DE112015003229T5

DE112015003229T5 - Verfahren zum Beurteilen von vaginaler Atrophie

Info

Publication number: DE112015003229T5
Application number: DE112015003229.0T
Authority: DE
Inventors: Raphael Warren; Dean Larry DuVal; Miranda Aref Farage; Charles Carson Bascom; Gina Marie Fadayel; Kenneth Robert Wehmeyer; Jay Patrick Tiesman; David Burton Moore; Murray A. Freedman
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2017-04-27
Also published as: CN107072599A; US20160135722A1; FR3023467A1; US20170340251A1; WO2016007810A1; US9706951B2; EP3014281A1

Abstract

Ein Array von Verfahren zum Beurteilen von vaginaler Atrophie wird offenbart. Die Verfahren können an sich oder in Kombination mit einer Behandlung oder als Teil eines Kits angewendet werden.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Beurteilen von vaginaler Atrophie, die sensorische Sensoren, pH-Wert, Biochemie, Genomik und/oder Histologie der Schamlippen und des Scheideneingangs einbeziehen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Menopause ist ein normales natürliches Alterungsereignis, das alle Frauen betrifft. Die Menopause kann als Beendigung der Ovulation und der Menstruation für mindestens 12 Monate ohne offensichtliche pathologische Ursache definiert werden. Das typische Alter für die Menopause ist 51 Jahre, wobei es heutzutage in den USA (Einwohnerhebung 2010) mehr als 53 Millionen Frauen im postmenopausalen Alter (50+ Jahre) gibt. Weitere Frauen fallen aufgrund einer radikalen Hysterektomie (Entfernung der Gebärmutter und beider Eierstöcke) in die postmenopausale Kategorie. Mit der Postmenopause wird eine dramatische Abnahme des zirkulierenden Östradiols auf weniger als 10 % des Niveaus, das bei Frauen im gebärfähigen Alter typisch ist, in Zusammenhang gebracht. Das reduzierte Östrogen setzt erhebliche anatomische Veränderungen in Gang, die zu eindeutigen Symptomen und Problemen hinsichtlich der Lebensqualität führen.
Es wurde zwar bereits berichtet, dass ein sinkender Östrogenspiegel eine systemische Wirkung auf den Körper, die Haut und das Haar einer Frau hat. Diese Wirkung ist jedoch auch im Urogenitalbereich zu beobachten und wird als vaginale Atrophie oder VA diagnostiziert. Eine VA-Beurteilung kann die Einführung eines Spekulums in die Vagina der Frau erforderlich machen. Subjektive Beurteilungen werden vorgenommen, darunter der Verlust von Hymenalfalten, die Gegenwart einer erweiterten Harnröhre, ein teleskopartiger Scheidenvorhof, Gegenwart von Petechien in der Vagina und Elastizitätsverlust, der digital (mit dem Finger) am Scheideneingang diagnostiziert werden kann. Die Hauptsymptome, die von Frauen berichtet werden, schließen unter Anderem ein Gefühl von vaginaler Trockenheit, Schmerzen bei sexueller Penetration, Bluten bei sexueller Penetration, Hautjucken im Vaginalbereich und Hautjucken im Genitalbereich ein.
Objektive Messungen und Prüfverfahren für VA stützen sich auf die Prüfung in der Vagina an der Schleimhautoberfläche. Das Hymen ist eine Membran, welche die externe vaginale Öffnung umgibt oder teilweise abdeckt (das Gewebe, das diese Öffnung umgibt, kann als der Hymenalring bezeichnet werden). Das Hymen ist die Grenze zwischen den inneren und den äußeren Genitalien. Es besteht aus einer dünnen faserigen Membran, welche die untere Vagina bedeckt, die auf ihrer äußeren Oberfläche von einem verhornten stratifizierten Plattenepithel und auf der inneren Oberfläche von einem unverhornenden stratifizierten Plattenepithel mit Glykogen (wie das Vaginalepithel) abgedeckt ist. Bei vielen Frauen mit VA kann sich das Hymen verengen und an Elastizität verlieren, was eine objektive Prüfung auf VA schwierig oder unangenehm macht. Das mit der Vaginalöffnung verbundene Gewebe wird auch als der Scheideneingang (Introitus vaginae) bezeichnet. Objektive VA-Messungen sind größtenteils auf den vaginalen pH-Wert beschränkt (und machen typischerweise ein Spekulum erforderlich, um einen angemessenen Zugang zu schaffen), wobei ein pH-Wert von mehr als oder gleich 5,5 als ein Anzeichen für VA eingestuft wurde. Ein vaginaler Abstrich der Epithelauskleidung (der ebenfalls die Einführung eines Spekulums in die Vagina erforderlich macht) kann auf die relative Abundanz von reifen Zellen (als vaginaler Reifungsindex oder Vaginal Maturation Index = VMI bezeichnet) analysiert werden. Allerdings variiert die Beziehung zwischen dem VMI und VA unter Klinikern, wobei die Abweichung relativ weitreichend sein kann. In ähnlicher Weise besteht keine eindeutige Beziehung zwischen der Symptomatik einer Frau und ihrer klinischen Beurteilung oder objektiven Messungen des vaginalen pH-Wertes.
Ein anderes potenziell objektives Verfahren zum Diagnostizieren von VA und der Wirkung einer Behandlung kann die Entnahme einer Vaginalbiopsie zum Erstellen von Transkriptionsprofilen einschließen. Der Erhalt einer Vaginalbiopsie ist recht schwierig und macht die Verwendung eines Spekulums erforderlich. Ferner ist die Entnahmestelle der Biopsie nicht immer präzise, und es können möglicherweise keine gleichmäßigen Eigenschaften der Biopsie sichergestellt werden. Zum Beispiel können Differenzen hinsichtlich der Biopsiedicke aus der Dermis stammende Daten verzerren.
Ferner sind mit Ausnahme des vaginalen pH-Wertes alle anderen Verfahren subjektiv und nicht zuverlässig. Ein anderes Problem besteht darin, dass alle vaginalen Prozeduren wie die subjektive Bewertung von vaginaler Atrophie oder das Feststellen des vaginalen pH-Wertes oder das Entnehmen von Vaginalabstrichen für den VMI die Einführung eines Spekulums in die Vagina erforderlich machen. Diese Prozedur kann insbesondere für Frauen, die unter VA leiden, recht schmerzhaft sein. Wenngleich das Spekulum für eine leichtere Einführung (typischerweise mit im Handel erhältlichem Ultraschallgel) gleitfähig gemacht werden kann, kann dies die Entnahme von pH-Wert und VMI beeinträchtigen. Die durch die Einführung eines Spekulums verursachten Schmerzen können die Entscheidung einer Frau beeinflussen, eine Diagnose und Behandlung von VA anzustreben.
Dementsprechend besteht ein Bedarf an VA-Diagnoseverfahren sowie an Verfahren zum Beurteilen der potenziellen Wirksamkeit von Behandlungen für VA, die nicht auf die Verwendung eines Spekulums und die Probenahme von Vaginalgewebe angewiesen sind und den Subjektivitätsgrad durch Anwenden eines quantitativen und objektiven Verfahrens reduzieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Array eines oder mehrerer Verfahren zum Identifizieren von urogenitalen Veränderungen, die mit vaginaler Atrophie in Zusammenhang stehen, wird offenbart. Das Array von Verfahren beinhaltet Folgendes: Messen eines pH-Wertes an den äußeren Schamlippen, den inneren Schamlippen, dem Scheideneingang oder Kombinationen davon; Bestimmen einer Bürstenempfindlichkeit am Scheideneingang; Beurteilen einer Glykogenmenge am Scheideneingang; Durchführen einer Biopsie am Scheideneingang und Analysieren von Epithelzellen am Scheideneingang; Beurteilen einer Proteinmengenprüfung am Scheideneingang oder den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen; Beurteilen von Metabolitenmengen am Scheideneingang oder den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen; Beurteilen von Histaminmengen am Scheideneingang oder den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen; transkriptomisches Wärme-Mapping an den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen oder am Scheideneingang; und Bewerten einer Genexpression an den äußeren Schamlippen auf Veränderungen in einem Gensondensatz.
Ferner wird ein Verfahren zum Beurteilen der Wirksamkeit eines Behandlungsregimes für vaginale Atrophie offenbart. Das Verfahren zum Beurteilen der Wirksamkeit eines Behandlungsregimes für vaginale Atrophie beinhaltet Folgendes: Vorbehandlungsbeurteilung von vaginaler Atrophie mittels eines oder mehrerer Diagnoseverfahren; Auftragen einer oder mehrerer topischer Behandlungen auf die äußeren Schamlippen, die inneren Schamlippen, den Scheideneingang, die Vagina oder Kombinationen davon, Nachbehandlungsbeurteilung des Zustands der vaginalen Atrophie mittels der gleichen Diagnoseverfahren, die bei der Vorbehandlungsbeurteilung von vaginaler Atrophie angewendet werden; und Bestimmen der Differenz zwischen der Vorbehandlungs- und der Nachbehandlungsbeurteilung von vaginaler Atrophie, um die Gesamtwirkung der topischen Behandlung zu beurteilen. Das eine oder die mehreren Diagnoseverfahren, die bei der Vorbehandlung und der Nachbehandlung angewendet werden, beinhalten Folgendes: Messen des pH-Wertes an den äußeren Schamlippen, den inneren Schamlippen, dem Scheideneingang oder Kombinationen davon; Bestimmen einer Bürstenempfindlichkeit am Scheideneingang; Beurteilen einer Glykogenprüfung am Scheideneingang; Biopsieanalyse der Epithelzellen am Scheideneingang; Beurteilen einer Proteinprüfung am Scheideneingang; transkriptomisches Wärme-Mapping an den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen; Bewerten einer Genexpression an den äußeren Schamlippen für einen Gensondensatz; Nachbehandlungsbeurteilung des Zustands der vaginalen Atrophie mittels der gleichen Diagnoseverfahren, die bei der Vorbehandlungsbeurteilung von vaginaler Atrophie angewendet werden; und Bestimmen der Differenz zwischen der Vorbehandlungs- und der Nachbehandlungsbeurteilung von vaginaler Atrophie, um die Gesamtwirkung der topischen Behandlung zu beurteilen.
Ein Kit zum Beurteilen der Wirksamkeit eines Behandlungsregimes für vaginale Atrophie umfasst Folgendes: ein Verfahren zur Vorbehandlungsbeurteilung von vaginaler Atrophie, umfassend: eine topische Behandlung zum Auftragen auf die äußeren Schamlippen, die inneren Schamlippen, den Scheideneingang, die Vagina oder Kombinationen davon; ein Verfahren zur Nachbehandlungsbeurteilung des Zustands der vaginalen Atrophie umfassend die gleichen Diagnoseverfahren, die bei der Vorbehandlungsbeurteilung von vaginaler Atrophie angewendet werden; und ein Mittel zum Bestimmen der Differenz zwischen der Vorbehandlungs- und der Nachbehandlungsbeurteilung von vaginaler Atrophie, um die Gesamtwirkung der topischen Behandlung zu beurteilen. Das eine oder die mehreren Diagnoseverfahren, die bei der Vorbehandlung und der Nachbehandlung angewendet werden, beinhalten Folgendes: Messen des pH-Wertes an den äußeren Schamlippen, den inneren Schamlippen, dem Scheideneingang oder Kombinationen davon; Bestimmen einer Bürstenempfindlichkeit am Scheideneingang; Beurteilen einer Glykogenprüfung am Scheideneingang; Biopsieanalyse der Epithelzellen am Scheideneingang; Beurteilen einer Proteinprüfung am Scheideneingang; transkriptomisches Wärme-Mapping an den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen; oder Bewerten einer Genexpression an den äußeren Schamlippen für einen Gensondensatz.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Wenngleich die Beschreibung mit Ansprüchen schließt, die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung konkret herausstellen und deutlich beanspruchen, wird angenommen, dass die Erfindung aus der folgenden Beschreibung in Zusammenschau mit den begleitenden Zeichnungen besser verständlich wird. Es zeigen:
1 Bilder von Biopsien, die am Scheideneingang durchgeführt wurden.
2 ein Bild, das bei der Messung von Epithelgewebe verwendet wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die in dem Array von Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Beurteilen von vaginaler Atrophie und Beurteilen der Wirksamkeit von Behandlungen für vaginale Atrophie machen weder die Verwendung eines Spekulums noch den Zugang zur Vagina erforderlich. Das folgende Array von Verfahren verringert den Subjektivitätsgrad durch Anwenden eines quantitativen und objektiven Verfahrens. Es versteht sich, dass man sich auf ein einziges Verfahren oder eine Kombination der nachstehend beschriebenen Verfahren stützen kann. Die folgenden Verfahren nutzen andere Stellen als den Vaginalkanal, die leicht zugänglich sind und zum objektiven Messen von Veränderungen im Zusammenhang mit urogenitaler Atrophie angewendet werden können, und die keine invasiven Instrumente, wie ein Spekulum, erforderlich machen. Darüber hinaus können diese Stellen mit den von Frauen beschriebenen Symptomen und der Wirksamkeit von Behandlungen in engem Zusammenhang stehen. Diese Stellen schließen die Schamlippen und den Hymenalring des urogenitalen Bereichs ein. Beide Stellen sind aufgrund ihrer Zugänglichkeit besonders attraktiv. Im Gegensatz zu dem stratifizierten Epithel der Schamlippen ist der Hymenalring wie die Vagina eine Schleimhautoberfläche.
Die folgenden Verfahren, bei denen die Schamlippen und der Hymenalring (oder Scheideneingang) verwendet werden, können pH-Wert, Histologie, Empfindlichkeit bei Berührung mit Bürstenwischbewegung, Analyse von Metaboliten und Analyse von Gentranskripten einschließen. Metaboliten waren identifizierte Analysewerkzeuge wie GCMS und wurden aus Extrakten quantifiziert, die aus Bürstenproben und Messstreifen abgeleitet wurden.
Messung von pH-Wert an äußeren Schamlippen, inneren Schamlippen und Hymenalring
Diese Beschreibung soll für den Fachmann nicht einschränkend sein.
Der pH-Wert kann durch im Handel erhältliches pH-Papier oder eine flachköpfige pH-Sonde gemessen werden. Zu nicht einschränkenden Beispielen von pH-Papier oder pH-Streifen gehören pHydrion-Papiere (Bereich 3,0–5,5; Hydrion MicroEssentials Laboratory Inc., New York, New York, USA) und pHion-Diagnosemessstreifen (Bereich 4,5–9,0; i-Herb.com). Ein nicht einschränkendes Beispiel einer flachköpfigen pH-Sonde ist zum Beispiel die SkinCheck HI-98109 (Hanna Instruments, Woonsocket, Rhode Island, USA).
Der pH-Wert kann unter Verwendung eines pH-Streifens durch Halten des pH-Streifens mithilfe einer Zange gemessen werden, um den pH-Streifen mit dem gewünschten Bereich 30 Sekunden lang in Kontakt zu halten.
Die Vorgehensweise zur Verwendung der pH-Sonde ist wie folgt.

1. Vor der Verwendung der pH-Sonde die Schutzkappe entfernen und die Elektrode durch Eintauchen der Spitze (vorzugsweise innerhalb von 5 cm (2 Zoll) entfernt von der unteren Kante, mehr bevorzugt innerhalb von 3 cm (1,5 Zoll) entfernt von der unteren Kante) in frischer Pufferlösung mit pH-Wert 7 (zum Beispiel Lösung HI7007P von Hanna Instruments) 1 Stunde lang bis sogar 24 Stunden lang konditionieren. Während der Konditionierung sollte sich die Sonde in der „Aus“-Position befinden.
2. Kalibrieren der pH-Sonde. Die pH-Sonde einschalten. Zuerst die konditionierte Sonde in destilliertem Wasser, vorzugsweise entionisiertem, destilliertem Wasser, abspülen. Die Sondenelektrodenspitze in Puffer mit pH-Wert 7 (Puffer, der weniger als 30 Tage alt ist, vorzugsweise frischer Puffer) eintauchen. Den Messwert stabilisieren lassen (d. h. vorzugsweise weniger als 1 h, mehr bevorzugt weniger als 15 Minuten). Nach Stabilisieren des Messwertes einen kleinen Schraubenzieher verwenden, um den pH-Wert mit dem Trimmer auf 7,00 +/–0,02 (bei Betrachtung des Displays der Elektrode obere linke Schraube) auf einen Messwert von 7,00 einzustellen. Die Elektrodenspitze mit Wasser (d. h. destilliertem Wasser, vorzugsweise entionisiertem, destilliertem Wasser) abspülen, Überschuss abschütteln und Vorgang mit frischem Puffer mit pH-Wert 4,0 (zum Beispiel Lösung HI70004P von Hanna Instruments) wiederholen. Den Messwert stabilisieren lassen (d. h. vorzugsweise weniger als 1 h, mehr bevorzugt weniger als 15 Minuten). Nach Stabilisieren des Messwertes einen kleinen Schraubenzieher verwenden, um den pH-Wert mit dem Trimmer auf 4,00 +/–0,02 (bei Betrachtung des Displays der Elektrode oben rechts) auf einen Messwert von 4,00 einzustellen. Das Messgerät ist zur Durchführung von Messungen bereit. Die Sondenspitze kann in jeder Pufferlösung (vorzugsweise innerhalb von 5 cm (2 Zoll) entfernt von der unteren Kante, mehr bevorzugt innerhalb von 3 cm (1,5 Zoll) entfernt von der unteren Kante bis zu 2 Stunden lang gelassen werden.
3. Messungen. Der Schalter des pH-Meters sollte eingeschaltet sein. Die Elektrodenspitze mit destilliertem Wasser, vorzugsweise entionisiertem, destilliertem Wasser abspülen und den Wasserüberschuss abtropfen lassen oder Überschuss sanft abschütteln. Die Elektrodenspitze 45–135 Grad von der Hautoberfläche, vorzugsweise 60–120 Grad von der Hautoberfläche und mehr bevorzugt 75–105 Grad von der Hautoberfläche halten. Die pH-Sondenanzeige weniger als 15 Minuten, vorzugsweise weniger als 5 Minuten, mehr bevorzugt weniger als 1 Minute stabilisieren lassen. Nach Gebrauch die Elektrodenspitze mit Wasser (d. h. destilliertem Wasser, vorzugsweise entionisiertem, destilliertem Wasser) abspülen, Überschuss abschütteln und mit der Durchführung einer Messung an einer anderen urogenitalen Stelle des gleichen Subjekts beginnen. Falls die Sonde nicht unmittelbar benutzt wird, kann die Sonde mit Wasser (d. h. destilliertem Wasser, vorzugsweise entionisiertem, destilliertem Wasser) abgespült und bis zum Gebrauch bis zu 2 Stunden lang in ein Bad mit einem Puffer von entweder pH-Wert 4,0 oder 7,0 übertragen werden.
4. Nach Gebrauch oder zwischen Subjekten. Den Schalter des pH-Meters nach Gebrauch ausschalten. Zur Aufbewahrung der pH-Sonde oder zum Gebrauch an einem anderen Subjekt muss die pH-Sonde entkontaminiert oder desinfiziert werden. Dies erfolgt auf eine von zwei bevorzugten Arten und Weisen. Eine Art und Weise besteht im Eintauchen der Sonde (vorzugsweise innerhalb von 5 cm (2 Zoll) entfernt von der unteren Kante, mehr bevorzugt vorzugsweise innerhalb von 3 cm (1,5 Zoll) entfernt von der unteren Kante) in 70 % Isopropylalkohol, vorzugsweise 20 bis 40 Minuten, mehr bevorzugt 25 bis 35 Minuten lang. Danach wird die Sonde mit Wasser (d. h. destilliertem Wasser, vorzugsweise entionisiertem, destilliertem Wasser) abgespült und rekalibriert. Als Alternative kann ein antimikrobielles Wischtuch (Sani-Cloth HB alkoholfrei von PDI, Orangeburg, New York, USA) oder Spray (Citrex Hospital Spray Disinfectant von Cardinal Health, Columbus, Ohio, USA) verwendet werden. Nach Auftragen 3 bis 5 Minuten, vorzugsweise 3 bis 4 Minuten, mehr bevorzugt 2,5 bis 4 Minuten warten. Danach folgen das Abspülen mit Wasser (d. h. destilliertem Wasser, vorzugsweise entionisiertem, destilliertem Wasser) und Rekalibrieren. Zur Aufbewahrung der pH-Sonde nach der Entkontamination die Sonde mit Wasser (d. h. destilliertem Wasser, vorzugsweise entionisiertem, destilliertem Wasser) abspülen, Überschuss abschütteln und entweder die Schutzkappe auf der Sondenspitze anbringen oder vor dem Anbringen auf der Sondenspitze einen bis 10 Tropfen HI 70300-Lagerlösung (Hanna Instruments) in die Schutzkappe geben.

Die pH-Sonde oder die pH-Streifen können zum Messen des pH-Wertes an den äußeren großen Schamlippen, den inneren großen Schamlippen, den kleinen Schamlippen und dem Hymenalring verwendet werden. Für Messungen an den Schamlippen und dem Hymenalring wird die pH-Sonde bevorzugt, wohingegen der pH-Streifen in der Vagina bevorzugt wird. Für Messungen an den Schamlippen kann die Sonde oder der Streifen am Mittelpunkt (zwischen posterior und anterior) der jeweiligen anatomischen Stelle angeordnet werden. Für Messungen am Hymenalbereich ist die pH-Sonde nahezu senkrecht zu der anatomischen Stelle oder kann von 45° bis 135° dazu variieren.
Messen der Empfindlichkeit des Scheideneingangs mit einer weichen Bürste und biochemischen Analysen
Das Verfahren kann ferner ein Verfahren zum Messen der Empfindlichkeit am Scheideneingang unter Verwendung eines weichen Instruments wie zum Beispiel einer Bürste einschließen. Zu Beispielen von Bürsten gehören Rundbürsten, wie zum Beispiel MasterAmp Buccal Brushes von Epicentre Biotechnologies (Madison, Wisconsin, USA). Die Bürsten sollten gegenüber dem Gewebe weich sein, wie durch die Borstenkante, Borstenlänge und Borstenhärte definiert. Bürsten können als Mittel zur Messung der Empfindlichkeit und/oder als ein Mittel zur Entnahme einer biologischen Gewebeprobe auf der Bürste in Kontakt mit dem Hymenalring gebracht werden.
Das Verfahren schließt das Inkontaktbringen der Bürste mit dem Hymenalring ein. Der Kontakt mit dem Hymenalring wird mindestens 1 Sekunde lang hergestellt.
Das Inkontaktbringen der Bürste mit dem Hymenalring kann die folgenden Schritte einschließen: Bringen des Subjekts in eine Position, sodass die Prüfsonde geeignet angeordnet werden kann, Freilegen des Hymenalrings, Halten des Bürstengriffs und leichtes Inkontaktbringen der Bürste mit dem Hymenalgewebe bei einer Kraft von zwischen 7 kPa und 0,07 kPa (1 psi und 0,01 psi) wie zum Beispiel weniger als 7 kPa, weniger als 3 kPa oder weniger als 0,7 kPa (1 psi, weniger als 0,5 psi oder weniger als 0,1 psi) und Bewegen der Bürste über den gewünschten Bereich des Gewebes zur Gewebeentnahme.
Vor dem Inkontaktbringen der Bürste mit dem Hymenalring sollte das Subjekt derart in Position gebracht werden, dass die Prüfsonde sachgerecht angeordnet werden kann. In vielen Fällen könnte dies, jedoch ohne Einschränkung, ein gynäkologischer Untersuchungsstuhl sein. Mit diesem Stuhl kann die Position des Subjekts eingestellt werden.
Nachdem das Subjekt geeignet positioniert ist, die Schamlippen spreizen, sodass der Hymenalbereich freiliegt.
Der nächste Schritt besteht im Ergreifen des Griffs der Bürste, Einführen und Ruhenlassen der Bürste (MasterAmp Buccal Brush von Epicentre Biotechnologies) ein einem Bereich entlang des Hymenalrings, vorzugsweise an der 3- oder 6- oder 9- oder 12-Uhr-Position.
Zur Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber einer Bürste kann das Kunststoffgriffende zwischen dem Zeigefinger und dem Daumen gehalten werden und mit einer drehenden Rotationsbewegung kann die Bürste 1 bis 25 Zyklen, vorzugsweise 2 bis 15 Zyklen, mehr bevorzugt 3 bis 10 Zyklen auf der Gewebeoberfläche gedreht werden. Jeder Zyklus dauert weniger als 5 Sekunden, vorzugsweise weniger als 2 Sekunden.
Nach Kontaktieren des Hymenalrings mit der Bürste sollte die Bürste entfernt und derart geschnitten werden, dass die Bürste in eine Sammelphiole (Bio Plas-Mikrozentrifugenröhrchen (Bio Plas 4204) und Verschlusskappen mit O-Ringen (Bio Plas 4215R) von VWR, (VWR International LLC, Radnor Pennsylvania, USA) #20170-710 umränderte Kegelröhrchen und VWR 20170-770) fällt, und die Phiole mit einer Verschlusskappe verschlossen wird.
Danach wird die Phiole in Trockeneis gelegt und kann in einem Gefrierschrank bei –70 °C (oder niedriger) bis zu sechs Monate lang gelagert werden.
Eine oder mehrere Bürstenproben können entnommen werden, zum Beispiel kann der Vorgang zwischen 2 bis 10 Mal, vorzugsweise 2 bis 5 Mal, wiederholt werden.
Die Bürstenproben können extrahiert werden, um Protein, DNA, Glykogen, Histamin, Zytokin und Metaboliten zu messen.
Das Verfahren kann ferner das Ausfüllen eines mit den Erfahrungen in Zusammenhang stehenden Fragebogens durch den Verbraucher einschließen. Der Fragebogen kann Fragen im Zusammenhang mit vaginaler Trockenheit einschließen. Der Fragebogen kann bestätigen, ob der Verbraucher die Bürste gefühlt hat und ob der Kontakt unangenehm war. Der Fragebogen kann den Verbraucher auffordern, das Gefühl zu beschreiben. Der Fragebogen kann ferner Fragen über Themen wie zum Beispiel genitale Hauttrockenheit, vaginale Trockenheit, genitales Hautjucken, vaginales Jucken, Schwierigkeiten beim Geschlechtsverkehr und Kombinationen davon aufweisen. Der Fragebogen kann den Verbraucher auffordern, Aspekte des Kontakts mit der Bürste, wie zum Beispiel einen Grad der Unangenehmheit, zu beurteilen. Die Beurteilungen können auf einer Skala von 1 bis 10 basieren, wobei eins für keinerlei Wahrnehmung und 10 für die stärkste Wahrnehmung steht.
Wie oben erwähnt, können Bürsten analysiert werden, um Protein, DNA, Glykogen, Histamin, Zytokin und Metaboliten zu messen. Bürsten können auf den Glykogengehalt unter Verwendung des EnzyChrom^TM Glykogen-Assay-Kits (BioAssay Systems, Hayward, Kalifornien, USA) analysiert werden. Das EnzyChrom^TM Glykogen-Assay-Kit benutzt ein einziges Arbeitsreagens, das den enzymatischen Abbau (Hydrolyse) von Glykogen durch α-Amylase und Amyloglucosidase mit der Oxidation von Glucose durch Glucoseoxidase und Detektion von Wasserstoffperoxid durch ein kolorimetrisches/fluorogenes Farbstoffreagens (aus dem Sicherheitsdatenblatt, das dem Enzy-Chrom^TM Glykogen-Assay-Kit beiliegt) kombiniert. Die Farbintensität des Reaktionsproduktes bei einer Wellenlänge von 570 nm bzw. die Fluoreszenzintensität bei λ_ex/em = 530/585 nm ist direkt proportional zu der Glykogenkonzentration in der Probe (Zhou M et al. Analytical Biochem 253:162-168, 1997). Glucosekonzentrationen in den Proben werden durch Zugabe von Blindprobenreagens bestimmt, das Glucoseoxidase und Farbstoff ohne Hydrolyseenzyme enthält. Der Glykogengehalt wird durch Subtrahieren von freier Glucose von der Glucose insgesamt (Glykogen + freie Glucose) bestimmt. Eine Kalibrierkurve wird unter Verwendung einer Stammlösung erstellt, um steigende Konzentrationen von Glykogen, ausgedrückt in Mikrogramm pro Milliliter (µg/ml), herzustellen. Drei Qualitätskontrollproben (hohe QC, mittlere QC und niedrige QC), die aus der Stammlösung hergestellt werden, werden zum Überwachen der Assayleistung während der Probenanalyse verwendet. Entnahme einer Biopsie
Das Array von Verfahren kann auch die Durchführung einer Biopsie von den äußeren Schamlippen, den inneren Schamlippen oder dem Scheideneingang einschließen. Die Biopsie kann zur histologischen Analyse, biochemischen Analyse oder transkriptomischen Analyse verwendet werden. Zur Entnahme der Biopsie wird die Hautoberfläche zuerst mit Betadine gereinigt und danach mit einem topischen Anästhetikum, wie zum Beispiel Lidokain, in einer Menge von ungefähr 0,05 bis 4 ml/cm² anästhesiert. Das Anästhetikum sollte genau unter dem Bereich platziert werden, der biopsiert werden soll. Sobald der anästhesierte Bereich taub ist, wird die Oberfläche mit Alkohol gereinigt. Hautbiopsien können von einem geschulten Arzt unter Verwendung eines Tischler-Morgang-Biopsieinstruments (erhältlich von Gynex Corporation, Redmond, Washington, USA) unter Anwendung von aseptischen Standardtechniken, gegebenenfalls gefolgt von Nahtverschluss, entnommen werden. Falls notwendig, können zusätzliche Maßnahmen für die Hämostase ergriffen werden. Eine Chromnaht kann bei dieser Prozedur verwendet werden und sollte auf natürliche Weise absorbiert werden, sodass keine Entfernung der Naht notwendig ist. Der Biospiebereich kann mit Polysporin behandelt und mit einem medizinischen Verbandsmull oder Wundverband abgedeckt werden. Ein OP-Nachsorgetermin kann für jedes Subjekt vereinbart werden, um die Heilung der biopsierten Stelle zu kontrollieren.
Es versteht sich, dass mehr als eine Biopsie durchgeführt werden kann. Die Biopsieproben können gemäß der folgenden Prozedur verarbeitet werden. Die Biopsieproben können zur histologischen Bewertung zuerst durch Übertragen der Biopsie in einen zuvor markierten formalinhaltigen Behälter (10 % neutrales gepuffertes Formalin, VWR 89370-094 oder gleichwertig) verwendet werden. Die Probe kann über Nacht in Formalin belassen und danach in eine Kunststoffkassette übertragen werden, die 70 % Ethanol enthält, zur späteren Paraffineinbettung, Schnitterstellung und Färbung (z. B., jedoch ohne Einschränkung auf, Hämatoxylin/Eosin). Die Biopsie kann auch zur späteren Schnitterstellung und Färbung im gefrorenen Zustand eingefroren werden.
Die Biopsieproben können zur transkriptomischen Analyse zuerst durch Übertragen der Biopsie in eine Lösung von RNALater (Life Technologies Katalognr. AM7021, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), gefolgt von einem Eintauchen in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Life Technologies Katalognr. 10010031 oder gleichwertig) und anschließendes Entfernen von Feuchtigkeit mit einem Kimwipe^® (hergestellt von Kimberly Clark Corporation, Irving, Texas, USA) verwendet werden. Die Probe kann dann in ein 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen (VWR Katalognr. 022363204) übertragen und mit Deckel verschlossen und in ein Trockeneis-Ethanol-Bad oder in einen Gefrierschrank bei –70 °C (oder kälter) bis zur RNA-Verarbeitung gelegt werden.
Biopsieproben können zur histologischen Bewertung und transkriptomischen Analyse verwendet werden.
Die histologische Bewertung kann durch die folgende Vorgehensweise ausgeführt werden:

1. Nach der Formalin- und der Ethanolbehandlung kann das Gewebe mit Xylol (VWR Katalognr. MK866802 oder gleichwertig) gereinigt und danach in Paraffin in eine Basisform eingebettet und verfestigt werden.

Nach Abkühlen des Gewebeblocks auf der Kälteplatte und Entnahme aus der Basisform wird dieser bis zum Schnitt in den Gefrierschrank (etwa –4 °C) gelegt.
Das Gewebe aus dem Gefrierschrank entnehmen und in einer Eisschale (oder gleichwertig) auf Eis kalt halten. Den Block zuschneiden und unter Verwendung eines Mikrotoms (Leica RM2125 RTS, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland, oder gleichwertig) in Stücke mit einer Dicke von 3 bis 4 µ schneiden. Die Stücke können auf ein Wasserbad gegeben und Falten oder Knitter entfernt werden.
Die Stücke können auf einem positiv geladenen Mikroskopträger (VWR Katalognr. 89500-498 oder gleichwertig) angeordnet werden, und überschüssiges Wasser kann von den Objektträgern ablaufen oder abtransportiert werden.
Die Objektträger werden in eine Ventana Symphony-Färbeschale gegeben und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) oder anderen erwünschten histochemischen Färbemitteln (wie PAS, Trichrome und andere) oder immunologischen Färbemitteln (wie Ki67, CD3, S100 und andere) unter Verwendung des Ventana Symphony-Systems (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona, USA) gefärbt.
Die Biopsieproben, Bürstenproben oder Messstreifenproben können extrahiert werden, um Protein, DNA, Glykogen, Histamin und Metaboliten zu messen.
Messung von Glykogen
Bürsten können auf den Glykogengehalt unter Verwendung des EnzyChrom^TM Glykogen-Assay-Kits (BioAssay Systems, Hayward, Kalifornien, USA) analysiert werden. Das EnzyChrom^TM Glykogen-Assay-Kit benutzt ein einziges Arbeitsreagens, das den enzymatischen Abbau (Hydrolyse) von Glykogen durch α-Amylase und Amyloglucosidase mit der Oxidation von Glucose durch Glucoseoxidase und Detektion von Wasserstoffperoxid durch ein kolorimetrisches/fluorogenes Farbstoffreagens (aus dem Sicherheitsdatenblatt, das dem EnzyChrom^TM Glykogen-Assay-Kit beiliegt) kombiniert. Die Farbintensität des Reaktionsproduktes bei einer Wellenlänge von 570 nm bzw. die Fluoreszenzintensität bei λ_ex/em = 530/585 nm ist direkt proportional zu der Glykogenkonzentration in der Probe (Zhou M et al. Analytical Biochem 253:162–168, 1997). Glucosekonzentrationen in den Proben werden durch Zugabe von Blindprobenreagens bestimmt, das Glucoseoxidase und Farbstoff ohne Hydrolyseenzyme enthält. Der Glykogengehalt wird durch Subtrahieren von freier Glucose von der Glucose insgesamt (Glykogen + freie Glucose) bestimmt. Eine Kalibrierkurve wird unter Verwendung einer Stammlösung erstellt, um steigende Konzentrationen von Glykogen, ausgedrückt in Mikrogramm pro Milliliter (µg/ml), herzustellen. Drei Qualitätskontrollproben (hohe QC, mittlere QC und niedrige QC), die aus der Stammlösung hergestellt werden, werden zum Überwachen der Assayleistung während der Probenanalyse verwendet. Die folgenden Reagenzien können bei der Analyse von Glykogen verwendet werden:

1) EnzyChrom^TM Glykogen-Assay-Kit, BioAssay Systems, Katalognr. E2-GN-100. Kit bis zu 6 Monate bei –20 °C lagern. Das Kit enthält die folgenden Reagenzien: a) Assay-Puffer, 12 ml b) Farbstoffreagens, 120 µl c) Enzym A (α-Amylase, Amyloglucosidase), getrocknet d) Enzym B (Glucoseoxidase), 120 µl e) Stärke Standard, 50 mg/ml, 50 µl;
2) Wasser, gereinigt durch Millipore Milli-Q-Filtrationssystem (Merck Millipore, Billerica, Massachusetts, USA); oder gleichwertig;
3) 5M-Natriumchlorid (NaCl), Sigma-Aldrich, Katalognr. S5150, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, USA; oder gleichwertig;
4) Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten, COMPLETE^TM, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalognr. 11-697-498-001;
5) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS-Pufferpacks), Sigma-Aldrich Corp., Katalognr. P3813. 1 PBS-Pufferpack in 1 Liter Wasser verdünnen. PBS-Lösung bis zu 1 Monat bei Raumtemperatur lagern; oder
6) Extraktionspuffer (‘EB’, PBS+0,25 M NaCl+Protease-Inhibitoren). 50 ml 5M NaCl (Reagens Nr. 3) in 950 ml PBS geben, um 0,25 M NaCl herzustellen. Reagens unter Verwendung eines 0,2 µm-Filterkolbens (Vakuumfiltereinheit, steril, Nalgene, Katalognr. 567-0020 oder gleichwertig, Nalge Nunc International Corporation, Rochester, New York, USA) filtern. Zu dieser Lösung 20 Protease-Inhibitor-Tabletten (Reagens Nr. 4) pro 1000 ml geben. Bis zu 1 Monat bei Raumtemperatur lagern.

Herstellung von Bürstenproben zur Messung von Glykogen
Die folgenden Schritte können zur Erstellung von Proben zur Messung von Glykogen angewendet werden.

1. Polypropylenröhrchen, die Bürstenproben enthalten, aus dem –70 °C-Gefrierschrank entnehmen.
2. Extraktionspuffer (EB, Reagens Nr. 6) in jedes Polypropylenröhrchen geben: a) 1,5 ml EB für jedes Röhrchen aliquotieren. b) Jede Verschlusskappe wieder aufsetzen, Verschlusskappen fest anziehen.
3. Phiolen im Eisbad (4–10 °C) ungefähr 30 Minuten lang beschallen (Ultrasonic Cleaner, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, Connecticut, USA; oder gleichwertig).
4. Röhrchen 10 Sekunden lang unter Verwendung eines Multi-Röhrchen-Vortexers (Multi-Tube Vortexer, VWR, Katalognr. VX2500; oder gleichwertig) verwirbeln.
5. Mit Pinzette, die mit antimikrobiellen Tüchern (Sani-Cloth^® Plus, PDI, Inc., Katalognr. Q89072; oder gleichwertig) gereinigt wurde, die Bürstenproben ergreifen und aus jedem Röhrchen entnehmen, während die Bürste gegen die Innenseite des Röhrchens gepresst wird, um etwaige Restflüssigkeit zu beseitigen. Pinzette mit antimikrobiellen Einwegtüchern abwischen und vor Handhabung der nächsten Bürstenprobe lufttrocknen lassen.
6. Extrakt 5 Minuten lang bei 3000 U/min (Raumtemperatur; Allegra X-12R, Beckman-Coulter, Fullerton, Kalifornien, USA; oder gleichwertig) zentrifugieren.
7. Extrakte in Deep-Well-Platten übertragen: a) Jedes Extraktröhrchen öffnen. b) Röhrchen in Liquid-Handler-Röhrchenständer (eines automatisierten Liquid-Handlers) in Reihenfolge in Übereinstimmung mit der Plattenvorlage geben. c) Unter Verwendung des automatisierten Liquid-Handlers (JANUS, Perkin-Elmer, Packard MultiPROBE; oder gleichwertig) einen Aliquoten des Überstandes (nach dem Zentrifugierschritt sollte der Aliquot ungefähr die Menge haben, die für eine angemessene Messung von Glykogen benötigt wird, ein Beispiel kann ein Aliquot von 250 µl sein) in eine leere, 2 ml tiefe 96-Well-Platte (Axygen Scientific, Katalognr. P-DW-20-C; oder gleichwertig, Corning Inc., Corning New York, USA) für Glykogen übertragen. Je nach Ergebnis, d. h. bei einer zu hohen Glykogenkonzentration, kann es notwendig sein, die Überstandsprobe zu verdünnen. d) Verschlussmatten sicher auf Deep-Well-Platten (Titer Plate Shaker, Lab-line Instruments, Inc., VWR, Katalognr. 57019-0600 oder gleichwertig) anbringen. e) Deep-Well-Platten 10 Sekunden lang mit einem Multi-Röhrchen-Vortexer verwirbeln. f) Deep-Well-Platten und Röhrchen, die Extrakte enthalten, bei –70 °C oder weniger für zukünftige Analysen einfrieren.
8. Bei Ausführen einer zweiten Extraktion extrahierte Bürsten in andere Polypropylenröhrchen geben und die Schritte 2 bis 7 wiederholen.

Glykogen-Assay

1) Assay-Reagenzien äquilibrieren und Probenextrakte bei Raumtemperatur (20–25 °C) auf Labortisch untersuchen. **Während des Experiments aufgetaute Enzyme aus dem EnzyChrom^TM Assay Kit auf Eis oder kühl (2–8 °C) halten.
2) Enzym A rekonstituieren. a. 120 µl Assay-Puffer in Phiole mit getrocknetem Enzym A geben. b. Phiole zur vollständigen Auflösung verwirbeln.
3) Arbeitsstandards herstellen. 50 mg/ml Stärkestandard wie folgt in Extraktionspuffer (EB) verdünnen, um Arbeitsstandards herzustellen. Nach jeder Verdünnung zur Vermischung der Lösung verwirbeln. Std1 = 200 µg/ml Glykogen = 10 µl Stärkestandard (50 mg/ml) + 2,49 ml EB Std2 = 150 µg/ml Glykogen = 300 µl aus 200 µg/ml Glykogen + 100 µl EB Std3 = 100 µg/ml Glykogen = 200 µl aus 200 µg/ml Glykogen + 200 µl EB Std4 = 50 µg/ml Glykogen = 200 µl aus 100 µg/ml Glykogen + 200 µl EB Std5 = 25 µg/ml Glykogen = 200 µl aus 50 µg/ml Glykogen + 200 µl EB Std6 = 12,5 µg/ml Glykogen = 200 µl aus 25 µg/ml Glykogen + 200 µl EB Std7 = 6,25 µg/ml Glykogen = 200 µl aus 12,5 µg/ml Glykogen + 200 µl EB Std8 = 3,125 µg/ml Glykogen = 200 µl aus 6,25 µg/ml Glykogen + 200 µl EB Blindprobe = EB
4) Qualitätskontrollen (QC) von Glykogen-Assay herstellen HQC = 80 µg/ml Glykogen = 80 µl von 200 µg/ml Glykogen + 120 µl EB MQC = 40 µg/ml Glykogen = 40 µl von 200 µg/ml Glykogen + 160 µl EB LQC = 10 µg/ml Glykogen = 50 µl von MQC + 150 µl EB
5) Deep-Well-Platte von Probenextrakten unter Verwendung eines Multi-Röhrchen-Vortexers (30 Sekunden, Stufe Nr. 7) verwirbeln.
6) 10 µl Standard, Assay QC oder Studienproben dupliziert in jeden Well der Assay-Platte (transparente Polystyrol-96-Well-Flachbodenplatte; Becton Dickinson, Katalognr. 3072, (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey, USA) oder gleichwertig) unter Verwendung einer einkanaligen 10-µl-Pipette in Übereinstimmung mit der 96-Well-Plattenvorlage geben.
7) Arbeitsreagens (ausreichend für 64 Wells) durch Zugabe von 70 µl Enzym A + 70 µl Enzym B + 70 µl Farbstoffreagens zu 6,3 ml Assay-Puffer herstellen.
8) Blindprobenreagens (ausreichend für 32 Wells) durch Zugabe von 40 µl Enzym B + 40 µl Farbstoffreagens zu 3,6 ml Assay-Puffer herstellen.
9) 90 µl Arbeitsreagens zu jedem Standard, Assay-QC und Proben-Well der Assay-Platte unter Verwendung von elektronischem Mehrkanal-Pipettierer im Multi-Abgabemodus (2 × 90 µl) geben.
10) 90 µl Blindprobenreagens zu jedem Blindproben-Well (kein Enzym A), wie in rot auf der Assay-Plattenvorlage angegeben, unter Verwendung von elektronischem Mehrkanal-Pipettierer im Multi-Abgabemodus (2 × 90 µl) geben.
11) Assay-Platte auf Titerplattenschüttler bei Stufe 5 10 Sekunden lang mischen.
12) Platte mit Kunststoffdeckel abdecken; auf Labortisch 30 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C) inkubieren.
13) Optische Dichte messen: Die Platte bei einer Wellenlänge von 570 nm mit einem computergesteuerten Mikroplattenlesegerät (SpectraMax 340PC³⁸⁴, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, Kalifornien, USA; oder gleichwertig) ablesen. Die Daten werden unter Verwendung der entsprechenden Plattenlesegerät-Software (SOFTmax^® PRO Software for Microplate Readers, SOFTmax^® PRO for Windows, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, Kalifornien, USA; oder gleichwertig) erstellt. Die folgenden Plattenlesegeräteeinstellungen werden empfohlen: Instrumentenparameter: Modus: Endpt L1 Wellenlänge: L1: 570 nm Auto Mix: EIN

Datenanalyse
Statistische Berechnungen:
Standards und Qualitätskontrollen werden in duplizierten Wells untersucht, sodass duplizierte Werte für die optische Dichte (OD) resultieren. Die OD-Ergebnisse werden als der Mittelwert (Durchschnitt) von duplizierten OD-Werten angegeben. Der Regressionsalgorithmus für die Datenanalyse ist eine quadratische Anpassung der Nennkonzentration der Kalibrierstandards und der OD-Mittelwerte. %CV (Variationskoeffizient) = (Standardabweichung/Mittler OD)·100 % % Verzerrung (Nur anwendbar auf Standards und QC) = ((Berechnete Konzentration – Nennkonzentration)/Nennkonzentration)·100 %
Glykogenbestimmung:
Falls eine Möglichkeit besteht, dass die Proben Glucose enthalten, sollten separate Blindproben hergestellt werden, die kein Enzym-A-Reagens enthalten. Zur Berechnung der Glykogenkonzentration in jeder Probe die Glucosekonzentration, die in jedem Blindproben-Well (kein Enzym A) bestimmt wird, von der Gesamtglykogenkonzentration + Glucose, die in dem entsprechenden Proben-Well bestimmt wird (Enzym A + Enzym B), subtrahieren: [Glykogen]_Probe = [Glykogen + Glucose]_Probe – [Glucose]_Probe
Messung von Protein
Die Messung von Protein kann unter Verwendung der folgenden Reagenzien ausgeführt werden:

1) Pierce BCA^TM Protein-Assay-Reagens A, Thermo Scientific, Katalognr. 23223, 1000 ml, enthaltend Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Bicinchoninsäure und Natriumtartrat in 0,1 M Natriumhydroxid.
2) Pierce BCA^TM Protein-Assay-Reagens B, Thermo Scientific, Katalognr. 23224, 25 ml, enthaltend 4 % Kupfersulfat.
3) Albumin-Standard, 2 mg/ml, Thermo Scientific, Katalognr. 23210, 50 ml, enthaltend Rinderserumalbumin (BSA) bei 2,0 mg/ml in 0,9 % Kochsalzlösung und 0,05 % Natriumazid.
4) Wasser, gereinigt durch Millipore Milli-Q-Filtrationssystem; oder gleichwertig.
5) 5M Natriumchlorid (NaCl), Sigma, Katalognr. S5150; oder gleichwertig.
6) Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten, COMPLETE^TM, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalognr. 11-697-498-001.
7) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS-Pufferpacks), Sigma, Katalognr. P3813. 1 PBS-Pufferpack in 1 Liter Wasser verdünnen. PBS-Lösung bis zu 1 Monat bei Raumtemperatur lagern.
8) Rinderserumalbumin (BSA), 30 % Sigma, Katalognr. A8577; oder gleichwertig.
9) Extraktionspuffer (‘EB’, PBS+0,25M NaCl+Protease-Inhibitoren). PBS-Lösung (Reagens Nr. 5) herstellen. 50 ml 5M NaCl (Reagens Nr. 3) zu 950 ml PBS geben, um 0,25M NaCl herzustellen. Mittels 0,2 µm-Filterkolben filtrieren. Zu dieser Lösung 20 Protease-Inhibitor-Tabletten (Reagens Nr. 4) pro 1000 ml geben. Bis zu 1 Monat bei Raumtemperatur lagern.

Vorgehensweise
Die obigen Schritte 1 bis 6 unter „Herstellung von Bürstenproben zur Messung von Glykogen“ wiederholen. Nach Schritt 6 unter „Herstellung von Bürstenproben zur Messung von Glykogen“ Extrakte in Deep-Well-Platten übertragen:

1. Jedes Extraktröhrchen öffnen.
2. Röhrchen in Reihenfolge in Übereinstimmung mit Plattenvorlage in MultiPROBE-Ständer anordnen.
3. Unter Verwendung des automatisierten Liquid-Handlers einen Aliquoten des Überstandes (nach dem Zentrifugierschritt sollte der Aliquot ungefähr die Menge haben, die für eine angemessene Messung von Protein benötigt wird, ein Beispiel kann ein Aliquot von 250 µl sein) in eine leere, 2 ml tiefe 96-Well-Platte übertragen. Je nach Ergebnis, d. h. bei einer zu hohen Proteinkonzentration, kann es notwendig sein, die Überstandsprobe zu verdünnen.
4. Verschlussmatten sicher auf Deep-Well-Platten anbringen.
5. Deep-Well-Platten 10 Sekunden lang mit einem Multi-Röhrchen-Vortexer verwirbeln.
6. Deep-Well-Platten bei –70 °C oder weniger für zukünftige Analysen einfrieren.

Assay

1) Rinderserumalbumin-Standards (BSA-Standards) herstellen a) Eine BSA-Stammlösung von 1 mg/ml durch Zugabe von 12 ml eines Albuminstandards von 2 mg/ml (Reagens Nr. 3) zu 12 ml Extraktionspuffer (EB, Reagens Nr. 9) herstellen. b) BSA-Zwischenstammlösung von 400 µg/ml wie folgt herstellen: Zwischenstammlösung, 400 µg/ml = 16 ml 1 mg/ml BSA + 24 ml EB. Volumina von 1 ml in zuvor markierte Röhrchen aliquotieren und bei –80 °C bis zum Tag der Analyse einfrieren. c) Zur Herstellung von BSA-Standards 2-fache serielle Verdünnung von Zwischenstammlösung (400 µg/ml) durchführen. Nach jeder Verdünnung gut verwirbeln. Das Restvolumen von 500 µl jedes Standards ist für 4 Platten in duplizierten Wells ausreichend. Std1, 200 µg/ml = 500 µl 400 µg/ml + 500 µl EB Std2, 100 µg/ml = 500 µl 200 µg/ml + 500 µl EB Std3, 50 µg/ml = 500 µl 100 µg/ml + 500 µl EB Std4, 25 µg/ml = 500 µl 50 µg/ml + 500 µl EB Std5, 12,5 µg/ml = 500 µl 25 µg/ml + 500 µl EB Std6, 6,25 µg/ml = 500 µl 12,5 µg/ml + 500 µl EB Std7, 3,125 µg/ml = 500 µl 6,25 µg/ml + 500 µl EB Std8, 1,56 µg/ml = 500 µl 3,125 µg/ml + 500 µl EB Blindprobe = 500 µl EB *Anmerkung: Std 8 wird als ein Ankerpunkt für die Kalibrierkurve verwendet und wird nicht als Kalibrator betrachtet. Die LLOQ des Verfahrens beträgt 3,125 µg/ml.
2) Rinderserumalbumin-Assay-QC (BSA-Assay-QC) herstellen a) HQC-, MQC- und LQC-Lösungen wie folgt herstellen: HQC, 75 µg/ml = 3 ml 1 mg/ml BSA + 37 ml EB MQC, 40 µg/ml = 1,6 ml 1 mg/ml BSA + 38,4 ml EB LQC, 20 µg/ml = 800 µl 1 mg/ml BSA + 39,2 ml EB b) 300 µl jeder QC in zuvor markierte Röhrchen aliquotieren und bei –80 °C bis zum Tag der Analyse einfrieren.
3) BCA^TM-Arbeitsreagens herstellen. a) 240 µl BCA^TM-Reagens B mit 12 ml BCA^TM-Reagens A pro 96-Well-Platte (transparentes Polystyrol-96-Well-Flachbodenplatte; Becton Dickinson, Katalognr. 3072, oder gleichwertig) kombinieren. b) Gut verwirbeln.
4) 50 µl pro Well-Standards und QC dupliziert unter Verwendung eines elektronischen Einkanal-Pipettierers im Multi-Abgabemodus gemäß der Plattengestaltung in Assay-Platte geben. Jedes Röhrchen vor Zugabe verwirbeln.
5) Deep-Well-Platte von Proben 30 Sekunden lang mit einem Multi-Röhrchen-Vortexer verwirbeln.
6) 50 µl pro Well unbekannte Proben in einfacher Ausführung unter Verwendung eines elektronischen 8-Kanal-Pipettierers im Umkehrpipettenmodus gemäß Plattengestaltung von Deep-Well-Platte in Assay-Platte geben.
7) 100 µl pro Well BCA^TM-Arbeitsreagens (hergestellt in Schritt Nr. 3) unter Verwendung eines elektronischen 8-Kanal-Pipettierers im Multi-Abgabemodus zugeben. Mit Kunststoffdeckel abdecken.
8) Platte bei 39 °C 45 Minuten lang auf einem Trockenblockerhitzer inkubieren. (Anmerkung: Die tatsächliche Temperatur von Lösungen in der Assay-Platte ist ungefähr 37 °C.)
9) Optische Dichte messen: Die Platte bei einer Wellenlänge von 562 nm mit einem computergesteuerten Mikroplattenlesegerät ablesen. Die Daten werden unter Verwendung einer entsprechenden Plattenlesegerät-Software generiert. Die folgenden Plattenlesegeräteeinstellungen werden empfohlen: Instrumentenparameter: Modus: Endpt L1 Wellenlänge: L1: 562 nm Auto Mix: EIN

Datenanalyse:
Statistische Berechnungen:
Standards und Kontrollen werden in duplizierten Wells untersucht, sodass duplizierte Werte für die optische Dichte (OD) resultieren. Die OD-Ergebnisse werden als der Mittelwert (Durchschnitt) von duplizierten OD-Werten angegeben. Der Regressionsalgorithmus für die Datenanalyse ist eine quadratische Anpassung der Nennkonzentration der Kalibrierstandards und der OD-Mittelwerte. %CV (Variationskoeffizient) = (Standardabweichung/Mittler OD)·100 % % Verzerrung (Nur anwendbar auf Standards und QC) = ((Berechnete Konzentration – Nennkonzentration)/Nennkonzentration)·100 %
Akzeptanzkriterien:

1) Duplizierte Wells (%CV) Der %CV zwischen duplizierten OD-Werten muss die folgenden Kriterien erfüllen: a) %CV muss ≤ 20,0 % für Standards 1–6 und unbekannte Proben (falls dupliziert analysiert) betragen b) %CV der LLOQ (Standard 7, 3,125 µg/ml) wird von den Akzeptanzkriterien ausgeschlossen; siehe Akzeptanzkriterien für % Verzerrung (Abschnitt 2a). c) Unbekannte Proben, welche diese Kriterien nicht erfüllen, werden als „NR“ angegeben und müssen in einem nachfolgenden Durchlauf erneut analysiert werden. d) %CV muss ≤ 20,0 % für mindestens 50 % der Assay-QC bei jeder QC-Menge betragen. %CV muss ≤ 20,0 % für mindestens 67 % der Assay-QC betragen.
2) % Verzerrung a) Standards: Mindestens 75 % der Kalibratoren müssen die folgenden Akzeptanzkriterien für % Verzerrung erfüllen: i) Zurückgerechnete Konzentrationen der Standards 1–6 müssen innerhalb von 20 % der Nennkonzentration (Verzerrung ±20,0 %) liegen. ii) Zurückgerechnete Konzentrationen der LLOQ (Standard 7, 3,125 µg/ml) müssen innerhalb von 25 % der Nennkonzentration (Verzerrung ±25,0 %) liegen. Standard 8 (1,56 µg/ml) wird als ein Ankerpunkt für die Kalibrierkurve verwendet und wird nicht als Kalibrator betrachtet. b) Assay-QC: Mindestens 50 % der Assay-QC-Werte müssen innerhalb von 20 % der Nennkonzentration (Verzerrung ± 20,0 %) bei jeder QC-Menge liegen. Zurückgerechnete Konzentrationen davon mindestens 67 % der Assay-QC müssen innerhalb von 20 % der Nennkonzentration (Verzerrung ±20,0 %) liegen.
3) Das Maskieren einer oder mehrerer Blindproben-Wells ist nur dann gestattet, wenn ein dokumentierter technischer Fehler während der Ausführung des Verfahrens auftritt und dieser Fehler eine Maskierung des bzw. der Blindproben-Well(s) rechtfertigt.
4) Optische Dichte-Werte (OD-Werte) nach einer Plattenblindprobenkorrektur müssen ≥ 0,001 für jeden Well von Standards 1–7 sein. Falls OD-Werte in beliebigen Standard-Wells geringer als 0,001 sind, sollten die Proben in einem nachfolgenden Durchlauf erneut analysiert werden.

Messung von Histamin
Dieser Assay basiert auf (1) US 8420054 (die eine Messung von stratifizierten Epithelien und nicht mukosalem Epithelgewebe betrifft) und auf (2) Kerr, K., Schwartz, J.R., Filloon, T., Fieno, A., Wehmeyer, K., Szepietowski, J.C., und Mills, K.J.; Scalp Stratum Corneum Histamine Levels: Novel Sampling Method Reveals Association with Itch Resolution in Dandruff/Seborrhoeic Dermatitis Treatment, Acta Derm Venereol 91:404–408, 2011).
Vorgehensweise
Nach Schritt 6 der „Herstellung von Bürstenproben zur Messung von Glykogen“ Extrakte auf die Deep-Well-Platten übertragen.

1. Jedes Extraktröhrchen öffnen.
2. Röhrchen in Reihenfolge in Übereinstimmung mit der Plattenvorlage in MultiPROBE-Ständer anordnen.
3. Unter Verwendung des automatisierten Liquid-Handlers einen Aliquoten des Überstandes (nach dem Zentrifugierschritt sollte der Aliquot ungefähr die Menge haben, die für eine angemessene Messung von Histamin benötigt wird, ein Beispiel kann ein Aliquot von 100 µl sein) in eine leere 96-Deep-Well-Platte (Axygen-Platte) übertragen. Je nach Ergebnis, d. h. bei einer zu hohen Histaminkonzentration, kann es notwendig sein, die Überstandsprobe zu verdünnen.
4. Die Proben können mit herkömmlichen Reagenzien, wie Albumin, ergänzt werden, um zur Vermeidung des Verlustes von Analyten an den Wänden der Laborutensilien beizutragen.
5. Verschlussmatten sicher auf Deep-Well-Platten anbringen.
6. Deep-Well-Platten 10 Sekunden lang mit einem Multi-Röhrchen-Vortexer verwirbeln.
7. Deep-Well-Platten bei –80 °C für zukünftige Analysen einfrieren.

Assay

1. Histamin-Standards und -Kontrollen können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Histamin wird mit einem Histamin-Enzym-Immunassay-Kit (EIA-Kit) (Histamine EIA Kit (US Distributor, Cayman Chem Co. #589651/Histamine EIA Kit Manufacture (Frankreich), SPbio #A05890) quantifiziert werden.
2. Ein Waschpuffer, Derivatisierungsreagens, Histamin-ACHE-Tracer und Ellman-Reagens können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
3. Standards, Kontrollen und Proben werden in einer Deep-Well-Platte derivatisiert.
4. Platten werden mit Puffer gewaschen und Standards, Blindproben, Proben und Qualitätskontrollen werden auf die Platte gegeben und 24 Stunden lang bei 4 °C inkubiert.
5. Danach werden die Platten vor der Zugabe der Ellman-Reagens gewaschen und im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert.
6. Die Platten können mittels standardmäßiger Spektralphotometrie abgelesen werden. Eine Datenanalyse kann durch standardmäßige statistische Verfahren und Berechnungen ausgeführt werden.

In einer weiteren Ausführungsform werden Extrakte, die von den Bürsten erhalten werden, in eine 96-Well-Platte gegeben. Jeder Well wird mit einem internen Standard (ISTD) eines mit stabilem Isotop markierten Histamins (D.sub.4-Histamin) versetzt und mit angesäuertem Wasser verdünnt. Ein Satz von Histaminstandards wird in der 96-Well-Polypropylenplatte über einen angemessenen Kalibrierbereich in angesäuertem Wasser hergestellt und mit ISTD versetzt. Die Standards und die Bürstenextrakte werden unter Anwendung von Gradienten-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie mit Tandemmassenspektrometrie (HPLC/MS/MS) analysiert. Histamin und der ISTD werden durch Elektrospray-Ionisation (ESI) mittels positiver Ionen überwacht. Eine Standardkurve wird durch Zeichnen des Signals konstruiert, das hier als das Peakflächenverhältnis (Peakfläche Histamin/Peakfläche ISTD) für jeden Standard gegenüber der Histaminmasse für den entsprechenden Standard definiert ist. Die Histaminmasse in den Kalibrierstandards und Bürstenextraktproben werden dann unter Verwendung der generierten Regressionsgleichung zurückgerechnet. Das Ergebnis kann als die Histaminmasse angegeben werden, oder das Ergebnis kann durch Dividieren durch die Proteinmenge, die ebenfalls in dem Bürstenextrakt gefunden wurde, standardisiert werden.
Messung von Zytokinen
Wenngleich die hier beschriebene Vorgehensweise einen Assay für den Interleukin-1α (IL-1α)- und Interleukin-1-Rezeptorantagonisten (IL-1ra) darlegt, können ähnliche Assays für andere Interleukine wie Il-6, Il-8, IL-10 und andere (ohne Einschränkung) in ähnlicher Weise ausgeführt werden.
Reagenzien

1. Bio-Plex Pro^TM Humane-Zytokin-IL-1α-Assay, Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, Kalifornien, USA, Katalognr. YF0001DVXM. Das Kit enthält die folgenden Bestandteile, die alle bei 2–8 °C gelagert werden: a) Humaner-Zytokin-23-Plex-Standard, Gruppe II (Katalognr. 171-D60001), lyophilisiert. b) Gekoppelte IL-1α-Magnetkügelchen (10X, Katalognr. 171-B6001M), 600 µl c) IL-1α-Detektionsantikörper (10X), 320 µl d) Streptavidin-Phycoerythrin, 100X; LICHTEMPFINDLICH, dunkel lagern. e) Assay-Puffer, 50 ml f) Waschpuffer, 130 ml (Katalognr. 171-304500, 1,5 l) g) Detektionsantikörper-Verdünnungsmittel, 5 ml
2. Humaner-Zytokin-27-Plex-Standard, Gruppe I (Katalognr. 171-D50001), lyophilisiert.
3. Bio-Plex Pro^TM Humanes-Zytokin-IL-1ra-Satz, Bio-Rad Laboratories, Inc., Katalognr. 171B5002M. Bei 2–8 °C lagern: a) Gekoppelte IL-1ra-Magnetkügelchen (10X, Katalognr. 171-B5002M), 600 µl b) IL-1ra-Detektionsantikörper (10X), 320 µl
4. Wasser, gereinigt durch Waters Milli-Q-Filtrationssystem; oder gleichwertig
5. 5 M Natriumchlorid (NaCl), Sigma, Katalognr. S5150; oder gleichwertig.
6. Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten, COMPLETE^TM, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalognr. 11-697-498-001.
7. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS-Pufferpacks), Sigma, Katalognr. P3813. 1 PBS-Pufferpack in 1 Liter Wasser verdünnen. PBS-Lösung bis zu 1 Monat bei Raumtemperatur lagern.
8. Rinderserumalbumin (BSA), 30 % Sigma, Katalognr. A8577; oder gleichwertig.
9. Extraktionspuffer (‘EB’, PBS+0,25 M NaCl+Protease-Inhibitoren). PBS-Lösung (Reagens Nr. 7) herstellen. 50 ml 5 M NaCl (Reagens Nr. 6) zu 950 ml PBS geben, um 0,25 M NaCl herzustellen. Mittels 0,2 µm-Filterkolben filtrieren. Zu dieser Lösung 20 Protease-Inhibitor-Tabletten (Reagens Nr. 6) pro 1000 ml geben. Bis zu 1 Monat bei Raumtemperatur lagern.
10. Zytokinprobenpuffer (‘CSB’, PBS+0,25 M NaCl+Protease-Inhibitoren+2 % BSA). 2 ml 30 % BSA (Reagens Nr. 8) zu 28 ml Zytokinextraktionspuffer (Reagens Nr. 9) geben. Bis zu einer Woche bei 2–8 °C lagern.
11. Bio-Rad-Ummantelungsfluid, 20 l, Katalognr. 171-000055, oder gleichwertig.
12. Bio-Rad-Kalibrierkit, Katalognr. 171-203060.

Apparate und Materialien:

1. Automatisierter Liquid-Handler, Packard MultiPROBE, Perkin-Elmer; Waltham, Massachusetts, USA, oder gleichwertig.
2. Bio-Plex Suspension Array System, Bio-Rad Laboratories, Inc.; oder gleichwertig.
3. Bio-Plex Manager Software für Bio-Plex Workstation, Bio-Rad Laboratories, Inc.; oder gleichwertig.
4. Bio-Plex Pro II Wash Station (für auf Magnet- und Polystyrolkügelchen basierende Assays), Katalognr. 300-34377, Bio-Rad Laboratories, Inc.; oder gleichwertig.
5. Ultraschallreiniger, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, Connecticut, USA; oder gleichwertig.
6. Zentrifuge, Allegra X-12R, Beckman-Coulter, Fullerton, Kalifornien, USA; oder gleichwertig.
7. Vortex-Mischer, Vortex Genie-2, VWR Scientific Products Inc., Katalognr. 58815-178; oder gleichwertig.
8. Titerplattenschüttler, Lab-line Instruments, Inc. (VWR, Katalognr. 57019-0600), oder gleichwertig.
9. Schwarze 96-Well-Flachboden-Mikroplatten, Katalognr. 171-025001, Bio-Rad Laboratories, Inc.
10. 96-Well-V-Boden-Mikroplatten, Katalognr. 651261, Greiner Bio-One International AG, Kremsmünster, Österreich; oder gleichwertig.
11. Aluminiumversiegelungsfolie, Katalognr. PCR-AS-200, Axygen Scientific; oder gleichwertig.
12. Mikroplatten-Klebeversiegelungsfolie, VWR, Katalognr. 60941-062; oder gleichwertig.
13. Reagenzieneinwegbehälter, Vista Lab, 50 ml, VWR, Katalognr. 802026-350; oder gleichwertig.
14. Elektronische Mehrkanal- oder Einkanal-Abgabepipettierer, manuelle Pipettierer mit entsprechenden Einwegpipettenspitzen; oder gleichwertig.
15. Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen, 2,0 ml, Bio-Plas, Inc., San Rafael, CA, Katalognr. 4204; oder gleichwertig.
16. Mikrozentrifugenröhrchen, 1,7 ml, Sorenson BioScience, Katalognr. 11700; oder gleichwertig.
17. Kegelförmige Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (15 ml, Katalognr. 352097 und 50 ml, Katalognr. 352098), Becton Dickinson, oder gleichwertig.
18. 2 ml tiefe Nunc-96-Well-Platten, VWR, Katalognr. 73520-474; oder gleichwertig.
19. Versiegelungsmatte für Deep-96-Rundwell-Sammelplatten (2,0 ml), Katalognr. AM-2ML-RD Axygen Scientific; oder gleichwertig.
20. Vakuumfiltereinheiten, PES-Membran, 0,2 µm Porengröße, Sterile, NALGENE Katalognr. 567-0020; oder gleichwertig.

Vorgehensweise:
Nach Schritt 6 der „Herstellung von Bürstenproben zur Messung von Glykogen“ Extrakte auf die Deep-Well-Platten übertragen:

1. Jedes Extraktröhrchen öffnen.
2. Röhrchen in Reihenfolge in Übereinstimmung mit der Plattenvorlage in MultiPROBE-Ständer anordnen.
3. 40 µl pro Well 30 % BSA (Reagens Nr. 8) auf eine 96-Well-Deep-Well-Platte geben.
4. Unter Verwendung des automatisierten Liquid-Handlers einen Aliquoten des Überstandes (nach dem Zentrifugierschritt sollte der Aliquot ungefähr die Menge haben, die für eine angemessene Messung von Zytokin benötigt wird, ein Beispiel kann ein Aliquot von 250 µl sein) in eine leere 96-Deep-Well-Platte (Axygen-Platte) übertragen. Je nach Ergebnis, d. h. bei einer zu hohen Proteinkonzentration, kann es notwendig sein, die Überstandsprobe zu verdünnen.
5. Verschlussmatten sicher auf Deep-Well-Platten anbringen.
6. Deep-Well-Platten 10 Sekunden lang mit einem Multi-Röhrchen-Vortexer verwirbeln.
7. Deep-Well-Platten bei –80 °C für zukünftige Analysen einfrieren.

Assay

1) Assay-Reagenzien, Matrix-QC und Studienproben auf Labortisch auf Raumtemperatur (20–25 °C) äquilibrieren.
2) Zytokinprobenpuffer (CSB, Reagens Nr. 10) durch Zugabe von 2 ml 30 % BSA (Reagens Nr. 8) zu 28 ml Zytokinextraktionspuffer (Reagens Nr. 9) herstellen
3) Humane-Zytokin-Standards herstellen a) Jede Phiole von Humanen-Zytokin-Standards rekonstituieren: Gruppe I (Reagens Nr. 2) und Gruppe II (Reagens Nr. 1a) mit 250 µl CSB. Jede Phiole 3 Sekunden lang sanft verwirbeln. Die Phiolen 30 Minuten auf Eis inkubieren lassen. b) Zum Herstellen von Arbeitsstandards serielle Verdünnungen von Gruppe I/II-Standard-Cocktail ausführen. Nach jeder Verdünnung gut verwirbeln. Die Konzentrationen von Arbeitsstandard 1 sind auf Standardwertekarten für jede Charge zu finden. Std 1 = 190 µl Gruppe I Std Cocktail + 190 µl Gruppe II Std Cocktail + 215 µl CSB Std 2 = 150 µl Std 1 + 450 µl CSB Std 3 = 150 µl Std 2 + 450 µl CSB Std 4 = 150 µl Std 3 + 450 µl CSB Std 5 = 150 µl Std 4 + 450 µl CSB Std 6 = 150 µl Std 5 + 450 µl CSB Std 7 = 150 µl Std 6 + 450 µl CSB Std 8 = 150 µl Std 7 + 450 µl CSB Std 9 = 150 µl Std 8 + 450 µl CSB Blindprobe = CSB *Standard 1 ist von der IL-1alpha-Kalibrierkurve ausgeschlossen (maskiert) und wird nicht als Kalibrator für IL-1alpha berücksichtigt. Standard 2 ist die ULOQ (Quantifizierungsobergrenze) des Verfahrens für IL-1alpha. **Standard 9 ist von der IL-1ra-Kalibrierkurve ausgeschlossen (maskiert) und wird nicht als Kalibrator für IL-1ra berücksichtigt. Standard 8 ist die LLOQ (Quantifizierungsuntergrenze) des Verfahrens für IL-1ra.

Humane-Zytokin-Kalibrator-Konzentrationen (pg/ml) – Beispiel: Charge Nr. 5023535, 5015357

Standard	Verdünnungsfaktor	IL-1alpha	IL-1ra
Std 1	1	25358*	30137
Std 2	4	6339,5	7534
Std 3	16	1585	1883,56
Std 4	64	396,2	470,89
Std 5	256	99,05	117,7
Std 6	1024	24,76	29,43
Std 7	4096	6,19	7,36
Std 8	16384	1,55	1,84
Std 9	65536	0,3875	0,46**

4) QC von Humanem-Zytokin-Assay herstellen a) Zur Herstellung von Assay-QC-1 (AQC-1) 100 µl Std 1 zu 900 µl CSB geben, verwirbeln. b) 100-fache Verdünnung von Std 1 durch Zugabe von 100 µl AQC-1 zu 900 µl CSB herstellen, verwirbeln. c) Zur Herstellung von QC-2 100 µl Lösung, die in Schritt 4b hergestellt wurde, zu 400 µl CSB geben, verwirbeln.
5) 2-fache Verdünnung von Matrix-QC durch Zugabe von 200 µl von jeweils frisch aufgetauter HQC und LQC zu 200 µl CSB geben, verwirbeln.
6) 1X-Antikörper-Immobilisierte-Kügelchen herstellen, vor Licht schützen. a) Kügelchenphiolen bei mittlerer Geschwindigkeit 30 Sekunden lang verwirbeln. Etwaige eingeschlossene Flüssigkeit vom Deckel pipettieren. b) 10X-Kügelchen: 575 µl IL-1α-Kügelchen(Reagens Nr. 1b) + 575 µl IL-1ra-Kügelchen (Reagens Nr. 3a) + 4,6 ml Assay-Puffer (Reagens Nr. 1e) verdünnen; verwirbeln. c) Vor Gebrauch 20 Min. bei Raumtemperatur äquilibrieren.
7) Verdünnte Probenextrakte herstellen. a) Deep-Well-Platte von Probenextrakten auf Multi-Röhrchen-Vortexer 30 Sekunden verwirbeln. b) Deep-Well-Platte bei 3000 U/min zentrifugieren, um Ablagerungen zu entfernen. c) 2-fache Probenverdünnung durch Zugabe von 50 µl Probenextrakten zu 50 µl CSB in V-Boden-Additionsplatte gemäß 96-Well-Platten-Vorlage unter Verwendung eines 8-Kanal-Pippetierers (Pipettenumkehrmodus) herstellen.
8) Additionsplatte beladen. a) 100 µl Standards, Assay-QC und Verdünnte-Matrix-QC in jeden Well der V-Boden-Additionsplatte gemäß Plattenvorlage unter Verwendung eines Einkanal-Pipettierers (Multi-Abgabemodus, 2 × 100 µl) zugeben. b) Mit Kunststoffplattenversiegler versiegeln.
9) Bio-Plex Pro II-Waschstation vorbereiten. a) Flüssigkeitsflasche 2 mit entionisiertem Wasser füllen, Kanal 2 vorbereiten. b) Flüssigkeitsflasche 1, die ausreichend Bio-Plex-Waschpuffer enthält, an Waschstation anbringen; Kanal 1 vorbereiten.
10) 1X Antikörper-Immobilisierte-Kügelchen in schwarze Flachboden-Assay-Platte geben. a) Verdünnte Kügelchen 30 Sekunden bei mittlerer Geschwindigkeit verwirbeln. b) Verdünnte Kügelchen in Reagensbehälter gießen und 50 µl in jeden Well der schwarzen Flachbodenplatte unter Verwendung des 8-Kanal-Pippetierers (Multi-Abgabemodus) geben.
11) Assay-Platte zweimal unter Verwendung der Bio-Plex Pro II-Waschstation waschen. a) Platte 15 Sekunden lang auf Magneten belassen. b) Wells zweimal mit dem Programm MAG X2 waschen. c) RINSE DAY mit Waschpuffer – Kanal 1.
12) Schwarze Flachboden-Assay-Platte beladen. a) Additionsplatte sanft auf Plattenschüttler 3 Sekunden (300 U/min) verwirbeln. b) 50 µl Standards, Assay-QC, Verdünnte-Matrix-QC und verdünnte Probenextrakte in jeden Well der schwarzen Flachboden-Assay-Platte gemäß Plattenvorlage unter Verwendung des 8-Kanal-Pipettierers (Pipettenumkehrmodus) geben.
13) Assay-Platte mit Folienplattenversiegler versiegeln und auf Plattenschüttler 40 Minuten lang bei Raumtemperatur (20–25 °C) inkubieren. a) Platte zwecks Lichtschutz mit Folienklebeplattenversiegler versiegeln. b) Drehzahl des Plattenschüttlers langsam auf bis zu 1100 U/min (Stufe 10) erhöhen; 30 Sekunden lang schütteln. c) Drehzahl des Plattenschüttlers langsam auf 300 U/min (Stufe 3) senken d) 40 Minuten lang auf Plattenschüttler bei Raumtemperatur inkubieren (20–25 °C).
14) 1X Detektionsantikörper (DAb) herstellen. Sollten 10–15 min vor Gebrauch hergestellt werden. a) 10X DAb 20 Sekunden bei mittlerer Geschwindigkeit verwirbeln, gefolgt von einem 30-sekündigen Schnellschleudervorgang. b) 300 µl 10X IL-1α-DAb (Reagens Nr. 1c) + 300 µl 10X IL-1ra-DAb (Reagens Nr. 3b) + 2,4 ml Detektionsantikörper-Verdünnungsmittel (Reagens Nr. 1 g) zugeben.
15) Assay-Platte dreimal unter Verwendung der Bio-Plex Pro II-Waschstation waschen. a) Platte 15 Sekunden lang auf Magneten belassen. b) Wells zweimal mit dem Programm MAG X3 waschen. c) RINSE DAY mit Waschpuffer – Kanal 1.
16) 1X Detektionsantikörper in schwarze Flachboden-Assay-Platte geben. a) 1X Detektionsantikörper 3 Sekunden lang sanft verwirbeln. b) In Reagensbehälter gießen und 25 µl 1X Detektionsantikörper in jeden Well unter Verwendung des 8-Kanal-Pippetierers (Multi-Abgabemodus) geben.
17) Assay-Platte mit Folienplattenversiegler versiegeln und auf Plattenschüttler 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (20–25 °C) inkubieren. a) Platte zwecks Lichtschutz mit Folienklebeplattenversiegler versiegeln. b) Drehzahl des Plattenschüttlers langsam auf bis zu 1100 U/min (Stufe 10) erhöhen; 30 Sekunden lang schütteln. c) Drehzahl des Plattenschüttlers langsam auf 300 U/min (Stufe 3) senken. d) 30 Minuten lang auf Plattenschüttler bei Raumtemperatur inkubieren (20–25 °C).
18) 1X Streptavidin-PE herstellen. Sollte 10 Minuten vor Gebrauch hergestellt werden; vor Licht schützen. a) 100X Streptavidin-PE (Reagens Nr. 1d) 20 Sekunden bei mittlerer Geschwindigkeit verwirbeln, gefolgt von einem 30-sekündigen Schnellschleudervorgang. b) 60 µl von 100X Streptavidin-PE in 5,94 ml Assay-Puffer geben. Gut verwirbeln.
19) Assay-Platte dreimal unter Verwendung der Bio-Plex Pro II-Waschstation waschen. a) Platte 15 Sekunden lang auf Magneten belassen. b) Wells zweimal mit dem Programm MAG X3 waschen. c) RINSE DAY mit Waschpuffer – Kanal 1.
20) 1X Streptavidin-PE in schwarze Flachboden-Assay-Platte geben. a) 1X Streptavidin-PE 5 Sekunden lang bei mittlerer Geschwindigkeit verwirbeln. b) In Reagensbehälter gießen und 50 µl 1X Streptavidin-PE in jeden Well unter Verwendung des 8-Kanal-Pippetierers (Multi-Abgabemodus) geben.
21) Assay-Platte mit Folienplattenversiegler versiegeln und auf Plattenschüttler 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (20–25 °C) inkubieren. a) Platte zwecks Lichtschutz mit Folienklebeplattenversiegler versiegeln. b) Drehzahl des Plattenschüttlers langsam auf bis zu 1100 U/min (Stufe 10) erhöhen; 30 Sekunden lang schütteln. c) Drehzahl des Plattenschüttlers langsam auf 300 U/min (Stufe 3) senken. d) 10 Minuten lang auf Plattenschüttler bei Raumtemperatur inkubieren (20–25 °C).
22) Assay-Platte dreimal unter Verwendung der Bio-Plex Pro II-Waschstation waschen. a) Platte 15 Sekunden lang auf Magneten belassen. b) Wells zweimal mit dem Programm MAG X3 waschen. c) RINSE NIGHT mit Wasser – Kanal 2.
23) Kügelchen in Assay-Puffer resuspendieren. a) 120 Mikroliter Assay-Puffer in jeden Well unter Verwendung eines 8-Kanal-Pipettierers geben. b) Platte zwecks Lichtschutz mit Folienklebeplattenversiegler versiegeln. c) Drehzahl des Plattenschüttlers langsam auf bis zu 1100 U/min (Stufe 10) erhöhen; 30 Sekunden lang schütteln.
24) Platte auf Bio-Plex Suspension Array Reader durchlaufen lassen. 50 Kügelchen pro Region ablesen, Probenvolumen: 50 µl. DD-Gates: 5.000 bis 25.000
25) Falls eine zweite Assay-Platte analysiert werden soll, Schritte 3 bis 25 wiederholen.

96-Well-Plattenvorlage
Datenanalyse:
Statistische Berechnungen:
Standards werden in duplizierten Wells untersucht, sodass duplizierte Fluoreszenzintensitätswerte (FI-Werte) resultieren. Der Mittelwert (Durchschnitt) der duplizierten FI-Werte der Standards für jedes Zytokin wird unter Anwendung eines nichtlinearen Regressionskurven-Anpassungsverfahrens mittels 5-Parameter-Logistikanpassung (5-PL) dargestellt und analysiert. Die Konzentration jedes Zytokins wird von der Standardkurve interpoliert. %CV (Variationskoeffizient) = (Standardabweichung/Mittlere FI)·100 % % Verzerrung (Nur anwendbar auf Standards und Assay-QC) = ((Berechnete Konzentration – Nennkonzentration)/Nennkonzentration)·100 % % Rückgewinnung (Nur anwendbar auf Standards und Assay-QC) = (Berechnete Konzentration/Nennkonzentration)·100 % Berechnete Konzentration = Beobachtete Konzentration; interpoliert von Standardkurve
Nennkonzentration = Erwartete Konzentration
Akzeptanzkriterien:

1) Duplizierte Wells (%CV) Der %CV zwischen duplizierten FI-Werten muss die folgenden Kriterien erfüllen: a) %CV muss µ _20 % für mindestens 75 % der Standards für jedes Zytokin (oder µ _25 % für die LLOQ (Quantifizierungsuntergrenze) sein. b) %CV muss µ _20 % für Proben sein (falls Durchlauf dupliziert ist). Unbekannte Proben, welche diese Kriterien nicht erfüllen, werden als „NR“ angegeben und müssen in einem nachfolgenden Durchlauf erneut analysiert werden.
2) % Verzerrung (% Rückgewinnung)

Messung von Metaboliten:
Nach Schritt 6 der „Herstellung von Bürstenproben zur Messung von Glykogen“ wurden Aliquoten des Überstandes in frische Röhrchen übertragen und bei –70 °C oder darunter für zukünftige Analysen eingefroren. Die Proben wurden zur Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten an Metabolon, Inc. (Durham, NC, USA) verschickt. Ein hierarchisches Mapping von funktionellen Elementen wurde ausgeführt, einschließlich von Metaboliten, die mit (1) oxidativem Stress (zum Beispiel, ohne Einschränkung darauf, Glutathion, S-Methylglutathion, Cystein, Methionin), (2) Proteinmetabolismus (zum Beispiel, ohne Einschränkung darauf, Methionin, N-Formylmethionin, Alanylglutamat, Threonylleucin), (3) Glykogenabbau (zum Beispiel, ohne Einschränkung darauf, Maltohexaose, Maltopentaose, Maltose, Maltotriose), (4) Pentosephosphat-Pathway oderr PPP (zum Beispiel, ohne Einschränkung darauf, Arabit, Sorbit, Mannit), (5) Entzündung (zum Beispiel, ohne Einschränkung darauf, 12-Hydroxyeicosatetraensäure oder 12-HETE, Arachidonat, Linoleat) und Membranbildung (Beispiele, ohne Einschränkung darauf, Cholinphosphat, Phosphoethanolamin, Glycerophosphoethanolamin) in Zusammenhang stehen.
Neben dem Hymenalbereich können Oberflächengewebeproben auch aus den Schamlippenbereichen unter Verwendung eines Messstreifen-Sammelverfahrens gefolgt von Extraktion und Analyse erhalten werden. D-Squame-Messstreifen von Cuderm können zur Probenahme verwendet werden.
Die Anmelder haben herausgefunden, dass das Schleimhautgewebe des Scheideneingangs ähnlich dem Vaginalkanal erhebliche Veränderungen durchmacht. Wie in 1A bis 1C dargestellt, zeigen die histologischen Bilder erhebliche anatomische und histologische Veränderungen am Scheideneingang, die der Vagina ähnlich sind. Zum Beispiel erscheint das Epithelgewebe (mit „E“ markiert) in Proben, die aus einer menopausalen Gruppe entnommen wurden, erheblich dünner im Vergleich zu den Proben, die von einer prämenopausalen Gruppe entnommen wurden. Die Epithelzellen, die typischerweise mit Glykogen gefüllt sind, sind flach. Ein neues Merkmal, das mit dem Scheideneingang in Zusammenhang steht und durch den menopausalen Status bewirkt wird, ist das Auftreten von Reteleisten oder Retezapfen (durch die Pfeile angegeben). Diese sind Epithelgewebeintrusionen in die Dermis und dienen zur Stabilisierung oder Bereitstellung einer starken Bindung an die darunterliegende Dermis (markiert mit „D“). Dieses Merkmal wird typischerweise bei der Luft ausgesetzten, stratifizierten Plattenepithelien beobachtet. Mit der Menopause werden die Retezapfen im Vergleich zur Prämenopause abgeschwächt oder verkürzt bzw. verschwinden. Mit einer HET-Behandlung nimmt sowohl die Dicke des Epithelgewebes als auch die Größe der Retezapfen zu. In 2 kann die relative Dicke des Epithelgewebes und die relative Abundanz der Retezapfen mit der folgenden Formel (unter Verwendung entweder von 4X oder 10X vergrößerten Bildern, vorzugsweise eines 10X-Bildes) gemessen werden:
Die krummlinige Linie „A-E“ bezieht sich auf die Grenzfläche zwischen dem Epithelgewebe und der Luft- oder Paraffingrenzfläche. Die krummlinige Linie „E-D“ bezieht sich auf die Grenze zwischen dem Epithelgewebe und dem dermalen Gewebe. Das Gewebebild wird derart erzeugt, dass eine senkrechte (oder nahezu senkrechte) Linie über die Linien A-E und E-D (c₁ und c₂) in Bereichen gezeichnet wird, die frei von Retezapfen sind. Die Länge der Linien A-E und E-D (gemessen in Pixel) zwischen den Grenzen c₁ und c₂. wird bestimmt. Zur Bestimmung einer Näherung der Retezapfen-Abundanz wird die Länge von E-D durch A-E dividiert. Weitere senkrechte (oder nahezu senkrechte) Linien werden erzeugt, die über die Linien A-E und E-D (c_n) gezeichnet werden und die Epitheldicke „d“ (gemessen in Pixel) messen. Zur Bestimmung einer Näherung der Epitheldicke wird die folgende Formel angewendet:
In ähnlicher Weise haben die Anmelder herausgefunden, dass der Gebrauch von transkriptomischen Wärmekarten zur Bestimmung von Veränderungen im Hymenalbereich und den äußeren Schamlippen verwendet werden kann.
Eine Genaktivitätsanalyse (auch als Transkriptomik bezeichnet) kann an einer Biopsie vorgenommen werden, die von den Schamlippen oder dem Hymenalbereich erhalten wird, um die Veränderungen im Zusammenhang mit der Menopause und den Behandlungswirkungen zu bestimmen. Das Erstellen von Transkriptionsprofilen ist dem Durchschnittsfachmann bekannt, wie von Cotreau et al. (Cotreau MM, Chennathukuzhi VM, Harris HA, Han L, Dorner AJ, Apseloff G, Varadarajan U, Hatstat E, Zakaria M, Strahs AL, Crabtree JS, Winneker RC und Jelinsky SA. Maturitas 58:366–376, 2007) gezeigt, wobei das Transkriptionsprofil von einer vaginalen Biopsie stammte, um die Wirkungen eines Hautpflasters aus Östrogen auf vaginale Atrophie zu bestimmen. Ein breiter gefasster Ansatz zur transkriptomischen Analyse, bei der Daten auf eine hierarchische Clusterbildung analysiert werden, um globale Muster zu visualisieren, kann unter Verwendung der Software OmniViz Version 6.1.4 (Instem Scientific, Cambridge, UK) angenommen werden.
Eine Analyse biologischer Begriffe zur Identifizierung von regulierten biologischen Prozessen kann unter Verwendung von genontologischen Begriffen und Verfahren, die denjenigen der DAVID Bioinformatics Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov) ähnlich sind, ausgeführt werden und ist auch in den folgenden Referenzen zu finden: (1) Huang da, W., B.T. Sherman und R.A. Lempicki, Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc, 2009. 4(1): S. 44–57, und (2) Huang da, W., B.T. Sherman und R.A. Lempicki, Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res, 2009. 37(1): S. 1–13.
Die gereinigte RNA, die aus der extrahierten Biopsie erhalten wird, wurde unter Verwendung des Affymetrix HT 3’ IVT Express-Kits (Katalognr. 901253, Santa Clara, Kalifornien, USA) in biotinmarkierte cRNA-Kopien umgewandelt und ein von Affymetrix bereitgestelltes Protokoll wurde an einer Beckman Biomek^® FX^p Laboratory Automation Workstation (Beckman Katalognr. A31842, Beckman Coulter, Brea, Kalifornien, USA) ausgeführt. Biotinylierte cRNA wurde durch begrenzte, alkalische Hydrolyse fragmentiert und danach über Nacht auf Affymetrix GeneTitan^® HG-U219-Arrayplatten unter Verwendung des Affymetrix GeneTitan^®-Instruments und des von Affymetrix bereitgestellten Protokolls hybridisiert. Nach der Verarbeitung wurden Chipbilder unter Verwendung des PLIER-Algorithmus, wie in der Affymetrix GeneChip Expression Console ausgeführt, in numerische Daten umgewandelt.
Insbesondere haben die Anmelder herausgefunden, dass von den ungefähr 49.000 Gensondensätzen, die ungefähr 22.000 Genen entsprechen, erwartungsgemäß ungefähr 2500 Sondensätze oder etwa 5 % durch reinen Zufall bei p < 0,05 (t-Test-Vergleich) signifikant wären. Die Anmelder haben entdeckt, dass der Östrogenstatus der Frau (Prämenopause vs. Postmenopause oder Postmenopause vs. Prämenopause + HET) mehr als nur durch reinen Zufall zu einer signifikanten Veränderung der Gensondenexpression führt. Für die am Hymenalring erhaltenen Proben führt die Behandlung mit HET zu einer etwa 18 %igen Veränderung der Gensonden, deren Aktivität sich verändert hat (8787/49293), das heißt, dass die transkriptionale Aktivität zu- oder abgenommen hat, wohingegen an den äußeren Schamlippen ungefähr 8 % der Gensondensätze signifikant durch HET vorgenommen werden. Wenn die Daten bei einem strengeren p < 0,01 (t-Test-Vergleich) gefiltert werden, zeigt eine hierarchische Genclusteranalyse der Hymenalringprobe, dass insgesamt 9060 Sondensätze diese Kriterien erfüllen. Von diesen Gensonden, die bei postmenopausalen Frauen anstiegen (5610 Gensondensätze) wurden 93,7 % (5256) durch HET umgekehrt. Von diesen Gensonden, die bei postmenopausalen Frauen abnahmen (3450) wurden 97,1 % (3349) durch HET umgekehrt. Wenn die Daten für die an den äußeren Schamlippen erhaltenen Proben in ähnlicher Weise mit der gleichen Strenge gefiltert wurden, erfüllten insgesamt 1620 Gensondensätze dieses Kriterium. Von diesen Gensonden, die bei postmenopausalen Frauen anstiegen (846 Gensondensätze) wurden 89,4 % (756) durch HET umgekehrt. Von diesen Gensonden, die bei postmenopausalen Frauen abnahmen (774) wurden 84,9 % (657) durch HET umgekehrt.
Insbesondere haben die Anmelder herausgefunden, dass mit Kollagen in Zusammenhang stehende Gene am Hymenalbereich und Veränderungen (Zu- oder Abnahmen) reguliert werden, die mit der durch die Menopausebehandlung umgekehrten Menopause in Zusammenhang stehen. Ferner werden mit Seneszenz in Zusammenhang stehende Gene in ähnlicher Weise durch menopausale Atrophiebehandlungen und eine Veränderung zwischen Prämenopause und denjenigen, die unter vaginaler Atrophie leiden, reguliert. Ferner werden mitochondriale strukturelle Proteine, ribosomale RNA und Enzyme, die mit der Energieproduktion, einschließlich der Elektronentransportkette und Zellatmung in Zusammenhang stehen, durch menopausale Atrophiebehandlungen und eine Veränderung zwischen Prämenopause und denjenigen, die unter vaginaler Atrophie leiden, reguliert. Die Anmelder haben herausgefunden, dass Veränderungen im Gensondensatz zur Beurteilung von Atrophie auf Gensonden beschränkt sein können, die mit der Kollagenexpression in Zusammenhang stehen. Die Anmelder haben herausgefunden, dass Veränderungen im Gensondensatz zur Beurteilung von Atrophie auf die Zellzyklusprogression beschränkt sein können.
Die Anmelder haben herausgefunden, dass prämenopausale Frauen gegenüber postmenopausalen Frauen, die unter vaginaler Atrophie leiden, unterschiedliche klinische Atrophiewerte und eine unterschiedliche Vaginaltrockenheit und unterschiedliche Grade von schmerzhaftem Geschlechtsverkehr haben. Die Anmelder haben auch herausgefunden, dass der pH-Wert am Hymenalbereich mit dem pH-Wert im Vaginalkanal überaus eng korreliert. Die Anmelder haben herausgefunden, dass der pH-Wert der äußeren Schamlippen mit Einsatz der Menopause um eine messbare Menge ansteigt und mit menopausalen Atrophiebehandlungen umgekehrt wird.
Eine Prüfung an den äußeren Schamlippen, den inneren Schamlippen und/oder am Scheideneingang ermöglicht die Beurteilung von vaginaler Atrophie ohne die Notwendigkeit der Einführung eines Spekulums in das Innere des Vaginalkanals. Das Array der obigen Verfahren ermöglicht die Beurteilung mittels pH-Wert, Bürstenempfindlichkeit, Glykogenspiegelbeurteilung aus einer Bürste oder Biopsie, Proteinbeurteilung aus einer Bürste oder Biopsie, Analyse der Epithelzellen, die aus einer Biopsie entnommen werden, die Verwendung von Wärmekarten, Genaktivität zur Bestimmung der Genexpression oder Kombinationen davon.
Die Anmelder haben herausgefunden, dass die obigen Verfahren zur Beurteilung von vaginaler Atrophie vor und nach einem Behandlungsregime angewendet werden können.
In einer Ausführungsform kann das Array von Verfahren zur Beurteilung einer Behandlung angewendet werden. Die Behandlung kann den pH-Wert in Bezug auf Atrophie um 0,1 bis 2,0 pH-Einheiten oder um 0,3 Einheiten bis 1,5 Einheiten reduzieren. In einer Ausführungsform kann das Array von Verfahren zur Beurteilung einer Behandlung angewendet werden. Die Behandlung kann dazu führen, dass am Scheideneingang ein pH-Wert von 3,5 Einheiten bis 5,8 Einheiten vorliegt.
In einer Ausführungsform kann das Array von Verfahren zur Beurteilung einer Behandlung durch Analysieren von Epithelzellen am Scheideneingang und der Abundanz von Retezapfen im Hymenalring angewendet werden. Eine Behandlung kann eine Wirkung der Erhöhung der Rete-Abundanz um 10 bis 100 % zeigen.
In einer Ausführungsform kann das Verfahren des Analysierens von Epithelzellen am Scheideneingang ferner das Messen der Dicke der Hymenalepithelien vor und nach einer Behandlung einschließen. Eine Behandlung kann eine Wirkung der Erhöhung der Dicke in Bezug auf die Atrophie um 10 bis 300 % zeigen.
In einer Ausführungsform kann das Verfahren des Analysierens von Glykogen am Scheideneingang ferner das Messen der Dicke der Glykogenmenge vor und nach einer Behandlung einschließen. Eine Behandlung kann eine Wirkung der Erhöhung der Glykogenmenge um 10 bis 300 % zeigen.
In einer Ausführungsform kann das Verfahren des Analysierens von Bestandteilen der Proteinsynthese wie N-Formylmethionin und/oder Methionin am Scheideneingang ferner das Messen der Menge von N-Formylmethionin und/oder Methionin vor und nach einer Behandlung einschließen. Eine Behandlung kann eine Wirkung des Erhöhens von Bestandteilen der Proteinsynthese, wie N-Formylmethionin und/oder Methionin, um 10 bis 100 % zeigen
In einer Ausführungsform kann das Verfahren des Analysierens von Bestandteilen des Glykogenmetabolismus, wie Maltohexaose und/oder Maltopentaose und/oder Maltotriose und/oder Maltose, am Scheideneingang ferner das Messen der Menge von Maltohexaose und/oder Maltopentaose und/oder Maltotriose und/oder Maltose vor und nach einer Behandlung einschließen. Eine Behandlung kann eine Wirkung des Erhöhens von Bestandteilen des Glykogenmetabolismus, wie Maltohexaose und/oder Maltopentaose und/oder Maltotriose und/oder Maltose, um 10 bis 100 % zeigen.
In einer Ausführungsform kann das Verfahren des Analysierens von Bestandteilen der Alkoholproduktion wie Mannit und/oder Sorbit und/oder Arabit am Scheideneingang ferner das Messen der Menge von Mannit und/oder Sorbit und/oder Arabit vor und nach einer Behandlung einschließen. Eine Behandlung kann eine Wirkung des Verringerns von Bestandteilen der Alkoholproduktion wie Mannit und/oder Sorbit und/oder Arabit um 10 bis 400 % zeigen.
In einer Ausführungsform kann das Verfahren des Analysierens von Bestandteilen von Entzündung wie 12-HETE und/oder Arachidonat und/oder Linoleat am Scheideneingang ferner das Messen der Menge von 12-HETE und/oder Arachidonat und/oder Linoleat vor und nach einer Behandlung einschließen. Eine Behandlung kann eine Wirkung des Verringerns von Bestandteilen von Entzündung wie 12-HETE und/oder Arachidonat und/oder Linoleat um 10 bis 400 % zeigen.
In einer Ausführungsform kann das Verfahren des Analysierens einer Gensondenaktivität am Scheideneingang ferner das Messen von Gensondenveränderungen vor und nach einer Behandlung einschließen. Eine Behandlung kann eine Wirkung des Erhöhens der transkriptomischen Gensondenaktivität in 1 bis 90 % des Gensondensatzes insgesamt zeigen.
Eine Behandlung kann eine Wirkung des Verringerns der transkriptomischen Gensondenaktivität in 1 bis 90 % des Gensondensatzes insgesamt zeigen.
Behandlungen können einen labial oder vaginal aufgetragenen Weichmacher, einschließen das aus Östrogenverbindungen, Isoflavonen oder Phytosteroiden und Hautbehandlungsmitteln (wie beispielsweise, jedoch ohne Einschränkung darauf Niacinamid und/oder Panthenol), Hyaluronin, Fettölen, gepufferten Säuren, Befeuchtungsmitteln und Mischungen davon besteht. Behandlungen können ferner ein orales oder dermales Abgabesystem einschließen, das aus Östrogen besteht. Eine Östrogenbehandlung, die im Allgemeinen oral oder dermal verabreicht wird, wird auch als Hormonersatztherapie oder HET bezeichnet.
In einer Ausführungsform ist das Ölmaterial mit einem Ölstabilitätsindex („OSI”) von mindestens etwa 10 Stunden, mindestens etwa 14 Stunden oder mindestens etwa 18 Stunden bei 110 °C oder 120 °C ausgewählt. Ein übliches Maß zur Überwachung der oxidativen Stabilität ist die Entwicklung von Hydroperoxiden (Peroxidwert oder PV) im Zeitverlauf. Die oxidative Stabilität kann auch im Hinblick auf die Zeit ausgedrückt werden, die zum Erhalt sekundärer Oxidationsprodukte erforderlich ist, wenn eine Probe bei erhöhter Temperatur Luft ausgesetzt wird. Diese Zeit, die als der Ölstabilitätsindex oder OSI bezeichnet wird, wird im Normalfall bei 110 °C oder 120 °C gemessen [Amer Oil Chem Soc Oil Stability Index Method Cd 12b–92] unter Verwendung des Rancimat-Instruments (Brinkmann Instruments, Inc.) oder des OSI-Instruments (Omnion, Inc.). Man ist der Auffassung, dass Ölmaterialien, die relativ hohe Ölsäuremengen umfassen, im Kontext der vorliegenden Erfindung tendenziell stabiler sind. In einer Ausführungsform umfasst das Ölmaterial bezogen auf das Gewicht des Ölmaterials mindestens etwa 10 %, von etwa 10 % bis etwa 80 % oder von etwa 15 % bis etwa 70 % Ölsäure. In einer Ausführungsform umfasst die Lotionszusammensetzung bezogen auf das Gewicht der Lotionszusammensetzung von etwa 0,0005 % bis etwa 16 %, von etwa 0,005 % bis etwa 8 % oder von etwa 0,01 % bis etwa 2,4 % Ölsäure. Zu nicht einschränkenden Beispielen von geeigneten Ölmaterialien mit den hierin beschriebenen gewünschten Eigenschaften gehören ölsäurehaltiges Rapsöl (Brassica campestris, B. napus, B. rapa; gekennzeichnet durch einen Ölsäuregehalt von mehr als 70 %, z. B. Rapsöl mit hohem Ölsäuregehalt, Rapsöl mit sehr hohem Ölsäuregehalt oder teilweise gehärtetes Rapsöl), Marulakernöl (Sclerocarya birrea), Palmöl (Elaeis Guineensis-Öl), Palmolein, Palmstearin, Palmsuperolein, Pecanöl, Kürbiskernöl, ölsäurehaltiges Safloröl (Carthamus Tinctorius; gekennzeichnet durch einen Ölsäuregehalt von mehr als etwa 30 % und einen Omega-6-Fettsäuregehalt von weniger als etwa 50 %, z. B. Safloröl mit hohem Ölsäuregehalt), Sesamöl (Sesamum indicum, S. oreintale), Sojabohnenöl (Glycine max, z. B. Sojabohnenöl mit hohem Ölsäuregehalt, Sojabohnenöl mit geringem Linolensäueregehalt, teilweise gehärtet) ölsäurehaltiges Sonnenblumenöl (Helianthus annus; gekennzeichnet durch einen Ölsäuregehalt von mehr als etwa 40 %, z. B. Sonnenblumenöl mit mittlerem Ölsäuregehalt oder Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt) und Mischungen davon. Ölsäurehaltiges Rapsöl, Palmöl, Sesamöl, Safloröl mit hohem Ölsäuregehalt, Sojabohnenöl mit hohem Ölsäuregehalt, Sonnenblumenöl mit mittlerem Ölsäuregehalt und Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt sind übliche, aus Pflanzenzucht gewonnene Öle und können auch aus nicht genetisch modifizierten Organismen (Nicht-GMO) gewonnen werden. Nicht einschränkende Beispiele von Ölmaterialien sind im Handel von einer Vielzahl von Lieferanten erhältlich, einschließlich Cargill für teilweise gehärtetes Sojabohnenöl (d. h. Preference^® 110W-Sojabohnenöl oder Preference^® 300 Hi Stability-Sojabohnenöl), Sonnenblumenöl mit mittlerem Ölsäuregehalt (d. h. NuSun^®-Sonnenblumenöl mit mittlerem Ölsäuregehalt), Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt (d. h. Clear Valley^®-Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt), Rapsöl mit hohem Ölsäuregehalt, Rapsöl mit sehr hohem Ölsäuregehalt und teilweise gehärtetes Rapssamenöl mit niedrigem Erucasäuregehalt (d. h. Clear Valley^® 65-Rapsöl mit hohem Ölsäuregehalt und Clear Valley^® 75-Rapsöl mit hohem Ölsäuregehalt); Lambert Technology für Rapsöl mit hohem Ölsäuregehalt (d. h. Oleocal C104); Arch Personal Care für Marulakernöl; Pioneer für Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt (d. h. Plenish^®); Asoyia für Sojabohnenöl mit niedrigem Linolengehalt (d. h. Ultra Low Linolenic Soybean Oil^®); und Dipasa, Inc. für raffiniertes Sesamöl.
Die Hautbehandlungsmittel können ferner ergänzende Hautbehandlungsmittel wie Niacinamid, Zinkoxid, Hexamidin, Panthenol und dergleichen und Mischungen davon umfassen. Geeignete Hautbehandlungsmittel sind in US 2003/0082219 A1 beschrieben.
In einer Ausführungsform ist das Befeuchtungsmittel typischerweise in Mengen von 0,1 bis 20 % (w/w), vorzugsweise von 1 bis 15 % (w/w) und mehr bevorzugt 2 bis 12 % (w/w) vorhanden. Geeignete Befeuchtungsmittel sind z. B. Aminosäuren, Pyrrolidoncarbonsäure, Milchsäure und ihre Salze, Lactitol, Harnstoff und Harnstoffderivate, Harnstoffsäure, Glucosamin, Creatinin, Zersetzungsprodukte von Kollagen, Chitosan oder Chitosansalze/-derivate und insbesondere Polyole und Polyolderivate (z. B Ethylenglycol, Propylenglycol, Butylenglycol, Pentylenglycol, Hexylenglycol, Erythrit, 1,2,6-Hexantriol, Polyethylenglycole wie PEG-4, PEG-6, PEG-7, PEG-8, PEG-9, PEG-10, PEG-12, PEG-14, PEG-16, PEG-18, PEG-20, PEG-135, PEG 150), Zucker und Zuckerderivate (z. B. Fructose, Glucose, Maltose, Maltitol, Mannit, Inosit, Sorbit, Sorbitylsilandiol, Sacharose, Trehalose, Xylose, Xylit, Glucuronsäure und ihre Salze), ethoxyliertes Sorbit (Sorbeth-6, Sorbeth-20, Sorbeth-30, Sorbeth-40), Honig und hydrierter Honig, hydrierte Stärkehydrolysate sowie Mischungen von hydriertem Weizenprotein, hydrolysiertes Milchprotein, Lecithin, Pythantriol, Hyaluronsäure und Salze davon und PEG-20-Acetatcopolymere. Besonders bevorzugte Befeuchtungsmittel sind Glycerin, Diglycerin und Triglycerin.
In einer Ausführungsform ist das Östrogenmaterial typischerweise in Mengen von 0,001 bis 10 %, vorzugsweise von 0,01 bis 8 % und mehr bevorzugt 0,05 bis 5 % vorhanden. Geeignete Östrogenmaterialien sind Östradiol, Östron und Östriol.
Phytosteroide repräsentieren Materialien, die aus Pflanzen extrahiert werden. Repräsentative Bestandteile können steroidale und nicht steroidale Strukturen einschließen, die beide eine steroidähnliche biologische Aktivität besitzen. Beispiele von steroidalen Materialien schließen aus Pflanzenöl gewonnene Steroide, d. h. Sitosterol, Stigmasterol und Campesterol ein. Nicht steroidale Strukturen schließen Isoflavone, Flavone und Coumestane ein. Isoflavone, zu denen Genestein, Daidzein, Formononetin und Equol gehören, wurden als nützliche Behandlungen für Symptome identifiziert, die mit Menopause und Perimenopause (US-Patent 5498631 an GORBACH, 12. März 1996), Depression und Demenz (US-Patent US 5733926 an GORBACH, 31. März 1998, US-Patent US 6083526 an GORBACH, 4. Juli 2000), Hautfaltenbildung (US-Patent US 6060070 an GORBACH, 9. Mai 2000) und Krebs ( WO 2004022023 an NOVOGEN) in Zusammenhang stehen.
In einer Ausführungsform ist das Isoflavonmaterial typischerweise in Mengen von 0,001 % bis etwa 40 % Isoflavone, vorzugsweise 0,001 % bis etwa 4 %, mehr bevorzugt 0,01 % bis etwa 2 % Isoflavone vorhanden. Die Isoflavone können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Sojaisoflavonen, Kleeisoflavonen, Genestein, Daidzein, Formononetin, Biochanin A, S-Equol, R-Equol oder einem mimetischen Pflanzenextrakt. Mit mimetischem Pflanzenextrakt ist im Kontext der Anmeldung ein beliebiger Pflanzenextrakt gemeint, der die Wirkung der identifizierten Isoflavone nachahmen kann.
In einer Ausführungsform können ein oder mehrere Verfahren innerhalb des Arrays von Verfahren in einem Kit zur Beurteilung der Wirksamkeit eines Behandlungsregimes für vaginale Atrophie enthalten sein, das ein Vorbehandlungsbeurteilungsverfahren; eine topische Behandlung zur Applikation auf die äußeren Schamlippen, die inneren Schamlippen, den Scheideneingang, die Vagina oder Kombinationen davon; ein Nachbehandlungsbeurteilungsverfahren für vaginale Atrophie und ein Mittel zum Bestimmen der Differenz zwischen der Vorbehandlungs- und der Nachbehandlungsbeurteilung von vaginaler Atrophie umfasst, um die Gesamtwirkung der topischen Behandlung zu beurteilen.
Das Vorbehandlungsbeurteilungsverfahren und das Nachbehandlungsbeurteilungsverfahren können eines oder mehrere der oben beschriebenen Verfahren zur Beurteilung von vaginaler Atrophie sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf: Messen des pH-Wertes an den äußeren Schamlippen, den inneren Schamlippen, dem Scheideneingang oder Kombinationen davon; Bestimmen einer Bürstenempfindlichkeit am Scheideneingang; Beurteilen einer Glykogenprüfung am Scheideneingang; eine Biopsieanalyse der Epithelzellen am Scheideneingang; Beurteilen einer Proteinprüfung am Scheideneingang; transkriptomisches Wärme-Mapping an den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen; oder Bewerten einer Genexpression an den äußeren Schamlippen, den inneren Schamlippen, dem Scheideneingang, der Vagina oder Kombinationen davon.
Das Kit kann ferner einen oder mehrere Absorptionsartikel aufweisen, die in Kombination mit dem Beurteilungsverfahren verwendet werden. Wie hier verwendet, kann ein Absorptionsartikel einen Damenhygieneartikel, eine Damenbinde, eine Interlabialeinlage, eine Damenslipeinlage, eine Erwachseneninkontinenzeinlage, eine Erwachseneninkontinenzhose, eine Erwachseneninkontinenzwindel, eine sterile Gaze, ein Feuchttuch und einen Wundverband einschließen.
Die hier offenbarten Maße und Werte sollen nicht als streng auf die genauen angegebenen numerischen Werte beschränkt aufgefasst werden. Stattdessen soll, falls nichts Anderes angegeben ist, jede dieser Abmessungen die Bedeutung des angegebenen Werts und eines funktional angemessenen Bereichs, der diesen Wert umgibt, haben. Beispielsweise soll eine Abmessung, die als „40 mm“ offenbart ist, „etwa 40 mm“ bedeuten.
Die hier als Endwerte von Bereichen offenbarten Werte sollen nicht als streng auf die genauen angegebenen numerischen Werte beschränkt aufgefasst werden. Stattdessen soll sich, falls nichts Anderes angegeben ist, jeder numerische Bereich sowohl auf die angegebenen Werte als auch beliebige ganze Zahlen innerhalb des Bereichs beziehen. Zum Beispiel soll sich ein Bereich, der als „1 bis 10“ offenbart ist, „1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10“ bedeuten.
Alle Dokumente, auf die in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung verwiesen wird, sind in ihren relevanten Abschnitten durch Bezugnahme hierin eingeschlossen; das Zitieren eines Dokuments darf nicht als Anerkenntnis ausgelegt werden, dass es dem Stand der Technik im Hinblick auf die vorliegende Erfindung entspricht. Sollten beliebige Bedeutungen oder Definitionen eines Begriffes in diesem Dokument mit beliebiger Bedeutung oder Definition desselben Begriffes in einem durch Bezugnahme eingeschlossenen Dokument in Zwiespalt stehen, gilt die Bedeutung oder Definition, die dem Begriff in diesem Dokument zugewiesen wurde.
Obwohl bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dargestellt und beschrieben wurden, ist es für den Fachmann offensichtlich, dass verschiedene weitere Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Grundgedanken und Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Daher sollen in den beigefügten Ansprüchen alle derartigen Änderungen und Modifikationen, die in den Schutzbereich der Erfindung fallen, abgedeckt sein.

Claims

Array eines oder mehrerer Verfahren zum Identifizieren von urogenitalen Veränderungen, die mit vaginaler Atrophie in Zusammenhang stehen, wobei die Verfahren Folgendes umfassen: a. Messen eines pH-Wertes an den äußeren Schamlippen, den inneren Schamlippen, dem Scheideneingang oder Kombinationen davon; b. Bestimmen einer Bürstenempfindlichkeit am Scheideneingang; c. Beurteilen einer Glykogenmenge am Scheideneingang; d. Durchführen einer Biopsie am Scheideneingang und Analysieren von Epithelzellen am Scheideneingang; e. Beurteilen einer Proteinmengenprüfung am Scheideneingang oder den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen; f. Beurteilen von Metabolitenmengen am Scheideneingang oder den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen; g. Beurteilen von Histaminmengen am Scheideneingang oder den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen; h. transkriptomisches Wärme-Mapping an den äußeren Schamlippen oder den inneren Schamlippen oder am Scheideneingang; und i. Bewerten einer Genexpression an den äußeren Schamlippen auf Veränderungen in einem Gensondensatz.
Array von Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zum Messen des pH-Wertes ferner das Verwenden einer pH-Sonde umfasst.
Array von Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Veränderungen im Gensondensatz auf Gensonden beschränkt sind, die mit einer Kollagenexpression in Zusammenhang stehen.
Array von Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Veränderungen im Gensondensatz auf Zellzyklusprogression beschränkt sind.
Array von Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein oder mehrere der Verfahren zum Beurteilen des Ausmaßes von vaginaler Atrophie vor und nach einem Behandlungsregime angewendet werden.
Array von Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Behandlung eine Wirkung der Reduzierung des pH-Wertes in Bezug auf eine Atrophie um 0,1 bis 2,0 pH-Einheiten zeigt.
Array von Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6, wobei die Behandlung eine Wirkung der Reduzierung des pH-Wertes in Bezug auf eine Atrophie um 0,3 Einheiten bis 1,5 Einheiten zeigt.
Array von Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Behandlung zu einem Scheideneingang mit einem pH-Wert von 3,5 bis 5,8 Einheiten führt.
Array von Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die Behandlung ein urogenital oder vaginal aufgetragener Weichmacher ist, das aus Östrogen, Isoflavonen, Niacinamid, Hyaluron, Panthenol, Fettölen, gepufferten Säuren und Mischungen davon besteht.
Array von Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Behandlung ein orales oder dermales Abgabesystem ist, das aus Östrogen besteht.
Array von Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Analysieren von Epithelzellen am Scheideneingang ferner das Messen der Abundanz von Retezapfen im Hymenalring umfasst, wobei die Verfahren ferner einer Behandlung umfassen, und wobei die Behandlung eine Wirkung des Erhöhens der Rete-Abundanz um 10 bis 100 % zeigt.
Array von Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Analysieren von Epithelzellen am Scheideneingang ferner das Messen der Dicke von Hymenalepithelien umfasst, wobei die Verfahren ferner eine Behandlung umfassen, und wobei die Behandlung eine Wirkung des Erhöhens der Dicke in Bezug auf die Atrophie um 10 bis 300 % zeigt.