DE19721825A1 - Verfahren zur Identifizierung von Enterohämorrhagischen E. coli - Google Patents

Verfahren zur Identifizierung von Enterohämorrhagischen E. coli

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Description

Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) treten in hochentwickelten Ländern zunehmend als Erreger von Diarrhoen und der hämorrhagischen Colitis beim Menschen auf. Als postinfektiöse lebensbedrohliche Komplikation der EHEC-Erkrankungen kommt es bei 5-10% der Erkrankten zu dem Vollbild des hämolytisch-urämischen Syndroms (HUS). Hämolyse und akutes Nierenversagen wurden aber auch als Einzelsymptome eines inkompletten HUS beobachtet. Akute Komplikationen wie ein Hirnödem können zum Tode führen. Bei klinischen EHEC-Isolaten werden häufig neben den zytotoxisch wirksamen Shiga-Toxinen (Syn. Verotoxine, Shiga-like Toxine) noch andere Pathoge­ nitätsfaktoren gefunden. EHEC sind in ihren Antigenstrukturen (O-,H-Antigene) hetero­ gen. Als wichtigster Serovar wurde O157:H7 identifiziert. Seltener werden EHEC z. B. der Serovare O157:H⁻, O26:H11, O111:H⁻ gefunden.
E. coli-Stämme die unter Bildung von Shiga-Toxinen eine hämorrhagische Colitis und/oder ein HUS verursachen können werden als enterohämorrhagische E. coli (EHEC) bezeichnet. Es sind begeißelte oder unbegeißelte gramnegative Stäbchen, die aufgrund ihrer Antigenstruktur zu verschiedenen Serovaren gehören. Bei der Mehrzahl der klinischen Isolate sind außer den Shiga-Toxinen noch andere Virulenzfaktoren nachweisbar. Die Infektion führt nach einer Inkubationszeit von 2-5 Tagen zur Durch­ fallerkrankung, die unterschiedlich schwer verlaufen kann. Der zunächst wäßrige Durchfall geht bei 15-20% der Erkrankten in eine profuse hämorrhagische Diarrhoe über. Bei 5-10% der Erkrankten entwickelt sich etwa 8 Tage nach Beginn der Durch­ fälle ein HUS.
Das klassische HUS ist die häufigste Ursache des akuten Nierenversagens im Kindes­ alter. Die mikroangiopathische Hämolyse mit Fragmentation der Erythrozyten und aku­ tem Hämoglobinabfall, massiver Laktatdehydrogenase-Erhöhung, Haptoglobin­ verbrauch und dem Thrombozytensturz im peripheren Blut als Folge der Bildung intra­ vaskulärer Mikrothromben werden pathogenetisch auf die Läsion kapillärer Endothel­ zellen zurückgeführt. Die glomeruläre Schädigung führt zum oft dramatischen Anstieg der harnpflichtigen Substanzen, mit oder ohne Anurie sowie zu Elektrolytentgleisungen und Überwässerung. Häufige extrarenale Komplikationen sind cerebrale Krammpfanfälle, Koma und Hirnödem. Auch die Invagination mit mechanischem Ileus; adultes Atemnot-Syndrom als Ausdruck eines Multiorganversagens; eine Pankreatitis mit Bildung eines Insulin-abhängigen Diabetes mellitus; oder ein toxischer Myokardschaden sind be­ schrieben. Gerade diese Komplikationen können in bis zu 10% der Fälle zum Tode im akuten Stadium führen. Auch nach Überstehen der akuten Symptomatik, oft unter In­ tensivtherapie mit Hämodialyse können schwere bleibende Schäden auftreten wie eine arterielle Hypertonie oder eine chronische Niereninsuffizienz, die eine ambulante Peri­ tonealdialyse, eine Nierentransplantation oder Tod in der terminalen Niereninsuffizienz nach sich ziehen kann. Leichtere Formen des HUS, die oft als inkomplettes HUS be­ zeichnet werden, entziehen sich oft der Diagnostik. So können nach einer enteralen EHEC-Infektion scheinbar isolierte hämolytische Anämien ohne Beeinträchtigung der Nierenfunktion auftreten. Eine Mikrohämaturie und/oder Proteinurie kann jedoch auch hier auf die leichte Nierenschädigung hinweisen. Auch das inkomplette HUS kann zu einer arteriellen Hypertonie führen.
Verbindliche Untersuchungsverfahren liegen bisher nicht vor. Grundsätzlich wird der kulturelle Nachweis von EHEC erschwert durch die biochemische Ähnlichkeit dieser Erreger mit den Kommensalen der Darmflora, durch die relativ geringe Anzahl im Ver­ gleich zur physiologischen Flora, die auch bei EHEC-Patienten kaum unterdrückt ist. So haben Patienten mit akuten blutigen Durchfällen oder HUS immer noch 106 bis 107 E. coli der physiologischen Darmflora pro Gramm Stuhl. Nicht selten findet sich nur ein EHEC auf 200-300 E. coli der physiologischen Flora. Erschwerend kommt die große Anzahl an E. coli-Serovaren die zur Shiga-Toxin Bildung befähigt sind (bisher 160 beim Menschen) hinzu. Daher ist bisher die diagnostische Strategie überwiegend auf den Nachweis der Toxine und/oder der Toxingene ausgerichtet.
Im folgenden werden die derzeit verwendeten diagnostischen Verfahren, bei denen es sich entweder um Erregerisolierung mittels Kulturverfahren oder um Nachweise von Erregertoxinen handelt kurz vorgestellt und kritisch gewertet.
Der Nachweis auf Sorbit-MacConkey-Agar (SMAC) ist möglich, da dieser Agar Sorbit als einzige Kohlenstoffquelle enthält. EHEC der Serogruppe O157:H7 können im Ge­ gensatz zu 95% der physiologischen E. coli Zuckeralkohol Sorbit nicht fermentie­ ren und so an den wegen Nicht-Umschlagens des Indikators farblosen Kolonien er­ kannt werden. Farblose Kolonien müssen isoliert werden und das Vorliegen des O-Antigen 157 muß mittels Objekträgeragglutination, ELISA oder Latexagglutination be­ stätigt werden. Weiterhin muß bei den isolierten Kolonien die Bildung von Shiga-Toxin bzw. das Vorliegen der Shiga-Toxingene nachgewiesen werden. Im Jahr 1988 wurden erstmals Stämme der Serogruppe O157:H⁻ im Stuhl von HUS-Patienten nachgewiesen, die in der Lage waren, Sorbit prompt zu vergären. Diese Stämme unterscheiden sich auf SMAC nicht von E. coli der physiologischen Flora und können auf diesem Nährbo­ den nicht als potentielle EHEC identifiziert werden.
Durch Kultur auf bluthaltigem Enterohämolysin-Agar Nährboden kann man den durch EHEC-Hämolysin verursachten enterohämolytischen Phänotyp nachweisen. Obwohl EHEC bis auf wenige Ausnahmen die Gene für das Hämolysin tragen, exprimiert jedes vierte Isolat nicht das phänotypische Merkmal. Darüber hinaus ist es sehr schwierig, bei der Kultivierung von Stuhl auf dem nicht selektiven Blutmedium einzelne Kolonien mit Hämolysehof überhaupt zu erkennen.
Bei der immunmagnetischen Separation (IMS) werden magnetische Partikel, die mit Antikörpern gegen EHEC O157 beschichtet sind, verwendet. Das Untersuchungsmate­ rial wird nach Voranreicherung in einem Flüssigmedium mit diesen Partikeln suspen­ diert. Nun wird ein Magnet angelegt und die Partikel werden mitsamt den anhaftenden EHEC aus der Bouillon gezogen. Die Magnetpartikel werden anschließend ausplattiert, z. B. auf SMAC. Auf diese Weise können die EHEC stark angereichert werden, Rein­ kulturen werden aber auch hier in der Regel nicht erzielt. Immerhin können mittels IMS 100 EHEC pro Gramm Stuhl nachgewiesen werden, während die Direktkulturverfahren 105 bis 106 EHEC pro Gramm Stuhl für ein positives Resultat benötigen.
Generell haben die Kulturverfahren den Nachteil, daß sie sehr zeitaufwendig sind und daß die alleinige Anzucht noch keinen direkten Nachweis des EHEC darstellt. Der Nachweis einer Toxin-Bildung muß anschließend an das Anzuchtverfahren immer noch durchgeführt werden.
EHEC gehören zur Gruppe der Shiga-Toxin produzierenden E. coli (STEC). Allerdings sind nicht alle in der Natur vorkommenden STEC für den Menschen pathogen. Nur die Stämme unter den STEC, die beim Menschen Darmerkrankungen und extraintestinale Manifestationen verursachen, werden als EHEC bezeichnet. Der direkte Nachweis von Shiga-Toxinen (Stx) im Stuhl oder bei dem isolierten Erreger mit Hilfe des ELISA stellt eine Diagnosemöglichkeit dar, die allerdings nicht unbedingt spezifisch für EHEC ist. Die Toxine Stx1 und Stx2 können entweder getrennt oder in Kombination nachgewie­ sen werden. Allerdings führt die unterschiedlich starke Expression dieser Toxine dazu, daß teilweise nur sehr geringe Mengen dieser Toxine vorhanden sind und damit der Nachweis erschwert oder sogar unmöglich wird.
Außer im ELISA können die Shiga-Toxine auch mittels Verozellkultur nachgewiesen werden. Der Zytotoxizitätstest mit Verozellen (Nierenzellen der afrikanischen Meerkat­ ze) hat eine hohe Sensitivität, allerdings ist bei Nachweis einer zytotoxischen Aktivität im Stuhl ein Neutralisationstest erforderlich um die Spezifität des Testergebnisses zu gewährleisten. Wegen der Heterogenität der Toxine (EHEC O157 können z. B. sechs verschiedene Toxinkombinationen exprimieren) und Stämmen, die zwei oder mehr im­ munologisch unterschiedliche Shiga-Toxine bilden, gegen die Antikörper nicht kommer­ ziell erhältlich sind, kann der Neutralisationstest nur in wenigen Speziallabors durch­ geführt werden. Bei Durchführung des Zytotxizitätstests ist erst nach drei Tagen mit einem Testergebnis zu rechnen, bei zusätzlicher Durchführung der Toxin-Neutralisation nach einer Woche.
EHEC können auch mit der Technik der PCR durch Nachweis der für EHEC spezifi­ schen Genfragmente nachgewiesen werden. Mittels geeigneter Primer werden für EHEC spezifische DNA-Zielsequenzen amplifiziert. Diese Methode hat sich als vertret­ bar sensitiv erwiesen, kann aber Probleme bereiten, wenn der Test direkt aus dem Stuhl durchgeführt wird. Daher wird die PCR häufig von Kolonienabschwemmungen durchgeführt. Zur Anwendung kommen Oligonukleotidprimer, die komplementär zu den stx1 und stx2 sind.
In der Kolonienblot-Hybridisierung werden die zu untersuchenden Bakterienkolonien auf einer Nylon-Membran fixiert, lysiert und spezifische Sequenzen der freigelegten DNA mittels Digoxigenin-markierten DNA-Proben (komplementär für die Shi­ ga-Toxine) sichtbar gemacht. Sie erlaubt die Identifizierung von einer EHEC-Kolonie unter 200-300 Kolonien der Begleitflora.
Die Durchführung der PCR und der Kolonienblot-Hybridisierung erfordert einen hohen Geräte- und Personalaufwand und ist nur in Speziallabors durchführbar.
Zusammenfassend stellte sich damit das Problem, daß die bestehenden Nachweis­ verfahren für Enterohämorrhagische E. coli entweder zu unspezifisch, zu kompliziert oder zu langwierig waren. Es bestand ein Bedarf für ein einfaches, spezifisches Nach­ weisverfahren für EHEC, um bei den weltweit zunehmend auftretenden EHEC-Erkrankungen durch schnelle spezifische Diagnostik frühzeitig geeignete Therapie­ maßnahmen einzuleiten und EHEC-Epidemien zu begrenzen. Nur die richtige, frühzei­ tige Therapie ist geeignet, die Spätfolgen der EHEC-Erkrankung und des HUS wie be­ sonders das Nierenversagen zu vermeiden. Durch zu späte oder falsche Diagnose be­ steht für die Patienten akute Gefahr, da übliche Antibiotika-Behandlungen bei EHEC-Infektionen kontraindiziert sind, den Patienten noch zusätzlich schaden und die Ent­ wicklung eines HUS beschleunigen können.
Das Problem wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man für die Diagnostik ein Verfahren zur Identifizierung von EHEC anwendet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Serin-Protease nachweist, die ein Molekulargewicht von ca. 105 kDa hat, Schweine-Pepsin und humanen Gerinnungsfaktor V spalten kann, von der überwie­ genden Mehrheit der EHEC gebildet wird und bei der überwiegenden Mehrheit anderer Pathogruppen darmpathogener E. coli nicht nachweisbar ist.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß man durch Nachweis der erfindungsge­ mäßen Serin-Protease die überwiegende Mehrheit der EHEC-Isolate eindeutig identifi­ zieren kann. Insbesondere können nahezu alle EHEC-Isolate der wichtigsten Sero­ gruppe E. coli O157:H7 diagnostiziert werden. Durch Verwendung der Serin-Protease ist es außerdem möglich, EHEC-Stämme von anderen Pathogruppen darmpathogener E. coli (Enteropathogene E. coli, Enterotoxinbildende E. coli, Enteroinvasive E. coli, Enteroaggregative E. coli) diagnostisch zu differenzieren.
Erfindungsgemäß kann man z. B. die Serinprotease durch Nachweis des Serinprotease-Genes oder von Fragmenten des Genes mittels PCR oder Hybridisierung mit spezifi­ schen Gen-Sonden identifizieren. Prinzipiell sind für dieses Nachweisverfahren auch das Gen oder Genfragmente der Vorstufe der Serinprotease mit einem Molekularge­ wicht von ca. 142 kDa geeignet.
Desweiteren ist erfindungsgemäß der immunologische Nachweis der Serinprotease oder Fragmenten davon mittels spezifischer Antikörper möglich. Auch die Vorstufe der Serinprotease mit einem Molekulargewicht von ca. 142 kDa oder Fragmente davon sind hierfür geeignet. Als Antikörper können polyklonale oder monoklonale Antikörper menschlichen oder tierischen Ursprungs verwendet werden.
Dieser Nachweis wird vorteilshaft im ELISA oder Immunoblot durchgeführt. Weitere Möglichkeiten bieten immunologische Techniken wie z. B. Immunodot-Verfahren, Im­ munfluoreszenz, Agglutinationsreaktionen oder Immunmagnetische Separation.
Eine weiteres erfindungsgemäßes Nachweisverfahren besteht im Nachweis der Pro­ teaseaktivität der Serinprotease. Dieser Nachweis kann z. B. mittels chromogener Substrate oder anderer geeigneter Substrate erfolgen. Da die Serinprotease in spezifi­ scher Weise Schweinepepsin und humanen Gerinnungsfaktor V spaltet, eignen sich diese Substrate oder davon abgeleitete Substrate in besonderer Weise für den Nach­ weis der Serinprotease.
Die aufgeführten Nachweisverfahren können direkt in Stuhl, Blut oder anderen Körper­ flüssigkeiten, in pflanzlichen oder tierischen Lebensmitteln, in Kotproben von Tieren, in Wasser (Brauchwasser, Oberflächenwasser, Trinkwasser etc.) oder in sonstigen Um­ weltproben durchführt werden.
In Fällen mit geringer Keimbelastung oder bei anderen Problemfällen kann man den Nachweis in Stuhl, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, in pflanzlichen oder tieri­ schen Lebensmitteln, in Kotproben von Tieren, in Wasser (Brauchwasser, Oberflä­ chenwasser, Trinkwasser etc.) oder in sonstigen Umweltproben durchführen, indem man Bakterien in Kulturmedium vermehrt und den Nachweis direkt im Kulturüberstand durchführt.
Mittels des erfindungsgemäßen Nachweises der Serinprotease können für den Men­ schen potentiell virulente STEC, die in diesem Falle als EHEC bezeichnet werden, von weniger oder avirulenten STEC differenziert werden. Wird neben dem Shiga-Toxin auch die Serinprotease nachgewiesen, ist der entsprechende Stamm mit höchster Wahrscheinlichkeit als EHEC zu klassifizieren. Für die Therapie von EHEC-Infektionen des Menschen und für die Prävention von Epidemien ist es dringend erforderlich, in einem einfachen und schnellen und trotzdem spezifischen Nachweisverfahren bei Durchfall-Patienten diese pathogenen EHEC von STEC zu unterscheiden. Außerdem ist es mittels dieses einfachen und schnellen Nachweisverfahren möglich, EHEC-Kontamination in Nahrungsmittel mit höherer Spezifität im Vergleich zum bisher verwendeten Shiga-Toxin-Nachweis zu identifizieren.
Da die besonders virulente Serogruppe O157 in den meisten Ländern weltweit für min­ destens 70% der bakteriologisch nachgewiesenen EHEC-assoziierten HUS-Fälle und für mindestens 30% der Enteritisfälle verantwortlich ist, ist es besonders vorteilhaft, daß die erfindungsgemäßen Nachweisverfahren ca. 95% dieser Serogruppe identifi­ ziert.
Beispiel 1
Von 442 Patienten mit Durchfall mit Verdacht auf EHEC-Infektion wurden Stuhlproben gewonnen und die Bakterien auf MacConkey Agar über Nacht angezüchtet. Die Bakte­ rien wurden abgeschwemmt und mittels PCR unter Verwendung spezifischer Oligonu­ kleotidprimer auf das Vorhandensein von Shiga-Toxin-Gen und des erfindungsgemäßen Serinprotease-Gen getestet. Als Oligonukleotidprimer für die Serinprotease wurden folgende Oligonukleotide verwendet: esp-A: 5'-AAACAGCAGGCACTTGAACG-3'; esp-B: 5'-GGAGTCGTCAGTCAGTAGAT-3'. Die Shiga-Toxin und die Serinprotease produ­ zierenden E. coli Stämme wurden isoliert und serotypisiert. Von 93 Serinprotease pro­ duzierenden E. coli gehörten 61 zur hochvirulenten Serogruppe O157, 12 zur Sero­ gruppe O26 und 20 zu anderen EHEC-Serogruppen (z. B. O111 und O103). Bei allen diesen Stämme konnte außerdem das Shiga-Toxin Gen nachgewiesen werden. Insge­ samt tragen von den 170 Shiga-Toxin-Gen positiven Isolaten 54% das Serinprotease-Gen. Innerhalb der für den Menschen besonders pathogenen Serogruppe O157:H7 wurden über das Serinprotease-Gen 95% (61 von 64) identifiziert.
Beispiel 2
Eine potentielle Infektionsquelle für den Menschen für EHEC-Infektionen stellen tieri­ sche Nahrungsmittel, die mit Kotspuren kontaminiert sind, dar. Unter Verwendung der Shiga-Toxine als Marker werden auch STEC-Stämme identifiziert (z. B. E. coli der Serogruppen O138, O139 und andere), die bisher noch nie beim Menschen als Krank­ heitserreger in Erscheinung getreten sind. So wurden z. B. nur bei 25% der aus Rohmilch isolierten STEC das Serinprotease-Gen nachgewiesen. Dies bedeutet, daß nur diese 25% der Rohmilchisolate als gesichert EHEC-positiv und humanpathogen gewertet werden können. Auf der Basis des Nachweises der Serinprotease ist damit ein spezifischerer Nachweis von EHEC-Kontamination in Nahrungsmittel im Vergleich zum bisher verwendeten Shiga-Toxin-Nachweis möglich.
Beispiel 3
Die Serinprotease wurde aus Kulturüberständen rekombinanter E. coli Stämme isoliert, die ein kloniertes Protease-Gen auf einem Plasmid trugen. Durch Verwendung dieser rekombinanten Stämme war es möglich, das Protein in besonders reiner Form zu ge­ winnen.
Die Aufreinigung erfolgte durch Gelelektrophorese und anschließende Elektroelution. Das gereinigte Protein wurde zur Immunisierung in Kaninchen verwendet. Das so er­ haltene, gegen die Serinprotease gerichtete, polyklonale Antiserum wurde zum immu­ nologischen Nachweis der Protease im Immunoblot verwendet. Hierfür wurden Über­ stände von Übernachtkulturen von EHEC-Stämmen verwendet, die mittels TCA-Fällung angereichert wurden. Bei allen in Beispiel 1 erwähnten Stämmen, bei denen mittels PCR das Serinprotease-Gen nachgewiesen worden war, konnte auf diesem Wege die Protease als 105 kDa-Bande nachgewiesen werden.
Beispiel 4
Kulturüberstände von 20 E. coli Stämmen, bei denen das Serinprotease-Gen durch PCR nachgewiesen worden war, wurden auf proteolytische Aktivität gegenüber Schweine-Pepsin und Gerinnungsfaktor V getestet. Der Nachweis der Aktivität erfolgte durch Nachweis der spezifischen Spaltprodukte im SDS-Polyacrylamidgel bzw. in ei­ nem Immunoblot unter Verwendung eines Antikörpers gegen Faktor V. Alle Kulturüber­ stände von Stämmen, die das Protease-Gen trugen, besaßen auch die spezifische Protease-Aktivität. In Kulturüberständen von 20 E. coli Stämmen, die das Serinprotea­ se-Gen nicht trugen, war auch keine Aktivität nachweisbar.

Claims (8)

1. Verfahren zur Identifizierung von Enterohämorrhagischen E. coli, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Serin-Protease nachweist, die
  • a) ein Molekulargewicht von ca. 105 kDa hat,
  • b) Schweine-Pepsin spalten kann,
  • c) humanen Gerinnungsfaktor V spalten kann,
  • d) von der überwiegenden Mehrheit der Enterohämorrhagischen E. coli gebildet wird und
  • e) bei der überwiegenden Mehrheit anderer Pathogruppen darmpathogener E. coli nicht nachweisbar ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Fragmente der Se­ rin-Protease oder Fragmente ihrer Vorstufe, die als Ganzes ein Molekulargewicht von ca. 142 kDa hat, nachweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachweis mittels spezifischer Antikörper gegen die Serin-Protease oder ihre Vorstufe oder Fragmente davon durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachweis mittels der Proteaseaktivität der Serin-Protease durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachweis mit­ tels der Spaltung eines chromogenen Substrates der Serin-Protease durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gen oder Genfragmente, welche Teile oder die komplette Serin-Protease-Vorstufe kodieren, mittels PCR oder Hybridisierung mit spezifischen Gen-Sonden nachweist.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachweis direkt in Stuhl, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, in pflanzlichen oder tierischen Lebensmitteln, in Kotproben von Tieren, in Wasser oder in sonstigen Umweltproben durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachweis in Stuhl, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, in pflanzlichen oder tierischen Le­ bensmitteln, in Kotproben von Tieren, in Wasser oder in sonstigen Umweltproben durchführt, indem man Bakterien in Kulturmedium vermehrt und den Nachweis di­ rekt im Kulturüberstand durchführt.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001023607A2 (de) * 1999-09-28 2001-04-05 Cytonet Gmbh & Co. Kg Multiplex-pcr zum nachweis von ehec-infektionen

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5047747A (en) * 1990-07-25 1991-09-10 Designtech International, Inc Combination back-up light and sound emitting device for trucks and other automotive vehicles
US5658747A (en) * 1994-05-10 1997-08-19 Biocontrol System, Inc. Compositions and methods for control of reactivity between diagnostic reagents and microorganisms
US5475098A (en) * 1994-06-14 1995-12-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Distinctive DNA sequence of E. coli 0157:H7 and its use for the rapid, sensitive and specific detection of 0157:H7 and other enterohemorrhagic E. coli

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001023607A2 (de) * 1999-09-28 2001-04-05 Cytonet Gmbh & Co. Kg Multiplex-pcr zum nachweis von ehec-infektionen
WO2001023607A3 (de) * 1999-09-28 2001-12-06 Cytonet Gmbh & Co Kg Multiplex-pcr zum nachweis von ehec-infektionen

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