DE2406811A1 - Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von ribonucleinsaeure - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von ribonucleinsaeureInfo
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Description
u.Z.: K 662 (Vo/Mü/kä)
Case 150-4
Case 150-4
KYOm HAKIiO KOGYO CO., LTD.
Tokyo, Japan
Tokyo, Japan
10
" Verfahren zur enzymatisehen Hydrolyse von Ribonucleinsäure "
Priorität: 14. Februar 1973, Japan, Nr. 17 449/73 24. März 1973, Japan, Nr. 33 088/73
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Ribonucleinsäure (RNS) unter Bildung von Nucleosidr2l-,3I-cyclophosphaten
und/oder Nucleosid-31,^'-cyclophosphaten.
Adenosin-2f, 3'-cyclophosphat (2', 3' -c-ΑίίΡ), ein Nucleosid-2', 3'-cyclophosphat,
war in letzter Zeit Gegenstand zahlreicher v/issenschaitlicher
Untersuchungen. Die Bedeutung von 2',3'-C-AMP ist darauf zurückzuführen, daß es im Zentralnervensystem von höheren
Tieren zu finden ist. Obwohl die Rolle von 2',3!-c-AMP im Zentralnervensystem
noch nicht vollständig geklärt ist, wird angenommen, daß diese Verbindung eine wichtige Rolle bei. der Nerven-
25' leitung spielt. Deshalb gelten 2',3'-C-AMP und andere Nucleosid- ■
2'^'-cyclophosphate als wertvolle Arzneistoffe und werden gegenwärtig
bei verschiedenen in vivo-Tierversuchen verwendet. Ferner sind diese Produkte wertvolle biochemische Reagentien zur Untersuchung
von Stoffwec'hselvorgängen.
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ORIGINAL INSPECTED
Es ist "bekannt, daß bei der Umsetzung von RNS mit "bestimmten
Ribonucleasearten, z.B. Ribonucleat-nucleotido-2'-transferase,
wie Ribonuclease T0, saure Ribonuclease und Blatt-Ribonuclease,
die RNS zuerst zu Zwischenprodukten hydrolysiert, beispielsv?eise zu Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten, wie Adenosin-2f,3'-cyclophosphat
(2',3'-c-AMP), Guanosin-2', 3'-cyclophosphat
(2',3f-c-GMP), Uridin-2!,3'-cyclophosphat (2',3'-C-UI-IP) und
Cytidin-2',3f-cyclophosphat (2·,3'-c-CHP). Diese Zwischenprodukte
v/erden schließlich zu Nucleosid-3-phosphaten zersetzt, d.h.
zu Adenosin-3f-phosphat, Guanosin-31-phosphat, Uridin-31-phosphat
und Cytidin-3'-phosphat.
Ferner ist es bekannt, daß die Anwesenheit eines Chelatbildners
bei der enzymatischen Hydrolyse von RNS die Spaltung von Nucleosid-2!,3'-cyclophosphaten zu Nucleosid-31-phosphaten hemmt.
Beispielsweise ist es bekannt,. RNS durch kristalline Ribonuclease aus Rhizopus nivens in Gegenwart eines Chelatbildners zu
Nucleosid-21^'-cyclophosphaten zu hydrolysieren, vgl.
S. Mantani et al., Agr. Biol. Chem., Bd. 36, Nr. 2 (1972),
S. 242 bis 248. Jedoch ist die Verwendung von gereinigter oder teilweise gereinigter Ribonuclease bei der Hydrolyse von RNS
nicht zweckmäßig, da zu ihrer Herstellung komplizierte Verfahrensschritte notwendig sind und da sich im Reaktionsgemisch zusätzlich
zu den gewünschten Produkten eine Reihe von Nebenprodukten bilden.
Adenosin-3f,5'-cyclophosphat hat bekanntlich eine Mittlerrolle
bei hormonbedingterr Stoffwechselvorgängen. 3',5'-c-AMP und die
übrigen Nucleosid-3', 5'-cyclophosphate sind neben ihrer Bedeu-
L· J
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Γ
tung als Reagentien für biochemische und medizinische Untersuchungen
auch als Arzneistoffe von Bedeutung.
Bisher wurde die enzymatic·ehe' Hydrolyse von IiNS zu Nucleosid-5"
3f,5'-cyclophosphaten in der Literatur nicht beschrieben. Es ist
lediglich bekannt, daß 3' ,5'-C-ZiIiP durch Umsetzung von Adenosintriphosphat
mit Adenylcyclsse, die aus Mikroorganismen oder
durch fermentative Verfahren' erhalten worden ist, entstehen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur enzymatisehen
Hydrolyse von RKS zur Verfügung zu stellen, das sich leicht großtechnisch durchführen läßt.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß bei der Einwirkung
von intakten Mikroorganismenzellen, die eine Ribonucleaseaktivität
aufweisen, in Gegenwart eines Chelatbildners auf RNS in hohen
Ausbeuten Nucleosid-2 ', 3t-cyclophosphat~~ ohne nennenswerte
Bildung von Nebenprodukten als Kydrolyseprodukte entstehen.
Ferner wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß bei der vorgenannten
Hydrolyse von FiIiS mit intakten Mikroorganismenzellen neten
Nucleosid-2', 3'-cyclophosphaten auch Nucleosid-3',5'-cyclophosphäte
in -vorbestimmten Verhältnissen erhalten v/erden können, wenn die Phosphationenkonzentration im Reaktionsmedium in geeigneter
Weise eingestellt wird.
Fig. 1 zeigt Papierchromatogramme von Reaktionsgemischen, die ncch Hydrolyse von RNS mit (a) intakten Zellen von Escherichia
coli und (b) teilweise gereinigter E-ibonuclease. die zerstörte
erhalten worden sind Lscherichia coli-Zellen enthält/ Zu Vergleichszwecken ist die ,
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entsprechende'Chromatographie auch mit 2',3'-C-AHP, 2',3' -c-GMP,
2f ,3'-C-UI-IP und 2',3' -c-GMP durchgeführt.
Dieses Papierchromatograrnm von Fig. 1 wurde auf folgende Weise
erhalten: Escherichia coil ATCC 10798 wird 16 Stunden bei 38°C
in einem 30 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat,
11 mg/ml DikaliumhjTlrogenphosphat und
0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Medium vom pH-Wert 6,8
gezüchtet. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert. 25 mg/ml (als trockene Zellen) der Zellen werden in einer
15 mg/ml RNS enthaltenden wäßrigen Lösung, die 15 millimolar an
Äthylendjamintetraessigsäirrc? ist, suspendiert. Das erhaltene Gemisch
wird anschließend 48 Ctunden bei AO0C umgesetzt.
Eine ähnliche Umsetzung wird mit aufgebrochenen Zellen durchgeführt.
Dabei werden 25 mg/ml (als trockene Zellen) der vorgenannten Zellmasse durch lOstimdige Ultraschallbehandlung bei
80C mit 28 kHertz/Sek. behandelt.
Die Reaktionsgemische werden 16 Stunden bei 25°C aufsteigend
chromatographiert. Als Laufroittel dient die obere Phase eines
Gemisches aus Isobuttersäure, n-Butanol und 0,5 η Ammoniaklösung
(1:1:1).
Aus Fig. 1 geht hervor, daß bei der Verwendung von intakten Mikroorganismenzellen zur Hydrolyse von HIiS das Reaktionsgemisch
nur die gewünschten Nucleosid-21,3'-cyclophosphate neben nicht
umgesetzter RWS enthält. Andererseits entstehen bei Verwendung von teilweise gereinigter Ribonuclease außer den gewünschten
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Nucleosid-2'^'-cyclophosphaten verschiedene Nebenprodukte im
Reaktionsgemisch.
Es wird angenommen, daß die gereinigte Ribonuclease durch andere
Enzyme verunreinigt ist, weshalb verschiedene Nebenprodukte entstehen. Demgegenüber wird angenommen, daß bei der Verwendung von
intakten Mikroorganismenzellen nach dem er"findungsgemäßen Verfahren
die FINS durch die Wirkung einer Ribonuclease hydrolysiert" wird, die an der Oberfläche der Mikroorganismenzellen vorhanden
ist, so daß die gewünschten 21,3f"-Cyclop'hosphate praktisch selektiv
gebildet werden.
Wie bereits erwähnt, läßt sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahrren durch die Kontrolle der Konzentration der Phosphationen im
Reaktionsmedium das Verhältnis der gebildeten Nucleosid-21 t3f-CAfclophosphate
zu dem Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten vorher bestimmen.
Beispiele für Nucleosid-31,5'-cyclophosphate, die sich
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten lassen, sind 3',5'-Cyclophosphat (3',5'-C-MP), Guanosin-3f,5l-cyclophosphat
(3',5'-C-GMP), Uridin-3f ,5'-cyclophosphat (3' ,5'-C-Ui-IP) und
Cytidin-3",5'-cyclophosphat. Vienn das erfindungsgemäße Verfahren
in Abwesenheit oder in Gegenwart von sehr geringen Konzentrationen an Phosphationen durchgeführt wird, wird die RNS
selektiv zu 2',3'-Cyclophosphaten gespalten. Bei der Durchführung
der Reaktion bei höheren Phosphationenkonzentrationen werden selektiv Nucleosid-3',S'-cyclophosphate gebildet. Bei der Einhaltung
einer mittleren Phosphationenkonzentration entstehen sowohl die 2',3'- als auch die 3',5'-Cyclophosphate.
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Γ r "I
Im erfihdungsgemäßen Verfahren können alle Mikroorganismen eingesetzt
werden, die eine Ribonuclease-Aktivität aufweisen. Um festzustellen, ob ein bestimmter Mikroorganismus eine Ribonuclease-Aktivität
aufweist, können übliche Verfahren angewendet werden. Die Erfindung erstreckt sich auf alle Mikroorganismen, die
diese Aktivität aufweisen.
Bevorzugte Mikroorganismen sind gram-negative Bakterien, insbesondere
solche der Gattungen Escherichia, Salmonella, Aerobacter und Pseudomonas. Die Gattung Aerobacter läßt sich im allgemeinen
folgendermaßen charakterisieren: kurze Stäbchen; beweglich oder unbevreglich, wobei die beweglichen Species ringsherum behaarte
Geiseln aufweisen; gram-negativ; gutes Wachstum auf gewöhnlichen Nährmedien; Verwertung von Glucose und Lactose unter Bildung
von Säure und Gas; aus Glucose wird die 2- oder mehrfache Menge Kohlendioxid im Vergleich zu Wasserstoff gebildet; Methylrot-Test
negativ; Voges-Proskauer-Test positiv; keine Bildung von Trimethylenglykol
aus Glycerin durch anaerobe Gärung; Verwertung von Citronensäuren und deren Salzen als alleinige Kohlenstoffquellen;
aerob, gegebenenfalls anaerob.
Die Gattung Escherichia läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: kurze Stäbchen; beweglich oder nicht beweglich;
gram-negativ; Verwertung von Glucose und Lactose unter Bildung
von Säure und Gas; keine Bildung von Acetylmethylcarbinol; Methylrot-Test positiv; aus Glucose werden etwa gleiche Volumina
Kohlendioxid und Wasserstoff gebildet; im allgemeinen kann Harnsäure nicht als alleinige Stickstoffquelle verwertet werden.
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Die Gattung Salmonella läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: Stäbchen, die im allgemeinen mit Hilfe einer
ringsherum behaarten Geisel beweglich sind, wobei auch nicht bewegliche Formen auftreten können; gram-negativ; keine Verflüssigung
von Gelatine; keine Indolbildung; variable Schwefelwasserstoff
bildung ; Säurebildung aus Glucose, Mannit, Maltose und Sorbit; im allgemeinen Gasbildung (Ausnahmen sind Salmonella
typhosa und Salmonella gallinarum, wobei die Gasbildung auch bei anderen Species oder Serotypen ausbleiben kann); Lactose,
Saccharose, Salicin und Adonit werden nicht angegriffen; die Verwertung von anderen Kohlenhydraten ist variabel; keine Bildung
von Acetylmethylcarbinol; Methylrot-Test positiv; Bildung von Nitriten aus Nitraten: im allgemeinen wird Ammoniumeitrat verwertet;
keine Hydrolyse von Harnstoff; negative KCN-Empfindlichkeit.
Die Gattung Pseudomonas läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: monotriche, lophotriche oder unbewegliche Zellen;
gram-negativ; häufig Entwicklung von fluoreszierenden diffundierenden Pigmenten mit grünlicher, bläulicher, violetter,
lilafarbener, rosafarbener, gelber oder einer anderen Farbe;
gelegentlich leuchtend rotes oder gelbes und nicht diffundierendes
Pigment; viele Arten ohne jegliche Pigmentbildung; die meisten Arten oxidieren Glucose zu Glukonsäure, 2-Ketoglukonsäure oder
. anderen Zwischenprodukten; im allgemeinen inaktiv bei der Oxidation von Lactose; Nitrate werden häufig zu Nitriten, Ammoniak
oder freiem Stickstoff reduziert.
Ferner werden gram-positive Hefen der Gattungen Hansenula, Kloeckera und Torulopsis bevorzugt. Die Gattung Hansenula gehört_,
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zur Unterfamilie Saccharomycetaideae und läßt sich im allgemeinen durch folgende Eigenschaften charakterisieren: Bildung von
Sproßzellen und Pseudomycel; hutförmige, saturnförmige oder'
runde Sporen; 1 bis 4 Asci, dissimilativ oxidativ (Häutehenbildung)-auch fc*-mentativ;
Nitratassimilation.
Nitratassimilation.
Die Gattung Torulopsis gehört zur Familie Cryptococcaceae und läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren:
· multilateraler. Sprossen; kein Pseudomycel oder· Mycel: keine Bildung
von stärkeähnlichen Verbindungen; stark ferment«tiv.
Die Gattung Kloeckera gehört ebenfalls zur Familie Cryptococcaceae
und läßt sich im allgemeinen folgendermaßen charakterisieren: bipolares Sprossen; zitronenförmige Zellen und fermentativ.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen werden nach üblichen Züchtungsverfahren für Bakterien oder Hefen
gezüchtet. Beispielsweise können die Mikroorganismen in einem eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze
und andere Nährstoffe enthaltenden Nährmedium gezüchtet v/erden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie
Glucose und Saccharose. Organische Säuren, Alkohole und Kohlen-Wasserstoffe
können ebenfalls verwendet werden, sofern der verwendete Mikroorganismus zur Assimilation dieser Kohlenstoffquellen
befähigt ist. Beispiele für Stickstoffquellen sind organische
Stickstoff
und anorganische /verbindungen, sowie natürliche organische Substanzen,
wie Peptone Maisquellwasser und Hefeextrakt. Ferner _j
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kanu das Nährmedium mit Phosphaten, wie KaliumdihydrogenphosjDhat
und Dikaliumhydrogenphosphat und Metallsalzen, wie Magnesiumsulfat, versetzt werden.
Die Züchtungsbedingungen v/erden je nach dem verwendeten Mikroorganismus
ausgewählt. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen beispielsweise durch Zentrifugation von der Gärmaische abgetrennt.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen RNS-Hydrolyseverfahrens
v/erden die Zellen in einem wäßrigen Medium in einer Konzentration
von 10 bis 40 mg/ml, vorzugsweise etwa 20 mg/ml, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, suspendiert. Die Suspension
wird mit RNS, einem Chelatbildner und einer bestimmten Menge
Phosphationen versetzt. . -
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete RNS wird nach üblichen
Verfahren gewonnen und stammt im allgemeinen aus Mikroorganismen. Zur Hydrolyse wird sie in einer Menge von 1 bis
40 mg/ml, vorzugsweise 10 bis 20 mg/ml verwendet.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können übliche Chelatbildner für ,
Metallionen verwendet werden; vgl. Mantani a.a.O. Vorzugsweise werden Äthylendiamintetraessigsäure, Cyclohexandiamintetraessigsäure
und Hydroxyäthylendiamintriessigsäure verwendet. Die Chelatbildner werden in einer Konzentration von 5 "bis 30 millimolar,
vorzugsweise 10 bis 30 millimolar eingesetzt.
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Wie bereits erwähnt, wird im erfindungsgemäßen Verfahren das
Verhältnis von Nucleosid-2f,3f-cyclophosphaten zu Nucleosid-31,
5f-cyclophosphaten durch die Konzentration der Phosphationen
im Reaktionsmedium beeinflußt.
Beispielsweise wird Escherichia coli ATCC 10798 in 50 ml eines
30 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat,
11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Puffers vom pH-Wert 6,8 16 Stunden
bei 38°C in einem 3 Liter fassenden Srlenmeyer-Kolben gezüchtet.
Nach beendeter Züchtung werden die Zellen durch Zentrifugieren von der Gärmaische abgetrennt, inschließend werden 2,5 g
(Trockengewicht) dieser Zellen in jeweils 100 ml "asser, 0,10 m, 0,15 i, 0,16 a, 0,17 m und 0,3 m Phosphatpuffer vom pK-Uert 7,5
suspendiert. Die Suspensionen werden mit 0,5 g P-NS und 292 mg
Äthylendiamintetraessigsäure versetzt und 48 Stunden bei 40 C zur Umsetzung gebracht. Anschließend wird die Menge der gebildeten
Nucleosid-2', 3' -cyclophosphate" und der I-Iucleosid-3', 5' cyclophosphate
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
Phosphationen- Bildung von Nucleosid- Bildung von Nucleosidkonzentration,
m 21 ,S'-cyclo.phosphaten, 31,5 '-cyclophosphaten,
mg/ml rng/ml
0 2 Spuren
0,10 2 Spuren
0,15 . 1,7 0,25
0,16 0,96 - 0,77
0,17 Spuren . 1,2
O,3 Spuren 1,2
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Γ 11 ·
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die RNS in Abwesenheit von Phosphationen selektiv zu Nucleosid-21,3'-cyclophosphaten
hydrolysiert wird. Bei steigender Phosphationenkonzentration nimmt die Bildung von Nucleosid-21,3'-cyclophosphaten
5" ab, während die Menge der gebildeten Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten
zunimmt. Bei- einer Phosphationenkonzentration von 0,17 m oder mehr wird die RNS praktisch selektiv zu Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten
hydrolysiert.-
Man erhält also nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei
Phosphationenkonzentrationen im Reaktionsmedium von 0 bis 15 m Reaktionsprodukte, die hauptsächlich aus Nucleosid-2'^'-cyclophosphaten
bestehen, während' bei Phosphationenkonzentrationen von 0,17 m und höher die Reaktionsprodukte hauptsächlich aus
Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten bestehen.
Bei einer Konzentration von 0,15 m bis 0,17 ι werden praktisch
gleichviel 2',3'- und 3',5'-Cyclophosphate gebildet.
Als Quelle für Phosphationen können verschiedene Phosphate verwendet
werden, die Phosphationen an das wäßrige Medium abgeben. Besonders, geeignete Phosphatquellen sind in den folgenden Beispielen
aufgeführt.
Im allgemeinen wird die Reaktion zwischen RNS, den Mikroorganismenzellen,
dem Chelatbildner und den Phosphationen 1 bis 96 Stunden, vorzugsweise 24 bis 48 Stunden, bei Temperaturen von
35 bis 45°C, vorzugsweise 38 bis 42°C, durchgeführt. Während der
Umsetzung wird der pH-Wert im Bereich von 4 bis 9 gehalten.
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Falls die selektive Bildung von Nucleosid-21,3'-cyclophosphaten
erwünscht ist, wird der pH-Wert vorzugsweise bei etwa 5 gehalten, während bei der selektiven Bildung von Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten
der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 8 gehalten wird.
Geeignete wäßrige Reaktionsmedien sind verschiedene Pufferlösungen,
wie Acetatpuffer und Phosphatpuffer. Im Hinblick auf die
Einstellung des pH-Wertes ist die Verwendung von Phosphatpuffern bevorzugt.
Nach beendeter Umsetzung v/erden die Reaktionsprodukte isoliert und nach üblichen Verfahren gereinigt. Beispielsweise v/erden die
Zellen aus dem Reaktionsgemisch durch Abfiltrieren entfernt. Das zellfreie Filtrat wird der Adsorption an Aktivkohle oder einem
synthetischen Adsorptionsmittel unterworfen und anschließend mit alkalischem, wäßrigem Methanol oder einem Gemisch aus Aceton und
Wasser eluiert. Das Eluat wird eingeengt und an einem Ionenaustauscherharz,
beispielsweise Dowex 1x2 (Cl~-Form) (stark basisches Anionenaustauscherharz der Firma The Dov/ Chemical Co.),
adsorbiert. Anschließend wird mit einer neutralen Salzlösung, beispielsweise einer wäßrigen Ammoniumhydrogencarbonatlösung
eluiert. Durch Gefriertrocknung oder Kristallisation erhält man aus dem Eluat ein Gemisch aus Nucleosid-2',3r-cyclophosphaten,
das 2«,3'-c-AMP, 2',3'-C-GMP, 2',3'-C-UMP und 2',3'-C-CMP enthält
oder ein Gemisch aus Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten, das
3',5'-C-AMP, 3',5'-C-GMP, 3',5'-C-UMP und 3',5'-C-CKP enthält.
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Wenn als Reaktionsprodukt ein Gemisch aus Nucleosid-21,3'-•
cyclophosphaten und Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten erhalten
wird, kann dieses leicht in die einzelnen Nucleosid-cyclophosphate
aufgetrennt v/erden. Beispielsweise werden die Zellen vom Reaktionsgemisch abfiltriert. Sodann wird das Filtrat mit
einer Säure, wie Salzsäure oder Phosphorsäure, auf einen ρΗ-ΐ/ert
von 3,5 Ms 4,0 eingestellt. Mach dem Einengen des Filtrates fallen die Kucleosid~3' ,5'--cyclophosphate aus. Nach dem Abtrennen
der Nucleosid-31,5'-cyclophosphate durch Filtrieren werden
die 2',3'-Cyclophosphate aus dem Filtrat erhalten. Die als Feststoff
erhaltenen Nucleosid-3',5'-cyclophosphate können anschließend
in einem schwach alkalischen Lösungsmittel vom pH-Wert mindestens 7,5 gelöst v/erden. Die auf diese V/eise erhaltenen
2f,3'- oder 3',5'-Cyclophosphate können auf die vorstehend
beschriebene T.veise gereinigt werden.
Die erhaltenen 2',3.'~ oder 3',5'-Cyclophosphate lassen sich
leicht nach bekannten Verfahren in "die einzelnen Komponenten auftrennen. Beispielsweise wird ein Gemisch aus 2',3'- oder
3'^'-Cyclophosphaten auf eine mit einem Anionenaustauscherharz, . wie Dowex 1x2 (Cl~-Form) beschickte Säule gegeben. Die Elution
wird stufenweise unter Verwendung von 0,1 bis 1,0 m Lösungen neutraler Salze, wie Ammoniumhydrogencarbonat, durchgeführt.
Durch wiederholte Säulenchromatographie lassen sich die 2',3'~ oder 3',5'-Cyclophosphate in die einzelnen Komponenten
auftrennen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
L -
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" Beispiel 1
Escherichia coli ATCC 10798 wird in 500 ml eines 30 mg/ml Glucose,
6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat,
11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml I-Tagnesiumsulfat
enthaltenden Puffers vom pH-V/ert 6,8 16 Stunden bei 38° C in
einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen durch Abzentrifugieren von der Gännaische abgetrennt.
Sodann v/erden 4 g (in sämtlichen Beispielen beziehen sich die
Gewichtsangaben der Zellen auf das Trockengev/icht) Zellen in
200 ml Wasser suspendiert. Die Suspension v;ird mit 3 g RIJS und
876 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Geraisch v.-.ird
48 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach der Umsetzung haben sich im Reaktionsgemisch 14 mg/ml eines Gemische« aus Iiucleosiä-21,31-cyclophosphaten
gebildet.
Die Zellen werden vom Reaktionsgemische abfiltriert und das PiI-trat
wird über eine mit Dowex 1x2 (Cl'-Fonn) beschickte Säule
gegeben. Die Elution wird mit einer wäßrigen Ammoniuinhydroge-ncarbonatlösung
durchgeführt. Das Eluat wird eingeengt und gefriergetrocknet.
Man erhält 1,8 g eines pulverförmiger! Gemisches aus Nucleosid-21^'-cyclophosphaten von 90prozentiger Reinheit,
das 2',3'-c-AMP, 2f,3f-c-GMP, 2f,3'-P-UMP und 2 f, 3'-C-CMP enthält.
Beispiel 2
2,5 g der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Zellen von Escherichia coli ATCC 10798 werden in 100 ml Wasser suspendiert. Die Suspen-_j
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Γ "1
sion wird mit. 1 g RNS und 519 mg Cyclohexandiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird sodann 48 Stunden bei 4O0C umgesetzt.
Nach "beendeter Reaktion erhält man 6*2 mg/ml eines Gemisches
aus Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten im Reaktionsmedium.
■ Bei -spiel 3
Escherichia coli ATCC 10798 wird in 500 ml eines 30 mg/ml
Glucose, 50 mg/ml Maisquellwasser, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat,
11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml I-Iagnesiumsulfat
enthaltenden Nährmediums vom pH-V,Tert 6,5 16 Stunden
"bei 38 C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt.
Sodann werden 2 g der Zellen in 100 ml T.vasser suspendiert. Die
Suspension wird mit 1,5g RNS und 500 mg Hydroxyäthylendiemintiriessigsäure
versetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man im Reaktionsmedium ein Gemisch aus 9,7 mg/ml e.ines Gemisches aus
Nucleosid-2f,3'~cyclophosphaten.
4,4 g der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Zellen von Escherichia coli ATCC 10798 werden in 200 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom
pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 2 g RNS und 876 mg Äthyl endiamintetraessigsäure versetzt.- Sodann wird das
Gemisch 48 Stunden bei 400C umgesetzt. Man erhält im Reaktionsgemisch 7,2 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-31,5f-cyclophosphaten.
409834/ 1098
T Anschließend werden die Zellen abfiltriert. Das Filtrat wird
an einem Kunstharz adsorbiert. Die Elution wird mit 50prozentigem Aceton durchgeführt, und das erhaltene Eluat wird eingeengt.
Die eingeengte Lösung wird an Dowex 1x2 (Cl"-Form adsor-
5' biert. Die Elutioii wird mit einer Calciumchlorid-Salzsäure-Pufferlösung
durchgeführt. Sodann wird das Eluat eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 0,6 g eines pulverförmigen Gemisches
aus i;ucleosid-3f jS'-c.yclpphosphaten von 86prozentiger Feinheit.
Aerobacter aerogenes, IAH 1133, ATCC 8329 wird in 500 ml eines
10 mg/ml GlUCOSe5 10 mg/ml Maisquellwasser, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat,
11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom
pH-'.v'ert 6,8 0 Stunden bei 28°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben
gezüchtet. Nach der Züchtung v/erden die Zellen abzentrifugiert.
7,5 g der so erhaltenen Zellen werden in 300 ml 0,05 m Acetatpuffer
vom pH-TiVert 5,5 suspendiert. Die Suspension wird mit 3 g
RUS und 1752 mg Ethylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch
wird sodann 24 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man im Reaktionsgemisch 5,6.mg/ml eines Gemisches
aus Nucleosid-21,3f-cyclophosphaten.
Die Zellen werden aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wird an einem Kunstharz adsorbiert. Die Elution wird mit
einem Gemisch aus Aceton und Ammoniaklösung durchgeführt. Das ,
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Eluat wird eingeengt und anschließend mit Wasser verdünnt. Die
verdjinnte Lösung wird über eine mit Dowex 1x2 (Cl""-Form) beschickte
Säule gegeben. Die Elution wird mit einer wäßrigen Ammoniurahydrogencarbonatiösung durchgeführt. Das Eluat wird eingeengt
und gefriergetrocknet. Man erhält 0,7 g eines pulverförmigen
Gemisches aus Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten von 85prozentiger
Reinheit.
Aerobacter aerogenes ATCC 8329 wird in 500 ml eines 10 mg/ml Glucose,. 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat,
11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-ViTerf6,8 8 Stunden bei 38°C
in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend v/erden die Zellen abzentrifugiert.
2,5 g der so erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,40 m Phosphatpuffer
vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 800 mg RNS und 584 mg Athylendiamintetraessigsäure versetzt. Das
Gemisch wird 36 Stunden bei 400C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion
erhält man 4,3 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten.
.
Das Reaktionsgemisch wird anschließend gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet.
Man erhält 133 mg eines pulverförmigen Gemisches aus
3f ,5'-Cyclophosphaten von 83prozentiger Reinheit.
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· Beispiel 7
Salmonella typhosa ATCC 9992 wird in 500 ml eines Nährmediums
der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 116 Stunden bei
28°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Ar
schließend werden die Zellen abzentrifugiert.
1,8 g der so erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,05 m Phosphatpuffer
vom pH-V7ert 6,8 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 f RNS und 438 mg Athylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch
wird 15 Stunden bei 400C umgesetzt. Es bilden sich
6,3 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-21,3f-cyclophosphaten.
Sodann wird das Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 5 aufgearbeitet. Man erhält 170 mg eines pulverförmigen Gemisches aus 2',3!-Cyc^_
phosphaten von 82prozentiger Reinheit.
2 g der gemäß Beispiel 7 erhaltenen Zellen von Salmonella typhosa werden in 100 ml 0,36 m Phosphatpuffer vom"pH-Wert 8,0
suspendiert. Die Suspension wird mit 1,5 g MS und 730 mg
Athylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 44 Stunden
bei 430C umgesetzt. Man erhält 9,1 mg/ml eines Gemisches
aus Hucleosid-31,5'-cyclophosphaten.
Beispie 19 Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 wird gemäß-Beispiel 1 gezüchtet.
Nach dem Züchten werden die Zellen'abzentrifugiert. 2,3 g der so erhaltenen Zellen v/erden in 100 ml 0,05 m Acetatpuffer
vom pH-V/ert 5,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1,5 g RNS _j
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Ί und 584 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch
wird 43 Stunden bei 380C umgesetzt. Man erhält 9 mg/ml eines Gemisches
aus Nucleosid-21,3'-cyclophosphaten.
' Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 5 aufgearbeitet. Man
erhält 144 mg eines pulverförmigen Gemisches aus Nucleosid-21,3'-cyclophosphaten
von 78prozentiger Reinheit..
Beispiel 10 Man verfährt wie in Beispiel 4, verwendet aber Pseudomonas
aeruginosa ATCC 15246 anstelle von Escherichia coli ATCC 10798.
Man erhält 371 ug/n;l eines Gordisches eus rcucD.eosid-31,5r-cyclophofiphaten.
B e i s ρ i e 1 11 Hansenula anomala ATCC 20144 v/ird in 500 ml eines 40 mg/ml Glucose,
5 rag/ml Pepton, 2 mg/ml Keieextrnkt, 2 .^g/rnl Kaliumdihydro- .
genphosphat, 2 mg/ml Dikaliumhydrogenphoüphat, 1 mg/ml Kagnesiumsulfat
und 20 mg/ml Malzextrakt entho].tc-nden Kährmediums vom
pH-^ert 6,5 28 Stunden bei 28°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben
gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen abzentrifugiert. Sodann werden 2,5 g der Zellen in 100 ml 0,33 m
Phosphatpuffer vom pK-v/er't 8,0 suspendiert. Die Suspension wird
mit 1 g RNS und 500 mg Hydroxyäthylendiamintriessigsäure versetzt
und 72 Stunden bei 400C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion
erhält man 3,6 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3f,5'-cyclophosphaten.
Sodann wird das Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet. Man erhält 47 rag eines pulverförmigen Gemisches
aus Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten von 76prozentiger Reinheit. ,
409834/1098
■ Beispiel 12
Kloeckera apiculata ATCC 18212 wird gemäß Beispiel 11 gezüchtet,
mit der Ausnahme, daß die Züchtungsdauer 32 Stunden beträgt'. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert. Sodann werden
3g der erhaltenen Zellen.in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom
pH-V.rert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und
692 mg Cyclohexandiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 72 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Umsetzung erhält
man 3,5 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten.
Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet. Man erhält 42 mg eines pulverförmigen Gemisches aus
3fj5'-Cyclophosphaten von 74prozentiger Reinheit.
Beispiel 13 2,5 g gemäß Beispiel 11 erhaltene Zellen von Torulopsis
sphaerica ATCC 8549 werden in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom
pH-»rert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und
438 mg Ethylendiamintetraessigsäure versetzt. Sodann wird das Gemisch
48 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 523 ug/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3',5T-cyclophosphaten.
L *
409834/1098
Claims (1)
- Patentansprüche(hy Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Ribonucleins'äüre zu Nucleosid-2', 3'-cyclophosphaten und Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten, dadurch, gekennzeichnet, daß man Ribonucleinsäure mit intakten Zellen von Ribonuclease-Aktivität aufweisenden Mikroorganismen in wäßrigem Medium in Gegenwart eines Chelatbildners umsetzt.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung zusätzlich in Gegenwart von Phosphationen durchführt .3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Iiucleosid-21, j5'-cyclophosphate und l·Iucleosid-351,5'-cyclophosphate aus dem wäßrigen Medium abtrennt.4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattungen Escherichia, Salmonella, Aerobacter, Pseudomonas, Hansenula, Kloeckera oder Torulopsis verwendet.5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Species Escherichia colij Aerobacter25' aerogenes, Salmonella typhosa, Pseudomonas aeruginosa, Hansenula anomala, Kloeckera apiculata oder Torulppsis sphaerica verwendet. .409834/10986. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Escherichia coli ATCC 10798, Aerobacter aerogenes ATCC 8329, Salmonella typhosa ATCC 9992, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Hansenula anomala ATCC 20144, Kloeckera apiculata ATCC 18212 oder Torulopsis sphaerica ATCC 8549 verwendet.7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mar als Chelatbildner Athylendiarnintetraessigsäure, Cyclohexandiamir.tetraessigsäure oder Hydroxyäthylendiamintriessigsäure verwendet.8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse bei einer Phosphationenkonzentration bis zu 0,15 ra durchführt und dadurch selektiv zu Nucleosid-21,3f-cyclophosphaten gelangt.9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phosphationenkonzentration von 0,15 m bis 0,17 m einstellt und dabei zu einem Gemisch aus etwa gleichen Mengen Nucleosid-2',3f-cyclophosphaten und Kucleosid-3',5'-cyclophosphaten gelangt.10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phosphationenkonzentration auf mindestens 0,17 m einstellt und dabei selektiv zu Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten gelangt.409834/1Ü98J 11-, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß . man 1 bis 40 mg/ml Ribonucleinsäure mit 10 bis 40 mg/ml intakten Mikroorganismenzellen umsetzt.5 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration des Chelätbildners im Medium auf 5 bis 30 milliraolar einstellt.13. - Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man 10 den pH-Vfert des Mediums auf etwa 5 einstellt.14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert, des Mediums auf etwa 8 einstellt.409834/1Ü98Leerseite
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