DE2050481A1

DE2050481A1 - Diagnostic agent for the semi-quantitative determination of glucose in aqueous liquids

Info

Publication number: DE2050481A1
Application number: DE19702050481
Authority: DE
Inventors: Kenneth Allen Haden Billy Harper Hendershot William Fred Elkart Ind Johnson La Veil Rolfson Salt Lake City Utah Blake, (V St A) P
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1969-10-15
Filing date: 1970-10-14
Publication date: 1971-04-29
Also published as: NO130520B; NO130520C; DK139795C; FR2065939A5; ZA706650B; CA926282A; CH558530A; DK139795B; GB1320957A; ES384417A1; US3814668A; NL7014994A; BE757507A; SE360178B; JPS5039558B1; DE2050481B2

Description

betreffendconcerning

Diagnostiziermittel zur halbquantitativen Bestimmung von Glukose in wässrigen FlüssigkeitenDiagnostic agent for the semi-quantitative determination of Glucose in Aqueous Liquids

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Diagnostiziermittel zur halbquantitativen Bestimmung von Glukose in wässrigen Flüssigkeiten, wie Urin, das Glukoseoxidase, ein wasserlösliches Jodid und eine Substanz mit Peroxidaseaktivität enthält.The invention relates to an improved diagnostic means for the semi-quantitative determination of glucose in aqueous liquids such as urine, the glucose oxidase water-soluble iodide and a substance with peroxidase activity contains.

Das Mittel ist in einem Träger und/oder einer semipermeablen Membran, wie Äthylcellulose enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Diagnostiziermittels ist zusätzlich eine färbende Substanz, wie Brilliantblau FGF,in dem Testmittel enthalten.The agent is in a carrier and / or a semi-permeable one Membrane, such as ethyl cellulose. In a preferred embodiment of the diagnostic agent according to the invention a coloring substance such as brilliant blue FGF is also contained in the test agent.

Der Nachweis von Glukose im Urin sowie die Bestimmung ihrer Konzentration ist von großer Wichtigkeit für Diabetiker, die durch entsprechende Diät ihre Zuckeraufnähme regulierenThe detection of glucose in the urine as well as the determination Their concentration is of great importance for diabetics, who regulate their sugar intake through an appropriate diet

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müssen und deren Glukosegehalt im Urin daher regelmäßig untersucht werden muß. Neben seiner Eignung für regelmäßige Urinuntersuchungen von Diabetikern durch Patienten selbst oder durch Ärzte, kann dieser Glukoseindikator auch wirksam für Routineurinanalysen in Krankenhäusern und auch Praxen verwendet werden zum Nachweis von Diabetes und für Reihenuntersuchungen, zur Unterscheidung von Glukosurie von anderen Meliturien und ähnlichem.therefore have to regularly check their urine glucose content must become. In addition to its suitability for regular urine examinations of diabetics by patients themselves or by doctors, this glucose indicator can also be used effectively for routine urine analyzes in hospitals and also medical practices are used to detect diabetes and for screening tests to distinguish glucosuria from others Melituria and the like.

t Da die frühzeitige Diagnose und regelmäßige Überwachung bei Diabetes so wichtig sind, muß ein Urinzuckertest, wenn er von größtmöglichem Wert sein soll, möglichst schnell und einfach genug sein, daß ihn jeder Patient leicht, selbst ausführen kann, genau, genug für den Kliniker und empfindlich genug um Änderungen in dem Zustand des Patienten anzuzeigen. Darüberhinaus muß das Diagnostiziermittel genügend quantitativ sein, um eine Zunahme der Glukosekonzentration genau zu messen und es dadurch zu ermöglichen, zwischen verschiedenen medizinischen Zuständen zu unterscheiden.t As the early diagnosis and regular monitoring are so important in diabetes, a urine test must, if it is to be of the greatest possible value, as quickly as possible and simple enough that any patient can easily do it himself, accurately, enough for the clinician and sensitive enough to indicate changes in the patient's condition. In addition, the diagnostic agent must be quantitative enough be to accurately measure an increase in glucose concentration and thereby make it possible to switch between different medical To distinguish between states.

Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Zucker im ^ Urin sind in der klinischen Chemie bekannt. Ein derartiges ^ Verfahren verwendet derfeenedict¹sehen Kupfer-Reduktionstest. Ein anderes verwendet ein alkalisches Kupfer-Reduktionsmittel in Tablettenform, das sich bei der Lösung selbst erwärmt und ein weiteres umfaßt einen Test, der nur auf der Wirkung von Enzymen beruht. Dieser zuletzt genannte enzymatisch^ Glukosetest umfaßt das Vorhanden/sein von Glukoseoxidase, einer peroxidierenden Substanz und eines Chromogens, daß anspricht, wenn das Testmittel mit einer Körperflüssigkeit, die Glukose enthält, zusammenkommt. Derartige Indikatorsubstanzen sind im aligemeinen Oxidations-Reduktionsindikatoren«,Methods for detecting and determining sugar in urine are known in clinical chemistry. One such method is used by the fairy dict ¹ see copper reduction test. Another uses an alkaline copper reducing agent in tablet form which heats itself up when dissolved, and another involves a test based only on the action of enzymes. This latter enzymatic glucose test comprises the presence of glucose oxidase, a peroxidizing substance and a chromogen that responds when the test agent comes into contact with a body fluid containing glucose. Such indicator substances are generally oxidation-reduction indicators «,

Die oben beschriebenen enzymatischen GlukosetestsystemeThe enzymatic glucose test systems described above

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sind normalerweise in bzw· auf dem Träger enthalten gewesen. Derartige Träger umfassen üblicherweise saugfähige Cellulosestreifen» in oder auf denen das Testmittel enthalten isto Es hat sich jedoch gezeigrfcf daß derartige enzymatische Glukosediagnostiziermittel nicht ausreichend quantitativ sind, d.h. daß sie eine geringe Zunahme von Glukose in Körperflüssigkeiten,wie Urin, nicht anzeigen können.were normally contained in or on the carrier. Such carriers usually comprise absorbent cellulose strips in or on which the test agent is contained however, it has been shown that such enzymatic glucose diagnostic agents are not quantitative enough, i.e. that they have a small increase in glucose in body fluids such as Urine, can not show.

Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein verbessertes halbquantitatives Diagnostiziermittel für Glukose herzustellen, das kleine Unterschiede der Glukosekonzentration in Körperflüssigkeiten wie Urin anzeigen kann und das eine sehr gute Stabilität besitzt. Das Diagnostiziermittel soll durch einfaches Eintauchen und Ablesen (dip and read) angewandt werden können und jeweils eine bestimmte Menge der Probe aufnehmen·It is therefore an object of the present invention to provide an improved semi-quantitative diagnostic agent for glucose, which can indicate small differences in the concentration of glucose in body fluids such as urine and that has a very good stability. The diagnostic agent should simply be immersed and read (dip and read) can be applied and each take up a certain amount of the sample

Es hat sich nun gezeigt, daß diese Aufgaben dadurch gelöst werden können, daß man ein Diagnostizierraittel für Glukose verwendet, das Glukoseoxidase, eine peroxidierende Substanz und ein wasserlösliches Jodidsalz in bzw. auf einem Träger und/ oder mit einer semipermeablen Membran, wie Äthylcellulose, überzogen verwendet. Hierdurch wird eine genau regulierte Menge der flüssigen Probe aufgenommen und zurückgehalten, wenn das Diagnostiziermittel in die Flüssigkeit eingetaucht wirdo Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Diagnostiziermittel zusätzlich eine färbende Substanz, wie einen blauen Farbstoff, wodurch ein ungewöhnlich breiter Farbgradient entsteht. Wie oben gesagt, hat es sich gezeigt, daß ein besserer halbquantitativer Glukosetest durch Verwendung eines wasserlöslichen Jodids als Chromogen in einem enzymatischen Glukosetestsystem erzielt werden kann₀ Es hat sich gezeigt, daß wenn ein Testmittel, das nur Glukoseoxidase, Peroxidase und ein Jodidsalz enthält, nur in eine Urinprobe eingetaucht wird, die Glukose enthält und sofort,wieder daraus entfernt wird - ein j, It has now been shown that these objects can be achieved by using a diagnostic agent for glucose which covers glucose oxidase, a peroxidizing substance and a water-soluble iodide salt in or on a carrier and / or with a semipermeable membrane such as ethyl cellulose used. As a result, a precisely regulated amount of the liquid sample is taken up and retained when the diagnostic agent is immersed in the liquid. In a preferred embodiment, the diagnostic agent according to the invention additionally contains a coloring substance, such as a blue dye, which results in an unusually broad color gradient. As stated above, it has been found that a better semiquantitative glucose test can be achieved by using a water soluble iodide as chromogen in an enzymatic glucose assay system ₀ It has been found that when a test agent which contains only glucose oxidase, peroxidase and an iodide salt, only is immersed in a urine sample containing glucose and immediately removed from it - a j,

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Überschuß der Probeflüssigkeit an dem Diagnostiziermittel zurückgehalten wird und dadurch verhindert, daß der atmosphärische Sauerstoff an der Reaktion teilnehmen kann und dadurch verläuft die Reaktion gewissermaßen cyclisch,Excess of the sample liquid is retained on the diagnostic agent and thereby prevents the atmospheric Oxygen can take part in the reaction and thus the reaction proceeds to a certain extent cyclically,

d.h. es wird angenommen, daß - wenn kein Sauerstoff an der Testreaktion teilnehmen kann, da sich eine Flüssigkeitsschicht über dem Diagnostiziermittel befindet - ein Teil des freien Jods als Oxidationsmittel für die reduzierte Glukoseoxidase wirkt, die bei der Reaktion entsteht. So ist das Jodid nicht nur als Indikatorsubstanz wirksam, sondern nimmt an der Glukoseoxidase- ψ -r- Glukosereaktion, teilethat is, it is believed that if oxygen cannot participate in the test reaction because there is a layer of liquid over the diagnostic agent, some of the free iodine acts as an oxidant for the reduced glucose oxidase produced in the reaction. The iodide is not only effective as an indicator substance, but also takes part in the glucose oxidase- ψ -r- glucose reaction

Bs hat sich nun gezeigt, daß - wenn ein Mittel; vorgesehen ist - um das Festhalten überschüssiger Flüssigkeitsprobe aus dem Diagnostiziermittel zu vermeiden, das Jodid als Indikatorsubstanz wirkt und nicht an der Glukoseoxidase-Glukosereaktion teilnimmt und man dadurch ausgezeichnete halbquantitative Ergebnisse erhält.It has now been shown that - if a means; intended is - in order to avoid the retention of excess fluid sample from the diagnostic agent, the iodide as an indicator substance acts and does not take part in the glucose oxidase-glucose reaction and thereby excellent semi-quantitative results receives.

wenn
Es hat sich so gezeigt, daß/man eine semipermeable Membranif
It has thus been shown that / one has a semipermeable membrane

auf die Oberfläche eines enzymatischen Glukosediagnostiziermittels aufbringt oder ein enzymatisches Testmittel zusammen mit einer fc semipermeablen Membran oder einer folienbildenden, polymeren Substanz verwendet, die Membran die Adhäsion überschüssiger Flüssigkeit verhindet und es dadurch ermöglicht, daß der atmosphärische Sauerstoff, an der Testreaktion teilnehmen kann<> Dadurch kann das Jodid in freies Jod übergehen und als Indikatorsubstanz wirken. -»*onto the surface of an enzymatic glucose diagnostic agent or an enzymatic test agent together with an fc semipermeable membrane or a film-forming, polymeric Substance used that prevents excess fluid from adhering to the membrane, thereby allowing the atmospheric Oxygen that can participate in the test reaction <> This allows the iodide to convert into free iodine and act as an indicator substance. - »*

Die für das erfindungsgemäße System geeigneten Jodsalze, sind solche, die in einem wässrigen System leicht dissoziieren und das charakteristische Jodidion bilden. Beispiele für Jod- ; salze, die als Indikatorsubstanzen geeignet sind, sind Kaliumiodid, Natriumiodid und Ammoniumjodid. Ausser daß die Salze 4-onisierbar sein sollen, darf der kat&ionische Teil des Moleküls'*The iodine salts suitable for the system according to the invention are those which readily dissociate in an aqueous system and form the characteristic iodide ion. Examples of iodine ; salts that are suitable as indicator substances are potassium iodide, Sodium iodide and ammonium iodide. Except that the salts Should be 4-onisable, the cat & ionic part of the molecule '*

1 0 9 8 1 8 / 1 3 8 A1 0 9 8 1 8/1 3 8 A

2050Α8Ί2050Α8Ί

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die enzymatische Katalyse der Glukoseoxidation nicht stören. Von den geeigneten Jodiden ist aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten und der Leichtigkeit mit der es erhältlich ist, Kaliumiodid für die vorliegende Erfindung bevorzugt. do not interfere with the enzymatic catalysis of glucose oxidation. Of the useful iodides, potassium iodide is preferred for the present invention for reasons of economy and ease with which it is available.

Die Prinzipien der dem enzymatischen Glukosetest zugrundeliegenden Reaktion sind bekannt. Glukoseoxidase katalysiert die aerobe Oxidation von Glukose, wobei Glukonsäure und Wasserstoffperoxid entstehen. Bei dieser Reaktion vereinigt sich der von der Glukose abgespaltene Wasserstoff mit atmosphärischem Sauerstoff, wobei Wasserstoffperoxid entsteht. Die Reaktion kann durch die folgende schematische Gleichung dargestellt werdeniThe principles underlying the enzymatic glucose test Reactions are known. Glucose oxidase catalyzes the aerobic oxidation of glucose, producing gluconic acid and hydrogen peroxide develop. During this reaction, the hydrogen split off from the glucose combines with the atmospheric Oxygen, producing hydrogen peroxide. The reaction can be represented by the following schematic equation will i

Glukoseoxidase
Glukose + O₂ ^ Glukonsäure + HpO₂ Glucose oxidase
Glucose + O ₂ ^ gluconic acid + HpO ₂

AuBser dem Enzym Glukoseoxidase muß das oben angegebene System ausserdem eine Substanz mit Peroxidaseaktivität enthalten. Von den Substanzen mit derartiger Aktivität ist Me errettich-Peroxidase oder Kartoffel-Peroxidase bevorzugt. Ausser diesen natürlich vorkommenden Peroxidasesubstanzen können andere organische Substanzen mit ähnlicher Aktivität ebenfalls verwendet werden. Beispiele für derartige andere Substanzen sind normales vollständiges Blut, rote Blutkörperchen allein,, lyophilisiertes Gesamtblut, Urohämin, Metallporphyrine und ähnliche Verbindungen.In addition to the enzyme glucose oxidase, the above must be mentioned System also contain a substance with peroxidase activity. Among the substances with such activity is horseradish peroxidase or potato peroxidase preferred. Besides these naturally occurring peroxidase substances you can other organic substances with similar activity can also be used. Examples of such other substances are normal whole blood, red blood cells alone, lyophilized whole blood, urohemine, metal porphyrins, and similar connections.

Um ein Diagnostiziermittel mit der gewünschten Stabilität, Reaktionsfähigkeit und Empfindlichkeit herzustellen, sollten die oben angegebenen Bestandteile, wenn sie mit der zu untersuchenden Flüssigkeit zusammenkommen, auf eine Wasserstoffionenkonzentration von ungefähr pH 3»^ bis 7»2 gepuffert sein, wobei ein Bereich von pH 5>0 bis 6,0 bevorzugt ist» Es hat sich gezeigt, daß von den vielen Puffern, die verwendet werden können, um den pH-Wert der Bestandteile in dem gewünschten Bereich zu halten,In order to produce a diagnostic agent with the desired stability, responsiveness, and sensitivity, the components specified above, when they come together with the liquid to be examined, to a hydrogen ion concentration buffered from about pH 3 »^ to 7» 2, with a Range of pH 5> 0 to 6.0 is preferred »Of the many buffers that can be used to make the to keep the pH value of the components in the desired range,

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ein Citronensäure-Natriumcitrat-Puffer die gewünschten Ergebnisse erreicht und dabei die enzymatischen Reaktionen in dem Diagnostiziermittel besonders wenig störtt Es können jedoch auch andere System verwendet werden, um gleiche pH-Bedingungen zu erhalten, wie Phosphat? Tartrat-und GIutamat-Puffer-Systeme.a citric acid-sodium citrate buffer will produce the desired results achieved and thereby the enzymatic reactions in the diagnostic agent very little disturbance However, other systems can also be used to maintain the same pH conditions, like phosphate? Tartrate and glutamate buffer systems.

Neben der Verwendung eines Jodidsals Chromogen, in dem erfindungsgemäßen Testsystem, ist es vorzuziehen, daß eine 2. Indikatorsubstanz in dem Testmittel enthalten ist. Hierbei hat. ^ es sieht gezeigt, daß der Zusatz eines blauen Farbstoffs zu ^ dem Testmittel dazu führt, daß das Diagnostiziermittel auf das Vorhandensein verschiedener Konzentrationen von Glukose deutlicher anspricht, wobei bei einer zunahmenden Glukosekonzentration Farbtöne von Blau über verschiedene Grüntöne bis Braun auftreten. Es hat sich als günstig erwiesen, als derartigen blauen Farbstoff ein Chromogen zu verwenden, daß von Blau nach Farblos geht, wenn es durch Wasserstoffperoxid, das bei der Testreaktion entsteht, oxidiert wird. In dieser Beziehung sind Farbstoffe, wie Indigokarmin und Brilliantblau FCF, als Chromogene ideal geeignet. Andere Farbstoffsubstanzen, die erfindungsgemäßfebenfalls verwendet werden können, sind Anilinblau,*Cyanolblau, Patentblau, Xylolblau V und Comassie-BrilliantblauoIn addition to the use of an iodide as a chromogen in which test system according to the invention, it is preferable that a 2. Indicator substance is contained in the test agent. Here has. ^ It is shown that the addition of a blue dye is too ^ the test agent leads to the diagnostic agent for the presence of different concentrations of glucose more clearly responds, with an increasing glucose concentration appearing in shades of blue through various shades of green to brown. It has proven advantageous to use a chromogen as such a blue dye that goes from blue to colorless, if it is oxidized by hydrogen peroxide produced during the test reaction. In this regard, dyes such as indigo carmine and brilliant blue FCF are ideally suited as chromogens. Other coloring substances also used in the present invention are aniline blue, * cyanol blue, patent blue, Xylene blue V and Comassie brilliant blue

Ausser den oben angegebenen Bestandteilen des Testmittels, die aktiv an der Testreaktion teilnehmen, können andere Zusätze ebenfalls verwendet werden. Solche Zusätze sind unter anderem Dickungsmittel, die auch als Enzym-Stabilisatoren wirken. In dieser Beziehung hat es sich gezeigt, daß ein Diagnostiziermittel, das Substanzen, wie Polyvinylpyrrolidon, Natriumalginat, Gelatine, Rinderserumalbumin, Polyvinylalkohol und ein Interpolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid, wie es in der USA-Patentschrift 3 ^53 I80 beschrieben und im Handel unter dem Namen Gantrez AN bekannt ist, enthält, bevorzugt ist. Es hat sich gezeigt, daß Diagnostiziermittel, die die oben angegebenenIn addition to the above-mentioned components of the test agent which actively participate in the test reaction, other additives can also be used. Such additives include thickeners, which also act as enzyme stabilizers. In this regard, it has been found that a diagnostic agent containing substances such as polyvinylpyrrolidone, sodium alginate, gelatin, bovine serum albumin, polyvinyl alcohol and an interpolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride, as described in U.S. Patent 3 ^ 53180 and commercially available under the Name Gantrez AN is known, contains, is preferred. It has been found that diagnostic agents which contain the above

• - 7 -• - 7 -

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aktiven Bestandteile und ausserdem Gantrez und PVP enthalten» ungewöhnlich stabil sind,, Es hat sich gezeigt, daß die Verwendung von Polyvinyl-pyrrolidon zur Bildung eines Farbkomplexes mit dem freien Jodid führt, wodurch die Wirksamkeit des Indikatorsystems verbessert wird. Daher ist die Verwendung von PVP für die erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel bevorzugt0active ingredients and also contain Gantrez and PVP » are unusually stable, it has been shown that the use of polyvinyl pyrrolidone to form a color complex with the free iodide leads, thereby increasing the effectiveness of the indicator system is improved. The use of PVP is therefore preferred for the diagnostic agents according to the invention0

Wie oben angegeben, hat es sich bei Verwendung eines Jodidsalzes als Indikatorsubstanz bei einem enzymatisehen Glukosetestsystem als notwenig erwiesen, dafür zu sorgen, daß das Anhaften von überschüssiger Flüssigkeitsprobe an dem Diagnostiziermittel weitgehend oder vollständig vermieden wird. In diesem Zusammenhang hat es sich gezeigt, daß eine semipermeable Membran, wie Äthylcellulose, ein derartiges Festhalten von Wasser verhindert. Andere Celluloseverbindungen und folienbildenden Substanzen, die die gleiche Wirkung erzielen,können,ebenfalls verwendet werden,, Derartige Substanzen sind die Celluloseäther und -ester sowie verschiedene andere hydrophobe, folienbildende polymere Substanzen. Äthylcellulose hat sich für die erfindungsgemäßen Zwecke als besonder vorteilhaft erwiesen·As stated above, it has been found using an iodide salt as an indicator substance in an enzymatic glucose test system proven necessary to prevent excess fluid sample from adhering to the diagnostic agent is largely or completely avoided. In this context, it has been shown that a semipermeable membrane such as Ethyl cellulose, prevents such retention of water. Other cellulose compounds and film-forming substances, which achieve the same effect can also be used “Such substances are the cellulose ethers and esters as well as various other hydrophobic film-forming polymeric substances. Ethyl cellulose has been used for the invention Purposes proven to be particularly beneficial

Was die genauen Mengenverhältnisse der aktiven Bestandteile betrifft, hat es sich gezeigt, daß ein veiter Konzentrationsbereich verwendet werden kann. Als allgemeine Richtlinie können die folgenden Konzentrationsbereiche dienen. Diese Werte sind auf die Lösung bezogen, in der die Bestandteile des Testsystems auf den Träger aufgebracht werden.As for the exact proportions of the active ingredients is concerned, it has been found that a wide range of concentrations can be used. As a general guideline, you can the following concentration ranges are used. These values are related to the solution in which the components of the test system be applied to the carrier.

Bestandteile Menge pro 100 ml LösungIngredients Amount per 100 ml of solution

Glukoseoxidase 16OOO-33000 EinheitenGlucose oxidase 16,000-33,000 units

Peroxidative Substanz 40-60 mg>Peroxidative substance 40-60 mg>

Jodid 1 - 2 gIodide 1 - 2 g

- 8- 8th

1 0 9 8.1 8 / 1 3 81 0 9 8.1 8/1 3 8

IA- - 8 -IA- - 8 -

Bestandteile ■ Menge pro 100 ml LösungIngredients ■ Amount per 100 ml of solution

Zweites Chromogen (blauer Farbstoff) 1 - 20 mg Folienbildendes Polymer 0,5- 1 g 'Second chromogen (blue dye) 1 - 20 mg film-forming polymer 0.5-1 g '

Bezogen auf eine Probe von 3000 Worthington-Einheiten (WE/mcg Gelöst in einem organischen Lösungsmittel wie Benzol.Based on a sample of 3000 Worthington units (WE / mcg Dissolved in an organic solvent such as benzene.

Wie zu Anfang bemerkt, soll das Testmittel vorzugsweise auf oder in einem Träger enthalten sein*, wobei man die Kombinä-As noted at the beginning, the test agent should preferably be contained on or in a carrier *, with the combination

^ tion von Testmittel und Träger so verwenden kann, daß man sie nur in die zu. untersuchende Flüssigkeit eintaucht und das Ergebnis abliest. Das kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, z.B. dadurch, daß man ein saugfähiges Material mit einer Lösung des Testmittels imprägniert und anschließend das imprä^ tion of test agent and carrier can be used in such a way that they can be used only in the too. examining liquid is immersed and the result read. This can be accomplished by a number of methods, for example by placing an absorbent material with a Solution of the test agent impregnated and then the impregnated

nierte Diagnostiziermittel trocknet, wodurch ein fein verteiltes, trockenes, inniges Gemisch der Bestandteile durch Adhäsionswirkung fest auf der Oberfläche des Trägers haftet. Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Diagnostiziermittels besteht darin, daß man einen saugfähigen Träger mit einer Lösung oder mit Lösungen des Testmittels imprägniert und anschließend trocknet. Wenn ein saugfähiger Träger verwendet wird, kann erned diagnostic agent dries, creating a finely divided, dry, intimate mixture of ingredients through Adhesive effect firmly adheres to the surface of the support. The preferred method of making the diagnostic agent consists in that an absorbent carrier is impregnated with a solution or with solutions of the test agent and then dries. If an absorbent carrier is used, it can

fc aus verschiedenen Materialien bestehen, z.B. aus Filterpapier, Holzstreifen, synthetischen, faserigen Plastikmaterialien, gewebten oder nicht gewebten Stoffen usw.. Das bevorzugte saugfähige Material ist Filterpapier mit einer Dicke von ungefähr 0,25 bis 0,5 mm. Naclvdem der Träger mit dem Grundtestmittel imprägniert und getrocknet ist, kann die semipermeable Membran _BÄ dadurch aufgebracht werden, daß man das Diagnostiziermittel in eine Lösung aus dem polymeren Folienbildner in einem organischen. Lösungmittel eintaucht und ein zweitesmal trocknet. Ein anderes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel besteht darin, daß man das Testraittel einfach mit ".einer folienbildenden polymeren Substanz vermischt und ein derartiges Gemisch anleinen Träger oder einen Handgriff fixiert.fc consist of various materials such as filter paper, strips of wood, synthetic, fibrous plastic materials, woven or non-woven fabrics, etc. The preferred absorbent material is filter paper approximately 0.25-0.5 mm thick. After the carrier has been impregnated with the basic test agent and dried, the semipermeable membrane _{BA can} be applied by converting the diagnostic agent into a solution of the polymeric film former in an organic. Dips solvent and dries a second time. Another method for producing the diagnostic agents according to the invention consists in simply mixing the test agent with a film-forming polymeric substance and fixing such a mixture on a leashed carrier or a handle.

■ , ■ ' ■ _ ο „■, ■ '■ _ ο "

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Im folgenden wird die Anwendung eines erfindungsgemäßen Diagnostiziermittels beschrieben. Bei der Durchführung des Glukosetests wird das Diagnostiziermittel in die zu untersuchende Flüssigkeit eingetaucht, die normalerweise eine Urinprobe ist und sofort wieder daraus entfernt. Das wird deshalb getan, weil der pH-Wert des nassen Diagnostiziermittels normalerweise von dem in dem Testmittel enthaltenen Puffer bestimmt werden muß. Wenn das Diagnostiziermittel längere Zeit in der Flüssigkeit bleibt, bestünde die Gefahr, daß die Bestandteile des Diagnostiziermittels aus dem Träger in die Flüssigkeit ausgelaugt würden. Ein derartiges Auslaugen wird jedoch im wesentlichen durch Anwendung der oben beschriebenen semipermeablen Membran vermieden. Die durch das Vorhandensein von Glukose in der Testflüssigkeit entwickelte Farbe wird dann dilrch visuellen Vergleich mit einer vorher hergestellten Farbkarte bestimmt. Verschieden instrumenteile Verfahren können auch angewandt werden, um die entwickelte Farbqualität zu bestimmen. Dadurch wird die Genauigkeit des Tests erhöht, da die subjektive Farbbestimmung durch das menschliche Auge vermieden wird. Wie ebenfalls oben angegeben, wird durch den ausgezeichneten Farbgradienten,der· sich aufgrund der beiden chromogenen Substanzen in dem Testmittel ergibt, ein darartiger subjektiver menschlicher Fehler weitgehend ausgeschaltet.The use of a diagnostic agent according to the invention is described below. When performing the glucose test, the diagnostic agent is immersed in the liquid to be tested, which is usually a urine sample, and immediately removed therefrom. This is done because the pH of the wet diagnostic agent must normally be determined from the buffer contained in the test agent. If the diagnostic agent remains in the liquid for an extended period of time, there is a risk that the constituents of the diagnostic agent would be leached from the carrier into the liquid. However, such leaching is essentially avoided by using the semipermeable membrane described above. The color developed by the presence of glucose in the test liquid is then determined by visual comparison with a previously prepared color card. Various instrumental methods can also be used to determine the color quality developed. This increases the accuracy of the test, since the subjective color determination by the human eye is avoided. As also indicated above, the excellent color gradient that results from the two chromogenic substances in the test agent largely eliminates any such subjective human error.

Eine spezielle Zusammensetzung eines erfindungsgemäßen Diagnostiziermittels wird in dem folgenden Beispiel beschrieben.A specific composition of a diagnostic agent according to the invention is described in the following example.

example

Die folgenden Komponenten wurden zur Herstellung von 100 ml eines Gemisches nach und nach miteinander vermischt.The following components were used to make 100 ml of a mixture gradually mixed together.

-ΙΟΙ 09 8 1 8/1384-ΙΟΙ 09 8 1 8/1384

2050A8 12050A8 1

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- 10 -- 10 -

Ingredients quantity

1 ο Kaliumiodid 1 g1 ο potassium iodide 1 g

2. Brilliantblau FCF (FD und C Blau Nr.l) 10,^ mg2. Brilliant Blue FCF (FD and C Blue No. 1) 10, ^ mg

3» Destilliertes Wasser3 »Distilled water

k. Citronensäure, wasserfrei k. Citric acid, anhydrous

5. Natriumeitrat . 2H_o05. Sodium citrate. 2H _o 0

6. Gantrez AN 139 (10 ?Sige wässrige6. Gantrez AN 139 (10? Sige aqueous

Lösung)Solution)

" 7· Polyvinylpyrrolidon (10 folge wässrige k Lösung)"7 · polyvinylpyrrolidone (10 sequence aqueous k solution)

8. Peroxidase8. Peroxidase

;„ Glukoseoxidase; "Glucose oxidase

# 3000 Worthingtpn-Einheiten/mcg. ** 1000 Einheiten/ml.# 3000 wordingtpn units / mcg. ** 1000 units / ml.

53 ι53 ι 3 g3 g alal mlml 0,595 g0.595 g 5,2:5.2: mg Xmg X 1010 ml **ml ** 5 τ5 τ 5Q5Q 3333

Man imprägnierte Filterpapier (Whatman 3 MM) mit der oben angegebenen Lösung, ließ es abtropfen . und trocknete 7 min in einem Trockentunnel bie 85⁰C. Nachdem man es aus dem Trockentunnel entnommen hatte, tauchte man das imprägnierte ™ Papier in eine Lösung aus 0,85 g Äthylcellulose in 100 ml Benzol. Anschließend trocknete man das Papier wieder, schnitt es in kleine Quadrate von ungefähr 5 x 5 nun und befestigte diese Quadrate am Ende eines flüssigkeitsundurchlässigen Streifens aus Plastikfolie von 5 mm χ 6 cm.Filter paper (Whatman 3 MM) was impregnated with the above solution and allowed to drain. and dried for 7 minutes in a drying tunnel bie 85 ⁰ C. After they had taken it from the drying tunnel, immersing the impregnated ™ paper in a solution of 0.85 g of ethyl cellulose in 100 ml of benzene. The paper was then dried again, cut into small squares of approximately 5 × 5 and these squares attached to the end of a liquid-impermeable strip of plastic film of 5 mm × 6 cm.

Die wie oben hergestellten Diagnostiziermittel wurden mit verschiedenen Urinproben, die Glukosemengen von 0 bis 2 Gew.-fo enthielten, in Berührung gebracht. Man erhielt die folgenden ErgebnisseiThe diagnostic agents prepared as above were brought into contact with various urine samples containing glucose levels from 0 to 2 weight percent. The following results were obtained:

- 11 -- 11 -

1 0981 8/ 13 81 0981 8/13 8

lA-38 692 - 11 -LA-38 692 - 11 -

Farbentwicklung in 1 minColor development in 1 min

blau hellgrün grün braungrün dunkelbraungrün dunkelbraunblue light green green brown green dark brown green dark brown

aus den oben angegebenen Ergebnissen hervorgeht, wurden mit einem erfindungsgemäß hergestellten Diagnostiziermittel ausgezeichnete quantitative Ergebnisse für den Glukosegehalt erhalten. Mit einem im Handel erhältlichen Produkt bei dem o-Tolidin anstelle von Jodidsalz als Indikator verwendet Wurde, war es möglich, die oben angegebenen Glukosekonzentrationen bis zu einem Wert von nicht mehr als 0,5 &-?<> Glukose ungefähr quantitativ abzuschätzen.As can be seen from the above results, excellent quantitative results for the glucose content were obtained with a diagnostic agent prepared according to the invention. With a commercially available product in which o-tolidine instead of iodide salt as an indicator used was, it was possible no longer the glucose concentrations above up to a value of 0,5 & - <> glucose estimate approximately quantitatively.

GlukosekonzentrationGlucose concentration 1010 2525th 00 5050 O,O, 0,0, 0,0, 11 22

Claims

1 0 9 B 1 8 / 1 3 81 0 9 B 1 8/1 3 8

Claims

1.' Diagnostic agent for semi-quantitative determination of glucose in aqueous liquids consisting of a carrier of glucose oxidase, a substance with peroxidase * Contains activity and an indicator, characterized in that the indicator is a water-soluble iodide and the diagnostic agent additionally contains a hydrophobic, film-forming, semipermeable, polymeric material.

2. Diagnostic agent according to claim 1, characterized in that it additionally contains a blue dye.

3. Diagnostic agent according to claim 2, characterized in that that the dye brilliant blue FCF, indigo carmine, aniline blue, cyanoI blue, patent blue, xylene blue V and / or Comassie blue is. .

4 ·. Diagnostic means according to claim 1 to 3t thereby gekennzei c h η e t that there is also a buffer containing the system to a * pH of about 3, ^ to 7.2 holds.

5. diagnostic agent according to claim 1 to 4, characterized in that the film-forming polymeric substance is a cellulose ester or a cellulose ether.

6o Diagnostiziermittel according to claim 5, characterized ge ke η η is characterized in that the folienb |. Ldende, substance Athylcellulose

is.

- 13 -

1 098 1 8/1 3 8

LA-38 692 -13-

7, diagnostic agent according to claim 1 to 6, characterized in that the water-soluble iodide salt Potassium iodide, sodium iodide and / or ammonium iodide.

8, diagnostic means according to claim 7 »characterized in that it identifies that the iodide is potassium iodide

9, diagnostic means according to claim 1 to 8, characterized characterized in that the substance with peroxidative activity is peroxidase.

ΙΟ »Diagnostic agent according to claim 1 to 9i thereby

marked that the carrier is absorbent Paper is.

11. Diagnostic agent according to claim 1 to 10, characterized ζ eichne t that absorbent paper with the dry residue of an aqueous solution of the following composition

Glucose oxidase 160,000-33,000 units

peroxidative substance 4-0 - 60 mg

water-soluble iodide 1 - 2 g

based on 100 ml and then coated with a solution of 0.5 to 1 g of ethyl cellulose in 100 ml of benzyl.

12. Diagnostic agent according to claim 11, characterized in that the solution is additionally 1 to 20 mg of a blue dye.

13 · Diagnostic means according to claim 12, characterized in

characterized that the blue dye Brilliantüau FCF is. .

109818 / 138A

Ik, a method for producing a diagnostic agent according to claim 1 Ms 13 »characterized in that a solution of glucose oxidase, a substance with peroxidative activity, a water-soluble iodide salt and a film-forming polymeric material is produced, this solution is applied in or on a carrier and then the solution and dry the carrier

, 15 · A method for producing a diagnostic ^{agent w} according to claims 1 to 13 »characterized in,

that you have a solution of glucose oxidase, a substance with. , _Ί η ₊ peroxidative activity and a water-soluble iodide salt /, this solution in or _{0 is} applied to a carrier, the solution and the carrier are dried and then the carrier is coated with an oleiferous semipermeable material.

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