DE202012007249U1

DE202012007249U1 - Analysator zum Analysieren von Ionen mit einem hohen Masse-Ladungs-Verhältnis

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Publication number: DE202012007249U1
Application number: DE202012007249U
Authority: DE
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2012-10-30
Anticipated expiration: 2022-07-28

Abstract

Massenanalysator, der Folgendes umfasst: einen elektrostatischen Massenanalysator, um Ionen darin aufzunehmen, wobei der elektrostatische Massenanalysator Folgendes umfasst: ein Detektionssystem zum Detektieren der Ionen in dem elektrostatischen Massenanalysator; ein Signalverarbeitungssystem zum Bestimmen des Masse-Ladungs-Verhältnisses wenigstens einiger detektierter Ionen; und ein Steuersystem, das konfiguriert ist, die Einleitung der Ionen in den elektrostatischen Massenanalysator so zu steuern, dass die Absolutgeschwindigkeit in dem elektrostatischen Massenanalysator wenigstens einiger der Ionen, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, nicht größer als 8.000 m/s ist, und das konfiguriert ist, die durchschnittliche Weglänge während der Dauer der Detektion derartiger Ionen zu steuern, wodurch sie länger ist, als zum Detektieren derartiger Ionen mit einer Auflösungsleistung von 1.000 des Masse-Ladungs-Verhältnisses erforderlich ist.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Massenspektrometrie. Die Aspekte der Erfindung beziehen sich auf ein Verfahren und einen Analysator für die Massenanalyse von Ionen in einem elektrostatischen Massenanalysator, vorzugsweise für Ionen mit einem hohen Masse-Ladungs-Verhältnis. Beispiele derartiger Ionen enthalten Proteine und Proteinkomplexe und andere makromolekulare Arten. Die Erfindung ist insbesondere, aber nicht ausschließlich für die Massenanalyse vollständiger Proteine und Proteinanordnungen und Komplexe in einem sogenannten natürlichen Zustand nützlich, d. h. unter beinahe physiologischen Bedingungen.
Hintergrund der Erfindung
Massenspektrometer werden verbreitet verwendet, um Ionen auf der Grundlage ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses (m/z) zu analysieren. Die Massenspektrometrie ist eine vorrangige Technik für die Analyse von Proteinen geworden. Die Entwicklung der Elektrosprayionisation, die an die Massenspektrometrie koppelt ist, hat die Analyse großer vollständiger Proteine und Proteinkomplexe ermöglicht, selbst wenn die Letzteren durch schwache nicht kovalente Wechselwirkungen zusammengehalten sind. Folglich ist ein neues Gebiet entstanden, das als die Massenspektrometrie natürlicher Proteine bezeichnet wird, das sich auf die Analyse derartiger Arten unter beinahe physiologischen Bedingungen (d. h. bei einem etwa neutralen pH) konzentriert. Die Anwendungen dieses Zugangs reichen von der ausführlichen Untersuchung der Gleichgewichte zwischen verschiedenen quaternären Strukturen, wie sie durch Umweltänderungen oder das Binden von Substraten oder Kofaktoren beeinflusst werden, bis zur Analyse vollständiger Nanomechanismen, wie z. B. ganzer Viruspartikel, Proteasome und Ribosome, [A. Heck, Native mass spectrometry: a bridge between interatomics and structural biology, Nature Methods, 5 (2008), 927–933].
Typischerweise besitzen unter derartigen Bedingungen erzeugte Ionen einen niedrigeren Ladungszustand und folglich ein hohes m/z (das normalerweise ein m/z von 5.000–10.000 übersteigt). Dies bringt sie außerhalb des typischen Massenbereichs der meisten Massenspektrometer und ist folglich eine typische Anwendung für Flugzeit-Massenanalysatoren (TOF-Massenanalysatoren) aufgrund deren Fähigkeit, auf sehr hohe m/z zuzugreifen, geworden, die häufig mit dedizierten Quadrupol-Massenfiltern gekoppelt sind (die bei sehr niedrigen Frequenzen arbeiten, um den Massenbereich auszudehnen). Aufgrund der Probleme bei der Ionendetektion, da die Sekundärelektronenvervielfachung bei derartigen m/z für typische Ionenenergien ineffektiv wird, musste eine zusätzliche Nachbeschleunigung eingeführt werden. Die Verwendung der TOF-Massenanalysatoren besitzt jedoch Nachteile, weil der niedrige Arbeitszyklus und die Übertragung der typischerweise verwendeten Flugzeitinstrumente mit orthogonaler Beschleunigung die Empfindlichkeit der Detektion begrenzen, während der begrenzte Flugweg und die Nachbeschleunigung die Auflösungsleistung auf weniger als eintausend begrenzen. Um die Analyseleistung für große Ionen zu verbessern, ist vorgeschlagen worden, die Ionenkühlung bei erhöhten Drücken nach der Atmosphäre-Vakuum-Grenzfläche in den Q-TOF-Instrumenten zu verwenden, wie in I. V. Chernushevich, B. A. Thomson, "Collisional Cooling of Large Ions in Electrospray Mass Spectrometry", Anal. Chem., 2004, 76, 1754–1760, beschrieben ist.
Im Hinblick auf den obigen Hintergrund ist die vorliegende Erfindung gemacht worden.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Massenanalyse mehrfach geladener Ionen bereitgestellt, das Folgendes umfasst: Einleiten mehrfach geladener Ionen in einen elektrostatischen Massenanalysator, in dem die Ionen mehreren Änderungen der Bewegungsrichtung unterzogen werden; Detektieren der Ionen in dem Analysator; und Bestimmen des Masse-Ladungs-Verhältnisses wenigstens einiger der detektierten Ionen; wobei die Absolutgeschwindigkeit in dem Analysator wenigstens einiger der Ionen, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, nicht größer als 8.000 m/s ist und die durchschnittliche Weglänge während der Dauer der Detektion derartiger Ionen länger ist, als zum Detektieren derartiger Ionen mit einer Auflösungsleistung von 1.000 des Masse-Ladungs-Verhältnisses erforderlich ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein elektrostatischer Massenanalysator, um Ionen darin aufzunehmen, bereitgestellt, wobei der elektrostatische Massenanalysator Folgendes umfasst: ein Detektionssystem zum Detektieren der Ionen in dem elektrostatischen Massenanalysator, vorzugsweise durch Bildstromdetektion; ein Signalverarbeitungssystem zum Bestimmen des Masse-Ladungs-Verhältnisses wenigstens einiger detektierter Ionen; und ein Steuersystem, das konfiguriert ist, die Einleitung der Ionen in den elektrostatischen Massenanalysator so zu steuern, dass die Absolutgeschwindigkeit in dem elektrostatischen Massenanalysator wenigstens einiger der Ionen, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, nicht größer als 8.000 m/s ist, und das konfiguriert ist, die durchschnittliche Weglänge während der Dauer der Detektion derartiger Ionen so zu steuern, dass sie länger ist, als zum Detektieren derartiger Ionen mit einer Auflösungsleistung von 1.000 des Masse-Ladungs-Verhältnisses erforderlich ist.
In einem besonderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung gemacht worden, um die Empfindlichkeit und die Selektivität der Detektion schwerer Proteine in Massenanalysatoren zu vergrößern. Die Erfindung ist unter Verwendung elektrostatischer Massenanalysatoren, insbesondere elektrostatischer Fällen, gemacht worden.
Die Erfindung ermöglicht überraschend, dass große mehrfach geladene Ionen mit einem ausreichenden Rauschabstand detektiert werden, um es zu ermöglichen, dass ihr Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, einschließlich großer Ionen, die sich vorher über der Massenanalyse mit Analysatoren außer den TOF-Analysatoren befanden. Für derartige große Ionen ist die Einzelionendetektion erreichbar. Die Empfindlichkeit der Analyse kann verbessert werden, indem ein geeigneter elektrostatischer Massenanalysator mit Energien betrieben wird, die z. B. niedriger als ein Schwellenwert für die Ionenfragmentation sind. Die Empfindlichkeit der Analyse kann z. B. durch die Massen- oder Energiefilterung der schweren Ionen vor der Analyse in dem elektrostatischen Massenanalysator verbessert werden. Die Erfindung verwendet folglich einen Zugang, bei dem Ionen mit hohem m/z, wie z. B. Proteinkomplexe, unter Verwendung eines elektrostatischen Massenanalysators, wie z. B. einer elektrostatischen Falle (EST), analysiert werden, wobei entsprechende Instrumentenverbesserungen bereitgestellt werden. Die Massenspektrometrie großer vollständiger Proteine, die in einer elektrostatischen Falle analysiert werden, kann dadurch ausgeführt werden.
Derartige Ionen können nicht kovalente Komplexe von Proteinen, z. B. sogar in einem sogenannten natürlichen Zustand, enthalten. Derartige Ionen besitzen typischerweise eine niedrigere Ladung als die aus herkömmlichen Quellen hergestellten Proteine und folglich sogar ein höheres m/z. Falls die Geschwindigkeit derartiger Ionen niedrig genug ist, ist insbesondere ihre Stabilität in elektrostatischen Massenanalysatoren, insbesondere elektrostatischen Fallen, wie z. B. in einem Orbitrap^TM-Massenanalysator, überraschend gut. Außerdem können große Weglängen der Ionenbewegung innerhalb des Massenanalysators während der Detektion verwendet werden, um eine hohe Auflösungsleistung bereitzustellen. Auf diese Art kann die Bestimmung ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses mit einer höheren Auflösungsleistung als der, die die TOF oder andere Techniken für Ionen mit derartig hohem m/z erreicht haben, mit guter Empfindlichkeit erreicht werden. Bevorzugte Merkmale der Erfindung enthalten die Filterung der in den Massenanalysator eingeleiteten Ionenpopulation, wodurch ausreichend intensive Signale von den interessierenden Ionen erhalten werden können und große Längen der Flugwege erreicht werden können, um die gewünschte Auflösungsleistung zu erreichen, wie z. B. eine Auflösungsleistung, die typischerweise 1000 oder mehr beträgt.
Die durchschnittliche Weglänge, auf die hier Bezug genommen wird, ist die durchschnittliche Entfernung, die von einem Ensemble von Ionen während der Dauer, während der sie detektiert werden, zurückgelegt wird, d. h., einige detektierte Ionen legen eine kürzere Entfernung vor dem Verlust durch Stoß, Streuung usw. zurück, während andere eine längere Entfernung zurücklegen. Es ist festgestellt worden, dass bewirkt werden kann, dass derartige große Ionen mit einer niedrigen Absolutgeschwindigkeit Entfernungen in dem Massenanalysator zurücklegen, die ausreichend lang sind, um sie mit einer Auflösungsleistung von 1000 oder mehr zu detektieren. Die durchschnittliche Weglänge während der Dauer der Detektion derartiger großer Ionen ist länger als die, die erforderlich ist, um derartige Ionen mit einer Auflösungsleistung von 1.000, bevorzugt von 2.000 und bevorzugter von 5.000, des Masse-Ladungs-Verhältnisses zu detektieren. Folglich sind Auflösungsleistungen über den obenerwähnten Werten erreichbar, z. B. 5.000 bis 10.000 oder größer. In Massenanalysatoren, die die Bildstromdetektion verwenden, wird das aus der Bewegung der Ionen in dem Analysator detektierte Übergangsignal vorzugsweise während einer Dauer von wenigstens 50 ms (Millisekunden), bevorzugter 50 bis 500 ms oder länger, aufgezeichnet. Bei niedrigen Ionengeschwindigkeiten und einer geeigneten Ionenfilterung ist z. B. die Aufzeichnung langer Detektionsübergänge von Ionen mit hohem m/z, wie hier beschrieben ist, erreichbar, wobei dies zu einer hohen Auflösungsleistung führt.
Die Ionen legen derart lange Entfernungen in dem elektrostatischen Massenanalysator aufgrund eines Weges zurück, der mehrere Änderungen der Bewegungsrichtung umfasst, wobei dadurch derartige Entfernungen in einem Massenanalysator mit moderaten oder kleinen Abmessungen erreicht werden. Die durch die Ionen zurückgelegte durchschnittliche Weglänge kann 500 m übersteigen (z. B. 500–1000 m) oder kann 1000 m übersteigen. Die mehrfachen Änderungen der Bewegungsrichtung können auf die Reflektion der Ionen an zwei oder mehr Ionenspiegeln zurückzuführen sein. In den Fällen von zwei Ionenspiegeln können die Ionen mehreren Änderungen der Bewegungsrichtung unterzogen werden, da sie zwischen den zwei Ionenspiegeln wiederholt reflektiert werden. Dies ist in einem Orbitrap-Massenanalysator der Fall, in dem die Ionen mehreren Änderungen der Bewegungsrichtung unterzogen werden, da sie zwischen zwei Ionenspiegeln (jeder Spiegel umfasst eine getrennte Hälfte einer äußeren Elektrode) wiederholt reflektiert werden, während sie kontinuierlich um eine Mittelelektrode kreisen.
Optional werden die Ionen mit derartigen niedrigen Geschwindigkeiten unter derartigen Bedingungen erzeugt, dass sie einen niedrigeren Ladungszustand besitzen und folglich ein höheres m/z besitzen als es normalerweise der Fall ist, z. B. in der Proteomik. Gemäß der vorliegenden Erfindung besitzen wenigstens einige der Ionen mit derartigen niedrigen Geschwindigkeiten, deren m/z bestimmt wird, ein m/z, das normalerweise ein m/z von 5.000 übersteigt, das optional ein m/z von 10.000 übersteigt und das ferner optional ein m/z von 15.000 übersteigt. Die Ionen mit einem m/z von bis zu 20.000 und bevorzugter einem m/z von bis zu 30.000 können in dem Massenanalysator mit diesen Absolutgeschwindigkeiten bereitgestellt werden, wobei dadurch ihr m/z durch die Erfindung bestimmt werden kann. Durch die Erfindung wird jedoch keine absolute Obergrenze für das m/z unterstellt.
Ausführlicher umfasst das Verfahren vorzugsweise die folgenden Schritte: Erzeugen der Ionen in einer Ionenquelle und Einleiten der Ionen in den Massenanalysator. Ein ionenoptisches System ist typischerweise erforderlich, das die Übertragung vollständiger großer Ionen von der Ionenquelle, wo derartige Ionen erzeugt werden, zu dem Massenanalysator ermöglichen kann. Ein derartiges optisches System umfasst vorzugsweise einen Multipol, der zwischen der Ionenquelle und dem Massenanalysator positioniert ist. Ein derartiger Multipol kann in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen für die Energiefilterung der Ionen verwendet werden. Ein geeignetes System umfasst vorzugsweise einen HF-Multipol. Der HF-Multipol oder ein anderes optisches System ist vorzugsweise konfiguriert oder wird vorzugsweise betrieben, um Ionen bis zu einem m/z von 10.000, bevorzugter bis zu einem m/z von 20.000 und sogar bis zu einem m/z von 30.000 zu übertragen. Typischerweise kann dies das Anlegen einer maximalen verfügbaren HF-Spannung an den (die) Multipol(e) umfassen, um die Ionen mit dem höchsten verfügbaren m/z unter den zu analysierenden Ionen zu übertragen. Derartige hohe oder maximale Spannungen sollten außerdem an alle anderen ionenoptischen HF-Vorrichtungen, wie z. B. HF-Multipole, z. B. alle anderen HF-Ionenfallen oder HF-Ionenführungen, angelegt werden. Der (die) Multipol(e), auf die hier Bezug genommen wird, kann (können) geeignet ein Quadrupol, ein Hexapol oder ein Oktupol usw. sein.
Das Verfahren umfasst vorzugsweise das Bereitstellen eines Masse Ladungs-Verhältnis-Filters und/oder eines Energiefilters stromaufwärts des elektrostatischen Massenanalysators. Demgemäß werden die Ionen vorzugsweise auf der Grundlage ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses und/oder ihrer Energie gefiltert, bevor sie in den elektrostatischen Massenanalysator eingeleitet werden. Die Filterung, insbesondere die Energiefilterung, wird vorzugsweise nach einer Stufe der unvollständigen Kühlung der Ionen ausgeführt, z. B. nach der unvollständigen Kühlung innerhalb eines Multipols. Die unvollständige Kühlung der Ionen ist in dieser Stufe annehmbar, falls stromabwärts des Filters eine weitere (vorzugsweise eine vollständige) Kühlung der Ionen vor der Massenanalyse ausgeführt wird, z. B. innerhalb eines oder mehrerer weiterer Multipole, die in der Form einer Ionenfalle oder eines Ionenspeichers oder in der Form einer Stoßzelle vorliegen können.
Folglich umfasst die Erfindung vorzugsweise die Filterung der Ionen durch ein Masse-Ladungs-Verhältnis-Filter und/oder ein Energiefilter stromaufwärts des elektrostatischen Massenanalysators. Die Filterung der Ionen erfolgt vorzugsweise durch eine Spannungsbarriere stromaufwärts des elektrostatischen Massenanalysators, die als ein Filter für niedrige Masse-Ladungs-Verhältnisse oder für niedrige Energien wirkt. Die Erfindung umfasst bevorzugter ferner eine oder mehrere Elektroden, um eine Barrierenspannung daran anzulegen, um als ein Filter für niedrige Masse-Ladungs-Verhältnisse oder für niedrige Energien zu wirken. Die Elektrode(n) könnte(n) eine Membran oder eine Linse oder einen elektrostatischen Sektor umfassen. Die Elektroden können die Stäbe eines Multipols, der als eine Ionenführung wirkt, insbesondere eines HF-Multipols umfassen. Der Multipol für diesen Zweck kann der oben beschriebene Multipol sein, d. h. zum Führen der Ionen von der Ionenquelle zum elektrostatischen Massenanalysator. Auf diese Art können z. B. Ionen mit niedrigeren Massen durch die Filterung vor dem elektrostatischen Massenanalysator entfernt werden. Diese Filterung ermöglicht es, dass mehr Ionen mit einer höheren Masse den elektrostatischen Massenanalysator füllen, bevor Raumladungseffekte relevant werden.
Vorzugsweise wird ein Masse- oder Energiefilter, wie z. B. eines, wie es beschrieben worden ist, auf die Ionen nach ihrer Ausdehnung in einem Gas angewendet. Vorzugsweise tritt die Ausdehnung in einem Gas an einer Atmosphäre-Vakuum-Grenzfläche auf. Folglich ist in den bevorzugten Ausführungsformen das oder jedes Filter vorzugsweise stromabwärts einer Atmosphäre-Vakuum-Grenzfläche positioniert. Derartige Grenzflächen können als eine Grenzfläche zwischen einer Ionenquelle (bei Atmosphärendruck) und einem Vakuumbereich vorhanden sein. Die Komponenten, wie z. B. das (oder jedes) Filter, des ionenoptischen Systems usw. befinden sich vorzugsweise in dem Vakuumsystem.
Die durchschnittliche Restionenenergie während der Filterung ist zur Masse mit einem Koeffizienten von wenigstens: a) 0,5 V/kTh, b) 0,7 V/kTh oder c) 1 V/kTh proportional. Vorzugsweise ist die Restenergie der Ionen (die Endenergie der Ionen, die von der Ionenquelle kommen) während der Filterung, z. B. die Energie, wie sie durch die Ausdehnung an der Atmosphäre-Vakuum-Grenzfläche bestimmt ist, zur Masse proportional, wobei sie im Bereich von 0,5 bis 1 V/kTh oder größer liegt (1 Th = 1 m/z-Einheit).
Vorzugsweise werden die Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis, das kleiner als 3000 oder kleiner als 4000 oder kleiner als 5000 ist, im Wesentlichen herausgefiltert, wobei dadurch verhindert wird, dass sie in den elektrostatischen Massenanalysator eintreten. Folglich ist das oder jedes Filter vorzugsweise konfiguriert, um die Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis, das kleiner als 3000 oder kleiner als 4000 oder kleiner als 5000 ist, herausfiltern und dadurch zu verhindern, dass derartige Ionen in die elektrostatischen Falle eintreten.
Vorzugsweise umfasst die Erfindung nach dem Hindurchleiten der Ionen durch eines oder beide der Filter ferner das Fangen (d. h. das Speichern) der Ionen in einer Ionenfalle, z. B. einer linearen Ionenfalle, vor dem Einleiten der Ionen in den elektrostatischen Massenanalysator, der wiederum vorzugsweise eine elektrostatische Falle ist. Die Ionenfalle (d. h. der Ionenspeicher) befindet sich folglich stromabwärts des einen oder beider Filter und stromaufwärts des elektrostatischen Massenanalysators. Die Ionenfalle ist vorzugsweise eine Multipol-Ionenfalle, wie z. B. eine lineare Multipol-Ionenfalle, insbesondere eine gekrümmte lineare Ionenfalle (C-Falle).
Vorzugsweise umfasst die Erfindung ferner nach dem Hindurchleiten der Ionen durch eines oder beide Filter das Kühlen der Ionen vor dem Einleiten der Ionen in den elektrostatischen Massenanalysator. Das Kühlen kann in der obenerwähnten Ionenfalle (oder dem obenerwähnten Ionenspeicher) ausgeführt werden. Zum Zweck des Kühlens umfasst die Erfindung jedoch vorzugsweise ferner eine Stoßzelle, insbesondere eine Hochdruck-Stoßdissoziationszelle (Hochdruck-HCD) stromabwärts des einen oder der beiden Filter und stromaufwärts der elektrostatischen Falle. Die HCD kann sich stromabwärts der Ionenfalle (oder des Ionenspeichers), wo sie vorhanden sind, z. B. in einer ausgangslosen Positionen befinden, wie in WO 2006/103412 beschrieben ist.
Vorzugsweise ist die Absolutgeschwindigkeit während der Detektion der wenigstens einigen der Ionen in der elektrostatischen Falle, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, nicht größer als 6.000 m/s und bevorzugter nicht größer als 5.000 m/s. Das Steuersystem ist folglich vorzugsweise konfiguriert, die Einleitung der Ionen in die elektrostatische Falle zu steuern, wodurch die Absolutgeschwindigkeit während der Detektion der wenigstens einigen der Ionen in der elektrostatischen Falle, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, nicht größer als 6.000 m/s, bevorzugter nicht größer als 5.000 m/s ist.
Vorzugsweise besitzen wenigstens einige Ionen mit eingeschränkter Geschwindigkeit, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, ein Masse-Ladungs-Verhältnis von wenigstens 5.000, bevorzugter wenigstens 10.000, noch bevorzugter wenigstens 15.000 und bis zu 30.000 oder mehr. Die Masse der wenigstens einigen Ionen mit eingeschränkter Geschwindigkeit, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, kann bis zu 1 MDa oder bis zu 2 MDa betragen oder größer als 1 oder 2 MDa sein (MDa = MegaDalton).
Vorzugsweise ist die Ladung der wenigstens einigen der Ionen, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, (die vorzugsweise das Masse-Ladungs-Verhältnis von wenigstens 5.000 besitzen), eine Ladung, die kleiner als 30 ist. Vorzugsweise besitzen die wenigstens einigen der Ionen in der elektrostatischen Falle, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, eine Ladung pro kDa der Masse, die kleiner als 0,2 ist.
Vorzugsweise werden die Ionen durch Elektrospray-, MALDI-, Laserspray- oder Einlassionisation erzeugt, d. h. die Ionenquelle ist vorzugsweise eine aus: einer Elektrosprayquelle, einer MALDI-Quelle, einer Lasersprayquelle und einer Einlassionisationsquelle. Die Ionen werden vorzugsweise durch ein Verfahren der Ionisation bei Atmosphärendruck erzeugt, wie z. B. der Elektrosprayionisation, der MALDI usw. Die so erzeugten Ionen sind mehrfach geladen. Die unter den Bedingungen des Atmosphäredrucks erzeugten Ionen werden vorzugsweise in einem Gas an einer Atmosphäre-Vakuum-Grenzfläche ausgedehnt, wie beschrieben worden ist. Auf diese Art können die Ionen durch die Ausdehnung in dem Gas Energie erlangen. Eine derartige Energie kann verwendet werden, um eine effektive Energiefilterung der Ionen zu ermöglichen.
Vorzugsweise werden die Ionen aus einer Lösung erzeugt, insbesondere aus der Lösung elektrozerstäubt. Die Ionen werden vorzugsweise durch Verfahren (vorzugsweise Elektrospray-Verfahren) erzeugt, die die Erzeugung von Ionen mit einer niedrigen Ladung pro Einheitsmasse (z/m) bevorzugen. Die Ionen werden bevorzugter aus einer Lösung mit einem pH, der größer ist als typisch, erzeugt (insbesondere elektrozerstäubt). Am bevorzugten ist der pH 5 oder höher. Insbesondere ist es bevorzugt, die Ionen aus einer Lösung mit einem pH im Bereich von 6 bis 8,5, bevorzugter im Bereich von 7,0 bis 7,6 zu erzeugen. Folglich befindet sich die Lösung in derartigen Ausführungsformen vorzugsweise in einem beinahe physiologischen Zustand (pH ~7). Folglich ist die Ionenquelle vorzugsweise eine Elektrosprayquelle, die mit einer Lösung mit einem pH in den obenerwähnten Bereichen, insbesondere im Bereich von 6 bis 8,5, eine Grenzfläche bildet.
Die Ionen können aus einem oder mehreren verschiedenen Molekülen in einer oder mehreren Proben abgeleitet werden, z. B. Makromolekülen, die aus einem oder mehreren der folgenden Typen von Molekülen ausgewählt sind: Proteine, Proteinkomplexe, Polypeptide, Biopolymere, Biopharmazeutika, DNA, Fragmente der DNA, cDNA, Fragmente der cDNA, RNA, Fragmente der RNA, mRNA, Fragmente der mRNA, tRNA, Fragmente der tRNA, Antikörper, monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Enzyme, Metabolite usw. Die Probe, die ionisiert wird, kann z. B. wenigstens 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000 oder 5000 verschiedene Moleküle umfassen. Vorzugsweise umfassen die Ionen die Ionen von Proteinen oder Proteinkomplexen, bevorzugter in einem natürlichen Zustand.
Vorzugsweise erfolgt das Detektieren der Ionen in dem elektrostatischen Massenanalysator durch Bildstromdetektion, die das Detektieren eines Bildstrom-Übergangssignals umfasst, wobei der Druck in dem elektrostatischen Massenanalysator unter einem Pegel gehalten wird, bei dem die Zerfallskonstante des Bildstrom-Übergangssignals wenigstens a) 10 ms oder b) wenigstens 20 ms oder c) wenigstens 40 ms beträgt. Typischerweise ist der Druck in dem elektrostatischen Massenanalysator nicht größer als 10^–8 mbar, bevorzugt nicht größer als 5 × 10^–9 mbar, bevorzugter nicht größer als 2 × 10^–9 mbar und noch bevorzugter nicht größer als 10^–9 mbar. Das Bildstrom-Detektionssystem umfasst vorzugsweise wenigstens eine Elektrode, vorzugsweise ein Paar von Elektroden, die einen durch die Bewegung der Ionen innerhalb des Massenanalysators, die bevorzugt eine periodische Bewegung innerhalb des Massenanalysators ist, induzierten Bildstrom detektieren.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren das Umsetzen des Bildstrom-Übergangssignals in ein Massenspektrum, wobei das Massenspektrum verwendet werden kann, um die Spitzen aufzulösen, die aus einer kovalenten und/oder einer nicht kovalenten Bindung kleiner Moleküle an Proteine oder Proteinanordnungen entstehen. Ein Signalverarbeitungssystem, das z. B. einen Computer umfasst, ist vorzugsweise für diesen Zweck vorgesehen. Weitere Komponenten des Signalverarbeitungssystems können Elektronik umfassen, wie z. B. einen Analog-Digital-Umsetzer (Digitalisierer) und/oder einen Vorverstärker, um das Übergangssignal vor der Verarbeitung und der Umsetzung des Signals in dem Computer zu digitalisieren und zu verstärken.
Das Steuersystem des Massenanalysators umfasst vorzugsweise einen Computer, der programmiert ist, die Einleitung der Ionen auf diese Art zu steuern. Das Signalverarbeitungssystem umfasst außerdem vorzugsweise einen Computer, der programmiert ist, das Masse-Ladungs-Verhältnis wenigstens einiger detektierter Ionen zu bestimmen. Das Steuersystem und das Signalverarbeitungssystem können denselben Computer oder verschiedene Computer umfassen. Die Signalverarbeitung des Übergangssignals in ein Massenspektrum ist in der Technik der Massenspektrometrie Routine, z. B. unter Verwendung einer Fourier-Transformation. Demgemäß sind Computerprogramme für die Ausführung in dem Computer verfügbar, die eine derartige Transformation ausführen.
Während der Massenanalysator im Allgemeinen nicht auf irgendeinen spezifischen Typ eingeschränkt ist und z. B. nicht auf elektrostatische Fallen eingeschränkt sein kann, sondern ein TOF-Massenanalysator sein kann, umfasst das Verfahren vorzugsweise das Einleiten der mehrfach geladenen Ionen in einen elektrostatischen Massenanalysator und das Fangen der Ionen darin, wobei das Verfahren bevorzugter das Detektieren der (gefangenen) Ionen in dem elektrostatischen Massenanalysator umfasst. Der elektrostatische Massenanalysator dient folglich vorzugsweise dazu, die Ionen darin aufzunehmen und zu fangen. Der elektrostatische Massenanalysator dient vorzugsweise dazu, die Ionen, wie sie z. B. darin gefangen sind, zu veranlassen, innerhalb des Massenanalysators eine periodische Bewegung auszuführen, z. B. zu oszillieren (wobei dieser Begriff hier außerdem eine Bewegung umfasst, die eine Drehbewegung ist). Vorzugsweise wird die Oszillation der Ionen in dem elektrostatischen Massenanalysator durch die Bildstromdetektion detektiert. Hier bedeutet der Begriff elektrostatischer Massenanalysator einen Massenanalysator, der ein elektrostatisches Feld verwendet, um einen Ionenweg innerhalb des Analysators bereitzustellen. Der elektrostatische Massenanalysator ist vorzugsweise eine elektrostatische Falle, d. h. eine Ionenfalle, die ein elektrostatisches Feld verwendet, um die Ionen darin zu fangen. Ein Beispiel ist ein Massenanalysator oder eine Falle, der bzw. die die Oszillationsfrequenz der in einem elektrostatischen Feld gefangenen Ionen misst, wobei sich die Oszillation harmonisch in einer Richtung ändert. Beispiele enthaltenen verschiedene Fourier-Transformations-Massenanalysatoren (FT-Massenanalysatoren), wobei spezifische Beispiele FT-Ionen-Zyklotronresonanz-Massenanalysatoren (FT-ICR-Massenanalysatoren) sind, z. B. die, die als der Orbitrap^TM verkauft werden.
Ein bevorzugtes elektrostatisches Feld ist ein hyperlogarithmisches elektrostatisches Feld. Ein bevorzugtes Beispiel der elektrostatischen Falle ist eine, in der die Ionen in einem elektrostatischen Feld oszillieren und dadurch mehreren Richtungsänderungen unterzogen werden, vorzugsweise in einem hyperlogarithmischen elektrostatischen Feld, wobei die Oszillation die Ionen umfasst, die um eine Mittelelektrode kreisen, die axial langgestreckt ist, während sie axial harmonischen Oszillationen unterzogen werden, wobei die Falle die Frequenz der axialen Oszillation misst. In derartigen Fallen werden die Ionen wiederholt Änderungen der Richtung in der axialen Richtung unterzogen. Derartige Analysatoren werden als der Orbitrap-Massenanalysator verkauft. Die Konstruktion und der Betrieb der Orbitrap-Massenanalysatoren sind z. B. in US 5.886.346 und in Olsen, J. V.; Schwartz, J. C.; Griep-Raming, J.; Nielsen, M. L.; Damoc, E.; Denisov, E.; Lange, O.; Remes, P.; Taylor, D.; Splendore, M; Wouters, E. R.; Senko, M.; Makarov, A.; Mann, M. u. Horning, S. A., Dual Pressure Linear Ion Trap Orbitrap Instrument with Very High Sequencing Speed, Mol. Cell Proteomics, 2009, 8, 2759–2769, beschrieben.
Der Schritt, die Ionen zu veranlassen, in dem elektrostatischen Feld zu oszillieren, ist ein wohlbekanntes und notwendiges Merkmal der Fourier-Transformations-Massenanalysatoren (FT-Massenanalysatoren). Die Verwendung einer geeigneten Ioneninjektion in ein geeignetes hyperlogarithmisches elektrostatisches Feld, wie in einem Orbitrap-Massenanalysator, veranlasst z. B. die Ionen, die Oszillation in dem Massenanalysator zu beginnen (d. h. Oszillation bei Injektion), wobei die Oszillation in dem hyperlogarithmischen elektrostatischen Feld weitergeht. In FT-ICR-Massenanalysatoren wird das Anlegen eines Magnetfeldes und eines elektrischen Erregungsfeldes angewendet, um die Ionen zu veranlassen, zu oszillieren.
Die Oszillationsfrequenz der Ionen wird als ein Zeitbereichssignal detektiert. Die Oszillationsfrequenz der Ionen kann in das Masse-Ladungs-Verhältnis der Ionen transformiert werden, z. B. unter Verwendung einer Fourier-Transformation, insbesondere unter Verwendung einer schnellen Fourier-Transformation (FFT). Folglich kann aus der Detektion der Ionen in der elektrostatischen Falle durch Bildstromdetektion das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) der Ionen bestimmt werden und/oder kann ein Massenspektrum der Ionen daraus bestimmt werden. Falls die Ladung der Ionen bekannt ist, wie es oft möglich ist, kann dann die Masse der Ionen bestimmt werden. Das Masse-Ladungs-Verhältnis der Ionen kann in Einheiten von Thomson (Th) ausgedrückt werden. Die Masse der Ionen kann in Einheiten von Dalton (Da) ausgedrückt werden. Verbesserte Verfahren der Fourier-Transformation, wie sie z. B. in EP 2372747 beschrieben sind, können verwendet werden, um die Qualität des endgültigen Massenspektrums zu verbessern.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
1 zeigt eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform eines elektrostatischen Massenanalysators gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die Massenspektren verschiedener vollständiger Proteine und Proteinanordnungen.
3 zeigt eine Nahansicht nach 2d.
4a zeigt ein Massenspektrum mit einer einzigen Abtastung einzelner Ionen des GroEL, um die Empfindlichkeit zu demonstrieren; 4b zeigt die Verteilung der detektierten Signale über den Rauschabständen (S/N) für die drei intensivsten Ladungszustände des GroEL, die die quantisierte Natur der S/N-Verhältnisse angibt.
5 zeigt ein Massenspektrum für die am GroEL ausgeführte durch Hochenergiestöße verursachte Dissoziation (HCD).
Ausführliche Beschreibung der Ausführungsformen der Erfindung
Um ein ausführlicheres Verständnis der Erfindung zu ermöglichen, werden nun unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung zahlreiche repräsentative Ausführungsformen beschrieben. Die beschriebenen Ausführungsformen sind lediglich Beispiele und nicht vorgesehen, den Umfang der Erfindung einzuschränken.
In 1 basiert die bevorzugte Ausführungsform auf einem Exactive Plus-Instrument 1 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland), das eine elektrostatische Falle in der Form eines Orbitrap^TM-Massenanalysators verwendet. Das Instrument umfasst einen Elektrozerstäuber 2 bei Atmosphärendruck. Es ist klar, dass andere Ionenquellen verwendet werden könnten. Die Erfindung könnte außerdem für die Analyse von Ionen verwendet werden, die durch matrixunterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI), Lasersprayen oder irgendeine andere Einlassionisation oder in der Tat irgendwelche andere Techniken, die Ionen mit hohem m/z erzeugen können, erzeugt werden.
Die Ionen aus dem Elektrozerstäuber gehen durch eine Übertragungskapillare 3 zu einer gestapelten Ringionenführung (S-Linse) 4 und dann durch einen Injektions-Flatapol 6 und einen gebogenen Flatapol 8. Der Druck in dem Bereich der S-Linse zum gebogenen Flatapol beträgt typischerweise 1–10 mbar (z. B. 1,6 mbar). Der gebogene Flatapol besitzt 2-mm-Lücken zwischen seinen Stäben. Ein Grad der Stoßkühlung tritt in dem gebogenen Flatapol auf. Ein Ionentor 10 in der Form einer schnellen gespaltenen Linse steuert den Eintritt der Ionen in den Nur-HF-Transport-Multipol 12, der in dieser Ausführungsform ein Oktopol ist und typischerweise auf einem Druck gehalten wird, der kleiner als 10^–4 mbar ist. Von dem Transport-Multipol treten die Ionen in eine C-Falle 14 ein, typischerweise mit einem Druck von (0,1–4,0) × 10^–3 mbar (z. B. 0,5 × 10^–3 mbar) darin. Optional können die Ionen für die weitere Kühlung in eine gasgefüllte ausgangslose HCD-Zelle 16 geleitet werden, die HF-Multipol-Stäbe umfasst, typischerweise bei einem Druck von (1–20) × 10^–3 mbar (z. B. 5 × 10^–3 mbar). Von dort werden die Ionen zurück zur C-Falle geleitet. Die HCD-Zelle ist für diesen Zweck mit einem axialen Feld versehen, z. B. durch das Bereitstellen einer Bremsspannung auf der Rückseite der HCD. Die HCD-Zelle ist durch eine einzelne Membran von der C-Falle getrennt, was das leichte Abstimmen der HCD-Zelle erlaubt. Bei Bedarf können das an die HCD-Zelle angelegte HF- und axiale Feld eingestellt werden, um für die Fragmentierung der Ionen darin zu sorgen. Die HCD-Zelle erlaubt ein besseres Fangen, während ein bestimmter Druck in der C-Falle und folglich im Orbitrap aufrechterhalten wird, weil die HCD-Zelle i) länger als die C-Falle ist und ii) sich auf einem höheren Druck als die C-Falle befindet. Die Ionen werden von der C-Falle in den Orbitrap-Massenanalysator 20 injiziert. Das Vakuum in der Orbitrap-Abteilung liegt vorzugsweise unter 7 × 10^–10 mbar, obwohl es von dem Druck in der HCD-Zelle abhängig ist. Für einige große Proteine könnten Drücke über 2 × 10^–9 mbar verwendet werden. Das m/z größerer, langsamerer Ionen kann bei derartigen Drücken in dem Orbitrap bestimmt werden, was auf den zurückgelegten Gesamtweg zurückgeführt werden kann, der schneller mit der Masse abnimmt als die mittlere freie Weglänge mit der Masse zunimmt.
Die Anzahl der Ionen in dem Orbitrap wird automatisch gesteuert (automatische Verstärkungsregelung), indem die Gesamtionenladung unter Verwendung einer kurzen Vorabtastung vor der analytischen Abtastung gemessen wird und daraus die Ioneninjektionszeit für die analytische Abtastung berechnet wird. Für hohe Abtastraten kann die vorergehende analytische Abtastung als die Vorabtastung verwendet werden, um die Abtastzykluszeit zu optimieren. Außerdem oder alternativ kann ein Ionenkollektor 17 hinter der HCD-Stoßzelle angeordnet sein und kann für die unabhängige Ladungsdetektion verwendet werden, die periodisch (z. B. alle 5–10 s) die Genauigkeit der automatischen Verstärkungsregelung prüft und einstellt. Ein Beispiel eines derartigen Systems ist in der Patentanmeldung des Anmelders, Nummer GB 1108473.8 , eingereicht am 20. Mai 2011, beschrieben, deren Inhalte in ihrer Gesamtheit hier aufgenommen sind. Die durch die Bildstromdetektion in dem Orbitrap-Massenanalysator detektierten Übergänge werden unter Verwendung eines Fourier-Transformation-Prozesses in dem (nicht gezeigten) Instrumentencomputer verarbeitet, um die Übergangsignale in Frequenzkomponenten und dann das m/z umzusetzen. Die Erfassungsgeschwindigkeit reicht von 12 Hz für eine Auflösungsleistung von 17.500 bei einem m/z von 200 (die 3.200 bei einem m/z von 6000 entspricht) bis 1,5 Hz für eine Auflösungsleistung von 140.000 bei einem m/z von 200 (die 25.000 bei einem m/z von 6000 entspricht).
Wenn die Bildstromübergänge geeignet konfiguriert sind und geeignet betrieben werden, werden die Bildstromübergänge sehr schwerer Proteine beträchtlich länger als basierend auf den vorhandenen Daten von Proteinen mit mittlerer Größe bei dem typischen Betriebsdruck in dem Analysator erwartet wird, [A. A. Makarov, E. Denisov, "Dynamics of ions of intact proteins in the Orbitrap mass analyzer", J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2009, 20, 1486–1495]. Es ist entdeckt worden, dass dieser Effekt auftritt, sobald die Absolutgeschwindigkeit der Ionen während der Detektion kleiner als etwa 8000 m/s wird (320 Volt der Beschleunigungsspannung pro 1000 Einheiten des m/z, d. h. V/kTh), wobei er im Allgemeinen unter 6000 m/s ausgeprägter ist (Beschleunigungsspannung 180 V/kTh). Diese Anforderung ist dem direkt entgegengesetzt, was für die Detektion in Flugzeitinstrumenten durch Sekundäremission aufgrund der Detektion durch den Bildstrom in dem Orbitrap-Massenanalysator erforderlich ist. Auf diese Art wird die optimale Leistung für die natürliche MS ermöglicht. Es ist festgestellt worden, dass diese Bedingung sowohl für Stickstoff- als auch für Xenon-Stoßgase (mit Massen von 28 bzw. 131 Da) gilt. Wahrscheinlich entsteht eine derartige Unabhängigkeit vom Stoßgas aus den verschiedenen Wirkungsgraden der Energieübertragung bei den Stößen.
Eine derartige Verringerung der Ionenenergie in dem Orbitrap-Massenanalysator erlaubt sogar, ihn bei viel höheren Drücken als üblich zu betreiben (z. B. 1–2 × 10^–9 mbar). Ähnlich kann die HCD-Zelle bei einem höheren Druck als üblich von 0,02–0,03 mbar betrieben werden. Sogar unter derartigen Bedingungen ist festgestellt worden, dass die Zerfallskonstante der Übergänge von z. B. den +66 ... +75-Ladungszuständen des GroEl-Proteinkomplexes (Masse etwa 800 kDa) 20 ms übersteigt, was folglich die Detektion einzelner Ionen mit einem Rauschabstand von etwa 4 erlaubt. Gemäß einem weiteren bevorzugten Merkmal erlaubt deshalb das Verfahren, dass das m/z von einzelnen Ionen bestimmt wird, die in dem Massenanalysator vorhanden sind. Diese Bedingung erlaubt dadurch eine signifikante Verbesserung der Empfindlichkeit, der Massenauflösungsleistung und der Geschwindigkeit der Analyse bei der MS von natürlichen und schweren Proteinen. Diese verbesserten Parameter erlauben vorteilhaft die Analyse der kovalenten und nicht kovalenten Bindung kleiner Moleküle an Proteinanordnungen mit guter Empfindlichkeit und guter Massenauflösungsleistung.
Im Gegensatz zu normalen FT/MS-Bedingungen, wo mehr Ladungen pro Molekül im Allgemeinen als besser betrachtet werden, ist festgestellt worden, dass es von einer bestimmten Masse an im Allgemeinen ausreichend Ladungen pro Molekül gibt, um einzelne Ionen zu detektieren (in Abhängigkeit von den Detektionszeiten kann dies von 5 bis 20 Ladungen aufwärts sein), wobei es dann wichtiger wird, mehrere Arten mit weniger Ladungen pro Ion zu besitzen, was eine bessere statistische Darstellung der Isotopenmuster usw. (mit anderen Worten: mehr relevante Informationen pro Zeiteinheit) ergibt.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die Selektivität und die Empfindlichkeit der Analyse verbessert werden können, indem zwei Effekte verwendet werden: (i) eine unvollständige Verzögerung schwerer Ionen während der Stoßkühlung, z. B. in einem Flatapol, die es ihnen erlaubt, eine kinetische Energie von etwa 0,5–1 V/kTh zu behalten, die etwa der Geschwindigkeit der Gasausdehnung an der Atmosphäre-Vakuum Grenzfläche entspricht; und (ii) eine relativ schmale Ladungsverteilung für die bei der natürlichen MS erzeugten Ionen, typischerweise < 10% FWHM. Im Ergebnis dessen haben die Erfinder insbesondere festgestellt, dass eine Energiefilterung verwendet werden kann, um nur einen m/z-Bereich von Interesse auszuwählen, z. B. mit einer Auflösungsleistung von 2–3, wobei folglich erlaubt wird, dass die C-Falle und dadurch der Orbitrap-Massenanalysator nur mit Ionen von Interesse ohne die Notwendigkeit eines Massenfilters gefüllt werden. In bestimmten Ausführungsformen ist klar, dass ein m/z-Filter verwendet werden könnte, falls ein Bedarf besteht. In der Ausführungsform nach 1 können die ionenoptischen Elemente eingestellt werden, um ein Abschneiden bei niedriger Energie und hoher Energie bereitzustellen, z. B. indem der Versatz des Transport-Multipols erhöht wird bzw. die Bremsspannung an der Rückseite des HCD-Multipols verringert wird. Für das Abschneiden von Ionen mit hohem m/z könnte der HF-Pegel eines oder mehrerer der Multipole außerdem verringert werden. Auf diese Art kann der Massenanalysator mit mehr Ionen von analytischem Interesse, z. B. hohem m/z, gefüllt werden.
Die unvollständige Kühlung ist aufgrund der nachfolgenden Speicherung und vollständigen Kühlung der Ionen in der C-Falle und optional der HCD-Zelle annehmbar. Die unvollständige Kühlung ermöglicht jedoch, dass die Energiefilterung vorteilhaft nach einer derartigen Stufe der unvollständigen Kühlung verwendet wird. Dies steht im Gegensatz zur Kühlung bei erhöhten Drücken, die nach der Grenzfläche in den Q-TOF-Instrumenten erforderlich ist, [I. V. Chernushevich, B. A. Thomson, "Collisional Cooling of Large Ions in Electrospray Mass Spectrometry", Anal. Chem., 2004, 76, 1754–1760].
In den im Folgenden beschriebenen Experimenten wurde die Steuer-Software des Instruments modifiziert, um es zu ermöglichen, dass der Massenbereich des Instruments von einem m/z von 50–6.000 bis zu einem m/z von 400–20.000 vergrößert wird. Die maximalen HF-Spannungen wurden z. B. an alle HF-Multipole in dem Instrument, einschließlich der C-Falle, angelegt. Für eine effizientere Auflösung und ein effizienteres Einfangen der großen Proteine und eine vergrößerte Empfindlichkeit wurde den Ionen erlaubt, in die HCD-Zelle einzutreten, wobei sie dort gespeichert und gekühlt werden, bevor sie zurück in die C-Falle zurückkehren, anstatt die Ionen direkt nach dem Verlassen des Transport-Multipols in der C-Falle zu fangen. Die HCD-Zelle war mit einer dedizierten Gasleitung ausgerüstet, die das Umschalten zwischen dem Standard-Stickstoff-Stoßgas und Xenon erlaubte. Der Druck in der Orbitrap-Abteilung spiegelte die Variationen des Drucks in der HCD-Zelle wider und variierte in Abhängigkeit vom Experiment zwischen 5 × 10^–10 und 2 × 10^–9 mbar.
Das Abstimmen des Spannungsversatzes in dem Transport-Oktopol wurde für die Masse-/Energiefilterung der eingehenden Ionen verwendet. Es wurden Bremsspannungen von bis zu 5 V verwendet, ohne die Intensität der Ionen mit einem m/z > 6000 zu beeinflussen, während die mit einem m/z < 3000 fast vollständig eliminiert wurden. In Anbetracht der relativ niedrigen Gasdrücke in dem gebogenen Flatapol ist dieser Effekt den Geschwindigkeiten zuzuschreiben, die durch die mitgerissenen Ionen während der gasdynamischen Ausdehnung in der S-Linse 4 und dem Injektion-Flatapol 6 erlangt werden und die durch die unvollständige Gaskühlung in dem gebogenen Flatapol 8 nur teilweise abgegeben werden. In der Tat muss die restliche Ionengeschwindigkeit etwa 400 m/s übersteigen, um diesen Effekt bereitzustellen, die mit der abschließenden Luftgeschwindigkeit von etwa 700–800 m/s in der S-Linse und dem Injektions-Flatapol kompatibel ist.
Die Experimente zeigten, dass vollständige makromolekulare Anordnungen, wie z. B. Proteinkomplexe, bis zu einem MDa mit einer Einzelionenempfindlichkeit und einer hohen spektralen Auflösung mit einem Orbitrap-Massenanalysator analysiert werden können, der normalerweise für die Analyse kleiner Moleküle, wie z. B. Peptide, verwendet wird. Die Analyse großer vollständiger Proteine und Komplexe in ungefähr natürlichen Zuständen durch die Massenspektrometrie kann eine Fülle von Informationen für die strukturelle Biologie und für biophysikalische Studien bieten.
Die Daten wurden unter Verwendung des Standard-Software-Pakets Xcalibur 2.2 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) erfasst und verarbeitet.
Für die Eichung wurden anorganische Salze Csl und Ammoniumhexafluorophosphat (AHFP), die Cluster mit zunehmendem Molekulargewicht bilden, als Massenkalibriersubstanzen verwendet. Die Csl-Cluster wurden bis zu einem m/z von 18.000 und das AHFP bis zu einem m/z von 10.000 detektiert. Eine Auflösung von 25.000 bei einem m/z von 5.000 und von 16.000 bei einem m/z von 10.000 konnte leicht erreicht werden.
Unter Verwendung des Instruments gemäß der vorliegenden Erfindung wurde in einem ersten Experiment ein monoklonaler IgG-Antikörper, der aus 4 disulfid-verknüpften Proteinketten bestand, mit einem ungefähren Molekulargewicht von 149 kDa analysiert. Es wurde eine schmale Ladungszustandsverteilung bei einem m/z von 5.000–7.000 beobachtet, die mit Ladungen von 24+ bis 29+ des vollständigen Antikörpers in Beziehung steht, wie in 2a gezeigt ist. Das berechnete Molekulargewicht lag innerhalb von 4 Da des theoretischen Werts, was eine Massengenauigkeit innerhalb von 30 ppm widerspiegelt und eine vollständige Auflösung angibt. Die Auflösungsleistung des Orbitrap-Analysators erlaubte die Grundlinientrennung der verschiedenen Glycosylierungsformen des Antikörpers mit gemessenen Molekulargewichten, die sich um 162 Da, d. h. Hexose-Einheiten, unterschieden.
In einem weiteren Experiment wurde eine Folge von nicht kovalenten Proteinanordnungen mit zunehmendem Molekulargewicht analysiert. Die 2b–d zeigen einen Überblick über die Massenspektren, die für (b) pentamere und hexamere Kapsomer-Zwischenformen der HK97-Virusanordnung (210 kDa und 253 kDa), (c) das Hefe-20S-Proteasom (730 kDa) und (d) das Chaperon-Protein GroEL (801 kDa) erhalten wurden. 3 zeigt einen gezoomten Abschnitt der Spektren für (d). Für jede in den 2b–d gezeigte Anordnung wird eine schmale Ladungszustandsverteilung beobachtet, die angibt, dass die natürliche Struktur der Komplexe beibehalten wird. Der größte hier gemessene Proteinkomplex, GroEL, besiedelt z. B. die Ladungszustände von 68+ bis 77+ bei einem m/z von 10.000 bis 12.000. Die FWHM-Auflösung dieser Spitzen beträgt über 2000, wobei das experimentelle Molekulargewicht 800.782,2 ± 23,6 Da beträgt (eine Massengenauigkeit von 20 ppm im Vergleich zum theoretischen Molekulargewicht 800.766,4 Da). Die beobachtete Spitzenbreite ist signifikant schmaler als sie in äquivalenten Experimenten mit einer Q-Tof-Instrumentierung beobachtet wurde.
Um die Empfindlichkeit der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren, wurden einzelne Ionen des GroEL in einzelnen Abtastungen detektiert (4a). Es wurden quantisierte Signaländerungen in Schritten von 1, 2 usw. detektiert, wobei das erste Maximum in der S/N-Verteilung nach 4b der Detektion eines einzelnen Ions eines speziellen Ladungszustands entspricht, wobei das zweite Maximum der Detektion von zwei Ionen entspricht, die gleichzeitig bei demselben m/z auftreten. Wenn aufeinanderfolgende Abtastungen summiert wurden, reproduzierten sie genau das für mehrere Ionen des GroEL erfasste Spektrum.
In weiteren Experimenten wurde die Erfindung außerdem für Folgendes verwendet: (i) die Tandem-MS, die die Analyse einzelner Untereinheiten erlaubt, die von einem Komplex dissoziiert sind, und (ii) die Analyse kleiner Massenänderungen in Arten mit hohen Molekulargewicht, die die Bindung kleiner Moleküle, Medikamente, Liganden, Nucleotide, Lipide usw. anzeigen könnten. Für (i) wurde die durch Hochenergiestöße verursachte Dissoziation (HCD) am GroEL ausgeführt. Dies führte zu einer asymmetrischen Austreibung eines Monomers, um einen 13-Untereinheits-Komplex mit einer relativ kleinen Anzahl von Ladungen übrig zu lassen. Die Spitzen für dieses Dissoziationsprodukt wurden in dem m/z-Bereich von 15.000–22.000 beobachtet, wie in 5 gezeigt ist.
Es ist klar, dass Variationen an den vorhergehenden Ausführungsformen der Erfindung vorgenommen werden können, während sie immer noch in den Umfang der Erfindung fallen. Jedes in dieser Beschreibung offenbarte Merkmal kann durch alternative Merkmale ersetzt werden, die dem gleichen, einem äquivalenten oder einem ähnlichen Zweck dienen, wenn es nicht anders angegeben ist. Folglich ist jedes offenbarte Merkmal nur ein Beispiel einer generischen Folge von äquivalenten oder ähnlichen Merkmalen, wenn es nicht anders angegeben ist.
Die Verwendung irgendeines und aller Beispiele oder einer beispielhaften Sprache (”z. B.”, ”wie z. B.”, ”beispielsweise” und einer ähnlichen Sprache), die hier bereitgestellt ist, ist lediglich vorgesehen, die Erfindung besser zu veranschaulichen, wobei sie keine Einschränkung an den Umfang der Erfindung angibt, wenn er nicht anderweitig beansprucht ist. Keine Sprache in der Beschreibung sollte als irgendein nicht beanspruchtes Element als wesentlich für die Praxis der Erfindung angebend ausgelegt werden.
Wie sie hier einschließlich in den Ansprüchen verwendet werden, sind die Einzahlformen der Begriffe hier als die Mehrzahlformen enthaltend und umgekehrt auszulegen, wenn es der Kontext nicht anders angibt. Wenn es der Kontext nicht anders angibt, bedeutet z. B. eine Bezugnahme in der Einzahl hier einschließlich in den Ansprüchen, wie z. B. ”ein” oder ”eine”, ”ein oder mehrere”.
Überall in der Beschreibung und den Ansprüchen dieser Beschreibung bedeuten die Wörter ”umfassen”, ”einschließen”, ”besitzen” und ”enthalten” und die Variationen der Wörter, z. B. ”umfassend” und ”umfasst” usw., ”einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf”, wobei sie nicht vorgesehen sind, andere Komponenten auszuschließen (und andere Komponenten nicht ausschließen).
Alle in dieser Beschreibung beschriebenen Schritte können in irgendeiner Reihenfolge oder gleichzeitig ausgeführt werden, wenn es nicht anders angegeben ist oder es der Kontext anders erfordert.
Alle in dieser Beschreibung offenbarten Merkmale können in irgendeiner Kombination kombiniert werden, mit Ausnahme der Kombinationen, in denen sich wenigstens einige derartige Merkmale und/oder Schritte wechselseitig ausschließen. Insbesondere sind die bevorzugten Merkmale der Erfindung auf alle Aspekte der Erfindung anwendbar und können in jeder Kombination verwendet werden. Gleichermaßen können die in den nicht wesentlichen Kombinationen beschriebenen Merkmale getrennt (nicht in Kombination) verwendet werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2006/103412 [0020]
US 5886346 [0031]
EP 2372747 [0033]
GB 1108473 [0042]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

A. Heck, Native mass spectrometry: a bridge between interatomics and structural biology, Nature Methods, 5 (2008), 927–933 [0002]
I. V. Chernushevich, B. A. Thomson, ”Collisional Cooling of Large Ions in Electrospray Mass Spectrometry”, Anal. Chem., 2004, 76, 1754–1760 [0003]
Olsen, J. V.; Schwartz, J. C.; Griep-Raming, J.; Nielsen, M. L.; Damoc, E.; Denisov, E.; Lange, O.; Remes, P.; Taylor, D.; Splendore, M; Wouters, E. R.; Senko, M.; Makarov, A.; Mann, M. u. Horning, S. A., Dual Pressure Linear Ion Trap Orbitrap Instrument with Very High Sequencing Speed, Mol. Cell Proteomics, 2009, 8, 2759–2769 [0031]
A. A. Makarov, E. Denisov, ”Dynamics of ions of intact proteins in the Orbitrap mass analyzer”, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2009, 20, 1486–1495 [0043]
I. V. Chernushevich, B. A. Thomson, ”Collisional Cooling of Large Ions in Electrospray Mass Spectrometry”, Anal. Chem., 2004, 76, 1754–1760 [0047]

Claims

Massenanalysator, der Folgendes umfasst: einen elektrostatischen Massenanalysator, um Ionen darin aufzunehmen, wobei der elektrostatische Massenanalysator Folgendes umfasst: ein Detektionssystem zum Detektieren der Ionen in dem elektrostatischen Massenanalysator; ein Signalverarbeitungssystem zum Bestimmen des Masse-Ladungs-Verhältnisses wenigstens einiger detektierter Ionen; und ein Steuersystem, das konfiguriert ist, die Einleitung der Ionen in den elektrostatischen Massenanalysator so zu steuern, dass die Absolutgeschwindigkeit in dem elektrostatischen Massenanalysator wenigstens einiger der Ionen, deren Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird, nicht größer als 8.000 m/s ist, und das konfiguriert ist, die durchschnittliche Weglänge während der Dauer der Detektion derartiger Ionen zu steuern, wodurch sie länger ist, als zum Detektieren derartiger Ionen mit einer Auflösungsleistung von 1.000 des Masse-Ladungs-Verhältnisses erforderlich ist.
Massenanalysator nach Anspruch 1, wobei das Detektionssystem ein Bildstrom-Detektionssystem ist.
Massenanalysator nach Anspruch 1, der ferner ein Masse-Ladungs-Verhältnis-Filter und/oder ein Energiefilter stromaufwärts des Massenanalysators umfasst.
Massenanalysator nach Anspruch 3, der ferner Elektroden umfasst, um daran eine Barrierenspannung anzulegen, um als das Filter für niedrige Masse-Ladungs-Verhältnisse oder für niedrige Energien zu wirken.
Massenanalysator nach Anspruch 4, wobei die Elektroden die Stäbe einer Multipol-Ionenführung umfassen.
Massenanalysator nach Anspruch 3, wobei das oder jedes Filter stromabwärts einer Atmosphäre-Vakuum-Grenzfläche positioniert ist.
Massenanalysator nach Anspruch 6, wobei die Atmosphäre-Vakuum-Grenzfläche bestimmt, dass die Restenergie der Ionen während der Filterung proportional zur Masse ist und im Bereich von 0,5 bis 1 V/kTh liegt oder größer ist.
Massenanalysator nach Anspruch 3, wobei das oder jedes Filter konfiguriert ist, um die Ionen mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis, das kleiner als 3000 ist, im Wesentlichen herauszufiltern und dadurch zu verhindern, dass derartige Ionen in den Massenanalysator eintreten.
Massenanalysator nach Anspruch 3, der ferner stromabwärts des einen oder beider Filter und stromaufwärts des Massenanalysators eine Ionenfalle umfasst.
Massenanalysator nach Anspruch 9, wobei die Ionenfalle eine gekrümmte lineare Ionenfalle ist.
Massenanalysator nach Anspruch 3, der ferner stromabwärts des einen oder beider Filter und stromaufwärts des Massenanalysators eine Stoßzelle umfasst.
Massenanalysator nach Anspruch 1, wobei das Steuersystem konfiguriert ist, die Einleitung der Ionen in den Massenanalysator zu steuern, wodurch die Absolutgeschwindigkeit wenigstens einiger der Ionen in dem Massenanalysator während der Detektion nicht größer als 6.000 m/s ist.
Massenanalysator nach Anspruch 12, wobei das Steuersystem konfiguriert ist, die Einleitung der Ionen in den Massenanalysator zu steuern, wodurch die Absolutgeschwindigkeit wenigstens einiger der Ionen in dem Massenanalysator während der Detektion nicht größer als 5.000 m/s ist.
Massenanalysator nach Anspruch 1, wobei die Ionen die Ionen von Proteinen oder Proteinkomplexen umfassen.
Massenanalysator nach Anspruch 1, der ferner eine Ionenquelle umfasst, die eine der Folgenden ist: eine Elektrosprayquelle, eine MALDI-Quelle, eine Lasersprayquelle und eine Einlassionisationsquelle.
Massenanalysator nach Anspruch 15, wobei die Ionenquelle die Ionen aus einer Lösung mit einem pH im Bereich von 6 bis 8,5 erzeugt.
Massenanalysator nach Anspruch 1, wobei das Detektionssystem dem Detektieren eines Bildstrom-Übergangsignals von den Ionen dient und der Druck in dem Massenanalysator unter einem Pegel gehalten wird, bei dem die Zerfallskonstante des Bildstrom-Übergangssignals wenigstens a) 10 ms oder b) wenigstens 20 ms oder c) wenigstens 40 ms beträgt
Massenanalysator nach Anspruch 1, wobei der elektrostatische Massenanalysator eine elektrostatische Ionenfalle ist.
Massenanalysator nach Anspruch 18, wobei die elektrostatische Ionenfalle eine elektrostatische Umlauf-Ionenfalle ist.