DE1293951B

DE1293951B - Process for obtaining parotene

Info

Publication number: DE1293951B
Application number: DET17895A
Authority: DE
Inventors: Asano Eiichi; Niinobe Shinkichi; Ito Yosoji
Original assignee: Teikoku Hormone Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Aska Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1960-02-16
Filing date: 1960-02-16
Publication date: 1969-04-30

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung von Parotin und insbesondere die Abtrennung von Parotin in reinem Zustand aus Rinderspeicheldrüsen. Parotin ist ein Hormon, das für das Wachstum und die Ernährung von harten und mesenchymalen Ge- S weben erforderlich und als Heilmittel für verschiedenartige Krankheiten bekannt ist, so für Pyorrhea alveolaris, Magensenkung, Lendenschmerzen schwangerer Frauen, Myasthenie, Keratodermia tylodes palmaris progressiva, progressiven Muskelschwund, Chondrodystrophia foetalis, Arthritis deformans und Spondylitis deformans.The present invention relates to the recovery of parotene and, more particularly, to the separation of it Parotin in its pure state from bovine salivary glands. Parotin is a hormone that is essential for growth and the nourishment of hard and mesenchymal tissues is required and as a remedy for various types Diseases is known, for example for pyorrhea alveolaris, Stomach sagging, lumbar pain in pregnant women, myasthenia, keratodermia tylodes palmaris progressiva, progressive muscle wasting, fetal chondrodystrophia, arthritis deformans and spondylitis deformans.

Aus Speichel und Speicheldrüsen kann man durch Extraktion bei schwach alkalischem pH und Fällen im schwach sauren Bereich Rohparotin gewinnen. In der deutschen Auslegeschrift 1 065 133 wird ein Verfahren zur Reinigung dieses Rohproduktes beschrieben, nach dem eine Ausbeute von maximal 3 bis 4%, bezogen auf das Rohparotin, erreicht werden kann.From saliva and salivary glands can be obtained by extraction at weakly alkaline pH and cases win raw parotene in the weakly acidic range. In the German Auslegeschrift 1 065 133 a procedure described for the purification of this crude product, after which a maximum yield of 3 to 4%, based on the raw parotene, can be achieved.

Demgegenüber wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Gewinnung von Parotin in reinem und wertvollem Zustand mit einer ausgezeichneten Ausbeute aus Rinderspeicheldrüsen vorgeschlagen.In contrast, the invention provides a method for obtaining pure and valuable parotene Proposed condition with excellent yield from bovine salivary glands.

Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich. Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following description.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Gewinnung reinen Parotins vorgeschlagen, bei dem mit Wasser bei einem pH von etwa 8,0 bis 8,2 aus zerkleinerten tierischen Ohrspeicheldrüsen ein Extrakt erhalten wird, indem man das Rohparotin bei einem pH-Wert von etwa 4,6 bis 4,8 ausfällt, mit saurem Aceton und dann mit Aceton wäscht, das gewaschene Rohparotin in Wasser bei einem pH-Wert bis zu 9,0 auflöst, mit Ammoniumsulfat oder Ammoniumsulfatlösung bis zu einer Sättigungskonzentration von 7% (Sättigungskonzentration 0,17) die Verunreinigungen ausfällt und filtriert, aus dem Filtrat mit Ammoniumsulfat oder Ammoniumsulfatlösung bis zu einer Sättigungskonzentration von 33,6% (Sättigungskonzentration 0,8) die Parotinfraktion ausfällt, nach Auflösung in Wasser bei einem pH-Wert von etwa 8,0 gegen Wasser dialysiert, mit Mineralsäure bei einem pH-Wert von etwa 4,5 ausfällt, nach Auflösen in Wasser bei einem pH-Wert von etwa 8,0 gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf etwa pH 7,0 einstellt und gefriertrocknet, das halbgereinigte Parotin in Wasser bei einem pH-Wert von etwa 8,0 auflöst, das Parotin durch Zugabe von Aceton bis zu einer Acetonkonzentration von 50% und Zugabe von 0,2 Mol NaCI ausfällt, nach Auflösen in Wasser bei einem pH-Wert von etwa 8,0 gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriertrocknet.According to the invention, a method for obtaining pure parotene is proposed in which with Water at a pH of about 8.0 to 8.2 from crushed animal parotid glands an extract is obtained by precipitating the raw parotene at a pH of about 4.6 to 4.8, with acidic Acetone and then with acetone washes the washed raw parotene in water at a pH up to 9.0 dissolves, with ammonium sulfate or ammonium sulfate solution up to a saturation concentration of 7% (Saturation concentration 0.17) the impurities precipitates and filtered, from the filtrate with ammonium sulfate or ammonium sulfate solution up to a saturation concentration of 33.6% (saturation concentration 0.8) the parotid fraction precipitates after dissolving in water at a pH of about 8.0 dialyzed against water, precipitated with mineral acid at a pH of about 4.5, after dissolving in Dialyzed water at a pH of about 8.0 against distilled water and adjusted to about pH 7.0 and freeze-dried, which dissolves semi-purified parotene in water at a pH of about 8.0, which Parotin by adding acetone up to an acetone concentration of 50% and adding 0.2 mol NaCl precipitates after dissolving in water dialyzed against distilled water to a pH of about 8.0 and freeze-dried.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das bei einem pH-Wert von etwa 4,6 bis 4,8 gefällte Rohparotin ohne Acetonwäsche in Wasser bei einem pH-Wert von etwa 9,0 gelöst und die Gefriertrocknung des nach der Ammoniumsulfatlösung und der Dialyse erhaltenen Zwischenproduktes ersetzt durch eine Entwässerung mit saurem Aceton und Äther.In another embodiment of the present invention this is done at a pH of about 4.6 to 4.8 precipitated raw parotene dissolved in water at a pH of about 9.0 without washing with acetone and the freeze-drying of the intermediate product obtained after the ammonium sulfate solution and the dialysis replaced by dehydration with acidic acetone and ether.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des nach dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren erhaltenen Parotins sind in der Tabelle im Beispiel 1 angegeben.The physical and chemical properties of the method proposed according to the invention Parotins obtained are given in the table in Example 1.

Nach dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren wird Parotin in reinem Zustand und in einer ausgezeichneten Ausbeute nach Verfahrensstufen hergestellt oder abgetrennt, die auf den Eigenschaften von Parotin beruhen. Diese Verfahrensstufen können, wie in den Zeichnungen, in einem Fließbild schematisch dargestellt werden.According to the method proposed according to the invention, parotin is in a pure state and in a excellent yield produced or separated according to process steps based on the properties based on parotene. These process steps can, as in the drawings, be shown schematically in a flow diagram being represented.

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren wird durch die Fig. 1 näher erläutert und besteht aus den folgenden Verfahrensstufen:The method proposed according to the invention is explained in more detail by FIG. 1 and consists from the following process stages:

1. Zerkleinertes Parotin enthaltende Rinderdrüsen werden mit schwach alkalisch gemachtem Wasser, und zwar bei einem pH-Wert von 8,0 bis 8,2, etwa 3 Stunden extrahiert, worauf der Auszug nach einem üblichen Verfahren, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt wird;1. Bovine glands containing crushed parotin are washed with water that has been made weakly alkaline, at a pH of 8.0 to 8.2, extracted for about 3 hours, after which the extract by a conventional method, e.g. B. by centrifugation, is separated;

2. der Auszug wird mit einer Mineralsäure, ζ. Β. Salzsäure, zwecks Einstellung eines pH-Wertes von 4,6 bis 4,8 behandelt, wobei sich beim Stehenlassen eine Abscheidung bildet, die dann nach einem üblichen Verfahren, z. B. Zentrifugieren, abgetrennt wird;2. the extract is made with a mineral acid, ζ. Β. Hydrochloric acid to adjust the pH from 4.6 to 4.8 treated, with a deposit forming on standing, which then by a conventional method, e.g. B. centrifugation, is separated;

3. diese Abscheidung wird nochmals mit schwach ätzalkalischem Wasser, und zwar bei einem pH-Wert von 8,0 bis 8,2, etwa 3 Stunden extrahiert, worauf der Auszug zusammen mit dem darin suspendierten unlöslichen Material vollständig eingefroren wird;3. This deposition is repeated with weakly alkaline water, namely at a pH value from 8.0 to 8.2, about 3 hours extracted, after which the extract along with the inside completely freezing the suspended insoluble material;

4. das gefrorene Material wird bei einer Temperatur von etwa 2O⁰C zwecks Erzeugung einer klaren aufgetauten Flüssigkeit langsam aufgetaut; 4. the frozen material is thawed slowly at a temperature of about 2O ⁰ C in order to produce a clear thawed liquid;

5. die aufgetaute Flüssigkeit wird nochmals mit einer Mineralsäure, ζ. Β. Salzsäure, zwecks Einstellung eines pH-Wertes von 4,6 bis 4,8 behandelt, wobei sich beim Stehenlassen eine Abscheidung bildet, die dann nach einem üblichen Verfahren, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt wird;5. the thawed liquid is again with a mineral acid, ζ. Β. Hydrochloric acid, for adjustment a pH of 4.6 to 4.8 treated, with a deposit on standing forms, which then by a conventional method, for. B. by centrifugation, separated will;

6. die Abscheidung wird mit saurem Aceton und dann mit Aceton zwecks Herauswaschung der löslichen Verunreinigungen gewaschen. Die Behandlung wird vorzugsweise mehrere Male wiederholt, bis in dem Lösungsmittel praktisch kein extrahiertes Material mehr enthalten ist. Das saure Aceton kann z. B. ein Gemisch aus 101 Aceton und 10 ecm 38%iger Salzsäure sein, das zuvor mindestens 10 Stunden bei 0 bis 3° C stehengelassen worden ist. Während der Behandlung mit Aceton kann die überschüssige Säure z. B. durch Auftropfen von wäßrigem Ammoniak neutralisiert werden. Bei dieser Behandlung wird rohes, pulverförmiges Parotin erhalten;6. The deposit is made with acidic acetone and then with acetone to wash out the washed soluble impurities. The treatment is preferably several times repeatedly until there is practically no extracted material in the solvent. The acidic acetone can, for. B. be a mixture of 101 acetone and 10 ecm 38% hydrochloric acid, which has been left to stand at 0 to 3 ° C for at least 10 hours. During treatment with acetone, the excess acid z. B. by dripping with aqueous ammonia be neutralized. In this treatment, raw, powdered parotin is obtained;

7. das rohe Parotin wird dann mit schwach ätzalkalischem Wasser, und zwar mit einem pH-Wert von 9,0, etwa 3 Stunden extrahiert, worauf der Auszug nach einem üblichen Verfahren, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt wird;7. The raw parotene is then mixed with weakly alkaline water, namely with a pH value of 9.0, extracted for about 3 hours, whereupon the extract according to a conventional method, z. B. by centrifugation, is separated;

8. die beim Zentrifugieren erhaltene obere, trübe Schicht wird mit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung zwecks Einstellung einer Sättigung von 0,17 behandelt, worauf die abgeschiedenen Verunreinigungen abgetrennt werden;8. The upper, cloudy layer obtained during centrifugation is coated with a saturated ammonium sulfate solution treated for the purpose of setting a saturation of 0.17, whereupon the deposited Impurities are separated;

9. das Filtrat wird dann mit kristallinem Ammoniumsulfat zwecks Erzielung einer Sättigung von 0,8 behandelt, worauf die erhaltene Abscheidung abgetrennt wird. Die Abtrennung erfolgt vorzugsweise durch Saugfiltration, wobei als Filtriermittel ein möglichst dünnes Celitbett verwendet wird, weil die Abscheidung mittels9. The filtrate is then washed with crystalline ammonium sulfate to achieve saturation treated of 0.8, whereupon the deposit obtained is separated. The separation takes place preferably by suction filtration, the filter medium being a bed of Celite which is as thin as possible is used because the deposition means

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Zentrifugieren nicht vollkommen abgetrennt lang zerkleinert. Dann wird etwa die 5- bis 6facheCentrifugation not completely separated and comminuted for a long time. Then it will be about 5 to 6 times

werden kann; Menge dieses Materials an Wasser (100 bis 1201) zu-can be; Amount of this material in water (100 to 1201)

10. die Abscheidung wird nochmals mit Wasser bei gesetzt, worauf unter Rühren Ätznatronlösung zwecks einem pH-Wert von 8,0 extrahiert, worauf der Einstellung eines pH-Wertes von 8,0 bis 8,2 zuge-Auszug z. B. durch Zentrifugieren und/oder FiI- 5 setzt wird. Dann wird unter fortgesetztem Rühren trieren abgetrennt wird. Der Auszug wird dann 3 Stunden extrahiert. Der Auszug wird durch Zentrimit den gegebenenfalls vorliegenden Wasch- fugieren abgetrennt, unter Rühren mit Salzsäure wässern einige Tage gegen fließendes Wasser zwecks Einstellung eines pH-Wertes von 4,6 bis 4,8 dialysiert; versetzt und dann über Nacht stehengelassen. Die er-10. the deposit is set again with water, whereupon caustic soda solution for the purpose of stirring extracted to a pH value of 8.0, whereupon the adjustment of a pH value of 8.0 to 8.2 added-extract z. B. by centrifugation and / or FiI- 5 is set. Then, with continued stirring trier is separated. The extract is then extracted for 3 hours. The extract is made by centrimite any wash fugues present are separated off, while stirring with hydrochloric acid soak for a few days against running water to adjust the pH to 4.6-4.8 dialyzed; and then left to stand overnight. Which he-

11. das Dialysat wird dann mit einer Mineralsäure, io haltene Abscheidung wird durch Zentrifugieren abz. B. Salzsäure, bis zu einem pH-Wert von 4,5 getrennt und mit etwa dem 5fachen ihres Volumens angesäuert, worauf die beim Stehenlassen ge- an Wasser versetzt. Der pH-Wert des Gemisches bildete Abscheidung z. B. durch Zentrifugieren wird dann durch Zugeben einer Ätznatronlösung abgetrennt wird; unter Rühren auf 8,0 bis 8,2 eingestellt. Dann wird11. The dialysate is then extracted with a mineral acid, io-held deposition is removed by centrifugation. B. hydrochloric acid, separated up to a pH value of 4.5 and with about 5 times its volume acidified, whereupon water is added when left to stand. The pH of the mixture formed deposit z. B. by centrifugation is then added by adding a caustic soda solution is separated; adjusted to 8.0 to 8.2 with stirring. Then it will be

12. die Abscheidung wird dann in Wasser bei einem 15 weitere 3 Stunden unter Rühren extrahiert. Der AuspH-Wert von 8,0 gelöst, worauf das Gemisch zug wird zusammen mit dem darin suspendierten ungegen destilliertes Wasser dialysiert wird; löslichen Material getrennt in Töpfe gegossen und12. The deposit is then extracted in water for a further 3 hours with stirring. The AuspH value of 8.0 dissolved, whereupon the mixture is train together with the suspended in it against dialyzing distilled water; soluble material poured into pots separately and

13. das Dialysat wird auf einen pH-Wert von 7,0 mindestens 17 Stunden in einer Kühlkammer eingestellt und dann zentrifugiert. Die obere (unterhalb—15° C) zwecks vollständigen Einfrierens Schicht wird durch Gefrieren getrocknet. Dabei ao stehengelassen. Das gefrorene Material wird dann wird ein getrocknetes Pulver erhalten, das eine ohne Verzögerung in einen Auftautopf übergeführt teilweise gereinigte Substanz ist; und in einer Auftaukammer (20 + 2° C) langsam13. The dialysate is kept at a pH of 7.0 for at least 17 hours in a cooling chamber set and then centrifuged. The upper one (below -15 ° C) for complete freezing Layer is dried by freezing. Left to stand ao. The frozen material is then a dried powder is obtained, which is transferred to a thawing pot without delay is partially purified substance; and slowly in a thawing chamber (20 + 2 ° C)

14. das Pulver wird mit schwach ätzalkalischem aufgetaut. Die klare, aufgetaute Flüssigkeit wird Wasser mit einem pH-Wert von 8,0 30 Minuten unter Rühren mit Salzsäure bis zu einem pH-Wert extrahiert, worauf der Auszug nach einem üb- 25 von 4,6 bis 4,8 versetzt und dann über Nacht stehenlichen Verfahren, z. B. durch Zentrifugieren, ab- gelassen. Die Abscheidung wird dann durch Zentrigetrennt wird; fugieren abgetrennt, mit dem 4- bis 5fachen des Vo-14. The powder is thawed with a mildly alkaline solution. The clear, thawed liquid will Water at pH 8.0 for 30 minutes while stirring with hydrochloric acid up to pH extracted, whereupon the extract is added after an excess of 4.6 to 4.8 and then left to stand overnight Procedure, e.g. B. by centrifugation, drained. The deposit is then centrifugally separated will; fugue separated, with 4 to 5 times the volume

15. der klare Auszug wird mit Natriumchlorid lumens an Aceton gewassen und dann unter Rühren zwecks Erreichung einer Konzentration von 151 sauren Acetons zugesetzt (Gemisch von 101 Ace-0,2 m behandelt, und Aceton wird bis zu einer 30 ton und 10 ecm 38°/oiger Salzsäure, das zuvor min-Konzentration von 50% zugetropft, worauf sich destens 10 Stunden bei 0 bis 3° C stehengelassen worbeim Stehenlassen eine Abscheidung bildet, die den ist). Nach dem Zugeben des Acetons wird das durch Zentrifugieren abgetrennt wird; Gemisch noch stehengelassen, bis sich die Abschei-15. The clear extract is washed with sodium chloride lumens on acetone and then with stirring added to achieve a concentration of 151 acidic acetone (mixture of 101 Ace-0.2 m treated, and acetone is up to a 30 ton and 10 ecm 38% hydrochloric acid, the previously min concentration of 50% was added dropwise, whereupon it was left to stand at 0 to 3 ° C for at least 10 hours Allowing to stand forms a deposit that is the). After adding the acetone it will separated by centrifugation; Let the mixture stand until the separating

16. der Abscheidung wird Wasser mit einem pH- dung vollständig niedergeschlagen hat. Anschließend Wert von 8,0 zugesetzt, worauf das Gemisch 35 wird die Acetonschicht mittels eines Nutschenfilters gegen destilliertes Wasser dialysiert wird; unter Saugen so vollständig wie möglich entfernt.16. The deposition is water with a pH dung has completely precipitated. Afterward Value of 8.0 added, whereupon the mixture 35 is the acetone layer by means of a Nutsche filter dialyzing against distilled water; removed as completely as possible with suction.

17. das Dialysat wird auf einen pH-Wert von 7,0 Nach dem Entfernen von Aceton werden 151 sauren eingestellt und zentrifugiert. Die obere Schicht Acetons erneut zugesetzt, worauf das beschriebene wird durch Gefrieren getrocknet. Dabei wird Verfahren in gleicher Weise wiederholt wird. Wenn reines pulverförmiges Parotin erhalten. 4° die Acetonschicht noch bräunlich gefärbt ist, wird17. The dialysate is brought to pH 7.0. After removing acetone, 151 become acidic set and centrifuged. The upper layer of acetone was added again, whereupon the described is dried by freezing. The procedure is repeated in the same way. if Obtain pure powdered parotene. 4 ° the acetone layer is still brownish in color

In Fig. 2 der Zeichnung wird eine modifizierte nochmals mit weiteren 101 sauren Acetons ge-Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens waschen. Dann werden 5 1 Aceton zugesetzt, worauf erläutert. Die Stufen dieses Verfahrens sind nahezu das Gemisch gerührt und anschließend mittels eines die gleichen wie die oben angegebenen, nur fehlt die Nutschenfilters abgesaugt wird. Die Abscheidung Stufe 6, so daß die in Stufe 5 erhaltene feuchte Ab- 45 wird durch weiteres Zugeben einer geringen Menge scheidung nach dem Verfahren von Stufe 7 direkt Aceton in einem Homogenisator und durch Rühren extrahiert wird. Die Stufe 13 ist bei dieser Ausfüh- aufgeschlämmt. Während des Rührens wird zwecks rungsform wie folgt modifiziert: 13' das in Stufe 12 Neutralisation der überschüssigen Säure wäßriges erhaltene Dialysat wird mit saurem Aceton zwecks Ammoniak zugetropft. Nach dem Neutralisieren wird Einstellung einer Konzentration von 90% versetzt, 50 die Aufschlämmung auf einen Nutschentrichter gewobei eine Abscheidung gebildet wird, die dann ab- gössen und dann abgesaugt, während mit weiteren 51 zentrifugiert wird; 13" die Abscheidung wird mit Aceton gewaschen wird. Nach dem Entfernen des Aceton und Äther gewaschen und dann getrocknet, Acetons durch Absaugen wird die Abscheidung unter wobei eine pulverförmige, teilweise gereinigte Sub- verringertem Druck getrocknet. Dabei werden 100 g stanz erhalten wird. Nach den wie oben modifizierten 55 rohen Parotins erhalten. (Die Ausbeute beträgt 0,3 Verfahrensstufen kann Parotin mit nahezu der glei- bis 0,5 %, auf die rohen Speicheldrüsen bezogen.) chen Reinheit in ausgezeichneten Ausbeuten erhalten Dann wird zu 100 g des rohen Parotins die 50facheIn Fig. 2 of the drawing, a modified embodiment is shown again with further 101 acidic acetones wash the method according to the invention. Then 5 l of acetone are added, whereupon explained. The stages of this process are nearly the mixture and then stirred by means of a the same as the ones given above, only missing the suction filter. The deposition Step 6, so that the moist waste obtained in Step 5 is removed by further adding a small amount divorce according to the procedure of step 7 acetone directly in a homogenizer and by stirring is extracted. The stage 13 is slurried in this version. While stirring is used for the purpose Modified as follows: 13 'the aqueous in stage 12 neutralization of the excess acid dialysate obtained is added dropwise with acidic acetone for the purpose of ammonia. After neutralizing it will Setting a concentration of 90% added 50 the slurry on a suction funnel a deposit is formed, which is then poured off and then sucked off, while another 51 is centrifuged; 13 "the deposit is washed with acetone. After removing the Acetone and ether washed and then dried, acetone by suction is taking the deposition being a powdery, partially purified sub-reduced pressure dried. 100 g punch is obtained. Obtained after the 55 raw parotins modified as above. (The yield is 0.3 Process stages can be parotin with almost the same up to 0.5%, based on the raw salivary glands.) Chen purity obtained in excellent yields. Then, 100 g of the crude parotene is 50 times as much

werden. Volumenmenge (50 1) Wasser gegeben, worauf unterwill. Volume amount (50 1) given water, whereupon under

Die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfah- Eiskühlung und Rühren Ätznatronlösung zwecks Einrens wird in den folgenden Beispielen erläutert, die 60 stellung eines pH-Wertes von 9,0 zugesetzt wird. Das jedoch nicht den Erfindungsbereich einschränken Extrahieren unter Rühren wird weitere 3 Stunden sollen. fortgesetzt. Nach der Feststellung des pH-Wertes desThe execution of the inventive method ice cooling and stirring caustic soda solution for the purpose of ironing is explained in the following examples, the 60 position is added to a pH of 9.0. That but does not limit the scope of the invention. Extracting with stirring is carried out for an additional 3 hours should. continued. After determining the pH of the

gerührten Gemisches wird die obere Schicht durchstirred mixture, the upper layer is through

Beispiel 1 Zentrifugieren abgetrennt. Zu der oberen getrübtenExample 1 centrifugation separated. To the upper clouded one

65 Schicht wird unter Kühlen und Rühren eine gesättigte65 layer becomes saturated with cooling and stirring

Nach dem in F i g. 1 erläuterten Verfahren werden Ammoniumsulfatlösung zwecks Erzielung einer Sättikg gefrorener Ochsenohrenspeicheldrüsen in einer gung von 0,17 zugesetzt, worauf das Gemisch über Nahrungsmittelzerkleinerungsvorrichtung 15 Minuten Nacht stehengelassen und in einer Eiskammer filtriertAfter the in F i g. 1 explained method ammonium sulfate solution for the purpose of achieving a saturation Frozen ox-eared salivary glands in an amount of 0.17 added, whereupon the mixture over Food chopper allowed to stand for 15 minutes overnight and filtered in an ice chamber

wird. Dem erhaltenen Filtrat wird kristallines Ammoniumsulfat zwecks Erzielung einer Sättigung von 0,8 zugesetzt. Nach dem Stehenlassen über Nacht wird das Gemisch durch ein möglichst dünnes Celitbett unter mäßigem Saugen filtriert. Der Filterkuchen wird in Wasser suspendiert, unter Rühren bei einem pH-Wert von 8,0 extrahiert und dann zentrifugiert. Der zurückbleibende Kuchen wird mit Wasser gewaschen und zwecks vollständiger Abtrennung des Auszuges abgesaugt. Die beim Zentrifugieren erhaltene obere Schicht und das Filtrat der Saugfiltration werden vereinigt und zwei Nächte gegen fließendes Wasser dialysiert. Das Dialysat wird dann unter Kühlen und Rühren durch Zugeben von Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,5 gebracht. Nach dem Stehenlassen über Nacht wird die Abscheidung durch Zentrifugieren abgetrennt, worauf eine geringe Menge Wasser zugesetzt und das Gemisch auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt wird. Anschließend wird das Gemisch gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das ao Dialysat wird dann auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und zentrifugiert. Die obere Schicht wird durch Gefrieren getrocknet. Dabei werden 15 g der teilweise gereinigten Substanz erhalten. (Die Ausbeute, auf das rohe Parotin bezogen, beträgt 15 %.) Dann werden diese 15 g der teilweise gereinigten Substanz mit der 50fachen Volumenmenge (750 ecm) Wasser versetzt, worauf unter Kühlen mit Eis und Rühren Ätznatronlösung zwecks Einstellung des pH-Wertes auf 8,0 zugesetzt wird. Die Extraktion unter Rühren wird weitere 30 Minuten fortgesetzt. Das unlösliche Material wird dann durch Zentrifugieren entfernt, worauf die abgetrennte klare obere Schicht mit einer solchen Menge Natriumchlorid versetzt wird, daß die Konzentration 0,2MoI beträgt, worauf unter Eiskühlung und Rühren Aceton bis zu einer Konzentration von 50 ⁰Zo zugetropft wird. Das Gemisch wird dann in einer Eiskammer über Nacht stehengelassen, worauf die Abscheidung durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Der Abscheidung wird dann destilliertes Wasser zugesetzt, worauf der pH-Wert auf 8,0 eingestellt wird. Das Gemisch wird dann über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert. Nach der Dialyse wird das Dialysat auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und zentrifugiert. Die obere Schicht wird durch Gefrieren getrocknet. Nach dem oben angegebenen Reinigungsverfahren werden 7,5 g reines Parotin erhalten. (Die Ausbeute, auf das rohe Parotin bezogen, beträgt 7,5 %.)will. Crystalline ammonium sulfate is added to the filtrate obtained in order to achieve a saturation of 0.8. After leaving to stand overnight, the mixture is filtered through a bed of Celite which is as thin as possible with moderate suction. The filter cake is suspended in water, extracted with stirring at pH 8.0 and then centrifuged. The remaining cake is washed with water and suctioned off to completely separate the extract. The upper layer obtained by centrifugation and the filtrate from suction filtration are combined and dialyzed for two nights against running water. The dialysate is then brought to a pH of 4.5 by adding hydrochloric acid while cooling and stirring. After standing overnight, the deposit is removed by centrifugation, a small amount of water is added and the mixture is adjusted to pH 8.0. The mixture is then dialyzed against distilled water. The ao dialysate is then adjusted to pH 7.0 and centrifuged. The top layer is dried by freezing. This gives 15 g of the partially purified substance. (The yield, based on the raw parotene, is 15%.) Then these 15 g of the partially purified substance are mixed with 50 times the volume (750 ecm) of water, whereupon, while cooling with ice and stirring, caustic soda solution is added to adjust the pH 8.0 is added. The extraction with stirring is continued for an additional 30 minutes. The insoluble material is then removed by centrifugation, whereupon the separated clear upper layer is treated with an amount of sodium chloride such that the concentration is 0.2 mol, whereupon acetone is added dropwise ^{to a concentration of 50 0 zo with ice-cooling and stirring.} The mixture is then left to stand in an ice chamber overnight, after which the deposit is separated off by centrifugation. Distilled water is then added to the deposit and the pH is adjusted to 8.0. The mixture is then dialyzed against distilled water overnight. After dialysis, the dialysate is adjusted to a pH of 7.0 and centrifuged. The top layer is dried by freezing. Following the cleaning procedure given above, 7.5 g of pure parotin are obtained. (The yield based on the raw parotene is 7.5%.)

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des dabei erhaltenen reinen Parotins sind in der folgenden Tabelle angegeben:The physical and chemical properties of the pure parotene thereby obtained are as follows Table specified:

Isoelektrischer Punkt Isoelectric point

Elektrophorese Electrophoresis

Werte der Elementaranalyse ..
UltraviolettabsorptionsmaxhnaElemental analysis values.
Ultraviolet absorption maxhna

Ultrazentrifugation Ultracentrifugation

Molekulargewicht Molecular weight

Aminosäurebestandteile Amino acid components

Beständigkeit gegenüber Wärme Resistance to heat

Beständigkeit gegenüber Säure und Alkali Resistance to acid and alkali

Zucker sugar

Geringste wirksame Dosierung zur Herabsetzung des Kaninchenserum-Calciumspiegels Lowest effective dosage to reduce rabbit serum calcium levels

Geringste wirksame Dosierung zur Erhöhung der zirkulierenden Leucocyten von Kaninchen Least effective dosage for increasing circulating leucocytes in rabbits

pH-Wert 5,7pH 5.7

Homogen (pH-Wert 8,0, Phosphatpufferlösung)Homogeneous (pH 8.0, phosphate buffer solution)

C 50,84 "/ο, N 14,53%, H 7,31%, S 0,77%C 50.84 "/ ο, N 14.53%, H 7.31%, S 0.77%

277 ± 0,5 ιημ277 ± 0.5 μm

S_20w = 3,43S _20w = 3.43

100 000 bis 150 000100,000 to 150,000

Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Phenylalanin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Arginin, Lysin, Histidin, Cystin, Methionin, Serin, Threonin, Prolin, Tryptophan und Tyrosin (17 Arten)Glycine, alanine, valine, leucine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, lysine, Histidine, cystine, methionine, serine, threonine, proline, tryptophan and tyrosine (17 types)

unbeständig
unbeständig
0,47 bis 0,79%inconsistent
inconsistent
0.47 to 0.79%

1,0 bis 1,5 mg/kg
1,0 bis 1,5 mg/kg1.0 to 1.5 mg / kg
1.0 to 1.5 mg / kg

Example 2

Bei dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von rohem Parotin wird, wie aus F i g. 2 ersichtlich, die Behandlung mit saurem Aceton und Aceton weggelassen und die feuchte Abscheidung in den letzten Stufen als rohes Parotin gereinigt. In the process described in Example 1 for the preparation of raw parotene, as from F i g. 2, the treatment with acid acetone and acetone omitted and the wet deposit Purified as raw parotene in the final stages.

Als Ausgangsmaterial werden 20 kg gefrorene Ochsenohrenspeicheldrüsen verwendet. 600 g der nicht getrockneten feuchten Abscheidung, die nach dem Gefrieren und Auftauen aus der aufgetauten Flüssigkeit am isoelektrischen Punkt abgeschieden worden ist, werden mit der lOfachen Volumenmenge (81) Wasser versetzt, worauf Ätznatronlösung unter Kühlen und Rühren zwecks Einstellung eines pH-Wertes von 9,0 zugesetzt wird. Die Extraktion unter Rühren wird 1 Stunde lang fortgesetzt. Nach Feststellung des pH-Wertes des Gemisches wird die obere Schicht durch Zentrifugieren abgetrennt. Der oberen Schicht wird unter Kühlen und Rühren eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung zwecks Erreichung einer Sättigung von 0,17 zugesetzt, worauf nach dem Stehenlassen über Nacht in einer Eiskammer filtriert wird. Dem erhaltenen Filtrat wird kristallines Ammoniumsulfat zwecks Erreichung einer Sättigung von 0,8 zugesetzt, worauf über Nacht stehengelassen wird. Die Abscheidung wird durch ein möglichst dünnes Celitbett unter mäßigen Saugen abfiltriert. Der Filterkuchen wird dann in Wasser supendiert, unter Rühren bei einem pH-Wert von 8,0 extrahiert und dann zentrifugiert. Der zurückbleibende Kuchen wird mit Wasser gewaschen und zwecks vollständiger Abtrennung des Filtrats abgesaugt. Die beim Zentrifugieren erhaltene obere Schicht und das bei der Saugfiltration erhaltene Filtrat werden vereinigt und zwei Nächte gegen fließendes Wasser dialysiert. An-The starting material used is 20 kg of frozen ox-ear salivary glands. 600 g the not dried moist deposit, which after freezing and thawing from the thawed Liquid has been deposited at the isoelectric point, will be with ten times the volume amount (81) Water is added, whereupon caustic soda solution is added while cooling and stirring to adjust the pH of 9.0 is added. The extraction with stirring is continued for 1 hour. After finding the pH of the mixture, the upper layer is separated by centrifugation. The upper one A saturated ammonium sulfate solution is used to achieve a layer with cooling and stirring Saturation of 0.17 added, followed by filtering after standing overnight in an ice chamber will. The filtrate obtained is given crystalline ammonium sulfate in order to achieve saturation of 0.8 added, which is then left to stand overnight. The deposition is possible through a Filtered off a thin bed of celite with moderate suction. The filter cake is then suspended in water, extracted with stirring at pH 8.0 and then centrifuged. The cake left behind is washed with water and filtered off with suction to separate the filtrate completely. The one when centrifuging The upper layer obtained and the filtrate obtained in the suction filtration are combined and dialyzed against running water for two nights. At-

schließend wird das Dialysat durch Zugeben von Salzsäure unter Kühlen und Rühren auf einen pH-Wert von 4,5 gebracht. Nach dem Stehenlassen über Nacht wird die Abscheidung durch Zentrifugieren abgetrennt, worauf eine geringe Menge Wasser zugesetzt S und das Gemisch auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt wird. Anschließend wird das Gemisch gegen destilliertes Wasser dialysiert. Zu diesem Dialysat wird saures Aceton unter Kühlen und Rühren bis zu einer Konzentration von 90% getropft. Das Gemisch wird in einer Eiskammer über Nacht stehengelassen. Die Abscheidung wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Aceton und Äther gewaschen und dann unter verringertem Druck getrocknet. Dabei werden 20 g der teilweise gereinigten Substanz erhalten. (Die Ausbeute, auf das rohe Parotin bezogen, beträgt 20 »/0.)finally, the dialysate is brought to pH by adding hydrochloric acid while cooling and stirring brought from 4.5. After standing overnight, the deposit is separated off by centrifugation, whereupon a small amount of water was added and the mixture was adjusted to a pH of 8.0 will. The mixture is then dialyzed against distilled water. About this dialysate Acid acetone is added dropwise with cooling and stirring up to a concentration of 90%. The mixture is left in an ice chamber overnight. The deposit is separated by centrifugation, washed with acetone and ether and then dried under reduced pressure. Be there Obtained 20 g of the partially purified substance. (The yield based on the raw parotene is 20 »/ 0.)

Diese 20 g der teilweise gereinigten Substanz werden dann mit der 50fachen Volumenmenge (11) Wasser versetzt, worauf Ätznatronlösung unter Kühlen ao mit Eis und Rühren zwecks Einstellung des pH-Wertes auf 8,0 zugesetzt wird. Die Extraktion unter Rühren wird 30 Minuten lang fortgesetzt. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren entfernt, worauf die klare obere Schicht mit einer solchen Menge Natriumchlorid versetzt wird, daß eine Konzentration von 0,2 Mol erreicht wird, worauf Aceton unter Kühlen mit Eis und unter Rühren bis zu einer Konzentration von 50% zugesetzt wird. Das Gemisch wird in einer Eiskammer über Nacht stehengelassen, worauf die gebildete Abscheidung durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Der Abscheidung wird eine geringe Menge destillierten Wassers zugesetzt, worauf der pH-Wert auf 8,0 eingestellt wird. Das Gemisch wird dann über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und zentrifugiert. Die abgetrennte obere Schicht wird durch Gefrieren getrocknet. Nach dem oben angegebenen Reinigungsverfahren werden 10 g reinen Parotins erhalten. (Die Ausbeute, auf das rohe Parotin bezogen, beträgt 10%.) Die Eigenschaften des nach diesem Verfahren erhaltenen Parotins sind mit denen des im Beispiel 1 erhaltenen Parotins identisch.These 20 g of the partially purified substance are then mixed with 50 times the volume (11) Water added, whereupon caustic soda solution while cooling ao with ice and stirring to adjust the pH is added to 8.0. The extraction with stirring is continued for 30 minutes. The insoluble Material is removed by centrifugation, followed by the clear top layer with such Amount of sodium chloride is added that a concentration of 0.2 mol is reached, whereupon acetone is added while cooling with ice and stirring to a concentration of 50%. The mixture is left to stand in an ice chamber overnight, whereupon the deposit formed through Centrifugation is separated. A small amount of distilled water is added to the separation, whereupon the pH is adjusted to 8.0. The mixture is then distilled against overnight Dialyzed water. The dialysate is adjusted to pH 7.0 and centrifuged. the the separated upper layer is dried by freezing. According to the cleaning procedure given above 10 g of pure parotene are obtained. (The yield based on the raw parotene is 10%.) The properties of the parotene obtained by this process are the same as those in the example 1 Parotins obtained identical.

Wenn auch in den oben angegebenen Beispielen Verfahren zur Herstellung von Parotin aus Ochsenohrenspeicheldrüsen erläutert worden sind, so können selbstverständlich auch Ohrenspeicheldrüsen anderer Tiere verwendet werden, ohne daß der Erfindungsbereich verlassen wird.Although in the examples given above, processes for the production of parotin from ox-ear salivary glands have been explained, the parotid glands of other animals can of course also be used without affecting the scope of the invention is left.

Claims

Patent claims:

1. Method of extracting fine parotene from a water at a pH of about 8.0 to 8.2 extract obtained from crushed animal parotid glands, thereby characterized in that the raw parotene is precipitated at a pH of about 4.6 to 4.8, Washed with acid acetone and then with acetone, the washed raw parotene in water at a Dissolves pH up to 9.0, with ammonium sulfate or ammonium sulfate solution up to one Saturation concentration of 7% (saturation concentration 0.17) precipitates the impurities and filtered, from the filtrate with ammonium sulfate or ammonium sulfate solution up to one Saturation concentration of 33.6% (saturation concentration 0.8) the parotid fraction fails, dialyzed against water after dissolution in water at a pH of about 8.0, with mineral acid precipitates at a pH of about 4.5 after dissolving in water at a pH dialyzed from about 8.0 against distilled water and adjusted to about pH 7.0 and freeze-dried, the semi-purified parotin dissolves in water at a pH of about 8.0, which Parotin by adding acetone up to an acetone concentration of 50% and adding 0.2 mol of NaCl precipitates after dissolving in water at a pH of about 8.0 against distilled Dialyzed water and freeze-dried.

2. The method according to claim 1, characterized in that this is done at a pH from about 4.6 to 4.8 precipitated raw parotene without acetone washing in water at a pH of about 9.0 dissolves and that the freeze-drying of the ammonium sulfate solution and the Intermediate product obtained dialysis replaced by dehydration with acidic acetone and Ether.

1 sheet of drawings 909518/535