DE19910394A1 - Fertility control substances - Google Patents

Fertility control substances

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DE19910394A1
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fertility
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Monika Lessl
Ekkehard Brockstedt
Michaele Peters-Kottig
Christa Hegele-Hartung
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Abstract

The invention relates to a substance and methods for obtaining agents for controlling fertility.

Description

Die Erfindung betrifft eine Substanz sowie Verfahren zur Gewinnung von Mitteln zur Fertilitätskontrolle.The invention relates to a substance and to methods for obtaining agents for Fertility control.

Das weibliche Kontrazeptivum, das am häufigsten eingesetzt wird, ist die klassische Pille. Sie besteht aus einem Östrogen- und einem Gestagenanteil. Eine regelmäßige Einnahme führt zur Ovulationshemmung bei der Frau. Das Prinzip dieser Methode ist, daß es durch die Einnahme der Pille zu einer Unterdrückung der endogenen Steroidhormonproduktion im Ovar und somit zu einer Ovulationshemmung kommt. Ein Nachteil ist, daß ein natürlicher Zyklus somit bei der Frau nicht mehr vorhanden ist. Zudem können in Zusammenhang mit der Einnahme der Pille bei Patientinnen mit Risikopotential Nebenwirkungen wie beispielsweise Brustspannungen, Gewichtszunahmen etc. auftreten.The female contraceptive that is used most often is the classic one Pill. It consists of an estrogen and a progestogen component. A regular one Ingestion leads to inhibition of ovulation in women. The principle of this method is that by taking the pill it suppresses the endogenous Steroid hormone production in the ovary and thus leads to an inhibition of ovulation. On The disadvantage is that the woman no longer has a natural cycle. In addition, in connection with taking the pill in patients with Risk potential side effects such as breast tensions, Weight gains etc. occur.

Prinzipien für die männliche Fertilitätskontrolle sind bisher nur wenige bekannt. Eines der wenigen Prinzipien, das bisher beim Mann erprobt wurde, ist die Verabreichung von Testosteronderivaten. Dadurch kommt es zu einer Unterdrückung der Spermatogenese und somit zur männlichen Infertilität. Diese Methode der Empfängnisverhütung hat jedoch noch viele Nachteile. So dauert es bis zum Eintreten des Empfängnisschutzes ca. 70 Tage. Darüber hinaus müssen die Testosteronderivate aufgrund mangelnder oraler Verfügbarkeit injiziert werden.Only few principles are known for male fertility control. One One of the few principles that has been tried in men is the administration of Testosterone derivatives. This leads to suppression of spermatogenesis and thus male infertility. This method of contraception has however, there are still many disadvantages. So it takes until contraceptive protection occurs about 70 days. In addition, the testosterone derivatives have to be lacking oral availability.

Durch zahlreiche Untersuchungen ist belegt, daß bei der Frau mit zunehmendem Alter die Fertilität abnimmt. Dies ist unter anderem auf eine schlechtere Qualität der Eizelle, eine erhöhte Abortrate, verstärkte Exposition mit Infektionskeimen (z. B. Chlamydien oder Gonokokken) zurückzuführen. Da sich in den Industrieländern jedoch das Alter der Erstgebärenden immer weiter nach hinten verschiebt, ist es notwendig, Möglichkeiten zur Verbesserung der Fertilität zu finden. Dieses trifft für die Frau und auch für den Mann zu. Für Paare mit Fertilitätsstörungen stehen heute die Techniken der assistierten Reproduktion zur Verfügung (In-vitro-Fertilisation (IVF); Gamete intrafallopian transfer (GIFT), Intrauterine Insemination). Diese Methoden sind jedoch invasiv und in den meisten Fällen mit einer vorherigen Stimulation der Follikelreifung bei der Frau durch Proteohormone (Follikel-stimulierendes Hormon/FSH) verbunden. Diese kann zu unangenehmen Nebenwirkungen wie Kopfschmerzen oder Schmerzen im Abdomen, im schlimmsten Fall jedoch auch zum sogenannten ovariellen Hyperstimulationssyndrom führen.Numerous studies have shown that women age fertility decreases. Among other things, this is due to poorer quality of the egg cell, an increased abortion rate, increased exposure to infection germs (e.g. chlamydia or gonococci). However, since in the industrialized countries the age of First-time mothers moving ever further back, there is a need for opportunities to improve fertility. This applies to the woman and also for him Man too. For couples with fertility disorders, assisted techniques are available today Reproduction available (in vitro fertilization (IVF); gamete intrafallopian transfer (GIFT), intrauterine insemination). However, these methods are invasive and in the in most cases with prior stimulation of follicular maturation in women Proteohormones (Follicle Stimulating Hormone / FSH) linked. This can be too unpleasant side effects such as headache or pain in the abdomen, in the worst case, however, also to the so-called ovarian hyperstimulation syndrome to lead.

Liegt das Problem der Infertilität auf der Seite des Mannes, so steht heute die Technik der Intracytoplasmatischen Injektion des Spermiums (ICSI) in die Eizelle zur Verfügung. Da bei dieser Methode jedoch auch "defekte" Spermien in die Eizelle injiziert werden können, birgt sie bisher noch nicht genau bekannte Gefahren von Mißbildungen oder sonstigen Entwicklungsstörungen des Embryos. If the problem of infertility is on the side of the man, the technology stands today intracytoplasmic sperm injection (ICSI) into the egg. However, since this method also "defective" sperm are injected into the egg can, it harbors hitherto unknown dangers of malformations or other developmental disorders of the embryo.  

Daher besteht die dringende Notwendigkeit neue Substanzen und Mittel zur Fertilitätskontrolle, das heißt sowohl zur Fertilitätsförderung als auch zur Fertilitätshemmung, sowohl für die Frau, als auch für den Mann, bereitzustellen.There is therefore an urgent need for new substances and agents Fertility control, that is, both for fertility promotion and for Provide fertility inhibition, both for women and for men.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zur Fertilitätskontrolle. Die Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur Induktion, Stimulation oder Hemmung des LH-abhängigen-Ovar-Proteins (LHOP) getestet wird. Dies geschieht vorzugsweise in hierzu geeigneten Testverfahren, bei denen die LHOP-Aktivität induziert, stimuliert oder gehemmt wird. Sowie die Verwendung dieser Substanzen zur Herstellung von die Fertilität kontrollierenden Mitteln.The present invention relates to methods for providing means for Fertility control. The process is characterized by the fact that a potential effective substance on its ability to induce, stimulate or inhibit the LH-dependent ovary protein (LHOP) is tested. This is preferably done in test methods suitable for this, in which the LHOP activity induces, stimulates or is inhibited. As well as the use of these substances to manufacture the Fertility control agents.

Des weiteren betrifft die Erfindung Mittel zur Fertilitätsförderung, welche mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur des LHOP enthalten.Furthermore, the invention relates to means for fertility promotion, which at least contain a portion of the amino acid primary structure of the LHOP.

Unter die Fertilität kontrollierende Mittel gemäß vorliegender Erfindung werden alle Mittel verstanden, die sich sowohl zur Fertilitätsförderung als auch zur Fertilitätshemmung, sowohl für die Frau, als auch für den Mann, eignen.Fertility control agents according to the present invention include all Understood means that are both for fertility promotion and Fertility inhibition, suitable for both women and men.

Unter stimulierenden Substanzen gemäß vorliegender Erfindung werden solche verstanden, die die LHOP-Enzymaktivität steigern.Stimulating substances according to the present invention include those understood that increase the LHOP enzyme activity.

Unter induzierenden Substanzen gemäß vorliegender Erfindung werden solche verstanden, die die LHOP mRNA oder Proteinmenge erhöhen.Inductive substances according to the present invention include those understood that increase the LHOP mRNA or amount of protein.

Unter hemmenden Substanzen gemäß vorliegender Erfindung werden solche verstanden, die die LHOP-Enzymaktivität herabsetzen und/oder hemmen und/oder die LHOP mRNA oder Proteinmenge vermindern.Inhibitory substances according to the present invention include such understood that reduce and / or inhibit LHOP enzyme activity and / or Reduce LHOP mRNA or amount of protein.

Mit Hilfe der Kombination von 2-dimensionaler Gelelektrophorese und nachfolgender Massenspektrometrie wurde ein Protein in Maus-Ovarien identifiziert, das durch das luteinisierende Hormon (LH) induziert wird. Eine Datenbanksuche zeigte, daß es sich dabei um ein Protein handelt, welches eine hohe Proteinsequenzhomologie zum Maus- Vas-Deferens-Protein (MVDP) und zum humanem ARL-1 (Cao et al. 1998, J. Biol. Chem. 273 : 11429-11435) zeigt. Das MVDP wurde zum ersten Mal von Taragnat et al., 1988 (J. Reprod. Fert. 83 : 835-842) in Samenleitern von männlichen Mäusen beschrieben. Mit den oben beschriebenen Methoden konnte ein neues Protein im Ovar (LH-abhängiges-Ovar-Protein; LHOP) nachgewiesen werden. Zudem konnte gezeigt werden, daß LHOP im Ovar unter der Kontrolle von LH spezifisch exprimiert wird. LH wird in der Mitte des Zyklus von der Hypophyse ausgeschüttet und bewirkt die meiotische Reifung der Eizelle sowie die Ovulation der Eizelle. Dies läßt darauf schließen, daß Substanzen, welche LHOP beeinflussen (stimulieren, induzieren oder hemmen) regulativ auf die Eizellreifung, die Follikelreifung, die Steroidogenese und/oder die Ovulation wirken.Using the combination of 2-dimensional gel electrophoresis and subsequent Mass spectrometry identified a protein in mouse ovaries that was identified by the Luteinizing hormone (LH) is induced. A database search showed that it was is a protein that has a high protein sequence homology for mouse Vas Deferens protein (MVDP) and for human ARL-1 (Cao et al. 1998, J. Biol. Chem. 273: 11429-11435). The MVDP was first developed by Taragnat et al., 1988 (J. Reprod. Fert. 83: 835-842) in the vas deferens of male mice described. With the methods described above, a new protein in the ovary (LH-dependent ovary protein; LHOP) can be detected. It also showed that LHOP is specifically expressed in the ovary under the control of LH. LH is released in the middle of the cycle by the pituitary gland and causes it meiotic maturation of the egg and ovulation of the egg. This suggests conclude that substances which influence (stimulate, induce or inhibit) regulating egg maturation, follicular maturation, steroidogenesis and / or the ovulation work.

Die Induktion von LHOP durch LH erfolgt sowohl auf der mRNA, als auch auf der Proteinebene. In einem Zeitverlauf konnte gezeigt werden, daß eine Induktion der mRNA bereits 2 h nach Applikation des LH beginnt. LHOP is induced by LH both on the mRNA and on the Protein level. Over time, it could be shown that an induction of the mRNA begins 2 hours after application of the LH.  

Sequenzvergleiche zeigten, daß das LHOP-Protein zur Familie der Aldo-Keto- Reduktasen gehört. Diese Gruppe von Enzymen reduziert Aldehyde oder Ketone von verschiedenen Substraten. Auch Steroide mit Aldehyd- oder Ketogruppe zählen zu den Substraten der Familie der Aldo-Keto-Reduktasen.Sequence comparisons showed that the LHOP protein belongs to the Aldo keto family Heard reductases. This group of enzymes reduces aldehydes or ketones from different substrates. Steroids with aldehyde or keto groups are also among them Substrates of the Aldo keto reductase family.

Eine Hemmung des LHOP (auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene) führt daher zu einer Hemmung der Eizellreifung, der Follikelreifung, der Steroidogenese und/oder der Ovulation. Eine Stimulierung des Proteins (auf mRNA, Protein- und/oder Enzymebene) oder eine Verabreichung des rekombinanten Proteins hat den gegenteiligen Effekt und fördert die Fertilität (z. B. bei Ovarialinsuffizienz oder beim Auftreten von polycystischen Ovarien).Inhibition of the LHOP (at the mRNA, protein and / or enzyme level) therefore leads to an inhibition of egg maturation, follicular maturation, steroidogenesis and / or Ovulation. A stimulation of the protein (at the mRNA, protein and / or enzyme level) or administration of the recombinant protein has the opposite effect and promotes fertility (e.g. in ovarian failure or when polycystic occurs Ovaries).

Es ist beim männlichen Tier (Maus) beschrieben, daß das dem LHO-Protein sehr ähnliche MVD-Protein in großen Mengen im Vas deferens vorkommt. Eine Hemmung des LHOP und/oder des MVDP wird somit die Reifung und/oder den Transport der Spermien durch den Vas Deferens negativ beeinflussen und zu einer Fertilitätshemmung führen. Eine Stimulierung des LHOP und/oder des MVDP oder Verabreichung von rekombinantem Protein hingegen hat den gegenteiligen Effekt und trägt zur Förderung der männlichen Fertilität bei.It is described in the male animal (mouse) that the LHO protein is very Similar MVD protein occurs in large quantities in the vas deferens. An inhibition of the LHOP and / or the MVDP is the maturation and / or the transport of the Sperm negatively affected by the Vas Deferens and become one Lead to fertility inhibition. A stimulation of the LHOP and / or the MVDP or Administration of recombinant protein, however, has the opposite effect and contributes to the promotion of male fertility.

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft Mittel zur Förderung der Fertilität, z. B. bei der in vitro oder in vivo Fertilisation, welche mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur oder das gesamte Protein des MVDP oder ARL-1 umfassen.A first aspect of the invention relates to means for promoting fertility, e.g. B. at in in vitro or in vivo fertilization, which involves at least a portion of the Amino acid primary structure or all of the protein of the MVDP or ARL-1.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Mittel zur Förderung der Fertilität, z. B. bei der in vitro oder in vivo Fertilisation, welche mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur oder das gesamte Protein des LHOP umfassen.Another aspect of the invention relates to means to promote fertility, e.g. B. at the in vitro or in vivo fertilization involving at least a portion of the Amino acid primary structure or all of the protein of the LHOP.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zur Fertilitätskontrolle. Die Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Induktion oder Hemmung des LHO-Proteins getestet wird. Dies geschieht vorzugsweise in hierzu geeigneten Testverfahren, bei denen die LHOP-Aktivität stimuliert oder gehemmt wird. Das Testverfahren kann beispielsweise als Hochdruckdurchsatz-Screeningverfahren automatisiert werden. Substanzen, die bei diesem Hochdruckdurchsatz- Screeningverfahren als LHOP hemmende oder stimulierende Substanzen identifiziert werden, können nachfolgend durch chemische Modifikation in ihrer Wirkung optimiert werden. Diese so gewonnenen Derivate lassen sich erfindungsgemäß einsetzen.Another aspect of the invention relates to methods for providing means for Fertility control. The process is characterized by the fact that a potential effective substance on its ability to specifically induce or inhibit the LHO protein is tested. This is preferably done in suitable for this Test procedures in which LHOP activity is stimulated or inhibited. The Test methods can be, for example, high-pressure throughput screening methods be automated. Substances that at this high pressure throughput Screening methods identified as LHOP inhibiting or stimulating substances can subsequently be optimized in their effect by chemical modification become. These derivatives obtained in this way can be used according to the invention.

Bei den so aufgefundenen Substanzen kann es sich um kleine Moleküle, Antisense- RNA, Ribozyme, GeneBloc oder weitere Substanzen handeln, welche Einfluß auf die Induktion der mRNA, des Proteins oder auch auf die enzymatische Aktivität des LHOP nehmen.The substances found in this way can be small molecules, antisense RNA, ribozymes, GeneBloc or other substances act which influence the Induction of the mRNA, the protein or also on the enzymatic activity of the LHOP to take.

So eignet sich insbesondere ein Enzymassay zum Auffinden von Substanzen, die die LHOP-Enzymaktivität (Reduktion von Aldehyden und Ketonen) stimulieren oder hemmen.An enzyme assay is particularly suitable for finding substances which Stimulate LHOP enzyme activity (reduction of aldehydes and ketones) or inhibit.

Zum Auffinden derartiger Substanzen wird das LHO-Protein gereinigt. Dazu kann beispielsweise der kodierende Bereich des lhop-Gens in einen Expressionsvektor insertiert werden und das Enzym in pro- oder eukaryontischen Zellen überexprimiert werden (Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, 1997, Vol. 2; p. 16.0.1). Das so gewonnene rekombinante Protein kann anschließend mit bekannten chromatographischen Methoden, zum Beispiel durch Größenausschluß- und/oder Kationen- und/oder Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt werden und nach Inkubation in Phosphatpuffer mit NADPH im Enzymtest eingesetzt werden.To find such substances, the LHO protein is purified. This can for example the coding region of the lhop gene into an expression vector be inserted and the enzyme overexpressed in pro- or eukaryotic cells  (Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, 1997, Vol. 2; p. 16.0.1). The recombinant protein obtained in this way can then be mixed with known proteins chromatographic methods, for example by size exclusion and / or Cation and / or anion exchange chromatography are purified and after Incubation in phosphate buffer with NADPH can be used in the enzyme test.

Mit Hilfe des beschriebenen Enzymassays können Substanzen ausgetestet werden, die die Reduktion von Substraten der LHOP-Aldo-Ketoreduktase stimulieren oder hemmen. Die so aufgefundenen stimulierenden Substanzen werden dann zur Herstellung von Mitteln zur Förderung der Fertilität bei der Frau und beim Mann verwendet. Die hemmenden Substanzen werden zur Herstellung von Mitteln, die Fertilität bei der Frau und/oder beim Mann hemmen, verwendet.With the help of the enzyme assay described, substances can be tested stimulate or inhibit the reduction of substrates of LHOP-Aldo ketoreductase. The stimulating substances found in this way are then used to produce Means used to promote fertility in women and men. The Inhibitory substances are used to manufacture fertility agents in women and / or inhibit the man used.

Des weiteren sind beispielsweise Antisense(AS)-Moleküle, Ribozyme (RB) oder "Genebloc Reagenzien" (GB) zur Hemmung von LHOP auf Ebene der Transkription geeignet.Furthermore, for example, antisense (AS) molecules, ribozymes (RB) or "Genebloc Reagent" (GB) for the inhibition of LHOP at the level of transcription suitable.

Die AS-, RB- oder GB-Moleküle, können beispielsweise mit dem Fachmann bekannten Methoden von der Sequenz des lhop-Gens abgeleitet werden und beispielsweise in geeigneten Zell- und/oder Tiermodellen auf ihre die Fertilität hemmende Wirksamkeit in vitro und/oder in vivo getestet werden.The AS, RB or GB molecules can, for example, be known to the person skilled in the art Methods are derived from the sequence of the lhop gene and, for example, in suitable cell and / or animal models for their fertility-inhibiting effectiveness in tested in vitro and / or in vivo.

Als Testverfahren zum Auffinden von Molekülen, die das LHOP auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene hemmen oder induzieren, eignet sich beispielsweise das Modell des perfundierten Ovars.As a test method for finding molecules that the LHOP on mRNA, protein and / or inhibit or induce enzyme level, the model is suitable, for example of the perfused ovary.

Beim Modell des perfundierten Ovars wird bei Ratten oder Mäusen das Ovar präpariert, wobei Infusionskatheter in die Aorta und Vena cava gelegt werden. Das Modell ist genau bei Brännström et al. 1987 (Acta Physiol. Scand. 130: 107-14) beschrieben. Mit Hilfe dieses Modells können Substanzen ausgetestet werden, die die LHOP-Expression auf mRNA Protein- und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren.In the model of the perfused ovary, the ovary is prepared in rats or mice, with infusion catheters placed in the aorta and vena cava. The model is exactly with Brännström et al. 1987 (Acta Physiol. Scand. 130: 107-14). With With the help of this model, substances that express LHOP can be tested inhibit or induce protein and / or enzyme level at the mRNA level.

Die so ausgetesteten hemmenden Substanzen werden dann zur Herstellung von Mitteln zur Fertilitätshemmung, die induzierenden werden zur Herstellung von Mitteln für die Fertilitätsförderung, sowohl beim Mann als auch bei der Frau, verwendet.The inhibitory substances tested in this way are then used to produce Anti-fertility agents that are used to manufacture agents for fertility promotion, both in men and women.

Zweckmäßigerweise werden pharmakologisch verträgliche Substanzen getestet. Hierzu zählen, wie bereits ausgeführt, niedermolekulare pharmakologische Wirkstoffe, insbesondere jedoch kleine Moleküle sowie AS/RB- oder GB-Moleküle.Appropriately, pharmacologically acceptable substances are tested. For this count, as already mentioned, low molecular weight pharmacological agents, in particular, however, small molecules as well as AS / RB or GB molecules.

Geeignete pharmazeutische Darreichungsformen enthalten den Wirkstoff in einer Menge, die entweder die Fertilität verhindert oder aber fördert.Suitable pharmaceutical dosage forms contain the active ingredient in one Amount that either prevents or promotes fertility.

Der Wirkstoff kann alleine oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen entweder gleichzeitig oder sequentiell verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann neben dem Wirkstoff weitere pharmazeutisch übliche Substanzen enthalten. Die Substanz kann entweder oral, nasal, transdermal, pulmonal oder parenteral, beispielsweise durch Injektion verabreicht werden. Weiterhin denkbar sind Implantate, sowie Vaginalringe oder intrauterine Systeme. The active ingredient can either alone or in combination with other active ingredients can be administered simultaneously or sequentially. The pharmaceutical In addition to the active ingredient, the composition can include other pharmaceutically customary ones Contain substances. The substance can be either oral, nasal, transdermal, pulmonary or administered parenterally, for example by injection. Still conceivable are implants, as well as vaginal rings or intrauterine systems.  

Oral verabreichbare Zusammensetzungen können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern oder Flüssigkeiten vorliegen. Durch Injektion verabreichbare Zusammensetzungen sind üblicherweise in Form einer parenteral verträglichen wässrigen Lösung oder Suspension.Orally administrable compositions can be in the form of tablets, capsules, Powders or liquids are present. Can be administered by injection Compositions are usually in the form of a parenterally acceptable one aqueous solution or suspension.

Schließlich betrifft die Erfindung noch ein Verfahren zur Förderung der Fertilität, wobei man einem Patienten, insbesondere einem humanen Patienten, eine wirksame Menge einer das LHO-Protein stimulierenden oder induzierenden Substanz verabreicht.Finally, the invention relates to a method for promoting fertility, wherein an effective amount to a patient, particularly a human patient a substance that stimulates or induces the LHO protein.

Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fertilitätshemmung, wobei man einem Patienten, insbesondere einem humanen Patienten, eine wirksame Menge einer das LHO-Protein hemmenden Substanz verabreicht.Furthermore, the invention relates to a method for inhibiting fertility, wherein a patient, particularly a human patient, an effective amount of a the LHO protein inhibitory substance.

Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fertilitätshemmung, wobei man einem Patienten, insbesondere einem humanen Patienten, eine wirksame Menge mindestens eines Abschnittes der Aminosäureprimärstruktur des LHOP, des MVDP oder des ARL-1 verabreicht.Furthermore, the invention relates to a method for inhibiting fertility, wherein an effective amount to a patient, particularly a human patient at least a portion of the amino acid primary structure of the LHOP, the MVDP or the ARL-1.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Antikörper, welche gegen mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur oder das gesamte Protein des LHOP des MVDP oder des ARL-1 gerichtet sind bzw. diese erkennen (Sambrook et al., 1989, Production of Antibodies 18.3; Plückthun, Bio/Technology 9 (1991), 545-551 und darin zitierte Literaturstellen). Sowie die Verwendung dieser Antikörper bzw. Mittel sowie Kits diese enthaltend zur Diagnose der Fertilität beim Mann oder der Frau.In a further aspect, the invention relates to antibodies which are at least against a portion of the primary amino acid structure or all of the LHOP des protein MVDP or ARL-1 are directed to or recognize them (Sambrook et al., 1989, Production of Antibodies 18.3; Plückthun, Bio / Technology 9 (1991), 545-551 and therein cited references). As well as the use of these antibodies or agents and kits containing these for the diagnosis of fertility in men or women.

Des weiteren betrifft die Erfindung Antisensemoleküle, welche gegen mindestens einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz oder die gesamte Sequenz des lhop, mvdp oder arl-1 gerichtet sind bzw. diese erkennen (Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser (Histochemistry 1993 Vol. 100, 431-440)). Sowie die Verwendung dieser Antisensemoleküle bzw. Mittel sowie Kits diese enthaltend zur Diagnose der Fertilität beim Mann oder der Frau.The invention further relates to antisense molecules which act against at least one Section of the nucleic acid sequence or the entire sequence of the lhop, mvdp or arl-1 or recognize them (Schaeren-Wiemers and Gerfin-Moser (Histochemistry 1993 Vol. 100, 431-440)). As well as the use of this Antisense molecules or agents as well as kits containing them for the diagnosis of fertility in men or women.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele und Figuren erläutert. Es zeigen:The invention is further illustrated by the following examples and figures. Show it:

Fig. 1 Identifizierung des LHO-Proteins im Ovar. Ovarien von immaturen, FSH-geprimten Mäusen (Alter: 19-23 Tage) wurden vor bzw. 14 h nach LH-Applikation entnommen und für die weitere Analytik präpariert. Mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Gelelektrophorese wurde ein Proteinspot detektiert, der unter LH-Einfluß signifikant variant exprimiert ist. Fig. 1 Identification of the LHO protein in the ovary. Ovaries from immature, FSH-primed mice (age: 19-23 days) were removed before or 14 h after LH application and prepared for further analysis. With the help of high-resolution two-dimensional gel electrophoresis, a protein spot was detected that was expressed significantly variant under the influence of LH.

Fig. 2 In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der lhop mRNA im Ovar der Maus. Ovarien von immaturen, FSH-geprimten Mäusen (Alter 19-25 Tage) wurden vor (A) bzw. nach LH-Applikation (B; 6 h nach LH-Behandlung) entnommen und in Tissue Teck zur Durchführung eine in-situ- Hybridisierung eingebettet. Mit Hilfe einer für die lhop mRNA-spezifischen Sonde konnte die lhop mRNA spezifisch in Ovarien (in Theca- und Stromazellen) nach LH-Behandlung nachgewiesen werden (B). Fig. 2 in situ hybridization to detect the lhop mRNA in the mouse ovary. Ovaries from immature, FSH-primed mice (age 19-25 days) were removed before (A) or after LH application (B; 6 h after LH treatment) and embedded in tissue teck for in situ hybridization . With the help of a probe specific for the lhop mRNA, the lhop mRNA could be detected specifically in ovaries (in theca and stromal cells) after LH treatment (B).

Fig. 3 Northern-Blot von Maus-Ovarien mRNA. Nach LH-Applikation konnte eine 300-fache Steigerung der lhop mRNA gemessen werden. Figure 3 Northern blot of mouse ovary mRNA. After LH application, a 300-fold increase in lhop mRNA was measured.

Fig. 4 Vergleich zwischen dem MVDP und ARL-1-Protein. Fig. 4 Comparison between the MVDP and ARL-1 protein.

BeispieleExamples 1) Enzymassay zum Austesten von Substanzen, die die LHOP-Enzymaktivität (Reduktion von Aldehyden und Ketonen) stimulieren1) Enzyme assay to test substances that have LHOP enzyme activity (Reduction of aldehydes and ketones) stimulate

Zum Austesten von LHOP stimulierenden Substanzen sollte das LHOP-Protein gereinigt werden. Dazu sollte der kodierende Bereich des LHOP-Gens in einen Expressionsvektor (z. B. pRSET, pTrcHis2-Topo, pBlueBacHis2/Invitrogen Groningen/Netherlands) insertiert werden und das Enzym in pro- oder eukaryontischen Zellen überexprimiert werden. Das so gewonnene rekombinante Protein sollte anschließend mit bekannten chromatischen Methoden (z. B. Verwendung von Pro-Bond Nickel-Chelating Harz/Invitrogen) aufgereinigt und in dem nachfolgend beschriebenen Enzymtest eingesetzt werden. Zunächst wird das aufgereinigte Protein (0,5-2,5 µg) in 135 mM Natrium- Phosphatpuffer (pH 6,2) mit 0,2 mM NADPH und 0,3 M Lithiumsulfat inkubiert. Die Abnahme von NADPH zu NADP wird am Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt. Eines der Standardsubstrate für Aldo- Ketoreduktasen ist DL-glyceraldehyde. Mit Hilfe des beschriebenen Enzymassays können Substanzen ausgetestet werden, die die Reduktion von Substraten der LHOP-Aldo-Ketoreduktase stimulieren.The LHOP protein should be used to test LHOP stimulating substances getting cleaned. To do this, the coding region of the LHOP gene should be divided into one Expression vector (e.g. pRSET, pTrcHis2-Topo, pBlueBacHis2 / Invitrogen Groningen / Netherlands) and the enzyme in pro- or eukaryotic cells are overexpressed. The so won recombinant protein should then be used with known chromatic Methods (e.g. use of Pro-Bond nickel chelating resin / Invitrogen) purified and used in the enzyme test described below become. First, the purified protein (0.5-2.5 µg) in 135 mM sodium Incubate phosphate buffer (pH 6.2) with 0.2 mM NADPH and 0.3 M lithium sulfate. The decrease from NADPH to NADP is measured on a spectrophotometer Wavelength of 340 nm tracked. One of the standard substrates for aldo Ketoreductases is DL-glyceraldehyde. With the help of the described Enzyme assays can be tested for substances that reduce Stimulate substrates of LHOP aldo ketoreductase.

2) Enzymassay zum Austesten von Substanzen, die die LHOP-Enzymaktivität (Reduktion von Aldehyden und Ketonen) hemmen2) Enzyme assay to test substances that have LHOP enzyme activity Inhibit (reduction of aldehydes and ketones)

Der oben beschriebene Enzymassay sollte analog wie unter 1) beschrieben eingesetzt werden, um Substanzen aufzufinden, die die LHOP-Aktivität hemmen.The enzyme assay described above should be analogous to that described under 1) used to find substances that inhibit LHOP activity.

3) Einsatz von Antisense(AS)-Molekülen, Ribozymen (RB) oder "Genebloc- Reagenzien" (GB) zur Hemmung der LHOP-Transkription3) Use of antisense (AS) molecules, ribozymes (RB) or "Genebloc- Reagents "(GB) to inhibit LHOP transcription

AS-, RB- oder GB-Moleküle sollten mit Hilfe geeigneter Computerprogramme von der c-DNA Sequenz des lhop Gens abgeleitet werden. Die AS, RB oder GB Moleküle sollten dann in mit Hilfe von Alzet-pumps bei der Maus in vivo appliziert (Dosierung 3-30 mg/kg) werden. Zur Identifizierung derjenigen AS, RB oder GB-Moleküle, die eine Transkription der lhop mRNA inhibieren, wird die Methode der in situ Hybrisierung eingesetzt. Dazu werden die Ovarien der behandelten Tiere entnommen und in Tissue Teck eingebettet. Nachfolgend wird eine in situ-Hybridisierung mit lhop-spezifischen Sonden nach Schaeren- Wiemers und Gerfin-Moser (Histochemistry 1993 Vol. 100, 431-440) durchgeführt. Die AS, RB oder GB Moleküle können alternativ in vitro appliziert werden. Dazu wird eine Follikelkultur von reifen Follikeln (genaue Beschreibung siehe Fehrenbach et al., J Reprod Fertil. 1998 Jul; 113(2): 287-97) angelegt und die o. g. Moleküle werden der Kultur zugesetzt. Durch beide Methoden Applikation von lhop-spezifischen AS, RB oder GB Molekülen in vitro oder in vivo können AS, RB oder GB Moleküle identifiziert werden, die die Bildung der lhop mRNA hemmen. Diese Moleküle können dann beim Menschen eingesetzt werden, wo es zu einer Hemmung der Follikelreifung, Eizellreifung und/oder der Ovulation bei der Frau kommt. Werden diese Moleküle beim Mann in vivo appliziert, wird die Reifung der Spermien und/oder der Transport durch den Vas Deferens gehemmt. Spezifische AS, RB oder GB Moleküle, die die Transkription der lhop mRNA hemmen, können als Kontrazeptiva beim Mann und bei der Frau eingesetzt werden.AS, RB or GB molecules should be used with the help of suitable computer programs from the c-DNA sequence of the lhop gene. The AS, RB or GB Molecules should then be in vivo using Alzet pumps in the mouse applied (dosage 3-30 mg / kg). To identify those AS, RB or GB molecules that inhibit transcription of the lhop mRNA, the Method of in situ hybridization used. To do this, the ovaries of the removed from treated animals and embedded in tissue teck. Below is in situ hybridization with lhop-specific probes according to Schaeren Wiemers and Gerfin-Moser (Histochemistry 1993 Vol. 100, 431-440) carried out. The AS, RB or GB molecules can alternatively be applied in vitro  become. For this purpose, a follicle culture of mature follicles (exact description see Fehrenbach et al., J Reprod Fertil. 1998 Jul; 113 (2): 287-97) and the above Molecules are added to the culture. By both methods Application of lhop-specific AS, RB or GB molecules in vitro or in vivo AS, RB or GB molecules can be identified that contribute to the formation of the lhop inhibit mRNA. These molecules can then be used in humans where there is an inhibition of follicular maturation, egg maturation and / or the Ovulation in women is coming. These molecules are used in men in vivo Applied, the maturation of the sperm and / or the transport by the vas Deferens inhibited. Specific AS, RB or GB molecules that transcribe The lhop can inhibit mRNA as contraceptives in men and women be used.

4) Beim Modell der perfundierten Ovars wird das Ovar von Ratten oder Mäusen präpariert, wobei Infusionskatheter in die Aorta und Vena cava gelegt werden4) In the model of the perfused ovary, the ovary is from rats or mice prepared, with infusion catheters placed in the aorta and vena cava

Das Modell ist genau bei Brännström et al. 1987 (Acta Physiol. Scand. 130: 107-­ 14) beschrieben. Mit Hilfe dieses Modells können Substanzen aufgefunden werden, die die LHOP-Expression auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren. Die so aufgefundenen hemmenden Substanzen sind zur Fertilitätshemmung, die induzierenden sind zur Fertilitätsförderung, sowohl beim Mann als auch bei der Frau, geeignet.The model is exactly from Brännström et al. 1987 (Acta Physiol. Scand. 130: 107- 14). With the help of this model substances can be found be the LHOP expression at the mRNA, protein and / or enzyme level inhibit or induce. The inhibitory substances found in this way are for fertility inhibition, which are inducible for fertility promotion, both suitable for both men and women.

5) Auffinden von Substanzen, die das LHOP auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene hemmen oder induzieren, mittels des Modells der hypophysektomierten Ratte5) Finding substances that the LHOP on mRNA, protein and / or Inhibit or induce enzyme level using the model of hypophysectomized rat

Das Modell der hypophysektomierten Ratte ist von JS Richard, 1980 (Physiol. Rev. 60: 51-89) ausführlich beschrieben worden. Bei diesem Modell wird die Follikelreifung und die Ovulation durch ein genau definiertes Hormonregime (siehe Literaturstelle oben) induziert. Die Injektion von 17-β-Estradiol gefolgt von Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) stimuliert die Follikelreifung, die nachfolgende Injektion von LH triggert die Eizellreifung, Steroidogenese und die Ovulation. Mit Hilfe dieses Modells können Substanzen aufgefunden werden, die die LHOP-Expression auf mRNA-, Protein- und /oder Enzymebene inhibieren oder induzieren. Die so aufgefundenen hemmenden Substanzen sind zur Fertilitätshemmung, die induzierenden zur Fertilitätsförderung, sowohl beim Mann als auch bei der Frau, geeignet.The hypophysectomized rat model is from JS Richard, 1980 (Physiol. Rev. 60: 51-89) has been described in detail. In this model the Follicle maturation and ovulation through a precisely defined hormone regime (see reference above). The injection of 17-β-estradiol followed by Follicle stimulating hormone (FSH) stimulates follicular maturation subsequent injection of LH triggers egg maturation, steroidogenesis and Ovulation. With the help of this model, substances can be found that inhibit LHOP expression at the mRNA, protein and / or enzyme level or induce. The inhibitory substances found in this way are for Fertility inhibition that induces fertility promotion, both in Suitable for both men and women.

6) Auffinden von Substanzen, die das LHOP auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene hemmen oder induzieren, mittels des Modells der immaturen Ratte6) Finding substances that the LHOP on mRNA, protein and / or Inhibit or induce enzyme level using the model of the immature rat

Im Modell der immaturen Ratte wird duch Injektion von 5-10 IU (FSH) die Follikelreifung synchron in vielen Follikeln des Ovars induziert. Nach 48 h wird mit 10 I.U. LH die Eizellreifung, Steroidogenese und Ovulation ausgelöst. Mit Hilfe dieses Modells können ebenfalls Substanzen gefunden werden, die die LHOP-Expression auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren. Die so aufgefundenen Substanzen können zur Fertilitätskontrolle beim Mann und bei der Frau eingesetzt werden.In the immature rat model, injection of 5-10 IU (FSH) is used Follicular maturation induced synchronously in many ovary follicles. After 48 h with 10 I.U. LH triggered egg maturation, steroidogenesis and ovulation. With Using this model, substances can also be found that the Inhibit LHOP expression at the mRNA, protein and / or enzyme level or induce. The substances found in this way can be used for fertility control used in men and women.

Claims (9)

1. LHOP umfassend mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur zur Herstellung von die Fertilität fördernden oder hemmenden Mitteln.1. LHOP comprising at least a portion of the amino acid primary structure Manufacture of fertility-promoting or inhibitory agents. 2. Verwendung von LHOP-spezifischen Antikörpern zur Diagnose der Fertilität.2. Use of LHOP-specific antibodies to diagnose fertility. 3. Verwendung von Substanzen, die spezifisch das LHOP hemmen, zur Herstellung von die Fertilität hemmenden Mitteln.3. Use of substances that specifically inhibit the LHOP for production of fertility inhibitors. 4. Verwendung von Substanzen, die spezifisch das LHOP induzieren oder stimulieren, zur Herstellung von die Fertilität fördernden Mitteln.4. Use of substances that specifically induce or stimulate LHOP, for the production of fertility-promoting agents. 5. Verfahren zur Bereitstellung von die Fertilität fördernden Mitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Induktion oder Stimulation des LHOP testet und bei einem positiven Testergebnis die Substanz in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffen, überführt.5. procedures for the provision of fertility-promoting funds, characterized, that a potentially effective substance is based on its ability to specific Induction or stimulation of the LHOP tests and with a positive test result the substance in a suitable for pharmaceutical applications Dosage form, possibly together with usual auxiliary, additional and Carriers transferred. 6. Verfahren zur Bereitstellung von die Fertilität hemmenden Mitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Hemmung des LHOP testet und bei einem positiven Testergebnis die Substanz in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffen, überführt.6. procedures for the provision of fertility inhibitors, characterized, that a potentially effective substance is based on its ability to specific Inhibition of LHOP tests and with a positive test result the substance in a dosage form suitable for pharmaceutical applications, optionally transferred together with conventional auxiliaries, additives and carriers. 7. Verfahren zur Förderung der Fertilität, dadurch gekennzeichnet, daß man eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Induktion des LHOP testet und bei einem positiven Testergebnis die Substanz in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffen, überführt und einem Patienten verabreicht.7. procedures to promote fertility, characterized, that a potentially effective substance is based on its ability to specific Induction of the LHOP tests and with a positive test result the substance in a dosage form suitable for pharmaceutical applications, optionally transferred together with conventional auxiliaries, additives and carriers and administered to a patient. 8. Verfahren zur Fertilitätshemmung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Hemmung des LHOP testet und bei einem positiven Testergebnis die Substanz in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffen, überführt und einem Patienten verabreicht.8. methods of inhibiting fertility, characterized, that a potentially effective substance is based on its ability to specific Inhibition of LHOP tests and with a positive test result the substance in a dosage form suitable for pharmaceutical applications, optionally transferred together with conventional auxiliaries, additives and carriers and administered to a patient. 9. Verfahren zur Förderung der Fertilität, dadurch gekennzeichnet, daß das LHOP umfassend mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffen, überführt und einem Patienten verabreicht wird.9. procedures to promote fertility, characterized, that the LHOP includes at least a portion of the Amino acid primary structure in a suitable for pharmaceutical applications Dosage form, possibly together with usual auxiliary, additional and Carriers, transferred and administered to a patient.
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