DE19831609B4 - Process for the preparation of amino acids of the aspartate and / or glutamate family and agents which can be used in the process - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie, bei dem die Pyruvat-Carboxylase-Aktivität durch genetische Veränderung des Enzyms und/oder die Pyruvat-Carboxylase-Genexpression eines die entsprechende Aminosäure produzierenden Mikroorganismus erhöht wird.A process for the microbial production of amino acids of the aspartate and / or glutamate family, in which the pyruvate carboxylase activity is increased by genetic modification of the enzyme and / or the pyruvate carboxylase gene expression of a corresponding amino acid-producing microorganism.

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie gemäß den Ansprüchen 1 bis 17, Pyruvat-Carboxylase-Gene nach Anspruch 18 bis 23, Genstrukturen nach Anspruch 24, Vektoren nach Anspruch 25, transformierte Zellen nach Anspruch 26 bis 31 sowie Verwendungen nach Anspruch 32 bis 37.The The invention relates to a method for the microbial production of amino acids of the aspartate and / or glutamate family according to claims 1 to 17, pyruvate carboxylase genes according to claim 18 to 23, gene structures according to claim 24, vectors according to claim 25, transformed cells according to claim 26 to 31 and uses according to claims 32 to 37.

Aminosäuren sind von großem wirtschaftlichen Interesse, wobei die Verwendung von Aminosäuren vielfältig ist: So wird z. B. L-Lysin wie auch L-Threonin, L-Methionin und L-Tryptophan als Futtermittelzusatz benötigt, L-Glutamat als Gewürzzusatz, L-Isoleucin und L-Tyrosin in der pharmazeutischen Industrie, L-Arginin und L-Isoleucin als Medikament oder L-Glutamat, L-Aspartat und L-Phenylalanin als Ausgangssubstanz zur Synthese von Feinchemikalien.Amino acids are of great economic interest, whereby the use of amino acids is manifold: So z. L-lysine as well as L-threonine, L-methionine and L-tryptophan needed as a feed additive, L-glutamate as a spice additive, L-isoleucine and L-tyrosine in the pharmaceutical industry, L-arginine and L-isoleucine as a drug or L-glutamate, L-aspartate and L-phenylalanine as Starting substance for the synthesis of fine chemicals.

Eine bevorzugte Methode zur Herstellung dieser verschiedensten Aminosäuren ist die biotechnologische Herstellung mittels Mikroorganismen; denn auf diese Weise wird direkt die biologisch wirksame und optisch aktive Form der jeweiligen Aminosäure erhalten, und es können einfache und preisgünstige Rohstoffe eingesetzt werden. Als Mikroorganismen werden z. B. Corynebacterium glutamicum und seine Verwandten ssp. flavum und ssp. lactofermentum (Liebl et al., Int J System Bacteriol 1991, 41: 255 bis 260) wie auch Escherichia coli und verwandte Bakterien eingesetzt.A preferred method for preparing these various amino acids the biotechnological production by means of microorganisms; because In this way it becomes directly the biologically effective and optical active form of the respective amino acid, and it can be simple and inexpensive Raw materials are used. As microorganisms z. B. Corynebacterium glutamicum and its relatives ssp. flavum and ssp. lactofermentum (Liebl et al., Int J System Bacteriol 1991, 41: 255-260) as well also used Escherichia coli and related bacteria.

Diese Bakterien produzieren die Aminosäuren normalerweise aber nur in der zum Wachstum benötigten Menge, so daß also keine überschüssigen Aminosäuren gebildet und ausgeschieden werden. Dies ist darin begründet, daß in der Zelle die Biosynthese der Aminosäuren in vielfacher Weise kontrolliert wird. Folglich sind bereits verschiedenste Verfahren bekannt, um die Produktbildung durch Ausschalten der Kontrollmechanismen zu steigern. Bei diesen Prozessen werden z. B. Aminosäureanaloga eingesetzt, um die effektive Regulation der Biosynthese auszuschalten. So ist beispielsweise ein Verfahren beschrieben, bei dem Corynebacterium-Stämme benutzt werden, die gegen L-Tyrosin- und L-Phenylalaninanaloga resistent sind ( JP 19037/1976 und 39517/1978 ). Ebenso sind Verfahren beschrieben, bei denen gegenüber L-Lysin- oder auch L-Theoninanaloga resistente Bakterien eingesetzt werden, um die Kontrollmechanismen zu überwinden ( EP 0 205 849 A2 , GB 2 152 509 A .These bacteria normally produce the amino acids only in the amount needed for growth, so that no excess amino acids are formed and excreted. This is due to the fact that in the cell, the biosynthesis of the amino acids is controlled in many ways. Consequently, a variety of methods are already known to increase the product formation by switching off the control mechanisms. In these processes z. B. amino acid analogues used to eliminate the effective regulation of biosynthesis. For example, a method using Corynebacterium strains resistant to L-tyrosine and L-phenylalanine analogs is described ( JP 19037/1976 and 39517/1978 ). Also described are methods in which L-lysine or L-theonin analogues resistant bacteria are used to overcome the control mechanisms ( EP 0 205 849 A2 . GB 2 152 509 A ,

Weiterhin sind auch durch rekombinante DNA-Techniken konstruierte Mikroorgansimen bekannt, bei denen ebenfalls die Regulation der Biosynthese aufgehoben ist, indem die Gene, die für die nicht mehr feedback-inhibierbaren Schlüsselenzyme kodieren, kloniert und exprimiert werden. So ist z. B. ein rekombinantes, L-Lysin produzierendes Bakterium mit plasmid-kodierter, feedback-resistenter Aspartatkinase bekannt ( EP 0 381 527 A1 ). Ebenso ist ein rekombinantes, L-Phenylalanin produzierendes Bakterium mit feedback-resistenter Prephenatdehydrogenase beschrieben ( JP 123475/1986 , EP 0 488 424 A2 ).Furthermore, microorganisms constructed by recombinant DNA techniques are also known in which the regulation of biosynthesis is also abolished by cloning and expressing the genes which code for the no longer feedback-inhibitable key enzymes. So z. B. a recombinant, L-lysine-producing bacterium with plasmid-encoded, feedback-resistant aspartate kinase known ( EP 0 381 527 A1 ). Also described is a recombinant, L-phenylalanine-producing bacterium with feedback-resistant prephenate dehydrogenase ( JP 123475/1986 . EP 0 488 424 A2 ).

Darüber hinaus wurden auch durch Überexpression von Genen, die nicht für feedback-sensitive Enzyme der Aminosäuresynthese kodieren, erhöhte Aminosäureausbeuten erreicht. So wird z. B. die Lysinbildung durch erhöhte Synthese der Dihydrodipicolinatsynthase verbessert ( EP 0 197 335 A ). Ebenso wird durch erhöhte Synthese der Threonindehydratase eine verbesserte Isoleucinbildung erreicht ( EP 0 436 886 A ).In addition, overexpression of genes that do not code for feedback-sensitive enzymes of amino acid synthesis, increased amino acid yields were achieved. So z. B. Improves lysine formation by increased synthesis of Dihydrodipicolinatsynthase ( EP 0 197 335 A ). Likewise, increased synthesis of threonine dehydratase results in improved isoleucine formation ( EP 0 436 886 A ).

Weitere Versuche zur Erhöhung der Aminosäureproduktion zielen auf eine verbesserte Bereitstellung der zellulären Primärmetabolite des Zentralstoffwechsels. So ist bekannt, daß die durch rekombinante Techniken erreichte Überexpression der Transketolase eine verbesserte Produktbildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin ermöglicht ( EP 0 600 463 A ). Weiterhin führt die Reduktion der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität in Corynebacterium zu verbesserter Bildung aromatischer Aminosäuren ( EP 0 331 145 A1 ), wohingegen die Erhöhung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität in Corynebacterium zu erhöhter Ausscheidung von Aminosäuren der Aspartatfamilie führte ( EP 0 358 940 A1 ).Further attempts to increase amino acid production are aimed at an improved delivery of the cellular primary metabolites of the central metabolism. Thus, it is known that the transketolase overexpression achieved by recombinant techniques allows for improved product formation of L-tryptophan, L-tyrosine or L-phenylalanine ( EP 0 600 463 A ). Furthermore, the reduction of phosphoenolpyruvate carboxylase activity in Corynebacterium leads to improved formation of aromatic amino acids ( EP 0 331 145 A1 ), whereas the increase in phosphoenolpyruvate carboxylase activity in Corynebacterium resulted in increased secretion of amino acids of the aspartate family ( EP 0 358 940 A1 ).

Während des Wachstums und speziell unter Aminosäureproduktionsbedingungen muß der Tricarbonsäure-Cyclus kontinuierlich und effektiv mit C4-Verbindungen, z. B. Oxalacetat, aufgefüllt werden, um die für die Aminosäurebiosynthese abgezogenen Zwischenprodukte zu ersetzen. Bis vor kurzem hat man angenommen, daß für diese sogenannten anaplerotischen Funktionen in Corynebacterium die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase verantwortlich ist (Kinoshita, Biology of industrial micro-organisms 1985: 115 bis 142, Benjamin/Cummings Publishing Company, London; Liebl, The prokaryotes II, 1991: 1157 bis 1171, Springer Verlag N. Y.; Vallino und Stephanopoulos, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633 bis 646). Es wurde jedoch gefunden, daß Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-negative Mutanten im Vergleich zu den jeweiligen Ausgangsstämmen auf allen getesteten Medien gleich wuchsen (Peters-Wendisch et al., FEMS Microbiology Letters 1993, 112: 269 bis 274; Gubler et al., Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857 bis 863). Dieses Ergebnis zeigte, daß die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase nicht essentiell für das Wachstum ist und für die anaplerotischen Reaktionen keine oder nur eine untergeordnete Rolle spielt. Desweiteren wies das oben genannte Ergebnis darauf hin, daß es in Corynebacterium mindestens ein anderes Enzym geben muß, das für die Synthese von Oxalacetat, das für das Wachstum benötigt wird, verantwortlich ist. Kürzlich wurde auch tatsächlich eine Pyruvat-Carboxylase-Aktivität in permeabilisierten Zellen von Corynebacterium glutamicum gefunden (Peters-Wendisch et al., Microbiology 1997, 143: 1095 bis 1103). Dieses Enzym wird effektiv durch AMP, ADP und Acetyl-Coenzym A inhibiert und in Gegenwart von Laktat als Kohlenstoffquelle in erhöhter Menge gebildet. Da davon ausgegangen werden mußte, daß dieses Enzym in erster Linie für die Auffüllung des Tricarbonsäure-Cycluses beim Wachstum verantwortlich ist, war zu erwarten, daß eine Erhöhung der Genexpression bzw. der Enzymaktivität entweder zu keiner oder allenfalls zu einer geringfügigen Erhöhung der zur Aspartatfamilie gehörenden Aminosäuren führt. Desweiteren wurde erwartet, daß eine Erhöhung der Genexpression bzw. der Enzymaktivität der Pyruvat-Carboxylase ebenso keinen Einfluß auf die Produktion von Aminosäuren anderer Familien haben würde.During growth, and especially under amino acid production conditions, the tricarboxylic acid cycle must be continuously and effectively reacted with C4 compounds, e.g. As oxaloacetate, to replace the withdrawn for amino acid biosynthesis intermediates. Until recently, it has been thought that phosphoenolpyruvate carboxylase is responsible for these so-called anaplerotic functions in Corynebacterium (Kinoshita, Biology of Industrial Micro-organisms 1985: 115-142, Benjamin / Cummings Publishing Company, London; Liebl, The Prokaryotes II, 1991: 1157-1171, Springer Verlag NY, Vallino and Stephanopoulos, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633-646). However, phosphoenolpyruvate carboxylase-negative mutants were found to grow equally on all media tested (Peters-Wendisch et al., FEMS Microbiology Letters 1993, 112: 269) to 274; Gubler et al., Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857-863). This result showed that the phosphoenolpyruvate carboxylase is not essential for growth and plays no or only a minor role in the anaplerotic reactions. Furthermore, the above result indicated that there must be at least one other enzyme in Corynebacterium responsible for the synthesis of oxaloacetate needed for growth. Recently, pyruvate carboxylase activity has also been found in permeabilized cells of Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch et al., Microbiology 1997, 143: 1095-1103). This enzyme is effectively inhibited by AMP, ADP and acetyl coenzyme A and formed in the presence of lactate as a carbon source in an increased amount. Since it had to be assumed that this enzyme is primarily responsible for the replenishment of the tricarboxylic acid cycle in the growth, it was to be expected that an increase in gene expression or enzyme activity either to no or at most to a slight increase of belonging to the aspartate family Amino acids leads. Furthermore, it was expected that an increase in gene expression or enzyme activity of the pyruvate carboxylase would also have no effect on the production of amino acids of other families.

Es wurde nunmehr überraschenderweise gefunden, daß nach Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase-Aktivität durch genetische Veränderung des Enzyms und/oder nach Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase-Genexpression die mikrobielle Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder der Glutamatfamilie erhöht wird. Es zeigte sich, daß insbesondere Stämme mit erhöhter Kopienzahl des Pyruvat-Carboxylase-Gens etwa 50% mehr Lysin, 40% mehr Threonin und 150% mehr Homoserin ins Kulturmedium ausscheiden.It has now been surprisingly found that after increase pyruvate carboxylase activity genetic change of the enzyme and / or after increase the pyruvate carboxylase gene expression the microbial production of amino acids the aspartate and / or glutamate family is increased. It turned out that in particular strains with elevated Copy number of the pyruvate carboxylase gene about 50% more lysine, 40% excrete more threonine and 150% more homoserine into the culture medium.

Die genetische Veränderung der Pyruvat-Carboxylase zur Erhöhung der Enzymaktivität erfolgt vorzugsweise durch Mutation des endogenen Gens. Derartige Mutationen können entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösenden Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e).The genetic change the pyruvate carboxylase to increase the enzyme activity is preferably carried out by mutation of the endogenous gene. Such mutations can either generated by undirected classical methods, such as for example, by UV irradiation or by mutagenic chemicals, or specifically by genetic engineering methods such as deletion (s), Insertion (s) and / or nucleotide exchange (s).

Die Pyruvat-Carboxylase-Genexpression wird durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Expression des Gens positiv beeinflussen, erhöht. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem insbesondere die Transkriptionssignale erhöht werden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß durch Veränderung der dem Strukturgen vorgeschalteten Promotorsequenz der Promotor in seiner Wirksamkeit erhöht wird oder indem der Promotor komplett durch wirksamere Promotoren ausgetauscht wird. Auch kann eine Verstärkung der Transkription durch entsprechende Beeinflussung eines dem Pyruvat-Carboxylase-Gens zugeordneten Regulatorgens erfolgen. Desweitern kann ggf durch Mutation einer regulatorischen Gensequenz die Effektivität der Bindung eines Regulatorporteins an die DNA des zu regulierenden Pyruvat-Carboxylase-Gens so beeinflußt sein, daß dadurch die Transkription verstärkt und somit die Genexpression erhöht ist. Desweiteren können dem Pyruvat-Carboxylase-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sog. „enhancer” zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Pyruvat-Carboxylase-Genexpression bewirken. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA verbessert wird.The Pyruvate carboxylase gene expression is enhanced by increasing gene copy number and / or through reinforcement regulatory factors that positively influence the expression of the gene, elevated. So can a reinforcement regulatory elements preferably at the transcriptional level take place, in particular by increasing the transcription signals. This can be done, for example, that by changing the structural gene upstream promoter sequence of the promoter in its effectiveness elevated or by making the promoter complete by more effective promoters is exchanged. Also, an amplification of transcription may be due corresponding influence on a regulator gene assigned to the pyruvate carboxylase gene respectively. In addition, if necessary by mutation of a regulatory Gene sequence the effectiveness the binding of a Regulatorporteins to the DNA of the regulated Pyruvate carboxylase gene be influenced so that thereby the transcription reinforced and thus increased gene expression is. Furthermore you can but also the pyruvate carboxylase gene as regulatory sequences be assigned to so-called "enhancers", the above an improved interaction between RNA polymerase and DNA also an increased pyruvate carboxylase gene expression cause. In addition, however, an enhancement of translation is possible by for example, the stability the m-RNA is improved.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl wird das Pyruvat-Carboxylase-Gen in ein Genkonstrukt bzw. Vektor eingebaut. Das Genkonstrukt enthält insbesondere dem Pyruvat-Carboxylase-Gen zugeordnete regulatorische Sequenzen, vorzugsweise solche, die die Genexpression verstärken. Für den Einbau des Pyruvat-Carboxylase-Gens in ein Genkonstrukt wird das Gen vorzugsweise aus einem Mikroorganismen-Stamm der Gattung Corynebacterium isoliert und in einen Aminosäure-produzierenden Mikroorganismen-Stamm, insbesondere Corynebacterium oder in Escherichia coli oder Serratia marcescens, transformiert. Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich insbesondere Gene aus C. glutamicum oder C. glutamicum ssp. flavum oder C. glutamicum ssp. lactofermentum. Nach Isolierung des Gens und der in vitro-Rekombination mit bekannten Vektoren (vgl. z. B. Simon et al., Bio/Technology 1983, 1: 784 bis 791; Eikmanns et al., Gene 1991, 102: 93 bis 98) erfolgt die Transformation in die Aminosäure-produzierenden Stämme durch Elektroporation (Liebt et al., FEMS Microbiology Letters 1991, 65: 299 bis 304) oder Konjugation (Schäfer et al., J Bacteriol 1990, 172: 1663 bis 1666). Als Wirtsstämme werden vorzugsweise solche Aminosäureproduzenten eingesetzt, die in der Synthese der entsprechenden Aminosäure dereguliert sind und/oder die eine erhöhte Exportcarrier-Aktivität für die entsprechende Aminosäure aufweisen. Weiterhin werden solche Stämme bevorzugt, die einen erhöhten Anteil an solchen Zentralstoffwechselmetaboliten enthalten, die an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligt sind und/oder Stämme, die einen erniedrigten Anteil an den nicht an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Zentralstoffwechselmetaboliten enthalten, insbesondere an Metaboliten, die für Konkurrenzreaktionen zuständig sind; d. h. es werden solche Stämme bevorzugt, bei denen ein zu dem entsprechenden Aminosäurebiosyntheseweg konkurrierender Biosyntheseweg mit verminderter Aktivität abläuft. So ist insbesondere ein, gegen L-Asparaginsäure-β-Methylester (AME) resistenter coryneformer Mikroorganismen-Stamm mit reduzierter Citrat-Synthase-Aktivität geeignet ( EP 0 551 614 A2 ).To increase the gene copy number, the pyruvate carboxylase gene is incorporated into a gene construct or vector. In particular, the gene construct contains regulatory sequences associated with the pyruvate carboxylase gene, preferably those which enhance gene expression. For the incorporation of the pyruvate carboxylase gene into a gene construct, the gene is preferably isolated from a microorganism strain of the genus Corynebacterium and transformed into an amino acid-producing microorganism strain, in particular Corynebacterium or Escherichia coli or Serratia marcescens. Genes of C. glutamicum or C. glutamicum ssp. Are particularly suitable for the method according to the invention. flavum or C. glutamicum ssp. lactofermentum. After isolation of the gene and in vitro recombination with known vectors (see, for example, Simon et al., Bio / Technology 1983, 1: 784-791, Eikmanns et al., Gene 1991, 102: 93-98). transformation into the amino acid-producing strains is by electroporation (Liebt et al., FEMS Microbiology Letters 1991, 65: 299-304) or conjugation (Schäfer et al., J Bacteriol 1990, 172: 1663-1666). Preferred host strains are those amino acid producers which are deregulated in the synthesis of the corresponding amino acid and / or which have increased export carrier activity for the corresponding amino acid. Furthermore, those strains are preferred which contain an increased proportion of those central metabolite metabolites which are involved in the synthesis of the corresponding amino acid and / or strains which contain a reduced proportion of the central metabolism metabolites not involved in the synthesis of the corresponding amino acid, in particular of metabolites, responsible for competitive reactions; ie, those strains are preferred in which a correspond to the As a result, the competing biosynthetic pathway with reduced activity of the amino acid biosynthesis pathway proceeds. For example, a coryneform microorganism strain resistant to L-aspartic acid-β-methyl ester (AME) and having reduced citrate synthase activity is particularly suitable ( EP 0 551 614 A2 ).

Nach Isolierung sind Pyruvat-Carboxylase-Gene mit Nukleotidsequenzen erhältlich, die für die unter SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder deren Allelvariationen kodieren bzw. die die Nukleotidsequenz von Nukleotid 165 bis 3587 gemäß SEQ ID No. 1 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz aufweisen. Desweiteren sind Gene mit einem vorgeschalteten Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid 20 bis 109 gemäß SEQ ID No. 1 oder eine im wesentlichen gleichwirkende DNA-Sequenz erhältlich. Allelvariationen bzw. gleichwirkende DNA-Sequenzen umfassen insbesondere funktionelle Derivate, die durch Deletion(en), Insertion(en) und/oder Substitution(en) von Nukleotiden aus entsprechenden Sequenzen erhältlich sind, wobei die Enzymaktivität bzw. -funktion erhalten bleibt oder sogar erhöht ist. Diese Pyruvat-Carboxylase-Gene werden vorzugsweise im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.To Isolation are pyruvate carboxylase genes with nucleotide sequences available, the for the SEQ ID NO. 2 indicated amino acid sequence or their allelic variations encode or the nucleotide sequence of nucleotide 165 to 3587 according to SEQ ID No. 1 or a substantially identical DNA sequence. Furthermore, genes with an upstream promoter of the nucleotide sequence of Nucleotide 20 to 109 according to SEQ ID No. 1 or a substantially equivalent DNA sequence is available. Allelic variations or equivalent DNA sequences include in particular functional derivatives obtained by deletion (s), insertion (s) and / or Substitution (s) of nucleotides are obtainable from corresponding sequences, the enzyme activity or function is maintained or even increased. These pyruvate carboxylase genes are preferably used in the process according to the invention.

Dem Pyruvat-Carboxylase-Gen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne zugeordnetem Regulatorgen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Genstruktur enthalten ist.the Pyruvate carboxylase gene with or without upstream promoter or with or without associated regulatory gene, one or more DNA sequences upstream and / or downstream, so that the gene in a gene structure is included.

Dem Pyruvat-Carboxylase-Gen ist vorzugsweise der tac-Promotor (lacIQ-Gen) vorgeschaltet, wobei diesem insbesondere regulatorische Sequenzen zugeordnet sind.The pyruvate carboxylase gene is preferably preceded by the tac promoter (lacI Q gene), with this particular regulatory sequences are assigned.

Durch Klonierung des Pyruvat-Carboxylase-Gens sind Plasmide erhältlich, die das Gen enthalten und zur Transformation eines Aminosäureproduzenten geeignet sind. Die durch Transformation erhältlichen Zellen, bei denen es sich vorzugsweise um transformierte Zellen von Corynebacterium handelt, enthalten das Gen in replizierbarer Form, d. h. in zusätzlichen Kopien auf dem Chromosom, wobei die Genkopien durch Rekombination an beliebigen Stellen des Genoms integriert werden, und/oder auf einem Plasmid oder Vektor.By Cloning of the pyruvate carboxylase gene are plasmids available, containing the gene and transforming an amino acid producer are suitable. The cells obtainable by transformation in which it is preferably transformed cells of Corynebacterium contains the gene in replicable form, d. H. in additional Copies on the chromosome, where the gene copies by recombination be integrated at any point of the genome, and / or on a plasmid or vector.

Ausführungsbeispielembodiment

1. Klonierung des Pyruvat-Carboxylase-Gens aus Corynebacterium glutamicum1. Cloning of the pyruvate carboxylase gene from Corynebacterium glutamicum

Ausgehend von konservierten Bereichen aller bisher bekannten Pyruvat-Carboxylase-(pyc-)Genen, von Saccharomyces cerevisiae (J Biol Chem 1988, 263: 11493–11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307–315), Mensch (Biochim Biophys Acta 1994, 1227: 46–52), Maus (Proc Natl Acad Sci, USA 1993, 90: 1766–1770), Aedes aegypti (EMBL-GenBank: Accession Nr. L36530) sowie von Mycobacterium tubercolosis (EMBL-GenBank: Accession Nr. U00024) wurden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech). Die Primer entsprachen den Basen 810 bis 831 und 1015 bis 1037 des pyc-Gens von M. tuberculosis. Mit diesen Primern konnte mittels PCR nach der Standardmethode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) für nicht-degenerierte, homolge Primer ein Fragment von ca. 200 bp aus chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC 13032, die wie bei Eikmanns et al. (Microbiology 1994, 140: 1817–1828) beschrieben, isoliert wurde, amplifiziert werden. Die Größe von 200 bp entsprach der Erwartung für pyc-Gene. Das PCR-Produkt wurde wie bei Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463–5467) beschrieben, sequenziert. Die Sequenzierung wurde mit fluoreszenzmarkierten ddNTPs mit einer automatischen DNA-Sequenzierapparatur (Applied Biosystems) durchgeführt.outgoing of conserved regions of all previously known pyruvate carboxylase (pyc) genes, from Saccharomyces cerevisiae (J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315), human (Biochim Biophys Acta 1994, 1227: 46-52), mouse (Proc Natl Acad Sci, USA 1993, 90: 1766-1770), Aedes aegypti (EMBL GenBank: Accession No. L36530) and Mycobacterium tubercolosis (EMBL GenBank: Accession # U00024) were PCR primers synthesized (MWG Biotech). The primers corresponded to bases 810 to 831 and 1015 to 1037 of the pyc gene of M. tuberculosis. With these Primers could be amplified by PCR according to the standard method of Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) for non-degenerate, a primer yielded a fragment of about 200 bp Chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC 13032, as in Eikmanns et al. (Microbiology 1994, 140: 1817-1828) was amplified. The size of 200 bp corresponded to the Expectation for pyc genes. The PCR product was as in Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463-5467), sequenced. Sequencing was performed with fluorescently labeled ddNTPs with a automated DNA sequencing apparatus (Applied Biosystems).

Ausgehend von diesem DNA-Fragment aus C. glutamicum wurden folgende homologe Oligonukleotide hergestellt:

Figure 00080001
Starting from this DNA fragment from C. glutamicum, the following homologous oligonucleotides were prepared:
Figure 00080001

Die Oligonukleotide wurden als PCR-Primer zur Isolierung einer Sonde für das Gen der Pyruvat-Carboxylase (pyc) aus C. glutamicum verwendet. Die Primer wurden in eine PCR-Reaktion mit chromosomaler DNA von C. glutamicum und Digoxigeninmarkierten Nukleotiden eingesetzt. Die Reaktion wurde nach der Vorschrift des 'PCR DIG Labeling Kits' der Firma Boehringer Mannheim durchgeführt. Mit diesem Ansatz konnte ein Digoxigenin-markiertes DNA-Fragment amplifiziert werden, das der erwarteten Größe von ca. 200 bp entsprach. Die so hergestellte pyc-Sonde wurde dann eingesetzt, um über Southern-Blot-Hybridisierung ein DNA-Fragment in der chromosomalen DNA von C. glutamicum zu identifizieren, auf dem das pyc-Gen lokalisiert ist. Hierzu wurden jeweils 2 bis 5 μg chromosomaler DNA von C. glutamicum WT mit den Restriktionsenzymen HindIII, SphI, SalI, DraI, EcoRI und BamHI geschnitten, die erhaltenen DNA-Fragmente 16 h bei 20 V in einem 0,8%igen Agarosegel gelelektrophoretisch ihrer Größe entsprechend aufgetrennt. Die in dem Agarosegel befindlichen DNA-Fragmente wurden nach einer Methode von Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503–517) denaturiert und vakuumunterstützt mit der VacuGene Blot Apparatur von Pharmacia LKB (Uppsala, Schweden) aus der Gelmatrix auf eine Nylon-Membran (Nytran N13 von Schleicher und Schüll, Dassel, Schweiz) transferiert, immobilisiert und die Digoxigeninmarkierung mittels NBT/X-Phosphat-Umsetzung durch alkalische Phosphatase nachgewiesen. Auf diese Weise konnten folgende, mit der pyc-DNA-Sonde hybridisierende chromosomale Fragmente nachgewiesen werden: ein 17 kb HindIII-Fragment, ein 6,5 kb SalI-Fragment und ein 1,35 kb EcoRI-Fragment.The oligonucleotides were used as PCR primers to isolate a probe for the pyruvate carboxylase (pyc) gene from C. glutamicum. The primers were used in a PCR reaction with chromosomal DNA of C. glutamicum and digoxigenin-labeled nucleotides. The reaction was carried out according to the protocol of the 'PCR DIG Labeling Kit' from Boehringer Mannheim. With this approach, a digoxigenin-labeled DNA fragment could be amplified, which corresponded to the expected size of about 200 bp. The pyc probe thus prepared was then used to identify, via Southern blot hybridization, a DNA fragment in the chromosomal DNA of C. glutamicum on which the pyc gene is located. For this purpose, in each case 2 to 5 ug chromosomal DNA of C. glutamicum WT were cut with the restriction enzymes HindIII, SphI, SalI, DraI, EcoRI and BamHI, the DNA fragments obtained for 16 h at 20 V. separated in a 0.8% agarose gel gelelektrophoretisch according to their size. The DNA fragments present in the agarose gel were denatured by a method of Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517) and vacuum-assisted with the VacuGene Blot apparatus from Pharmacia LKB (Uppsala, Sweden) from the gel matrix on a nylon membrane (Nytran N13 from Schleicher and Schull, Dassel, Switzerland) transferred, immobilized and the digoxigenin labeled by NBT / X-phosphate reaction by alkaline phosphatase detected. In this way, the following chromosomal fragments hybridizing with the pyc-DNA probe could be detected: a 17 kb HindIII fragment, a 6.5 kb SalI fragment and a 1.35 kb EcoRI fragment.

Das 17 kb HindIII-Fragment wurde isoliert und subkloniert. Dazu wurde eine Cosmid-Genbank aus chromosomaler DNA von C. glutamicum im Cosmid pHC79 verwendet, die das Genom von C. glutamicum zu 99% repräsentierte (Mol Microbiol 1992, 6: 317–326). Der E. coli-Stamm DH5α wurde mit dieser Genbank mittels der CaCl2-Methode von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Habour Laborstory Press) transformiert und zu ca. 300 Kolonien pro LB-Agarplatte mit 50 μg/l Kanamycin ausplattiert (insgesamt 5000 Kolonien). Anschließend wurden die erhaltenen Transformanden auf Nytran N13-Filter übertragen und diese zur alkalischen Lyse der Zellen und Denaturierung der DNA auf mit 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl getränktem Whatmann-Papier 5 min. inkubiert. Die darauffolgende Neutralisierung erfolgte mit 1 M Tris/HCl pH 7,5 und 1,5 M NaCl. Nach Inkubation der Filter in 2 × SSC wurde die freigesetzte DNA durch UV-Bestrahlung bei 366 nm auf dem Filter fixiert. Anschließend wurden die restlichen Zelltrümmer durch Schütteln in 3 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C entfernt. Die Filter wurden in dieser Form für die Hybridisierung mit einer spezifischen pyc-Sonde, wie bei Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503–517) beschrieben, verwendet. Es wurden 3 Transformanden identifiziert, die gegen die pyc-Sonde hybridisierten. Aus diesen Transformanden wurde die Cosmid-DNA mittels Plasmid-Präparation nach der Methode der alkalischen Lyse von Birnboim (Meth Enzymol 1983, 100: 243–255) isoliert und anschließend über Restriktion und Southern-Blot Analyse auf das Vorhandensein des HindIII-Fragments getestet. Das Cosmid pHC79-10, das ein 40 kb Insert enthielt, trug das 17 kb HindIII-Fragment vollständig und wurde weiter analysiert. Es zeigte sich, daß auch nach Restriktion mit den Endonukleasen SalI und EcoRI die gleichen hybridisierenden Fragmente wie in der chromosomalen DNA, d. h. ein 6,5 kb SalI- und ein 1,35 kb EcRI-Fragment, erhalten wurden. Das 17 kb HindIII-Fragment wurde durch Restriktion mit HindIII aus dem Cosmid isoliert und in den E. coli-Vektor pUC18, der ebenfalls mit HindIII geschnitten wurde, ligiert. Es wurde eine Restriktionsanalyse des Fragments in dem resultierenden Vektor pUCpyc erstellt. Die physikalische Kartierung des Fragments ist in 1 dargestellt.The 17 kb HindIII fragment was isolated and subcloned. For this purpose, a cosmid gene library from chromosomal DNA of C. glutamicum in the cosmid pHC79 was used, which represented 99% of the genome of C. glutamicum (Mol Microbiol 1992, 6: 317-326). E. coli strain DH5α was digested with this library by the CaCl 2 method of Sambrook et al. (Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Habour Laboratory Press) and plated to about 300 colonies per LB agar plate with 50 ug / l kanamycin (a total of 5000 colonies). Subsequently, the resulting transformants were transferred to Nytran N13 filters and these for alkaline lysis of the cells and denaturation of the DNA on soaked with 0.5 M NaOH and 1.5 M NaCl Whatmann paper 5 min. incubated. The subsequent neutralization was carried out with 1 M Tris / HCl pH 7.5 and 1.5 M NaCl. After incubation of the filters in 2 × SSC, the released DNA was fixed on the filter by UV irradiation at 366 nm. Subsequently, the remaining cell debris was removed by shaking in 3 × SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. The filters were used in this form for hybridization with a specific pyc probe as described in Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517). Three transformants were identified which hybridized against the pyc probe. From these transformants, the cosmid DNA was isolated by plasmid preparation by the method of alkaline lysis of Birnboim (Meth Enzymol 1983, 100: 243-255) and then tested by restriction and Southern blot analysis for the presence of the HindIII fragment. The cosmid pHC79-10 containing a 40 kb insert completely carried the 17 kb HindIII fragment and was further analyzed. It was found that even after restriction with the endonucleases SalI and EcoRI the same hybridizing fragments as in the chromosomal DNA, ie a 6.5 kb SalI and a 1.35 kb EcRI fragment were obtained. The 17 kb HindIII fragment was isolated by restriction with HindIII from the cosmid and ligated into the E. coli vector pUC18, which was also cut with HindIII. Restriction analysis of the fragment was made in the resulting vector pUCpyc. The physical mapping of the fragment is in 1 shown.

2. Sequenzierung des Pyruvat-Carboxylase-Gens2. Sequencing of the Pyruvate Carboxylase Gene

In weiteren Subklonierungsschritten wurden ein 0,85 kb SalI-EcoRI-Fragment, das 1,35 kb EcoRI-Fragment, ein 1,6 kb EcoRI-EcoRI-StuI-Fragment sowie ein 1,6 kb ClaI-Fragment, das partiell mit dem 0,85 kb SalI-EcoRI-Fragment überlappte, durch Restriktion mit den entsprechenden Restriktionsenzymen aus dem Plasmid pUCpyc isoliert. Durch Ligation wurden die Fragmente in den jeweils entsprechend restringierten Vektor pUC18 kloniert und anschließend nach Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463–5467) wie oben beschrieben sequenziert. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden mit dem Programmpaket HUSAR (Release 3.0) des Deutschen Krebsforschungszentrums (Heidelberg) analysiert. Die Sequenzanalyse der Fragmente ergab ein durchgehendes offenes Leseraster von 3576 bp, das für eine Proteinsequenz von 1140 Aminosäuren kodiert. Ein Vergleich der abgeleiteten Proteinsequenz mit der EMBL Gen-Datenbank (Heidelberg) ergab Ähnlichkeiten zu allen bekannten Pyruvat-Carboxylasen. Die höchste Identität (62%) wurde zur putativen Pyruvat-Carboxylase aus Mycobacterium tuberculosis (EMBL-GenBank: Accession Nr. U00024) gefunden. Die Ähnlichkeit betrug, unter Berücksichtigung konservierter Aminosäureaustausche, 76%. Ein Vergleich mit den Pyruvat-Carboxylasen anderer Organismen ergab 46 bis 47% identische und 64 bis 65% ähnliche Aminosäuren (Gene 1997, 191: 47–50; J Bacteriol 1996, 178: 5960–5970; Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 1766–1770; Biochem J 1996, 316: 631–637; EMBL-GenBank: Accession Nr. L36530; J Biol Chem 1988, 263: 11493–11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307–315). Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, daß das klonierte Fragment das Gen für die Pyruvat-Carboxylase aus C. glutamicum trägt. Die Nukleotidsequenz des Gens ist unter SEQ ID No. 1 und die entsprechende Aminosäuresequenz unter SEQ ID No. 2 angegeben.In further subcloning steps, a 0.85 kb SalI-EcoRI fragment, the 1.35 kb EcoRI fragment, a 1.6 kb EcoRI-EcoRI-StuI fragment and a 1.6 kb ClaI fragment partially overlapping the 0.85 kb SalI-EcoRI fragment, by restriction with the appropriate restriction enzymes the plasmid pUCpyc isolated. By ligation the fragments became cloned into the respectively restricted vector pUC18 and subsequently according to Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463-5467) as above described sequenced. The resulting nucleotide sequences were with the program package HUSAR (Release 3.0) of the German Cancer Research Center (Heidelberg) analyzed. Sequence analysis of the fragments revealed a continuous open reading frame of 3576 bp coding for a protein sequence of 1140 amino acids coded. A comparison of the deduced protein sequence with the EMBL Gen database (Heidelberg) revealed similarities to all known Pyruvate carboxylase. The highest identity (62%) became the putative pyruvate carboxylase from Mycobacterium tuberculosis (EMBL GenBank: Accession No. U00024). The similarity was, taking into account conserved amino acid exchanges, 76%. A comparison with the pyruvate carboxylases of other organisms revealed 46 to 47% identical and 64 to 65% similar amino acids (Gene 1997, 191: 47-50; J Bacteriol 1996, 178: 5960-5970; Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 1766-1770; Biochem J 1996, 316: 631-637; EMBL GenBank: Accession # L36530; J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315). From these results, it was concluded that the cloned fragment contained the Gene for carries the pyruvate carboxylase from C. glutamicum. The nucleotide sequence of Gene is under SEQ ID no. 1 and the corresponding amino acid sequence under SEQ ID no. 2 indicated.

3. Überexpression des Pyruvat-Carboxylase-Gens3. overexpression of the pyruvate carboxylase gene

Zur Überexpression des Gens für die Pyruvat-Carboxylase aus C. glutamicum wurde das Gen aus dem Plasmid pUCpyc als 6,2 kb SspI-ScaI-Fragment in den E. coli-C. Glutamicum-Pendelvektor pEK0 (Gene 1991, 102: 93–98) kloniert, der mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PstI geschnitten wurde. Mittels Klenow-Polymerase-Behandlung wurden die überhängenden Enden zu glatten Enden aufgefüllt (EcoRI) bzw. abgedaut (PstI), und der linearisierte Vektor wurde mit dem 6,2 kb SspI-ScaI-Fragment ligiert. Das erhaltene Konstrukt pEK0pyc wurde zunächst in den Stamm E. coli DH5α transformiert, die Plasmid-DNA auf den erhaltenen Transformanden isoliert und auf die Richtigkeit des Inserts durch Restriktion kontrolliert. Die DNA wurde anschließend in den Stamm SP733 durch Elektroporation eingebracht (FEMS Microbiol Lett 1989, 65: 299–304). Bei diesem Stamm handelt es sich um eine Mutante des restriktionsnegativen C. glutamicum Stammes R127 (Dechema Biotechnology Conference 1990, 4: 323–327, Verlag Chemie), die durch chemische Mutagenese erhalten worden war und sich dadurch auszeichnet, daß sie nicht auf Minimalmedium mit Pyruvat und Lactat als einziger Kohlenstoffquelle wachsen kann (Microbiology 1997, 143: 1095–1103). Dieser Phänotyp wird durch einen Defekt in der Pyruvat-Carboxylase hervorgerufen und konnte durch das Einbringen des Pyruvat-Carboxylase-Gens aus C. glutamicum komplementiert werden, d. h. der Stamm, der das Plasmid pEK0pyc trägt, war im Gegensatz zum Ausgangsstamm wieder in der Lage auf Minimalmedium mit Lactat als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Damit war auch der Beweis erbracht, daß das Gen für eine funktionelle Pyruvat-Carboxylase kodiert.For overexpression of the gene for the pyruvate carboxylase from C. glutamicum, the gene from the plasmid pUCpyc as 6.2 kb SspI-ScaI fragment in the E. coli C was. Glutamicum shuttle vector pEK0 (Gene 1991, 102: 93-98), which was cut with the restriction endonucleases EcoRI and PstI. By means of Klenow polymerase treatment, the overhanging ends were made blunt ended (EcoRI) or digested (PstI), and the linearized vector was ligated with the 6.2 kb SspI-ScaI fragment. The obtained Construct pEK0pyc was first transformed into strain E. coli DH5α, the plasmid DNA isolated on the resulting transformants and checked for the correctness of the insert by restriction. The DNA was subsequently introduced into strain SP733 by electroporation (FEMS Microbiol Lett 1989, 65: 299-304). This strain is a mutant of the restriction-negative C. glutamicum strain R127 (Dechema Biotechnology Conference 1990, 4: 323-327, Verlag Chemie), which was obtained by chemical mutagenesis and is characterized in that it is not on minimal medium with Pyruvate and lactate as sole carbon source can grow (Microbiology 1997, 143: 1095-1103). This phenotype is caused by a defect in the pyruvate carboxylase and could be complemented by the introduction of the pyruvate carboxylase gene from C. glutamicum, ie, the strain carrying the plasmid pEK0pyc was able again in contrast to the parent strain Minimal medium with lactate as sole carbon source to grow. This was also proof that the gene codes for a functional pyruvate carboxylase.

Darüber hinaus wurde das Plasmid pEK0pyc in den C. glutamicum Wildtyp ATCC 13032 durch Elektroporation transformiert. Der resultierende Stamm WT (pEK0pyc) wurde im Vergleich zum Wildtyp ATCC 13032 bezüglich seiner Pyruvat-Carboxylase-Aktivität untersucht. Die Stämme wurden in Komplexmedium (Luria-Bertani, Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laborstory Press) mit 0,5% Lactat und auf Minimalmedium mit 2% Lactat bzw. 4% Glukose gezüchtet, und der Pyruvat-Carboxylase-Test wurde entsprechend der Methode, wie sie bei Peters-Wendisch et al. (Microbiology 1997, 143: 1095–1103) beschrieben wurde, durchgeführt. Das Ergebnis der Analyse (Tabelle 1) zeigt, daß die Pyruvat-Carboxylase-Aktivität im pEK0-pyc-tragenden Stamm ca. 4-fach höher als im Ausgangsstamm war.Furthermore was the plasmid pEK0pyc in the C. glutamicum wild type ATCC 13032 transformed by electroporation. The resulting strain WT (pEK0pyc) was compared to the wild type ATCC 13032 in terms of its Investigated pyruvate carboxylase activity. The tribes were in complex medium (Luria-Bertani, Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) with 0.5% lactate and on minimal medium with 2% lactate or 4% glucose, and the pyruvate carboxylase assay was performed according to the method as described by Peters-Wendisch et al. (Microbiology 1997, 143: 1095-1103) was performed. The result of the analysis (Table 1) shows that the pyruvate carboxylase activity in the pEK0-pyc carrying Trunk about 4 times higher when was in the starting trunk.

4. Gesteigerte Akkumulation von Lysin durch Überexpression des Pyruvat-Carboxylase-Gens im Stamm C. glutamicum DG52-54. Increased accumulation of lysine by overexpression of the pyruvate carboxylase gene in strain C. glutamicum DG52-5

Zur Untersuchung der Auswirkung der Überexpression des Gens für die Pyruvat-Carboxylase in dem Lysin-Produktionsstamm DG52-5 (J Gen Microbiol 1988, 134: 3221–3229) wurde der Expressionsvektor pVWEX1 verwendet, der eine IPTG-induzierbare Expression erlaubt. In diesen Vektor wurde das pyc Gen promotorlos hinein kloniert. Dazu wurden zunächst PCR-Primer (Primer 1 = Position 112 – 133; Primer 2 = Position 373 bis 355 in der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1) synthetisiert und 261 bp des promotorlosen Anfangsbereichs des Pyruvat-Carboxylase-Gens mittels PCR amplifiziert. Die Primer wurden so gewählt, daß Primer 1 eine PstI-Schnittstelle vermittelt und Primer 2 eine BamHI-Schnittstelle. Nach der PCR wurde das erhaltene 274 bp PCR-Produkt isoliert, zu Konkatemeren ligiert und anschließend mit den Restriktionsenzymen PstI und BamHI geschnitten. Der Restriktionsansatz wurde durch Ethanol-Fällung ankonzentriert und anschließend mit dem PstI-BamHI-geschnittenen Vektor pVWEX1 ligiert. Das erhaltene Konstrukt pVWEX1-PCR wurde durch Restriktion getestet. Der Endbereich des pyc Gens wurde durch RcaI-Klenow-SalI-Behandlung aus dem Vektor pEK0pyc isoliert und in den BamHI-Klenow-SalI behandelten Vektor pVWEX1-PCR ligiert. Das erhaltene Konstrukt pVWEX1pyc wurde durch Restriktionskartierung analysiert. Eine physikalische Karte des Plasmids ist in 2 gezeigt.To study the effect of overexpression of the gene for the pyruvate carboxylase in the lysine production strain DG52-5 (J Gen Microbiol 1988, 134: 3221-3229), the expression vector pVWEX1 was used which allows IPTG-inducible expression. In this vector, the pyc gene was cloned into it promoterless. For this purpose, PCR primers (primer 1 = position 112-133, primer 2 = position 373 to 355 in the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1) were first synthesized and 261 bp of the promoterless initial region of the pyruvate carboxylase gene were amplified by means of PCR. The primers were chosen such that primer 1 mediates a PstI site and primer 2 a BamHI site. After PCR, the resulting 274 bp PCR product was isolated, ligated to concatemers, and then cut with the restriction enzymes PstI and BamHI. The restriction mixture was concentrated by ethanol precipitation and then ligated with the PstI-BamHI cut vector pVWEX1. The resulting construct pVWEX1-PCR was tested by restriction. The end region of the pyc gene was isolated from the vector pEK0pyc by RcaI-Klenow-SalI treatment and ligated into the BamHI-Klenow-SalI treated vector pVWEX1-PCR. The resulting construct pVWEX1pyc was analyzed by restriction mapping. A physical map of the plasmid is in 2 shown.

Das Plasmid wurde durch Elektroporation in den C. glutamicum Stamm DG52-5 eingebracht. Als Kontrolle wurde der Stamm DG52-5 mit dem Vektor pVWEX1 ohne Insert transformiert und die L-Lysinausscheidung jeweils drei verschiedener Transformanden verglichen. Dazu wurden DG52-5(pVWEX1)1, 2 und 3 sowie DG52-5(pVWEX1pyc)3, 4 und 6 in Komplexmedium (2XTY; Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laborstory Press; mit 50 μg/l Kanamycin) gezüchtet und das Fermentationsmedium CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595–5603) jeweils aus den Vorkulturen getrennt beimpft. Das Medium enthielt zusätzlich Kanamycin, um die Plasmide stabil zu halten. Es wurden jeweils zwei parallele Ansätze durchgeführt, wobei einem Kolben 200 μg IPTG/ml zugesetzt wurde, während der zweite Kolben kein IPTG enthielt. Nach Kultivierung für 48 Stunden bei 30°C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Upm wurde die in das Medium akkumulierte Lysinmenge bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (J Chromat 1983, 266: 471–482). Das Ergebnis der Fermentation ist in Tabelle 2 dargestellt, wobei die angegebenen Werte Mittelwerte aus jeweils drei Experimenten mit unterschiedlichen Klonen darstellen. Es zeigte sich, daß die Überexpression des Pyruvat-Carboxylase-Gens zu einer um 50% gesteigerten Akkumulation von Lysin im Medium führt. Somit stellt die Nutzung des entdeckten und beschriebenen Gens für das anaplerotische Enzym Pyruvat-Carboxylase ein Verfahren dar, um die L-Lysinbildung entscheidend zu verbessern.The Plasmid was electroporated into the C. glutamicum strain DG52-5 brought in. As a control, the strain DG52-5 with the vector pVWEX1 transformed without insert and the L-lysine excretion in each case compared three different transformants. For this, DG52-5 (pVWEX1) 1, 2 and 3 and DG52-5 (pVWEX1pyc) 3, 4 and 6 in complex medium (2XTY; Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; with 50 μg / l Kanamycin) and the fermentation medium CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603), respectively inoculated separately from the precultures. The medium additionally contained kanamycin, to keep the plasmids stable. There were two parallel ones approaches performed, where one plunger 200 μg IPTG / ml was added while the second piston did not contain IPTG. After cultivation for 48 hours at 30 ° C on the rotary shaker at 120 rpm, the amount of lysine accumulated in the medium was determined. The determination of the amino acid concentration was carried out by high pressure liquid chromatography (J Chromat 1983, 266: 471-482). The result of the fermentation is shown in Table 2, wherein the given values mean values from three experiments each represent with different clones. It was found that overexpression of the pyruvate carboxylase gene leads to a 50% increase in the accumulation of lysine in the medium. Consequently represents the use of the discovered and described gene for the anaplerotic Enzyme pyruvate carboxylase is a method to the L-lysine formation to improve decisively.

5. Gesteigerte Akkumulation von Threonin und Homoserin durch Überexpression des Pyruvat-Carboxylase-Gens im Stamm C. glutamicum DM368-35. Increased accumulation of threonine and homoserine by overexpression of the pyruvate carboxylase gene in strain C. glutamicum DM368-3

Analog zu den Experimenten zur L-Lysin-Bildung wurde auch die Akkumulation von Threonin im Kulturüberstand durch Überexpression des Gens für die Pyruvat-Carboxylase untersucht. Hierzu wurde, wie unter Punkt 4 beschrieben, der Threoninproduktionsstamm C. glutamicum DM368-3 (Degussa AG) mit dem Plasmid pVWEX1pyc sowie zur Kontrolle mit dem Plasmid pVWEX1 transformiert und die Threoninausscheidung von jeweils drei verschiedenen Transformanden untersucht. Dazu wurden DM368-3(pVWEX1)1, 2 und 3 sowie DM368-3(pVWEX1pyc)1, 2 und 3 in Komplexmedium (2 × TY mit 50 μg/l Kanamycin) gezüchtet und das Fermentationsmedium CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595–5603) jeweils aus den Vorkulturen getrennt beimpft. Das Medium enthielt zusätzlich Kanamycin, um die Plasmide stabil zu halten. Es wurden zwei parallele Ansätze durchgeführt, wobei einem Kolben 200 μ IPTG/ml zugesetzt wurde, während der zweite Kolben kein IPTG enthielt. Nach Kultivierung für 48 Stunden bei 30°C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Upm wurde die in das Medium akkumulierte Threoninmenge bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte ebenfalls mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (J Chromat 1983, 266: 471–482). Das Ergebnis der Fermentation ist in Tabelle 3 dargestellt, wobei die angegebenen Werte Mittelwerte aus jeweils drei Experimenten mit unterschiedlichen Klonen darstellen. Es zeigte sich, daß die Überexpression des Pyruvat-Carboxylase-Gens zu einer ca. 40%igen Steigerung der Threoninkonzentration im Medium führt. Somit stell die Nutzung des endeckten und beschriebenen Gens für das anaplerotische Enzym Pyruvat-Carboxylase ein Verfahren dar, um die L-Threoninbildung entscheidend zu verbessern.Analogous Accumulation also became one of the experiments on L-lysine formation of threonine in the culture supernatant by overexpression of the gene for the pyruvate carboxylase examined. For this purpose, as described under point 4, the threonine production strain C. glutamicum DM368-3 (Degussa AG) with the plasmid pVWEX1pyc as well transformed for control with the plasmid pVWEX1 and the threonine excretion each of three different transformants examined. In addition were DM368-3 (pVWEX1) 1, 2 and 3 and DM368-3 (pVWEX1pyc) 1, 2 and 3 in Complex medium (2 × TY with 50 μg / l Kanamycin) and the fermentation medium CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603), respectively inoculated separately from the precultures. The medium additionally contained kanamycin, to keep the plasmids stable. Two parallel approaches were performed, with a flask 200 μ IPTG / ml was added while the second piston did not contain IPTG. After cultivation for 48 hours at 30 ° C on the rotary shaker at 120 rpm, the amount of threonine accumulated in the medium was determined. The determination of the amino acid concentration was also done by high pressure liquid chromatography (J Chromat 1983, 266: 471-482). The result of the fermentation is shown in Table 3, wherein the given values are averages of three experiments each with represent different clones. It was found that overexpression of the pyruvate carboxylase gene to an approximately 40% increase in Threonine concentration in the medium leads. Thus, the use of the discovered and described gene for the anaplerotic enzyme Pyruvate carboxylase a method to decisively improve L-threonine formation.

Desweiteren zeigte die Aminosäurekonzentrationsbestimmung, daß überraschenderweise der Stamm mit überexprimiertem Pyruvat-Carboxylase-Gen außerdem etwa 150% mehr Homoserin ins Medium ausschied als der Stamm mit nicht überexprimiertem Gen. Die entsprechenden Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 3 dargestellt. Sie machen deutlich, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren sowohl die Threonin- als auch die Homoserinbildung entscheidend verbessert werden kann. Stamm IPTG [μg/ml] Pyruvat-Carboxylase [nmol min–1 mg Trockengewicht–1] 13032(pEK0pyc) 0 75 ± 13 ATCC 13032 0 19 ± 4 DG52-5(pVWEX1pyc) 200 0 88 ± 13 11 ± 2 DG52-5(pVWEX1) 200 0 5 ± 2 6 ± 1 DM368-3(pVWEX1pyc) 200 0 76 ± 10 12 ± 3 DM363-3(pVWEX1) 200 0 10 ± 1 11 ± 2 Tabelle 1 Stamm IPTG [μg/ml] Lysin [mM] DG52-5(pVWEX1pyc) 200 0 35,4 ± 2,6 23,6 ± 2,9 DG52-5(pVWEX1) 200 0 23,3 ± 2,9 22,1 ± 4,0 Tabelle 2 Stamm IPTG [μg/ml] Threonin [mM] Homoserin [mM] DM368-3(pVWEX1pyc) 200 0 10,2 ± 0,5 7,9 ± 1,0 14,4 ± 1,2 5,6 ± 0,2 DM368-3(pVWEX1) 200 0 8,0 ± 0,5 7,5 ± 0,8 5,8 ± 0,7 6,1 ± 1,0 Tabelle 3 SEQUENZPROTOKOLL

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Furthermore, the amino acid concentration determination showed that, surprisingly, the overexpressed pyruvate carboxylase gene strain also secreted about 150% more homoserine into the medium than the non-overexpressed gene strain. The corresponding results are also shown in Table 3. They make it clear that both threonine and homoserine formation can be decisively improved by the process according to the invention. tribe IPTG [μg / ml] Pyruvate carboxylase [nmol min -1 mg dry weight -1 ] 13032 (pEK0pyc) 0 75 ± 13 ATCC 13032 0 19 ± 4 DG52-5 (pVWEX1pyc) 200 0 88 ± 13 11 ± 2 DG52-5 (pVWEx1) 200 0 5 ± 2 6 ± 1 DM368-3 (pVWEX1pyc) 200 0 76 ± 10 12 ± 3 DM363-3 (pVWEx1) 200 0 10 ± 1 11 ± 2 Table 1 tribe IPTG [μg / ml] Lysine [mM] DG52-5 (pVWEX1pyc) 200 0 35.4 ± 2.6 23.6 ± 2.9 DG52-5 (pVWEx1) 200 0 23.3 ± 2.9 22.1 ± 4.0 Table 2 tribe IPTG [μg / ml] Threonine [mM] Homoserine [mM] DM368-3 (pVWEX1pyc) 200 0 10.2 ± 0.5 7.9 ± 1.0 14.4 ± 1.2 5.6 ± 0.2 DM368-3 (pVWEx1) 200 0 8.0 ± 0.5 7.5 ± 0.8 5.8 ± 0.7 6.1 ± 1.0 Table 3 SEQUENCE LISTING
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Claims (37)

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie, bei dem die Pyruvat-Carboxylase-Aktivität durch genetische Veränderung des Enzyms und/oder die Pyruvat-Carboxylase-Genexpression eines die entsprechende Aminosäure produzierenden Mikroorganismus erhöht wird.Process for the microbial production of amino acids Aspartate and / or Glutamate family in which the pyruvate carboxylase activity by genetic change of the enzyme and / or pyruvate carboxylase gene expression of a corresponding amino acid producing microorganism is increased. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch Mutation des endogenen Pyruvat-Carboxylase-Gens ein Enzym mit höherer Pyruvat-Carboxylase-Aktivität erzeugt wird.Method according to claim 1, characterized in that that by Mutation of the endogenous pyruvate carboxylase gene produces an enzyme with higher pyruvate carboxylase activity becomes. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression der Pyruvat-Carboxylase durch Erhöhen der Genkopienzahl erhöht wird.Method according to claim 1 or 2, characterized that the Gene expression of pyruvate carboxylase is increased by increasing the gene copy number. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung der Genkopienzahl das Pyruvat-Carboxylase-Gen in ein Genkonstrukt eingebaut wird.Method according to claim 3, characterized that to increase gene copy number the pyruvate carboxylase gene into a gene construct is installed. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen in ein Genkonstrukt eingebaut wird, das dem Pyruvat-Carboxylase-Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen enthält.Method according to claim 4, characterized in that that this Gene is incorporated into a gene construct associated with the pyruvate carboxylase gene contains regulatory gene sequences. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein die entsprechende Aminosäure produzierender Mikroorganismus mit dem das Gen enthaltende Genkonstrukt transformiert wird.Method according to claim 4 or 5, characterized the existence producing the corresponding amino acid Microorganism with the gene construct containing the gene transformed becomes. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium mit dem das Gen enthaltende Genkonstrukt transformiert wird.Method according to Claim 6, characterized the existence Microorganism of the genus Corynebacterium containing the gene Gene construct is transformed. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transformation ein Mikroorganismus eingesetzt wird, in dem die an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Enzyme dereguliert sind und/oder die eine erhöhte Exportcarrier-Aktivität für die entsprechende Aminosäure aufweisen.Method according to claim 6 or 7, characterized that for the transformation a microorganism is used in which the synthesis the corresponding amino acid involved enzymes are deregulated and / or the increased export carrier activity for the corresponding amino acid exhibit. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transformation ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der einen erhöhten Anteil an den an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Zentralstoffwechselmetaboliten enthält.Method according to one of claims 6 to 8, characterized that for the transformation a microorganism is used which has an increased proportion to the central metabolism metabolites involved in the synthesis of the corresponding amino acid contains. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transformation ein Mikroorganismus eingesetzt wird, bei dem ein zu dem entsprechenden Aminosäurebiosyntheseweg konkurrierender Biosyntheseweg mit verminderter Aktivität abläuft.Method according to one of claims 6 to 9, characterized that for the transformation a microorganism is used in which one to the corresponding Aminosäurebiosyntheseweg competitive biosynthetic pathway with reduced activity. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Pyruvat-Carboxylase-Gen aus einem Mikroorganismus-Stamm der Gattung Corynebacterium isoliert wird.Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that Pyruvate carboxylase gene from a microorganism strain of the genus Corynebacterium is isolated. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression durch Verstärkung der Transkriptionssignale erhöht wird.Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that Gene expression by amplification the transcription signals increased becomes. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dem Pyruvat-Carboxylase-Gen der tac-Promotor vorgeschaltet wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the pyru Vat carboxylase gene is preceded by the tac promoter. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch dem tac-Promotor zugeordnete regulatorische Sequenzen.A method according to claim 13, characterized by regulatory sequences associated with the tac promoter. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Pyruvat-Carboxylase-Gen ein Gen mit einer für die unter SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz und deren Allelvariationen kodierenden Nukleotidsequenz eingesetzt wird.Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that as Pyruvate carboxylase gene is a gene with one of the SEQ ID NO. 2 specified amino acid sequence and their allelic variations encoding nucleotide sequence used becomes. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Pyruvat-Carboxylase-Gen ein Gen mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 165 bis 3587 gemäß SEQ ID No. 1 eingesetzt wird.Method according to claim 15, characterized in that that as Pyruvate carboxylase gene a gene with the nucleotide sequence of nucleotide 165 to 3587 according to SEQ ID No. 1 is used. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung von Lysin, Threonin, Homoserin, Glutamat und/oder Arginin.Method according to one of the preceding claims Production of lysine, threonine, homoserine, glutamate and / or arginine. Pyruvat-Carboxylase-Gen mit einer für die unter SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen kodierenden Nukleotidsequenz.Pyruvate carboxylase gene with one for the under SEQ ID no. 2 indicated amino acid sequence and / or their allelic variations encoding nucleotide sequence. Pyruvat-Carboxylase-Gen nach Anspruch 18 mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 165 bis 3587 gemäß SEQ ID Nr. 1.Pyruvate carboxylase gene according to claim 18 with the Nucleotide sequence of nucleotide 165 to 3587 according to SEQ ID No. 1. Pyruvat-Carboxylase-Gen nach Anspruch 18 oder 19 mit einem vorgeschalteten Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid 20 bis 109 gemäß SEQ ID No. 1.Pyruvate carboxylase gene according to claim 18 or 19 with an upstream promoter of the nucleotide sequence of nucleotide 20 to 109 according to SEQ ID No. 1. Pyruvat-Carboxylase-Gen nach Anspruch 18 oder 19 mit vorgeschaltetem tac-PromotorPyruvate carboxylase gene according to claim 18 or 19 with upstream tac promoter Pyruvat-Carboxylase-Gen nach Anspruch 21 mit dem Promotor zugeordneten regulatorischen Sequenzen.Pyruvate carboxylase gene according to claim 21 with the Promoter associated regulatory sequences. Pyruvat-Carboxylase-Gen nach einem der Ansprüche 18 bis 20 mit diesem zugeordnete regulatorische Gensequenzen.Pyruvate carboxylase gene according to any one of claims 18 to 20 associated with this regulatory gene sequences. Genstruktur, enthaltend ein Pyruvat-Carboxylase-Gen nach einem der Ansprüche 18 bis 23.Gene structure containing a pyruvate carboxylase gene according to one of the claims 18 to 23. Vektor, enthaltend ein Pyruvat-Carboxylase-Gen nach einem der Ansprüche 18 bis 23 oder eine Genstruktur nach Anspruch 24.Vector containing a pyruvate carboxylase gene one of the claims 18 to 23 or a gene structure according to claim 24. Transformierte Zelle, enthaltend in replizierbarer Form ein Pyruvat-Carboxylase-Gen nach einem der Ansprüche 18 bis 23 oder eine Genstruktur nach Anspruch 24.Transformed cell containing in replicable Form a pyruvate carboxylase gene according to one of the claims 18 to 23 or a gene structure according to claim 24. Transformierte Zelle nach Anspruch 26, enthaltend einen Vektor nach Anspruch 25.A transformed cell according to claim 26, comprising A vector according to claim 25. Transformierte Zelle nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Gattung Corynebacterium angehört.A transformed cell according to claim 26 or 27, characterized characterized in that they belongs to the genus Corynebacterium. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß in dieser die an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Enzyme und/oder die am Export der entsprechenden Aminosäure beteiligten Enzyme dereguliert sind.A transformed cell according to any one of claims 26 to 28, characterized in that in these involved in the synthesis of the corresponding amino acid Enzymes and / or those involved in the export of the corresponding amino acid Enzymes are deregulated. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen erhöhten Anteil an den an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Zentralstoffwechselmetaboliten enthält.A transformed cell according to any one of claims 26 to 29, characterized in that an elevated one Share of those involved in the synthesis of the corresponding amino acid Contains central metabolite metabolites. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen erniedrigten Anteil an den nicht an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Zentralstoffwechselmetaboliten enthält.A transformed cell according to any one of claims 26 to 30, characterized in that a reduced proportion of those not involved in the synthesis of the corresponding amino acid contains central metabolism metabolites involved. Verwendung eines Pyruvat-Carboxylase-Gens zur Steigerung der Produktion von aus der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie stammenden Aminosäuren von Mikroorganismen.Use of a pyruvate carboxylase gene for enhancement production of the aspartate and / or glutamate family amino acids of microorganisms. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein mutiertes Pyruvat-Carboxylase-Gen, das für ein Enzym mit erhöhter Pyruvat-Carboxylase-Aktivität kodiert, verwendet wird.Use according to claim 32, characterized the existence mutant pyruvate carboxylase gene coding for an enzyme with increased pyruvate carboxylase activity, is used. Verwendung nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß der die entsprechende Aminosäure produzierende Mikroorganismus mit einem Genkonstrukt, das ein Pyruvat-Carboxylase-Gen enthält, transformiert wird.Use according to claim 32 or 33, characterized that the the corresponding amino acid producing microorganism with a gene construct containing a pyruvate carboxylase gene contains, transformed becomes. Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Genkonstrukt zusätzlich regulatorische Gensequenzen enthält.Use according to claim 34, characterized that this Gene construct additionally contains regulatory gene sequences. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pyruvat-Carboxylase-Gen aus Corynebacterium verwendet wird.Use according to one of claims 32 to 35, characterized the existence Pyruvate carboxylase gene from Corynebacterium is used. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminosäure-produzierender Mikroorganismus Corynebacterium verwendet wird.Use according to one of claims 32 to 36, characterized that as Amino acid-producing Microorganism Corynebacterium is used.
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