DE19732619C2

DE19732619C2 - Optische Detektoreinrichtung

Info

Publication number: DE19732619C2
Application number: DE19732619A
Authority: DE
Inventors: Albrecht Brandenburg
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1997-07-29
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 1999-08-19
Anticipated expiration: 2017-07-30
Also published as: EP1000342A1; DE59805839D1; US6239876B1; EP1000342B1; DE19732619A1; WO1999006819A1

Description

Die Erfindung betrifft eine optische Detektoreinrichtung nach dem Oberbegriff des An spruches 1, die auf der Bestimmung oder Beeinflussung der Phasengeschwindigkeit von in einem Wellenleiter geführten oder sich frei im Raum ausbreitenden Lichtes basiert.

Zum Nachweis von chemischen Reaktionen oder zur Analyse von Substanzen oder Stoffgemischen, sowie zur Bestimmung der Brechzahl eines Mediums bzw. der Brech zahldifferenz zweier Flüssigkeiten oder Gase besteht anwenderseitig ein Bedarf nach einem hochwertigen, gleichwohl störunanfälligen und aus wenigen Komponenten ver hältnismäßig einfach aufgebautem Detektorsystem.

Zu diesem Zweck sind im Stand der Technik interferometrische oder differential refraktorische Meßzellen und Meßeinrichtungen bekannt (US 4229105, US 5168325, US 5426505).

Ein direkter Nachweis chemischer oder biochemischer Reaktionen, d. h. eine Detektion, die ohne die Verwendung von Markierungen, (wie z. B. durch Fluoreszenz oder Radioak tivität) auskommt, kann unter anderem dadurch erfolgen, daß die Ausbreitungsge schwindigkeit einer Lichtwelle in Abhängigkeit von ihrer Beeinflussung durch die zu er fassende Substanz (Detektionsmedium) erfaßt wird. Aus der Veränderung der Ausbrei tungsgeschwindigkeit wird dann auf das beeinflussende Medium (Detektionsmedium) rückgeschlossen. Die Veränderung der Ausbreitungsgeschwindigkeit der Lichtwellen kann durch verschiedene optische Anordnungen detektiert werden. Vielfach wird die Ge schwindigkeitsmessung auf eine Winkelmessung zurückgeführt. Dabei werden sowohl frei im Raum sich ausbreitende Lichtstrahlen als auch in Wellenleitern geführtes Licht verwendet. Wie bekannt, ist die Führung des Lichtes in einem Lichtwellenleiter mit einem evaneszenten Feldanteil verbunden, der außerhalb des Lichtleiters geführt wird. Daher ist es mit optischen Lichtwellenleitern möglich, eine Detektion von Massenbelegungen auf der Oberfläche des Lichtwellenleiters (genauer auf der Oberfläche der lichtleitenden Schicht des Lichtwellenleiters) vorzunehmen.

In diesem Bereich hat sich das Interesse, insbesondere auf zwei Meßprinzipien, die Oberflächen-Plasmonenräsonanz (B. Liedberg, C. Nylander, I. Lundström: Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing; Sensors and Actuators 4 (1983) 299) und das Prinzip des Gitterkopplers (Ph. Nellen, K. Tiefenthaler, W. Lukosz: Integra ted optical input grating couplers as biochemical sensors; Sensors and Actuators 15 (1988) 285) konzentriert. In beiden Fällen wird die Ausbreitungskonstante einer geführ ten Lichtwelle aus einer Winkelmessung bestimmt. Dabei benutzt man die Tatsache, daß die Anregung des Oberflächenplasmons bzw. des Wellenleitermodus (im Falle des Git terkopplers) bei Einstrahlung auf das Dünnfilm-Element nur in einem sehr kleinen Win kelbereich möglich ist. Dieser Winkelbereich verschiebt sich in Abhängigkeit von der Adsorption von Molekülen auf der Oberfläche des Bauelementes. Die Empfindlichkeit der beiden Meßmethoden bezüglich der Oberflächenbelegung mit Antikörpern bzw. Antige nen ist etwa gleich. Sie ist allerdings dadurch begrenzt, daß das Zentrum des Winkelbe reiches, in dem die Einkopplung möglich ist, mit einer Genauigkeit von ca. 1 × 10^-3 dieses Winkelbereiches bestimmt werden kann.

Aus US-PS 5 239 364 ist ein optisches Meßverfahren bekannt, bei welchem unter Verwen dung eines Interferometers die Phasendifferenz zweier Lichtstrahlen gemessen wird, die durch Aufteilung eines Lichtstrahles aus kohärentem Licht gebildet sind. Einer der beiden Lichtstrahlen wird über einen Umlenkspiegel auf ein zu untersuchendes Substrat gerichtet. Der durch das Substrat hindurchtretende Teil des entsprechenden Lichtstrahls wird mittels eines teildurchlässigen Spiegels mit dem anderen Lichtstrahl überlagert. Die derart zusammengeführten Lichtstrahlen werden über eine Linsenanordnung auf einen entsprechenden Sensor projiziert, wobei die hierbei aufgrund von Interferenzen über den Sensor erfaßten Hell-Dunkel-Schwankungen als Impulse von einem Rechner erfaßt werden, welcher auf Grundlage dieser Impulse die Phasendifferenz der beiden Licht strahlen ermittelt.

Ein weiteres Verfahren, das sogenannte "resonant mirror"-Prinzip führt die Änderung der Ausbreitungsgeschwindigkeit auf eine Winkelmessung zurück (R. Cush, J. Cronin, W. Steward; C. Maule, J. Molloy; N. Goddard: The resonant mirror: a novel optical biosensor for direct sensing of biomolecular interactions, Part I: Principle of operation and associa ted instrumentation, Biosensors & Bioelectronics 8 (1993) 347).

Ferner werden in jüngerer Zeit zunehmend integriert-optische Bauelemente für inter ferometrische Zwecke verwendet, wie z. B. das Mach-Zehnder Interferometer oder das Young-Interferometer (z. B. als Schichtwellenleiter für die Erfassung von magnetischen Feldstärken, Spannungen oder Temperaturen, für die Refraktrometrie oder chemische Substanznachweise). Diese integrierten Optiken sind sehr kompakt und mechanisch stabil. Im Bereich der Technologie solcher planaren Lichtwellenleiter muß den Proble men der Faser- und Lichteinkopplung in diese integrierten Optiken ebenso wie dem Er halt eindeutiger Meßergebnisse wegen der periodischen Struktur von interferometrisch erhaltenen Intensitätsverteilungen besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden.

Anwenderseitig wird die Verbesserung dieser bestehenden Systeme im Sinne einer hochauflösenden optischen Detektoreinrichtung gewünscht, die aus Kostengründen und zur Verbesserung der Störunanfälligkeit aus wenigen optischen Komponenten und ein fach aufgebaut sein soll. Die Einrichtung soll außerdem eine Auslegung als Vielkanalsy stem ermöglichen, so daß in einem Arbeitsgang eine Vielzahl von Analysen (vorzugsweise mehr als 100 Analysen) parallel durchgeführt werden können. Analysen anordnungen, die chemische oder biochemische Reaktionen auf der Oberfläche eines Lichtwellenleiters auswerten, erfordern preisgünstige und leicht austauschbare Wellenlei ter-Bauelemente, da die Immobilisierung spezifischer Substanzen zur Erkennung des Analyten (Detektionsmedium) nur begrenzt haltbar ist. Insbesondere ist in der Regel nur eine begrenzte Anzahl von Nachweisen mit einer Immobilisierung durchführbar.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine optische Detektoreinrichtung zu schaffen, die den vorgenannten Anforderungen genügt und in unkomplizierter und ko stengünstiger Weise eine gewünschte, stoffspezifische Detektion ermöglicht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruches 1 gelöst.

Die erfindungsgemäß vorgesehene Strahlformung des von einer Lichtquelle aufgenom menen Lichtes zu zwei Strahlquellen, die divergentes Licht abstrahlen, gestattet bei Be aufschlagung des einen Strahlenbündels mit einem Referenzmedium (Referenzstrecke) und Beaufschlagung des anderen Strahlenbündels mit einem Detektionsmedium (Meßstrecke) eine einfache Überlagerung der divergenten Strahlenbündel in der Detek tionsebene, in der sich ein ortsauflösender Detektor (vorzugsweise eine CCD-Zeile) be findet, zur Erfassung der charakteristischen Intensitätsverteilung.

Das entstehende Linienmuster entspricht der Signatur, wie sie aus dem Doppelspaltver such bekannt sind. Diese Signatur (Intensitätsverteilung) verändert sich, wenn sich in einer der Einwirkungsstrecken (Meßstrecke bzw. Referenzstrecke) die Phasenge schwindigkeit des lichtes ändert. Die Analyse des Beugungsmusters, das durch den ortsauflösenden Detektor erfolgt, erlaubt die quantitative Bestimmung der Phasendiffe renz am Ende von Meß- bzw. Referenzstrecke (Einwirkungsstrecken) und damit die Analyse einer bestimmten Substanz, von Stoffgemischen oder chemischen Reaktionen, sowie auch die Bestimmung von Brechzahlen zweier Flüssigkeiten oder Gase unter Durchstrahlung der vorzugsweise in einer Doppelküvette befindlichen Medien durch die Strahlenbündel.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann zusätzlich unter Ausnutzung der Fluoreszenz des Detektionsmediums (oder des Referenzmediums) auch eine Analyse durch Fluoreszenzmessung erfolgen.

Bevorzugte Ausgestaltungen des Erfindungsgegenstandes sind in den Unteransprüchen dargelegt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen und dazugehörigen Zeichnungen näher erläutert. In diesen zeigen:

Fig. 1a-1c schematische Darstellungen der strukturellen Auslegung von optischen Detektoreinrichtungen nach verschiedenen Ausführungsbeispielen der Er findung,

Fig. 2 eine optische Detektoreinrichtung in schematischer Darstellung nach ei nem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung mit einer Strahlfor mungseinrichtung stromauf von Meß- bzw. Referenzstrecke (Einwirkungskanäle bzw. Einwirkungsstrecken),

Fig. 3 eine optische Detektoreinrichtung in schematischer Darstellung nach ei nem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung mit Meß- bzw. Referenz strecke stromauf einer Strahlformung,

Fig. 4 eine optische Detektoreinrichtung nach einem weiteren Ausführungsbei spiel der Erfindung mit Integration der Meß- bzw. Referenzstrecken und der Strahlformungseinrichtung in einem integriert-optischen Bauelement,

Fig. 5 eine optische Detektoreinrichtung nach einem weiteren Ausführungsbei spiel der Erfindung in Mehrkanalauslegung, in schematischer Darstellung, und

Fig. 6 eine optische Detektoreinrichtung (partiell) in Kombination mit einer Fluo reszenzerfassung in schematischer Darstellung.

Zunächst wird auf die Fig. 1a bis 1c Bezug genommen, die in schematischer Block darstellung verschiedene Auslegungsmöglichkeiten der optischen Detektoreinrichtung zeigen.

In allen Fällen besteht die Detektoreinrichtung aus einer (einzigen) Lichtquelle 1, einer optischen Anordnung (Strahlformungsoptik 2) zur Erzeugung zweier divergent abstrah lender, räumlich begrenzter, möglichst punktförmiger Intensitätsverteilungen (Strahlquellen), einem aus einer Meßstrecke 3 und einer Referenzstrecke 4 bestehen den Einwirkungsbereich, in dem das Licht entlang der oder durch die zu analysierenden Substanzen geführt wird, sowie einer fotoelektrischen Empfangseinrichtung 5 (ortsauflösender Detektor).

In den Fig. 1a bis 1c ist eine solche optische Detektoreinrichtung schematisch dar gestellt. Die Einwirkungsstrecke aus Meßstrecke 3 und Referenzstrecke 4 kann sich vor oder hinter dem optischen Teiler 2 (Strahlformungsoptik) befinden. Diese beiden Ausfüh rungsformen sind in den Fig. 1a und 1b dargestellt.

Wie in Fig. 1c gezeigt, kann der optische Teiler (Strahlformungsoptik 2) auch integral einstückig mit der Meßstrecke 3 (Meßkanal) bzw. der Referenzstrecke 4 (Referenzka nal), d. h. mit dem Einwirkungsbereich in einem integriert optischen Element (IO-Ele ment), vorzugsweise einem planaren Lichtwellenleiter (Schichtwellenleiter) ausgebildet sein, wie dies anhand weiterer Ausführungsbeispiele noch genauer erläutert wird.

Die beiden divergenten Strahlenbündel überlagern sich auf der sich an die Strahlfor mungsoptik 2 anschließenden Strecke. Sie erzeugen in einer Detektionsebene, in der sich die ortsauflösende, d. h. die eine Positionsinterpretation der Intensitätsverteilung gestattende optoelektronische Empfangseinrichtung, vorzugsweise eine CCD-Zeile 5, befindet, eine für die untersuchte Probe charakteristische Intensitätsverteilung. Das ent stehende Linienmuster entspricht der Signatur, die bei dem bekannten Doppelspaltever such entsteht. Dieses Muster verändert sich, wenn sich in einer der Einwirkungsstrecken, d. h. entweder in der Meßstrecke 3 oder in der Referenzstrecke 4 die Phasengeschwin digkeit des Lichtes ändert. Die Analyse des Beugungsmusters erlaubt die quantitative Bestimmung der Phasendifferenz am Ende von Meßstrecke 3 und Referenzstrecke 4.

Eine Ausführungsform des Ausführungsbeispiels nach Fig. 1a ist in Fig. 2 dargestellt. Hierbei ist die Strahlformungsoptik 2 im Lichtpfad zwischen der Lichtquelle 1 und einem planaren Lichtwellenleiter 6, in dem (hier nicht näher dargestellt) die Meßstrecke 3 und die Referenzstrecke 4 gebildet sind, angeordnet. Die Strahlformungsoptik 2 besteht aus einer fokussierenden Linse 7 und einem Kösters-Prisma 8. In der Brennebene der fo kussierenden Linse 7 entstehen zwei helle Lichtflecke, die divergent in den dahinterlie genden Raum einstrahlen. Ist hier ein planarer Lichtwellenleiter 6 angeordnet, der ohne laterale Strukturierung seiner vorzugsweise an der Oberfläche befindlichen lichtleitenden Schicht in einer Ebene festliegt, verlaufen die Strahlenbündel in der Ebene der licht leitenden Beschichtung weiterhin divergent, während das Licht in einer Ebene senkrecht zu der lichtleitenden Schicht auf die lichtleitende Schicht konzentriert wird. Entscheidend für die Erzeugung des Beugungsmusters an dem fotoelektrischen Detektor 5 ist die di vergente Ausbreitung des ersten und zweiten Lichtbündels in der Schichtebene des planaren Lichtwellenleiters 6.

In dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 2 ist eine Einkopplung des Lichtes von dem Kösters-Prisma 8 in den planaren Lichtwellenleiter 6 bzw. in die lichtleitende Schicht desselben durch eine Endfläche des planaren Lichtwellenleiters 6 vorgesehen. In dieser Endfläche entstehen Strahlquellen 9, 9' als Ausgangsquellen der beiden Lichtbündel des in der lichtleitenden Schicht des planaren Lichtwellenleiters geführten Lichtes und bilden die Meßstrecke 3 und die Referenzstrecke 4. In den jeweiligen Bereichen auf der Oberfläche des planaren Lichtwellenleiters 6, (die mit der lichtleitenden Schicht bedeckt ist), werden z. B. - hier nicht gezeigte - Durchflußzellen aufgesetzt, mit denen im Bereich der Meßstrecke 3 die Analyten (Detektionsmedium) und über die Referenzstrecke 4 Referenzflüssigkeiten zugeführt und dem evaneszenten Feld des in der lichtleitenden Schicht des planaren Lichtwellenleiters 6 geführten Lichtes ausgesetzt werden. Beim Durchlaufen des planaren Lichtwellenleiters 6 wird die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Wellenleiter-Modus aufgrund des evaneszenten Feldanteiles, z. B. durch die auf der lichtleitenden Schicht ablaufenden chemischen Reaktionen, beeinflußt. Nachdem sie die lichtleitende Schicht des Lichtwellenleiters 6 durchlaufen haben, treten die Lichtbündel durch eine Endfläche des planaren Lichtwellenleiters 6 aus. Dabei wird die Ausbrei tungsrichtung in der Ebene des lichtleitenden Filmes nur durch die Brechung des Lichtes verändert. Die Lichtbündel A, B sind weiterhin divergent, so daß sie nach einer bestimm ten Strecke überlagern und man in einer Detektionsebene, in der eine CCD-Zeile 5 an geordnet ist, das Beugungsmuster erhält. In der Ebene senkrecht zum planaren Lichtwel lenleiter 6 kann das Licht kollimiert werden oder durch Fokussierung mit einer Zylinder linse eine linienförmige Intensitätsverteilung in der Detektionsebene erzeugt werden.

In einer alternativen Ausführungsform kann bei Austausch des planaren Lichtwellenlei ters 6 gegen eine Doppelküvette auch eine Brechzahldifferenz zweier Flüssigkeiten oder Gase mit der im übrigen wie vorbeschrieben ausgeschalteten Detektoreinrichtung ge messen werden.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel einer optischen Detektoreinrichtung ist schematisch in Fig. 3 gezeigt. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Einwirkungsstrecke, d. h. die Meß strecke 3 und die Referenzstrecke 4, stromauf, d. h. vor der Strahlformungsoptik 2, an geordnet. Die Meßstrecke 3 bzw. die Referenzstrecke 4 ist auch in diesem Fall in einem integriert-optischen Element (IO-Element), d. h. in einem Schichtwellenleiter oder plana ren Lichtwellenleiter 6, ausgebildet, der an seiner Oberfläche die lichtleitende Schicht 10 auf einem Substrat 11 trägt. Zur Ein- und Auskopplung des Lichtes in den bzw. aus dem Lichtwellenleiter 6 werden hier Beugungsgitter 12 eingesetzt. Nach Durchlaufen des wie derum lateral unstrukturierten Lichtwellenleiters 6 werden die Strahlenbündel durch eine Zylinderlinse 13 kollimiert. Mit zwei sphärischen Linsen 7 werden zwei Brennpunkte er zeugt. In der Brennebene der sphärischen Linsen 7 befindet sich eine doppelte Loch blende 14. Nach Durchlaufen der doppelten Lochblende 14 überlagern sich die diver gent verlaufen Strahlenbündel (hier nicht gezeigt), so daß in der CCD-Zeile 5 dieselbe Signatur entsteht wie in dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 2. Zur Einkopplung der Strahlenbündel in das Koppelgitter wird hier ein Umlenkspiegel 15 verwendet.

Ein Ausführungsbeispiel für die in einem Bauteil zusammengefaßte, integrale Ausbildung von Einwirkungsbereich, d. h. von Meßstrecke 3 und Referenzstrecke 4 mit der Strahl formungsoptik in einem wiederum als Schichtwellenleiter (planarer Lichtwellenleiter 6) ausgebildeten integriert-optischen Element zeigt schematisch Fig. 4. Paralleles Licht ei nes Lichtstrahles wird über einen Umlenkspiegel 15 durch ein Koppelgitter 12 in den planaren Lichtwellenleiter 6 eingekoppelt. Der planare Lichtwellenleiter 6 besteht wieder um aus einem Basissubstrat 11, das mit der lichtleitenden Schicht 10 überzogen ist. In der lichtleitenden Schicht 10 des Lichtwellenleiters 6 sind planare Linsen 16 gebildet, die in der Ebene der lichtleitenden Schicht 10 des Lichtwellenleiters 8 eine Lichtbündelung bewirken. Diese fokussierenden Linsen 16 werden durch eine Anhebung der effektiven Brechzahl des Wellenleiter-Modus erzeugt. Dies kann z. B. durch Erhöhung der Dicke der lichtleitenden Schicht 10 im Bereich der fokussierenden. Linsen 16 hervorgerufen werden. Diese planaren Linsen 16 fokussieren das geführte Licht unter Durchlaufen von Meßstrecke 3 bzw. Referenzstrecke 4 auf planarer Spalte zur Bildung eines Strahlquel lenpaares, von dem aus das Licht in divergenten Lichtbündeln aus der Endfläche des Lichtwellenleiters 6 zur Überlagerung in der Detektionsebene der CCD-Zeile 5 abge strahlt wird. Ein solcher Spalt kann z. B. dadurch erzeugt werden, daß in dem Bereich um die schmale Austrittsöffnung des Lichtes aus der lichtleitenden Schicht 10 des Lichtwel lenleiters 6 herum diesem eine das Licht stark absorbierende Eingeschaft verliehen wird oder dadurch, daß das Licht in diesem Bereich in anderer Weise abgestrahlt wird.

Die Erhöhung der Lichtabsorptionsfähigkeit zur Bildung der punktförmigen Strahlquellen, von der aus sich das Licht als divergentes Lichtbündel ausbreitet, kann z. B. durch metal lische Beschichtungen 17 des Wellenleiters 6 realisiert werden.

Der andere Fall, d. h. das Bilden einer punktförmigen Strahlquelle kann durch eine defi nierte Unterbrechung des Lichtwellenleiters erreicht werden. Zum Beispiel kann der ganzflächig hergestellte Lichtwellenleiter durch strukturiertes Ätzen seiner Oberfläche in seiner lichtleitenden Schicht dort unterbrochen werden, wo das Licht nicht weitergeführt werden, divergent abgestrahlt werden soll.

Ein derartiges planares Analagon zu der Ausbildung einer Doppelspaltblende würde auch ohne die planaren Linsen arbeiten. Die Fokussierung der Linsen auf die planaren Spalte erhöht insgesamt die transmittierte Lichtintensität deutlich. Bei Verwendung der Linsen filtert der Spalt bei einem solchen, hier nicht gezeigten, Ausführungsbeispiel un erwünschtes Streulicht aus der anschließend in der Detektionsebene aufgenommenen Intensitätsverteilung. Es versteht sich von selbst, daß auch bei diesem Ausführungsbei spiel die Anordnung des Analyten bzw. der Referenzflüssigkeit, z. B. mit Hilfe von Durch flußzellen, in Kontakt mit der lichtleitenden Schicht (Oberfläche) des planaren Lichtwel lenleiters 6 nur schematisch und nicht im einzelnen gezeigt ist.

Als lichtleitendes Schichtelement kann auch ein integriert-optischer Y-Verteiler als Ele ment, durch das in einem Bauteil die Einwirkungsstrecke (Referenzstrecke, Meßstrecke) mit der Strahlformungsoptik zur Bildung der Strahlquellen, die die divergenten Strahl bündel abstrahlen, kombinierbar ist, verwendet werden. Der Y-Verteiler ist im Gegensatz zu den vorerläuterten Lichtwellenleitern dabei aus Streifenleitern aufgebaut. Das heißt, der Y-Verteiler weist hinsichtlich seiner lichtleitenden Schicht eine laterale Strukturierung auf, so daß bestimmte Lichtpfade durch diese Strukturierung der Lichtwellenleiter vorge geben werden. Für Monomode-Wellenleiter liegen typische Strukturbreiten in der Grö ßenordnung von wenigen Mikrometern. Der Y-Verteiler teilt das in einen Eingang einge koppelte Licht auf zwei Ausgänge auf, die die Strahlquellen bilden. Durch die Beugung des Lichtes beim Austritt aus dem Wellenleiter entstehen divergente Strahlbündel, die nach einer bestimmten Strecke auch ein Linienmuster erzeugen. Die Einwirkung durch die zu detektierenden Substanzen bzw. chemischen Reaktionen erfolgt wiederum durch das evaneszente Feld des Streifenleiters. Ein Zweig dieser als Y-Verteiler ausgebildeten, planaren optischen Struktur, bildet die Meßstrecke, während der andere Zweig die Refe renzstrecke bildet. Die Länge der Einwirkungsstrecke kann sehr präzise durch struktu rierte Deckschichten definiert werden. Auch in einem solchen Fall werden vorzugsweise zwei verschiedene Durchflußzellen auf die Pfade des Y-Verteilers aufgesetzt, die einer seits den Analyten (Detektionsmedium) und andererseits Referenzflüssigkeiten führen.

Alternativ ist auch in diesem Fall die Messung von Brechzahlen an Flüssigkeiten oder Gasen möglich, in dem die Oberfläche des Y-Verteilers unbeeinflußt bleibt aber im An schluß an den Y-Verteiler eine Doppelküvette angeordnet wird, durch die die aus den beiden Pfaden von den Strahlquellen Y-Verteilers austretende Lichtstrahlung divergent hindurchtritt.

Sowohl in diesem wie auch in den vorerläuterten Ausführungsbeispielen kann auch die Brechzahl von Flüssigkeiten dadurch bestimmt werden, daß aufgrund des evaneszenten Feldes die Phasengeschwindigkeit der geführten Lichtwelle auch von einer Brechzahl des über der lichtleitenden Schicht des Wellenleiters befindlichen Mediums abhängt.

In einer Detektionsebene entsteht ein hier nur schematisch angedeutetes Linienmuster. Die Intensitätsverteilung läßt sich bei Verwendung kohärenten Lichtes, abgesehen von einem Intensitätsabfall am Rand der Signatur, durch eine cos²-Funktion beschreiben. Bei einer Veränderung der Phasengeschwindigkeit des Lichtes im Bereich von Meßstrecke bzw. Referenzstrecke bewegt sich die Signatur lateral. Durch verschiedene numerische Verfahren kann die Phase dieser periodischen Verteilung sehr genau bestimmt werden.

Vorzugsweise wird die aufgenommene Signatur mit Hilfe einer Fourier-Transformation ausgewertet.

Bei einer Lateralverschiebung um eine Periode der Signatur oder einem Vielfachen da von, bereitet zunächst die Eindeutigkeit der Auswertung Schwierigkeiten, da bei Ver schiebung um genau eine Periode wieder eine identische Identitätsverteilung entsteht. Diese Schwierigkeit kann durch den Einsatz mehrerer, zumindest zweier diskreter Licht wellenlängen umgangen werden. Es ist also vorteilhaft, gleichzeitig mit lichtunterschiedli cher Wellenlänge in Meßstrecke und Referenzstrecke zu arbeiten. Die dann entstehen de Verteilung ist durch ein cos²-Funktion mit einer periodischen Einhüllenden beschrie ben. Die Periode der Hüllkurve hängt von der Differenz der verwendeten Lichtwellenlän gen ab. Die Verschiebung der Hüllkurve entspricht derjenigen der ursprünglichen Signa tur kleinerer Periode. Der Eindeutigkeitsbereich der Erfassung kann daher deutlich ver größert werden.

Alternativ hierzu kann anstelle kohärenten Lichtes auch Licht geringer Kohärenz in Meßstrecke und Referenzstrecke verwendet werden. In diesem Fall wird die cos²- Funktion von einer nicht-periodischen Einhüllenden überlagert und die Position einer Signatur durch Faltung mit einer Funktion bestimmt, die aus einem periodischen Anteil und einer nicht-periodischen Einhüllenden besteht. Die Auswertung ist dann eindeutig möglich.

Bei Verwendung von Licht geringer Kohärenz erfolgt die Auswertung der Intensitätsver teilungen in der Detektionsebene vorzugsweise in zwei Schritten. Zunächst wird eine Grobsuche durchgeführt, mit der das Maximum der Einhüllenden der Intensitätsvertei lung bestimmt wird. Dieser Algorithmus muß mindestens mit einer Genauigkeit erfolgen, die der Periode des Beugungsmusters entspricht, so daß die Interferenzordnung ein deutig gegeben ist. In einem zweiten Schritt wird mit hoher Auflösung die Phasenlage der periodischen Intensitätsverteilung ermittelt.

Vorzugsweise wird diese Grobsuche aus einer Korrelation des mit der CCD-Zeile aufge nommenen Signals mit zwei Referenzverteilungen durchgeführt. Es handelt sich bei die sen Referenzverteilungen um numerisch berechnete Sinus- und Kosinus-Funktionen mit einer kosinusförmigen Einhüllenden. Diese modifizierte Kreuzkorrelation ergibt ein Ma ximum an der Position des Maximums der Einhüllenden der Intensitätsverteilung (Interferometersignal).

Ausgehend von dieser Position wird ein Zentrum der Intensitätsverteilung genau be stimmt, indem ein Fourier-Transformation der Signalverteilung vorgenommen wird.

Wahlweise kann auch eine FFT-Analyse (Fast Fourier Transformation) des Interferome tersignales, d. h. der Signatur oder Intensitätsverteilung durchgeführt werden. Zur genau en Positionsbestimmung werden nur diejenigen Fourier-Koeffizienten ausgewertet, die der Ortsfrequenz zugeordnet sind, bei der das Leistungsspektrum sein Maximum hat. Da die Fourier-Koeffizienten bei anderen Ortsfrequenzen keine Information enthalten, ist es ausreichend, nur diese eine Ortsfrequenz zu betrachten.

Alternativ zu dem FFT-Algorithmus werden unter Verwendung numerisch errechneter Sinus- und Kosinus-Funktionen die Fourier-Koeffizienten nur bei der Ortsfrequenz des Signales errechnet. Die Phase wird durch Berechnung des Arcustangens des Verhält nisses der Fourier-Koeffizienten bestimmt.

Im Rahmen der Realisierung derartiger Detektoreinrichtungen kann somit kohärentes Licht, vorzugsweise aber auch Licht geringer Kohärenzlänge oder Licht mit mehreren Wellenlängen, gleichzeitig verwendet werden.

Neben der optischen Detektoreinrichtung, wie sie anhand von Ausführungsbeispielen erläutert und in den vorliegenden Ansprüchen näher umrissen ist, ist auch das vorerläu terte Meß- und Auswerteverfahren erfindungswesentlich.

Auf dem Gebiet der Analytik ist die parallele Detektion vieler Substanzen ein wesentli ches Ziel gegenwärtiger und zukünftiger Entwicklungen. Gegenwärtig werden in Ana lyseautomaten in der Regel sogenannte Mikrotiterplatten verwendet, die auf ihrer Ober fläche 8 × 12 Vertiefungen (wells) aufweisen. Die Platten sind üblicherweise 8,6 × 12,8 cm groß. Der Entwicklungstrend geht zu kleineren Analytmengen (kleinere Mengen an Detektionsmedium) und eine größere Anzahl von Meßstellen.

Nach einem weiteren Ausführungsbeispiel können auch auf Grundlage der vorliegenden Detektoreinrichtung bzw. des Meßverfahrens Analysen in einem derartigen Mikrotiterplat tenformat oder ähnlicher Anordnungen vieler miniaturisierter Behälter für Reagenzien erfolgen.

Eine solche Ausführungsform zeigt Fig. 5, die eine Weiterbildung in Richtung Mehrkanal- Analyse zum Ausführungsbeispiel nach Fig. 3 ist. Ähnlich dem Young-Interferometer wird ein Laserstrahl, hier ein aufgeweiterter Laserstrahl 1', über einen Umlenkspiegel 15 und ein (hier nicht dargestelltes) Koppelgitter in das integriert-optische Bauelement, den planaren Lichtwellenleiter 6, eingekoppelt, so daß der an seiner Oberfläche mit der licht leitenden Schicht versehene Lichtwellenleiter 6 in seiner ganzen Breite ausgeleuchtet ist. Durch fotolitografische Bearbeitung sind auf der Oberfläche des Lichtwellenleiters 6 eine Vielzahl von Meßfenstern definiert. Im vorliegenden Fall sind vier Meßfenster, d. h. jeweils ein aus einer Meßstrecke 3 und einer Referenzstrecke 4 bestehendes Paar, vorgese hen, die praktisch zwei Interferometer darstellen. Nach einer Auskopplung des Lichtes und Führung über einen weiteren Umlenkspiegel 15 wird eine Fokussierung auf Schlitz blenden 18 mit einem Linsenarray 19 durchgeführt, das vorzugsweise mit mikroopti schen Linsensystemen (z. B. Kugellinsen) oder mit GRIN-Linsen realisiert werden kann. Falls nur eine CCD-Zeile 5 verwendet wird, ist es erforderlich, die einzelnen Interferome ter, gebildet jeweils durch eine Meßstrecke 3 und eine Referenzstrecke 4 zeitlich ab wechselnd auszulesen. Herzu ist vorzugsweise ein elektrisch ansteuerbares Flüssig keitskristallfeld 20 vorgesehen, das den Ausgang eines Interferometers auf die CCD- Zeile 5 durchläßt, die Ausgänge der anderen (hier des zweiten) Interferometers aber sperrt. Auf diese Weise erscheint jeweils nur die Signatur eines Interferometers auf die CCD-Zeile 5. Aufgrund der relativ langsam ablaufenden Immunreaktionen bei der Unter suchung biochemischer Reaktionen sind die Geschwindigkeitsanforderungen an ein Multiplexing sehr gering. Auch in diesem Fall ist die Anordnung des auf die Schlitzblen den fokussierenden Linsenarrays fakultativ, im Interesse der Signalintensität jedoch vorteilhaft.

Alternativ zu der Ausführungsform nach Fig. 5 kann auch an jeder Meßstelle, d. h. an jeder Referenzstrecke und jeder Meßstrecke, ein eigenes Paar Koppelgitter für die Ein- und Auskopplung des Lichtes vorgesehen sein. Das Auslesen kann jeweils gleichzeitig für jede Reihe von Vertiefungen, in denen sich die Detektionsmedien bzw. Referenzme dien befinden, erfolgen. Eine nächste Reihe von Proben kann durch mechanisches Ver schieben der Trägerplatte (in der Art von Mikrotiterplatten) oder der Lichtführung in Be zug auf die gebildeten Referenz- und Meßstrecken erfolgen.

Auf diese Weise kann auch eine Vervielfachung eines integriert optischen Y-Teilers zu einem Mehrkanal-Detektor erfolgen, in dem mehrere Y-Verteiler in einer Reihenanord nung eingesetzt werden, derart, daß die beiden Strahlquellen am Ausgang eines Y- Verteilers die Eingangs-Lichtquelle für zwei nachgeordnete Y-Verteiler bilden.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel ist (für einen Kanal, d. h. für Meß- oder Referenzstrec ke) in Fig. 6 dargestellt. Die Besonderheit dieses Ausführungsbeispieles besteht darin, daß hier die optische Detektion eines durch eine Küvette 21 geführten, z. B. in Pfeilrich tung durch die Küvette 21 zirkulierenden Mediums zugleich eine Fluoreszenzstrahlung 22 dieses Mediums erfaßt und vorzugsweise durch das transparente oder transluzente Substrat 11 hindurch durch einen Fotoverstärker 23, vorzugsweise mit vorgeschaltetem Filter 24, erfaßt wird.

In diesem Fall kann also eine zusätzliche Information über dem zu detektierenden Medium (zusätzlich zur optischen Auswertung durch Überlagerung der konvergenten Lichtbündel von Meßstrecke und Referenzstrecke) entsprechende Fluoreszenzstrahlungsmessun gen verglichen bzw. erfaßt werden und hieraus ein weiteres Unterscheidungskriterium für, z. B. den Analyten, zur Verfügung gestellt werden.

Auch bei diesem Ausführungsbeispiel (das nur die Meßstrecke in dem planaren Lichtlei ter 6 schematisch im Schnitt zeigt, ist ebenfalls ein aus (transparentem oder transluzen tem) Substrat 11 und lichtleitender Schicht 10 bestehender planarer Lichtwellenleiter 6 verwendet, dessen Wellenleiter (lichtleitende Schicht 10) durch eine Deckschicht 25 ab gedeckt ist, unter Freilassen eines Bereiches, in den die Küvette 21 mit dem Analyten 26 in Anlagekontakt an die lichtleitende Schicht 10 gebracht ist.

Das Licht wird über ein Koppelgitter 12 eingekoppelt und in der lichtleitenden Schicht reflektiert, so daß es nach Durchlaufen der lichtleitenden Schicht 10, z. B. wie in dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 3 oder 4, weiterverarbeitet werden kann.

Zugleich löst das Licht jedoch auch im Analyten 26 eine Fluoreszenzstrahlung 22 aus, die durch das Substrat 11 hindurch an der Unterseite des Lichtwellenleiters 6 fotoelek trisch erfaßt wird.

Dem Analyten 26 kann eine solche Fluoreszenzeigenschaft entweder von Hause aus innewohnen oder sie kann ihm durch entsprechendes Markieren mit fluoreszierendem Material verliehen werden. Gegebenenfalls können auch andere Strahlungsemissionen als Zusatzinformation erfaßt werden, wie z. B. radioaktive Strahlung, nachdem der Analyt mit entsprechenden Substanzen geimpft worden ist. Vorzugsweise werden jedoch lichtabhängige Strahlungseigenschaften des Analyten, insbesondere die Fluoreszenz, zur Gewinnung einer Zusatzinformation verwendet. Die Detektion dieser Fluoreszenz strahlung kann auch in anderer Weise, d. h. auch an anderen Stellen bezüglich des Lichtwellenleiters 6 erfolgen.

Durch die Erfindung wird eine für viele Analysezwecke verwendbare, robust gestaltete und in ihrem Aufbau einfache optische Detektoreinrichtung geschaffen, die auch rasch austauschbar ist, so daß den Erfordernissen der Praxis nach Bereitstellung eines Nach weiselementes für chemische oder biochemische Reaktionen auf optischer Basis in be sonders vorteilhafter Weise Rechnung getragen ist.

Claims

1. Optische Detektoreinrichtung, insbesondere zur Analyse von Substanzen, Stoff gemischen oder chemischen Reaktionen, sowie zur Bestimmung von Brechzahlen, mit einer Lichtquelle, einer Meß- und Referenzstrecke und einer optoelektronischen Erfas sungseinrichtung, gekennzeichnet durch einen der Lichtquelle nachgeordneten opti schen Teiler zur Bildung von zwei Strahlquellen (9, 9') für divergent abgestrahlte Licht bündel, wobei einem Lichtbündel die Meßstrecke (3) sind einem Lichtbündel die Refe renzstrecke (4) zugeordnet und zumindest in der Meßstrecke (3) die Phasengeschwin digkeit des Lichtes beeinflußt ist, und die divergenten Lichtbündel im Bereich der opto elektronischen Erfassungseinrichtung (5) unter Bildung einer charakteristischen Intensi tätsverteilung überlagert sind.

2. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Lichtquelle abgestrahlte Licht zumindest teilweise in einem planaren Wellen leiter (6) geführt ist.

3. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß die beiden Strahlquellen (9, 9') kohärentes Licht oder Licht geringer Kohärenzlänge abstrahlen.

4. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Licht unterschiedlicher Wellenlängen gleichzeitig verwendet ist.

5. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine minder optoelektronischen Erfas sungseinrichtung (5) aufgenommene Intensitätsverteilung mit Hilfe eine Fourier-Trans formation auswertbar ist.

6. Optische Detektoreinrichtung nach 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Positi on einer Intensität der Intensitätsverteilung mit einer nicht-periodischen Einhüllenden durch Faltung mit einer Funktion bestimmt ist, die aus einem periodischen Anteil und einer nicht-periodischen Einhüllenden besteht.

7. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtbündel frei das Detektions- bzw. Referenzmedium durchlaufen.

8. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Detektions- bzw. Referenzmedium in Durchflußzellen oder Küvetten (21) be findet.

9. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest das Detektionsmedium (26) Fluoreszenzeigenschaften aufweist und die bei Bestrahlung mit dem in der Meßstrecke geführten Lichtstrahlenbündel von dem Detektionsmedium abgestrahlte Fluoreszenz strahlung (22) einer Empfangseinrichtung (23) zugeführt sind.

10. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Empfangseinrichtung einen Photodetektor (23), vorzugsweise mit vorgeschaltetem Filter (24), enthält.

11. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeich net, daß das der Meßstrecke (3) zugeordnete Lichtbündel in einen, vorzugsweise par tiell mit einer Deckschicht (25) versehenen, planaren Lichtwellenleiter (6) eingekoppelt ist und in einem freigelegten Bereich der lichtleitenden Schicht (10) des Lichtwellenleiters (6) mit dieser eine Küvette (21) mit dem Detektionsmedium (26) in Kontakt ist.

12. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die von dem Detektionsmedium (26) abgestrahlte Fluoreszenzstrahlung (22) durch ein transparentes Substrat (11) des Lichtwellenleiters (6) hindurch von der im Bereich einer Rückseite des planaren Wellenleiters angeordneten Empfangseinrichtung (23) erfaßbar ist.

13. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Teiler stromauf der Meß- und Referenzstrecke (3, 4) angeordnet ist.

14. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Teiler stromab der Meß- und Referenzstrecke (3, 4) angeordnet ist.

15. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Teiler und die Meß- und Referenzstrecke (3, 4) in einem optischen Element, insbesondere einem planaren Licht wellenleiter (6) integriert sind.

16. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Teiler eine Strahlfor mungsoptik (2) mit einer fokussierenden Linse und einem Kösters-Prisma (8) ist.

17. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kösters-Prisma (8) ein planarer Lichtwellenleiter (6) nachgeordnet ist, der die bei den divergierenden Lichtbündel in der Ebene der lichtleitenden Schicht (10) des plana ren Lichtwellenleiters (6) divergent führt.

18. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß stromab des Lichtwellenleiters (6) die Lichtbündel in einer Ebene senkrecht zum Licht wellenleiter (6) zur Erzeugung einer linienförmigen Intensitätsverteilung kollimiert oder mit einer Zylinderlinse fokussiert sind.

19. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Meß- und Referenzstrecke (3, 4) in einem planaren, lateral unstrukturierten Lichtwellenleiter (6) gebildet ist, in die parallele Lichtstrahlen, insbesondere über Koppelgitter (12), ein- und/oder auskoppelbar sind und stromab des Lichtwellenleiters eine Zylinderlinsenanordnung (13), gefolgt von einem Paar sphärischer Linsen (7) angeordnet ist, in deren Brennebene eine doppelte Loch blende (14) angeordnet und die von dieser ausgehenden, divergenten Lichtbündel von einer photoelektrischen Erfassungseinrichtung, insbesondere einer CCD-Zeile (5) auf genommen sind.

20. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Meß- und Referenzstrecke (3, 4) in einem planaren, lateral unstrukturierten Lichtwellenleiter (6) gebildet ist, in die parallele Lichtstrahlen, insbesondere über ein Koppelgitter (12), einkoppelbar sind und in der lichtleitenden Schicht (10) des Lichtwellenleiters (6) stromab der Meß- und Referenz strecke (3, 4) ein Paar planarer Spalte zur Bildung von divergenten Lichtbündeln ange ordnet ist, die durch eine nachgeordnete, photoelektrische Erfassungseinrichtung, ins besondere eine CCD-Zeile (5), erfaßbar sind.

21. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß stromauf der planaren Spalte planare Linsen (16) zur Fokussierung des geführten Lich tes in einer Dimension auf die planaren Spalte zur Intensitätssteigerung der Signalge winnung angeordnet sind.

22. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die planaren Linsen durch (16) Anhebung einer effektiven Brechzahl der Wellenleiter struktur, insbesondere durch eine erhöhte Dicke der lichtleitenden Schicht (10) des Lichtwellenleiters (6), gebildet sind.

23. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekenn zeichnet, daß die planaren Spalte durch metallische Beschichtung (17) des planaren Lichtwellenleiters (6) realisiert sind.

24. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekenn zeichnet, daß die planaren Spalte durch definierte Unterbrechung der lichtleitenden Schicht des planaren Lichtwellenleiters, insbesondere durch strukturiertes Ätzen der Oberfläche des ganzflächig mit der lichtleitenden Schicht beschichteten Lichtwellenlei ters, realisiert sind.

25. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Meß- und Referenzstrecke (3, 4) in einem integriert optischen Y-Verteiler, der einen lateral strukturierten, planaren Lichtwel lenleiter bildet, ausgebildet sind.

26. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 1 bis 25, gekennzeichnet durch eine Mehrkanalanordnung.

27. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß ein planarer Lichtwellenleiter (6) eine Mehrzahl von Meß- und Referenzstrecken (3, 4) aufweist und am Ende oder stromab des Lichtwellenleiters (6) eine Mehrzahl von den Meß- und Referenzstrecken zugeordneten, divergenten Lichtbündel abstrahlende Strahlquellen gebildet sind, denen eine Auswahleinrichtung (20) zugeordnet und die fo toelektrische Erfassungseinrichtung (5) nachgeordnet ist.

28. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlquellen durch eine, vorzugsweise steuerbare, Schlitzblendenanordnung (19) gebildet sind.

29. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß den Meß- und Referenzstrecken (3, 4) des Lichtwellenleiters (6) stromab desselben eine das aus dem Lichtwellenleiter (6) austretende Licht auf die Schlitzblendenanordnung (19) fokussierende Linsenanordnung (18) zugeordnet ist.

30. Optische Detektoreinrichtung nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekenn zeichnet, daß die Auswahleinrichtung ein elektrooptisch schaltbares Flüssigkeitskristall feld (20) zur Auswahl eines jeweils aus Meßstrecke (3) und zugehöriger Referenzstrecke (4) gebildeten Einwirkungskanalpaares ist.

31. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß stromauf und stromab des Lichtwel lenleiters (6) eine Umlenkspiegelanordnung (15) vorgesehen ist.

32. Optische Detektoreinrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden An sprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Mehrzahl von Meß- und Refe renzstrecken (3, 4) des Lichtwellenleiters gemeinsam von der Lichtquelle nach Strahl aufweitung und gegebenenfalls Kollimation beaufschlagt sind.