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Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganis mus der Spezies Bacillus subtihs
DE2101803A1
Germany
- Other languages
English - Inventor
George Sechn Kalabokias (Frank reich)
Worldwide applications
Application DE19712101803 events
1971-07-29
Status
Pending
Description
translated from
PATENTANWÄLTE 210 I Ö U O
dr. W. Schalk · dipl.-ing. P. Wirth · dipl.-ing. G. Dannenberg
D R. V. SCHMIED-KOWARZIK - DR. P. WE 1 N HOLD · DR, D. G U DE L
6 FRANKFURT AM MAIN
SK/SK
^Mi ff't-f Societe Rapidase S,A.
lytlx .*-» B.P. 47
'•'-•-■1' Seclin (Nord), Frankreich
Verfahren zur
Die Bezeichnung "alkalische Protease" steht für eine Klasse proteolytischer
Enzyme, die im alkalischen pH-Bereich, z.B. bei einem pH-Wert zwischen
B-11,5, v/irksam sind. Diese Materialien sind vielversprechend als Reinigungsmittel
zur Fleckentfernung aus Bekleidung in den häufigen Fällen, wo die Flecken Proteinkomponenten enthalten. Ein v/eiterer Vorteil dieser Materialien
besteht darin, daß sie im allgemeinen in Verbindung mit handelsüblichen
Reinigungsmitteln verwendet werden können. Somit stehen Waschmittelformulierungen
zur Verfügung, die alkalische Protease zur Verbesserung des Ver— ™
haltens der Formulierungen enthalten.
Bekanntlich kann alkalische Protease durch Züchtung des Organismus Bacillus
subtilis hergestelltt warden. Viele Organismen diaper Art ergeben jedoch nur
eine Geringe Ausbeute an alkalischer Protease, wodurch die Herstellung des Materials aus diücci. Organismen unzureichend und teuer ist.
109831/1U8
2 1C -: O 3
En wurde nun gefunden, da" die L jchoriif'ürrni:>-.\rt dos urneniinnr-, :;. ;'-.liIu_>
:.uLiilis
gegenüber anderen Arten von üacillus suhtili:; wcsrnLÜGi verbesserte -.u:-
L5uten an alkalischjr Protease liefert und ::-ornit einen vrespntlichon Vnrt;.:il
bsi der Herstellung von alkalische Protease aufgrund erheblicher Zuri αίι:τ en
in dEr Prcduktionsvarksarnkeit üurcii Verwendung des Organismus ergibt, Ι.·±υ
Licheniformis-Art ivird von manchen Ctellen alü eine von subtilis unr.bfv'Irrji^s.:
Art angesehen. Sie ist jedoch Bacillus suhtilis sehr ähnlich und wird crfindungsgerfiiifl
als Unterart desselben angest^nen.
Die aus Licheniformis gp.bildüte Protease wird vorzugsweise clurcn Ausf.:iliunir
mit Methanol odsr einem anderen, nicht—wässrigen, polnren Lösun;j£:mittel von
der Kultur abgetrennt.
Die erfindungsgemciß hergestellt= alkalische; Protease hat gewähnlich bei höheren
Temperaturen eine größere Wirksamkeit als andere alkalische Pr.ot&usen,
wodurch ihre Verwendung in automatischen 'Waschmaschinen erleichtert wird.
Lichenifarimis Organismen werden in einem Nahrmsdiurfi mit periodischen absatzvveisen
Zugabenan löslichem Kohlehydrat während des größten Teils der Züchtungsperiode gezüchtet, um einen Gehalt an reduzierendem Zucker von etwa Q,1-2
Gew.-i/a, vorzugsweise 0,4-1 Gew.-r;i, des Kulturmediums aufrechtzuerhalten. Die
Züchtung erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur
von 30-40 C. und einem pH-Wert von 5,0-8,0■während der gesamten Züchtungsdauer,
um die vorteilhaft hohen Ausbeuten an alkalischer Protease zu erzielen.
Ein Vorteil in der Verwendung von Licheniformis besteht darin, daß man eine
geringe Ausdeute cn Amylase-Nebenprodukt erhalt, während anürre, hoho Ausbeuter·
an Protease liefernde Organismen dazu neigen, (iroiie Mengen un Amyla.se zu produzieren.
,
■'*■-■ ■■■■■■= -10983 1/Ute BAOORKSINAL
t ι
—* C\ ■"·
'..ührcnil nur Zt'Jchtun r;j'".tufR wird es besonders bevorzugt, den pH~.,crt zv,r:'.;:«":;::π
(JjU-Ij1L und die "i ί,,-η/κ.rutur zwischen ?/(~1;:ίπ0. zu halten.
Uie h'Iuri.:;:: Zurjubc lüclichcr Kohlehydrate ·,·..'.hrend der urfi
Züchtuir:L.-.tui π in .;3-::ir,un Antnilcn zv.-ucks nufrochterhaltung der uLicn genannten
Konzüntiv-'-ion an i'cdjzic-rcnuc:!:! Zucker vr:rbüS3crt das V/nchstum dec Grganitmus
und die ProuuKtion an alkalischer Protease in unerwarteter V,eise.
Gewöhnlich wird Ltt;u:baute Stärke als Kohlehydratquelle verwendet. Dic3 GtLi
leinn auf versehi rnnne .',eise-, ζ.!Γ. durci Verwundung von Enzymen, eurch V,-ärrr.3,
durcli iir.urc ader durc;· irrendwslchs anderen geeigneten !.'.αΒηαηηιεη, auf ein
reduziertes I.'.alekulurgEr.vicht abgeoaut sein.
Das ursprüngliche !„a^rv.yuiun, in das Bacilbu subtilis, Abart Lichenifornis,
eingeführt v.irn, hat gc.vähnlicii ejnen Kohlehyciratgehalt von etwa 10-20 Gew.—,..
Nachdem nie Konzentration ecs Nührnediums an reduzierendem Zucker auf weniger
als etv.a 2 Gew.—/j durc-i Stoff\vachseleinv.d.rkung ues Mikroorganismus reduziert
worden ist, wird gewöhnlich in häufigen Anteilen in oben'beschriebener Weise
weiteres Kohlehydrat zugefügt.
Die Konzentration en reduzierendem Zucker kann colorimetrisch mit einem Klett-Colorimcter
unter Verwendung eines 54-Filters (540 m -u) bestimmt werden. Die
Reduktion von üinitrosaücylsilure durch das zu testende f.'.edium wird gemessen
und mit einam Glucose-^tandard in'dest. ,'.asser verglichen. Dann wird die Konzentration
an reduzierendem Zucker auf Plucossbasis berechnet, d.h. man nimmt;
an, daß d-'s einzige Anwesende Reduktionsmittel Glucose ist und berechnet die
angenommenere G]uciisekc;nzentration als Konzentration an reduzierendem Zucker.
RAD
-*1 0 9 ö 3 1 / ί A 4 8 BAU
Nach Fortschreiten der Züchtung für eine zur UiIdung der HunhstausLuute
an alkalischer Protease ausreichende Dauer wird die Ftnteaso gewöhnlich vom
Rest des Mediums abgetrennt. Dies kann durch Filtrieren des Γ/ediums zur Entfernung
von äußeren Feststoffen, Waschen derselben und einschließende Ausfällung
der alkalischen Protease vom Filtrat erfo]uen.
Zur Ausfällung der alkalischen Protease vom Kulturfiltrat sind gewöhnlich
polare Lösungsmittel mit einem niedrigen Wassergehalt geeignet. Verwendbare Lösungsmittel sind Aceton, Diethylether und Alkohole mit höchstens etwa 3 ■
Kohlenstoffatomen, wie Methanol, /.thanol und Isapropanol. Es können auch
Mischungen polarer Lösungsmittel verwendet werden. Eine andere Klasse von Materialien" zur Ausfüllung der alkalischen Protease vom Kulturfiltriat sind
die löslichen Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Kaliumnitrat und
Natriumchlorid.
Vor der Ausfällung der alkalischen Protease vom Filtrat aus der Züchtung es
ist es zv/eckmäßig,' das Kulturfiltriat und die zugefügte Vvaschlösung auf etwa
30-40 c/3 des ursprünglichen Gewichtes einzudampfen. Dann wird die alkalische
Protease vom EvacDrat, vorzugsweise mit einem Alkohol mit höchstens 3 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, ausgefällt.
Die so hergestellte Protease hat gewöhnlich ihre maximale proteolytische Wirksamkeit
in einem Temperaturbereich von etwa 57—G7 C. bei einem pH—Wert von
etwa 8,5.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie
zu beschränken.
1 0983 1/1448
B e i s ρ j. π 1 2
(A) eine Kultur von Uacillus subtilis, Abart Licheniformis, wurde unter aeroben
Bedingungen in einem Kulturmedium mit einem pH-'.7ert von 6,0-6,7 bei
einer Temperatur von 35-37DC. gezüchtet. Das Kulturmedium enthielt die folgenden
Bestandteile:
mit Amyipse abgebaute Maisstärke 30 Gew.-^o
gepreßte Hefe 0,1-0,8 Gew.~f;i
f.'aisweichflüssigkeit 0,9-2,5 Gew.-$
Lactose ' Li; 1-0,5 Gew.-^
P ho sp.horsäure 0,5-1,8 G ew. -f Ό - &
Calciumcarbonat 1 Gew.-^
Magnesiumsulfat Spur
Mangansulfat . Spur !
Zinksulfat " ' Spur
Kupfersulfat Spur
Eisencarbonat Spur
Wasser ' Rest
Als das Wachstum des Organismus den Gehalt an reduzierendem Zucker unter 1 %
absinken ließ, wurde in häufigen Anteilen weitere mit Amylase abgebaute Stärke zugefügt, um die Konzentration an reduzierendem Zucker zwischen etwa 0,1—2
Gew.-f/o zu halten. Mj
Nach 50-üO-stündiger Fermentation wurden in der Kulturmaische etwa 29
Wirkcamkeits- Ä
Protease-yeinheiten pro ecm gefunden. Die Protease wurde mit Methanol ausgefüllt
und abfiltriert. .■' *"
(lj) Üiü Wiederholung dus obigen Versuches ohne Zugabe der abgebauten Stärke
in häufirjc;n Antfjilen ortjab eiruj Hüchstausbeute von etwa 2ü OÜÜ Protease-WirksamknitBoiriheitcn
pro ecm nach etwa 4ü-ntündirjer Fermenttition.
109831/1448 '3
2\ -! : 5 O 3
— U —
. Die Protease.—Wirksamkeitseinheiten wurden wie falijt berechnet:
Eine Pufferlösung aus 3,0 g Tris-(hydroxymethyl}-::ninomcthan (als "Tris"
bekannt) in Mischung mit 400 ecm dost. '.\asser wurde hergestellt und unter
Rühren mit 1M-Salzsüure auf einen pH-.'.ert von 0,5 titriert, bann wurde riest.
Wasser bis zu einem Volumen von 500 ecm zugefügt.
Es wurde eine Substratlösung hergestellt durch Zugabe von 1,3 g Casein zu CO
ecm eines 0,05?,! "Tris"—Puffers bei einem pH-'.vert von 7,6, dann wurde zum
Lösen das Caseins unter Rühren erhitzt. Mach dem Abkühlen.wurde weitere Pufferlösung
bis zu einam Volumen von 100 ecm zugefügt.
Eine Mischung, zu der die in der obigen Fermentation hergestellten, enzymhaltigen
Produkte zugefügt wurden, wurde in einer Reihe von Testrohren hergestellt, indem man in jedem Rohr 3 ecm der obigen Substratlösung, 3 ecm einer
0,02i\i-Natriumhydraxydlösung und 3 ecm einer 0,014 M Natriumtripolyphosphatlösung,
die mit HCl auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht war, mischte. Die Rohre
wurden mit Stöpseln verschlossen und auf eine Temperatur von 37°C. gebrächt. Der pH-Wert sollte bei 8,5 oder darüber liegen.
Mittels einer Uhr.mit zusätzlichem Zeiger wurdennach einer gegebenen Zeit
3 ecm einer Enzymlösung, die die zu bestimmende alkalische Protease enthielt,
in jedes Tsstrohr mit Ausnahme der Kontrolle "ohne Substrat" gegeben,
die statt dessen 3 ecm der oben hergestellten Pufferlösung erhielt. Der Rohrinhalt
wurde mindestens 30 Sekunden durch Klopfen der Rohrende'gemischt
und dann bei 37 C. bebrütet. Genau 15 Minuten nach Zugabe der Enzymlösung
wurden jedem Rohr 10 g Trichloressigssurelösung (hergestellt durch Zugabe von
16 g Trichloressigsäure, 10 g Natriumacetat und Ίϋ,9 ecm Eisessig in einen
Behälter und Verdünnen mit dest. Wasser auf 1 l) zugefügt. Pieso Mischung
109831/U48 ORIGINAL !MSFECTEO
9 in 13 03
zerstört ±ια I n::yai und verhindert ein:; «eitere Hydrolyse das urweBC.-r.Gn
tinnnins durch du, V.nrym. Dann wurde ücr Inhalt jedes Rohres durcn ein V<
z~ ,Vhatinan Mr. 42 i'cpicr filtriert, wobei der erste Anteil des Filtrates er.- = -durch
das Papier filtriert wurde.
Gleichzeitig v.urdü eine "Enzym-Kontrollprabe" hergestellt, inaern rr.an 5 zzn
der Fnzymlüsunn Ib Minuten bui 37°C. bebrütete. üic Lösung wurds dann zu
einer Miscnung auc 3 ecm nuhatratlck.ung, 3 ecm 0,2N Natriumhydroxyc un; 2 zzn
0,Lj-I-Ii.1! !Jatriuntripolvpha^phr.t zurcnr.hcn, nachdem die Mischung 15 !.'inurän rsi
37°w. bebrütet worden war und 1ü ccn v.m- obigen TrichlorcsüigiülursläE^-;:
zugegeben vvuren. Mach Zugabe der Enzymlüsung wurde die Mischung err.svz rric
gelegentlichem schütteln eine halbe Stunde bei 27°C. bebrütet und dann filtriert
.
Dann wurden die optischen Dichten jedes der obigen Filtrate bsi 275 n,u ur.tsr
Verwendung einer 10 ram Zelle und eines üpektrophotonieters bestimmt, ύετ sz
eingestellt war, daß der Punkt einer lüD-vicjen Durchlässigkeit der abgsis£=-is
Vfert der obsn hergestellten Kontrollprobe "ohne Substrat" war. Dann würger. ε^3
abgelesenen Werte korrigiert, indem man die optische Dichte der oben hergestellten
"Enzymkontrollprobe" von den optischen Dichten der anderen Testlösungen
subtrahierte.
Dann wurde die [.".enge an anwesender alkalischer Protease in Y.'irksarioiteinhoiten
ausrjedri"ir.kt, die durch die folgende Formol berechnet wurden:
korrigierte opt.Dichte bei 27üm,u der- i!ydrijlycatmiüchuruj
Süwirk.v-ink.- im Tristrohr Volumen (d.h. 22 zz~
iiinhBitun = opt.üid-tc bei 27Ü m,u von 1,ü mg Zeit [aAu 'l= Π*Γ^
Tyrosin pro ecm (d.h. O,Ü11A)
109831/1148
2101 303
-B-
D.h. eine Wirksatn'iitseinheit ist diejenige Enzymmenge, die in einer Minute
unter den Bedingungen des obigen Testes ausreichend Tyrosin und andere Materialien durch Hydrolyse des Casein bildet, um bei 275 m,u eine solche
Dichte zu ergeben, die gleich der Dichte einer Tyrosinlösung mit 1,5 mg
Tyrosin pro ecm ist.
Wurde Beispiel 1 (A) und (θ) unter Verwendung eines Kulturmediums wiederholt,
das nur 2,5 Gew.—yj der mit Amyläse abgebauten Maisstärke enthielt, wobei die
restliche Maisstärke durch Wasser ersetzt war, und die Fermentation bei einer Temperatur von 37-42°C. für 70-80 Stunden durchgeführt, so erhielt man praktisch
äquivalente Ergebnisse.
Beispiel 3
Beispiel 3
.(A) Eine Kultur Eacillus subtilis, Abart Licheniformis, wurde 20 Minuten auf
erhitzt, 60 C. in einer 0,ÖEM/aigen Natriumchloridlösung/auf eine Kartoffelschaibe be-
impft und 24 Stunden bei 37 C. gezüchtet. Danach wurden Stücke der Kartoffelscheibe
zu 1000 ecm einer Mischung aus 4 g Dextrose, 5 g Natriumchlorid, 10 g Tripton, 3 g Rindfleischextrakt, 1 g Κ^ΗΡΟ», 3 g Hefeextrakt und dem
Rest aus Wasser zugefügt. Diese Mischung wurde 16 Stunden bei 37°C. in einem RotationschüttelEutomaten zur Bildung eines bakteriellen · Inoculums bebrütet.
Aue den folgenden Bestandteilen wurde ein Maischenpräparat hergestellt/
109831/UA8
Gew.-Teile
mit Amylase abgebaute Stärkelösung -24 ^
(45 Gew.-i/i Stärke) ' ·
Lactose ' 4,3
K2HPO4 4,3
Maisweichflüssigkeit 26,0
Phosphorsäure (75-^/oig) 12,9
Brewer's Hefe 7,2
Sojaprotein (Kaysoy) 3,65
Calciumcarbonat · 2,88
hydratisiertes Magnesiumsulfat .1,25
Natriumchlorid 0,72 * mk
Mischung aus 5 Gew.-Teilen Kleie und „ „
4 Gew.-Teilen Fettöl . '
hydratisiertes Ferrosulfat Spur
hydratisiertes Mangansulfat Spur
hydratisiertes Zinksulfat Spur
Wasser ■ ausreichend für sir,
Gesamtgewicht vor, 1000 Gew.-Teilen
Die obige Maische, wurde absatzweise 45 Minuten bei 125-130 C. sterilisiere
und auf 35-37°C. abgekühlt. Zur Schaffung eines pH-Wertes von 6,3-6,5 v.lt=3
steriler Ammoniak zugefügt. Zur Maische wurden etwa 0,3 Gew.-iji des oben hergestellten
bakteriellen Inoculums zugefügt, dann wurde etwa 20 Stunden ur.z=r Λ
Belüftung und mit Rühren fermentiert. Während dieser Zeit wurde die Temperatur auf 35—37 C. und der pH-Wert durch periodische Ammoniakzugabe zwiscen
6,1—6,5 gehalten.
Danach wurde ein anderes, dem obigen ähnliches Maischenprüparat hergestellt,
wobei 372 Gew.-Teile des 45-'/iigGn, mit Amylase abgebauten StürkOlüsung ur.z
entsprechend wenicjor Wasser zugefügt wurden. Dia Maische wurde absatzweise
untar dun obun beschrieborion Hßdinrjun[.ien sterilisiert, auf 35-37DC. abgekühlt,
und dünn wurde Ammoniak hi::>
zu oincmi pii-.V^rL vi;iw (),4-(j,fi zuqt.fügt.
109831/UA8
.-,ο- 2li..:jO3
Etwa BO Gew.-Teile der bereits fermentierten f.'uiscnu wurden zum neuen !.tai^chbpräparat
zugefügt, dann wurde 50 Stunden unten der obicrun Fermentations—
bedingungen fermentiert. Der Kohlehydratgehalt der Forrnentationsrnischung wurde
von Zeit zu Zeit untersucht, und gelegentlich wurden jev.ails et.'.u 17 Ge'.v.-Teile
der obigen, mit Amylase abgebauten Stürkelusuno' zugegeben, um eine Konzentration
an reduzierendem Zucker zwischen 0,4-1 Gew.-^j aufrechtzuerhalten. Gewöhnlich
erfolgten die Kohlehydratzugaben alle 3 Stunden.
Die anwesende alkalische Protease wurde nach dem unten beschriebenen Verfahrein
bestimmt und ergab die folgenden Werte:
Fermentation; std Protease-.Virksamkeitseinheiten
pro ecm
34 2 784
42 23 -655
46 24 166
50 ; 24 662
58 ■ 23 693
Dann wurde die erhaltene Maische filtriert und der Filterrückstand mit Leitungswasser
gewaschen. "
Das FiItrat wurde auf eine Konzentration von etwa 18° Be. eingedampft, auf
3 C. abgekühlt und auf einen leicht sauren pH-Wert eingestellt. Zur Ausfällung
der Protease wurde (.'.ethanol bis zu einer Konzentration von etwa BO ^4 zugefügt,
der dann von der flüssigen Phase abfiltriert wurde.
109831/U48
210 1303
[JiD na cn ϋί.-ΓΓι obinnn Verfahren hergestellte alkalische Protease zei-v^ irre
maximale prateolytiscnn V.irksainkeit bei etwa CD-OS C, gemessen durc: i"rs
Hydrolyse van Casein für 10 Minuten bei einem pH-Wert von b,5. Die al-;?.li=--is
Prütnaso zeigt hei einem pii-V.ert von etwa 10 ihre maximale proteolyciscr=
Wii'ksnmkcit bei einer Temperatur von 37 C. und bei einem pH-v'/ert von οτ.νπ
9,(3 bei einer Temperatur von 61 C.
(Β) Der obige Versuch wurde wiederholt, wobei während der Fermentr-icr.ezsikeine
absatzweise Zugabe der mit Enzym abgebauten Stürkel-ooung erfcli:--2. ία
wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:
Fermentation; std Protease-.VirksE-rnkoitseinr.si-^n
pro ecm -
30 13 11Ö
34 '15 930
42 10 395
Die Protease-Wirksamkeitseinheiten in diesem Beispiel werden wie 'in'EciszisI
1 definiert.
10 9Ö31/U48 BAD
Claims (6)
Hide Dependent
translated from
Claims (6)
Hide Dependent
translated from
1.- Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganismus der Spezies· Bacillus
subtili^s, Unterart Licheniformis, in aerober Weise in'einem Nährmedium bei
einen pH-Wert von 5,0-8,0, dadurch gekennzeichnet, daß während des grüßten
Teils der Züchtungsdauer des Mikroorganismus absatzweise häufig sin wasserlösliches
Kohlehydrat zugefügt wird, um den Gehalt an reduzierendem Zucker im Medium zwischen etwa üs1-2 Gsw.-,3 zu halten.
2,— Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kohlehydrat
als abgebaute Stärke zugefügt wird,
3.- Verfahren nachAnsprush 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, deß die Temperatur
3U-4G C. beträgt.
4,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, -daß die Temperatur
34-38°ü. beträgt und der pH-Wert 6,0-6,6 ist. · .
5,- Verfahren ndch Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt
an reduzierendem Zucker zwischen 0,4-1 Gew.-ya gehalten wird.
6.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, .üaB der Mikroorganismus
gezüchtet wird, indem man ihn in ein [Jährmedium mit etwa 10—20
Gev.'.-j. Kohlehydrat in Form von abgebauter Stärke, bezogen auf das Gewicht dec
Mediums gibt, und, nachdem der Kohlehydratgehalt Durch die Etoffwechseleinwirkung
des Mikroorganismus auf weniger als etwa 2 Gew. — .' verringert worden
ist, in häufigen Anteilen Kohlehydrat zugefügt, um den Gehalt an reduzierenden
Zucker zwischen utv.a 0,4-1 Gew.-^o zu halten. (
Der Patentanwalt:
r . ι
L '
109831/U48