gruppe I zeigt die Gruppe IV eine etwa 4,5fache Zunahme der Zahl der Leukozyten und eine etwa 8fache Zunahme der Zahl der Granulozyten. Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die wirksame Tagesdosis bei Mäusen etwa 50 mg/kg Körpergewicht beträgt. Da die koloniebildende Aktivität des verwendeten CSF in im vorstehend beschriebenen Versuch um einen Faktor von 1,556 höher ist im Falle von Knochenmarkzellen der Maus als im Falle von mensch­ lichen Knochenmarkzellen entspricht die wirksame Dosis bei einem Patienten mit Granulozytopenie, die bei menschlichen Knochenmarkzellen eine Wirkung zeigt, die dem Effekt bei Mäusen entspricht, etwa einer Tagesdosis von 77,8 mg/kg Körper­ gewicht. Die akute Toxizität wird unter Verwendung des gleichen CSF untersucht, wie in dem vorstehend beschriebenen Test zur Bestimmung der Dosis und an Mäusen des gleichen Stammes (6 bis 8 Wochen alt, durchschnittliches Körperge­ wicht 20,4 g). Es werden keine Todesfälle beobachtet bei einer Versuchsgruppe von 5 männlichen und 5 weiblichen Mäusen, denen 4,0 g CSF/kg Körpergewicht gegeben wurden. Dementsprechend ist die akute Toxizität so gering, daß sie nach dem vorstehend beschriebenen Versuch nicht bestimmt werden kann.

Beispiel 1 (1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen

200 ml Blut aus peripheren Gefäßen von gesunden Versuchs­ personen werden in einem Gefäß aufgefangen, das 1000 Einheiten Heparin enthält. Der Inhalt des Gefäßes wird durch vor­ sichtiges Bewegen vermischt. Hierauf wird das heparinisierte Blut in einen sterilen Glaszylinder mit einem Durchmesser von 20 mm und einem Fassungsvermögen von 200 ml verbracht und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird die obere, die Leukozyten enthaltende Schicht vorsichtig mit abpipettiert, mit serumfreiem McCoy′s 5A Medium auf das Doppelte des ursprünglichen Volumens verdünnt und 15 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Die sedimentierten Leukozyten werden in 20 ml McCoy′s 5A Medium suspendiert und die Suspension wird über eine Natriummetrizoatlösung (Dichte 1,077) in einem Zentrifugen­ rohr beschichtet und 30 Minuten bei 400 g zentrifugiert. Die weiße Schicht, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten am Boden der oberen Schicht enthält, wird mit einer Pipette aufgenommen, mit McCoy′s 5A Medium gewaschen und 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Diese Behandlung wird noch zweimal wiederholt. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen werden in 20 ml McCoy′s 5A Medium sus­ pendiert. Ein Teil wird zur Zählung der Zellen mit einem automatischen Blutzellenzählgerät verwendet. Es wird ein Aus­ strich der Suspension hergestellt, mit Wright-Giemsa-Farb­ stoff gefärbt, und die Zahl der Lymphozyten sowie die Zahl der Monozyten und Makrophagen wird morphologisch bestimmt, um das Zellenverhältnis festzustellen. Der Anteil der Mono­ zyten und Makrophagen beträgt 25,5%.

Jeweils 5 ml der erhaltenen Suspension werden in vier Petri­ schalen mit einem Durchmesser von 15 cm gegeben. Sodann werden 30 ml McCoy′s 5A Medium zugesetzt, das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt ist. Danach werden die Petrischalen 2 Stunden bei 37°C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid stehengelassen. Hierauf wird das Medium abgegossen, und es werden 30 ml McCoy′s 5A Medium zugesetzt. Nach ziemlich kräftigem Schütteln wird das Medium zur Abtrennung der Lymphozyten verworfen. Der Anteil der verbleibenden Monozyten und Makrophagen wird auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt. In jeder Petrischale beträgt der Anteil 95%.

(2) Herstellung des Glykoproteids

Das Glykoproteid wird nach der JP-OS 1 40 707/79 und der entsprechenden DE-OS 29 10 745 hergestellt.

400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen werden mit 10prozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 8 ein­ gestellt und bei 0°C und 15 000 g zentrifugiert. Unlösliche Substanzen werden sedimentiert. Der Überstand wird mit 10prozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 10×80 cm gegeben, die mit Kieselgel gefüllt ist. Die am Kieselgel adsorbierten Bestandteile werden mit 40 Liter 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das erhaltene Eluat wird mit 1 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, mit pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt und 15 bis 18 Stunden bei 0°C stehengelassen. Sodann wird die entstandene Fällung abfiltriert.

Die erhaltene Fällung wird in 2 Liter 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung gelöst, in einen Dialyseschlauch gegeben und gegen 0,05 molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gründ­ lich dialysiert. Danach wird die dialysierte Lösung, d. h. das Retentat, mit der genannten Pufferlösung auf 10 Liter aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 4×40 cm gegeben, die mit CM-Sephadex C-50 Ionenaustauscher gefüllt ist. Dieser Austauscher ist vorher mit 0,05 molarer Phosphat­ pufferlösung äquilibriert worden. Die Verunreinigungen werden duch Adsorption am Ionenaustauscher entfernt. Das Eluat wird gesammelt.

10 Liter des erhaltenen Eluats werden unter Verwendung eines "Diaflow" Hohlfaser-Konzentrators (Typ DC-30) konzentriert. Das Konzentrat wird sodann 15 bis 18 Stunden bei 5°C gegen eine 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialy­ siert. Die dialysierte Lösung, d. h. das Retentat, wird mit der gleichen Pufferlösung auf 1 Liter aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0×40 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist. Diese Cellulose ist vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden. Nach dem Waschen mit 0,1 molarer cis-HCl-Pufferlösung werden die adsorbierten Bestandteile mit 0,1 molarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,3 molar an Natriumchlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,1 molare tris-HCl-Puffer­ lösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert.

Die erhaltene dialysierte Lösung wird erneut auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0×40 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Sodann wird die Säule mit einer linearen Konzentrationsgradientenlösung von Natriumchlorid (Chloridionenkonzentrationsgradient 0,1 bis 0,3 molar) eluiert. Es werden die Fraktionen aufgefangen, die bei Chloridionen Konzentrationen von 0,15 bis 0,25 molar eluiert werden. Die Fraktionen werden vereinigt und mit pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, in einer kleinen Menge 0,1 molarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird als Fraktion A bezeichnet.

20 ml der erhaltenen dialysierten Lösung werden an einer mit Sephadex G-150 gefüllten Säule mit den Abmessungen 4,0×60 cm entwickelt. Die Säule ist vorher mit 0,1 molarer tris-HCl- Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden. Die Frak­ tionen, die einem relativen Ausflußwert von 1,11 bis 1,45 entsprechen, werden aufgefangen. Die Fraktionen werden ver­ einigt und gegen destilliertes Wasser gründlich dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 500 mg eines Pulvers erhalten, das als Frak­ tion B bezeichnet wird.

200 mg des erhaltenen Pulvers werden in einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst, die 1,0 molar an Natriumchlorid ist. Die Lösung wird auf eine 100 ml fassende Säule gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4B gefüllt, und die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die Säule wird gründlich mit einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 1,0 molar an Natriumchlorid ist. Sodann wird die Säule mit einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 50 millimolar an α-Methyl-D-glykosid und 1,0 molar an Natriumchlorid ist. Das Eluat wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wird sodann gefriergetrocknet.

Etwa 50 mg des erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers werden in 1 ml einer 0,125 molaren tris-Glycin-Pufferlösung vom pH-Wert 6,8 gelöst, die 10% Glycerin enthält. Die Lösung wird bei 10 Milliampere unter Kühlung in einer präparativen Elektrophoresevorrichtung der Elektrophorese unterworfen. Es wird ein 8prozentiges Acrylamidgel mit den Abmessungen 20×25 mm vom pH-Wert 8,9 verwendet. Die Fraktion mit einer relativen Beweglichkeit von 0,46 wird mit einer 0,025 mola­ ren tris-Glycin-Pufferlösung vom pH-Wert 8,3 eluiert und sodann gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 10 mg Glykoproteid erhalten. Beim Wiederholen des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden etwa 30 mg Glykoproteid erhalten.

(3) Züchtung der Monozyten und Makrophagen

Das auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene Glyko­ proteid wird zu 30 ml eines McCoy′s 5A Medium gegeben, das 20% fetales Kälberserum enthält, und zwar in einer Menge von 100 µg/ml Medium. 30 ml des erhaltenen Mediums werden in jeweils eine Petrischale gegossen, die anhaftende Makrophagen und Monozyten enthält, wie dies vorstehend unter Ziffer (1) des Beispiels beschrieben ist. Die Populationsdichte der Monozyten und Makrophagen in dem Medium beträgt 10⁶/ml. Das hergestellte Medium wird 3 Tage bei 37°C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid inkubiert. Es wird ein CSF-enthaltendes konditioniertes Medium erhalten.

(4) Reinigung von CSF in dem konditionierten Medium

Die Medien aus den Petrischalen werden 10 Minuten bei 2°C und 2000 g zentrifugiert. Es werden etwa 120 ml eines klaren Überstandes erhalten, der mittels einer Ultrafiltrations­ membran mit einer molekularen Trenngrenze von 10 000 konzentriert wird. Das erhaltene Konzentrat wird mit 100 ml einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,2 ver­ setzt und erneut auf 5 ml konzentriert.

Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0×60 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Sodann wird das CSF mit einer linearen Gradientenkonzentration von Kochsalz (0 bis etwa 3 molar) eluiert. Die aktive Substanz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mittels der vorstehend genannten Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Hierauf wird die konzentrierte Lösung auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0×90 cm gegeben, die mit Sephadex G-150 gefüllt ist und die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Sodann wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung entwickelt. Es werden diejenigen Fraktionen aufgefangen, die einem Molekulargewicht von 65 000 bis 90 000 sowie die Fraktionen, die einem Molekular­ gewicht von 30 000 bis 60 000 entsprechen. Diese Fraktionen werden vereinigt und mittels der Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit destilliertem Wasser versetzt, entsalzt und konzentriert. Es werden etwa 5 ml einer Lösung erhalten, die gereinigtes CSF enthält. Diese Lösung besitzt eine Aktivität, bestimmt gemäß Versuchsbeispiel 1, entsprechend der Bildung von 41 000 Kolonien menschliche Granulozyten/ml.

Beispiel 2

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und zur Herstellung des gereinigten Glykoproteids behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz des gereinigten Glykoproteids zu serumfreiem McCoy′s 5A Medium in einer Menge von 100 µg/ml Medium hergestellt worden ist. Es werden etwa 5 ml einer gereinigten CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 16 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.

Beispiel 3

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und zur Herstellung der glykoproteidhaltigen Fraktion (Fraktion A) behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz dieser Fraktion zu serumfreiem McCoy′s 5A Medium in einer Menge von 5 mg (83,3 mg Glykoproteid)/ml Medium her­ gestellt worden ist. Es werden etwa 120 ml eines kondi­ tionierten Mediums erhalten. Dieses konditionierte Medium wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wird unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur konzentriert. Es werden etwa 5 ml einer CSF-enthaltenden Lösung erhalten. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entspre­ chend der Bildung von 36 700 menschlichen Granulozytenkolonien/ ml Lösung.

Beispiel 4

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut abgetrennt und zur Herstellung der glykoproteidhaltigen Fraktion (Fraktion B) behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz dieser Fraktion zu McCoy′s 5A Medium, das 10% menschliches Serum enthält, in einer Menge von 1 mg (83,3 µg Glyko­ proteid)/ml Medium hergestellt worden ist. Es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung hat eine Akti­ vität entsprechend der Bildung von 43 200 menschlichen Granulo­ zytenkolonien/ml Lösung.

Beispiel 5 (1) Herstellung des Glykoproteids

Nach der Methode von Stanley und Mitarb. a.a.O., werden Glyko­ proteid und glykoproteidhaltige Fraktionen folgendermaßen hergestellt:
400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen werden gegen Wasser durch eine Ultrafiltrationsmembran dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 7,4 einge­ stellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 2×15 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, und die vorher mit einer 0,03 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 äquilibriert worden ist. Die aktiven Substanzen werden an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Hierauf werden die aktiven Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren tris-HCl-Puffer­ lösung gewaschen, die 0,04 molar an Natriumchlorid ist. Sodann werden die aktiven Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,15 molar an Natriumchlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen destil­ liertes Wasser dialysiert. Es wird die Fraktion C erhalten.

Die erhaltene dialysierte Lösung wird mit Calciumphosphatgel in einer Menge von 58 ml Gel/g Protein versetzt. Die aktiven Substanzen werden am Gel adsorbiert. Sodann wird das Calcium­ phosphatgel abfiltriert, zweimal mit 20 Liter einer 0,005 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gewaschen und mit 5 Liter einer 0,025 molaren Phosphatpufferlösung eluiert. Das Eluat wird 10 Minuten bei 12 000 g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird gegen destilliertes Wasser dialy­ siert. Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingedampft. Das erhaltene Konzentrat wird mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung äquilibriert, auf eine Säule mit den Abmessungen 2,5×90 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Sodann wird mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung eluiert, die Natriumchlorid in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,15 molar enthält. Die glykoproteidhaltigen Fraktionen werden aufgefangen und mittels einer Ultrafiltrations­ membran konzentriert (Fraktion D).

Das erhaltene Konzentrat wird der Gelfiltration an einer Säule mit den Abmessungen 2,5×110 cm unterworfen, die mit Biogel P-100 gefüllt ist, das vorher mit einer 0,03 molaren tris-HCl-Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es werden 230 mg Glykoproteid erhalten (Produkt von Standardreinheit).

100 mg dieses Produktes werden in einer 0,1 molaren Acetat­ pufferlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst, die 1,0 molar NaCl, 0,001 molar MgCl₂, 0,001 molar MnCl₂ und 0,001 molar CaCl₂ ist. Die Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 36×1,0 cm gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4B gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquili­ briert worden ist. Es wird mit einer 0,1 molaren α-Methyl-D- glukosidlösung eluiert. Es werden 8 mg Glykoproteid (hoch­ gereinigtes Produkt) erhalten.

Die biologische Aktivität gegenüber Knochenmarkzellen der Maus der Glykoproteidpräparate unterschiedlicher Reinheit werden nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.
Probespezifische Aktivität halbgereinigtes Produkt
  Fraktion A   21 000   Fraktion B   54 000 Produkt von Standardreinheit  180 000 hochgereinigtes Produkt1 240 000

(2) Züchtung von Monozyten und Makrophagen und Reinigung von CSF im konditionierten Medium

Die Verfahren von Beispiel 1 (3) und 1 (4) werden wiederholt, jedoch werden 1000 Einheiten/ml Medium des Glykoproteids von Standardreinheit anstelle des hochgereinigten Glyko­ proteids verwendet. Es werden etwa 5 ml einer gereinigten CSF-haltigen Lösung erhalten, die eine Aktivität entsprechend der Bildung von 35 000 menschlichen Granulozyten­ kolonien/ml Lösung besitzt.

Beispiel 6

Beispiel 5 wird wiederholt, und es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung erhalten. Es wird jedoch ein Glykoproteid verwendet, das nach der Methode von Stanley und Metcalf, a.a.O. anstelle der Methode von Stanley und Mitarb. hergestellt worden ist. Die gereinigtes CSF ent­ haltende Lösung in diesem Beispiel zeigt eine Aktivität ent­ sprechend der Bildung von 9800 menschlichen Granulozyten­ kolonien/ml der Lösung.

20 Liter menschlicher Urin wird gegen Leitungswasser bei Raumtemperatur während 8 bis 12 Stunden dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung mit 75 g DEAE-Cellulose versetzt, die mit Wasser und 100 ml einer 1,0 molaren tris- HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist.

Das erhaltene Gemisch wird grundsätzlich vermischt, damit sich das Glykoproteid an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Nach der Abtrennung des Überstandes wird die DEAE-Cellulose dreimal mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das adsobierte Glykoproteid mit 300 ml einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,5 molar an Natriumchlorid ist. Dieses Verfahren wird sechsmal wiederholt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei 40°C konzentriert und gegen eine 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,3×44 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Das Glykoproteid wird an der DEAE-Cellulose adsobiert. Danach wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das adsorbierte Glykoproteid nach der Natriumchlorid- Konzentrationsgradienten-Eluierungsmethode mit einem Gradienten von 0,1 bis 0,5 molar Natriumchlorid im gleichen Puffer eluiert. Das Eluat wird gegen Wasser dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird unter vermindertem Druck einge­ dampft und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wird in einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und auf eine Säule mit den Abmessungen 2,3×150 cm gegeben, die mit Sephadex G-150 gefüllt ist und die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es wird die Glykoproteidfraktion aufgefangen. Diese Fraktion wird dialy­ siert und gefriergetrocknet. Es werden etwa 12 mg eines Pulvers mit einer spezifischen Aktivität von etwa 36 000 bei Knochenmarkzellen der Maus enthalten.

Beispiel 7

Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem Blut auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise abge­ trennt. Es wird eine Glykoproteid enthaltende Fraktion auf die nachstehend beschriebene Weise nach der Methode von Laukel und Mitarb., a.a.O. hergestellt und zu serumfreiem McCoy′s 5A Medium in einer Menge von 2000 Einheiten/ml gegeben. Unter Verwendung dieses Mediums wird die Züchtung in ähnlicher Weise wie im Beispiel 5 durchgeführt. Es werden 120 ml eines konditionierten Mediums erhalten. Dieses Medium wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur auf etwa 5 ml konzentriert. Es wird eine CSF enthaltende Lösung erhalten, die eine Aktivität ent­ sprechend der Bildung von 29 000 menschlichen Granulozyten­ kolonien/ml Lösung aufweist.

50 Liter menschlicher Urin werden gegen laufendes Leitungs­ wasser mittels einer Ultrafiltrationsmembran (CL 100) dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 10×30 cm gegeben, die mit DEAE- Cellulose gefüllt ist, die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,3 äquilibriert worden ist. Das Glykoproteid wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Danach wird die Säule mit einer 0,05 molaren tris-HCl- Pufferlösung vom pH-Wert 7,3 gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das Glykoproteid mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,3 molar an Natrium­ chlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,05 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0 dialysiert, die 0,5 molar an NaCl, 2 millimolar an CaCl₂ und 2 millimolar an MgCl₂ ist. Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,6×40 cm gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4B gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Das am Säulen­ inhalt adsorbierte Glykoproteid wird mit der gleichen Pufferlösung gewaschen. Hierauf wird das Glykoproteid mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,15 molar an a-Methyl- D-mannosit ist. Das erhaltene Eluat wird durch Ultrafiltra­ tion konzentriert. Es werden etwa 7 ml einer Fraktion erhalten, die 6 mg Glykoproteid in 1 ml enthält. Die spezifische Aktivität dieser Fraktion beträgt etwa 20 000 bei Knochenmarkzellen der Maus.

Beispiel 8

Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem Blut gemäß Beispiel 1 abgetrennt. Es wird eine glykoproteid­ haltige Fraktion (Fraktion D) in gleicher Weise wie in Beispiel 5 hergestellt und zu McCoy′s 5A Medium gegeben, das 10% menschliches Serum enthält. Die Fraktion D wird in einer Menge von 2000 Einheiten/ml Medium zugegeben. Unter Verwendung dieses Mediums werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten, wie in Beispiel 5. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 24 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung eines Faktors mit stimulierender Wirkung auf die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulopoetischer Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut in einem ein Glykoproteid enthaltenden Gewebekulturmedium vermehrt und den gebildeten Faktor aus der Kulturflüssig­ keit isoliert, wobei das Glykoproteid dadurch erhalten worden ist, daß man die in menschlichem Urin enthaltenen Proteine konzentriert, die erhaltenen Proteine zur Abtrennung von Verunreinigungen mit einem Kationenaus­ tauscher behandelt, das Eluat zur Adsorption des Glykoproteids mit einem Anionenaustauscher behandelt, das Glykoproteid aus dem Anionenaustauscher mit einer Salz­ lösung mit linearem Konzentrationsgradient eluiert, das Eluat der Gelfiltrationschromatographie an einem stark vernetzten Polymergel unterwirft, um das Glykoproteid zu entwickeln, und die Fraktionen mit relativen Elutions­ volumen (das erforderliche Volumen des Lösungsmittels, das zum Eluieren der Substanz von der Säule erforderlich ist, zu Leervolumen der Gelsäure) von 1,11 bis 1,60 auf­ fängt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermehrung der Monozyten und Makrophagen in Gegenwart von Serum durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serum menschliches Serum einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serum in einer Menge von mindestens 5%, bezogen auf das Volumen des Mediums, einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Glykoproteid, welches die Bildung von mensch­ lichen Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 0,1 µl/ml Medium einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Glykoproteid, welches die Bildung von Mäuse­ makrophagen und Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium einsetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Glykoproteid als teilweise gereinigtes Material einsetzt, das noch Harnproteine enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Monozyten und Makrophagen, die in das Gewebekulturmedium überimpft werden, mindestens 10⁵/ml beträgt.
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