DE19834948A1

DE19834948A1 - Detection of RNA using a reverse transcriptase primer comprising a first sequence which specifically hybridizes with the RNA, used to detect DNA contamination of samples

Info

Publication number: DE19834948A1
Application number: DE19834948A
Authority: DE
Inventors: Monika Jecht; Christian Probst
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-08-03
Filing date: 1998-08-03
Publication date: 2000-02-17

Abstract

A method for the specific detection of RNA in the presence of sequence identical DNA, where a reverse-transcriptase (RT) reaction is performed, by producing an RT primer with a first and second sequence (A and B) to detect RNA complementary to cDNA, and amplifying the cDNA by polymerase chain reaction (PCR), is new. (A) specifically hybridizes with the RNA. Independent claims are also included for the following: (1) an RT primer to specifically detect RNA in the presence of an identical DNA sequence; and (2) a kit with an RT primer as above and a buffer solution, Taq-buffer solution, a PCR primer, dNTP solution and/or DTT solution.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Detek tion von RNA in Anwesenheit sequenzidentischer DNA. Sie be trifft ferner einen RT-Primer zur spezifischen Detektion von RNA in Anwesenheit sequenzidentischer DNA.The invention relates to a method for specific detection tion of RNA in the presence of sequence-identical DNA. You be also meets an RT primer for the specific detection of RNA in the presence of sequence-identical DNA.

Nach dem Stand der Technik ist zur Detektion von RNA in Anwe senheit sequenzidentischer DNA ein die folgenden Schritte um fassendes Verfahren bekannt:
According to the prior art, a method comprising the following steps is known for the detection of RNA in the presence of sequence-identical DNA:

a) performing a reverse transcription reaction (RT- Reaction) in which a reverse transcript ons (RT) primers complementary to the detected RNA re cDNA is produced and
b) amplification of the cDNA using polymerase chain Reaction (PCR).

Beim Schritt lit. a dient das freie 3'-OH-Ende des an ein Template gebundenen RT-Primers als Startpunkt der bei einer Temperatur von 42°C erfolgenden RT-Reaktion, bei der RNA in cDNA revers transkripiert wird.At step lit. a serves the free 3'-OH end of the on Template-bound RT primers as the starting point for a Temperature of 42 ° C RT reaction, with the RNA in cDNA is reverse transcribed.

Im Anschluß an den Schritt lit. b kann die amplifizierte cDNA in einem weiteren Schritt detektiert werden.Following step lit. b can be the amplified cDNA can be detected in a further step.

Bei einer dem Schritt lit. a vorausgehenden RNA-Preparation kann es zu einer Kontamination mit DNA kommen. Wenn die in der RNA-Preparation enthaltene DNA im zur Detektion genutzten Bereich sequenzidentisch mit der zu detektieren RNA ist, führt sie zu Spezifitätsproblemen beim RNA-Nachweis durch die PCR. Um diesem Problem entgegenzuwirken, werden üblicherweise folgende Maßnahmen ergriffen:
With a step lit. A previous RNA preparation can lead to contamination with DNA. If the DNA contained in the RNA preparation is identical in sequence to the RNA to be detected in the area used for the detection, it leads to specificity problems in the RNA detection by the PCR. The following measures are usually taken to counteract this problem:

a) DNase digestion of the RNA preparation is carried out leads.
b) Before the end of the reverse transcriptase Reaction temperatures avoided at which DNA is in single strands denatured.
c) The so-called RT-Tail-PCR method is used. The RT primers are designed so that they only partially wise, namely in the 3 'range, with the RNA to be detected are complementary. Not present in the contaminating DNA their sequence areas form the 5 'area of the RT tail Primers. The PCR is then carried out using one to one Sequence region of the first strand cDNA complementary and one Tail primer derived from the tail sequence. Aim this The procedure is to amplify using PCR contamination to prevent render DNA and to specifically amplify cDNA ren.

Die Maßnahme lit. aa hat den Nachteil, daß sie arbeits- und kostenintensiv ist. Außerdem beinhaltet DNAse fast immer Spu ren von RNase. DNase-Verdaus sind selten vollständig. Die empfindliche und meist nur in Spuren vorhandenen RNA wird zu sätzlichen Arbeitsschritten unterzogen, wodurch deren Quali tät und Quantität abnimmt.The measure lit. aa has the disadvantage that it is labor and is expensive. In addition, DNAse almost always contains spu RNase. DNase digests are rarely complete. The sensitive and mostly only traces of RNA are turned into subjected to additional work steps, which makes their quality activity and quantity decreases.

Bei der Maßnahme lit. bb wird die Wahrscheinlichkeit der Bil dung von Einzelstrang-DNA vor dem Ende der RT-Reaktion zwar minimiert, nicht jedoch ausgeschlossen. Insbesondere sekun därstrukturierte RNA-Moleküle erfordern vor der RT-Reaktion hohe Denaturierungstemperaturen.With the measure lit. bb becomes the probability of bil formation of single-stranded DNA before the end of the RT reaction minimized, but not excluded. In particular sekun därstructured RNA molecules require before the RT reaction high denaturation temperatures.

Bei der Maßnahme lit. cc ist es möglich, daß die RNA komplementäre Region des RT-Tail-Primers aufgrund ihrer Länge von üblicherweise 15 bis 20 Nukleotiden bei der Reaktionstem peratur der RT-Reaktion sowohl an RNA als auch an DNA hybri disiert. Die DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität der re versen Transkriptase kann aufgrund der Hybridisierung des RT- Tail-Primers an sequenzidentische DNA zur Synthese Tail- haltiger DNA, sogenannter Pseudo-cDNA, führen, die vom cDNA- Strang nicht mehr unterscheidbar ist. Freier RT-Tail-Primer kann aufgrund seiner relativ langen 3'-komplementären Region bei der PCR mit nicht-cDNA hybridisieren und ebenfalls zu Tailhaltiger Pseudo-cDNA führen. Besonders problematisch bei diesem Verfahren ist die durch die reverse Transkriptase syn thetisierbare Pseudo-cDNA. Die Spezifität kann gleichwohl durch Weglassung der RT-Reaktion vor der PCR verbessert wer den. Dadurch ist aber nur prüfbar, ob bei der PCR freier RT- Tail bzw. PCR-Primer an kontaminierende DNA hybridisiert ist. Eine solche Kontrolle gibt keine Sicherheit vor Spezifitäts verlusten durch Hybridisierung des RT-Tail-Primers an DNA bei der RT-Reaktion.With the measure lit. cc it is possible that the RNA complementary region of the RT tail primer due to its length of usually 15 to 20 nucleotides in the reaction temperature of the RT reaction on both RNA and DNA hybri doped. The DNA-dependent DNA polymerase activity of the right verse transcriptase may be due to hybridization of the RT Tail primers to sequence-identical DNA for the synthesis of tail containing DNA, so-called pseudo-cDNA, lead from the cDNA Strand is no longer distinguishable. Free RT tail primer can due to its relatively long 3 'complementary region hybridize to non-cDNA during PCR and also to Tail-containing pseudo-cDNA lead. Particularly problematic with this method is syn. by reverse transcriptase detectable pseudo-cDNA. The specificity can nonetheless who omitted the RT reaction before the PCR the. However, this only makes it possible to check whether free RT- Tail or PCR primer is hybridized to contaminating DNA. Such a control does not provide any security against specificity lost through hybridization of the RT tail primer to DNA the RT reaction.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein Verfahren sowie ein RT-Primer angegeben werden, mit dem auf einfache und kostengünstige Weise eine spezifische Detektion von RNA in Anwesenheit sequenzidentischer DNA durchführbar ist. The object of the present invention is to overcome the disadvantages to eliminate the state of the art. It is supposed to be a Methods and an RT primer can be specified with the simple and inexpensive way of specific detection of RNA in the presence of sequence-identical DNA is.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 13 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 12 und 14 bis 21.This object is achieved by the features of claims 1 and 13 solved. Appropriate embodiments of the invention result from the features of claims 2 to 12 and 14 to 21.

Nach Maßgabe der verfahrensseitigen Lösung ist vorgesehen, daß die erste Sequenz spezifisch mit der RNA hybridisiert. Das ermöglicht auf einfache Weise eine RNA-Detektion in Anwe senheit sequenzidentischer DNA.In accordance with the procedural solution, it is provided that that the first sequence hybridizes specifically to the RNA. This enables RNA detection in an easy way of sequence-identical DNA.

Vorteilhafterweise wird beim Schritt lit. b die Anelie rungstemperatur höher gewählt als eine Reaktionstemperatur beim Schritt lit. a. Der Schritt lit. a kann bei einer, vor zugsweise zwischen 37 und 42°C liegenden, Reaktionstemperatur durchgeführt werden, bei der die erste Sequenz spezifisch mit RNA, nicht jedoch mit DNA, hybridisiert. So kann auf beson ders einfache Weise eine spezifische Verfahrensführung er zielt werden.In step lit. b the anelie tion temperature selected higher than a reaction temperature at step lit. a. The step lit. a can in front of one preferably between 37 and 42 ° C, reaction temperature be carried out in which the first sequence specifically with RNA, but not with DNA, hybridizes. So can in particular he simple way of carrying out a specific procedure aims to be.

Beim RT-Primer handelt es sich zweckmäßigerweise um einen Tail-RT-Primer. Dabei ist vorzugsweise eine erste 3'- terminale Sequenz des RT-Primers komplementär zu einem ersten RNA-Sequenzabschnitt der zu detektierenden RNA. Die erste Se quenz kann eine Länge von 6 bis 10 Basen aufweisen. Nach ei nem Ausgestaltungsmerkmal folgt 5' der ersten Sequenz die zweite zur detektierenden RNA nicht komplementäre Sequenz, die eine Länge von 25 bis 40, vorzugsweise 30, Basen aufwei sen kann. Die zweite Sequenz ist zweckmäßigerweise identisch mit einem zweiten RNA-Sequenzabschnitt, der vorzugsweise im Abstand von 400 bis 600, 5' des zur ersten Sequenz komplemen tären ersten RNA-Sequenzabschnitts sich befindet. - Die vor genannten Maßnahmen tragen weiter zur RNA-Spezifität des Ver fahrens bei. The RT primer is expediently one Tail RT primer. A first 3'- terminal sequence of the RT primer complementary to a first RNA sequence section of the RNA to be detected. The first se quenz can have a length of 6 to 10 bases. After egg A design feature follows 5 'of the first sequence second sequence which is not complementary to the detecting RNA, which have a length of 25 to 40, preferably 30, bases can. The second sequence is expediently identical with a second RNA sequence section, which is preferably in Distance from 400 to 600, 5 'of the complemen to the first sequence The first RNA sequence section is located. - The before Measures mentioned further contribute to the RNA specificity of the Ver driving at.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal ist ein beim Schritt lit. b eingesetzter PCR-Primer länger als die erste Sequenz des RT-Primers ausgebildet, wobei ein zur zweiten Se quenz identischer oder teilidentischer PCT-Primer eingesetzt werden kann.According to a further design feature, a Step lit. b PCR primer used longer than the first Sequence of the RT primer formed, one to the second Se Identical or partially identical PCT primer used can be.

Wenn die zweite Sequenz nicht identisch mit einem zweiten RNA-Sequenzabschnitt ist, wird beim Schritt lit. b vorteil hafterweise ein weiterer PCR-Primer mit einem 25 bis 40 Basen aufweisenden zur detektierenden RNA identischen Abschnitt eingesetzt. Der Abschnitt kann sich in einem Abstand von 400 bis 600 Basen 5' eines zur ersten Sequenz komplementären wei teren Abschnitts auf der zu detektierenden RNA befinden. - Die vorgenannten den Schritt lit. b betreffenden Maßnahmen bewirken eine besonders einfache und wirtschaftliche Verfah rensführung.If the second sequence is not identical to a second one RNA sequence section, step lit. b advantage another PCR primer with a 25 to 40 bases having a section identical to the detecting RNA used. The section can be at a distance of 400 up to 600 bases 5 'of a complementary white to the first sequence tere section on the RNA to be detected. - The aforementioned step lit. b measures concerned result in a particularly simple and economical procedure leadership.

Nach einer weiteren Lösung ist ein RT-Primer vorgesehen, bei dem die erste Sequenz mit dem RNA-Sequenzabschnitt einen Schmelzpunkt aufweist, der eine RNA-spezifische Hybridisie rung ermöglicht. - Dadurch wird eine Hybridisierung mit kontaminierender DNA vermieden. Die Spezifität wird dadurch verbessert.According to a further solution, an RT primer is provided at which the first sequence with the RNA sequence section Melting point that has an RNA-specific hybridization tion enables. - This makes hybridization with contaminating DNA avoided. The specificity is thereby improved.

Der Schmelzpunkt Tm ist zweckmäßigerweise höher als der Schmelzpunkt eines aus der ersten Sequenz und sequenzidenti scher DNA gebildeten Hybrids. Die Anelierungstemperatur eines aus der ersten Sequenz und dem ersten RNA-Sequenzabschnitt gebildeten Hybrids liegt vorteilhafterweise zwischen 37 und 43°C. Sie liegt damit insbesondere niedriger als eine Anelie rungs-Temperatur bei der nachfolgenden PCR. The melting point Tm is advantageously higher than that Melting point one from the first sequence and sequence identi DNA formed hybrid. The annealing temperature of a from the first sequence and the first RNA sequence section hybrid formed is advantageously between 37 and 43 ° C. In particular, it is lower than an anelie temperature during the subsequent PCR.

Die erste Sequenz des als sogenannter Tail-RT-Primer ausge bildeten RT-Primers weist vorteilhafterweise 6 bis 10 Basen auf. Der ersten Sequenz kann eine zweite zur detektierenden RNA nicht komplementären Sequenz folgen, die zweckmäßigerwei se eine Länge von 25 bis 40, vorzugsweise 30, Basen aufweist. Die zweite Sequenz kann identisch mit einem zweiten RNA- Sequenzabschnitt sein, der vorzugsweise im Abstand von 400 bis 600 Basen, 5' des zur ersten Sequenz komplementären er sten RNA-Sequenzabschnitt sich befindet. - Ein die vorgenann ten Merkmale aufweisender RT-Primer ermöglicht auf einfache Weise eine spezifische Herstellung von zur detektierenden RNA komplementärer cDNA.The first sequence of the so-called Tail RT primer formed RT primer advantageously has 6 to 10 bases on. The first sequence can be a second one to be detected RNA does not follow a complementary sequence which is convenient se has a length of 25 to 40, preferably 30, bases. The second sequence can be identical to a second RNA Sequence section, which is preferably at a distance of 400 up to 600 bases, 5 'of the complementary to the first sequence most RNA sequence section is located. - One of the above The features of the RT primer enable simple Way a specific production of RNA to be detected complementary cDNA.

Der erfindungsgemäße RT-Primer kann auch Bestandteil eines Kits sein, der mindestens einen der folgenden weiteren Be standteile enthält: Pufferlösung, Taq-Pufferlösung, PCR- Primer, dNTP-Lösung, DTT-Lösung. Dabei ist vorteilhafterweise ein ggf. enthaltener PCR-Primer länger als die erste Sequenz des RT-Primers.The RT primer according to the invention can also be part of a Kits that the at least one of the following Be contains components: buffer solution, Taq buffer solution, PCR Primer, dNTP solution, DTT solution. It is advantageous an optional PCR primer longer than the first sequence of the RT primer.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Ausführungsbei spiele und der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:The invention is illustrated by the following embodiment games and the drawing explained in more detail. Show it:

Fig. 1a ein Sequenzprotokoll eines RNA-spezifischen RT- Tail-Primers, FIG. 1a is a sequence listing of a specific RNA-RT primer tail,

Fig. 1b ein Sequenzprotokoll eines korrespondierenden PCR- Primers, FIG. 1b is a sequence listing of a corresponding PCR primer

Fig. 2 eine erste Agarosegelelektrophorese zum Nachweis des Sensitivitätsunterschieds der RNA-spezifischen RT-PCR bei der Detektion von sequenzidentischer RNA und DNA, Fig. 2 shows a first agarose gel electrophoresis for detection of the sensitivity difference of the RNA-specific RT-PCR in the detection of identical sequence DNA and RNA,

Fig. 3 eine zweite Agarosegelektrophorese zum Nachweis der RNA-Spezifität, Fig. 3 shows a second agarose gel electrophoresis for the detection of RNA-specificity,

Fig. 4 einen Vergleich einer herkömmlichen RT-PCR mit der erfindungsgemäßen RT-PCR anhand einer dritten Aga rosegelelektrophorese und Fig. 4 rosegelelektrophorese a comparison of a conventional RT-PCR with the inventive RT-PCR using a third and Aga

Fig. 5 ein Schema zur Erläuterung der Funktionsweise des Verfahrens. Fig. 5 is a diagram for explaining the operation of the method.

In Fig. 1a ist das Sequenzprotokoll eines RNA-spezifischen RT-Tail-Primers gezeigt. Die Nukleotidnumerierung bezieht sich dabei auf den attenuierten Stamm HM 175 (nach Cohen et al., 1989, J. Virol; 63: 5364-5370). Der gezeigte RT-Tail- Primer weist hier einen aus neun zur Plusstrang-RNA sequenz komplementären Nukleotiden bestehenden Primärabschnitt A auf. Ein "Tail" bzw. Anhangsabschnitt B enthält 38 zum Templa testrang sequenzidentische Nukleotide.The sequence listing of an RNA-specific RT tail primer is shown in FIG. 1a. The nucleotide numbering relates to the attenuated strain HM 175 (according to Cohen et al., 1989, J. Virol; 63: 5364-5370). The RT tail primer shown here has a primary section A consisting of nine nucleotides complementary to the plus-strand RNA sequence. A "tail" or appendix section B contains 38 nucleotide sequences identical to the template strand.

In Fig. 1b ist die Sequenz eines PCR Primers dargestellt. Da bei handelt es sich um einen sogenannten "sense-antisense" oder "sanse"-Primer. Ein solcher PCR-Primer wird verwendet, wenn der Tail-Abschnitt B des RNA-spezifischen RT-Tail- Primers sequenzidentisch zu einer Region der zu detektieren den RNA ist.The sequence of a PCR primer is shown in FIG. 1b. Since it is a so-called "sense-antisense" or "sanse" primer. Such a PCR primer is used when the tail section B of the RNA-specific RT tail primer is sequence identical to a region of the RNA to be detected.

Fig. 2 zeigt anhand einer ersten Agarosegelelektrophorese den Sensitivitätsunterschied bei der Detektion sequenzidentischer RNA und DNA. Die ausgewiesenen Konzentrationen beziehen sich auf die Gesamtnukleinsäuremenge im RT-Ansatz. Die RNA ist hier über in vitro Transkription hergestellt und die freien Nukleotide sind abgetrennt worden. Die Nukleinsäurekonzentra tionsbestimmung ist photometrisch erfolgt. Das Amplifikati onsprodukt von 750 bp konnte im Falle der RNA bis zu einer Templatemenge von 0,16 pg detektiert werden. Im Falle der DNA lag das Detektionslimit bei 0,16 ng. Daraus folgt eine etwa 1000-fach höhere Sensitivität der erfindungsgemäßen RNA- spezifischen RT-PCR gegenüber sequenzidentischer DNA. Fig. 2 shows a first with reference to agarose gel electrophoresis, the sensitivity difference in the detection of identical sequence DNA and RNA. The concentrations shown relate to the total amount of nucleic acid in the RT mixture. The RNA is produced here via in vitro transcription and the free nucleotides have been separated. The nucleic acid concentration was determined photometrically. The amplification product of 750 bp could be detected in the case of RNA up to a template amount of 0.16 pg. In the case of DNA, the detection limit was 0.16 ng. This results in an approximately 1000-fold higher sensitivity of the RNA-specific RT-PCR according to the invention to sequence-identical DNA.

Fig. 3 zeigt anhand einer zweiten Agarosegelektrophorese den Nachweis der RNA-Spezifität gemäß Fig. 2. Dazu ist jeweils die höchste Konzentration an RNA und DNA gemäß Fig. 2, näm lich 160 ng, mit RNase verdaut worden. Wie aus Fig. 3 er sichtlich ist, ist bei der DNA die 750 bp große Bande klar erkennbar; die RNA führt dagegen nicht mehr zu einer spezifi schen Bande. Also beruht die in Fig. 2 gezeigte Amplifikation tatsächlich auf RNA. FIG. 3 shows, using a second agarose gel electrophoresis, the detection of the RNA specificity according to FIG. 2. For this purpose, the highest concentration of RNA and DNA according to FIG. 2, namely 160 ng, has been digested with RNase. As can be seen from FIG. 3, the 750 bp band is clearly recognizable in the DNA; the RNA, however, no longer leads to a specific band. So the amplification shown in Fig. 2 is actually based on RNA.

In Fig. 4 ist anhand einer dritten Agarosegelektrophorese der Vergleich einer herkömmlichen RT-PCR mit der erfindungsgemä ßen RT-PCR gezeigt. Dabei sind jeweils Zellextrakte verwendet worden, die mit in vitro transkribierter unaufgereinigter Vollängen-HAV-RNA transfiziert worden sind. Die Extrakternte ist täglich bis zu 6 Tagen nach der RNA-Transkription er folgt. Aus Fig. 4 ist erkennbar, daß bei der herkömmlichen RT-PCR bis 6 Tage nach der Transkription DNA nachgewiesen wird. Es liegt keine RNA-Spezifität vor. Bei der erfindungs gemäßen RNA-spezifischen RT-PCR ist DNA nicht nachweisbar. Bis zum Tag 3 ist mit abnehmender Intensität die transfizier te-RNA erkennbar. Ab dem Tag 4 ist die Replikation anhand ei ner Zunahme der Intensität von RNA nachweisbar.In Fig. 4 by means of a third comparison of agarose gel electrophoresis of a conventional RT-PCR with the inventive SEN RT-PCR is shown. Cell extracts were used that were transfected with in vitro transcribed uncleaned full-length HAV RNA. The extract is harvested daily up to 6 days after RNA transcription. From Fig. 4 it can be seen that in the conventional RT-PCR DNA is detected up to 6 days after the transcription. There is no RNA specificity. In the case of the RNA-specific RT-PCR according to the invention, DNA cannot be detected. Up to day 3, the transfected RNA can be recognized with decreasing intensity. From day 4, replication can be demonstrated based on an increase in the intensity of RNA.

Zur Durchführung der erfindungsgemäßen RT-PCR werden 2 µl des erfindungsgemäßen RNA-spezifischen RT-Tail-Primers (10 µM) zu sammen mit 5 µl H₂O und 5 µl Total-RNA (aus 3 × 10⁴ Zellen) 10 Minuten auf eine Temperatur von 70°C erhitzt. Sodann wird die Mischung auf Eis abgekühlt. Es wird ein RT-Mastermix zugege ben, der 2 µl 0,1 M DTT, 1 µl 10 mM dNTPS (each), 4 µl Su perskript II First-strand Puffer enthält. Die Mischung wird für 2 Minuten auf eine Temperatur von 42°C erhitzt. Anschlie ßend wird 1 µl Superskript II Reverse Transkriptase (200 U) zugegeben. Die Mischung wird 50 Minuten auf eine Temperatur von 42°C gehalten und anschließend 10 Minuten auf eine Tempe ratur von 72°C erhitzt.To carry out the RT-PCR according to the invention, 2 μl of the RNA-specific RT tail primer according to the invention (10 μM) together with 5 μl H ₂ O and 5 μl total RNA (from 3 × 10 ⁴ cells) for 10 minutes each Temperature of 70 ° C heated. The mixture is then cooled on ice. An RT master mix is added, which contains 2 µl 0.1 M DTT, 1 µl 10 mM dNTPS (each), 4 µl superscript II first-strand buffer. The mixture is heated to a temperature of 42 ° C for 2 minutes. Then 1 µl Superscript II Reverse Transcriptase (200 U) is added. The mixture is kept at a temperature of 42 ° C for 50 minutes and then heated to a temperature of 72 ° C for 10 minutes.

Zur Durchführung der PCR-Reaktion werden 2 µl des RT- Reaktionsansatzes mit 8,4 µl H₂O, 2 µl 10×Taq-Puffer, 4 µl sanse-Primer (10 µM) und 3,2 µl dNTP (2,5 nM each) versetzt. Der Ansatz wird 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Nach Zugabe von 0,5 µl Taq-DNA-Polymerase (2,5 U) werden 30 Temperaturzyklen mit den folgenden Schritten durchgeführt:
To carry out the PCR reaction, 2 ul of the RT reaction mixture with 8.4 ul H ₂ O, 2 ul 10 × Taq buffer, 4 ul sanse primer (10 ul) and 3.2 ul dNTP (2.5 nM each). The mixture is heated to 95 ° C. for 5 minutes. After adding 0.5 µl Taq DNA polymerase (2.5 U), 30 temperature cycles are carried out with the following steps:

1. Schritt: Temperaturerhöhung auf 94°C für 1 Minute,
2. Schritt: Temperaturerniedrigung auf 58°C für 1 Minute,
3. Schritt: Temperaturerhöhung auf 72°C für 1 Minute.
1st step: temperature increase to 94 ° C for 1 minute,
2nd step: temperature reduction to 58 ° C for 1 minute,
3rd step: temperature increase to 72 ° C for 1 minute.

In Fig. 5 ist nochmals schematisch das Funktionsprinzip des Verfahrens gezeigt. Da RNA/DNA-Hybride einen höheren Schmelz punkt (Tm-Wert) besitzen, als DNA/DNA-Hybride wird die Reak tionstemperatur beim Schritt lit. a so gewählt, daß eine Hy bridisierung von RNA/DNA-Hybriden, jedoch nicht von DNA/DNA- Hybriden möglich ist. Um in der nachfolgenden PCR-Reaktion keinesfalls eine Amplifizierung von DNA zuzulassen, liegt die Temperatur der Anelierungstemperatur beim Schritt lit. b mög lichst weit oberhalb der Temperatur beim Schritt lit. a. Da sequenzidentische DNA bei diesem Verfahren weitgehend diskri miniert wird, kann auf arbeits- und kostenintensive DNA- Eleminations-Arbeitsschritte verzichtet werden. Die Sensiti vität und Spezifität des Verfahrens ist erhöht.The functional principle of the method is shown again schematically in FIG. 5. Since RNA / DNA hybrids have a higher melting point (Tm value) than DNA / DNA hybrids, the reaction temperature in step lit. a chosen so that a hybridization of RNA / DNA hybrids, but not of DNA / DNA hybrids is possible. In order not to permit amplification of DNA in the subsequent PCR reaction, the temperature of the annealing temperature is at step lit. b as far as possible above the temperature in step lit. a. Since sequence-identical DNA is largely discriminated using this method, labor-intensive and cost-intensive DNA elimination steps can be dispensed with. The sensitivity and specificity of the process is increased.

Beim RNA-spezifischen RT-Primer kann es sich um ein DNA- Oligonukleotid handeln, welches vorzugsweise als RT-Primer ausgebildet ist. Dabei ist eine erste 3'-terminale Sequenz des Primers komplementär zu einem ersten RNA-Sequenzabschnitt der zu detektierenden RNA. Um eine RNA-spezifische Hybridi sierung zuzulassen, wird der Schmelzpunkt der basenkomplemen tären Region so gewählt, daß eine RNA/DNA-Hybridisierung, nicht aber eine DNA/DNA-Hybridisierung in der RT-Reaktion stattfinden kann. Die Einstellung des Schmelzpunkts bzw. der Reaktionstemperatur beim Schritt lit. a richtet sich nach der Länge der zur detektierenden RNA komplementären Region des RT-Tail-Primers. Wird die RT-Reaktion bei einer Temperatur von 37 bis 42°C durchgeführt, so beträgt die Länge der kom plementären Region des RT-Tail-Primers etwa 6 bis 10 Basen. - Nach einem Ausgestaltungsmerkmal folgt 5' der komplementären Sequenz A des RT-Tail-Primers eine zweite Sequenz B, die zur zu detektierenden RNA nicht komplementär ist. Diese besitzt eine Länge von 25 bis 40, vorzugsweise 30 Basen. Die zweite Sequenz B kann:
The RNA-specific RT primer can be a DNA oligonucleotide, which is preferably designed as an RT primer. A first 3'-terminal sequence of the primer is complementary to a first RNA sequence section of the RNA to be detected. In order to permit RNA-specific hybridization, the melting point of the base-complementary region is chosen such that RNA / DNA hybridization, but not DNA / DNA hybridization, can take place in the RT reaction. The setting of the melting point or the reaction temperature in step lit. a depends on the length of the region of the RT tail primer which is complementary to the RNA to be detected. If the RT reaction is carried out at a temperature of 37 to 42 ° C, the length of the complementary region of the RT tail primer is about 6 to 10 bases. - According to one design feature, 5 'of the complementary sequence A of the RT tail primer is followed by a second sequence B which is not complementary to the RNA to be detected. This has a length of 25 to 40, preferably 30 bases. The second sequence B can:

a) not identical to a section on the detection RNA. In this case, the following PCR reaction two primers are used, with a first primer identical to an RNA section of the RNA to be detected is selected, which is preferably about 400 to 500 bases 5 ' of the first sequence A of the RNA-specific RT tail primer complementary region is located on the RNA to be detected, while a second primer is fully (B) or partially identical (B ') to the tail sequence is.
b) be identical to an RNA section which is preferably located about 400 to 500 bases 5 'of the region complementary to the first sequence A of the RNA-specific RT tail primer on the RNA to be detected. This has the advantage that only one primer is used in the subsequent PCR reaction, which acts both as a sense and as an antisense primer. In Fig. 5, this primer is referred to as "sanse primer". This hybridizes both with the complementary sequence of the first strand of cDNA and with the tail complementary region of the second strand of cDNA (see B or B 'in FIG. 5). This eliminates competitive reactions of the primers and simplifies the process.

Claims

1. A method for the specific detection of ribonucleic acid (RNA) in the presence of sequence-identical deoxyribonucleic acid (DNA), wherein

a) a reverse transcriptase (RT) reaction is carried out, in which an RT-primer having a first (A) and a second sequence (B) has a cDNA complementary to the detected RNA and
b) the cDNA is amplified by means of polymerase chain reaction (PCR),

characterized in that the first sequence (A) hybridizes specifically to the RNA.

2. The method according to claim 1, wherein in step lit. b the Annealing temperature is chosen higher than a reak tion temperature at step lit. a.

3. The method according to any one of the preceding claims, wherein the step lit. a at one, preferably between 37 and 42 ° C, carried out reaction temperature in which the first sequence (A) is specific to RNA, but not hybridized with DNA.

4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first sequence (A) 3'-terminally arranged and complete mentally to a first RNA sequence section to de tectic RNA.

5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first sequence (A) has a length of 6 to 10 bases points.

6. The method according to any one of the preceding claims, wherein 5 'of the first sequence (A) the second one to be detected RNA non-complementary sequence (B) follows.

7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the second sequence (B) has a length of 25 to 40 preferably has 30 bases.

8. The method according to any one of the preceding claims, wherein the second sequence (B) is identical to a second RNA Sequence section, which is preferably at a distance of 400 to 600 bases, 5 'of the complete for the first sequence (A) mental first RNA sequence section is located.

9. The method according to any one of the preceding claims, wherein a step lit. b PCR primer used longer as the first sequence (A) of the RT primer is.

10. The method according to any one of the preceding claims, wherein at step lit. b identi to the second sequence (B) shear or partially identical (B ') PCR primer used becomes.

11. The method according to any one of claims 1 to 7, 9 or 10, with step lit. b another PCR primer (C) with a 25 to 40 base to detect the RNA identical section is used.

12. The method of claim 11, wherein the section is in a distance of 400 to 600 bases 5 'one to the first Sequence (A) complementary further section on the RNA to be detected.

13. RT primer for the specific detection of ribonucleic acid right (RNA) in the presence of sequence-identical deoxyribonu Small acid (DNA) with which an RNA to be detected complementary cDNA can be produced, a first 3'- terminal sequence (A) complementary to a first RNA Sequence section of the RNA to be detected, thereby characterized in that the first sequence (A) with the first RNA sequence section has a melting point (Tm), which enables RNA-specific hybridization.

14. RT primer according to claim 13, wherein the melting point (Tm) is higher than the melting point of one from the first Se sequence (A) and sequence-identical DNA formed hybrid.

15. RT primer according to claim 13 or 14, wherein the Anelie temperature of one of the first sequence (A) and the first RNA sequence section formed hybrid between 37 and 42 ° C.

16. RT primer according to one of claims 13 to 15, wherein the first sequence (A) has a length of 6 to 10 bases points.

17. RT primer according to one of claims 13 to 16, wherein 5 ' the first sequence (A) a second one to be detected RNA non-complementary sequence (B) follows.

18. RT primer according to one of claims 13 to 17, wherein the second sequence (B) a length of 25 to 40, preferably two se 30, bases.

19. RT primer according to one of claims 13 to 18, wherein the second sequence (B) identical to a second RNA Sequence section, which is preferably at a distance of 400 to 600 bases, 5 'of the complete for the first sequence (A) mental first RNA sequence section is located.

20. Kit with an RT primer according to one of claims 13 to 19 and at least one of the following further holdings parts: buffer solution, Taq buffer solution, PCR primer, dNTP- Solution, DTT solution.

21. The kit of claim 20, wherein the PCR primer is longer as the first sequence (A) of the RT primer.