DE2701405A1

DE2701405A1 - Neue anthracyclinglycoside und verfahren zu deren herstellung

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Publication number: DE2701405A1
Application number: DE19772701405
Authority: DE
Inventors: Mario Dr Gosalvez
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-01-16
Filing date: 1977-01-14
Publication date: 1977-07-21
Also published as: CH629219A5; PT66067B; NZ183084A; BE850438A; YU5477A; DK11877A; AU2131977A; AU513698B2; JPS52111555A; GR70696B; FI770115A; EG12735A; FR2338285B1; AR218620A1; IE44689L; GB1568263A; ATA19677A; NO770122L; FR2338285A1; PL108660B1

Description

27OUOb

£ / U I H U J

München, 14. Januar 1977 M/17335

Dr.Mario Gosaivez Caleruega 21, 70a pinar de Chamartin

Madrid 33 / Spanien

Neue Anthracyclinglycoside und Verfahren zu deren Herstellung

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Die Anthracyclinglycosidantibiotika sind jene, in welchen ein Tetrahydronaphthacenchromophor an einen Zucker, am häufigsten einen basischen Zucker₍ gebunden ist. Repräsentative Beispiele derartiger Antibiotika sind folgende:

Doxorubicin Daunorubicin Daunorubicinol Pyrromycin Rutilantin Cinerubin A Cinerubin B Aklavin
Rhodomycin A Rhodomycin B γ-Rhodomycin 1 γ-Rhodomycin 2 γ-Rhodomycin 3 γ-Rhodomycin 4 Isorhodomycin A Reticulomycin A

Reticulomycin B

Isochinocyclin A

Galirubin

Mycetin

Mycetin A

Violacin

a-Citromycin

γ-Citromycin

1O-Deoxyrhodomycin

ß-Isorhodomycin

Y-Isorhodomycin

£-Isorhodomycin

Minomycin

Aquayamycin

Ayamycin

Nogalomycin

Doxorubicinol

Von diesen haben Doxorubicin (US-PS 3 590 028), Daunorubicin (GB-PS 1 003 383) und deren Derivate und Analoga weitgehend Aufmerksamkeit als onkolytische Mittel gefunden, d.h. als Mittel, die bei der Behandlung von Leukämie und in der anderen Krebschemotherapie verwendbar sind.

Doxorubicin besitzt die allgemeine Formel

	*Υ'''/s*	Λ
rii	/	-•"III OH
	H
1
I
OCH_{3 (}



ίΤ I^

H ι λ JO ^H-^

, (D

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" 270U05

worin R₁ -COCH₂OH darstellt und R die besondere Daunosaminyl- gruppe der Formel

(II)

ist. Wenn hingegen R. -COCH- bedeutet, resultiert die Formel von Daunorubicin. Viele Analoga dieser Verbindungen wurden hergestellt, hauptsächlich durch Behandlungen an der Hydroxymethylketongruppe von Doxorubicin, der Methylketongruppe von Daunorubicin und an der Ddunosaminylaminogruppe beider Verbindungen. Repräsentative Analoga sind beispielsweise in der US-PS 3 686 136, in J.Med.Chem. VS₁ 872 (1973), von K.Yamamoto et al., in den DT-PS 2 327 211, 2 557 537 und 1 920 198, in Agents and Actions 5/4, 383 (1975) von E. Bachman et al., in Cancer Chemother.Rep. £, 115 (1975) von P.Chandra, id. 123 von F. Arcamone und in Cancer Chemother.Rep. 4_, 707 (1975) von G. Zbinden et al. beschrieben. Als Derivat von besonderem Interesse kann Rubidazon erwähnt werden, d.h. die Verbindung der Formel (I), worin R die in Formel (II) angegebene Bedeutung hat und R₁ -CCH-NNHCO-C,H_c darstellt. Andere sind Doxorubicinol und Daunorubicinol.

Ein Problem, das dauernd mit der Verwendung dieser onkolytlschen Anthracyclinglycoside verbunden ist, stammt von deren hoher allgemeiner, hämatologischer, digestiver und kardia·⁴· ler Toxizität, welche deren verbreitetere Verwendung auf für die wirksame Krebschemotherapie adäquate Dosen beschränkt hat. Die Kardiotoxizität dieser Heilmittel hat sich als besonders störend erwiesen. Somit folgt der Verwendung von Doxorubicin

2 bei kumulativen Dosen im Überschuß von 500 mg pro m schwere, oft letale, Kardiotoxizität. Das Problem der Toxizität, das mit Doxorubicin verbunden ist,hat zu vielen Versuchen geführt, die Verbindung in zweckmäßiger Weise zu modifizieren, doch mußte vor kurzem, nämlich im Jahre 1975, eine Forschergruppe feststellen, daß die Verbindung, die die

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starke und Breitspektrum-Antitumoraktivität von Adräamycin (Doxorubicin) mit sehr geringer kardialer Toxizität vereinigt, noch nicht gefunden worden ist (G. Zbinden et al., Cancer Chemother. Rep. 5^, 707).

Im Laufe der Prüfung der Kardiotoxizität von Doxorubicin wurde gefunden, daß es ein starker Inhibitor der Na- und K-abhängigen Kardialmembrantransport-ATPase und somit ein Inhibitor des K-Transportes ist. Es wurde auch festgestellt, daß dieser Hemmung durch Kalzium entgegengewirkt wurde, wobei angenommen wird, daß Doxorubicin mit Kalzium einen Komplex bildet. Die kumulative Kardiotoxizität von Doxorubicin wäre erklärt, wenn der im Blut gebildete Kalzium-Doxorubicinkomplex in der ATPase inaktiv wäre, während der kleine Teil an freiem Glykosid im wesentlichen irreversibel an das Enzym gebunden wäre. Es wurde gefolgert, daß dichte monomere gesättigte Metallderivate von Anthracyclinglycosiden, wie Derivate, die Metallkationen aufweisen, deren Affinität für die Polydentaliganden des Glykosids größer ist als jene von Kalzium, nicht kardiotoxisch sein müßten. Gleichzeitig könnte diese Modifikation den Mechanismus der onkolytischen Aktivität der Heilmittel nicht berühren, was eine Aufnahme in die DNA der Tumorzellen mit sich bringen könnte. Wie immer der Mechanismus der Wirkung sein mag, wobei auch in keiner Weise eine Bindung an irgendeine besondere Theorie der Wirkung beabsichtigt ist, wurden nun Metallderivate von Anthracyclinglycosiden hergestellt, die im wesentlichen die bisherige charakteristische Kardiotoxizität nicht mehr aufweisen, während sie jedoch die Antikrebswirkung der Stamm verbindungen beibehalten. Die neuen Verbindungen bieten auch andere signifikante Vorteile, wie im nachfolgenden beschrieben.

Es wurde bereits über Komplexe von Metallen mit Anthracyclinglykosiden berichtet. Beispielsweise berichteten D.W.Yesair et al. in A.A.C.R.Abstr. 285 (1974) über Adriamycin-(Doxorubicin) und Daunomycin-(Daunorubicin)komplexe mit Fe(II), Co(II), Cu(II) und anderen Metallkationen. Diese vereinigten Cu(II) und sowohl Adriamycin ("A") als auch Daunomycin ("D")

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und gaben Molverhältnisse für letzteres von Cu(II):D (1:1) an. Sie folgerten daraus, daß Cuproionen etwas gegen verzögerte Anthracyclintoxizität schützen. Danach haben andere Forscher, die diese Arbeit bestätigen wollten, gefunden, daß ein 1:2-Cu(II):D-Polymerkomplex nach der Yesair-Methode entsteht (50 % des Metallkations bilden keinen Komplex), daß aber in vivo unmittelbar eine vollständige Auflösung des Komplexes erfolgt (K. Mailer et al., Biochem.Pharm. 25, 2085 (1976).

Diese Forscher folgerten, daß die vorher in vivo festgestellten Wirkungen nicht der Anwesenheit der Chelatform dieser Heilmittel zugeschrieben werden können.

Die erfindungsgemäß hergestellten Metallderivate der Anthracyclinglycoside sind im wesentlichen in monomerer Form (d.h. ein Glycosid pro Derivatmolekül) und unerwünschte Polymerisation, die beispielsweise Einführung in die DNA von Tumorzellen verhindert, wird im wesentlichen durch neue Methoden vermieden, die die aktive Anwesenheit von freiem Metall verhindern. Gleichzeitig enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorzugsweise mehrere Metallkationen pro Molekül des Anthracyclinglycosids.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Kombination eines Anthracyclinglycosids mit zumindest einem Bidentatliganden und eines divalenten oder trivalenten Metallkations in Lösung, dessen Affinitat für den Liganden größer ist als jene von Ca(II); die Einstellung des pH-Wertes des erhaltenen Systems, um die Chelierung des Metalls durch die Bidentatliganden zu fördern; die Abtrennung der erhaltenen Lösung von festem, metallhaltigem Nebenprodukt und die schnelle Behandlung der erhaltenen Lösung, um eine weitere Reaktion zwischen Glycosid und Metallkationen zu stoppen. Beim Abtrennungsschritt kann eine wesentliche Menge an makromolekularem Polyglycosid-Nebenprodukt ebenfalls entfernt werden. Neue, nach dem obigen Verfahren hergestellte Verbindungen erwiesen sich im wesentlichen frei von Kardiotoxizität, behielten jedoch dennoch onkolytische Aktivität des Stammglycosids auf einer Vergleichsbasis von im wesentlichen mg zu mg bei. Die Einführung von Metall in die Glycoside ändert die sichtbaren, UV-, IP- und NMR-Spektren der Ausgangsverbindungen, was eine

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Änderung der Molekularstruktur der Antibiotika zufolge der Partialnatur der covalenten Bindung, die aus der Wechselwirkung mit den Metallkationen resultiert, anzeigt. Das Metall scheint auch Katabolismus der Stammverbindung in toxische Derivate zu vermindern.

Im Vergleich mit den onkolytischen Stammverbindungen zeigen die Metallderivate der vorliegenden Erfindung eine signifikant verminderte allgemeine, digestive und hämatologische Toxizität. Die Einführung von Metall ändert die elektronischen Eigenschaften der Stammverbindung und scheint somit deren Permeabilitätseigenschaften profund zu berühren. Somit scheint die bevorzugte Verbindung der Erfindung, Triferridoxorubicin, imstande zu sein, sowohl hämatoencephalische als auch intestinale Barrieren passieren zu können, während Doxorubicin selbst dies nicht in wirksamem Ausmaß tut. Man kann erwarten, daß sich derartige Eigenschaften auch in weiteren Ausführungs formen der Erfindung manifestieren, so daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von neoplastischen Krankheiten des Gehirns verwendet und in jedem Fall oral, z.B. mit verdauungssaf t-resistenten überzügen, verabreicht werden können.Zusätzlich zu dem oben Angeführten scheint die Einführung von Metallkationen die immunosuppressiven Eigenschaften der entsnrechenden Stammverbindung signifikant zu vermindern. So senkte beispielsweise bei Vergleichsversuchen Doxorubicin das Milzgewicht und immunokompetente Zellen auf ein signifikantes Ausmaß, während nach der vorliegenden Erfindung hergestelltes Triferridoxorubicin sich als wesentlich weniger immunosuppressiv erwies.

Wenn schließlich die gemäß vorliegender Erfindung hergestellten Verbindungen parenteral verabreicht werden, wird die der Verabreichungsstelle benachbarte Nekrose, welche die Verwendung der entsprechenden Stammverbindung, beispielsweise Doxorubicin, begleitet, offensichtlich eliminiert. Die offensichtlich größere Spezifität der onkolytischen Metallderivate der vorliegenden Erfindung kann den geänderten Permeabilitätseigenschaften, wie oben erwähnt, zuzuschreiben sein. Wie immer

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der Vorteilmechanismus sein mag, ist es offensichtlich, daß die gemäß vorliegender Erfindung hergestellten Verbindungen ein breites Spektrum an vorteilhaften Eigenschaften zeigen, welche in den entsprechenden Stammverbindungen nicht vorhanden sind. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden zweckmäßigerweise an Hand der folgenden Formel (III)

(III)

erläutert, welche bestimmte Trimetall-Anthracyclinglycoside der vorliegenden Erfindung aufweisen. Wenn R- Wasserstoff

-COCH₃ bzw. -COCH-OH bedeuten, resultieren Trimetall-

Daunorubicin und Trimetal]-Doxorubicin. Wie für den Fachmann ersichtlich, kann R₁ andere Bedeutung haben und R_ kann beispielsweise eine Acylgruppe oder eine andere Gruppe in Übereinstimmung mit den oben diskutierten Analoga sein. In jedem Falle ist ersichtlich, daß die Bidentatliganden der Stammverbindung, im bevorzugten Fall, alle durch Metall ("Me") besetzt sind. Wenn bei der Herstellung der Verbindungen der Erfindung weniger Metallreaktant verwendet wird, als erforderlich ist, um im wesentlichen alle Bidentatliganden des Stammglycosids zu substituieren, ist ersichtlich, daß in der erhaltenen Zusammensetzung das Metallkation auf verschiedene Weisen unter

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den Liganden der einzelnen Glycoside, die die Zusammensetzung bilden, verteilt sein kann. Es wird anaenommen, ^aS in derartigen Fällen die Liganden des Aglycons bevorzugt substituiert werden. Vorzugsweise werden jedoch bei Herstellung der Verbindungen der Erfindung zumindest etwa η Mol Metallkation pro Mol Glycosid zugeführt, wobei η die Zahl der Bidentatliganden im Glycosidmolekül ist. Tatsächlich kann ein stöchiometrischer Überschuß an Metallkation verwendet werden in Abhängigkeit von den im nachstehenden beschriebenen Vorkehrungen. Vorzugsweise enthalten im Falle von Glycosiden mit drei Bidentatliganden pro Molekül die erhaltenen Zusammensetzungen zumindest etwa 2 Mol Metall pro Mol Glycosid. Am meisten bevorzugt beträgt in diesem Fall das Verhältnis Metall zu Glycosid 3:1. Während jedoch, wie oben bereits angeführt, keinerlei Bindung an diese Theorie erfolgen soll, ist es möglich, daß die nicht besetzten Bidentatligangen der Stammglycoside als Bindungsstellen für die Hemmung der Na-K-ATPase wirken, so daß zweckmäßiger weise darauf geachtet werden soll, daß ihre Besetzung durch Metall gewährleistet ist.

In dem in der Formel illustrierten Fall sind die Bidentatliganden des Anthracyclinons (AgIykon) Dicarbonyl. Ein anderer Ligand erscheint in der Daunosaminylgruppe, der von der Nachbarschaft einer Aminogruppe und einer Glycosylhydroxylgruppe stammt. Selbstverständlich können besondere Anthracyclinglycoside, die bei Durchführung der Erfindung von Vorteil sind, andere Arten von komplexbildenden Liganden aufweisen. Eine Varietät anderer Bidentatliganden ist von J. Kleinberg et al. in Inorganic Chemistry, S. 218 bis 220, D.C. Heath und Co., Boston (1960), beschrieben.

Die Verbindungen der Erfindung werden in Lösung, vorzugsweise wässeriger Lösung, durch die Kombination des Stammglycosids und eines Metallkations, das in jeder beliebigen Form, vorzugsweise als Salz, zugeführt wird, gebildet. Verwendete Kationen sind solche, deren Affinität für den Liganden größer ist als jene von Ca(II), wie durch die Hill-Methode bestimmt, beispielsweise zweiwertige Kationen, wie Mn(II), Cd(II), Fe(II), Zn(II), Co(II), Pb(II), Ni(II), Cu(II) und Hg(II), und dreiwertige Kationen, wie Fe(III) und Al(III). Bevorzugte Kationen

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sind Fe(II), Fe(III), Cu(II) und Co(II), wobei Fe(III) am meisten bevorzugt wird. Bevorzugte Metallsalzreaktanten sind Chloride, Sulfate und Nitrate, obwohl Hydroxyde ebenfalls verwendet werden können.

Wenn der Metallreaktant und das Glycosid zunächst in wässeriger Lösung vereinigt werden, ist das erhaltene System gewöhnlich relativ sauer. Obwohl eine Lösung des Metallreaktanten bei saurem pH-Wert erleichtert wird, wird vorzugsweise der pH-Wert nahe der Neutralität eingestellt, um die Bidentatliganden zu deprotonisieren und die Chelierung der Kationen zu begünstigen. Somit wird der pH-Wert des Reaktionssystems zweckmäßigerweise auf einen Wert eingestellt, der ausreicht, die Chelierung zu begünstigen, vorzugsweise nahe Neutralität, beispielsweise auf etwa 6,5 bis etwa 7,5, vorzugsweise etwa 6,8 bis etwa 7,2. Die Einstellung des pH-Wertes soll allmählich erfolgen, um die Ausfällung von fester Metallverbindung auf ein Minimum herabzusetzen, deren Anwesenheit offensichtlich zur Bildung von unwirksamen polyglycosidenthaltenden Gruppen beiträgt.

Die Temperatur der Reaktion wird durch Löslichkeitsüberlegungen (untere Grenze) und die Abbautemperatur des besonderen beteiligten Anthracyclins (obere Grenze) bedingt. Gewöhnlich wird während der pH-Einstellung die Temperatur bei etwa 15 bis 5O°C gehalten.

Nach der pH-Einstellung werden die erhaltenen, im allgemeinen monomeren metallhaltigen Derivate zweckmäßigerweise sofort von festen, metallhaltigen Nebenprodukten abgetrennt, beispielsweise durch Filtration. Ein Großteil der im Filtrat enthaltenen Glycosidgruppen ist monomer. Wie durch Ultrafiltrationstechniken gezeigt, sind bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mehr als etwa 95 % und optimalerweise mehr als etwa 99 % des Glycosidgehaltes des Filtrats monomer. Die erhaltene Lösung, die immer eine kleine Menge an nicht-komplexierten löslichen Metallkationen enthält, wird dann sofort weiterverarbeitet, um eine weitere Reaktion zwischen Metall und Glycosid zu verhindern,die zur Bildung von unwirksamen polyglycosidhaltigen Materialien führen kann, wie sie von Yesair (wie oben erwähnt), beschrieben wurden.

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Freies Metall kann beispielsweise durch Magnesiumcarbonat absorbiert oder chromatographisch entfernt werden. Am meisten bevorzugt wird nach gegebenenfalls möglicher Dosierung die filtrierte Lösung einfach und sofort durch schnelles Gefrieren verfestigt. Durch schnelles Gefrieren der filtrierten Reaktionsmischung auf diese Weise wird eine weitere Reaktion zwischen Metall und Glycosid, die sonst auftreten könnte, wirksam verhindert« Danach wird das Produkt vorzugsweise gefriergetrocknet und bei geringer Feuchtigkeit, zweckmäßig bei weniger als etwa 1 %, gelagert.

Das gefriergetrocknete Material, das gewöhnlich einen Großteil an Mannit oder einem anderen Exzipienten enthält, sollte parenteral im wesentlichen unmittelbar nach Rekonstituierung beispielsweise mit sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von beispielsweise 1 ml/2,5 mg multimetallischem Anthracyclinglycosid verwendet werden. Andererseits können Verbindungen, wie beispielsweise Triferridoxorubicin oral in v^rdauungssaft-resistenter Dosisform verabreicht werden.

Obwohl das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Anthracyclinglycosid-Metalls gemäß vorliegender Erfindung wie oben beschrieben verläuft, d.h.Umsetzung des vorher gebildeten Anthracyclinglycosids, beispielsweise Doxorubicin oder Daunorubicin, mit dem geeigneten Metallsalzreaktanten, ist es klar, daß es auch möglich sein kann, die Metallchelierung als einen der Endschritte in einem Anthracyclinglycosidsyntheseverfahren zu bewirken, ohne das freie Anthracyclinglycosid als solches tatsächlich zu isolieren.

Andere Verbindungen zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung sind Anthracyclinglycoside, in welchen sich die Glycosidgruppe von jener unterscheidet, die gewöhnlich an ein bestimmtes Anthracyclinon (Aglykon) gebunden ist, wie sie durch einen Streoptomycetesstarmi in Form eines Glycosids gebildet werden. Derartige Anthracyclinglycoside werden durch Umsetzen eines geeigneten Anthracyclinons, beispielsweise Daunorubicinon, mit einem geeigneten Alkylierungsmittel hergestellt, wie von Penco, Chim.Ind. (Mailand), 50, 908 (1968); CA. 70, 1953J; und in

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der FR-PS 2 183 710 beschrieben. Geeignete Alkylierungsmittel sind 2,3,4,e-Tri-O-acetyl-a-D-glucopyranosylbromid; 3,4,6-Tri-0-acetyl-2-deoxy-2-trifluoracetamido-a-D-glucopyranosylbromid; Di-(N-trifluoracetyl-a-daunosamin).

Durch derartige Reaktionen können die Aglykone der hier genannten Anthracyclinglycoside in eine Vielzahl von anderen Anthracyclinglycosiden übergeführt werden. Die Daunosamingruppen von Daunorubicin und Doxorubicin können beispielsweise durch RhodJsamin oder andere basische Zucker ersetzt werden.

Die hier beschriebenen Metallchelate können sich auch als zweckmäßig für die Kontrolle von Spurenmetallionen erweisen, insbesondere was ihre Fähigkeit betrifft, als Quellen von Spurenmetallen beispielsweise zum Zwecke des Pflanzenwachstums zu dienen. Die Metallchelate von Fe⁺ können von speziellem Wert für die Verwendung bei der Behandlung von Eisenchlorose oder -mangel bei Pflanzen sein. Die angewandte Menge an Ferrichelat würde durch den Gehalt an verfügbarem Eisen in der speziellen Erde, in der die Pflanzen wachsen, bestimmt werden. Die zweckmäßigerweise verwendete Menge an Ferrichelat sollte ausreichend sein, um den chlorotischen Zustand innerhalb eines Zeitraumes von 1 bis 2 Wochen zu eliminieren. Weiterhin können die Verbindungen auch als Stabilisatoren für verschiedene Systeme dienen, wie Kunststoffe, die von Vinylidenchlorid stammen, worin Chloridspuren zur Instabilität des Kunststoffes Anlaß geben. Bei derartigen Systemen wird das Metallchelat zweckmäßigerweise in Konzentrationen verwendet, die ausreichen, die Wirkungen der maximalen Chloridmenge, die freigesetzt werden könnte, zu beseitigen.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, ohne diese jedoch hierauf zu beschränken.

Biochemische und pharmakologische Studien der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen

In der nachstehenden Tabelle I sind die Cissoziationskonstanten von Doxorubicin und Daunorubicin mit verschiedenen Metallen angegeben. Die Metalle sind in der Reihenfolge ihrer allgemeinen Chelierungsaffinität angeführt. Die Konstante wurde für einige von ihnen angegeben. wie gezeigt, ist das Metall mit

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der höchsten Affinität für Doxorubicin und Daunorubicin dreiwertiges Eisen und das Metall mit der geringsten Affinität Kalzium. Die Dissoziationskonstante wurde nach der Hill-Methode berechnet, wobei die Farbänderung bei Bildung der Metallderivate der Antibiotika ausgenützt wurde. Die angegebene Dissoziationskonstante bezieht sich auf die stärkste Wechselwirkung Ligand Metall in jedem Fall. Der Hinweis auf die Affinität eines Metalls für jeden bestimmten Glycosid-Polydentat-"Liganden" bezieht sich im Falle eines Glycosids mit mehreren Liganden auf jenen, der die stärkste Wechselwirkung Ligand - Metall darstellt, bestimmt nach der Hill-Methode.

Tabelle I

Metall Dissoziationskonstante des

Metallderivats mit Doxorubicin und Daunorubicin

Fe(III) 5 χ 1O~⁷ M

Hg(II)

Cu(II) 1 x 1O~⁶ M

Al(III) Ni(II) Pb(II)

Co(II) 1,3 x 1O"⁵ M

Zn(II)

Fe(II) 3,5 χ 1o"⁵ M

Cd(II) Mn(II)

Ca(II) 12,7 χ 10~⁵ M

Mg(II)

Der Versuch gemäß Tabelle I zeigt, daß die Metalle mit der höchsten Affinität für Doxorubicin und Daunorubicin Fe , Cu und Co sind, wobei Ca die geringste Affinität aufweist. Der Rest der Metalle muß entsprechend ihrer Stellung in der Tabelle eine dazwischenliegende Affinität aufweisen.

In Tabelle II ist die Wirkung von Doxorubicin, Ferridoxorubicin 2:1 und Ferridoxorubicin 3:1 auf die Aktivität des ATPasenatrium-kaliumabhängigen Enzyms, isoliert von einem Kaninchenherz, angegeben.

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Tabelle II

% ATPase Na-K-abhängige Aktivität bei Anwesenheit steigender Konzentrationen von Anthracyclinen

Konzentration

100%	65 %	40 %	25 %	25 %	25
100%	80 %	60 %	60 %	60 %	60
100%	100 %	100 %	100 %	100 %	100
100%	100 %	100 %	100 %	100 %	100

Heilmittel OM 1O~¹³M 1O^-11M 10 ⁹M 10~⁷M 10~⁵M

Doxorubicin

Ferridoxorubicin 1:1

Ferridoxorubicin 2:1

Ferridoxorubicin 3:1

Der Versuch gemäß Tabelle II zeigt, daß Doxorubicin ein starker Inhibitor von Na-K ATPase ist, was nunmehr offensichtlich mit der Kardiotoxizität eng verbunden ist. Es

sind die 2:1 und 3:1 Ferriderivate von Doxorubicin im Enzym völlig inaktiv, während das Ferriderivat 1:1 von Doxorubicin teilweise inhibierend ist. Aus diesen Tatsachen kann auf Basis der Ergebnisse von Tabelle I gefolgert werden, daß dem Metallderivat von Doxorubicin, das mit dem Metall in einem Verhältnis 2:1 oder höher gebildet wird, der inhibierende Effekt auf die Na-K ATPase fehlt, d.h. Kardiotoxizität nicht vorhanden ist. Eine ähnliche Arbeit hat gezeigt, daß Metallderivate von Daunorubicin gleichfalls die Na-K ATPase nicht hemmen. Die übrigen, hier beschriebenen Chelate besitzen ein ähnliches Verhalten. Beispielsweise hat sich gezeigt, daß die folgenden Doxorubicinanaloga Na-K ATPase hemmen. Man kann erwarten, daß ihre entsprechenden Metallderivate, wenn sie hergestellt werden, wie oben für Doxorubicin beschrieben wurde, eine bemerkenswerte Reduktion der Kardiotoxizität zeigen. Die Verbindungen besitzen die allgemeine Formel (I), worin R eine Gruppe der Formel (II) ist und R₁ die angegebene Bedeutung hat.

Tabelle III

Analoga R₁ Konzentration für

50 % Hemmung Na-K ATPase

Rubidazon -C=N-NHCO-CcH₁.

"CH ^{6 5}

NSC-219977 -C=N-NH-CO-CcH^Cl 10"¹¹M

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Tabelle III (Fortsetzung)

NSC-221264	-C=N-NH-CO-C^-H-OH ^SCH₃ ^{6 4}	10-¹⁰M
NSC-227013	-C=N-NH-CO-CcH.-N ""^CH3 ^CH₃ ^{6 4} \CH₃	10"¹⁰M
NSC-219976	-C=N-NH-CO-CcH^OCH-, "CH₃ ^{6 4 3}	10~⁹M
NSC-237638	-C-O-CH₃	10~⁹M
NSC-236672	-C=N-NH-C0-C_fiH₄ OH ^XCH₃	10~⁹M
NSC-234740	-C=N-NH-CO-CH₆H₄O-(CH₂)₂-CH₃ ^CH₃	10"⁸M
NSC-233854	-C=N-NH-CO-C^H.-Li	10~⁷M
NSC-211391	-C=N-NH-CO-(CH₉) -,-CH, ^NCH₃ ^λ ^{J J}	10"⁶M
NSC-221266	-C=N-NH-CO-C_CH.-Cl ^CH3	1O^-6M
NSC-216071	-C=N-NH-CO-C^-H₁. ^XCH₂OH ^{6 5}	10~⁵M
NSC-221265	-C=N-NH-CO-C₆H₄-NO₂	10~⁵M
NSC-237672	-C=N-NH-CO-C,H.-Cl ^CH₃ ^{6 4}	10"⁵M

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Tabelle IV illustriert den Vergleich zwischen Doxorubicin und Ferridoxorubicin 2,5:1 bei der DNA-Synthese von Leukämie 1210-Mäusezellen.

Tabelle IV

% Hemmung der DNA-Synthese bei zunehmenden Konzentrationen des Anthracyclins

Konzentration

Heilmittel ΟμΜ 3μΜ 5μΜ 7,5μΜ 10 μΜ

Doxorubicin O % 60 % 68 % 75 % 90 %

Ferridoxorubicin (2,5:1) 0 % 50 % 70 % 80 % 90 %

Der Versuch gemäß Tabelle IV zeigt, daß die Ferriderivate auf DNA-Synthese den gleichen inhibierenden Effekt aufweisen wie das Stammantibiotikum und daß daher die Antitumoraktivität, die auf der Hemmung von DNA-Synthese basiert, im Metallderivat verbleibt.

In Tabelle V ist die Toxizität von Doxorubicin und Ferridoxorubicin verglichen. Dieser Versuch wurde mit Proben von Ferridoxorubicin durchgeführt, die mit verschiedenen Mengen Eisen in einem Verhältnis von mehr als 2:1 hinsichtlich des Antibiotikums hergestellt wurden, und jede Probe führte zu ähnlichen Resultaten. Die Heilmittel wurden lediglich durch eine einzige intraperitoneale Injektion an Gruppen von zehn Mäusen verabreicht und die Zahl der überlebenden nach 8 Tagen aufgezeichnet.

Tabelle V

% überlebende	Mäuse nach Verabreichung der	mg/kg	Dosen	Anthracycline	50 mg/kg	60 mg/kg
		60 % 100 %	30 mg/kg 40		0 % 40 %	0 % 30 %
Heilmittel	10 mg/kg 20	0 % 100 %	mg Ag
Doxorubicin Ferridoxorubicin	100 % 100 %	0 % 70 %

Dieser Versuch zeigt, daß Ferridoxorubicin wesentlich weniger toxisch ist als Doxorubicin. Bei graphischer Darstellung der Daten der Tabelle IV wird berechnet, daß die mittlere letale Dosis des verwendeten Ferridoxorubicins 47 mg/kg beträgt.

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Tabelle VI zeigt die therapeutische Wirksamkeit von Ferridoxorubicin bei Leukämie P-338 der Maus. Bei diesem Versuch wurden Ferridoxorubicinproben verwendet, die mit verschiedenen Verhältnissen Metall zu Antibiotikum von mehr als bzw. gleich 2:1 hergestellt wurden; mit allen Proben wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Die mittlere Uberlebensrate wurde an einer Gruppe von 10 Mäusen gemessen, denen 100 000 Leukämiezellen eingeimpft worden waren und die am ersten Tag nach Impfung mit zunehmenden Dosen Doxorübicin und Ferridoxorubicin behandelt wurden.

Tabelle VI Tage der mittleren Uberlebenszeit von leukämischen Mäusen

Dosis (ip)

Heilmittel 0 mg/kg 4 mg/kg 8 mg/kg 12 mg Ag 24 mg/kg 36 Doxorübicin 11 Tage 50 Tage 48 Tage 42 Tage 6 Tage 4 Tage Ferridoxorubicin 11 Tage 5O Tage 48 Tage 42 Tage 35 Tage 23 Tage

Der Versuch gemäß Tabelle VI zeigt, daß Ferridoxorubicin eine therapeutische Wirkung gleich jener von Doxorübicin bei leukämischen Mäusen aufweist, daß es jedoch zufolge seiner niedrigen Toxizität in größeren Dosen verwendet werden kann. Da die optimale Heildosis von Doxorübicin in Menschen wegen der beschränkenden Toxizität nicht erreicht werden kann, stellt Ferridoxorubicin wegen seiner niedrigen Toxizität einen klaren therapeutischen Fortschritt dar.

In Tabelle VII sind die elektrokardiographischen Änderungen unmittelbar nach intravenöser Injektion zunehmender Dosen von Doxorübicin und Ferridoxorubicin 3:1 an Kaninchen angegeben.

Dieser Versuch zeigt, daß mit Ferridoxorubicin im Elektrokardiogramm keine signifikanten Änderungen auftreten, obwohl sie mit Doxorübicin sehr intensiv sind, und es wird das Fehlen von Kardiotoxizität des Ferridoxorubicins bestätigt.

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Tabelle

VII

Elektrokardiographische Änderungen

Dosis

Heilmittel

5 mg/kg 10 mg/kg 15 mg/kg 20 mg/kg 30 mg/kg

Doxorubicin

ausgeglichene neg.T-Welle neg.T T-Welle weites

QRS

neg.T neg. T weites weites QRS QRS Arrhythmie Bradykardiearrhyth-

mie

Ferridoxorubicin

keine

ohne signifikante Änderung

Tabelle VIII zeigt die sichtbaren und IR-Spektralcharakteri- stika von Doxorubicin und Ferridoxorubicin (3:1).

Tabelle

VIII

Wellenlänge

Optische Absorption oder % Transmittanz bei verschiedenen Wellenlängen

1730 1620 1590 1585 1570 600 480 280

cm

-1

cm

-1

cm

-1

cm

-1

cm

-1

nm

Doxorubicin
Ferridoxorubicin

30 % 50 % 0 % 10 % 23 % 20 %

% 0 % 0 % 0,180 0,200 % 37 % 0,080 0,100 0,360

Aus Tabelle VIII geht hervor, daß die Komplexe verschiedene Absorptionen von den freien Verbindungen bei verschiedenen Wellenlängen zeigen und daß auch die Komplexe verschiedene Absorptionspeaks aufweisen.

Tabelle IX zeigt einen Vergleich zwischen der hämatologischen Toxizität von Doxorubicin und Ferridoxorubicin (3:1).

Tabelle

Hämatologische Toxizität von Anthracyclinderivaten

(Leucocytenzahl/mm )

Tag

Heilmittel
Doxorubicin

Dosis (mg/kg) 10 20

4.700 4.700

3.300 2.400

709829/0940

Ferridoxorubicin

	IX	4.700	2701405
90	4.700
Fortsetzung der Tabelle	4.700
10	4.700	5. 100
15	4.700	4.400
20	4.700	4.400
30	4.700	3.600
40	3.800
50	2.800
60	1 .8OO

Es kann beobachtet werden, daß die hämatologische Toxizität, die mit 20 mg/kg Doxorubicin festgestellt wurde, mit Ferridoxorubicin bis zu Konzentrationen von mehr als 50 mg/kg nicht erreicht wird.

Die biochemischen und pharmakologischen Studien, die in den Tabellen I bis IX aufgezeigt wurden, zeigen insgesamt, daß Doxorubicin und Daunorubicin Metallchelatderivate mit allen in Tabelle I angeführten Metallen bilden; daß diese Metallchelatderivate besonders stabil sind, wenn sie mit Ferrieisen, Kupfer und Kobalt gebildet werden; und daß die gebildeten Metallchelatderivate mit einem Verhältnis Metall zu Antibiotikum von 2:1 oder mehr in dem ATPase Na-K-abhängigen Enzym inaktiv, bei Mäusen und Kaninchen weniger toxisch und bei Mausleukämie therapeutisch aktiv sind. Obwohl der Großteil der Versuche mit Ferridoxorubicin mit verschiedenen Verhältnissen Metall zu Antibiotikum (2:1 oder größer) durchgeführt wurde, sind die Ergebnisse mit Metallchelatderivaten beider Antibiotika mit verschiedenen Metallen in verschiedenen Verhältnissen ähnlich.

Beispiel 1: Ferridoxorubicin 3:1 (Triferridoxorubicin)

100 Mikromol Doxorubicin und 300 Mikromol Ferrichlorid wurden in wässeriger Lösung bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren in einem Kolben, der mit einem pH-Meßgerät versehen v.'ar, gemischt. Bei Berührung des Eisens rr.it dem Antibiotikum begann sich der Komplex zu bilden und der pH-Viert wurde langsam mit konz. NaOH auf 7,3 eingestellt. Dann wurde die Lösung mit Wasser auf eine Konzentration von 1 mg Doxorubicin pro ml eingestellt und ein tris-Hydroxymetnylaminomethanpuffer bei pH 7,3 zu einer Endkonzentration von 12 mM zugesetzt. Unmittel-

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. 270 HÜ5

it

bar danach wurde die Lösung schnell durch ein 0,22 u steriles Filter geleitet. Dann wurde die Lösung schnell in einen kleinen Kolben gegossen, durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gefroren und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde in Ampullen mit einem Gehalt an 10 mg steril verschlossen und unmittelbar vor der Verwendung mit 10 ml Wasser rekonstituiert.

Auf ähnliche Weise können andere Anthracyclinglycoside mit Ferrichlorid unter Bildung entsprechender Ferrichelate umgesetzt werden.

Beispiel 2: Ferridoxorubicin (3,5:1)

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch 350 Mikromol Ferrichlorid und eine Reaktionstemperatur von 42 C angewendet wurden.

Beispiel 3: Ferriuoxorubicin (2,5:1)

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch 250 Mikromol Ferrichlorid verwendet wurden und der pH-Wert auf 6,9 eingestellt wurde.

Beispiel 4: Ferridoxorubicin (2:1)

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei jedoch 200 Mikromol Ferrichlorid verwendet wurden; es wurde das 2:1-Metallderivat erhalten.

Beispiel 5: Ferridoxorubicin (1:1)

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch 100 Mikromol Ferrihydroxyd verwendet wurden.

Beispiel 6: Cupridoxorubicin

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch Cuprisulfat anstelle von Ferrichlorid verwendet wurde.

Beispiel 7: Kobaltdoxorubicin

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch Kobaltchlorid anstelle von Ferrichlorid verwendet wurde.

Im Lichte der obigen Ausführungen werden für den Fachmann auf diesem Gebiet andere Möglichkeiten, durch welche die erfindungsgemäßen Verbindungen erhalten werden können, klar. Beispielsweise kann das Monochlorhydrat von Daunorubicin anstelle

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270U05

von Doxorubicin bei jedem der obigen Verfahren verwendet werden. Es können auch andere polare Lösungsmittel als Wasser verwendet werden, beispielsweise können die Metallderivate durch Vereinigen des Kations und des Glycosids in einem Alkohol unter Rühren und Luftausschluß gebildet werden. Ähnlich können zahlreiche andere metallhaltige Reaktanten als FeCl., verwendet werden, z.B.

Tabelle X

Repräsentative metallhaltige Salze zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung

FeSO₄ HgCl₂

CuSO ZnSO₄

NiCl₂ Cd (NO₃)₂

CoCl₂ Pb(OCOCH₃)₂

Al (SO.) Pb(NO-J

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden bei der Krebsbehandlung in onkologisch wirksamen Mengen verabreicht, gewöhnlich in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger. So kann beispielsweise Triferridoxorubicin oder Triferridaunorubicin an Patienten verabreicht werden, die an neoplastischen Krankheiten leidern, u.zw. in Dosen von etwa 40 bis

2
250 mg/m Körperfläche in Intervallen von etwa 1 bis 3 Wochen. Im allgemeinen sind diese Verbindungen zur Verwendung bei all jenen Krebskrankheiten bestimmt, bei welchen die entsprechenden Stammglycoside Anwendung finden, sowie bei anderen Arten von Krebs, wo sich die Derivate zufolge ihrer neuen Permeabilitätseigenschaften als aktiv erwiesen (beispielsweise Gehirn).

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Claims

Patentans ρ r ü c h e

1. Verfahren zur Herstellung von neuen Anthracyclinglycosiden, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Glycosid aus der Gruppe Doxorubicin und Daunorubicin

mit zumindest etwa 3 Mol pro Hol Glycosid eines fletallkations in wässeriger Lösung vereinigt, wobei die Affinität des Metallkations für Bidentatliganden der Glycosidmoleküle größer ist als jene von Ca(II),

b) den pH-Wert des erhaltenen Systems auf etwa 6,5 bis 7,5 einstellt, um die Chelierung der Metallkationen durch Bidentatliganden zu fördern, wobei lösliche monomere metallhaltige Glycoside gebildet werden,

c) die erhaltene Lösung von festen metallhaltigen Nebenprodukten abtrennt und

d) unmittelbar nach der Abtrennung die Lösung durch schnelles

Gefrieren behandelt, um eine weitere Reaktion zwischen Glycosid und Metallkationen zu verhindern.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Glycosid mit zumindest 2 Mol pro Mol Glycosid eines Kations aus der Gruppe Fe(II), Fe(III), Cu(II) und Co(II) vereinigt.

3. ' Eine Glycosidzusammensetzung der allgemeinen Formel

(a)

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ORIGINAL INSPECTED

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worin einer ode : mehrere der Bidentatliganden (a), (b) und (c) durch ein cheliertes Metallkation der Gruppe Mn(II), Cd(II), Fe(II), Zn(II), Co(II), Pb(II), Ni(II), Al(III), Cu(III), Hg(II) und Fe(III) besetzt sind und R₁ -COCH₃ oder -COCH₀OH bedeutet, wobei das Verhältnis cheliertes Metallkation zu Glycosid in der Zusammensetzung zumindest etwa 2 beträgt.

4. Triferridoxorubicin.

5. Triferridaunorubicin.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine onkologisch wirksame Menge zumindest eines im wesentlichen monomeren Anthracyclinglycosidchelats eines Metallkations aus der Gruppe Fe(II), Cu(II), Co(II) und Fe(III), welches als Inhibitor von Na-K ATPase unwirksam ist, in einem pharmazeutisch verwendbaren Träger enthält.

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