DE19701802A1 - Verfahren zum Nachweis von kontaminierenden Karzinomzellen mittels Reverse Transcriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) - Google Patents

Verfahren zum Nachweis von kontaminierenden Karzinomzellen mittels Reverse Transcriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

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DE19701802A1
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von kontaminierenden Karzinomzellen in peripheren Blutzellen und in Leukapherasaten für die autologe Stammzelltransplantation mittels Reverse Transcriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT- PCR).
Verschiedene Methoden sind für den Nachweis kontaminierender Tumorzellen bekannt, so z. B. die immunzytochemische Färbung, Tumorzell-Klonalitäts-Assays oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Diese Methoden wurden hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und klinischer Einsatzmöglichkeit verschiedentlich untersucht. Die Besonderheiten der zugrundeliegenden Erkrankung sind hierbei für die Überlegenheit einer Methode gegenüber anderen von Ausschlag.
Als eine bevorzugte Methode wird die Reverse Transcriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) angesehen ( Datta et al, J. Clin. Oncol. 12: 475-482, 1994). Sie erwies sich bei verschiedenen bösartigen Erkrankungen als besonders sensitiv mit einer Nachweisempfindlichkeit von bis zu einer Tumorzelle in 10⁷ mononukleären Zellen des Blutes (Lin et al., Curr. Opinion. Oncol. 2: 460-467, 1995).
Als spezifischer Marker zum Nachweis epithelialer Zellen wird Cytokeratin (CK) 19 mRNA beschrieben. Es wurde jedoch festgestellt, daß der spezifische Nachweis von CK 19 mRNA durch Gegenwart eines bekannten CK 19 Pseudogens mit hoher Homologie behindert wird. Dieses Pseudogen ist verantwortlich für falsch-positive Ergebnisse bei verschiedenen nicht epithelial bedingten malignen Krankheiten (Savtchenko et al, Am. J. Hum. Genet. 43: 630-637, (1989).
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein empfindliches Nachweisverfahren für kontaminierende Karzinomzellen in peripheren Blutzellen mittels RT-PCR bereitzustellen, das falsch-positive Werte ausschließt.
Die Aufgabe konnte überraschend durch Verwendung von EGF- Rezeptor-Primern gelöst werden.
Erfindungsgemäß wird die RT-PCR mittels einem oder mehreren EGF-Rezeptor-Primer-Paaren durchgeführt.
Bevorzugt wird der EGF-Rezeptor-Primer (EGFR) HSEGFPRE bp 698-1181 mit den Sequenzen für
EGFR1 - ACTTTCTCAGCAACATGTCGATGGACTT (sense 698-725) und
EGFR2 - CCCTTCGCACTTCTTACACTTGCGGACG (antisense 1181-1151)
eingesetzt.
Besonders bevorzugt ist der Primer EGFR bp 702-1175 mit den Sequenzen für
EGFR1 - TCTCAGCAACATGTCGATGG (sense 702-721) und
EGFR2 - TCGCACTTCTTACACTTGCG (antisense 1175-1156).
Bei negativem Ergebnis in der ersten Amplifikation wird erfindungsgemäß durch eine erneute PCR-Reaktion mit innerhalb der Primärsequenz lokalisierten Primern (nested primers) eine Reamplifikation durchgeführt.
Bevorzugt wird dabei als weiterer Primer EGFR bp 783-1060 mit den Sequenzen für
EGFR3 - CTGGGGTGCAGGAGAGGAGAACTGCCAG (sense 783-810) und
EGFR4 - CGCAGGTGGCACCAAAGCTGTATTTGCC (antisense 1060-1033)
eingesetzt.
Besonders bevorzugt ist als Primer EGFR bp 787-1056 mit den Sequenzen für
EGFR3 - GGTGCAGGAGAGGAGAACTG (sense 787-806) und
EGFR4 - GGTGGCACCAAAGCTGTATT (antisense 1056-1037).
Die Verwendung der erfindungsgemäßen EGF-Rezeptor-Primer zum Nachweis von kontaminierenden Karzinomzellen im peripheren Blut, hat den großen Vorteil, daß der EGF-Rezeptor in einem Teil der Karzinomzellen durch Gen-Amplifikation und/oder Überexpression in erheblich höheren Mengen als im normalen epithelialen Gewebe nachweisbar ist.
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist deshalb besonders gut geeignet für den Nachweis von Karzinomzellen im peripheren Blut. Seine Empfindlichkeit liegt bei 1 Tumorzelle in bis zu 10⁶ mononukleären Zellen des Blutes, falsch­ positive Werte aus gesunden Proben wie im Vergleich unter Verwendung von CK 19 festgestellt, werden ausgeschlossen.
Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Ausführungsbeispiele 1. RNA-Präparation
Periphere mononukleäre Blutzellen von gesunden Spendern (Negativ-Kontrolle) und Patienten wurden über einen Ficoll- Hypaque Gradienten (Pharmacia Schweden) getrennt und zweimal mit PBS-Puffer, der 1% FCS enthält, gewaschen. Die Zellen wurden gezählt, die Vitalität wurde mittels Trypan-blau Ausschluß eingeschätzt.
Die Zellen wurden anschließend in TRIzol-Reagenz (GIBCO BRL, USA) lysiert, homogenisiert und danach einer einstufigen Guanidin Isothiocyanat/Phenol RNA-Präparation nach Chromczynski, P. und N. Sachi, Annal. Biochem. 162, S. 156- 159 (1987) unterzogen. Durch Addition von Chloroform erfolgte eine Phasentrennung. Die RNA, die in der wäßrigen oberen Phase enthalten war, wurde in Isopropanol bei -80°C ausgefällt, in 80%igem Ethanol gewaschen und in RNAse freiem Wasser resuspendiert.
Um kontaminierende DNA zu eliminieren, wurde die RNA einer RNAse-freien DNAse I (1U/µg RNA, Boehringer Mannheim, BRD) bei 37°C für 30 Minuten ausgesetzt. Nach Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 95°C für 5 Minuten, wurde die RNA ausgefällt und resuspendiert. Die Degradation von genomischer DNA wurde durch PCR-Analyse unter Verwendung von β₂ Microglobulin- Primern, die mehrere Exons überspannen, geprüft (Bouaboula, M. et al (1992), J. Biol. Chem. 267: 21830-21838), so daß in Gegenwart von genomischer DNA ein PCR-Produkt mit 700 bp größer als jenes von β₂ Microglobulin mRNA erhalten wurde.
2. Spezifität der RT-PCR Analyse
Zur Beobachtung von Brusttumorzellen in peripheren mononukleären Blutzellen unter Verwendung der RT-PCR, wurden verschiedene epitheliale oder Brust-epitheliale Markergene auf Spezifität und Sensivität analysiert:
  • - epitheliales Oberflächen-Antigen (Simon, B. et al (1990), Proc. Natl. Acad. Sci (USA). 87: 2755-2759),
  • - Mucin 1 (Noguchi, S. et al (1994), Cancer. 74: 1595-1600),
  • - Aromatase-Cytochrom P 450 und Cytokeratin (Datta, Y. H. et al (1994), J. Clin. Oncol. 12: 475-482) und
  • - epithelialer Wachstumsfaktor Rezeptor (EGF-R)- (Carpenter, G. (1987), Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914).
Von allen untersuchten Targets zeigten nur Cytokeratin und der EGF-R hohe Spezifität, außer in Brusttumorzellinien waren in keiner anderen Zellinie spezifische PCR-Produkte gegeben. Abb. 1 zeigt die Ergebnisse der RT-PCR-Analyse, die unter Verwendung der RNA von den Brusttumorzellen T 47D, MCF-7 und R30C, der RNA von den lymphoiden Zellinien BLIN-1, NALM-6, U266, BJAB, Raji und BL-41 durchgeführt wurde. RTPCR für β₂ Mikroglobulin diente zur Kontrolle für die Anwesenheit intakter mRNA.
Ergänzend wurde RNA von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von 20 gesunden Spendern präpariert, DNAse wurde aufgenommen und die PCR in bekannter Weise durchgeführt. Keine der analysierten Proben zeigte PCR-Produkte für Cytokeratin 19 und EGF-R mRNA. Abb. 2 zeigt die Ergebnisse, die aus 10 PBMC-Proben erhalten wurden (Spalten 1-10), RNA der Brusttumorzellinie R30C diente als positive Kontrolle (Spalte 11).
Die Reamplifikation von Cytokeratin 19 mRNA PCR-Produkten unter Verwendung von "nested" Primern zeigte PCR-Signale in ungefähr 50% von allen gesunden Spenderproben. Verschiedene Blutproben von gesunden Spendern, die unter Weglassen des DNA-Schrittes präpariert worden waren, und die in dem RNA- Verfahren verwendet wurden, waren in der primären Amplifikation positiv. Die RT-PCR auf Cytokeratin 19 mRNA zeigte damit nicht die Spezifität der erfindungsgemäß etablierten RT-PCR auf EGF-Rezeptor-mRNA.
3. Sensitivität der RT-PCR-Analyse
Zur Bestimmung der Sensitivität des RT-PCR-Assays wurden unter Verwendung von PBMC gesunder Spender verschiedene Untersuchungen durchgeführt. 10⁷ PBMC, die in absteigender Verdünnung Brusttumorzellen der Zellinien MCF-7 und R30C enthielten, wurden durch RNA-Isolierung und RT-PCR-Analyse untersucht. Die Beobachtung, begrenzt auf EGF-Rezetor mRNA und Cytokeratin 19 mRNA, variierte erheblich und reproduzierbar innerhalb der unterschiedlichen vorhandenen Brusttumorzellen. Mit beiden Targets wurde eine maximale Sensivität von 1 Tumorzelle in 10⁵ PBMC beobachtet, mit einer außergewöhnlichen Sensivität für EGF-R mRNA-Amplifikation von 1 : 10⁶ in einem Fall von Cal-51 Serienverdünnung (Abb. 3).
4. Immunocytochemische Färbung und RT-PCR: Vergleich der Sensitivität
Zur Bestimmung der Sensitivität zur Beobachtung von Brusttumorzellen wurden Untersuchungen unter Verwendung von PBMC gesunder Spender durchgeführt. 10⁷ PBMC, die in absteigender Verdünnung Brusttumorzellen von der Zellinie Cal-51 enthielten, wurden zur immuncytochemischen oder PCR- Analyse eingesetzt. Abb. 4 zeigt das Ergebnis der immuncytochemischen Analyse unter Einsatz von mAk HEA 125 (linke Säule) und Pan-Cytokeratin (rechte Säule) in der Verdünnungsserie. Eine Tumorzell-Kontamination von 1 TM-Zelle in 10⁵ MNC wurde beobachtet. Die RT-PCR Ergebnisse sind wie bereits oben erwähnt in Abb. 3 dargestellt. Die Beobachtung der Sensitivität von 1 Brusttumorzelle in 10⁵ mononuklearen Zellen wurde erreicht. Darüber hinaus zeigte die RT-PCR für EGF-R mRNA eine Sensitivität von 1:10⁶ Zellen.
5. Karzinom-Detektion mittels RT-PCR
10 µg RNA, die aus Zellen des peripheren Blutes bzw. Leukapheresaten gewonnen wurden, werden mit einem 15(dT)- Primer nach einem Standardprotokoll zu cDNA revers transkribiert. 1/10 dieser Probe wird zur RT-PCR eingesetzt.
Die PCR-Reaktion wird in vierzig Zyklen bei 94°C 40 sec, 60°C 1 min, 72°C 1 min durchgeführt, mit abschließenden fünf Minuten bei 72°C. Untersucht wurde neben der Expression von EGF-Rezeptor-Transkripten (Primer EGFR1 und EGFR2) auch die Expression von β2-Mikroglobulin mRNA (interne Kontrolle zum Beleg der Integrität der RNA). Je 20 µl der PCR-Produkte werden schließlich neben einem Größenmarker auf einem 1%- Agarose-Gel aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidium-Bromid sichtbar gemacht. Bei negativem Ergebnis in der ersten Amplifikation kann durch eine erneute PCR-Reaktion unter oben genannten Bedingungen in dreißig Zyklen mit innerhalb der Primärsequenz lokalisierten Primern (EGFR3 und EGFR4; "nested primers") eine Reamplifikation durchgeführt werden.
Oligonukleotide zum Nachweis der EGF-Rezeptor-mRNA in der RT- PCR
Die für den EGF-Rezeptor-Transkript-Nachweis verwendeten Primer wurden aus in der EMBL-Datenbank archivierten Sequenzen ausgewählt und auf kreuzhybridisierende Sequenzen geprüft. Sie sind in 5′-3′-Orientierung aufgelistet.
Die erfindungsgemäßen Primer sind:
Primer EGFR1 (sense): TCT CAG CAA CAT GTC GAT GG (hsegfpre 702-721)
Primer EGFR2 (a-sense): TCGCAC TTC TTA CAC TTG CG (hsegfpre 1175-1156)
Primer EGFR3 (sense): GGT GCA GGA GAG GAG AAC TG (hsegfpre 787-806)
Primer EGFR4 (a-sense): GGT GGC ACC AAA GCT GTA TT(hsegfpre 1056-1037).

Claims (5)

1. Verfahren zum Nachweis von kontaminierenden Karzinomzellen in peripheren Blutzellen und in Leukapherasaten mittels Reverse Transcriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) durch Gewinnung von RNA aus Zellen des peripheren Blutes oder aus peripheren Stammzellen, die nach an sich üblichen Methoden zu cDNA revers transkribiert wird, und anschließender Durchführung der RT-PCR mittels einem oder mehreren EGF-Rezeptor-Primer-Paaren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als EGF-Rezeptor-Primer (EGFR) HSEGFPRE bp 698-1181 mit den Sequenzen für
EGFR1 - ACTTTCTCAGCAACATGTCGATGGACTT (sense 698-725) und
EGFR2 - CCCTTCGCACTTCTTACACTTGCGGACG (antisense 1181-1151)
eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer EGFR bp 702-1175 mit den Sequenzen für
EGFR1 - TCTCAGCAACATGTCGATGG (sense 702-721) und
EGFR2 - TCGCACTTCTTACACTTGCG (antisense 1175-1156)
eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als weiterer Primer EGFR bp 783-1060 mit den Sequenzen für
EGFR3 - CTGGGGTGCAGGAGAGGAGAACTGCCAG (sense 783-810) und
EGFR4 - CGCAGGTGGCACCAAAGCTGTATTTGCC (antisense 1060-1033)
eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer EGFR bp 787-1056 mit den Sequenzen für
EGFR3 - GGTGCAGGAGAGGAGAACTG (sense 787-806) und
EGFR4 - GGTGGCACCAAAGCTGTATT (antisense 1056-1037)
eingesetzt wird.
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WO2008119562A1 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Bergen Teknologioverforing As Method and kits for detection of egfrviii

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