DE19831210A1 - Method and apparatus for two-dimensional separation of biomolecules - Google Patents

Method and apparatus for two-dimensional separation of biomolecules

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DE19831210A1
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gels
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separation
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DE1998131210
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Brigitte Wittmann-Liebold
Christian Scheler
Christian Wurzel
Andreas Reuter
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WITA PROTEOMICS AG, 14513 TELTOW, DE
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Wita Wittmann Institute Of Technology And Analysis Of Biomolecules GmbH
Wita Wittmann Inst Of Tec GmbH
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00Investigating or analysing materials by the use of electric, electro-chemical, or magnetic means
    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electro-chemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44773Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis

Abstract

The present invention relates to a method and to devices for the electrophoresis separation of gel biomolecules into one and two dimensions in an electrophoresis apparatus. This invention can essentially be used for separating proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleic acids or cellular complexes, etc. A first device according to this invention is characterised in that a combined electrophoresis chamber (1) comprises a central portion (2) with cooling members (3). These members are arranged under electrophoresis chambers (6, 7) which are formed on either side of the central portion (2) by a plurality of inner (4) and outer (5) plates interacting with isolation members (9) which can be removed or switched. The cooling members are also arranged under buffer vessels (8, 21). A second combined chamber is also provided for the electrophoresis separation of biomolecules or other mixtures of substances in the form of horizontally superposed gels into one or two dimensions, wherein said chamber comprises a base-wall plate as well as a cover plate. This invention further relates to a method for carrying out the separation into one and into two dimensions, as well as to the formulation of specific gels.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen in Gelen durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur und dient insbesondere der Auftrennung von beispielsweise Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen, Nukleinsäuren oder Zellkomplexen in Gelen (z. B. in Polyacrylamidgelen, Harnstoffgelen oder Agarosegelen) in zwei Dimensionen. The present invention relates to a method and an apparatus for two-dimensional separation of biomolecules in gels by electrophoresis in an electrophoresis apparatus and serves, in particular the separation of, for example, proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleic acids or cell complexes in gels (for. Example in polyacrylamide gels, urea gels or agarose gels) in two dimensions.

Proteine und Peptide sind Biopolymere, die zu Tausenden in jeder Zelle vorkommen; Proteins and peptides are biopolymers which occur thousands in each cell; sie sind die unmittelbaren Genprodukte, die alle Zellprozesse katalysieren, stimulieren und regulieren. they are the direct gene products that catalyze all cellular processes stimulate and regulate. Ihre Struktur und Funktionsanalyse bildet die Basis für die Aufklärung aller wichtigen Zellvorgänge und ist die Grundlage zum Verständnis von Krankheitsprozessen auf der molekularen Ebene und in der molekularen Medizin, z. Their structure and function analysis forms the basis for the investigation of all essential cellular processes and is the basis for the understanding of disease processes at the molecular level and in molecular medicine, z. B. bei der Tumorentstehung und zur Entwicklung von Frühdiagnostika und neuen Therapeutika in der Pharmaindustrie. As in tumorigenesis and the development of early diagnostics and new drugs in the pharmaceutical industry. Wegen der oft sehr geringen Konzentrationen, in denen die Peptide und Proteine in der Zelle vorkommen, ist es notwendig, hochempfindliche Nachweismethoden und Trenntechniken für ihre Charakterisierung zu entwickeln. Because of the often very low concentrations, in which the peptides and proteins present in the cell, it is necessary to develop highly sensitive detection methods and separation techniques for their characterization.

Proteine sind aus langen Ketten von Aminosäuren aufge baut und weisen eine für jedes Protein spezifische räumliche Struktur auf. Proteins are built up of long chains of amino acids and have a specific for each protein spatial structure. Jedes Protein hat eine indivi duelle Aminosäurefolge, die Primärsequenz, die sich zu einer jeweils spezifischen Raumstruktur (3D-Struktur) auffaltet, die Träger der physiologischen Funktion im Zellgeschehen ist. Each protein has an indi vidual amino acid sequence, the primary sequence which unfolds to a respective specific spatial structure (3D structure), the carrier of the physiological function in cellular processes. Proteine nehmen als direkte Genpro dukte eine zentrale Stellung bei allen Lebensprozessen ein. Proteins take as direct-products genpro a central role in all life processes. Sie katalysieren die biosynthetischen Vorgänge als Enzyme, bauen den Organismus als Strukturproteine auf, bewerkstelligen Stofftransport und Signaltransduktion und spielen eine wesentliche Rolle bei der Translation der Erbinformation (Proteinbiosynthese) und bei allen Regulationsvorgängen. They catalyze the biosynthetic processes as enzymes build the organism as structural proteins accomplish mass transport and signal transduction and play a key role in the translation of genetic information (protein synthesis) and all regulatory processes. Eine einzelne Zelle enthält über 5000 unterschiedliche Proteine. A single cell contains more than 5000 different proteins. Biosynthese und Expres sion jedes Proteins sind genauestens reguliert. Biosynthesis and Expres sion of each protein are accurate least regulated. In un terschiedlichen Geweben kommen verschiedene Expres sionsmuster zustande. In un terschiedlichen tissues different Expres come about sion pattern. Außerdem können posttranslatio nale Veränderungen in den Proteinen auftreten, wie z. Moreover posttranslatio dimensional changes in the proteins may occur such. B. Phosphorylierungen beim Hitzeschockprotein 27, die von physiologischer Bedeutung sind und in der zwei-dimen sionalen Elektrophorese ein charakteristisches Muster nach immunchemischer Anfärbung im Western-Blot ergeben. B. Phosphorylation during heat shock protein 27, which are of physiological importance and produce a characteristic pattern by immunochemical staining in the Western blot in the two-dimen-dimensional electrophoresis. Daher ist es wichtig, die Expression nicht nur auf der Gen- und Botennukleinsäure (mRNA)-Ebene zu studieren, sondern auch die Proteine, ihre Zusammensetzung und Konzentration in den unterschiedlichen Zellen und Gewe ben, besonders beim Menschen, genauestens zu kennen. Therefore, it is important that the expression not only of gene and nucleic messenger (mRNA) to study plane, but also the proteins, their composition and concentration in different cells and tissue ben, especially in humans, to know exact legal. Nach der Totalsequenzierung ganzer Genome, wie z. After the total sequencing of entire genomes such. B. dem aus Hefe oder wie im Humangenomprojekt konzipiert, kommt daher der Erforschung der Proteine und ihren Zellfunktionen eine zentrale Bedeutung zu. As the yeast or as conceived in the human genome project, so the study of proteins and their cellular functions are of central importance. Wenn in ei nigen Jahren das menschliche Genom mit ca. 100 000 Ge nen bekannt sein wird, werden sich die Wissenschaftler mehr und mehr der Erforschung der durch die Gene ko dierten Proteine zuwenden müssen, was unter dem Begriff Proteomforschung zusammengefaßt wird. will be when nen in ei Nigen years the human genome with about 100,000 Ge known, the scientists researching the co-founded by the genes, proteins are more and more have to turn to what is summarized under the term proteomics. Nur ein Bruchteil dieser wichtigen Biomoleküle ist bisher auf der molekularen Ebene bekannt. Only a fraction of these important biomolecules is previously known at the molecular level. Ohne die Strukturinformationen können jedoch die Vorgänge des Zellstoffwechsels und seiner regulatorischen Zusammenhänge nicht verstanden werden. Without the structural information, however, the processes of cellular metabolism and its regulatory relationships can not be understood. Dies ist besonders bei der Aufklärung der Entstehung von Krankheiten unumgänglich. This is essential especially in educating the development of diseases. Viele der über 5000 Zellproteine sind weder in ihrer Struktur noch in ihrer Funktion bekannt. Many of the more than 5,000 cell proteins are known neither in its structure nor in their function. Um ihre biologische Bedeutung und physiologische Rolle zu verstehen, werden in modernen Forschungsprojekten Totalzellextrakte oder die Gesamtproteine aus Einzelzellinien in hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophoresen (2DE) getrennt und sichtbar gemacht. To understand their biological significance and physiological role, total cell extracts or the total proteins from Einzelzellinien in high-resolution two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) are separated and visualized in modern research projects. Zellextrakte aus verschiedenen Gewebeproben, z. Cell extracts from various tissue samples such. B. aus Tumorgewebe, können so miteinander und mit gesunden Gewebeproben verglichen und die Proteine durch proteinchemische und massenspektrometrische Analysen identifiziert und charakterisiert werden. B. from tumor tissue, can be as compared to each other healthy tissue samples and the proteins identified by protein chemistry and mass spectrometry analyzes and characterized. Auf diese Weise lassen sich krankheits-assoziierte Proteine nachweisen, die als Marker zur Früherkennung der Krankheiten dienen oder den jeweiligen Grad der Krankheit, z. In this way, disease-associated proteins can be detected, which serve as a marker for early detection of diseases or the respective degrees of the disease, such. B. bei der Tumorentstehung, präzise charakterisieren können. B. in tumor development, be able to characterize precisely.

Da die Proteine oft nur in kleinsten Mengen exprimiert werden, ist es wichtig, hochsensitive Verfahren zur Trennung und Identifikation zu entwickeln. Since the proteins are often expressed only in very small quantities, it is important to develop highly sensitive method for the separation and identification. Um die ehrgeizigen, in die Zukunft weisenden Forschungsprojekte in Zusammenhang mit der Genomfunktionsanalyse bewerkstelligen zu können, sind neue, innovative Trenn- und Analyse-Techniken vonnöten. In order to accomplish the ambitious, looking to the future research projects related to the genome functional analysis, new, innovative separation and analysis techniques are needed.

Ein- und zwei-dimensional durchgeführte Gelelektropho resen von Proteinen, Nukleinsäuren, oder anderen Biomo lekülen sind seit langem in der Biochemie, der pharma zeutischen Industrie, Medizinforschung und Laborpraxis eingeführte Techniken, um schnelle Auftrennungen, Ver gleiche von Trennmustern oder Qualitätskontrollen von Isolaten und Produkten durchzuführen. One- and two-dimensional conducted Gelelektropho resen of proteins, nucleic acids, or lekülen other Biomo have long been in biochemistry, introduced pharma ceutical industry, medical research and laboratory practice techniques to rapid separations, United same hyphenation patterns or quality control of isolates and products perform. Die Elektrophore sekammern und ihr Zubehör (Powersupply, Kühlsysteme, Detektoren) sind längst zu unumgänglichem Inventar in jedem naturwissenschaftlichen, pharmazeutisch oder la bormedizinisch ausgerichteten Laboratorium geworden. The Electrophoresis sekammern and components (power supply, cooling systems, detectors) have long since become impossible to circumvent inventory in each science, pharmaceutically or la bormedizinisch oriented laboratory.

Für die Trennung von Biomolekülen in einer Trennrichtung (ein-dimensionale Elektrophorese, 1DE) stehen zahlreiche Elektrophoresekammersysteme und Trennmethoden zur Verfügung, die je nach anstehendem Trennproblem auf die speziellen Anwendungen adaptiert sind. For the separation of biomolecules in a separation direction (one-dimensional electrophoresis, 1DE) numerous Elektrophoresekammersysteme and separation methods are available, which are adapted to the specific applications, depending on the separation problem is pending. Die Trennung einzelner Proben erfolgt zumeist in Kapillarröhrchen oder Gelstreifen und die Trennung multipler Proben wird zumeist in Flachgelen (Slabgelen) durchgeführt, bei denen Auftragstaschen am oberen Ende einer dünnen auspolymerisierten Gelschicht ausgespart sind. The separation of individual samples mostly in capillary or gel strip and the separation of multiple samples is usually in slab gels (Slabgelen) is carried out in which order envelopes at the upper end of a thin gel layer polymerized are recessed. Diese Geltaschen werden beim Gießen durch Einbringung von sogn. This gel pockets are in the casting by introducing Sogn. Kämmen während der Polymerisation vorbereitet. Combing prepared during the polymerization. In diese Taschen werden nach Polymerisation des Geles und Entfernung der Kämme die Proben eingebracht. In these bags, the samples are introduced after polymerization of the gel and removal of the combs. Für Trennungen komplexer Protein- und Peptidmischungen in langen Gelen (< 10 cm) stehen weit weniger Kammersysteme zur Verfügung. in long gels for separations of complex protein and peptide mixtures (<10 cm) are far less chamber systems.

Die Auftrennung in zwei verschiedenen Dimensionen (2DE), bei denen unterschiedliche Bedingungen für die Auftrennung in den beiden Dimensionen gewählt werden (z. B. erste Dimension: Trennung nach Ladung, zweite Dimension: Trennung nach Molekülgröße) stehen keine einfach handbaren Komplettsysteme zur Verfügung, die sich zur Vollautomatisierung eignen. The separation in two different dimensions (2DE), where different conditions for the separation in the two dimensions can be selected (for example, first dimension. Separation according to charge second dimension separation according to molecular size) are not easy handbaren complete systems are available, which are suitable for full automation. Gewöhnlich muß bei diesen Elektrophoresen jede Dimension in einer anderen Kammer durchgeführt und das nach der ersten Dimension gewonnene Trenngel auf das vorbereitete Gel der zweiten Dimension manuell aufgebracht und dort einpolymerisiert werden. Typically each dimension must be performed in a different chamber and applied the separating gel obtained after the first dimension to the prepared gel of the second dimension manually and polymerized there in these electrophoreses. Erst dann kann die elektrophoretische Trennung der Probe in der zweiten Dimension erfolgen. Only then the electrophoretic separation of the sample in the second dimension can be carried out. Die manuell durchgeführten Teilschritte sind zeitaufwendig, erfordern viel Geschicklichkeit und erlauben eine Perfektion und Reproduzierbarkeit nur bis zu einem gewissen Grad, in Abhängigkeit von der Person, die die Handhabung durchführt. The manually performed partial steps are time consuming, require a lot of skill and allow perfection and repeatability only to a certain degree, depending on the person who performs the operation.

1DE Trennungen von Proteinen und Peptiden werden zumeist in kleinen Kammern in 5-11 cm langen polymerisierten Polyacrylamidgelen unterschiedlicher Quervernetzung und unterschiedlicher Dicke (z. B. 0.7 bis 1.5 mm) und Breite durchgeführt (in sogn. Slabgele). 1DE separations of proteins and peptides are mostly in small chambers in 5-11 cm long polymerized polyacrylamide gels of various crosslinking and different thickness (z. B. 0.7 to 1.5 mm) and width is performed (in sogn. Slabgele). Hierzu werden auf das in flüssiger Form zwischen zwei Glasplatten gegossene Gel nach Polymerisierung die Proben aufgetragen und in einer Elektrophoreseapparatur für mehrere Stunden bei 500 bis 2000 Volt/20 cm aufgetrennt. For this purpose, the samples are applied and separated in an electrophoresis apparatus for several hours at 500 to 2000 volts / 20 cm on the cast in liquid form between two glass plates gel after polymerization. Danach wird das Gel entnommen und zur Anfärbung der Substanzen in eine Färbelösung getaucht; Thereafter, the gel is taken and immersed for staining of the substances in a staining solution; danach zur Entfernung des Überschusses an Farbstoff in einer Entfärbelösung entfärbt und dabei werden die Substanzen sichtbar. thereafter decolorized the dye in a destaining solution to remove the excess, while the substances are visible. Sie können durch Photographie oder durch Einscannen im Computer in ihrer Lage auf dem Gel dokumentiert werden, z. They can be documented by photography or by scanning the computer in their position on the gel, eg. B. für Vergleiche mit anderen Proben. As for comparisons with other samples. Es können zwischen dünnen Glasplatten auch sogn. It can also sogn between thin glass plates. trägerfreie Elektrophoresen durchgeführt werden, bei denen die zu trennenden Substanzen in einem dünnen Pufferfilm ohne jedweden Träger elektrophoretisch aufgetrennt werden. carrier-free electrophoresis are carried out, in which are electrophoretically separated substances to be separated in a thin film buffer without any carrier. Für andere Biomoleküle, wie Nukleinsäuren oder hochmolekulare Komplexe werden z. For other biomolecules such as nucleic acids or high molecular weight complexes z. B. auch Agarosegele zur Trennung verwandt. B. Agarose gels also used for separation.

Alternativ zu den Slabgelen hat sich die Trennung in der ersten Dimension auch in feinen Glaskapillaren (iD 0.7 bis 1.5 mm) bewährt, in die die zunächst flüssige Gelmischung zur Polymerisation eingebracht wird und die Substanzmischung danach von oben eingespritzt wird. Alternatively to the Slabgelen the separation in the first dimension in fine glass capillaries has proven (ID 0.7 to 1.5 mm) into which the first liquid gel mixture is introduced to the polymerization and the substance mixture is then injected from the top. Die Kapillaren werden zunächst in einem Gelgießständer mit Gel versetzt, dann dort polymerisiert und erst nachdem sie in die Elektrophoresekammer verbracht worden sind, mit der Probensubstanz befüllt. The capillaries are first placed in a Gelgießständer with gel, then polymerized there and only after they have been placed in the electrophoresis chamber filled with the sample substance.

Nach der Durchführung der unter Hochspannung aufgetrennten Proben müssen die Gele, die sehr weich und flexibel sind, vorsichtig aus den Kapillaren zur Einbringung in die Färbe-/Entfärbelösung ausgestoßen werden, wobei mechanische Defekte an den Gelen entstehen können. After the execution of the separated high voltage samples, the gels which are very soft and flexible, must be carefully discharged from the capillaries to be inserted into the staining / destaining, said mechanical defects may arise in the gels. Wegen der schwierigen Handhabung werden zunehmend auch schmale Flachgele (2 × 5-10 cm dünne Streifengele), die als getrocknete Fertiggele kommerziell zur Verfügung stehen, für die 1DE verwandt (z. B. von der Fa. Pharmacia Biotech, Freiburg). Because of the difficulty of handling even narrow slab gels (Pharmacia Biotech, Freiburg, for. Example, from Fa.) Are increasingly (2 x 5-10 cm thin streak gels), which are available as dried precast commercially available, used for the 1GB.

Zur Trennung in der zwei-dimensionalen Technik (2DE) müssen die Gele aus der ersten Dimension (die Gele aus den Kapillaren oder die Gelstreifen) für die Auftren nung in der zweiten Dimension durch manuelle Manipula tion auf ein entsprechend vorbereitetes Flachgel (Slabgel), das bereits vorpolymerisiert ist, aufgebet tet und auf dieses Flachgel aufpolymerisiert werden. For the separation in the two-dimensional technique (2DE), the gels must be made of the first dimension (the gels from the capillaries or the gel strips) for the Auftren voltage in the second dimension tion by manual Manipula on a correspondingly prepared slab gel (slab gel) the is already prepolymerized aufgebet tet and be grafted onto this slab gel. Erst danach kann die Trennung in der zweiten Dimension in der entsprechenden Elektrophoresekammer für die 2. Dimension durchgeführt werden. Only after the separation in the second dimension in the corresponding electrophoresis can be performed for the 2nd dimension. Nach der Trennung er folgt die übliche Färbungs- und Entfärbungstechnik und Dokumentation der Ergebnisse. After the separation, he the usual coloring and Entfärbungstechnik and documentation of results follows. Verschiedene Gele und Puffersysteme für die Durchführung von gelelektrophore tischen Proteintrennungen in zwei Dimensionen sind be schrieben worden: In der zuerst beschriebenen Version werden z. Various gels and buffer systems for conducting gelelektrophore-Nazi protein separations in two dimensions have been written be: In the first described version z. B. Gemische von ribosomalen Proteinen in Harn stoffgelen getrennt, bei denen die pH-Bedingungen in den beiden Dimensionen variiert werden. B. mixtures of ribosomal proteins in urine stoffgelen separated, where the pH conditions in the two dimensions can be varied. Verfahren zur Auftrennung von hoch komplexen Proteinmischungen, z. A method for separating highly complex protein mixtures, such. B. aus intakten Zellen, Zellinien oder Geweben nutzen in der ersten Dimension Trennungen auf Grund verschiedener Ladung der Proteine durch Isoelektrofokussierung (IEF) und in der zweiten Dimension Trennungen nach Molekül größe in SDS-Natrium-dodecylsulfat-Gelen. B. from intact cells, cell lines or tissues use in the first dimension separations on the basis of different charge of the proteins by isoelectric focusing (IEF), and in the second dimension separation according to molecular size in SDS-sodium dodecyl sulfate gels. Für die Durchführung der Isoelektrofokussierung werden entweder Immobilone oder Ampholine benutzt, die in das Gel ein gebracht werden. either Immobilone or Ampholine be used for the implementation of the isoelectric focusing which are brought into a gel. Mit der letzteren Technik gelingt es mehr als 10 000 Proteine eines Zellysates aufzutrennen; With the latter technique, it is possible to separate more than 10, 000 proteins of a cell lysate; die erstere Technik mit Immobilonen ist für Trennungen von etwa 2000 Proteinen konzipiert. the former technique with Immobilonen is designed for separations of about 2,000 proteins. Bei Verwendung von Ampholiengradienten sind Trennungen von mehr als 10 000 Proteinen beschrieben worden (Klose und Kobalz, 1995) Diese hochauflösenden Proteingelelektrophorese-Techni ken werden für die moderne Proteomforschung, die Er mittlung der exprimierten Proteine einer Zelle und ih rer krankhaften Veränderungen, z. been when using Ampholiengradienten are separations of over 10 000 proteins described (Klose and Kobalz, 1995) This high-resolution protein gel-Techni risks are for modern proteomics that He mediation of the expressed proteins in a cell and ih rer pathological changes such. B. bei der Untersu chung der Tumorentstehung, genutzt. As in the investi monitoring of tumor development, used. Die Krankheits-as soziierten Proteine können nach Auftrennung in der hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophorese mittels proteinchemischer und massenspektrometrischer Verfahren identifiziert werden. The disease as soziierten proteins can be identified by means of protein chemistry and mass spectrometric method after separation in the high-resolution two-dimensional gel electrophoresis.

Die US 4,666,581 beschreibt eine Vorrichtung zur zwei dimensionalen Elektrophorese, bei welcher jedoch beide Gele nur in räumliche Nähe gebracht werden. The US 4,666,581 describes a device for two-dimensional electrophoresis, but in which both gels only be placed in close proximity. Statt manueller Handhabung, die schwierig und fehlerbehaftet ist, wird hier eine Mechanik, ein komplizierter Drehmechanismus, zum Übertragen des Geles von der ersten Dimension zur zweiten Dimension eingesetzt. Instead of manual handling, which is difficult and error prone, a mechanism, a complicated rotating mechanism, for transferring the gel from the first dimension is used for the second dimension. Die Puffergefäße sind nicht integriert. The buffer vessels are not integrated. Der Stromfluß muß auf komplizierte Art und Weise über Filterstreifen sichergestellt werden. The current flow must be ensured in a complicated way on tinsel.

Mit der US 4,874,490 wird ebenfalls ein System zur zwei-dimensionalen Elektrophorese beschrieben, wobei das Patent kein vollständig integriertes System offen bart und ein Gelgießgestell benötigt. With the US 4,874,490 a system for two-dimensional electrophoresis is also described, said patent does not disclose fully integrated system open and a Gelgießgestell needed. Auch sind die Puffergefäße für die kathodischen und anodischen Puf ferlösungen nicht integrale Bestandteile der Kammer. Also, the buffer vessels for the cathodic and anodic Puf ferlösungen are not integral parts of the chamber. Weiterhin ist in diesem System keine Kühlung inte griert. Furthermore, in this system, no cooling is inte grated. Es erfolgt die Trennung der ersten Dimension horizontal und in der zweiten Dimension vertikal. There is the separation of the first dimension and the second dimension in horizontal vertically. Die Gele müssen in der beschriebenen Konstruktion zwingend nacheinander in mehreren Schritten gegossen werden. The gels have to be poured into the construction described necessarily consecutively in several steps. Es muß zuerst die zweite Dimension in einem konventio nellen Gießständer außerhalb der Elektrophoresekammer gegossen werden. the second dimension in a conven tional casting stand outside the electrophoresis it must be cast first. Nach dem Gießen müssen über das Gel der zweiten Dimension Dicht-/Isolierstreifen durch me chanische Manipulation eingefügt werden. After casting, must be inserted over the gel of the second dimension sealing / insulating strip by me chanical manipulation. Danach erst kann das Gel für die erste Dimension gegossen werden. Only then the gel for the first dimension can be poured. Anschließend wird der Spacer wieder entfernt. Then the spacer is removed. Die Pro benaufgabe in größeren Mengen ist ungelöst. The Pro benaufgabe in larger quantities is unresolved. Beschrieben ist nur das Tränken einer Membran. Described is the impregnation of a membrane. Die Aufgabemenge und deren Aufkonzentrierung ist beschränkt. The feed quantity and their concentration is limited.

Weiterhin beschreibt die DE 42 44 082 A1 sowie die US 5,407,546 ein Verfahren und eine Vorrichtung zur hochauflösenden zwei-dimensionalen Elektrophorese. Furthermore, DE 42 44 082 A1 and the US 5,407,546 describes a method and apparatus for high-resolution two-dimensional electrophoresis. Wesentlich hierbei ist die selektive Rehydratisierung. Essentially this involves the selective rehydration. Es wird ausdrücklich ein zusammenhängendes Gel ("Ein- Molekül") verwendet. It is expressly a coherent gel is used ( "single molecule"). Als Ausgangsmaterial können nur getrocknete Gele verwendet werden und diese müssen re hydratisiert und reäquilibiriert werden. As a raw material only dried gels can be used and these must be re hydrated and reäquilibiriert. Das geschieht vor und nach der ersten Dimension und gesondert wird das Gel der zweiten Dimension rehydratisiert. This is done before and after the first dimension and the second dimension separately, the gel is rehydrated. Es ist kein vollautomatischer Ablauf möglich, da das Gel der ersten Dimension in ein geheiztes Äquilibratorgefäß transferiert und umgepuffert werden muß. It is not a fully automatic process possible because the gel in the first dimension has to be transferred in a heated and rebuffered Äquilibratorgefäß. Damit liegt keine vollständige Integration vor. Thus there is no complete integration.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, mit welchen mit einfachen Mitteln in einer einzigen Apparatur mit selbstgegossenen Gelen und/oder getrockneten Fertig gelen effektive Gelelektrophoresen der ersten und zwei ten Dimension durchgeführt werden können. The invention is therefore based on the object to provide a method and an apparatus with which gelen effective gel electrophoresis of the first dimension and two ten can be performed by simple means in a single apparatus with self-cast gels and / or dried instant.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Merkmale im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1 und 9 im Zusammenwirken mit den Merkmalen im Oberbegriff. This object is achieved by the features in the characterizing part of claims 1 and 9 in cooperation with the features in the preamble. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen enthalten. Advantageous embodiments of the invention are contained in the subclaims.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß eine Vollautomatisierung der gesamten 2DE einfach durchgeführt werden kann, indem die Gele für die Trennung in der ersten Dimension und die Gele für die Trennung in der zweiten Dimension nacheinander oder gleichzeitig vertikal zueinander angeordnet, als Gießgele oder Fertiggele in eine Elektrophorese- Kombikammer eingebracht und im Falle der gegossenen Gele voneinander isoliert polymerisiert werden, nachfolgend Pufferlösungen eingefüllt, z. A particular advantage of the invention is that a full automation of the entire 2DE can be easily performed by the gels arranged for the separation in the first dimension and the gels for the separation in the second dimension sequentially or simultaneously vertically to each other, as Gießgele or precast are introduced into a chamber Combined electrophoresis and polymerized isolated from each other in the case of the cast gels, subsequently filled buffer solutions, z. B. ein Proteinextrakt auf die Gele der ersten Dimension aufgetragen und die elektrophoretische Auftrennung der ersten Dimension bei konstanter Temperatur oder bei fixiertem Temperaturgradienten mit z. As applied to a protein extract onto the gels in the first dimension and the electrophoretic separation in the first dimension at a constant temperature or at a fixed temperature gradient with z. B. ansteigender elektrischer Spannung durchgeführt, anschließend die Pufferlösung abgesaugt, die Isolierung aufgehoben, in die entstehenden Räume zwischen erster und zweiter Dimension Kontaktgel eingefüllt und auspolymerisiert, Pufferlösungen eingefüllt und die elektrophoretische Trennung der zweiten Dimension bei präzise eingestellter Temperatur und konstanter elektrischer Leistung oder steigender Stromstärke durchgeführt wird und abschließend die Gele z. B. increasing electrical voltage performed, then filtered off with suction, the buffer solution, removed the insulation filled contact gel in the resultant spaces between the first and second dimension and polymerization is completed, filled buffer solutions and the electrophoretic separation of the second dimension at precise regulated temperature and constant electrical power or increasing current strength the gels z is performed and concluded. B. mit Färbelösung entwickelt und die Proteine mit herkömmlichen Methoden auf den Gelen sichtbar gemacht werden. B. developed with staining solution and the proteins are visualized with conventional methods on the gels.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die zwei-dimensionale Trennung in der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Kombikammer nur mit einer einzigen Vorrichtung bewerkstelligt wird, die für die Durchführung beider Elektrophorese-Dimensionen einge richtet ist und die Elektrophorese-Kombikammer einen Kern mit Kühlelementen aufweist, wobei die Kühlelemente beidseitig des Kerns durch aus inneren Platten und äußeren Platten im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen gebildeten Gelkammern und Puffergefäßen angeordnet sind. A further advantage of the invention is that the two-dimensional separation in the present invention electrophoresis Combined chamber is accomplished only with a single device is directed for the implementation of both electrophoresis dimensions turned and the electrophoresis combination chamber comprising a core with cooling elements, wherein the cooling elements are arranged on both sides of the core by of inner plates and outer plates formed in cooperation with removable or switchable insulating members gel chambers and buffer vessels.

Ein zusätzlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, daß das Gießen der Gele vor dem Auftrag der Substanzen im neuen Kammersystem in demselben Raum erfolgt, in dem auch die Trennungen selber in den beiden Dimensionen der Elektrophorese durchgeführt werden. An additional advantage of the invention is that the gel casting prior to the application of the substances in the new chamber system takes place in the same room where the separations are performed himself in the two dimensions of electrophoresis. Es entfallen daher zwei separate Gelgießständer (jeweils einer für die erste und für die zweite Dimension). therefore, it accounts for two separate Gelgießständer (one each for the first and for the second dimension). Die Gele für die beiden Elektrophorese-Dimensionen werden vor Beginn der Substanztrennung in der Elektrophorese-Kombikammer vorbereitet und stehen beim Start der jeweiligen Elektrophoresen bereit. The gels for the two electrophoresis dimensions are prepared before the start of substance separation in the electrophoresis combination chamber and are available at the start of the respective electrophoresis. Alle Manipulationen zum Gießen der Gele werden in einem Arbeitsgang vor Beginn des Probenauftrags gemacht. All manipulations for casting the gels are made in one operation before the start of sample application.

Ebenfalls vorteilhaft ist eine optimale Kühlung, die sowohl in der Elektrophoresekammer (für beide Dimen sionen) als auch in den Pufferkammern für beide Dimen sionen sichergestellt wird. Also advantageous is an optimal cooling that is both in the electrophoresis (for both Dimen versions) as well as emissions in the buffer chambers for both Dimen ensured.

In bisherigen Techniken werden die Gele und die Puffer lösungen der ersten Dimension zumeist gar nicht gekühlt und die bisher realisierten Kühlungen für die 2. Dimen sion weisen Mängel auf (Temperaturdifferenzen innerhalb der Gele; ungenügende Kühlung der Puffer). In previous techniques, the gels are solutions and the buffer of the first dimension generally not cooled, and the cooling previously realized for the 2nd Dimension sion have shortcomings (temperature differences within the gels; insufficient cooling of the buffer).

Variable Programmierungen des Elektrophoreseablaufes (Stufenprogramme, Gradientenprogramme, Temperaturpro gramme etc.) lassen sich ausführen. Variable programming of Elektrophoreseablaufes (step programs, gradient programs, temperature pro gramme etc.) can be performed.

Die Elektrophorese-Kombikammer läßt sich auch für ein dimensionale Trenngele variabler Länge (z. B. 10 bis 30 cm) für die Auftrennung multipler Proben verwenden. The electrophoresis chamber combination is particularly suitable for a dimensional separation gels of variable length (z. B. 10 to 30 cm) used for the separation of multiple samples. Die Trennungen können in der Kombikammer reproduzierbar unter genau festgelegten Standardbedingungen durchge führt werden. The separations can be transferred to the combined chamber reproducible Runaway under specified standard conditions.

Ebenso ist es auch möglich, die Elektrophorese-Kombi kammern für die Auftrennung mehrerer Proben, z. Likewise, it is also possible to electrophoresis combo chambers for separation of multiple samples such. B. 20 Proben, in einem ein-dimensionalen SDS-Gel zu benutzen, wobei die Proben mit Hilfe eines Auftragskammes auf dem Gel der 2. Dimension aufgebracht werden. B. 20 samples to use in a one-dimensional SDS-gel, the samples are applied to the gel of the second dimension with the help of an applicator comb. Ein entspre chender Einsatz mit Probentaschen wird eingebracht, wo sonst das Gel für die 1. Dimension enthalten ist. A entspre chender use with sample wells is incorporated, otherwise where the gel is contained for the first dimension.

Die erfindungsgemäße Elektrophoresekombikammer enthält vorzugsweise zwei mal zwei Gele, deren Zahl sich belie big erweitern läßt. The Elektrophoresekombikammer invention preferably comprises two times two gels, whose number can be expanded belie big. Die Gelpaare für die Trennung in der ersten Dimension werden parallel elektrophoretisch entwickelt und sind zunächst von den Gelen für die Durchführung der zweiten Dimension durch eine nicht leitende Isolierung getrennt, die danach beispielsweise mechanisch von außen ohne Aufschrauben der Kammer ent fernt und durch ein leitendes Medium ersetzt wird, das die Kontakte zu den Gelen für die Durchführung der zweiten Dimension herbeiführt. The Gelpaare for the separation in the first dimension are developed electrophoresed in parallel and are first separated from the gels to carry out the second dimension by a non-conductive insulation ent removed and then replaced, for example mechanically from the outside without screwing the chamber through a conductive medium is that induces the contacts to the gels for the implementation of the second dimension. Die Gele für die erste und zweite Dimension werden jeweils paarweise nachein ander unter verschiedenen Bedingungen entwickelt, ohne daß das Gel von der ersten Dimension auf die zweite me chanisch transferiert werden muß. The gels for the first and second dimensions are developed in pairs one after the other under various conditions without the gel must be transferred mechanically from the first dimension to the second me. Die Elektrophorese- Kombikammer hat für beide Dimensionen eine integrierte Kühlvorrichtung und integrierte Füll- und Puffergefäße. The electrophoresis combination chamber has a built-in cooler for both dimensions and integrated filling and buffer vessels. Der Deckelaufsatz der Elektrophorese-Kombikammer enthält die elektrischen Sicherheitsverbindungen für die Verbindung mit dem Powersupply, die Verbindungen zum Kühlaggregat und alle notwendigen Einfüllstutzen für das Gießen der Gele, für das Eingießen der Elektrolysepuffer und die Einführung der Probe. The lid assembly of the electrophoresis Combined chamber contains the electrical safety connections for the connection to the power supply, the connections to the cooling unit and all the necessary filler for casting of the gels, for pouring the electrolytic buffer and the introduction of the sample.

Die erfindungsgemäße 1DE/2DE-Elektrophorese-Kombikammer dient z. The 1GB / 2GB electrophoresis combination chamber according to the invention is used for. B. der Trennung von komplexen Proteinmischungen für die Auftrennung von Proteinen aus Geweben, Zell linien oder Mikroorganismen, die mehr als 5000 Proteine enthalten können. For example, the separation of complex protein mixtures for the separation of proteins from tissues, cell lines or microorganisms, which can contain more than 5000 proteins. In der Elektrophorese-Kombikammer können sowohl analytische als auch präparative Elektro phoresen durchgeführt werden, wobei je nach Stoffklasse z. In the electrophoresis chamber Combined both analytical and preparative electric can be performed phoresen, wherein depending on the class of z. B. isoelektrische Fokussierung und SDS-Elektrophorese oder Trennungen in Agarose, Harnstoff oder anderen Trennmedien Verwendung finden können. B. Isoelectric focusing and SDS-electrophoresis or separation in agarose, may be used urea, or other separation media. Die Kammer ist thermostatisierbar, enthält alle Puffergefäße für die Durchführung der ersten und zweiten Dimension und einen Aufsatz, der es erlaubt die Elektrophoresen unter hohen Spannungen z. The chamber is thermostated, includes the buffer vessels for carrying out the first and second dimension and an attachment which allows the electrophoreses under high voltages such. B. bis 5000 Volt durchzuführen. B. perform up to 5000 volts. Die Elek trophorese-Kombikammer dient z. The Elek trophoresis combi chamber serves for. B. der Identifizierung von krankheitsassoziierten Proteinen, zur Entwicklung von Markerproteinen bei der Erstellung von Frühdiagno sen von Krankheiten und zur Entwicklung neuartiger Pharmaka. For example, the identification of disease-associated proteins in the development of marker proteins in the preparation of Frühdiagno sen disease and development of novel drugs. Zellprozesse wie Embryonalentwicklung, Trans port- und Signaltransduktionsprozesse und Regulations- und Expressionsmuster können mit Hilfe der Elektropho rese-Kombikammer studiert werden. Cellular processes such as embryonic development, Trans port-based and signal transduction and regulation and expression patterns can be studied using the Elektropho rese combi chamber. Sie eignet sich zur Auflösung von < 5000 Proteinen und ist damit ein vor zügliches Instrument für die Untersuchung in der Pro teomforschung, einem neuen Forschungs- und Entwick lungsgebiet in der medizinischen und pharmazeutischen Grundlagenforschung und für industrielle Anwendungen, z. It is suitable for resolution of <5,000 proteins and is therefore a teomforschung before zügliches tool for investigation in the Pro, a new research and devel opment area in medical and pharmaceutical basic research and for industrial applications such. B. bei der Untersuchung ganzer Zellinhalte und ihrer Veränderungen oder zur Untersuchung des Einflusses von Pharmaka auf die Zellprozesse. As in the study of whole cell contents and their changes or to evaluate the impact of drugs on cell processes.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. The invention will be explained in detail below based on illustrated in the figures embodiments. Es zeigen: Show it:

Fig. 1 eine Explosivdarstellung der wesentlichen Kon struktionsteile der Elektrophorese-Kombikammer, Fig. 1 is an exploded view of the essential Kon structural parts of the electrophoresis chamber combination,

Fig. 2 den Aufbau des inneren Kernes, Fig. 2 shows the structure of the inner core,

Fig. 3 den inneren Kern mit angeordneter innerer Platte, Fig. 3 shows the inner core having arranged inner plate,

Fig. 4 die Elektrophorese-Kombikammer mit eingelegten Dichtungen und angeordneten Isolierungen, Fig. 4 shows the electrophoresis chamber combination with inserted gaskets and arranged insulations,

Fig. 5 die Elektrophorese-Kombikammer, einseitig komplett montiert mit Druckrahmen. Fig. 5 shows the electrophoresis Combined chamber on one side completely assembled with pressure frame.

Die Elektrophorese-Kombikammer 1 zur Trennung von bei spielsweise komplexen Proteinmischungen ermöglicht die elektrophoretische Trennung nacheinander in zwei ver schiedenen Dimensionen, dh unter verschiedenen Bedin gungen. The electrophoresis Combined chamber 1 for the separation of complex protein mixtures during play allows the electrophoretic separation in two successive ver different dimensions, ie under various conditions Bedin.

Wie in Fig. 1 zu ersehen ist, besteht die Elektropho rese-Kombikammer 1 aus mehreren Teilen, die miteinander durch Verschraubung zusammengesetzt werden: den inneren Kern 2 zur effektiven Kühlung, beidseitig damit verbunden die inneren Platten 4 und die äußeren Platten 5 , zwischen denen sich beidseitig je ein freier Raum für ein Flachgel (1. und 2. Dimension) befindet. . As can be seen in Figure 1, the Elektropho consists rese combi chamber 1 from several parts that are assembled together by screwing: the inner core 2 for effective cooling, at both ends connected thereto, the inner plates 4 and the outer plates 5, between which located on each side a free space on a slab gel (1st and 2nd dimension) is located. Mit Hilfe einer Dichtung 19 werden diese Platten 4 , 5 gegeneinan der gedichtet und gleichzeitig die Dicke des Geles festgelegt (z. B. 0.75 mm oder 1.5 mm). With the help of a gasket 19, these plates 4, 5 gegeneinan the sealed and at the same time set the thickness of the gel (eg. As 0.75 mm or 1.5 mm). Während die in nere Platte 4 aus einem gut die Temperatur leitenden Material gefertigt ist (z. B. einer speziellen gut lei tenden Keramik, dünner Kunststoff), ist die äußere Platte 5 vorzugsweise aus einem transparenten Material (z. B. Glas), um maximale Durchsicht zu gewähren. While the nere is made in plate 4 made of a good temperature-conducting material (eg. As a particular well lei Tenden ceramics, thin plastic), the outer plate 5 preferably made of a transparent material (eg., Glass) in order to provide maximum transparency. Die äußeren Platten 5 werden durch beidseitiges Anschrauben je eines Druckrahmens 13 gehalten; The outer plates 5 are held by both sides of a pressure screw each frame 13; Klammern werden nicht, wie sonst üblich, verwandt. Parentheses are not, as is usually used. Die untere Begren zung der Elektrophorese-Kombikammer 1 ist durch einen justier- und drehbaren Tisch gegeben, auf dem die Elek trophorese-Kombikammer 1 mittenfixiert ist. The lower Begren Zung of combi electrophoresis chamber 1 is provided by an adjustable and rotatable table on which the elec trophoresis combi chamber is fixed center. 1 Auf der Elektrophorese-Kombikammer 1 befindet sich ein Aufsatz in Form eines Deckels 14 , in den Zulauf 11 und Ablauf 12 für das thermostatisierte Kühlwasser und Einleitun gen für die Puffergefäße 8 und 21 der ersten und zwei ten Dimension (jeweils für den Anoden- und Kathodenpuf fer), für Einfüllstutzen und die Zuführungen der Elek troden eingearbeitet sind. In the electrophoresis Combined chamber 1, an article is in the form of a cover 14, into the inlet 11 and outlet 12 for the temperature of cooling water and Introductions gene for the buffer vessels 8 and 21 of the first and two th dimension (respectively for the anode and Kathodenpuf fer) are incorporated trodes for the filler neck and the supply lines of the Elek. Die Einleitungen für die Puffergefäße 8 und 21 dienen zunächst als Einfüllstut zen für das Eingießen der Gelflüssigkeiten. The introductions for the buffer vessels 8 and 21 serve as first Einfüllstut zen for the pouring of the gel liquids. Der innere Kern 2 und die Druckrahmen 13 sind z. The inner core 2 and the print frame 13 are, for. B. aus Polymerma terial (z. B. Acrylglas, Plexiglas) gefertigt und im Druckrahmen 13 sind Fenster in der Größe der Gele aus gespart, damit die Gießvorgänge der Gele und die Durch führung der Elektrophoresen leicht von außen beobachtet werden können. B. from Polymerma TERIAL manufactured (for. Example, acrylic glass, Plexiglas) and in the pressure frame 13 are saved window, so that the casting operations of the gels and can be easily observed by guiding the electrophoresis from the outside in the size of the gels.

Der innere Kern 2 ( Fig. 2) und die zwei inneren Platten 4 werden vom Hersteller verklebt ( Fig. 3). The inner core 2 (Fig. 2) and the two inner plates 4 are bonded by the manufacturer (Fig. 3). Weiterhin sind Puffergefäße 8 und 21 , die teilweise gleichzeitig Füllkammern für die Gele sind, angeordnet. Further, buffer vessels 8 and 21 which are partly simultaneously filling chambers for the gels are arranged. Die inneren Platten 4 schließen das Kühllabyrinth 10 (Kühlmäander) dicht ab, haben aber Öffnungen zu den Puffergefäßen 8 der ersten Dimension (Puffer, 1. Dim.) und Puffergefä ßen 21 der zweiten Dimension (Puffer 2. Dim.), wie in Fig. 2 und 3 dargestellt. The inner plates 4 connect the cooling labyrinth 10 (Kühlmäander) tight, but have openings to the buffer vessel 8 of the first dimension (buffer 1 Dim.) And Puffergefä SEN 21 of the second dimension (buffer 2. Dim.) As shown in Figure FIG. 2 and 3. Die Kühlelemente 3 , 10 sind unter den Gelen lokalisiert und kühlen nicht nur die Gele der ersten (Gel 1) und zweiten Dimension (Gel 2), sondern auch die Puffergefäße (Puffer 1. Dim und Puffer 2. Dim.). The cooling elements 3, 10 are located under the gels and cool not only the gels of the first (gel 1) and second dimension (gel 2), but also the buffer vessels (buffer 1 and buffer 2. Dim Dim.).

In der Fig. 3 (Kern komplett verklebt; muß nach den Elektrophoresen nicht demontiert werden) ist rechts oben die Füllkammer 8 für das 1. Dim. Gel mit Füllröhre 17 a für Gel 1 und gleichzeitig die Pufferkammer 8 für die erste Dimension (Lauf 1. Dimension) wiedergegeben. In Fig. 3 (core fully bonded, does not have to be disassembled after the electrophoresis) is right above the filling chamber 8 for the 1st Dim gel with stuffing tube 17 a for Gel 1, while the buffer chamber 8 (for the first dimension run 1. . dimension) reproduced.

Außerdem sind links oben die Füllkammer 17 b mit Füllrohr für das 2. Dim. Gel und gleichzeitig die Puffergefäße 21 für die 2. Dimension (Lauf 2. Dim.) dargestellt. In addition, the filling chamber are left above 17 b with filling tube for the 2nd Dim. Gel and simultaneously the buffer vessels 21 for the 2nd dimension (Run 2. Dim.) Shown. Die linke Füllkammer 17 b endet unten mittig, um ein gleichmäßiges Eingießen der Gelflüssigkeit von unten nach oben zu ermöglichen, wobei eine Entlüftungsöffnung 18 mit einer schräg ausgebildeten oberen Begrenzung für ein gleichmäßiges, langsames und Luftblasen-freies Eingießen sorgt. The left filling chamber 17 b ends at bottom center to allow a uniform pouring of the gel liquid from bottom to top, wherein a vent hole 18 makes an obliquely formed upper limit for an even, slow and bubble-free pouring.

In einer speziellen Ausführungsform ist die Elektrophorese-Kombikammer 1 oberflächenbeschichtet. In a specific embodiment, the combination electrophoresis chamber 1 is surface-coated. Es handelt sich dabei um eine Oberflächenbeschichtung der die Medien Gel, Gellösungen und Pufferlösungen berührenden Teile mit amorphen Kohlenstoffschichten. This is to provide a surface coating of the media gel, gel solutions and buffer solutions contacting parts with amorphous carbon coatings. Vorteile der Beschichtung sind, daß durch niedrige Oberflächenenergie ein Anhaften von Medienbestandteilen verhindert (analog zu Teflon) und somit die Entnahme des Gels nach der Trennung sowie die Reinigung des Gerätes erleichtert wird, die Schicht eine Hartstoffschicht ist und somit eine hohe Kratzfestigkeit aufweist und thermisch stabil ist. Advantages of the coating are that by low surface energy, adhesion of media components prevented is facilitated (similar to Teflon), and thus the removal of the gel after separation and cleaning of the device, the layer is a layer of hard material and thus has a high scratch resistance and thermally stable is. Alternativ können diese Oberflächen auch silanisiert werden. Alternatively, these surfaces may also be silanized.

Zur Durchführung der Elektrophorese werden folgende Arbeitsschritte absolviert: To carry out the electrophoresis following steps be taken:

  • 1. Im ersten Arbeitsschritt wird auf den kompletten Kernaufbau eine zweiteilige Dichtung 19 aufgelegt ( Fig. 4). 1. In the first step a two-part seal is placed on the complete core assembly 19 (Fig. 4).
  • 2. Dann werden im zweiten Arbeitsschritt Isolier schläuche 9 (z. B. 0.75-1.5 mm Rundschläuche oder viereckiges Material, z. B. Silikon), in vorgegebene Vertiefungen eingezogen ( Fig. 4). 2. Then in the second stage are insulated hoses 9 (z. B. 0.75-1.5 mm round or square tubing material, eg. Silicone), fed into predetermined wells (FIG. 4). Diese dienen der seitlichen Abgrenzung des 1. Gels von dem 2. Gel und der seitlichen Begrenzung des 2. Gels nach außen. These serve the lateral delimitation of the gel 1 of the second gel and the lateral boundary of the second gel to the outside.
  • 3. Als dritter Arbeitsschritt wird die äußere Glasplatte 5 aufgelegt. 3. As a third step, the outer glass plate 5 is placed.
  • 4. Im vierten Schritt wird der Druckrahmen 13 aufge legt und mit den Schrauben festgespannt ( Fig. 5). 4. In the fourth step the printing frame is inserted up 13 and with the screws tightened (Fig. 5).
  • 5. Im fünften Schritt wird der bisher entstandene Kör per umgedreht und Schritt 1-4 für die Vorbereitung der Parallelgele analog wiederholt. 5. In the fifth step of the previously formed Kör is reversed by step and 1-4 for the preparation of Parallelgele repeated analogously.
  • 6. Im sechsten Schritt werden die zwei Gele in die zwischen den Isolierschläuchen 9 gebildete Gelkam mern 6 für die erste Dimension gegossen, danach so gleich die zwei Gele in die Gelkammern 7 für die zweite Dimension. 6. In the sixth step, the two gels are numbers in the formed between the insulating sleeves 9 Gelkam 6 poured for the first dimension, then so is equal to the two gels in the gel chambers 7 for the second dimension.
  • 7. Der Deckel 14 wird aufgesetzt und die Polymerisie rung wird z. 7. The cover 14 is placed and the Polymerisie tion is z. B. über Nacht vorgenommen. B. made overnight.
  • 8. Danach werden die Pufferlösungen eingefüllt und dann kann der Proteinextrakt nach hochtourigem Zen trifugieren auf die 1. Dim. Gele aufgetragen wer den. 8. After that gels the buffer solutions are introduced and then the protein extract, after hochtourigem Zen trifugieren the first Dim. Applied to whoever.
  • 9. Dann erfolgt die elektrophoretische Auftrennung in der ersten Dimension. 9. Then, the electrophoretic separation is effected in the first dimension.
  • 10. Danach wird der 1. Dimension-Elektrophoresepuffer abgesaugt und die beiden Isolierschläuche 9 , die die 1. Gele von den 2. Gelen trennen, von außen herausgezogen, was sehr leicht vonstatten geht, und die entstehenden freien Kapillaren zwischen den Ge len durch Einfüllen von Stackinggelflüssigkeit be füllt, so daß nach Polymerisierung dieser Flüssig keiten der Kontakt zwischen dem jeweils ersten und zweiten Gel gegeben ist. 10. Thereafter, the first dimension electrophoresis buffer is aspirated and the two insulating sleeves 9, which separate the gels from the 1st 2nd gels, pulled out from the outside, which is very easily proceeds, and the resulting free capillaries between the Ge len by filling fills of Stackinggelflüssigkeit be such that after polymerization of these liquid speeds the contact between the respective first and second gel is given.
  • 11. Dann wird die Elektrophorese in der zweiten Dimen sion durchgeführt. 11. Then the electrophoresis is performed in the second Dimen sion.
  • 12. Nach Durchführung der Elektrophorese in der zweiten Dimension werden die Verschraubungen gelöst, die Gele zusammen mit den äußeren Glasplatten 5 abge löst und in ein Färbe- und Entfärbebad gegeben. 12. After completion of the electrophoresis in the second dimension the screw connections are loosened, the gels dissolve abge together with the outer glass plates 5 and placed in a dyeing and Entfärbebad. Da nach sind die Gele für die Dokumentation bereit. Because of the gels are ready for documentation.
  • 13. Die Durchführung neuer Gele ist nach Säuberung der Gelplatten und der Füll- und Puffergefäße sofort wieder möglich. 13. The implementation of new gels is possible immediately after cleaning the gel plates and the filling and buffer vessels.

Durch Montage mehrerer Einheiten können bis zu 10 2DE- Gele in einem Arbeitsgang durchgeführt werden. By mounting a plurality of units up to 10 2DE- gels can be carried out in one operation.

Beim Gießen der Gele der ersten Dimension werden die Gele als Flachgele in dem durch Füllrohr 17 a und Gel kammer 6 gebildeten U-Rohr gegossen und polymerisieren dort aus. During the casting of the gels in the first dimension, the gels are cast as slab gels in the chamber through the filling pipe 17 a and gel 6 formed U-tube and polymerize there. Dazu wird zuerst ein Stopgel mit hoher Quer vernetzung gegossen, das den unteren Bereich des U-Rohrs ausfüllen soll. For this, a Stopgel is first cast with high cross-network, which is to fill the bottom of the U-tube. Die nach Zugabe eines Polymerisa tionsstarters noch flüssige Gellösung wird hierfür in das äußere Pufferreservoir der ersten Dimension gege ben, wobei das Gel nur den unteren Bereich des U-Rohres ausfüllt. After addition of a polymerisation starters tion still liquid gel solution is therefor ben gege in the external buffer reservoir to the first dimension, the gel fills only the lower part of the U-tube. Es reicht etwa 10 mm über das untere Ende der beiden als Isolierschläuche ausgebildeten Isolierele mente hinaus. It ranges from about 10 mm above the lower end of the two embodied as Sleeving Isolierele addition elements.

Nach dem Auspolymerisieren wird das Separationsgel für die erste Dimension gegossen. After completing the polymerization, the separation gel is poured for the first dimension. In diesem Gel wird die Proteintrennung z. In this gel, the protein separation z. B. durch Isoelektrofokussierung durchgeführt. B. carried out by isoelectric focusing. Zum Gießen wird die noch flüssige Separa tionsgellösung in das zweite (weiter innen gelegene) Pufferreservoir der ersten Dimension über die Füllkam mern 8 eingegossen, bis der Bereich der ersten Dimen sion zwischen den beiden Isolierelemente 9 vollständig gefüllt ist. For casting the still liquid Separa tionsgellösung is in the second (more inwardly located) buffer reservoir the first dimension on the Füllkam numbers poured 8 until the portion of the first dimen sion between the two insulating elements 9 is completely filled. Das Gießen der Gele erfolgt unter konstan ter Temperatur, (z. B. bei 20°C, wozu die Kühlung ange schaltet ist) bis das Gel auspolymerisiert ist. Gel casting is carried out under konstan ter temperature (eg. As at 20 ° C, to which cooling is turned on) is polymerized to the gel.

Das Gel der zweiten Dimension wird zwischen den beiden Isolierelementen 9 von unten in die Apparatur eingegos sen, indem die Gellösung über das Gießreservoir der zweiten Dimension eingefüllt wird. The gel of the second dimension is in the apparatus eingegos sen by the gel solution is poured over the Gießreservoir the second dimension between the two insulating elements 9 from below. Die Gellösung fließt von dort über das Füllrohr 17 b nach unten und tritt in der Mitte der Gelkammer 7 aus. The gel solution flows from there through the filler pipe 17 b downwardly and exits in the middle of the gel compartment. 7 Die Luft wird durch den Gießvorgang automatisch nach oben verdrängt und kann über die Entlüftungsöffnung entweichen, bis die Gellö sung den Bereich der zweiten Dimension vollständig ge füllt hat. The air is automatically displaced by the casting upwards and can escape through the vent opening until the solution Gellö the area of ​​the second dimension has completely fills ge.

Das Gel polymerisiert bei konstanter Temperatur (z. B. durch Kühlung auf 20°C) aus. The gel is polymerized at a constant temperature (eg., By cooling to 20 ° C).

Im folgenden wird die Durchführung der ersten Dimension beschrieben. In the following, the implementation of the first dimension is described.

Die beiden Pufferreservoire ( 8 ) der ersten Dimension werden einmal mit einer alkalischen und einer sauren Pufferlösung gefüllt (z. B. 0,1N NaOH; 7% v/v H3PO4). The two buffer reservoirs (8) of the first dimension are once filled with an alkaline and an acidic buffer solution (e.g., 0.1N NaOH;. 7% v / v H3PO4). Die eine Pufferlösung fließt dabei in das U-Rohr bis zum Stopgel hinein, während die andere das Separations gel überschichtet. The one buffer solution then flows into the U-tube to Stopgel into it, while the other overlaid the separation gel. Das Separationsgel wird dann mit ei ner Schutzlösung höherer Dichte als der Puffer über schichtet (z. B. 6% (w/v) Glycerin, 4 M Harnstoff, 1,5% (w/v) Ampholyte in H2O). The separation gel is then mixed with egg ner protection solution of higher density than the buffer overlaid (z. B. 6% (w / v) glycerol, 4 M urea, 1.5% (w / v) ampholytes in H2O). Die Proben können durch Unter schichten unter die Schutzlösung auf das Separationsgel der 1. Dimension über Einfüllöffnung 20 aufgetragen werden. The samples may be applied by sub-layers under the protective solution to the separation gel of the 1st dimension over filling opening 20th Die elektrophoretische Trennung erfolgt dann z. The electrophoretic separation is then z. B. unter konstanter Temperatur (z. B. Kühlung auf 18°C) mit einem Spannungsgradienten von anfänglich z. B. under constant temperature (eg. B. cooling to 18 ° C) with a voltage gradient from an initial z. B. 100 V bis z. B. 100 V to eg. B. 3000 V über mehrerer Stunden. B. 3000 V over several hours. Nach dem Ende der Trennung werden die Pufferlösungen abgesaugt. After the separation, the buffer solutions are aspirated.

Bei der Durchführung einer 2DE muß die Probe immer auf das Gel der ersten Dimension aufgetragen werden; When performing a 2DE the sample must be always applied to the gel in the first dimension; die aufgetrennten Banden nach der ersten Dimension werden dann in der zweiten Dimension weiter aufgetrennt. the separated bands after the first dimension are then further separated in the second dimension.

Vor Beginn der elektrophoretischen Trennung in der zweiten Dimension werden die drei Isolierelemente 9 durch Herausziehen nach außen entfernt. Before the beginning of electrophoretic separation in the second dimension, the three insulating elements 9 are removed by pulling outward. Der Hohlraum zwischen den Gelen der ersten und zweiten Dimension wird mit einem Kontaktgel (z. B. Agarose) gefüllt, das schnell auspolymerisiert. The cavity between the gels of the first and second dimension is filled with a contact gel (eg., Agarose), which polymerized rapidly. Dann werden die beiden Puf fergefäße 21 der zweiten Dimension mit Laufpuffer (z. B. SDS-Laufpuffer: 192 mM Glycin, 25 mM Tris-Base, 5 µM Bromphenolblau in H2O) gefüllt. Then the two Puf be fergefäße 21 of the second dimension with running buffer (e.g., SDS running buffer. 192 mM glycine, 25 mM Tris base, 5 uM bromophenol blue in H2O) filled. Die Trennung erfolgt unter Temperierung auf z. The separation is carried out under temperature control to z. B. 15°C, z. B. 15 ° C, for example. B. bei konstanter Leistung oder mit einer Stromstärke von z. B. at constant power or a current of z. B. 40 mA pro Gel in den ersten 20 Minuten und dann mit 75 mA pro Gel. B. 40 mA per gel in the first 20 minutes and then at 75 mA per gel. Die Trennung ist mit Erreichen des Markerfarbstof fes Bromphenolblau am Ende des Geles beendet. The separation is completed upon reaching the Markerfarbstof fes bromophenol blue at the end of the gel. Die Elek trophorese-Kombikammer wird auseinandergeschraubt und das Gel zur Entwicklung und Färbung entfernt. The elec trophoresis combi chamber is unscrewed and the gel removed for development and coloring.

Das Elektrophoresegel wird nun nach Stand der Technik weiterbehandelt und z. The electrophoresis gel is then further treated in the art and such. B. in eine Wanne mit Fixierlösung gegeben. B. placed in a pan with the fixing solution. Durch Silberfärbung können die Proteine in ng- Mengen für analytische Zwecke sichtbar gemacht werden oder mittels z. By silver staining the proteins can be visualized by means of, or in ng quantities for analytical purposes. B. Coomassie Brilliant Blue für mikro präparative Zwecke (z. B. anschließender enzymatischer Spaltung und Sequenzierung) behandelt werden. B. Coomassie Brilliant Blue for micro-preparative purposes (eg. As subsequent enzymatic cleavage and sequencing) are treated. Alterna tiv kann das Gel nach Blotten für Immunofärbungen mit entsprechenden Antikörpern entwickelt werden. Alterna tively, the gel can be developed for immunostaining with appropriate antibodies after blotting. Diese Schritte sind nicht Bestandteil der Erfindung, aber un erläßlich, um die Proteine nach erfolgter Trennung sichtbar zu machen. These steps are not part of the invention, but un dispensable to make the proteins after separation visible.

Die Gele werden im vorliegenden Ausführungsbeispiel als Flachgele (nicht mehr als Rundgele) aber schmaler als in den bisherigen Flachgel-Systemen ausgeführt. The gels are in the present embodiment as slab gels run (no more than Rundgele) but narrower than in the previous slab gel systems. Die Breite des Geles kann durch Wahl verschieden breiter Dichtstreifen, Schläuche etc.) variabel gehalten wer den, so daß sowohl analytische als auch mikropräpara tive Gele gemacht werden können. The width of the gel may etc.) who made variable to so that both analytical can also be made mikropräpara tive gels by selecting different widths sealing strips, hoses. In den üblichen käuf lichen Flachgel-Elektrophorese-Kombikammern werden Fer tiggele bestimmter Breiten und Dicken verwandt. In the usual käuf union slab gel electrophoresis combo chambers Fer Tiggele certain widths and thicknesses are used. Außer dem werden bei dem vorliegenden Verfahren Ampholine (lösliche Zwittermoleküle) anstelle von immobilisierten Zwitterionen (Immobilone) benutzt, um den pH-Gradienten im Gel aufzubauen. In addition to the (soluble hybrid molecules) can be instead used to establish the pH gradient in the gel immobilized zwitterions (Immobilone) in the present method Ampholine. Prinzipiell ließen sich in der er findungsgemäßen Vorrichtung aber auch Immobilone ver wenden; In principle, he settled in the inventive device also Immobilone contact ver; jedoch sind die Trenneigenschaften dieser Gele bisher weniger gut als die mit Ampholinen erzeugten. However, the release properties of these gels are far less than those produced with ampholines.

Vorteile der beschriebenen Elektrophorese-Kombikammern sind: Advantages of the described electrophoretic combination chambers are:

  • - Variable Breiten der Gele; - Variable width of the gels;
  • - längere Trennstrecken, ohne daß die Gele beschädigt werden können; - longer separation distances without the gels can be damaged;
  • - Einsatz variabler Proteinmengen in der gleichen Appa ratur; - use of variable amounts of protein in the same Appa temperature;
  • - kein Transfer des Geles von der ersten auf die zweite Dimension nötig; - no transfer of the gel from the first to the second dimension necessary;
  • - keine Rehydratisierung wie bei Fertiggelen notwendig; - no rehydration necessary as with precast;
  • - bei Verwendung von Fertiggelen keine Anwendung erhöh ter Temperatur wie dies bei Rehydratisierungsschrit ten angewandt wird; - is applied not apply Incr ter temperature as in Rehydratisierungsschrit th when using precast;
  • - sowohl Fertiggelstreifen als auch selbst-gegossene Gele können verwendet werden. - both Fertiggelstreifen and self-cast gels can be used.
  • - präzise Fixierung des Geles relativ zur 2. Dimension; - precise fixation of the gel relative to the second dimension;
  • - Pufferreservoire mit im Kammersystem eingebunden; - buffer reservoirs involved in the chamber system;
  • - Kühlung beider Gele routinemäßig durchführbar; - cooling of both gels routinely achievable;
  • - die Kühlung ermöglicht identische Temperaturprofile für beide Parallelgele durch mäanderförmige Zwangs führung des Kühlmediums; - cooling permits identical temperature profiles for both Parallelgele meandering by forced flow of the cooling medium; keine unterschiedlichen Strömungsverhältnisse; no different flow conditions;
  • - Kühlung aller Puffergefäße (für die 1. und 2. Dim); - cooling of all the buffer vessels (for the 1st and 2nd dim);
  • - Einführung des sog. Stoppgels (dient zur mechanischen nicht aber elektrischen Abtrennung des Geles der er sten Dimension zu einem dazugehörigen Puffergefäß); . - Introduction of the so-called Stoppgels (used for mechanical but not electrical separation of the gel which he most dimension to an associated buffer vessel);
  • - gleichzeitiges Gießen beider Dimensionen möglich; - simultaneous casting of both dimensions possible; da her Zeitersparnis, da die Gele vor Gebrauch erst po lymerisieren müssen; because ago, the gels must lymerisieren only po before use time savings; dh beide Gele können gleich zeitig auspolymerisieren (z. B. über Nacht) und sind dann frühmorgens gebrauchsfertig; that is, both gels can simultaneously polymerize (for example, overnight.) and are then ready for use in the early morning;
  • - die Trennung erfolgt horizontal, nicht vertikal, ohne daß Kippvorgänge notwendig sind. - the separation takes place horizontally, not vertically without tilting operations are necessary. Die Stellung der Kammer ändert sich nicht während des Gelgießens und bei der Elektrophorese. The position of the chamber does not change during the gel casting and electrophoresis. Die Apparatur steht nach der Montage aufrecht, dh platzsparend. The apparatus is upright after assembly, ie space saving.

Nach Durchführung der ersten Dimension ist neu, daß die Isolierschläuche 9 oder Isolierstreifen 9 ohne Öffnen der Kammer nach der ersten Dimension entfernt werden. After performing the first dimension is new in that the insulating tubes are 9 or insulating strip 9 removed without opening the chamber to the first dimension. Volle Automatisierung ist möglich bei Einsatz eines Schrittmotors zum Entfernen der Isolierelemente 9 . Full automation is possible with the use of a stepping motor of the insulation 9 to remove. Neu ist ebenfalls die Einführung einer leitenden Kon taktflüssigkeit (z. B. auf Agarose-Basis) in den entste henden Hohlraum zwischen dem Gel der 1. und der 2 Dim., damit der elektrische Übergang zur 2. Dimension gewähr leistet ist ohne daß eine Umpufferung notwendig wird. Another novelty is the introduction of a conductive liquid Kon clock (z. B. agarose-based) in the entste Henden cavity between the gel of the 1st and 2 Dim. For the electric transition to the 2nd dimension is warrants without a rebuffering is necessary. Die Umpufferung kann aber durchaus stattfinden, indem der entstehende Zwischenraum nach Entfernen der Iso lierschläuche 9 mit Pufferlösung gespült wird. However, the buffer exchange may well take place by lierschläuche the resulting intermediate space after removal of the iso 9 is rinsed with buffer solution.

In der zweiten Dimension ist neu, daß das Füllen der Gellösung für die zweite Dimension von unten bei auf rechter Stellung der Elektrophorese-Kombikammer er folgt. In the second dimension is new in that the filling of the gel solution for the second dimension of the bottom right position in to the electrophoresis chamber combination he follows. Die Lösung wird automatisch langsam eingefüllt (wegen des Durchmessers der Füllkammer), so daß jegli che Blasenbildung vermieden wird, womit man sonst bei den meisten Kammern zu kämpfen hat. The solution is filled automatically slow (because of the diameter of the filling chamber) so that jegli che bubble formation is avoided, which one has to contend otherwise in most chambers.

Neu ist ebenfalls die nach oben angeschrägte Entlüf tungsöffnung 18 der 2. Dim., so daß alle Luft entwei chen kann. Another new feature is the angled upwardly tung breather opening 18 of the 2nd Dim., So that all air can entwei chen.

Dies ist möglich, weil das Gel in der Gelkammer 7 zwar vertikal steht, aber die Proteine horizontal (von rechts nach links oder von links nach rechts, je nach Wahl der Elektrodenanschlüsse) getrennt werden. This is possible because the gel in the gel compartment 7 is vertical, but the proteins are separated horizontally (from right to left or from left to right, depending on the choice of the electrode terminals).

Es können in dem System auch sog. Fertiggele, dh de hydratisierte Gele in der Elektrophorese-Kombikammer verwendet werden. It can also be called in the system. Pre-cast, ie de-hydrated gels are used in the electrophoresis combination chamber.

Dabei ist auf einer Trägerfolie ein streifenförmiges Gel (1. Dimension) aufgebracht. In this case, a strip-shaped gel (1st dimension) is applied to a carrier film. Neben diesem Streifen ist ein flächiges Gel (2. Dimension) in einem gewissen Abstand aufgebracht. In addition to this a flat strip gel (2nd dimension) is applied at a certain distance.

Die Gele auf der Trägerfolie werden auf Platte 4 über den Kühlelementen 3 gelegt. The gels on the carrier foil are placed on plate 4 through the cooling elements. 3

Anschließend wird die äußere Dichtung 19 sowie die Iso lierelemente 9 (je eine links und rechts vom Gel der ersten Dimension) eingesetzt. Subsequently, the outer seal 19 and the Iso is lierelemente 9 (each on the left and right of the gel in the first dimension) used.

Die Glasplatte 5 wird aufgelegt und der Druckrahmen 13 befestigt. The glass plate 5 is placed and the print frame 13 is fixed.

Rehydratisierungslösungen für beide Gele werden in die Puffergefäße 8 und 21 eingefüllt. Rehydratisierungslösungen for both gels are filled into the buffer vessel 8 and 21st

Die Gele werden rehydratisiert. The gels are rehydrated.

Die integrierten Puffergefäße der ersten Dimension wer den mit Pufferlösung gefüllt und der Strom eingeschal tet. The integrated buffer vessels of the first dimension who the filled with buffer solution and the power is switched OFF.

Nach Beendigung der Auftrennung werden die Puffer und dann die Isolierelemente 9 entfernt. After completion of the separation, the buffer, and then the insulating elements 9 are removed.

Umpufferungslösung kann durchgepumpt werden. Umpufferungslösung can be pumped.

Die Pufferlösung für die zweite Dimension wird einge füllt. The buffer solution for the second dimension is introduced.

Die zweite Auftrennung wird gestartet. The second separation is started.

Eine alternative Konstruktion ist die Verwendung von dünnwandigen, hochelastischen Schläuchen als Isoliere lemente 9 . An alternative design is the use of thin-walled, highly elastic tubing as insulating ELEMENTS 9th Die Abtrennung des freibleibenden Raumes zur Aufnahme des Geles der ersten Dimension wird entweder durch einen Schlauch, der u-förmig (eventuell in einer vorgesehenen Rille in einer der Platten) eingelegt ist, realisiert oder durch zwei Schläuche, die jeweils an einem Ende verschlossen sind. The separation of the remaining free space for receiving the gel in the first dimension is determined either by a tube that is (possibly in a groove provided in one of the plates) inserted u-shaped implements, or by two tubes which are closed at one end. Die Abdichtung erfolgt dadurch, daß der Schlauch mit einem Fluid (Flüssigkeit oder Gas) gefüllt wird. The sealing takes place in that the tube with a fluid (liquid or gas) is filled. Durch ausreichenden Innendruck erfolgt die Abdichtung gegen die inneren und äußeren Platten 4 und 5 . By sufficient internal pressure of the seal against the inner and outer plates 4 and 5 is carried out. Nach dem Gießen des Stopgeles kann das Gel der ersten Dimension gegossen werden. After pouring the Stopgeles the gel in the first dimension can be poured. Die Begren zung des Geles der zweiten Dimension erfolgt analog mit einem u-förmigen Schlauch oder einem am Ende verschlos senen Schlauch. The Begren wetting of the gel of the second dimension is carried out analogously with a U-shaped tube or a hose at the end verschlos Senen. Nach der Trennung der ersten Dimension wird der Schlauch evakuiert aber nicht aus dem System entfernt. After separation of the first dimension of the tube is evacuated but not removed from the system. In den entstehenden Raum zwischen erster und zweiter Dimension wird Agarosegelpufferlösung zur Her stellung einer elektrisch leitenden Verbindung zwischen den Gelen eingefüllt. In the resulting space between the first and second dimension Agarosegelpufferlösung is filled for Her position of an electrically conductive connection between the gels. Die anderen Abläufe erfolgen wie oben beschrieben. Other operations are carried out as described above.

Eine vorteilhafte Ausbildung besteht darin, daß dieser Schlauch mit einem adhäsiv nur auf einer der Platten 4 oder 5 fixiert ist oder auf einer der Platten 4 oder 5 festsitzend in einer Nut geführt ist, so daß sicherge stellt wird, daß sich der Schlauch nach der Evakuierung nur auf einer Platte 4 oder 5 befindet. An advantageous embodiment consists in that this tube is fixed with an adhesive only on one of the plates 4 or 5, or is guided tightly on one of the plates 4 or 5 in a groove, so that sicherge is assumed that the tube after the evacuation is only on a disk 4 or 5th

Eine Variante dieser Konstruktion bzw. der Methode ist es, den Schlauch nach abgelaufener Trennung der ersten Dimension zu entfernen. A variation of this construction and the method is to remove the tube after expiry of separation of the first dimension. Durch das Evakuieren wird die Entfernung wesentlich vereinfacht. By evacuating the distance is substantially simplified.

Die Erfindung ist nicht beschränkt auf die hier darge stellten Ausführungsbeispiele. The invention is not limited to the embodiments presented here Darge. Vielmehr ist es möglich, durch Kombination und Modifikation der genannten Mittel und Merkmale weitere Ausführungsvarianten zu realisie ren, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Rather, it is possible, reindeer further variants to realisie by combining and modifying the said means and features, without departing from the scope of the invention.

Bezugszeichenliste LIST OF REFERENCE NUMBERS

1 1

Elektrophorese-Kombikammer Electrophoresis combination chamber

2 2

Kern core

3 3

Kühlelemente cooling elements

4 4

innere Platte inner plate

5 5

äußere Platte outer plate

6 6

Gelkammer gel chamber

7 7

Gelkammer gel chamber

8 8th

Puffergefäße und Füllkammer für die 2. Dimension samt Einlässen Buffer vessels and filling chamber for the second dimension, including inlets

9 9

Isolierelemente insulating

10 10

Kühllabyrinth cooling labyrinth

11 11

Zulauf Kühlflüssigkeit Inlet cooling liquid

12 12

Ablauf Kühlflüssigkeit Coolant flow

13 13

Druckrahmen printing frame

14 14

Deckel cover

15 15

Spannelemente clamping elements

16 16

Sichtfenster window

17 17

a Füllkammern für die 1. Dimension a filling chambers for the first dimension

17 17

b Füllkammer mit Einlaß für die 2. Dimension b filling chamber with inlet for the 2nd Dimension

18 18

Entlüftungsöffnungen vents

19 19

Flächendichtung surface seal

20 20

Einfüllöffnung für Probe und 1. Dim. Gel 1. Filler opening for the sample and Dim. Gel

21 21

Puffergefäße samt Einlässe für 2. Dimension Buffer vessels including inlets for the second dimension

Claims (24)

1. Verfahren zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Stoffgemischen in Gelen, Polymerträgern oder für die ein-dimensionale trägerfreie Trennung durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur dadurch gekennzeichnet , daß 1. A method for two-dimensional separation of biomolecules or other mixtures of substances in gels, polymer carriers or carrier-free for the one-dimensional separation by electrophoresis in an electrophoresis apparatus characterized in that
  • - die Gele für die Trennung in der ersten Dimension und die Gele für die Trennung in der zweiten Dimension nacheinander oder gleichzeitig vertikal zueinander angeordnet als Gießgele oder Fertiggele in eine Elektrophorese-Kombikammer eingebracht und voneinander isoliert polymerisiert bzw. rehydratisiert werden, The gels for the separation in the first dimension and the gels for the separation in the second dimension sequentially or simultaneously to one another vertically arranged as Gießgele or precast introduced into an electrophoresis chamber combination and polymerized isolated from each other or rehydrated -
  • - nachfolgend Pufferlösungen eingefüllt, ein Biomolekülgemisch auf die Gele der ersten Dimension aufgetragen und die elektrophoretische Auftrennung der ersten Dimension bei konstanter Temperatur oder bei fixiertem Temperaturgradienten durchgeführt, - subsequently filled buffer solutions, a Biomolekülgemisch applied to the gels in the first dimension and the electrophoretic separation in the first dimension at a constant temperature or at a fixed temperature gradient performed
  • - anschließend die Pufferlösung abgesaugt, die Isolierung aufgehoben, in die entstehenden Räume zwischen erster und zweiter Dimension Kontaktgel eingefüllt und auspolymerisiert, Pufferlösungen eingefüllt und die elektrophoretische Trennung der zweiten Dimension bei präzise eingestellter Temperatur und konstanter elektrischer Leistung oder steigender Stromstärke durchgeführt wird und - subsequently filtered off with suction, the buffer solution, removed the insulation filled contact gel in the resultant spaces between the first and second dimension and polymerization is completed, buffer solutions filled and the electrophoretic separation of the second dimension at precise regulated temperature and constant electrical power or increasing current is performed, and
  • - abschließend die Gele entwickelt und die Proteine mit herkömmlichen Methoden sichtbar gemacht werden. - finally developed the gels and the proteins using conventional methods are made visible.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Trennung die Gele in der Elektrophorese- Kombikammer vertikal stehen und die Trennung der Proteine in der ersten Dimension vertikal und in der zweiten Dimension horizontal erfolgt. 2. The method according to claim 1, characterized in that the gels are in electrophoretic Combined chamber vertically to the separation and the separation of the proteins in the first dimension vertically and horizontally in the second dimension.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele der ersten Dimension als Flachgele in einem U-förmigen Rohr gegossen werden, wobei zuerst ein Stoppgel und nachfolgend das Separationsgel gegossen wird und sowohl Gießvorgänge als auch Polymerisationsvorgänge bei konstanter Temperatur mit aktivierter Kühlung erfolgen. 3. The method according to claim 1, characterized in that the gels of the first dimension as slab gels in a U-shaped pipe are cast, whereby first a Stoppgel and subsequently the separation gel is poured and carried out both casting processes and polymerization processes at a constant temperature with activated cooling ,
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele der zweiten Dimension in zwei Schritten gegossen werden derart, daß in einem ersten Schritt ein Dichtgel und nach dessen Polymerisation in einem zweiten Schritt die Gellösung von unten aufsteigend gegossen wird derart, daß die Luft nach oben verdrängt und das Gel anschließend bei konstanter Temperatur mit aktivierter Kühlung polymerisiert wird. 4. The method according to claim 1, characterized in that the gels of the second dimension are cast in two steps in such a way that in a first step, a sealing gel and, after the polymerization in a second step, the gel solution is poured in ascending order from the bottom so that the air upwardly displaced and the gel is then polymerized at a constant temperature with activated cooling.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Breite und die Dicke der Gele variierbar ist. 5. The method according to claim 1, characterized in that the width and the thickness of the gels can be varied.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufhebung der Isolierungen durch körperliches Entfernen von Dichtungen oder Schalten mittels Volumen- bzw. Durchmesserverringerungen von Dich tungsschläuchen realisiert wird. 6. The method according to claim 1, characterized in that the lifting of the insulation is realized tung hoses by physical removal of seals or switching means of volume or diameter reductions of you.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ablauf der zweidimensionalen Elektrophorese automatisiert durchgeführt wird. 7. The method according to claim 1, characterized in that the sequence of two-dimensional electrophoresis is performed automatically.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele und die Pufferlösungen von der gleichen Kühlung temperiert werden. 8. The method according to claim 1, characterized in that the gels and the buffer solutions are heated from the same cooling.
9. Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen in Gelen durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur, dadurch gekennzeichnet, daß eine Elektrophorese-Kombikammer ( 1 ) einen Kern ( 2 ) mit Kühlelementen ( 3 ) aufweist, wobei die Kühlelemente ( 3 ) zwischen den beidseitig des Kerns ( 2 ) durch innere Platten ( 4 ) und äußere Platten ( 5 ) im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen ( 9 ) gebildeten Gelkammern ( 6 , 7 ) und Puffergefäßen ( 8 ) angeordnet sind. 9. A device for two-dimensional separation of biomolecules in gels by electrophoresis in an electrophoresis apparatus, characterized in that an electrophoresis combination chamber (1) has a core (2) with cooling elements (3), wherein the cooling elements (3) between the both sides the core (2) through inner plates (4) and outer plates (5) in cooperation with removable or switchable insulating elements (9) formed gel chambers (6, 7) and buffer vessels (8) are arranged.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Kühlelemente ( 3 ) durch ein mäanderförmiges Kühllabyrinth ( 10 ) mit Zulauf ( 11 ) und Ablauf ( 12 ) gebildet sind. 10. Apparatus according to claim 9, characterized in that the cooling elements (3) by a meandering cooling labyrinth (10) having inlet (11) and outlet (12) are formed.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Kühllabyrinth ( 10 ) die Puffergefäße ( 8 ) und ( 21 ) umschließt. 11. The device according to claim 10, characterized in that the cooling labyrinth (10) enclosing the buffer vessels (8) and (21).
12. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die inneren Platten ( 4 ) aus einem gut tempera turleitenden Material und die äußeren Platten ( 5 ) aus einem transparenten Material bestehen. 12. Apparatus according to claim 9, characterized in that the inner plates (4) made of a good tempera turleitenden material and the outer plates (5) made of a transparent material.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die inneren Platten ( 4 ) aus Keramik oder Kunststoff und die äußeren Platten ( 5 ) aus Glas oder transparentem Kunststoff bestehen. 13. The apparatus according to claim 12, characterized in that the inner plates (4) made of ceramic or plastic, and the outer plates (5) consist of glass or transparent plastic.
14. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die äußeren Platten ( 5 ) durch einen Druckrahmen ( 13 ) gehalten werden und ein Deckel ( 14 ) die Elek trophorese-Kombikammer ( 1 ) nach oben abschließt. 14. The device according to claim 9, characterized in that the outer plates (5) by a pressure frame (13) are held, and a cover (14), the elec trophoresis combi chamber (1) terminates upwards.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Druckrahmen ( 13 ) über Spannelemente ( 15 ) beidseitig befestigt wird und Sichtfenster ( 16 ) zur Prozeßkontrolle aufweist. 15. The device according to claim 14, characterized in that the pressure frame (13) via clamping elements (15) is fixed on both sides and having side panel window (16) for process control.
16. Vorrichtung nach Anspruch 1, 9 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die untere Begrenzung der Elektrophorese- Kombikammer ( 1 ) durch einen justier- und drehbaren Tisch realisiert ist, auf welchem die Elektro phorese-Kombikammer ( 1 ) fixiert ist. 16. The apparatus of claim 1, 9 or 14, characterized in that the lower boundary of the electrophoresis is combi chamber (1) is realized by an adjustable and rotatable table on which the electro phoresis combi chamber (1) is fixed.
17. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Deckel ( 14 ) Ein- und Ausleitungen für das Kühlmedium sowie zu den Puffergefäßen ( 8 ) und Gelkammern ( 6 , 7 ) und die Anschlüsse für die Elektroden der 1. und 2. Dimension aufweist. 17. The apparatus according to claim 14, characterized in that the cover (14) inputs and discharges for the cooling medium and to the buffer vessel (8) and gel chambers (6, 7) and the connections for the electrodes of the 1st and 2nd dimension having.
18. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern ( 2 ) aus Polymermaterial wie Acrylglas, Keramik oder Plexiglas besteht. 18. The apparatus according to claim 9, characterized in that the core (2) consists of polymer material such as acrylic glass, ceramic or Plexiglas.
19. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelkammern ( 6 , 7 ) mit Füllrohren ( 17 ) verbunden sind und Entlüftungsöffnungen ( 18 ) angeordnet sind. 19. Device according to claim 9, characterized in that the gel chambers (6, 7) with filling pipes (17) are connected and vents (18) are arranged.
20. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen inneren Platten ( 4 ) und äußeren Platten ( 5 ) Dichtungen ( 19 ) angeordnet sind. 20. The apparatus according to claim 9, characterized in that between the inner plates (4) and outer plates (5) seals (19) are arranged.
21. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierelemente ( 9 ) mit Vertiefungen zusam menwirken. 21. Device according to claim 9, characterized in that the insulating elements (9) together with menwirken wells.
22. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die die Medien Gele und/oder Gellösungen und/oder Pufferlösungen berührenden Teile der Elek trophorese-Kombikammer ( 1 ) oberflächenbeschichtet sind. 22. Device according to claim 9, characterized in that the media gels and / or gel solutions and / or buffer solutions parts in contact with the elec trophoresis combi chamber (1) are surface-coated.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenbeschichtung aus amorphen Kohlenstoffschichten besteht oder durch Silanisieren realisiert wird. 23. The device according to claim 22, characterized in that the surface coating of amorphous carbon layers or is realized by silanization.
24. Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Substanzgemischen in Gelen, Polymeren oder trägerfreien Medien durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur, dadurch gekennzeichnet, daß alle für die Durchführung einer zwei dimensionalen Trennung notwendigen Baugruppen in einer Elektrophorese-Kombikammer 1 , bestehend aus einem Kern 2 mit Kühlelementen 3 , wobei die Kühlelemente 3 zwischen den beidseitig des Kerns durch innere Platten 4 und äußere Platten 5 im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen 9 gebildeten Trennkammern 6 , 7 , Puffergefäße 8 , 21 und Aufnahmen für Elektroden angeordnet sind, vollständig integriert sind und die Durchführung der zwei-dimensionalen Auftrennung vollständig automatisiert werden kann, ohne daß im Ablauf der zwei-dimensionalen Trennung eine Manipulation an den Gelen selber erfolgt. 24. Apparatus for two-dimensional separation of biomolecules or other mixtures of substances in gels, polymers or carrier-free media by electrophoresis in an electrophoresis apparatus, characterized in that all modules necessary for the implementation of a two-dimensional separation in an electrophoresis Combined chamber 1 consisting of a core 2, fully integrated with cooling elements 3, wherein the cooling elements 3 are arranged between both sides of the core formed by internal plates 4 and outer plates 5, in cooperation with removable or switchable insulating elements 9 separating chambers 6, 7, buffer vessels 8, 21 and holder for electrodes are and performing the two-dimensional separation can be fully automated, without the end of the two-dimensional separation occurs a manipulation of the gels themselves.
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