DE1617284B - Vorrichtung und Verfahren zum Züchten von Gewebekulturzellen - Google Patents
Vorrichtung und Verfahren zum Züchten von GewebekulturzellenInfo
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Description
3 4
An den durch die Endplatten 17 hindurchgeführten eine mechanische Pumpe verwendet werden. F i g. 2
Enden 16 sind die Trägerstäbe 13 mit Gewinde ver- zeigt eine Abänderung der Vorrichtung, bei der zum
sehen. Das ganze Aggregat von Platten 12, Träger- Umwälzen der Flüssigkeit eine außerhalb des Gefäßes
stäben 13 und Endplatten 17 wird von den Muttern 18 angeordnete Pumpe dient. Das Nährmedium 14 wird
zusammengehalten. 5 durch die Einlaßleitung 31 vom Boden des Gefäßes 11 Das Gefäß 11 steht auf der elastischen Schutzunter- durch die sterile Pumpe 32 angesaugt und durch die
lage 19 und ist zwischen der Grundplatte 20 und der Auslaßleitung 33 zum Flüssigkeitsspiegel gepumpt, wo
Deckplatte 21 eingeklemmt. Die Befestigungsstäbe 22 es austritt. Auf diese Weise wird das Medium umgesind
an der Grundplatte 20 befestigt und durch Öff- wälzt und belüftet, so saß in dem ganzen Gefäß 11
nungen in der Deckplatte 21 hindurchgeführt, und das io gleichmäßige Wachstumsbedingungen herrschen.
Ganze wird durch die auf die Enden der Befestigungs- Das Gefäß 11 mit dem darin befindlichen Medium
stäbe 20 aufgeschraubten Muttern 23 zusammengehal- 14, den Platten und der Umlaufpumpe kann sich in
ten. Zwischen dem Gefäß 11 und der Deckplatte 21 einem Ofen mit konstanter Temperatur oder in einem
befindet sich der elastische Dichtungsring 24, so daß thermostatisch gesteuerten Bad befinden, um die
das Gefäß 11, wenn es in dieser Weise eingespannt ist, 15 Wachstumstemperatur zu steuern. Das Gefäß kann
sich zwischen dem Dichtungsring 24 und dem elasti- aber auch mit einem Mantel ausgestattet sein, durch
sehen Kissen 19 befindet. den eine Temperatursteuerungsflüssigkeit umläuft. Die
Die bisher üblichen Verfahren, bei denen die Probenahme aus dem Gefäß zwecks Steuerung des
Gewebekulturen in mit Stopfen verschlossenen pH-Wertes kann von Zeit zu Zeit oder kontinuierlich
Flaschen gezüchtet werden, haben den Nachteil, daß 20 erfolgen. Gegebenenfalls kann das Nährmedium durch
die in dem Gewebekulturmedium zur Verfügung ein pH-Registriergerät überwacht werden, das seinerstehende
Sauerstoffmenge das Wachstum der Zellen seits mit einem Steuergerät in Verbindung steht, um die
infolge von Erschöpfung an Sauerstoff oder unkon- Zufuhr von Kohlendioxyd und damit den pH-Wert des
trollierbaren Konzentrationsgefällen und pH-Schwan- Nährmediums zu steuern.
kungen, die durch Ansammlung von Kohlendioxyd 25 F i g. 3 erläutert schematisch ein vollständig selbstzustande
kommen, beschränken kann. Die Vorrichtung tätiges System, bei dem das Nährmedium durch einen
und das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglichen Wärmeaustauscher, eine Belüftungssäule und eine
eine konstante Sauerstoffzufuhr und Vermischung des Gewebezellenzüchtungssäule umläuft, welch letztere
Nährmediums 14, so daß an allen aufeinandergestapel- die aufgestapelten, in Abständen voneinander stehenten
und voneinander auf Abstand stehenden Platten 12 30 den Platten enthält. Zur Steuerung und Innehaltung
gleichmäßige Wachstumsbedingungen herrschen. Bei der richtigen Wachstumsbedingungen dienen verden
bekannten Verfahren war ein großes Volumen an schiedene Meß- und Steuergeräte. In der dargestellten
Gasphase erforderlich, um genügend Sauerstoff zur Ausführungsform strömt das Nährmedium 14 aus der
Verfügung zu stellen und das erzeugte Kohlendioxyd Gewebekultursäule 10 durch eine Leitung in den
aufzufangen. Bei der in F i g. 1 dargestellten Ausfüh- 35 Wärmeaustauscher 35, der zum Erhitzen oder Kühlen
rungsform der Erfindung wird ein steriles Gemisch aus des Nährmediums verwendet werden kann. Durch das
Luft und Kohlendioxyd durch den Einlaß 25 in das von dem Temperaturregistrier- und -steuergerät 37
Verteilerrohr 26 eingeleitet, wobei die Luft den nötigen selbsttätig betätigte Ventil 36 und eine Warmwasser-Sauerstoff
zur Verfügung stellt und das Kohlendioxyd zuführung wird die richtige Züchtungstemperatur
zur Steuerung des pH-Wertes dient. An Stelle von 40 innegehalten. Aus dem Wärmeaustauscher 35 strömt
Kohlendioxyd können auch andere Mittel zum Steuern das Nährmedium 14 weiter über die Pumpe 38 in die
des pH-Wertes verwendet werden. Wenn das Gas- Belüftungssäule 39. Auf diesem Strömungsweg passiert
gemisch aus dem unteren Ende des Verteilerrohres 26 das Medium 14 die pH-Elektroden 40, die den pH-austritt,
erzeugen die frei aufsteigenden Gasblasen eine Wert des Nährmediums bestimmen und auf dem Wege
Turbulenz in der Flüssigkeit, die das Zellenwachstum 45 über den pH-Verstärker 41 und das pH-Registrier- und
auf einem Teil der Fläche der Platten 12 stören kann. -steuergerät 42 das Ventil 43 betätigen, durch das
Um diese Wirkung nach Möglichkeit einzuschränken steriles Kohlendioxyd zwecks Einstellung des pH-
und gleichzeitig einen Umlauf des Nährmediums 14 Wertes in das Nährmedium eingeleitet wird. Abgezu
erzeugen, ist die Luftheberpumpe 27 vorgesehen. messene Mengen steriler Luft werden in das Nähr-Wenn
das Gasgemisch in die Luftheberpumpe 27 ein- 50 medium eingeleitet, wenn es in die Belüftungssäule 39
tritt, nehmen die aufsteigenden Gasblasen flüssiges eintritt, die mit Porzellansätteln oder anderen Füll-Nährmedium
14 durch das untere Ende 28 der Pumpe körpern zur Erzielung eines guten Kontaktes zwischen
27 mit und führen es aufwärts, so daß es aus dem Gas und Flüssigkeit beschickt ist.
oberen Ende der Luftheberpumpe ausfließt. Auf diese Mit der oben beschriebenen Vorrichtung kann das
Weise wird eine gleichzeitige Belüftung und schwache 55 folgende Verfahren zum Züchten von Gewebezellen
Zirkulation des Nährmediums 14 erzielt. Durch die durchgeführt werden: Zu Anfang wird die Vorrichtung
Öffnung 29 können die Abgase und die gasförmigen gereinigt zusammengesetzt und sterilisiert. Dann stellt
Produkte entweichen. Das Probenahmerohr 30, das man das flüssige Nährmedium und die zum Beimpfen
sich nach unten in das flüssige Nährmedium erstreckt, erforderlichen Zellen her. Es wird eine Menge Nährdient
zur zeitweiligen Entnahme von Proben des Nähr- 60 medium hergestellt die ausreicht, um die Platten in dem
mediums zwecks Analyse und Verfahrenssteuerung. Gefäß zu bedecken. Das Nährmedium enthält die
Das Vermischen und der Umlauf des Nährmediums erforderlichen Salzlösungen, Puffer, Seren, pH-Indika-14
sind erforderlich, um gleichmäßige Umweltbedin- toren und Antibiotica. Für die meisten Zellen wird der
gungen für das Zellenwachstum an sämtlichen Platten pH-Wert zweckmäßig zwischen 6,6 und 7,6 gehalten.
12 zu schaffen. Zum Mischen und Umlaufenlassen des 65 Die zum Beimpfen erforderlichen Zellen werden nach
Nährmediums kann die oben beschriebene Luftheber- einem Zellenabtrennungsverfahren gewonnen, bei dem
pumpe, eine Rührvorrichtung, z. B. ein Magnetrührer, einzelne Zellen von zerkleinerten Gewebestücken losein
Vibrationsrührer oder ein Scheibenrührer, oder gelöst werden. Dies kann durch Einwirkung von
Trypsin oder anderen Enzymen oder aber nach anderen gelöstem Sauerstoff zu sättigen und den pH-Wert einmechanischen
oder chemischen Verfahren erfolgen. zustellen
Die einzelnen Zellen werden in Nährmedium ge- Die Zellensuspension wird mittels einer Pumpe durch
waschen, um die proteolytischen Enzyme zu entfernen das in F i g. 1 dargestellte Rohr 30 in die sterilisierte
oder zu neutralisieren. Dann werden die Zellen in der 5 Vorrichtung gefördert. Diese Vorrichtung besteht aus
zum Beimpfen erforderlichen Konzentration wieder in einem 7V21 fassenden Gefäß aus schwer schmelzbarem
dem Medium suspendiert. Die Suspension wird unter Glas, in dem 28 quadratische Glasplatten (10 · 10 cm)
aseptischen Bedingungen unter der Wirkung einer in Abständen von 6,35 mm voneinander übereinander-
Pumpe, eines Vakuums oder der Schwerkraft in die gestapelt sind. Eine Luftheberpumpe wird verwendet,
Massen - Gewebekultazuch ungsvorrichtung einge- io um etwa 4V2I Nährmedium umlaufen zu lassen. Die
fuhrt. Dann laßt man die Zellen so lange absitzen, bis Vorrichtung wird, wie oben beschrieben, gemäß
sie sich auf den Oberflächen der Platten festgesetzt F i g. 1 zusammengesetzt. Man läßt die Zellensuspen-
haben Zu diesem Zeitpunkt wird die Beluftungs- und sion 10 bis 15 Minuten mit Hilfe der Luftheberpumpe
Umlaufvorrichtung in Tätigkeit gesetzt. Bei einigen 27 umlaufen, um eine gute Verteilung der Zellen zu
Zellen ist ein Festsetzen auf den Plattenoberflächen i5 gewährleisten. Dann wird die Luftheberpumpe abge-
nicht erforderlich,, bevor man mit dem Umlauf des schaltet. Man läßt die Zellen sich auf den Oberflächen
Nahrmediums beginnt. Die Steuerung des pH-Wertes der Platten 12 4 Stunden absetzen. Sodann wird die
und des gelosten Sauerstoffs und Kohlendioxyds wird Gasheberpumpe 27 wieder in Tätigkeit gesetzt. Die
durch Steuerung der Geschwindigkeit der Begasung Pumpe fördert das Gasgemisch mit einer Geschwindig-
und des Flussigkeitsumlaufs sowie durch Steuerung der 20 keit von 300 ml/Min, und bewirkt gleichzeitig die
Zusammensetzung der Gasphase erreicht. Die Tempe- Begasung und den Umlauf des Nährmediums Zu
ratursteuerung erfolgt mittels eines ummantelten diesem Zeitpunkt ergibt die Analyse einer Probe auf
Gefäßes und eines äußeren Wärmeaustauschers oder gelösten Sauerstoff eine 50%ige Sättigung, bezogen auf
dadurch, daß man das Gefäß in einem Wasserbad oder bei der gleichen Temperatur mit Luft gesättigtes Wasser.
einem Raum, von konstanter Temperatur hält. Das 25 Die Begasung und der Umlauf des Nährmediums wer-
Wachstum der Zellen auf den Platten wird an der Auf- den während der gesamten Wachstumsperiode mit
nähme von Chemikalien aus dem Nahrmedmm sowie einer Geschwindigkeit von 300 ml/Min, fortgesetzt, so
durch mikroskopische Beobachtung von Kontroll- daß die Menge an gelöstem Sauerstoff einem Sätti-
gefaßen und bzw. oder mittels einer oder mehrerer gungsgrad von 70 bis 90 % entspricht. Mit Hilfe eines
Beobachtungsplatten in dem System verfolgt und über- 30 Wasserbades von konstanter Temperatur, in dem sich
wacht. Nach einer bestimmten Zeit bildet sich eine die gesamte Anlage befindet, wird die Temperatur im
nfIf-' u zusafmenffl°ssene Zellenschicht auf den Verlaufe von 6 bis 7 Tagen bei 36 bis 37° C konstant
Obernachen der Platten aus. Zu diesem Zeitpunkt gehalten
werden die Nährflüssigkeiten unter der Einwirkung Durch mikroskopische Untersuchung der Glasober-
von Druck, Vakuum oder Schwerkraft abgezogen, 35 flächen wird festgestellt, daß die Rindernierenzellen auf
und das Gewebe kann gewaschen werden, um Spuren jeder Platte zu einer Schicht von normalen Zellen
von Nähnnedium oder Serum daraus zu entfernen, zusammengeflossen sind, ebenso, wie sie in Gewebeworauf
die Vorrichtung mit neuem Nahrmedium ge- kulturflaschen erhalten werden
füllt wird. Sämtliche Vorgänge werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Nunmehr können 40
füllt wird. Sämtliche Vorgänge werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Nunmehr können 40
die Zellen untersucht oder zur Herstellung von Impf- Beispiel 2 ■ :■
stoffen, für biochemische oder sonstige Zwecke verwendet werden. Man arbeitet nach Beispiel 1 mit dem Unterschied,
daß das Nährmedium, nachdem die Zellen 6 bis 7 Tage
Beispiel 1 45 Sezücntet worden sind, aseptisch durch das »Me
dium 199« (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, S. 1, 1950)
„ . , ,T. . _. , zur Erhaltung der Zellen während der Viruserzeugung
Frisch gewonnene Nieren von jungen Rindern wer- ersetzt wird. Zusammen mit dem »Medium 199« wird
ieilofuf 2 £1S 5 "J™ zerkleinert. und mittels einer ein Stamm von an die Niereneewebekultur von jungen
O,25o/olgen Trypsinlosung trypsmiert. Die einzelnen 5o Rindern angepaßtem Influenz~a-B/M-Virus eingeführt.
Zellen werden in einem Nahrmedium der folgenden Unmittelbar nach dem Zusatz des neuen Nähr-
Zusammensetzung suspendiert: mediums wird die Luftheberpumpe 27 angestellt. Von
o , ... ..„ _ , Zeit zu Zeit werden während der Viruserzeugung
SazlosunggemaßEarl Flüssigkeitsproben zur Analvse abgezogen. Nach
Kt0Tq^1106 ' 0*0/ 55 6tägiger Viruserzeugung werden die Flüssigkeiten
i>. Ib i, IW) y6 /0 aseptisch abgezogen und auf gelösten Sauerstoff und
Lactalbumin-Hydrolysat 0,5% Virusgehalt analysiert. Die Analysen haben die folgen-
„..„ . _„, den Ergebnisse:
Kalberserum 4,0 °/0
Phenolrot 0,01 °/0 6° Hämagglutinationstiter 16 je ml
pH-Wert mit CO2 eingestellt auf .. 6,6 Hühnerzellenagglutination 6,7 je ml
Die Zellen werden in der zum Beimpfen erforder- Beispiel 3
liehen Konzentration (1,8 ■ 105 Zellen je Milliliter) 65
wieder in dem obigen Medium suspendiert. Nunmehr Man arbeitet nach Beispiel 1 mit dem Unterschied,
wird das Medium mehrere Minuten mit e.nem sterilen daß die Nierenzellen von juneen Rindern durch den
Gemisch aus 5 % CO, und 95 % LuIt begast, um es mit Wistar-Zellenstamra WI-38 ersetz- werden Das Nähr-
7 8
medium für diese Zellen ist folgendermaßen zusammen- Die Zellensuspension wird aus einzelnen Schichten
gesetzt: von Zellen erhalten, die in mehreren Gewebekultur-Grundmedium
flaschen gezüchtet werden. Die Zellensuspension wird, (E a gl e, H., Science, 122, wie oben beschrieben, in die Züchtungsvorrichtung
S. 501,1955) 90°/o 5 eingeführt. Nach 4 Tagen zeigt die mikroskopische
Kälberserum 10% Beobachtung der Plattenoberflächen, daß die Zellen
Glutamin 0,29 g/l zu einer normalen Zellenkultur zusammengeflossen
Phenolrot 0,01 % sind.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Vorrichtung zum Züchten von Gewebekultur- Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum
zellen, mit einem Gefäß (10) für flüssiges Kultur- 5 Züchten von Gewebekulturzellen, mit einem Gefäß (10)
medium (14) und einer Anzahl von in dem Gefäß für flüssiges Kulturmedium (14) und einer Anzahl von
auf Abstand voneinander stehenden Platten (12), in dem Gefäß auf Abstand voneinander stehenden
gekennzeichnet durch eine Anordnung Platten (12), die gekennzeichnet ist durch eine An-(27;
31 bis 33) zum Umlaufenlassen des flüssigen Ordnung (27; 31 bis 33) zum Umlaufenlassen des flüssi-Kulturmediums
und eine Leitung (26) zum Ein- io gen Kulturmediums und eine Leitung (26) zum Einleiten
eines sauerstoffhaltigen Gases in das flüssige leiten eines sauerstoffhaltigen Gases in das flüssige
Kulturmedium. Kulturmedium.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet Die Platten (12) können aus Glas, Kunststoff oder
durch eine Temperatursteuerungsanordnung (35 sonstigem geeigneten Werkstoff sein, auf dem sich die
bis 37) in der Anordnung zum Umlaufenlassen des 15 Zellen festsetzen und vermehren können. In der Vorflüssigen
Kulturmediums zum Konstanthalten der richtung ist zweckmäßigerweise eine Temperatur-Temperatur
des flüssigen Kulturmediums inner- Steuerungsanordnung (35 bis 37) in der Anordnung
halb eines bestimmten Bereiches. zum Umlaufenlassen des flüssigen Kulturmediums
3. Verfahren zum Züchten von Gewebekultur- vorgesehen, um die Temperatur des flüssigen Kulturzellen,
bei dem man in einem Gefäß, welches außer 20 mediums innerhalb eines bestimmten Bereiches kondem
flüssigen Kulturmedium eine Anzahl von in stant zu halten.
Abständen voneinander angeordneten Platten für Das erfindungsgemäße Verfahren zum Züchten von
das Zellenwachstum enthält, das Kulturmedium Gewebekulturzellen, bei dem man in einem Gefäß,
mit den zu züchtenden Zellen beimpft und das welches außer dem flüssigen Kulturmedium eine Anflüssige
Medium belüftet, bis sich auf den Ober- 25 zahl von in Abständen voneinander angeordneten
flächen der Platten zusammengeflossene Einzel- Platten für das Zellenwachstum enthält, das Kulturschichten
von Zellen gebildet haben, dadurch ge- medium mit den zu züchtenden Zellen beimpft und das
kennzeichnet, daß man das flüssige Medium in dem flüssige Medium belüftet, bis sich auf den Oberflächen
Gefäß umlaufen läßt. der Platten zusammengeflossene Einzelschichten von
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- 30 Zellen ausgebildet haben ist dadurch gekennzeichnet,
zeichnet, daß man das flüssige Medium abzieht, die daß man das flüssige Medium in dem Gefäß umlaufen
gezüchteten Zellen durch Zusatz eines Virus mit läßt. Das flüssige Medium wird dann abgezogen, die
einem frischen Nährmedium infiziert, das neue gezüchteten Zellen werden durch Zusatz eines Virus
Nährmedium belüftet, die Belüftung des Nähr- mit einem frischen Nährmedium infiziert, das neue
mediums fortsetzt, bis die gewünschte Viruskonzen- 35 Nährmedium wird belüftet, und die Belüftung wird
tration erreicht ist, und das letztgenannte Nähr- fortgesetzt, bis die gewünschte Viruskonzentration ermedium
zwecks Isolierung und Reinigung des Virus reicht ist. Dann wird das Nährmedium zum Isolieren
entfernte und Reinigen des Virus entfernt. Das virushaltige Nähr-
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- medium läßt man vorzugsweise umlaufen,
zeichnet, daß man das virushaltige Nährmedium 40 In den Zeichnungen zeigt
umlaufen läßt. Fig. 1 einen Querschnitt durch eine Vorrichtung
gemäß einer Ausführungsform der Erfindung,
F i g. 2 einen Querschnitt durch eine Vorrichtung
gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung
45 und
F i g. 3 eine schematische Darstellung eines selbsttätig gesteuerten Züchtungssystems.
Gewebekulturzellen zur Viruserzeugung für Impf- Die erfindungsgemäße Vorrichtung 10 ist in F i g. 1
stoffe wurden schon auf dem Boden von rechteckigen und 2 dargestellt. Bei der Ausführungsform gemäß
Flaschen gezüchtet. Die Flaschen werden mit sterili- 50 F i g. 1 sind in dem zylinderförmigen Gefäß 11 die
siertem Gewebenährmedium beschickt, das eine Zellen- übereinandergestapelten, in Abständen voneinander
suspension enthält. Dann werden die Zellen bebrütet, angeordneten Platten 12 untergebracht, auf denen die
bis sich durch Zellenwachstum auf der unter der Zellen gezüchtet werden. Die Platten 12 werden durch
Flüssigkeit befindlichen Glasoberfläche eine Schicht die gekerbten Trägerstäbe 13 auf Abstand voneinander
bildet, worauf das Zellennährmedium durch ein 55 gehalten. Gegebenenfalls können die Platten auch auf
frisches, virushaltiges Medium ersetzt wird. Wenn das andere Weise getragen und auf Abstand voneinander
Virus in die Zellen eingedrungen ist und die Virus- gehalten werden; z. B. können auf jede Platte mehrere
konzentration in dem Medium die erforderliche Höhe Abstandhalter von gleicher Dicke aufgesetzt werden,
erreicht hat, wird das virushaltige Medium auf Impf- die die nächsthöhere Platte tragen und den Abstand
stoffe verarbeitet. Um nach dieser Methode nennens- 60 zwischen den Platten bestimmen. Die Anordnung,
werte Mengen an Gewebekulturen zu erhalten, müssen mittels derer die Platten 12 auf Abstand voneinander
die Zellen auf den Böden einer großen Anzahl von gehalten werden, soll den freien Zutritt und den UmFlaschen
gezüchtet werden. lauf des Nährmediums 14 zwischen den auf Abstand Aus der deutschen Patentschrift 659 150 ist ein Bak- stehenden Platten 12 ermöglichen. Die in der Zeichterienbrut-
und -sterilisierschrank bekannt, bei dem 05 nung dargestellten Stäbe 13 haben Kerben 15, in die
sich ein Nährmedium auf Platten befindet, die auf die Platten 12 eingesetzt sind. Die Kerben 15 sind in
Abstand voneinander stehen und die in dem Schrank den Trägerstäben 13 so angeordnet, daß sie die Platten
angeordnet sind. Bei dieser bekannten Apparatur bil- 12 in den gewünschten Abständen voneinander halten.
Family
ID=
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3413707A1 (de) * | 1984-04-12 | 1985-10-17 | Rastislav Dr.Med.Vet. 7958 Laupheim Skoda | Verfahren zur massenzuechtung von zellen in lamellen-kammern |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3413707A1 (de) * | 1984-04-12 | 1985-10-17 | Rastislav Dr.Med.Vet. 7958 Laupheim Skoda | Verfahren zur massenzuechtung von zellen in lamellen-kammern |
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