DE2457107A1

DE2457107A1 - SALTS AND COMPLEXES OF LYSOZYME AND LYSOZYME DERIVATIVES

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Publication number: DE2457107A1
Application number: DE19742457107
Authority: DE
Inventors: Tiberio Bruzzese; Rudolfo Ferrari
Original assignee: Prodotti Antibiotici SpA
Current assignee: Prodotti Antibiotici SpA
Priority date: 1973-12-03
Filing date: 1974-12-03
Publication date: 1975-06-12
Also published as: JPS50116619A; JPS5538114B2; BE822807A; GB1431709A; FR2253534A1; FR2253534B1

Description

SPA Societa Prodotti Antibiotici S.p.A. 8, Via■ Biellay 1-20143 MilanoSPA Societa Prodotti Antibiotici S.p.A. 8, Via ■ Biellay 1-20143 Milano

Salze und Komplexe von Lysozym und LysozymderivateSalts and complexes of lysozyme and lysozyme derivatives

Die Erfindung betrifft neue Salze und Komplexe von Lysozym und basischen Derivaten des Lysozyms mit Gallensäuren wie auch die Herstellung dieser Verbindungen und ihre pharmazeutische Verwendung.The invention relates to new salts and complexes of lysozyme and basic derivatives of lysozyme with bile acids such as also the preparation of these compounds and their pharmaceutical use.

Es ist bekannt, daß Lysozym ein natürliches Protein ist, welches in biologischen fluiden Materialien gefunden wird und welches eine enzymatische Aktivität aufweist und eine bemerkenswerte lytische Einwirkung auf verschiedene saprophytische und pathogene Bakterien zeigt. Vom biologischen Standpunkt aus spielt es eine defensive Rolle, d.h. es schützt den Organismus vor dem Angriff durch pathogene Viren und bakterielle Mikroorganismen, und daher wird Lysozym als endogenes Antibiotikum angesehen.It is known that lysozyme is a natural protein found in biological fluid materials and which has an enzymatic activity and a remarkable one shows lytic action on various saprophytic and pathogenic bacteria. From a biological point of view it plays a defensive role, i.e. it protects the organism from attack by pathogenic viruses and bacterial microorganisms, and therefore lysozyme is considered an endogenous antibiotic.

Die Struktur von Lysozym wurde vollständig aufgeklärt. Es enthält 129 Amisosäurereste, wobei Reste dibasischer Aminosäuren besonders häufig vorkommen; es sind 11 Reste von Arginin, 6 Reste von Lysin und 1 Rest von Histidin vorhanden. Diese besondere Zusammensetzung von Lysozym ergibt eine starke positive Ladung und einen hohen isoelektrischen Punkt (um 11), und dadurch unterscheidet sich sich von der Haupt-The structure of lysozyme has been fully elucidated. It contains 129 amino acid residues, with residues of dibasic amino acids occur particularly frequently; there are 11 residues of arginine, 6 residues of lysine, and 1 residue of histidine. This particular composition of lysozyme gives it a strong positive charge and a high isoelectric point (at 11), and this differs from the main

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zahl der anderen Proteine, bei denen im allgemeinen der saure Charakter überwiegt.number of other proteins in which the acidic character generally predominates.

Im Hinblick auf das biologische Interesse, das mit den basischen Eigenschaften des Lysozyms verbunden ist, wurden zahlreiche Lysozymderivate hergestellt, die eine noch höhere positive Ladung als Lysozym selbst besitzen. Einige dieser Derivate (vergl. GB-PS 1 209 214) werden beispielsweise erhalten, indem man die Säurefunktionen der Dicarbonaminosäurereste (Asparaginsäure und Glutaminsäure) durch Veresterung schützt oder indem man die £ -Aminogruppen der Lysinreste in stärker basische £ -Guahidinogruppen überführt, wobei man Gruppen von Homoarginin erhält, oder indem man beide Verfahren verwendet.In view of the biological interest associated with the basic properties of the lysozyme, numerous Lysozyme derivatives produced that have an even higher level have a positive charge as lysozyme itself. Some of these derivatives (see GB-PS 1 209 214) are obtained, for example, by performing the acid functions of the dicarboxylic amino acid residues (aspartic acid and glutamic acid) Esterification protects or by removing the £ -amino groups of the Lysine residues converted into more basic £ -guahidino groups, giving groups of homoarginine, or by both methods are used.

Biologisch gesehen behalten alle obigen Derivate die Antivirenaktivität des ursprünglichen Lysozyms bei RNA- und DNA-Viren bei oder verstärken diese Aktivität und sie sind fähig, mit diesen Komplexe zu bilden, indem sie die entgegengesetzten Ladungen neutralisieren unter entsprechender Ausfällung. Die Guanidyl-Lysozyme halten ebenfalls die typische antibakterielle lytische Aktivität des Lysozyms. Biologically, all of the above derivatives retain antiviral activity of the original lysozyme in RNA and DNA viruses or increase this activity and they are able to to form complexes with these by neutralizing the opposite charges with corresponding precipitation. The guanidyl lysozymes also maintain the typical antibacterial lytic activity of the lysozyme.

Die oben angegebenen Eigenschaften ermöglichen, daß Lysozym und seine stärker basischen Derivate wasserlösliche Salze mit starken Säuren, beispielsweise mit Chlorwasserstoffsäure, wie auch mit schwachen Säuren, beispielsweise mit Ascorbinsäure, bilden. Lysozym und seine basischen Derivate besitzen ebenfalls die Neigung, mit vielen anionischen Makromolekülen Komplexe zu bilden, die im allgemeinen unlöslich sind, beispielsweise mit Nucleinsäuren und mit elektronegativen Kolloiden.The properties given above enable lysozyme and its more basic derivatives to form water-soluble salts with strong acids, for example with hydrochloric acid, as well as with weak acids, for example with ascorbic acid, form. Lysozyme and its basic derivatives also tend to have many anionic macromolecules To form complexes which are generally insoluble, for example with nucleic acids and with electronegative colloids.

Überraschenaerweise wurde gefunden, daß Lysozym und die basischen Derivate davon ebenfalls wasserlösliche Salze oder nur etwas wasserlösliche Salze und Komplexe mit GallensäurenSurprisingly, it has been found that lysozyme and the basic derivatives thereof are also water-soluble salts or only slightly water-soluble salts and complexes with bile acids

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bilden. Mit anderen Worten sind diese anionischen oberflächenaktiven Mittel fähig, sich mit den basischen Stickstoffatomen des Proteinmoleküls zu verbinden und ionische Bindungen zu bilden. Bei der Zusammenwirkung zwischen den Gallensäuren und dem Protein können auch andere Kräfte beteiligt sein, und so kann das oberflächenaktive Mittel mit dem Protein in Form eines Komplexes assoziiert sein, und zwar in Mengen, die über den stöchiometrischen Mengen liegen, die durch die Anzahl der kationischen Ladungen vorhersehbar sind.form. In other words, these are anionic surfactants Means able to combine with the basic nitrogen atoms of the protein molecule and form ionic bonds to build. Other forces may also be involved in the interaction between the bile acids and the protein and so the surfactant may be associated with the protein in the form of a complex in amounts in excess of the stoichiometric amounts that are predictable from the number of cationic charges.

Diese neuen Verbindungen sind von großem potentiellem Interesse vom pharmakologischen Standpunkt aus, da sie die basischen Antivirenaktivität der Lysozinnverbindungen durch einen Lösungsmechanismus verstärken, der im Zusammenhang mit der Oberflächenwirkung der Gallensäuren steht oder ebenfalls durch Synergismus mit einer spezifischen Antivirenaktivität der Gallensäuren selbst.These new compounds are of great potential interest from a pharmacological point of view, since they are the basic Antiviral activity of the lysotin compounds through a Reinforce the dissolution mechanism that is or is related to the surface action of the bile acids through synergism with a specific antiviral activity of the bile acids themselves.

Es ist bereits bekannt, daß, wenn oberflächenaktive Mittel mit Mikroorganismen inkubiert werden, sie offensichtlich mit den Zellmembranen, Zellbestandteilen wie mit Kalium, Aminosäuren, Purinen und Pyrimidinen reagieren, in das Inkubationsmedium diffundieren und daß Protoplasten sehr schnell lysiert (bzw. verdaut) werden. Die erhöhte Permeabilität·der biologischen Membranen, die durch die oberflächenaktiven Mittel hervorgerufen wird, potenziert synergistisch die bekannten antiviralen und antibakteriellen Aktivitäten von Lysozym und seinen basischen Derivaten.It is already known that when surface active agents are incubated with microorganisms, they are evident react with the cell membranes, cell components such as potassium, amino acids, purines and pyrimidines, in the incubation medium diffuse and that protoplasts are lysed (or digested) very quickly. The increased permeability · the biological membrane caused by the surfactants synergistically potentiates the known antiviral and antibacterial activities of lysozyme and its basic derivatives.

Typische Verwendungsgebiete und Einwirkungsgebiete der neuen erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen die therapeutische Behandlung von Herpes simplex und Herpes zoster, rekurrente Aphthosis, Rhinitis und Colitis Virenursprungs und anderer Virenkrankheiten einschließlich bestimmter carcinogener Krankheiten.Typical areas of use and areas of action of the new compounds according to the invention include therapeutic Treatment of herpes simplex and herpes zoster, recurrent aphthosis, rhinitis and colitis of viral origin and others Viral diseases including certain carcinogenic diseases.

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Die besondere Affinität gegenüber den Gallenwegen bedingt, daß diese neuen Verbindungen potentiell besonders aktiv in dieser Richtung sind. Die antivirale Aktivität des Lysozyms wird von antiinflaramatorisehen und antitoxischen Wirkungen begleitet, was für die Bekämpfung einer großen Vielzahl pathologischer Fälle nützlich ist.The particular affinity for the biliary tract means that these new compounds are potentially particularly active in that direction are. The antiviral activity of the lysozyme is enhanced by anti-inflammatory and antitoxic effects accompanies what is useful for combating a wide variety of pathological cases.

Die Herstellung der neuen Salze und Komplexe ist sehr einfach. Im allgemeinen wird Lysozym oder ein basisches Derivat davon in Form der freien Base direkt mit einem geringen Überschuß an Gallensäure umgesetzt. Die Umsetzung wird üblicherweise in wäßrigem Medium oder in einem Medium, das organische Lösungsmittel enthält, durchgeführt, bevorzugt bei Umgebungstemperatur, aber in jedem Fall bei einer Temperatur, die ausreichend niedrig ist, daß keine Denaturierung von irgendeiner Proteinverbindung stattfindet. Die Reaktionszeit ist im allgemeinen recht kurz und beträgt.üblicherweise ■ weniger als 4 bis 6 Stunden. Beim Fortgang der Salzbildung lösen sich das Lysozym und die Gallensäure, die in Wasser vollständig oder teilweise unlöslich sind allmählich, und man erhält pH-Werte in der Gegend des Neutralpunktes. Nach dem Abfiltrieren möglicher Spuren überschüssigen Materials und somit unlöslichen Materials wird das gewünschte Salz durch Lyophilisierung, Konzentration zur Trockene bei verminderter Temperatur und vermindertem Druck oder durch Ausfällung mit organischen Lösungsmitteln isoliert. In anderen Fällen, wo das gebildete Salz, in Wasser nur mäßig löslich ist, kann es direkt durch Filtration isoliert werden. Anstelle einer direkten Zwischenwirkung zwischen dem basischen Protein und der Gallensäure kann die Herstellung in einigen Fällen mit größerem Vorteil durchgeführt werden, indem man ein einfaches Salz der Lysozymverbindung, beispielsweise Lysοzym-hydroChlorid, mit einem Salz der Gallensäure, beispielsweise einem Natriumsalz, umsetzt. Eine doppelte Zersetzungsreaktion findet schnell statt, und man erhält die gewünschte Verbindung. Die Mittel und die Bedingungen für die Umsetzung sind ähnlich wie sie bereits oben beschrieben wurden.The preparation of the new salts and complexes is very simple. In general, lysozyme or a basic derivative thereof is used reacted directly in the form of the free base with a small excess of bile acid. Implementation is customary carried out in an aqueous medium or in a medium containing organic solvents, preferably at ambient temperature, but in each case at a temperature sufficiently low that no denaturation of any Protein connection takes place. The reaction time is generally quite short and is usually ■ less than 4 to 6 hours. As the salt formation progresses, the lysozyme and the bile acid dissolve completely in water or are partially insoluble gradually, and pH values in the region of the neutral point are obtained. After filtering off possible traces of excess material and thus insoluble material, the desired salt is made by lyophilization, Concentration to dryness at reduced temperature and pressure or by precipitation with organic Solvents isolated. In other cases, where the salt formed is only sparingly soluble in water, it can be used directly can be isolated by filtration. Instead of a direct interaction between the basic protein and the Bile acid manufacture can in some cases be done with greater advantage by adding a simple salt the lysozyme compound, for example lysozyme hydrochloride, with a salt of bile acid, for example a sodium salt. A double decomposition reaction takes place takes place quickly, and you get the connection you want. The means and conditions of implementation are similar to they have already been described above.

Da in Lysozym und in seinen Derivaten unterschiedliche Arten von basischen Gruppen vorhanden sind, einige davon besitzen unterschiedliche Basizitätswerte, ist es ebenfalls möglich, Verbindungen mit unterschiedlichem Grad an Salzbildung oder Komplexbildung herzustellen, d.h. solche, die vollständig oder teilweise umgesetzt sind, und der Gehalt der einzelnen Komponenten kann daher stark variieren. Es ist ebenfalls möglich, Doppelsalze herzustellen, die unterschiedliche Säureanionen enthalten. In all den Fällen können die erhaltenen Verbindungen, sofern erforderlich, gereinigt werden, beispielsweise durch Waschen mit geeigneten organischen Lösungsmitteln, durch die nichtumgesetzte Gallensäure, die vorhanden ist, gelöst und beseitigt wird. As in lysozyme and in its derivatives different types of basic groups are present, some of which have different basicity values, it is also possible To produce compounds with varying degrees of salt formation or complex formation, i.e. those that are completely or have partially reacted, and the content of the individual components can therefore vary widely. It is also possible To produce double salts that contain different acid anions. In all the cases, the received Compounds, if necessary, are cleaned, for example by washing with suitable organic solvents, is dissolved and eliminated by the unreacted bile acid that is present.

Beispiele von basischen Derivaten des Lysozyms, die zur Herstellung der neuen Salze verwendet werden können, umfassen Lysozym-methylester, Guanidyl-lysozym, Guanidyl-lysozym-methylester und Alkylamidino-lysozyme. Die Gallensäuren, die verwendet werden können, umfassen beispielsweise Cholsäure, Desoxycholsäure, Dehydrocholsäure, Glykocholsäure, Taurocholsäure u.a. Examples of basic derivatives of lysozyme that can be used to prepare the new salts include lysozyme methyl ester, guanidyl lysozyme, guanidyl lysozyme methyl ester and alkylamidino lysozymes. The bile acids that can be used include, for example, cholic acid, deoxycholic acid, dehydrocholic acid, glycolic acid, taurocholic acid, and others

Die neuen Verbindungen sind farblose, kristalline Feststoffe ohne definierten Schmelzpunkt. Sie besitzen unterschiedliche Löslichkeitsgrade in Wasser und alle sind unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, beispielsweise Diäthyläther, Petroläther, Ligroin, Benzol und Cyelohexan. Sie werden im allgemeinen durch Säuren und starke Alkalien gespalten.The new compounds are colorless, crystalline solids without a defined melting point. They own different Degrees of solubility in water and all are insoluble in common organic solvents, for example diethyl ether, Petroleum ether, ligroin, benzene and cyelohexane. They are generally broken down by acids and strong alkalis.

Die Analyse der neuen Verbindungen kann.durch direkte Titrierung der Komponenten erfolgen. Der Lysozymgehalt der neuen Verbindungen kann bestimmt werden, indem man die Lysis von Micrococcus lysodeikticus-Suspensionen.mißt (vergl. A.U. Di Nardo, Igiene Moderna, 60, 485/1967) und indem man die Absorption des ultravioletten Lichts bei 281. m/U entsprechendThe analysis of the new compounds can be done by direct titration of the components. The lysozyme content of the new compounds can be determined by analyzing the lysis of Micrococcus lysodeikticus suspensions. (Cf. A.U. Di Nardo, Igiene Moderna, 60, 485/1967) and by measuring the absorption of ultraviolet light at 281. m / rev accordingly

den in der Literatur beschriebenen Verfahren auswertet. Der Gehalt an Gallensäure wird üblicherweise bestimmt, indem man nach dem Ansäuern mit Chlorwasserstoffsäure mit Chloroform extrahiert, oder indem man die Säure, die freigesetzt wurde, direkt filtriert und anschließend mit wäßriger Natriumhydroxydlösung titriert unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator.evaluates the method described in the literature. The bile acid content is usually determined by after acidification with hydrochloric acid, it is extracted with chloroform, or by adding the acid that is liberated was filtered directly and then titrated with aqueous sodium hydroxide solution using phenolphthalein as an indicator.

In einigen Fällen ist es besser, charakteristische colorimetrische Reaktionen zu verwenden, beispielsweise kann die Dehydrocholsäure durch Farbreaktion mit, m-Dinitrobenzol in alkalischem Medium gemäß dem Verfahren von G.Saba erfolgen (vergl. J.Biochem., 3(3, 61/1939)> modifiziert von C.Bergamini und W. Versorese (vergl. Lo Sperimentale, 4, 79/1953); Taurocholsäure kann ebenfalls colorimetrisch nach der direkten Umsetzung mit 65%iger Schwefelsäure entsprechend dem in der Literatur beschriebenen Verfahren bestimmt werden (vergl. T.Inutsuka, Pukuoka Igaku-Zassi, 48, 733/1957).In some cases it is better to use characteristic colorimetric To use reactions, for example, the dehydrocholic acid can by color reaction with, m-dinitrobenzene in alkaline medium according to the method of G.Saba (see J.Biochem., 3 (3, 61/1939)> modified by C. Bergamini and W. Versorese (cf. Lo Sperimentale, 4, 79/1953); Taurocholic acid can also be colorimetric after the direct reaction with 65% sulfuric acid according to that in the Methods described in the literature are determined (see T. Inutsuka, Pukuoka Igaku-Zassi, 48, 733/1957).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.The following examples illustrate the invention without restricting it.

example 1

9,4 g Desoxycholsäure werden in 150 ml destilliertem Wasser duspendiert, anschließend wird sorgfältig eine stöchiometrische Menge von 1n wäßriger Natriumhydroxydlösung zugegeben. Die so erhaltene Lösung wird mit Tierkohle entfärbt und filtriert. Eine Lösung aus 20 g Lysozym-hydrochlorid in 150 ml destilliertem Wasser wird dann unter Rühren zugegeben. Es bildet sich sofort reichlich Niederschlag. Die Reaktionsmischung wird weitere 30 Minuten gerührt und das Produkt wird durch Zentrifugieren abgetrennt, durch Aufschlämmung mit 50 ml Wasser gewaschen und nach dem gleichen Verfahren isoliert. Nach dem Trocknen im Vakuum bei Umgebungstemperatur und anschließende Reinigung durch Waschen mit Diäthyläther9.4 g of deoxycholic acid are dissolved in 150 ml of distilled water suspended, then a stoichiometric amount of 1N aqueous sodium hydroxide solution is carefully added. The solution obtained in this way is decolorized with animal charcoal and filtered. A solution of 20 g of lysozyme hydrochloride in 150 ml distilled water is then added with stirring. Abundant precipitate forms immediately. The reaction mixture is stirred for an additional 30 minutes and the product is separated by centrifugation, by slurry with Washed 50 ml of water and isolated by the same procedure. After drying in vacuo at ambient temperature and subsequent cleaning by washing with diethyl ether

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erhält man 24,5 g Lysozym-descxycholat in Form eines farblosen, kristallinen Feststoffs, der kaum in Wasser löslich ist. Die Analyse ergibt einen Lysozymgehalt von 78% und einen Desoxycholsäuregehalt von ungefähr 18% (Wassergehalt 4%).24.5 g of lysozyme descxycholate are obtained in the form of a colorless, crystalline solid which is hardly soluble in water is. The analysis shows a lysozyme content of 78% and a deoxycholic acid content of approximately 18% (water content 4%).

Example 2

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wird durch Umsetzung des Natriumsalzes von Desoxycholsäure mit Guanidyllysozym-hydrochlorid das Desoxycholat von Guanidyl-lysozym erhalten, das die gleichen physikalischen Eigenschaften und eine ähnliche analytische Zusammensetzung im Hinblick auf den Gallensäuregehalt und das Lysozymderivat besitzt.In a manner similar to that described in Example 1, by reacting the sodium salt of deoxycholic acid with guanidyl lysozyme hydrochloride the deoxycholate obtained from guanidyl lysozyme, which has the same physical properties and a similar analytical composition in terms of possesses the bile acid content and the lysozyme derivative.

Example g

Die Umsetzung von Natriumdesoxycholat mit Lysozym-methylesterhydrochlorid auf analoge Weise wie in Beispiel 1 beschrieben ergibt das entsprechende Desoxycholat von Methyl-lysozym.The reaction of sodium deoxycholate with lysozyme methyl ester hydrochloride in a manner analogous to that described in Example 1 gives the corresponding deoxycholate of methyl lysozyme.

Example 4

Durch Umsetzung von Natriumdesoxycholat mit Guanidyl-lysozymmethylester-hydrochlorid auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben erhält, man das Desoxycholat von Methylguanidyllysozym. By reacting sodium deoxycholate with guanidyl lysozyme methyl ester hydrochloride in a manner similar to that described in Example 1, the deoxycholate of methylguanidyl lysozyme is obtained.

Beispiel 5 . Example 5 .

10 g Lysozym (freie Base) werden in 100 ml destilliertem Wasser suspendiert und mit 3,5 g Desoxycholsäure vermischt. Die Suspension wird bei Umgebungstemperatur 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann zur Trockene bei verminderter Temperatur und Druck eingedampft und der erhaltene Rückstand wird mit Chloroform durch Aufschlämmen gut' gewaschen, um überschüssige freie Desoxycholsäure zu beseitigen. Nach dem Trocknen im Vakuum erhält man das Desoxycholat von Lysozym. Es besitzt die gleichen chemischen und analytischen Eigenschaften wie das Produkt von Beispiel 1.10 g of lysozyme (free base) are dissolved in 100 ml of distilled water suspended and mixed with 3.5 g of deoxycholic acid. The suspension is stirred at ambient temperature for 2 hours. The reaction mixture is then evaporated to dryness at reduced temperature and pressure and the residue obtained is washed well with chloroform by slurrying to remove excess free deoxycholic acid. After this Drying in vacuo gives the deoxycholate of lysozyme. It has the same chemical and analytical properties like the product of example 1.

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example

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 5 beschrieben wird Desoxycholsäure mit Guanidyl-lysozym umgesetzt und man erhält das Desoxycholat von Guanidyl-lysozym in Form einer farblosen, kristallinen Verbindung, die analytisch der Verbindung entspricht, die man in Beispiel 2 erhalten hat.In a manner similar to that described in Example 5, deoxycholic acid is reacted with guanidyl lysozyme and one obtains the deoxycholate of guanidyl lysozyme in the form of a colorless, crystalline compound, the analytical of the compound corresponds to that obtained in Example 2.

Example 7

15 g Lysozym (freie Base) werden in 100 ml' destilliertem Wasser suspendiert und dann werden portionsweise 3 g' Dehydrocholsäure zugegeben, wobei man eine Lösung erhält. Spuren von überschüssiger Dehydrocholsäure werden durch Filtration entfernt und dann wird das Filtrat durch Tierkohle entfärbt und lyophilisiert. Der . Rückstand enthält das Dehydrocholat von Lysozym in im wesentlichen quantitativer Ausbeute. Die Verbindung ist ein farbloser, kristalliner Feststoff, der in Wasser sehr löslich ist. Die Analyse zeigt einen Gehalt an Lysuzym von 81% und einen Gehalt an Dehydrocholsäure von ungefähr 16%.15 g of lysozyme (free base) are dissolved in 100 ml of distilled water suspended and then 3 g of dehydrocholic acid are added in portions, a solution being obtained. traces excess dehydrocholic acid is removed by filtration and then the filtrate is decolorized by charcoal and lyophilized. Of the . The residue contains the dehydrocholate of lysozyme in essentially quantitative yield. The compound is a colorless, crystalline solid, which is very soluble in water. The analysis shows a lysuzyme content of 81% and a content of dehydrocholic acid of about 16%.

Example 8

Dehydrocholsäure wird mit Guanidyl-lysozym auf analoge Weise wie in Beispiel 7 beschrieben umgesetzt, wobei man das Dehydrocholat von Guanidyl-lysozym erhält, welches die gleichen physikalischen Eigenschaften und eine ähnliche analytische Zusammensetzung, bezogen auf den Gallensäuregehalt und das Guanidyl-lysozym, zeigt wie das Produkt von Beispiel 7.Dehydrocholic acid is reacted with guanidyl lysozyme in a manner analogous to that described in Example 7, the dehydrocholate being reacted obtained from guanidyl lysozyme, which has the same physical properties and a similar analytical The composition, based on the bile acid content and the guanidyl lysozyme, shows the same as the product of Example 7.

Example 9

20 g Lysοzym-hydrochlorid in 50 ml destilliertem Wasser werden unter Rühren zu einer Lösung aus 9,6 g Dehydrocholsäure, suspendiert in 20 ml destilliertem Wasser und vermischt mit einer stöchiometrischen Menge von 1n wäßriger Natriumhydroxydlösung gegeben. Die Reaktionsmischung wird 3 Stunden unter Rühren bei O⁰C gehalten. Die gebildeten Kristalle werden ab-20 g of lysozyme hydrochloride in 50 ml of distilled water are added with stirring to a solution of 9.6 g of dehydrocholic acid, suspended in 20 ml of distilled water and mixed with a stoichiometric amount of 1N aqueous sodium hydroxide solution. The reaction mixture is ^{kept at 0} ° C. for 3 hours with stirring. The crystals formed are removed

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filtriert und im Vakuum getrocknet, wobei man ein Rohprodukt (21,5 g) erhält, welches zweimal gewaschen wird, indem man es mit insgesamt 300 ml Chloroform aufschlämmt, um freie Dehydrocholsäure zu entfernen, und dann wird das Produkt abfiltriert und wieder im Vakuum getrocknet. Man erhält 19 g Dehydrocholat des Lysozyms in Form eines fast farblosen, kristallinen Feststoffs. Die analytische Zusammensetzung ist ähnlich wie die des Produktes von Beispiel 7, der Lysozymgehalt beträgt 80% und der Dehydrocholsäuregehalt beträgt 1796. .filtered and dried in vacuo to give a crude product (21.5 g) which is washed twice by it is slurried with a total of 300 ml of chloroform to remove free dehydrocholic acid and then the product becomes filtered off and dried again in vacuo. You get 19 g dehydrocholate of lysozyme in the form of an almost colorless, crystalline solid. The analytical composition is similar to that of the product of Example 7, the lysozyme content is 80% and the dehydrocholic acid content is 1796..

Example 10

Die Umsetzung von Natriumdehydrocholat mit Guanidyl-lysozymhydrochlorid auf ähnliche Weise wie in Beispiel 9 beschrieben ergibt das entsprechende Dehydrocholat von Guanidyllysozym. The reaction of sodium dehydrocholate with guanidyl lysozyme hydrochloride in a manner similar to that described in Example 9 gives the corresponding dehydrocholate of guanidyl lysozyme.

Example 11

Eine Lösung aus 15 g Lysozym-hydrochlorid in 100 ml destilliertem Wasser wird unter Rühren zu einer Lösung gegeben, die man erhält, indem man 10,3 g Natriumtaurocholat in 150 ml destilliertem Wasser gelöst und dann mit Tierkohle entfärbt. Die erhaltene Suspension wird 30 Minuten unter Rühren bei Umgebungstemperatur gehalten und dann wird das Produkt durch Filtration entfernt, mit 50 ml Wasser gewaschen, filtriert und im Vakuum getrocknet. Das Taurocholat des" Lysozyms, das man so erhält (Ausbeute 20 g), ist ein kristalliner, fast farbloser Feststoff, Die Analyse ergibt einen Gehalt von Lysozym von 74% und einen Gehalt an Taurochol-· säure von 21% (Wassergehalt = 4%).A solution of 15 g of lysozyme hydrochloride in 100 ml of distilled Water is added with stirring to a solution which is obtained by adding 10.3 g of sodium taurocholate in Dissolve 150 ml of distilled water and then decolorize it with animal charcoal. The suspension obtained is kept under stirring at ambient temperature for 30 minutes and then the product becomes removed by filtration, washed with 50 ml of water, filtered and dried in vacuo. The taurocholate of the " Lysozyme, which is obtained in this way (yield 20 g), is a crystalline, almost colorless solid. Analysis shows a Lysozyme content of 74% and a content of taurocholic acid of 21% (water content = 4%).

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls pharmazeutische Mittel, die die neuen Salze und Komplexe von Lysozym und basischen Derivaten von Lysozym enthalten. Diese pharmazeutischen Mittel können oral, rektal oder parenteral zusammen vermischtThe invention also relates to pharmaceutical agents containing the new salts and complexes of lysozyme and basic Contain derivatives of lysozyme. These pharmaceutical agents can be mixed together orally, rectally, or parenterally

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mit festen oder flüssigen pharmazeutischen Trägern verabreicht werden.administered with solid or liquid pharmaceutical carriers.

Feste Mittel für die orale Verabreichung umfassen komprimierte Tabletten, Pillen, dispergierbare Pulver und Körnchen. In solchen festen Zusammensetzungen wird eines der neuen Salze oder einer der neuen Komplexe mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel wie Calciumcarbonat, Stärke, Algininsäure oder Lactose vermischt. Feste Zusammensetzungen für die rektale Verabreichung können hergestellt werden, indem man die aktiven Materialien mit bekannten Suppositoriengrundstoffen vermischt. Die festen Zusammensetzungen können ebenfalls, wie es übliche Praxis ist, zusätzliche Verbindungen, mit Ausnahme inerter Verdünnungsmittel, beispielsweise Schmiermittel wie Magnesiumstearat, enthalten.Solid means for oral administration include compressed tablets, pills, dispersible powders and granules. In such solid compositions is one of the new salts or one of the new complexes with at least one inert Diluents such as calcium carbonate, starch, alginic acid or lactose mixed. Solid compositions for the Rectal administration can be prepared by mixing the active materials with known suppository bases mixed. The solid compositions can also, as is common practice, additional compounds, with the exception of inert diluents such as lubricants such as magnesium stearate.

Flüssige Mittel für die orale Verabreichung umfassen pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Lösungen,· Suspensionen, Sirupe und Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel, wie man sie üblicherweise auf diesem Gebiet verwendet, wie Wasser und flüssiges Paraffin enthalten. Außer den inerten Verdünnungsmitteln können solche Mittel ebenfalls Adjuvantien wie Benetzungs- und Suspensionsmittel und Süßstoffe und Geschmacksmittel enthalten.Liquid agents for oral administration include pharmaceutical acceptable emulsions, solutions, · suspensions, syrups and elixirs, the inert diluents, how to they are commonly used in this field as include water and liquid paraffin. Except for the inert diluents Such agents can also include adjuvants such as wetting and suspending agents and sweeteners and flavoring agents contain.

Die erfindungsgemäßen Mittel für die orale Verabreichung umfassen Kapseln aus absorbierbarem Material wie Gelatine, die eines der neuen Salze oder Komplexe, mit oder ohne Zugabe von Verdünnungsmitteln oder Arzneimittelträgerstoffen, enthalten. The compositions of the invention for oral administration include capsules made of absorbable material such as gelatin, the contain any of the new salts or complexes, with or without the addition of diluents or excipients.

Die erfindungsgemäßen Präparationen für die parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele von nichtwäßrigen Lösungsmitteln oder Suspensionsmedien .umfassen Propylenglykol, Polyäthylenglykol, pflanzliche Öle wie Olivenöl undThe preparations according to the invention for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsions. Examples of non-aqueous Solvents or suspending media include propylene glycol, Polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil and

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injizierbare organische Ster wie Äthyloleat. Diese Massen können ebenfalls Adjuvantien wie Benetzungsmittel, Emulgiermittel und Dispersionsmittel enthalten. Sie können sterilisiert werden, beispielsweise durch Filtration durch Bakterien zurückhaltende Filter, durch Einverleibung in die Massen von Sterilisationsmitteln, durch Bestrahlung oder durch Erwärmen. Sie können ebenfalls in Form steriler, fester Massen hergestellt werden, die in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen, injizierbaren Medium unmittelbar vor der Verwendung gelöst werden können.injectable organic sters such as ethyl oleate. These masses may also contain adjuvants such as wetting agents, emulsifiers and dispersants. You can be sterilized are, for example, by filtration through bacteria-retaining filters, by incorporation into the masses of sterilizing agents, by irradiation or by heating. They can also be in the form of sterile, solid masses be prepared in sterile water or other sterile injectable medium immediately prior to use can be solved.

Der Prozentgehalt an neuem Salz oder Komplex in den erfindungsgemäßen Mitteln kann variieren, es ist nur erforderlich, daß ein solcher Anteil vorhanden ist, daß eine geeignete Dosis für die gewünschte therapeutische Wirkung zur Verfügung steht. Im allgemeinen sollten die erfindungsgemäßen Präparationen oral, rektal oder parenteral verabreicht werden, um 250 bis 1000 mg aktive Verbindung/Tag zu ergeben. Die parenterale Verabreichung kann beispielsweise auf intramuskulärem, intravenösem oder intrabursalem Weg erfolgen.The percentage of new salt or complex in the present invention Means can vary, it is only necessary that such a proportion be present that a suitable one Dose for the desired therapeutic effect is available. In general, the preparations according to the invention should administered orally, rectally or parenterally to give 250 to 1000 mg of active compound / day. The parenteral Administration can take place, for example, by the intramuscular, intravenous or intrabursal route.

Die folgenden Beispiele erläutern pharmazeutische erfindungsgemäße Mittel.The following examples illustrate pharmaceuticals according to the invention Middle.

Example 12

500 mg-Tabletten werden hergestellt, die enthalten:500 mg tablets are made that contain:

Lysozym-desoxycholat 250 mgLysozyme Deoxycholate 250 mg

Stärke . 150 mgStrength . 150 mg

Lactose 95 mgLactose 95 mg

Magnesiumstearat 5 mgMagnesium stearate 5 mg

Example 13

Lysozym-taurocholat 300 mgLysozyme taurocholate 300 mg

Stärke ■ . 180 mgStrength ■. 180 mg

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- 12 Magnesiumstearat 20 mg- 12 magnesium stearate 20 mg

Die in den obigen Beispielen 12 und 13 "beschriebenen Mittel sind für die orale Verabreichung an Menschen für die Vorbeugung und Behandlung von Vireninfektionen gedacht.The agents described in Examples 12 and 13 "above are for oral administration to humans for prophylaxis and treatment of viral infections.

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Claims

- 13 sponsorship awards

Ή. Salts and complexes of lysucey and of basic
Derivatives of lysozyme with bile acids.

2. Lysozyme deoxycholate.

3. Guanidyl lysozyme deoxycholate.

4. Methyl lysozyme deoxycholate.

5. Methyl guanidyl lysozyme deoxycholate.

6. Lysozyme dehydrocholate.

7. Guanidyl lysozyme dehydrocholate.

8. Lysozyme taurocholate. . ■

9 .. Process for the preparation of salts and complexes of lysozyme and of basic derivatives of lysozyme with bile acids, characterized in that lysozyme or a basic Lysozyme derivative is reacted with a bile acid.

10. Process for the preparation of salts and complexes of lysozyme and of basic derivatives of lysozyme. with bile acids, characterized in that a simple salt
of lysozyme is reacted with a salt of a bile acid.

11. The method according to claim 9 or 10, characterized in that that the reaction in an aqueous medium or

carried out in a medium containing organic solvents will.

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12. Salts and complexes of lysozyme and basic
Derivatives of lysozyme with bile acids, prepared according to
a method according to one or more of claims 9 to 11.

13 · 'Pharmaceutical agents containing at least one Salt or a complex according to one or more of claims 1 to 8 together with a solid or liquid, pharmaceutical diluents or carriers.

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