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DE19908883A1 - Verfahren zur Erhöhung der Auflösung optischer Abbildung - Google Patents

Verfahren zur Erhöhung der Auflösung optischer Abbildung

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DE19908883A1
DE19908883A1 DE1999108883 DE19908883A DE19908883A1 DE 19908883 A1 DE19908883 A1 DE 19908883A1 DE 1999108883 DE1999108883 DE 1999108883 DE 19908883 A DE19908883 A DE 19908883A DE 19908883 A1 DE19908883 A1 DE 19908883A1
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Rainer Heintzmann
Christoph Cremer
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Abstract

Technische Aufgabe und Zielsetzung DOLLAR A In den üblichen Verfahren optischer Abbildung ist die erreichbare Auflösung durch die numerische Apertur der Linse und die Wellenlänge des abbildenden Lichts begrenzt. Dieses drückt sich darin aus, daß nur ein kleiner Bereich von Raumfrequenzen, aus denen sich das Objekt (über Fouriertransformation) zusammengesetzt denken läßt, durch das optische System übertragen werden kann. Das neue Verfahren soll es ermöglichen, diesen übertragenen Raumfrequenzbereich substantiell zu erweitern, um damit unter anderem die Auflösung der Abbildung zu erhöhen. DOLLAR A Lösung des Problems DOLLAR A Durch Ausnutzen eines nichtlinearen Zusammenhangs zwischen im Objekt emittiertem Licht und dem lokalen Wert einer weiteren räumlich veränderlichen Größe (z. B. der lokalen Einstrahlungsintensität) läßt sich der übertragbare Raumfrequenzbereich beträchtlich erweitern. Durch lokale Variation dieser Einflußgröße und die Aufnahme verschiedener Bilder läßt sich ein Bild des Objekts rekonstruieren, dessen Auflösung auf Grund der Nichtlinearität fundamental höher ist als die durch das Abbe-Limit gegebene. In der Erfindung werden verschiedene Möglichkeiten beschrieben, solche nichtlinearen Effekte zu erzeugen und verschiedene Arten der Datenauswertung, um Bilder zu rekonstruieren. DOLLAR A Anwendungsgebiet DOLLAR A Die Verbesserung der Auflösung optisch abbildender Systeme (z. B. im Bereich der mikroskopischen Analyse in der Biologie oder Halbleitertechnik).

Description

1. Grundlagen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lichtmikroskopie entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs I.

Die Auflösung von optischen Systemen, wird oft wesentlich durch die objektseitige Aper­ tur der Objektivlinse/n bestimmt. Licht, welches vom Objekt abgestrahlt wird, wird nur detektiert, wenn es innerhalb des Akzeptanzwinkels des Objektivs auf dieses trifft. Die Auflösung eines Lichtmikroskops hängt bekannterweise von dem Bereich ab, in dem die lichtoptische Transferfunktion (OTF) des Systems nicht verschwindet. Die OTF gibt an, welche Raumfrequenzen, aus denen sich das Objekt (über Fouriertransformation) zusam­ mengesetzt denken läßt, während der optischen Abbildung erhalten bleiben, und wie sie dabei geschwächt werden. Verschwindet die OFT an Stellen im reziproken Raum vollstän­ dig, so ist es unmöglich, ohne Annahmen über die Struktur des Objektes zu machen, diese Raumfrequenzen in einem Bild zu rekonstruieren. Eine Ausdehnung der OTF auf einen möglichst großen Bereich ist also anzustreben, um die Auflösung des optischen Systems zu erhöhen.

In der Fluoreszenzmikroskopie emittieren Fluoreszenzfarbstoffe mit einer Intensität, die in erster Näherung proportional zur Intensität des am Ort des Farbstoffes eingestrahlten Lichts ist. Sie tun das im Gegensatz zur Absorptionsmikroskopie, Reflexionsmikroskopie oder auch Phasenkontrastmikroskopie inkohärent zueinander. Wenn man annimmt, daß an einem Punkt im Objekt die ausgestrahlte Fluoreszenzintensität proportional ist zu der dort eingestrahlten Lichtintensität, so läßt sich ein gemessenes Bild Im() (rückübersetzt in Objektraumkoordinaten ) beschreiben, indem man die ortsabhängige Beleuchtungsin­ tensität (Bel()) mit der dort vorhandenen Farbstoffkonzentration Obj() multipliziert und das Ergebnis mit der Punktbildfunktion ("point spread function" PSF) des abbildenden Systems faltet.

Im reziproken Raum übersetzt sich dies in die Faltung der fouriertransformierten Beleuch­ tungsfunktion F(Bel()) mit der fouriertransformierten Objektfunktion F(Obj() und anschließende Multiplikation mit der lichtoptischen Transferfunktion OTF(). F bezeich­ net hier und im folgenden die Fouriertransformation. Die Koordinaten im reziproken Raum werden mit bezeichnet.

Allgemeiner lassen sich viele Mikroskopieverfahren mit der Formel 1 beschreiben, wenn man unter Obj() die jeweilige Dichte der Eigenschaft des Objekts versteht, dies es zu untersuchen gilt und unter PSF() die effektive Punktbildfunktion des gesamten Systems (Bildaufnahme und -rekonstruktion). Bei iterativen oder nichtlinearen Rekonstruktions­ verfahren gilt dies oft noch näherungsweise.

In üblichen abbildenden Systemen ist der im Wert von Null verschiedene Bereich (der Träger) der OTF durch die numerische Apertur und die Wellenlänge des abzubildenden Lichts auf einen gewissen Bereich eingeschränkt (für genauere Herleitungen und Erläute­ rungen siehe US-Patent US 5671085). Gleichermaßen ist auch die Fouriertransformierte der Beleuchtungsfunktion F(Bel() in der Ausdehnung ihres Trägers durch die Licht­ wellenlänge und, gegebenenfalls, Aperturen des Beleuchtungssystems eingeschränkt.

2. Stand der Technik 2.1 Existente Verfahren

In den letzten Jahren wurden verschiedentlich Systeme ersonnen, um die Auflösung zu verbessern. Dabei spielt die geeignete Wahl der Beleuchtung des Objekts eine große Rolle. So wird beim konfokalen Mikroskop mit einem fokussiertem Lichtstrahl das Objekt von einer Seite möglichst punktweise beleuchtet (Patent US 4631581) und geeignet abgetastet (gescannt), wobei oft die Detektion mittels einer Blende auf einen kleinen Bereich des Objekts begrenzt wird.

Beim 4Pi-Mikroskop (Patent EP 0491289 A1) wird von beiden Seiten des Objektes kohä­ rent beleuchtet und je nach Ausführung auch detektiert. Beim Wellenfeldmikroskop wird üblicherweise mit kohärenten ebenen Lichtwellen von gegenüber liegenden Seiten beleuchtet (Patent US 4621911, [8][9]). Beim I5M-Mikroskop wird sowohl kohärent von zwei Seiten beleuchtet als an auch kohärent detektiert (Patent US [1], [2]) indem die beiden Bilder des Objekts auf einem ortsauflösenden Detektor zur Interferenz gebracht werden.

Das Theta-Mikroskop ([12], [10]) detektiert Licht von 3 Seiten und kann mit konfokaler oder 4Pi-ähnlicher Beleuchtung arbeiten. Da bei der Detektion "von der Seite" die Auflösung entlang der optischen Achse der Beleuchtung besonders groß ist erhält man insgesamt ein kleineres Fokusvolumen.

Des weiteren wurden in der stereomikroskopischen Oberflächentopographie Verfahren un­ ter Benutzung von räumlich variierender Beleuchtung (z. B. sinusförmig) eingesetzt. Durch Verrechnung der beiden gemessenen Bilder kann dann sehr genau auf die Oberflächenstruk­ tur geschlossen werden (Patent US 4525858, [16]).

Ein Verfahren, daß "optisches Schneiden" und somit hochauflösende dreidimensionale Bild­ gebung ähnlich des konfokalen Mikroskops ermöglicht ist durch Patent WO 97/31282 be­ kannt geworden. Es basiert auf der Aufnahme mehrerer Bilder mit jeweils unterschiedli­ chem Muster aus Beleuchtungslochblenden und zugehörigen Detektionslochblenden. Durch geeignete Rekonstruktionsverfahren läßt sich aus den aufgenommenen Daten ein Bild be­ rechnen, das dem eines konfokalen Mikroskops äquivalent ist (aperture correlation micros­ copy, siehe auch [7], [15]). In Patent WO 98/45745 ist ein Verfahren beschrieben, welches auf Beleuchtung unter Abbildung eines Beugungsgitters oder auf zwei interferierenden La­ serstrahlen beruht (siehe auch [14]). Zur lateralen Auflösungserhöhung wurde ein ähnliches Verfahren eingesetzt in [4].

Es gibt Verfahren, die sich auf nichtlineare Effekte in der Mikroskopie beziehen. Zu nennen ist hier die Mehrphotonen Mikroskopie (Patent US 5034613, Patent US 5777732, [6], [3], Patent US 5828459). Hier wird ein konfokaler Effekt erreicht durch die gleichzeitige Ab­ sorption mehrere Photonen mit entsprechend reduzierten Energien. Andere Techniken be­ nutzen die stimulierte Emission (Patent US 5731588, DE 44 16 558 A1) oder das Entfölkern des Grundzustandes der Fluoreszenzmoleküle, indem diese bewußt in den längerlebigen Tripplettzustand gepumpt werden [5].

2.2 Nachteile existenter Verfahren

Die beschriebenen Verfahren bringen alle recht großen technischen Aufwand mit sich. So gestaltet sich die Justierung von 4Pi, I5M und Thetamikroskop sehr schwierig. Die Verfah­ ren sind zudem auch aufwendig in der Herstellung, da sie sich nur unter oft großem Aufwand in vorhandene Mikroskopsysteme integrieren lassen. Beim Wellenfeldmikroskop ist es ein großes Problem, daß die OTF in axialer Richtung Bereiche aufweist, an denen sie verschwin­ det. Desweiteren bringt das Wellenfeldmikroskop, wie auch 4Pi-Mikroskopie in lateraler Richtung keinen Auflösungsgewinn gegenüber herkömmlicher Epi-Fluoreszenzmikroskopie bzw. konfokaler Fluoreszenzmikroskie.

Viele Verfahren (konfokale Laserscanning-, 4Pi-, Thetamikroskopie) sind damit verbunden, daß das Objekt punktweise abgerastert wird. Dies nimmt Zeit in Anspruch und bereitet insbesondere bei der Bildgebung zeitabhängiger Vorgänge Probleme. Außerdem benötigen abtastende Verfahren sehr schnelle Detektoren (z. B. Photomultiplier), die aber gegenüber langsameren Detektoren mit Ortsauflösung (z. B. CCDs) oft eine deutlich niedrigere De­ tektionseffizienz haben. Bei der Fluoreszenzmikroskopie kommt noch erschwerend hinzu, daß die sinnvolle Beleuchtungsstärke durch die maximale Anregungsrate der Farbstoffe im Fokus begrenzt ist, was der maximalen Abtastgeschwindigkeit weitere Grenzen setzt.

Bei den topographischen Verfahren wurde bisher nicht erkannt, daß eine ähnliche Ver­ suchsanordnung in der hochauflösenden Mikroskopie dazu imstande wäre, lateral und axial den Bereich der gemessenen Raumfrequenzen beträchtlich zu erweitern, insbesondere wenn nichtlineare Effekte ausgenutzt werden.

Verfahren, die nichtlineare optische Effekte ausnutzen, konnten bisher keine große Auflö­ sungserhöhung demonstrieren. Dies hängt auch damit zusammen, daß man mit entspre­ chend längeren Wellenlängen arbeiten muß, um Mehrphotonen Übergänge zu erreichen. Außerdem ist der Übertragungseffizienz bei hohen Raumfrequenzen im allgemeinen sehr schlecht, weil üblicherweise nur ein sehr kleiner Teil der Beleuchtungsintensität hohe Raum­ frequenzen enthält.

3. Ziel

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, das es ermöglicht, eine hohe Auflösung in optisch Abbildenden Systemen zu erzielen. Ein weiteres Ziel ist es bekannte mikroskopische Verfahren unter Beibehaltung ihrer jeweiligen Vorteile so zu erweitern, daß deren Auflösung zusätzlich gesteigert wird.

Diese Aufgabe wird durch Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.

3.1 Genauere Erläuterung des Verfahrens

In Anspruch 1 wird ein allgemeines Verfahren beschrieben, daß es ermöglicht den ef­ fektiven Bereich von detektierbaren Raumfrequenzen des Objekts F (Obj()) (Objekt- Raumfrequenzen) beträchtlich zu erweitern. Dabei wird ausgenutzt, daß unter gewissen Bedingungen die Formel 1 verallgemeinert werden muß zu

Es wird also kein linearer Zusammenhang mehr vorausgesetzt zwischen der von einem Ob­ jektpunkt ausgehenden Lichtintensität Iem() und der dort eingestrahlten Lichtintensität (enthalten in ()). Vielmehr ist nun Iem() eine allgemeine Funktion von der Dichte der zu untersuchenden Objekteigenschaft und anderen Faktoren (), die im Folgenden als nichtlineare Bedingungen bezeichnet werden. Der Vektorpfeil über soll andeuten, daß es sich um mehrere Bedingungen bi handeln kann. Ein wichtiger dieser Faktoren ist nach wie vor die eingestrahlte Lichtintensität an diesem Ort Bel (). Man kann nun Iem() als Taylorreihe mit konstanten Koeffizienten ci nähern:

der Einfachheit halber wurde hier nur eine nichtlineare Bedingung b1() berücksichtigt. Sind noch andere solche Bedingungen in den Prozeß der Aussendung von Licht von diesem Punkt involviert, so treten natürlich die entsprechenden Terme auch in dieser Entwick­ lung auf (insbesondere auch Mischterme wie c5b.Obj().b1().b2()). Der Term hinter c3 ist gerade der in Formel 1 genannte, wenn man als nichtlineare Bedingung b1() = Bel() annimmt. Die Fouriertransformierte der ausgesandten Lichtintensität F(Iem(Obj(), ()) enthält demnach analog zu Formel 1 den Term c3.F(Bel())⊗ F(Obj().

Man kann sich nun F(Bel()) in eine Summe einzelner δ-Funktionen zerlegt denken. Je nach Beleuchtungsmuster werden also Teile der Fouriertransformierten Objektfunkti­ on durch die Faltung mit der fouriertransformierten Beleuchtungsfunktion verschoben und mit entsprechendem Gewicht aufaddiert (siehe Abb. 1). Aus dieser Summe wird durch die optische Abbildung (die folgende Multiplikation mit der raumfrequenzbegrenz­ ten OTF()) gewissermaßen der detektierbare Bereich "ausgestanzt". Der Bereich detek­ tierbarer Objekt-Raumfrequenzen ist bei Beleuchtung mit einem Muster dadurch schon deutlich gegenüber dem Fall einer gleichmäßigen Beleuchtung erweitert. Mit entsprechen­ den Rekonstruktionsverfahren lassen sich die verschobenen Objekt-Raumfrequenzen wieder zu einem konsistenten Bild zusammensetzen (siehe [4]).

Außerdem treten jetzt aber auch Terme höherer Ordnung in b1() auf, wie hinter c5 und c6 in Formel 4. Deren Fouriertransformierte sind dann auch in F(Iem(Obj(), ())) enthalten. Wenn also b1() = Bel() erhält man in Formel 2 auch den Term: c5. [F(Bel()) ⊗ F(Bel())] ⊗ F(Obj()). Mit einem gewissen Anteil im Bild ist es jetzt möglich Raumfrequenzen des Objekts zu messen, die vorher nicht zugänglich waren, da sie durch die Faltung mit der raumfrequenzbegrenzten Funktion F(Bel()) noch nicht in den mittels OTF() detektierbaren Bereich geschoben werden konnten. Die Ausdehnung des Trägers von F(Bel()) ⊗ F(Bel() kann nun aber entsprechend größer sein, wodurch sich entsprechend höhere Raumfrequenzen in den durch OTF() detektierbaren Bereich schieben und so im Bild meßbar sind. Noch höhere Ordnungen wirken sich entsprechend in weiteren Faltungen mit den Fouriertransformierten der bi() aus, so daß entsprechend noch höhere Objekt-Raumfrequenzen detektierbar sind. Im Prinzip ist es damit möglich beliebig hohe Raumfrequenzen des Objekts zu detektieren und somit die Auflösung belie­ big zu erhöhen, wenn entsprechende Koeffizienten in der Reihenentwicklung 4 vorhanden sind. In den meisten Fällen wird die bei Rekonstruktion erzielbare praktische Auflösung aber oft durch das bei diesen hohen Objekt-Raumfrequenzen erreichbare Signal zu Rausch Verhältnis begrenzt.

3.2 Rekonstruktion aus Meßdaten

Hat man Daten gemessen, welche die gewünschten Objekt-Raumfrequenzen enthalten ist es sinnvoll diese zu einem konsistenten Bild zusammenzusetzen. Dazu muß es allerdings möglich sein die Funktionen bi() vom der das Objekt beschreibenden Funktion Obj() zu unterscheiden. Das bedeutet, daß man diese am Punkte variieren muß. Dies kann auf unterschiedliche Arten geschehen. Eine Möglichkeit ist es bi() als ein räumliches Muster auszubilden, daß dann gegenüber dem Objekt zwischen unterschiedlichen Einzelbildern verschoben wird. Des weiteren kann man aber z. B. auch die Stärke dieses Musters oder dessen Form zwischen der Aufnahme von Einzelbildern verändern, wodurch die in der Taylorentwicklung 4 gezeigten Komponenten auch unterscheidbar werden.

Eine Rekonstruktion eines hochauflösenden Bildes kann nun auf verschiedene Arten ge­ schehen. In einer direkten Variante werden die in der oben gezeigten Taylorentwicklung enthaltenen Terme, so weit sie meßbaren Einfluß haben, durch das Lösen eines Gleichungs­ systems ermittelt und so voneinander getrennt. Die Multiplikation mit der OTF verhindert nicht, daß es möglich ist an jedem Punkt im Bereich des Trägers der OTF im reziproken Raum dieses Gleichungssystem zu bestimmen und im Prinzip zu lösen. Durch Verschiebung im Fourierraum (oder Multiplikation mit exp(i) im Ortsraum mit Frequenzraum- Verschiebevektor ) können die individuellen Komponenten dann so zusammengesetzt werden, daß sich ein hochauflösendes Bild ergibt. Dieses kann dann mit weiteren Dekon­ volutionstechniken verarbeitet werden um die Qualität des Bildes weiter zu steigern.

Beleuchtung mit einem Muster aus möglichst hohen Raumfrequenzen ermöglicht eine große Auflösungserhöhung gegenüber der herkömmlichen Lichtmikroskopie (siehe auch Patent US 5671085). Durch Ausnutzung eines nichtlinearen Zusammenhangs zwischen der Stär­ ke eines Musters an einem Objektpunkt und der von diesem Objektpunkt ausgehenden (emmitierten bzw. gestreuten) Lichtintensität, ist es möglich ein Bild mit noch höherer Ortsauflösung zu berechnen. Als Beispiel läßt sich dieses Muster durch Anregung von Fluo­ reszenz mit einer ortsabhängigen Verteilung intensivem Lichts erzeugen. Die nichtlineare Abhängigkeit kann dann z. B. durch die Sättigung der Anregung von im Objekt vorhande­ nen Fluoreszenzfarbstoffen entsteht. Ist dabei das eingestrahlte Licht intensiv genug, erhält man einen nichtlinearen Zusammenhang der an einem Punkt emmitierten Lichtintensität von der an diesem Punkt eingestrahlten Lichtintensität (siehe [11] und [13]). Das detek­ tierte Licht enthält nun auch Information über Raumfrequenzen des Objekts, die sonst nicht zugänglich wären. Allerdings enthält jedes so aufgenommene Bild eine Mischung von Anteilen hoher Raumfrequenzen, die aber dann durch Aufnahme unter unterschiedlichen Bedingungen und Verrechnung mehrerer solcher Bilder getrennt und zu einem konsistenten hochauflösenden Bild zusammengesetzt werden können.

Um z. B. im Fall der Fluoreszenzmikroskopie bei Beleuchtung mit einer einem Liniengitter ähnlichen Struktur ein Bild zu rekonstruieren, kommt man wie folgt zu einem Gleichungs­ system:
Die Intensitätsverteilung des anregenden Lichts lasse sich in diesem Beispiel durch eine in den positiven Bereich verschobene Sinusfunktion beschreiben. Als Fouriertransformier­ te ergeben sich dann drei im Idealfall punktförmige Maxima bei = 0, = + und = - (Abb. 1). Diese Maxima haben je nach Modulationsgrad eine Intensität und einen jeweiligen Phasenwinkel in der komplexen Ebene, der von der Verschiebung diese Musters abhängt. Durch den Einfluß der nichtlinearen Abhängigkeit der Emissionsintensi­ tät von der Beleuchtungsintensität (Sättigung der Fluoreszenz) ergibt sich ein Muster der Anregbarkeit von Fluoreszenz eines bestimmten Farbstoffes, welches aus im Prinzip unend­ lich vielen Maxima im reziproken Raum besteht, deren absolute Höhe aber mit steigendem schnell abnimmt (siehe Abb. 2). Näherungsweise kann man Rekonstruktionen bei einem endlichen Raumfrequenzwert max = ± m b abbrechen und in der Rechnung nur Maxima mit kleineren Raumfrequenzen berücksichtigen. Verschiebt man dieses Anregbar­ keitsmuster gegenüber dem Objekt, so ändern sich die jeweiligen komplexen Phasenlagen der einzelnen punktförmigen Anregungs-Maxima im Fourierraum. Berücksichtigt man Anregungs-Maxima (und das bei = 0) benötigt man also 2m + 1 unter verschiedenen Bedingungen aufgenommene Bilder um die einzelnen abgebildeten Komponenten, welche mit dem jeweiligen Maximum gefaltet (also verschoben) sind separieren zu können. Als Beispiel sei hier m = 2. Der Phasenwinkel der Maxima im Frequenzraum des Anreg­ barkeitsmusters bewegt sich bei Verschieb des Anregbarkeitsmusters proportional zu n b, da eine Verschiebung im Raum um einer Multiplikation im Frequenzraum mit exp(i ) entspricht. Nimmt man also verschiedene Bilder In() = F(In()) des Ob­ jekts mit jeweils um ein fünftel des Grundmusters gegeneinander verschobener Phaselage des Beleuchtungsmusters (also auch des Anregbarkeitsmusters) auf, so ergibt sich folgendes Gleichungssystem:

Objn() bezeichnen hier die zum n. Maximum des Anregungsmusters gehörenden, ver­ schobenen komplexwertigen Komponenten des fouriertransformierten Objekts (Objekt- Raumfrequenzen), welche dann durch die OTF des abbildenden Systems transmittiert wurden. Durch Lösung dieses Gleichungssystems können die individuellen Objektkompo­ nenten, die zu jedem Maximum des Anregbarkeitsmusters gehören ermittelt werden. Dies kann z. B. durch Invertieren der Matrix M geschehen. Diese Inverse (M-1) kann dann mit dem rechts stehenden Vektor der gemessenen Intensität In() multipliziert werden, um die individuellen transmittierten Objektkomponenten zu ermitteln. Die Rechnung kann aufgrund der Linearität der Fouriertransformation auch pixelweise im Realraum ausge­ führt werden. Die komplexwertigen Komponenten Objn() können nun (z. B. durch Mul­ tiplikation im Realraum mit exp(i) um den Vektor im Fourierraum verschoben werden, so daß die jeweilige Raumfrequenz dort zu liegen kommt, wo sie bei flacher, gleichmäßiger Beleuchtung gemessen würde. ist also hier n b. Die Komponenten Objn() müssen noch in ihrer komplexen Phasenlage je nach gegenseitiger Phasenlage ϕn der Frequenzraum-Anregungsmaxima im Bild Io korrigiert werden (Multiplikation mit exp(-iϕn)) und können dann z. B. durch gewichtete Addition mit den anderen Objn() zu einem konsistenten Bild vereinigt werden. Man erhält auf diese Weise eine Ausdehnung des Trägers (des von Null verschiedenen Bereichs) der gesamt-OTF auf einen deutlich größeren Bereich als es bei linearer Abbildung möglich wäre und somit eine entsprechende Auflö­ sungserhöhung. Gleiches kann in verschiedenen Richtungen durchgeführt werden, was es so ermöglicht eine Auflösungserhöhung in ein, zwei oder drei Dimensionen zu erhalten. Die Gesamttransferfunktion kann im Anschluß daran oder bei Zwischenschritten noch durch entsprechendes Filtern und/oder Anwenden von Entfaltungstechniken verändert werden.

Auch ist es möglich ohne die beschriebe Matrix-Methode auszukommen, indem man z. B. Quadratur-Techniken anwendet (analog zu Patent WO 98/45745) oder algebraische/iterative Rekonstruktionsverfahren verwendet (maximum likelihood/expectation maximization, ma­ ximum entropie, algebraic reconstruction, . . .).

Analog zu obigem Verfahren lassen sich die Methoden anwenden auf beliebige Faktoren, die imstande sind, für sich oder im Zusammenwirken untereinander (insbesondere zusam­ men mit der Beleuchtungsintensität) die Intensität des von Objekt ausgehenden Lichts zu beeinflussen.

4. Vorteile des neuen Verfahrens gegenüber anderen Verfahren

Das Verfahren läßt sich vergleichsweise einfach praktisch realisieren. Die Justierung einer solchen Apparatur beschränkt sich auf ein minimales Maß.

Vorteilhaft ist auch, daß hohe Raumfrequenzen, die in Objektiven stark unterdrückt wer­ den, nun durch die Verschiebung im Frequenzraum effizienter detektiert werden können.

Außer einem lateralen Auflösungsgewinn erhält man zusätzlich auch einen axialen Auf­ lösungsgewinn und die Möglichkeit, zur optischen Achse senkrecht stehende Ebenen in axialer Richtung zu diskriminieren (ähnlich wie beim konfokalen Mikroskop). Auch hier ergibt sich bei Ausnutzung der nichtlinearen Abhängigkeit die Möglichkeit zu einem be­ trächtlichen Auflösungsgewinn.

Das Verfahren ist in Kombination mit vielen anderen Mikroskopieverfahren oder Verfah­ ren zur optischen Abbildung anwendbar (den oben genannten, Absorptionsmikroskopie, Reflexionsmikroskopie, Fluorescence Lifetime Imaging, Mehrphotonenmikroskopie, Inter­ ferenzmikroskopie, konfokale Mikroskopie, . . .).

Die Bildgebung kann z. B. mit einer CCD-Kamera an allen Punkten in der Bildebene gleich­ zeitig geschehen und ist daher deutlich schneller möglich als bei abtastenden Verfahren.

Die eingesetzten nichtlinearen Effekte (also z. B. Farbstoffsättigung) können auch dazu verwendet werden verschiedene Farbstoffe oder Farbstoffe in verschiedener Umgebung, die sonst schlecht von einander zu unterscheiden wären, auf Grund von unterscheidbaren nicht- linearen Eigenschaften zu trennen.

5. Ausführungsbeispiele

Ausführungsbeispiele des Verfahrens sind in den Zeichnungen dargestellt und werden im folgenden näher beschrieben.

Es zeigen

Abb. 3 eine beispielhafte Anwendung des Verfahrens auf die Epifluoreszenz­ mikroskopie.

Abb. 4 eine beispielhafte Anwendung des Verfahrens auf die Epifluoreszenz­ mikroskopie bei seitlicher Beleuchtung.

Abb. 5 Simulationen von Mikroskopiebildern, als wenn sie mit dieser Technik aufgenommen wurden. Die Bilder wurden entsprechend einer in jedem Pixel pois­ sonverteilten Photonenstatistik verrauscht. Die maximale Intensität betrug hierbei ca. 560 Photonen im Pixel in den jeweiligen Einzelbildern.

Abb. 6 Simulationen von aus diesen Bildern rekonstruierten hochauflösenden Bildern und der Vergleich mit simulierten normalen Epifluoreszenzbildern

Abb. 7 Vergleich der Intensitätskurven entlang einer Linie in 6d) und e).

Abb. 9 Vergleich zweier simulierter Rekonstruktionen mit einem elektronen­ mikroskopischen Bild des Zellkerns als angenommene "wahre" Fluoreszenzdichte des Objekts.

In Abb. 3 ist ein Beispiel der Anwendung des Verfahrens auf die Epifluoreszenzmikroskopie zu sehen. Die ortsabhängig stark fluktuierende Beleuchtung wird erreicht durch Abbildung eines Beugungsgitters (1) (hier ein Transmissionsgitter, Gitterabstand z. B. 30 µm) durch das Objektiv (2) auf das Objekt (3). Für die Aufnahme der unterschiedlichen Phasenlagen wird z. B. das Gitter in kleinen Schritten gegenüber dem Objekt unter dem Mikroskop ver­ schoben. Die minimale Anzahl der nötigen Aufnahmen für das Rekonstruieren eines Bildes ergibt sich durch die Anzahl der Unbekannten des assoziierten Gleichungssystems (s. o.). Die Änderung der Phasenlage läßt sich z. B. auch erreichen, indem man das Objekt unter dem Mikroskop gegenüber der abgebildeten Beugungsstruktur verschiebt oder direkt die Phase der verschiedenen Beugungsmaxima durch geeignete optische Elemente beeinflußt wird.

Um die Auflösung in allen Raum-Richtungen zu erhöhen, ist es nötig, mit Mustern unter verschiedenen Winkeln nacheinander oder mit einem 2-dimensionalen Muster, welches Beu­ gungsmaxima in mehreren Richtungen der Ebene hervorruft, in verschiedenen Phasenlagen in jeder Dimension zu beleuchten.

Durch Erstellen von Fokusserien kann man noch zusätzliche Information über die axiale Struktur und so dreidimensionale Bilder des Objekts gewinnen. Dies wird zum einen durch die inkohärente Lichtquelle zum anderen durch das Vorhandensein der 0. Beugungsordnung des Gitters noch zusätzlich erleichtert. Auch kann ein zusätzlicher Auflösungsgewinn durch Drehen des Objekts um eine auf der optischen Achse senkrecht stehende Achse unter dem abbildenden System erreicht werden.

Beleuchtet man mit entsprechend starken momentanen Intensitäten, so macht sich die Sättigung der Farbstoffe bemerkbar und führt zu den gewünschten nichtlinearen Ef­ fekten, die wesentlich zur Auflösungserhöhung beitragen. Als Lichtquellen bieten sich hier auch insbesondere intensive Blitzlicht-Lampen (aber auch Laser) an. Die gesuchten Anteile der sich überlagernden individuellen Ordnungen können aus den Bildern bei verschiedenen Phasenlagen der Anregungsstruktur errechnet werden. Es ist auch möglich, aus Aufnah­ men mit verschiedener Beleuchtungsintensität hochauflösende Bilder zu rekonstruieren.

Unterdrückt man (z. B. durch Ausblenden) die 0. Beugungsordnung des Gitters (1), so erhöht man damit in vorteilhafter Weise den Modulationsgrad der Beleuchtungsfunktion und damit die relative Intensität in höheren Anregungsordnungen.

In einer anderen Anordnung wird die Probe mit Laserlicht beleuchtet. Man kann auf das Beugungsgitter verzichten und den aufgeweiteten Laserstrahl direkt über einen halb­ durchlässigen Spiegel von zwei Seiten auf das Objektiv fallen lassen (nicht gezeigt). Es ist aber auch möglich, wie in Abb. 4 gezeigt, den Laserstrahl seitlich am Objektiv vorbei zu führen, wodurch noch höhere Beleuchtungsraumfrequenzen erzielt werden können. Die Anordnung gleicht in gewisser Weise einem Wellenfeldmikroskop, bei dem man nicht mit gegeneinander gerichtetem Licht beleuchtet und außerdem von der Seite detektiert. Um zusätzlich auch eine gute axiale Diskriminierung zu erhalten kann man den Strahl zugleich noch aus einer oder mehreren Richtungen durch das Objektiv (nicht gezeigt) und/oder von der dem Objektiv abgewandten Seite auf das Objekt fallen lassen (Abb. 4), wel­ ches sich in dem Interferenzbereich der Laserstrahlen (kreuzschraffierte Region) befindet. Die durch Nichtlinearitäten erzielbare zusätzliche Auflösungserhöhung kann man wiederum durch Benutzung entsprechend starker Laser bzw. gepulster Laser mit hohen momenta­ nen Intensitäten erreichen. Auch die Verwendung anderer intensiver Lichtquellen (z. B. Blitzlichtlampen) ist denkbar und ggf. vorteilhaft.

Die Abb. 5 zeigen eine Serie von simulierten Einzelbildern bei einem zugrunde­ liegenden Fluoreszenzmikroskopieverfahren wie in Abb. 3 gezeigt. Intensität ist hier als Schwärzung dargestellt. Zur besserem Sichtbarmachung der Beleuchtung wurde im Ob­ jekt (Abb. 5(a)) eine konstante Hintergrundfluoreszenz angenommen. In Abb. 6 werden daraus rekonstruierte Bilder mit konventionell simulierten optischen Abbildungen verglichen. Es ist erkennbar, daß die Bildqualität des nichtlinearen Verfahrens selbst kon­ ventionellen Rekonstruktionen mit Hochfrequenzverstärkung deutlich überlegen ist.

Abb. 8 zeigt einen lateralen Schnitt durch die simulierte optische Transferfunktion des Ge­ samtsystems aus Abb. 3. Der Gitterabstand des Beugungsgitters wurde hier so gewählt, daß nur die Beugungsordnungen 0, +1 und -1 des Beugungsgitters durch das Objektiv übertragen werden können. Durch die teilweise Sättigung der beteiligten Farbstoffe ergibt sich eine nichtlineare Beziehung zwischen der Beleuchtungsintensität und der Wahr­ scheinlichkeit der Anregung eines Farbstoffmoleküls an einem Punkt im Objektraum. Die­ se räumlich variierende Anregungswahrscheinlichkeit wird hier Anregungsmuster genannt. Wenn man annimmt, das die Anregungswahrscheinlichkeit für ein bestimmtes Farbstoff­ molekül eine Funktion der Beleuchtungsintensität ist, so führt eine Nichtlinearität dieser Funktion dazu, daß im Emissionsmuster auch räumlich höhere Harmonische des Anregungs­ musters auftreten. Maxima im reziproken Raum, die jenseits der durch die Abbe-Grenze gegebenen Raumfrequenzbegrenzung liegen, können dann im Anregungsmuster auftreten. Die raumfrequenzbegrenzte Abbildung der Multiplikation der Farbstoffverteilung mit dem Anregungsmuster enthält nun Komponenten analog zu einer linearen Anregung mit einem Muster, welches höhere Raumfrequenzen enthält.

6. Begriffsdefinitionen und Erläuterungen

Im Folgenden sind für die Patentansprüche wichtige Begriffe näher ausgeführt und definiert:
Objektbedingungen: Darunter sind alle Parameter und Bedingungen am Ort des Objek­ tes zu verstehen, die imstande sind, eine oder mehrere Eigenschaften (wie Intensität, Polarisationszustand, Phase, Farbe, Pulsform/-länge, Kohärenzgrad, Photonenkor­ relation, . . .) des Lichts, daß von Objekt ausgeht zu beeinflussen.
nichtlineare Abhängigkeit: Damit ist gemeint, daß die im Detektor detektierte Lichtin­ tensität in ihrer Abhängigkeit von dem Wert einer Objektbedingung am Ort der Lichtaussendung (auch Streuung usw.) meßbar keinem einfachen linearen Modell folgt, also daß Terme höherer Ordnung in der obigen Taylorentwicklung (Formel 4) auftreten. Es genügt aber auch, daß z. B. eine lineare Abhängigkeit der Lichtin­ tensität von mehreren Objektbedingungen zugleich vorliegt, da dann entsprechende "Mischterme" in der Taylorentwicklung auftreten, welche auch zu einer Erweiterung der detektierbaren Objekt-Raumfrequenzen führen.
detektierte Lichtintensität: Die Lichtintensität, die mit dem Detektorsystem gemes­ sen wird. Sie kann entsprechend der Funktionalität des Detektors von der am Ort des Detektors herrschenden mittleren Lichtintensität durchaus abweichen, wenn z. B. zeitlich moduliert detektiert wird oder ein rohes Detektorsignal mit anderen Signalen korreliert wird (z. B. durch Lock-In-Technik).
Einzelbild: Darunter sind allgemein mit einem im weitesten Sinne abbildenden lichtop­ tischen Verfahren aufgenommene Bilddaten zu verstehen. Es kann sich dabei um einen einzelnen Datenpunkt, mehrere an ein oder verschiedenen Objektpunkten auf­ genommene Datenpunkte oder -bereiche in ein-, zwei -, drei- oder mehr Dimensionen handeln. Insbesondere ist es für untenstehende Patentansprüche völlig unerheblich, ob die Objektbedingungen bei jedem Datenpunkt geändert oder moduliert werde, oder ob dies erst nach Abschnitten oder ganzen zwei- oder dreidimensionalen Bildern oder sogar Zeitserien geschieht.
räumliches Muster: Darunter ist zu verstehen, daß der Wert der Objektbedingung eine räumliche Struktur besitzt also abhängig vom Ort im Objektraum ist.
detektierbare Raumfrequenzanteile: Darunter sind die Anteile des Frequenzraums der Fouriertransformierten des Objekts zu verstehen, die mit dem zugrundeliegenden abbildenden Verfahren prinzipiell detektiert werden können.
Informationen über das Objekt: Hierunter soll insbesondere die räumliche Verteilung einer oder mehrere Eigenschaften des Objekts zu verstehen sein, aber auch andere Parameter, wie z. B. die Position eines von seiner Struktur her bekannten Teilobjekts im Raum oder die Zusammensetzung des Objekts.

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Claims (41)

1. Verfahren zur Erhöhung der Auflösung optischer Abbildung eines oder mehrerer Ob­ jekte (im Folgenden mit Objekt bezeichnet) mit folgenden Schritten:
  • a) Anpassung der im Objekt herrschenden Bedingungen, die das von einem Ob­ jektpunkt ausgehende Licht zu beeinflussen imstande sind, (Objektbedingungen bi() = Beleuchtungsintensität und/oder zusätzliche Effekte) derart, daß eine nichtlineare Abhängigkeit der von einem Objektpunkt detektierten Lichtinten­ sität von dem Wert eines in mindestens einer Objektbedingung enthaltenen räumlichen Musters in mindestens einem detektierten Wert hervorgerufen wird oder eine jeweils zu einem Wert lineare Abhängigkeit der von diesem Objekt­ punkt detektierten Lichtintensität von der Werten mindestens zweier räumlicher Muster bi() hervorgerufen wird.
  • b) Aufzeichnung wenigstens eines Einzelbildes unter diesen Objektbedingungen.
  • c) Ändern der Objektbedingungen derart, daß unterschiedliche durch das Aufnah­ meverfahren abgebildete Raumfrequenzanteile des Objekts (detektierbare Raum­ frequenzanteile) sich in ihrer Amplituden und/oder Phasenbeziehung zueinander verändern.
  • d) Aufzeichnung wenigstens eines weiteren Einzelbildes unter jeweils gemäß (c) veränderten Objektbedingungen.
  • e) Auswertung der gemessenen Bilder, indem die sich in den Einzelbildern unter­ schiedlich ausprägenden Objektbedingungen genutzt werden um Informationen über das Objekt zurückzugewinnen, die zu Raumfrequenzen des Objekts gehö­ ren, welche durch eine einfache Abbildung mit dem Aufnahmeverfahren nicht zugänglich wären.
2. Verfahren in dem das räumliche Muster durch ein Muster der Beleuchtungsintensität gegeben wird.
3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ab­ bildung mittels einem bekanntem optischen Mikroskopieverfahren geschieht; insbe­ sondere mittels Standard Fernfeld Mikroskopie, Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie, konfo­ kaler Mikroskopie, 4PI-Mikroskopie, I2M-, I3M-, I5M-Verfahren, Theta-Mikroskopie, Nahfeld-Mikroskopie.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine nichtlineare Abhängigkeit der im Detektor (oder den Detektoren) von einem Objektpunkt detektierten Lichtintensität zu der an diesem Punkt herrschenden Be­ leuchtungsintensität (nicht notwendigerweise bei der selben Frequenz des Lichts) ausgenutzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung nichtlinearer Effekte nötige momentane Lichtintensitäten dadurch er­ zeugt werden, daß eine gepulste Beleuchtungsquelle, insbesondere ein Pulslaser oder eine Blitzlampe, verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Sättigung des Fluoreszenzlichts von Fluorophoren unter intensiver Beleuchtung ausgenutzt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Sättigung der Absorption von Beleuchtungslicht unter intensiver Beleuchtung ausgenutzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Abhängigkeit der Phase des emittierten oder gestreuten Lichts von der im Ob­ jekt vorhandenen Beleuchtungsintensität ausgenutzt wird, welche sich im Detektor (zum Beispiel über Interferenz) oder davor in eine nichtlineare Intensitätsabhängig­ keit umsetzt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Abhängigkeit der Intensität der Ramanstreuung von dem Wert einer oder meh­ rerer Objektbedingungen ausgenutzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zeitlich kohärente Effekte (zum Beispiel Rabi-Oszillationen) an Atomen oder Mole­ külen (auch Fluorophore) im Objekt (in Lösung, Festkörpern, Gasen oder auch im Vakuum) gezielt ausgenutzt werden, um die benötigte nichtlineare Abhängigkeit zu erzeugen. Die Induktion solcher Effekte kann dabei insbesondere durch Beleuchtung mit sehr kurzen Pulsen geschehen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die nichtlineare Abhängigkeit des emittierten Lichts von der im Objekt vorhandenen Lichtintensität bei Mehrphotonen-Absorption ausgenutzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß Anregung und darauf folgende stimulierte Emission eine nichtlineare Abhängigkeit von detektiertem Licht und am Objektpunkt vorhandener Lichtintensität entsteht. Die stimulierte Emission kann gleichzeitig oder in zeitlicher Abfolge induziert werden. Sie kann bei der selben Wellenlänge (z. B. auch durch das Anregungslicht) oder bei einer anderen Wellenlänge (z. B. der Fluoreszenzwellenlänge) induziert werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß Fluorophore durch Licht gleichzeitig oder vor der Beleuchtung in andere Zustände (z. B. Tripplet-Zustand oder auch chemisch veränderte Zustände) versetzt werden und sich daraus eine nichtlineare Abhängigkeit des emittierten Lichts von der am Objekt­ punkt vorhandenen Intensität ergibt. Dies kann automatisch mit der Beleuchtung geschehen oder auch durch Beleuchtung mit anderen Wellenlängen.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Energie durch Strahlung oder strahlungslose Prozesse von Fluorophoren auf benach­ barte andere Fluorophor-Moleküle übertragen wird und dadurch eine nichtlineare Abhängigkeit der emittierten Lichtintensität von der am Nachbarort eingestrahlten Intensität entsteht.
15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine nichtlineare Abhängigkeit des von einem Objektpunkt detektierten Lichts von einem räumlich inhomogenen elektrischen Feld ausgenutzt wird.
16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine nichtlineare Abhängigkeit des von einem Objektpunkt detektierten Lichts von einem räumlich inhomogenen angelegten magnetischen Feld ausgenutzt wird.
17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine nichtlineare Abhängigkeit des von einem Objektpunkt detektierten Lichts von dem im Objektpunkt herrschenden Druck ausgenutzt wird.
18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine nichtlineare Abhängigkeit des von einem Objektpunkt detektierten Lichts von den im Objektpunkt herrschenden Scherkräften oder mechanischen Spannungsver­ hältnissen ausgenutzt wird.
19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine nichtlineare Abhängigkeit des von einem Objektpunkt detektierten Lichts von der im Objektpunkt herrschenden Temperatur ausgenutzt wird.
20. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine nichtlineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt detektierten Lichts von dort herrschenden chemischen Bedingungen (z. B. Ph-Wert) ausgenutzt wird.
21. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine nichtlineare Abhängigkeit des von einem Objektpunkt detektierten Lichts von der Intensität eingestrahlter Radiowellen oder Mikrowellen oder Infrarotlicht oder Röntgenstrahlung oder Schallwellen oder Ultraschallwellen ausgenutzt wird.
22. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das räumliche Muster einer Objektbedingung beschrieben oder annähernd beschrie­ ben werden kann durch eine Anzahl von Punkten im reziproken Raum verteilt in 1, 2 oder 3 Dimensionen.
23. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das räumliche Muster räumlich periodisch (oder näherungsweise periodisch) in einer oder mehreren Dimensionen ist.
24. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein ausgedehntes räumliches Muster erzeugt wird und Licht gleichzeitig (z. B. mit einer CCD-Kamera) von vielen Objektpunkten detektiert wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das räumliche Muster an ein oder mehreren Stellen möglichst fokussiert ist (Wie z. B. im konfokalen Mikroskop oder im 4Pi-Mikroskop) und Objekt und Muster für verschiedene Einzelbilder zueinander verschoben werden.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß versucht wird den Emissionsort des detektierten Lichts auf einem dem räumlichen Muster nach Anspruch 25 ähnlichen Verteilung einzugrenzen (z. B. durch Einfügen einer oder mehrerer Lochblenden vor dem Detektor).
27. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das räumliche Muster erzeugt wird durch Abbildung einer geeigneten Vorlage, die zwischen den Einzeldaten ausgetauscht oder gezielt verändert wird (zum Beispiel analog zur "Aperture Correllation Microscopy").
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbildung dieselben Elemente, die zur Detektion erforderlich sind ganz oder teilweise mit nutzt (z. B. Abbildung eines Intensitätsmusters durch das Objektiv, daß zur Detektion auch verwendet wird).
29. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das räumliche Muster erzeugt wird indem bewußt ganz oder zum Teil ein anderer Weg zur Erzeugung des Musters als die Benutzung der vorhandenen Detektionsmit­ tel um eine zusätzliche Steigerung der Auflösung zu erreichen (z. B. Erzeugung eines Wellenfelds durch seitliche Beleuchtung am Objektiv vorbei oder analog zur Thet­ amikroskopie mit anderen Objektiven).
30. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Objekt und das räumliche Muster in ein oder in mehrere Richtungen oder Dimensio­ nen relativ zu einander verschoben werden.
31. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das räumliche Muster zumindest auch dadurch verändert wird, daß Komponenten aus denen es sich (z. B. durch Interferenz) zusammensetzt in der Phase gegeneinander verschoben werden (zum Beispiel die Phase verschiedener Beugungsmaxima).
32. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine zeitliche Struktur der oder den nichtlinearen Bedingungen aufgeprägt wird und Daten zu unterschiedlichen Zeiten aquiriert werden (zum Beispiel bei dann ver­ änderter Einstrahlungs-Lichtintensität).
33. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Zusammensetzen der Einzeldaten direkt dadurch geschieht, daß die individu­ ellen Komponenten über das Lösen eines Gleichungssystems unter Berücksichtigung der verschiedenen nichtlinearen Bedingungen extrahiert werden und an den richtigen Stellen des Fourierraums plaziert (zum Beispiel gewichtet aufaddiert) werden. Die dazu notwendige Rechnung muß sich dazu nicht notwendigerweise auf den Fourier­ raum stützen. Eine Fouriertransformation ist dabei nicht unbedingt von Nöten.
34. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Zusammensetzen der Einzeldaten ganz oder teilweise implizit dadurch geschieht, daß von der Nichtlinearität abhängenden unterschiedlichen Daten in einem iterati­ ven Prozeß berücksichtigt werden.
35. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren durch Näherungen vereinfacht wird, das Gleichungssystem nur nähe­ rungsweise gelöst wird oder die Iterationen bereits nach wenigen Iterationen abge­ brochen werden.
36. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der iterative Prozeß auf Maximum-Likelihood Rekonstruktion oder anderen algebrai­ schen Verfahren beruht.
37. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Zusammensetzen der Daten ein weiteres rechnerisches Verfahren angewandt wird um die Auflösung zu erhöhen oder im Fourierraum entstehende Unstetigkeiten zu glätten oder die durch den Algorithmus entstehende effektive optische Transfer­ funktion beziehungsweise die effektive Punktbildfunktion geeignet zu formen (z. B. durch Unterdrückung oder Verstärkung gewisser Raumfrequenzen).
38. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die vorhandene Information über die nichtlineare Abhängigkeit der von einem Ob­ jektpunkt detektierten Intensität von den nichtlinearen Bedingungen ausgenutzt wird um die Position ein oder mehrerer Teilobjekte möglichst genau zu bestimmen.
39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Struktur des Teilobjekts oder die Struktur seines Bildes genau oder näherungsweise bekannt ist und diese in dem Verfahren als bekannte Struktur (a priori oder als gemessene Struktur) berücksichtigt wird.
40. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Unterschiede in der nichtlinearen Abhängigkeit der von einem Objektpunkt de­ tektierten Intensität von den nichtlinearen Bedingungen ausgenutzt werden um Auf­ schlüsse über die örtliche Zusammensetzung des Objekts an verschiedenen Positionen aus verschiedenen Materialien zu gewinnen.
41. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Unterschiede in der nichtlinearen Abhängigkeit der von einem Objektpunkt de­ tektierten Intensität von den nichtlinearen Bedingungen gezielt ausgenutzt werden um Teilobjekte und deren Position bestimmen zu können, auch wenn sich deren Bil­ der zu einem großen Teil überlagern.
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