DE1288237B

DE1288237B - Verfahren zum Herstellen einer Kollagenloesung

Info

Publication number: DE1288237B
Application number: DE1964N0024956
Authority: DE
Inventors: Fujii Tadahiko
Original assignee: Nihon Hikaku KK
Current assignee: Nihon Hikaku KK
Priority date: 1963-05-11
Filing date: 1964-05-11
Publication date: 1969-01-30

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Her- liefert Calciumchlorid die besten Resultate; es wird

stellen von Kollagenlösungen durch Auflösen von in einer Konzentration von 0,2 bis 1,5 Mol je Liter

sogenanntem unlöslichem Kollagen. Insbesondere verwendet. In der Praxis wurde gefunden, daß die

werden erfindungsgemäß solche Kollagen-Ausgangs- optimale Konzentration bei etwa 0,5 Mol je Liter

materialien verwendet, die von einem ausgewach- 5 liegt.

senen Tier stammen. Gemäß der Erfindung kann irgendein proteoly-Es wurden bereits verschiedene Verfahren zur Auf- tisches Enzym, außer Kollagenase, mit einer Aktivität lösung von sogenannten unlöslichen Kollagenfasern innerhalb eines pH-Bereiches von 2 bis 10 zur Anwenvorgeschlagen, jedoch umfassen alle diese Methoden dung kommen. Kollagenase vermag zwar unlösliches mehrere aufeinanderfolgende Verfahrensschritte. io Kollagen in Wasser aufzulösen, wobei jedoch das Ein derartiges Verfahren ist beispielsweise aus der Kollagen zu einem Zustand niedrigen Molekular-USA.-Patentschrift 3 034 852 bekannt, bei dem das gewichts abgebaut wird. Dementsprechend kann aus unlösliche Kollagen mit einem hydrolytischen Enzym, einer so erhaltenen Kollagenlösung das Kollagen nicht beispielsweise Trypsin oder Pepsin, bei einer Tempe- in Faserform wiedergewonnen werden, ratur unterhalb 60⁰C behandelt wird und anschließend 15 Wenn das erfindungsgemäß verwendete Enzym eine das Kollagen mit einer verdünnten Säure von einem breite Spezifität besitzt oder durch metallische Ionen pH-Wert zwischen iaind 4 bei einer Temperatur von nicht beeinflußt wird, kann das Kollagen besonders höchstens 37 ⁰C extrahiert wird. schnell und mit einer Ausbeute von 100% in Lösung Gemäß vorliegender Erfindung soll ein leicht und gebracht werden, wobei nur eine geringe Menge an schnell durchführbares Ein-Stufen-Verfahren zur Auf- so Enzym verwendet zu werden braucht, lösung von unlöslichem Kollagen aus der Haut eines Kollagenmaterial, welches bisher als schwer lösbar erwachsenen Tieres vorgeschlagen werden. Das KoI- galt, kann durch das erfindungsgemäße Verfahren lagen kann beispielsweise aus Ochsen- oder Kuh- leicht in Lösung gebracht werden. Nachdem ein häuten stammen. Bei dem erfindungsgemäßen Ver- Filtrat, wie es beispielsweise im nachfolgenden Beifahren soll eine Vorbehandlung zur Denaturierung 25 spiel 1 beschrieben ist, gegen 0,01 η-Essigsäure dialydes Kollagen in den Häuten nicht ausgeführt werden. siert ist, ergeben Messungen der spezifischen Rota-Dennoch soll sich gemäß der Erfindung eine Kollagen- tionsstärke, der Viskosität und der Fließdoppellösung in einer Ausbeute von 100 % ergeben, aus der brechung des Dialysates nahezu die nämlichen Werte, das Kollagen leicht in Faserform wiedergewonnen wie sie durch Messungen an mit Hilfe üblicher Mewerden kann. 30 thoden gewonnenen Lösungen gefunden werden, wo-Man war bisher der Ansicht, daß bei Behandlung bei die üblichen Methoden beispielsweise darin beder Kollagenfasern aus den Häuten erwachsener Tiere stehen können, daß säurelösliches Kollagen lediglich mit einem Enzym, dessen Aktivität im neutralen mit Pepsin behandelt wird. Diese Ergebnisse zeigen pH-Bereich lag, lediglich etwa 1 bis 2% des Kollagens an, daß selbst aus sogenanntem unlöslichen Kollagenin der Haut aufgelöst und in Lösung gebracht werden 35 material ein Kollagen in Lösung gebracht werden könnten und daß vielmehr der größere Teil des kann, welches den Charakter eines monomeren Mole-Kollagens von dem Enzym unbeeinflußt in der Haut küls, wie es für das Molekül des säurelöslichen KoI-zurückbliebe. lagens der Fall ist, besitzt. Aus den sich gemäß der Nunmehr wurde im Verlauf zahlreicher Versuche Erfindung ergebenden Säurelösungen können die gefunden, daß das Enzym effektiv auf die Haut eines 40 Kollagenfasern selbstverständlich durch übliche Verausgewachsenen Tieres einwirkt, wenn eine bestimmte fahren mit einer Ausbeute von 100 % wiedergewonnen Art eines neutralen Salzes oder eines kationischen werden. Elektronenmikroskopuntersuchungen zeigen, oberflächenaktiven Mittels bei der Enzymbehandlung daß die aus den erfindungsgemäß hergestellten Lösunzugegen ist, obgleich das Enzym dann langsamer auf gen gewonnenen Kollagenfasern eine streifige Struktur die Haut eines Jungtieres, beispielsweise Kalbshaut, 45 besitzen, die aus Längeneinheiten von 600 bis 640 Ä einwirkt. Infolgedessen kann die Auflösung einer Haut, besteht und den natürlichen Kollagenfasern entspricht, was bei den üblichen Verfahren mehrere Behandlungs- Aus den erfindungsgemäß gewonnenen Kollagenstufen erfordert, im Verlauf einer einstufigen Enzym- lösungen können außer Fasern und Fäden auch Filme, behandlung in Gegenwart des neutralen Salzes oder Schwämme, Schichtmaterialien oder Kollagenumhüldes kationischen oberflächenaktiven Mittels aus- 50 lungen hergestellt werden. Wenn insbesondere die geführt werden. Lösung oder Suspension des wiedergewonnenen Erfindungsgegenstand ist somit ein Verfahren zum Kollagens im Wasser auf eine Temperatur von 40 bis Herstellen einer Kollagenlösung, aus welcher das . 70° C erwärmt wird, kann Gelatine in extrem kurzer Kollagen in Faserform wieder gewinnbar ist, durch Zeit, verglichen mit anderen üblichen Gelatine-Her-Auflösen von sogenanntem unlöslichem Kollagen 55 Stellungsmethoden, gewonnen werden, mittels einer Enzymbehandlung, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kollagenmaterial mit einem Beispiel 1 proteolytischen Enzym außer Kollagenase in Gegen- _{a) Herstellu des sogenannten} unlöslichen wart eines neutralen Salzes mit einem zweiwertigen Kollagens Kation oder in Gegenwart eines kationischen grenz- 60

flächenaktiven Stoffes behandelt, wobei das proteo- Der Kornlederteil (portion of butt) eines frisch gelytische Enzym eine Aktivität innerhalb des pH-Be- schlachteten Ochsens oder Ochsen-Hautabfälle (trimreiches von 2 bis 10 besitzt. mings), welche eingesalzt waren, wurden mit Wasser Neutrale Salze, welche gemäß der Erfindung zur nach Entfernung der Behaarung ausgewaschen. Die Anwendung kommen können, sind wasserlösliche 65 Kornschicht und die Fleischseite des Ochsen-Korn-Chloride, Sulfate oder Thiosulfate zweiwertiger Metall- leders oder der Ochsen-Hautabfälle wurden hierauf kationen, beispielsweise Ca⁺+, Mg⁺+, Sr⁺+, Ba⁺+, entfernt. Anschließend wurde der kollagenreiche Teil '; Zn⁺+, Cd⁺+ oder Mn⁺+. Von diesen neutralen Salzen als Rohmaterial herausgenommen. Dieses Roh-

Claims

material wurde wieder mit Wasser ausgewaschen, in lösung wurde, unter denselben Bedingungen wie im eine 10%ige wäßrige, salzige (saline) Lösung ein- Beispiel 1 durchgeführt. Die für das Erhalten einer getaucht und schließlich bei niederer Temperatur klaren Lösung innerhalb 2 Tagen erforderliche Enzymunter Verwendung einer Fleischhackmaschine in menge betrug 3 Gewichtsprozent, bezogen auf das verkleine Stücke zerkleinert. Das zerkleinerte Material 5 wendete Kollagen,
wurde mit einer 10°/_oigen wäßrigen, salzigen Lösung Beispiel 3
ausgewaschen, um Proteine, beispielsweise Albumin

oder Globulin, zu entfernen. Hierauf wurde mit einer Die Auflösung wurde unter denselben Bedingungen 0,15molaren Zitronensäurelösung vollständig aus- wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme gewaschen, um irgendwelche kleine Mengen von in io jedoch, daß eine 0,4%ige Dodecylaminlösung, welche dem Material enthaltenem, säurelöslichem Kollagen mit Essigsäure angesäuert war und aus den im Beiherauszulösen. Das sich hierbei ergebende Material spiel 2 genannten Gründen 0,05 Mol je Liter Calciumwurde vollständig mit Wasser ausgewaschen, mit chlorid enthielt, benutzt wurde. Auch in diesem BeiAlkohol dehydratisiert, mit Alkohol—Äther (1:1) spiel wurde die im Beispiel 1 bezeichnete Protease entfettet und hierauf getrocknet. Das so gewonnene, 15 verwendet. Die für die Gewinnung einer klaren Lösung getrocknete Material war sogenanntes unlösliches innerhalb 2 Tagen erforderliche Enzymmenge war ein Kollagen. Dieses Rohmaterial wurde in allen nach- geringer Gewichtsprozentsatz des verwendeten Kolstehenden Beispielen verwendet. lagens.

b) Erfindungsgemäßes Verfahren ₂₀ Beispiel 4

Zu 600 mg des obenerwähnten Kollagens wurden Die Auflösung wurde gemäß dem nachstehenden

100 ml an 0,5molarer Calciumchloridlösung mit einem Vorgehen unter Verwendung von Pepsin ausgeführt,

pH-Wert von 6,2 zugegeben, wenn bei der nach- welches ein typisches proteolythisches Enzym mit

folgenden Behandlung eine aus einer »Streptomyces Aktivität im sauren pH-Bereich ist.

griseus«-Kultur isolierte und gereinigte Protease als 25 Zu 500 mg des sogenannten unlöslichen Kollagens,

Enzym verwendet wurde; wenn bei der nachfolgenden wie es gemäß Beispiel 1, a) gewonnen wurde, gab man

Behandlung Alkaliprotease als Enzym verwendet 100 ml an 0,01 n-Salzsäurelösung mit einem pH-Wert

wurde, wurden 100 ml an 0,5molarer Calciumchlorid- von 2,0, welche außerdem 0,01 Mol je Liter Calcium-

lösung, die auf ein pH von 7,0 bis 7,5 eingestellt war, chlorid enthielt. Nachdem die resultierende Mischung

benutzt. Nachdem die resultierende Mischung für eine 30 für eine Weile sich selbst überlassen war, wurde Pepsin

Weile sich selbst überlassen war, wurde das Enzym in in einer Menge von 2 Gewichtsprozent, bezogen auf

einer Menge von 2 Gewichtsprozent, bezogen auf das das verwendete Kollagen, zugegeben. Hierauf wurde

Kollagen, zur Anwendung gebracht. Dabei wurde die die Mischung bei einer Temperatur von 20⁰C mäßig

Mischung bei einer Temperatur von 20° C mäßig gerührt. Nach 48stündigem Umrühren waren 100 °/o

gerührt. Nach 2tägigem Umrühren verwandelte sich 35 des Kollagens gelöst.

die Mischung in eine vollständig klare Lösung mit Diese Auflösung kann auch unter Verwendung von hoher Viskosität. Diese klare Lösung wurde durch ein Magnesiumchlorid, Strontiumchlorid oder Barium-Glasfilter filtriert, um geringe Mengen an nicht chlorid an Stelle des Calciumchlorides ausgeführt kollagenösem Material, welches in der Lösung ver- werden, wobei sich dieselben Ergebnisse wie bei Verblieben war, zu entfernen. Das so erhaltene Filtrat 40 Wendung von Calciumchlorid einstellen,
wurde gegen die nämliche Pufferlösung dialysiert, Wenn andererseits die Auflösung ohne Calciumwelche bei der Auflösung des Kollagens benutzt wurde. chlorid oder ohne eines der anderen obengenannten Dies führte zu dem Ergebnis, daß die nichtkollagenöse Neutralsalze ausgeführt wurde, lösten sich nach Fraktion, welche mit dem Enzym zersetzt war, in 48stündigem Umrühren lediglich 60 % des Kollagens, einer Menge von 5 bis 10 Gewichtsprozent, bezogen 45 Aus dieser Tatsache folgt, daß die Auflösung des auf das Ausgangskollagen, entfernt wurde. Kollagens durch die Zugabe von Calciumchlorid oder

Wenn eine zum Calciumion äquimolare Menge der eines anderen neutralen Salzes beträchtlich gefördert

Verbindung wird.

CH₂-N(CH₂COONa)_{2 50} Beispiel 5

Die Auflösung wurde unter denselben Bedingungen

CH₂ — N(CH₂COONa)₂ wie im Beispiel 4 ausgeführt mit der einzigen Aus

nahme, daß eine 0,4%ige Lösung an Dodecylamin

der nach der Dialyse verbleibenden Kollagenlösung als kationisches, oberflächenaktives Mittel an Stelle zugeführt wurde und der pH-Wert dieser Lösung auf 55 von Calciumchlorid benutzt wurde; der pH-Wert 7 bis 8 mit Hilfe von Natriumphosphat eingestellt wurde dabei durch Zugabe von Essigsäure auf 3,0 einwurde, ließ sich die Kollagenfaser mit einer Ausbeute gestellt. Nach 48stündigem Umrühren waren 100 % von 100 % wiederherstellen. des Kollagens aufgelöst. Wenn die oben beschriebene

Auflösung ohne Dodecylamin als kationisches, ober-

Beispiel2 ^6o flächenaktives Mittel ausgeführt wird, lassen sich

lediglich 6O°/o des Kollagens nach 48stündigem Um-In diesem Beispiel wurde als Enzym die im Beispiel 1 rühren auflösen,
bezeichnete Protease und Magnesiumchlorid als
hauptsächliches Neutralsalz verwendet. Ferner wurde

eine geringe Menge an Calciumchlorid als Stabilisator 65 Patentanspruch:

für die Protease zugegeben. Die Konzentration des

Calciumchlorids betrug 0,05 Mol je Liter, diejenige Verfahren zum Herstellen einer Kollagenlösung,

des Magnesiumchlorids 0,45 Mol je Liter. Die Auf- aus welcher das Kollagen in Faserform wieder-

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gewinnbar ist, durch Auflösung von sogenanntem eines neutralen Salzes mit einem zweiwertigen

unlöslichem Kollagen mittels einer Enzymbehand- Kation oder in Gegenwart eines kationischen,

lung, dadurch gekennzeichnet, daß grenzflächenaktiven Stoffes behandelt, wobei das

man das Kollagerunaterial mit einem proteoly- proteolytische Enzym eine Aktivität innerhalb des

tischen Enzym außer Kollagenase in Gegenwart 5 pH-Bereiches von 2 bis 10 besitzt.