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Verfahren zur photometristen Bestimmung kleiner Mengeii gelöster
Stoffe und Küvette zur Durchführung des Verfahrens Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur photometrischen Bestimmung kleiner Mengen gelöster Stoffe, die in Form abgemessener
Lösungsproben auf cinen Träger aufgebracht sind.
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Die bekannten Verfahren, bei denen man Stofflösungen mißt, die sich
in Glasküvetten befinden, haben den Nachteil, daß eine bestimmte Mindestmenge an
Lösung vorhanden sein muß. Diese Menge hängt von der Konzentration des zu messenden
Stoffes in derLösung ab und darf auch bei Mikroküvetten und hoher Stoffkonzentration
nicht weniger als 0,1 bis 0,2 ml betragen. Erfahrungsgemäß stehen solche Mengen
aber bei biologischen Versuchen selten zur Verfügung, weswegen eine photometrische
Auswertung bisher oft nicht möglich war.
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Ein weiteres bekanntes Verfahren betrifft die photometrische Bestimmung
der Einzelkomponenten von Stoffgemischen, die durch Elektrophorese oder durch Chromatographie
auf Streifen von porösem Material getrennt und gegebenenfalls angefärbt sind. Das
Verfahren besteht darin, daß man die betreffenden Streifen durch Einbetten in eine
Flüssigkeit, die den gleichen oder etwa den gleichen Brechungsindex aufweist wie
das Material, aus dem die Streifen hergestellt sind, lichtdurchlässig macht und
anschließend die Extinktion nach den üblichen quantitativen Methoden mißt.
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Nach dem letztgenannten Verfahren können Stoffe, die sich auf einem
porösen Träger befinden, auch ohne vorausgehende Elektrophorese oder Chromatographie
photometrisch analysiert werden. Dabei stört, daß der Träger trotz Einbetten in
eine Flüssigkeit von gleichem Brechungsindex nicht vollkommen durchstrahlbar wird,
sondern nur ölpapierähnliche Beschaffenheit annimmt. Als Folge zeigt sich beim Photometrieren
ein -im Träger örtlich ungleicher Lichtverlust, der die Extinktion der aufgebrachten
Stoffprobe überlagert und das Messen geringer Stoffmengen ungenau macht.
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Für Eiweiß, das mit Amidoschwarz angefärbt ist, beträgt die meßbare
Mindestmenge daher bestenfalls 1 bis 2 Gamma (0,000002g), so daß das Verfahren fiir
die Bestimmung kleinster Stoffmengen ebenfalls nicht in Frage kommt.
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Die Erfindung bezweckt, den Mangel an photometrischen Mikromethoden
zu beseitigen, und schlägt ein Verfahren vor, das es unter Verwendung von Probenträger
und Küvette ermöglicht, kleinste Mengen gelöster Stoffe photometrisch zu messen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kennzeichnet sich dadurch, daß ein
fasriger oder poröser Träger zur Anwendung kommt, der in der Küvette durch ein Lösungsmittel
infolge beginnender Auflösung durch Aufhebung der lichtstreuenden und der doppelbrechenden
Eigenschaft seines Materials optisch gleichmäßig durchstrahlbar wird, während die
Struktur des Trägers so weit erhalten bleibt, daß die Prpbe ihre Lage beibehält,
und daß das Lösungsmittel gleiche Absorp-, tionseigenschaften besitzt wie der in
Auflösung begriffene .Träger.
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Gemäß der Erfindung wird auf -den aus fasrigem oder porösem Werkstoff
bestehenden Träger, der saugfähig ist, die zu bestimmende Lösungsprobe aufgetragen.
Nach Antrocknen des in ihr enthaltenen Stoffes wird der Träger in einer. durchsichtigen
Küvette mit einem Lösungsmittel versetzt, das zwar den Träger,. nicht aber den zu
messenden Stoff löst oder zerstört.
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Das Versetzen des Trägers mit dem Lösungsmittel hebt die lichtstreuende
und doppelbrechende Wirkung des Trägers auf, so daß er durchsichtig und streulichtfrei
durchstrahlbar wird. Bei Wahl eines geeigneten Mengenverhältnisses von Träger und
Lösungsmittel. wird ein Zustand beginnender Lösung erreicht, in dem die optimale
Durchstrahlbarkeit bereits erreicht, jedoch die Struktur des Trägers noch vorhanden
ist. Dadurch behält der zu bestimmende Stoff, der in Form kleinster Partikel im
Träger liegt und infolge seiner Unlöslichkeit im Träger-Lösungsmittel-Gemisch nicht
diffundieren kann, seine beim Aufbringen auf denTräger zustande gekommene Lage bei
und wird mit einem dem Probenfleck nach Form und Größe angepaßten Meßstrahl photometrisch
gemessen.
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Das Verfahren. gemäß der Erfindung ist von der Küvettengröße unabhängig
und erlaubt, sehr kleine Lösungsmengen zu analysieren. Die untere Grenze der Anwendbarkeit
ist durch die Menge des gelösten Stof-
fes gegeben und liegt einige
Zehnerpotenzen unter der Erfassungsgrenze der bekannten photometrischen Verfahren.
Beispielsweise können Eiweißbestimmungen an 0,2 Mikroliter (0,0002ml) Lösung durchgeführt
werden, wobei nach Anfärben mit Amidoschwarz noch einige Hundertstel Gamma Eiweiß-
meßbar sind.
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Dadurch, daß die Lösungsproben gemäß des vorgeschlagenen Verfahrens
auf fasrige oder poröse Träger aufgebracht werden, breiten sie sich entsprechend
der großen Oberfläche der Trägerstruktur auf einen begrenzt kleinen Raum aus und
geben, auch wenn sie ungewöhnlich kleine Stoffmengen enthalten, beispielsweise einige
Hundertstel Gamma Eiweiß, eine genügend hohe Absorption, um hinreichend genau messen
zu können.
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Die für die Auswertung wichtige, gleichmäßigeVerteilung der Probe
auf dem Träger hängt von dessen Saugfähigkeit für die Stofflösung ab. Um nicht saugfähige
Träger saugfähig zu machen oder die Saugfähigkeit - begrenzt saugfähiger Träger
zu verbessern, schlägt die Erfindung in einem weiteren Verfahrensschritt vor, den
Träger vor Aufbringen der Stoffprobe einer chemischen Behandlung zu unterziehen,
die das Trägermaterial für die Stofflösung netzbar macht bzw. ihm eine geeignete
Oberflächenspannung verleiht.
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Beispielsweise wird die Saugfähigkeit für wäßrige Lösungen bei Verwendung
von Polyvinylchlorid als Trägermaterial durch Imprägnation mit Olsäure erreicht.
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Nach Antrocknen der Lösungsprobe liegt der zu messende Stoff in Form
kleinster Partikel zwischen den Fasern bzw. in den Poren des Trägers und gibt ein
für ihn charakteristisches Absorptionsspektrum, das durch Lichtverluste infolge
der lichtstreuenden Wirkung der Partikel geringfügig überlagert wird.
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Der dadurch beim Messen der Proben entstehende Fehler ist, sofern
es sich um Lösungen eines bestimmten Konzentrationsbereiches handelt, beispielsweise
um Eiweiß lösungen zwischen 0,01 und 0,50/0, ohne Bedeutung. Er kann aber, wenn
erforderlich, durch Verwendung von Träger-Lösungsmittel-Paaren, deren Gemisch den
gleichen Brechungsindex aufweist wie die Stoffpartikel, ausgeschaltet werden.
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Ist die Absorption der Stoffprobe zu gering, um brauchbare Meßwerte
zu geben, oder liegt sie in einem ungünstigen Wellenbereich, so kann sie durch chemisches
Umsetzen oder Anfärben des Stoffes in geeigneter Weise verbessert werden. Um dieses
Ziel zu erreichen, schlägt die Erfindung vor, nach den bekannten Methoden der sogenannten
Tüpfelanalyse zu verfahren und beispielsweise - Eiweiß mit Amidoschwarz zu färben.
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Ein weiterer Verfahrensschritt gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet,
daß die fleckförmig im Träger liegende Stoffprobe durch Vorbeiführen an einem dem
Probenfleck angepaßten Meßstrahl photometrisch gemessen wird.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das aus einem der bekannten
Spektralphotometer, bei spielsweise derFirma Zeiss oder der Firma Beckmann, erhaItene
monochromatische Licht durch Kombination geeigneter Linsen und Blenden so geformt
werden, daß in der Meßebene, in der sich die Küvette mit dem Probenträger und dem
Lösungsmittel befindet, ein Meßstrahl entsteht, dessen Querschnitt der Form und
der Größe des zu untersuchenden Probenfieckes optimal angepaßt ist. Die Einstellung
der Stoffprobe im Meßstrahl wird mit Hilfe eines Justiermikroskopes und einer entsprechenden
Beleuchtungseinrichtung vorgenommen, und anschließend wird die Küvette mit
Träger
und Stoffprobe in schrittweisem Transport über genau bestimmte Wegstrecken, gegebenenfalls
in Bruchteilen von Millimetern, an dem der Probe angepaßten Lichtbündel vorbeigeführt
und dabei die Extinktion der Probe gemessen.
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Gemäß weiterer Erfindung kann als Träger ein papierartig verarbeiteter
Kunststoff, beispielsweise Polyvinylchlorid, zur Anwendung kommen.
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Besonders vorteilhaft ist es, wenn erfindungsgemäß als Lösungsmittel
für den Träger Nitrobenzol oder Tetrahydrofuran verwandt wird.
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Die erwähnten geringen Stoffmengen können nach dem neuen Verfahren
nicht nur photometrisch gemessen, sondern auch spektralanalytisch untersucht werden.
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Außer zur Analyse im sichtbaren Licht eignet sich das Verfahren bei
Verwendung von Träger-Lösungsmittel-Paaren, deren Gemisch das Licht niederer Wellenlängen
nicht oder nur gering absorbiert, ebenso zur Stoffanalyse im ultravioletten Bereich.
Um Fehler zu vermeiden, muß in diesem Fall die möglicherweise lichtstreuendeWirkung
der Partikel des zu messenden Stoffes durch Wahl eines Träger-Lösungsmittelgemisches
von entsprechendem Brechungsindex sorgfältig ausgeschaltet werden.
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Die Erfindung bringt schließlich eine Küvette zur Durchführung des
neuen Verfahrens in Vorschlag, die durch zwei parallel zueinander und in einem bestimmten
Abstand voneinander angeordnete, durchsichtige Platten, vorzugsweise Glasplatten,
gekennzeichnet ist Die Platten sind an beiden Seiten und am unteren Rand unter Bildung
von Behälterwänden miteinander verbunden, wobei die Tiefe der Küvette, gleich der
Abstand der Platten voneinander, so gewählt ist, daß bei Verwendung eines Trägers,
dessen Abmessung der Höhe und Breite des Küvettenraumes entspricht, das erforderliche
Mischungsverhältnis zwischen Träger und Lösungsmittel zustande kommt.
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Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können die Platten,
die die Küvette bilden, zur Ermöglichung des leichten und luftblasenfreien Einführens
des Trägers in den mit Lösungsmittel gefüllten Küvettenraum an ihren oberen Rändern
unter ständiger Erweiterung ihres gegenseitigen Abstandes abgebogen und im Querschnitt
keilförmig auslaufend ausgebildet sein.
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Das Versetzen des Trägers mit dem Lösungsmittel wird in der Küvette
vorgenommen, indem diese vor Einführen des Trägers mit dem Lösungsmittel gefüllt
wird.
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Um die Küvette nach Gebrauch mühelos reinigen zu können, wird erfindungsgemäß
vorgeschlagen, ihre Seitenwände mit nur einer der beiden Platten fest zu verbinden
und die andere abnehmbar aufzulegen.
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B'eispiel Eiweißbestimmnng an einer 0,01 bis 0,5 0/oigen Lösung,
Probenmengg 0,2 bis 5,0 Mikroliter (0,0002 bis 0,005 ml), Erfassungsgrenze 0,02
Gamma (0,00000002 g).
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Ein 40 x 40 mm großer Kunststoffträger, beispielsweise »Rhovyl« der
Firma Schleicher & Schfill, Dassel, wird mit Ölsäure durch Aufsaugen einer 20/oigen
Ölsäurelösung in Äther und nachfolgendes Abdampfen desAthers imprägniert. Sodann
wird dieleiweißhaltige Lösungsprobe aufgetragen und angetrocknet und danach das
auf dem Träger befindliche Eiweiß in einer gesättigten Amidoschwarzlõsung in Eisessig-Methanol
(1:10) zehn Minuten lang gefärbt. Die vom Eiweiß nicht gebundene Farbe - wird in
mehrfach erneuertem Eisessig-Methanol (1:10.) ausgewaschen, worauf das
Trocknen
des Trägers von der Waschflüssigkeit folgt.
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Eine innen 40 mm breite und 40 mm hohe sowie 0,6 mm tiefe Glasküvette-wird
mit Nitrobenzol gefüllt und darauf derTräger in die Küvette eingeführt. Nach vierzig
Minuten-ist der Träger optisch gleichmäßig durchstrahlbar, und die Küvette wird
in den Strahlengang eines Spektralphotometers gebracht. Durch schrittweisen Transport
wird die Probe mit einem Meßstrahl von bestimmtemQuerschnitt abgetastet und die
Extinktion aus den pro Meßschritt erhaltenen Einzelwerten errechnet.
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In der Zeichnung ist eine Eichkurve sowie ein Linsen- und Blendensystem
und eine Küvette zur Durchfiihrung des Verfahrens nach der Erfindung bei.spi.elsweise
dargestellt. Es zeigt -- -Fig. 1 eine Eichkurve, Fig. 2 das Linsen- und Blendensystem
in schematisches Darstellung, Fig. 3 eine Küvette in Ansicht und Fig.4 eine Küvette
imSchnitt nach der Linie IV-IV in Fig. 3.
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Aus der in Fig. 1 ersichtlichen Eichkurve ist die Eiweiß menge zu
entnehmen, die der gefundenen Extinktion entspricht. Die Eichkurve gilt für Werte
zwischen 0,02 und 12,5 Gamma (0,00000002 und 0,0000125 g) Eiweiß.
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Mit 1 ist in Fig. 2 ein Monochromator der Firma Zeiss oder der Firma
Beckmann bezeichnet, der einen Austrittsspalt 2 für monochromatisches Licht besitzt.
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Hinter dem Spalt 2 befindet sich eine Linse3 zur Abbildung des Monochromatorspaltes
in einer Blendenebene, in der ein Doppelspalt 4, bestehend aus einer Schlitzblende
mit verstellbaren Höhen- und Seitenbacken5 bzw. 6, angebracht ist. Die Verstellung
der Blendenbacken wird mif Hilfe der Stellschrauben 7 bzw. 8 vorgenommen, und das
Justieren der Schlitzblende im Strahlengang erfolgt mit der Stellschraube 9.
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Hinter der Schlitzblende ist ein Schrägspiegel 10 angeordnet, der
von einer Lichtquelle 11 bestrahlt wird. Im Strahlengang folgt eine Linsen2, die
den ausgeblendeten Meßstrahl in der Meßebene3 abbildet. In der Meßebene 13 ist ein
Probenträger14 mit Halterung für die angedeutete Glasküvette 15 vorgesehen. Der
Probenträger steht in einer Einrichtung 16, die dem Justieren der Probe im Meßstrahl
dient.
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Der Probenträger ist mit der Justiereinrichtung auf einem nicht gesondert
dargestellten Schlitten angeordnet, der mit einem Feintrieb 17 und einem Rast versehen
ist, um die Proben schrittweise in bestimmten Wegstrecken durch den Meßstrahl führen
zu können.
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Hinter der Meßebene befindet sich ein klappbarer Schrägspiegel 18,
mit dessen Hilfe das Justieren der Probe im Meßstrahl durch ein Mikroskop 19 beobachtet
wird.
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Dem Spiegel 18 ist der an sich bekannte lichtelektrische Empfänger
20, beispielsweise der Firma Zeiss oder der Firma Beckmann, nachgeschaltet.
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Der Spiegel 10 ist mit einem Durchlaß für den Meßstrahl versehen.
Die Lichtquelle 11 dient zum Beleuchten der Proben während des Justierens.
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Die die Küvette veranschaulichenden Fig. 3 und 4 zeigen, daß die
beiden durchsichtigen Platten21, 22 parallel zueinander mit Abstand voneinander
angeordnet und an den Seiten sowie am unteren Rand unter Bildung schmaler ;Wände23,
24 miteinander verbunden sind. Der Abstand zwischen den Platten 21, 22 ist so gewählt,
daß durch Einbringen eines der Küvette höhe und -breite entsprechend abgemessenen
Trägers 25 in die mit Lösungsmittel 26 gefüllte Küvette das
erforderliche Mischungsverhältnis
zwischen Träger und Lösungsmittel zustande kommt. Daß die Behälterwände mit nur
einer der Platten fest verbunden sind, während die andere, um die Küvette leicht
reinigen zu können, abnehmbar aufliegt, ist in den Zeichnungen nicht eigens dargestellt.
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Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß die Platten 21, 22 der Küvette an
ihren oberen Rändern 21 a; 22 a unter ständiger Erweiterung des Abstandes zwischen
ihnen keilförmig auslaufend ausgebildet sind. Auf diese Weise wird ein leichtes
und luftblasenfreies Einführen des Trägers 25 in die mit Lösungsmittel 26 gefüllte
Küvette ermöglicht. Das luftblasenfreie Mischen von Träger und Lösungsmittel ist
für eine fehlerfreie Ausmertung-der Proben unerläßlich.
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PATENTANSPRDCHE: 1. Verfahren zur photometrischen Bestimmung kleiner
Stoffmengen, die in gelöster Form auf einem saugfähigen Träger aufgebracht und in
einer Küvette photometrisch ausgewertet werden, dadurch gekennzeichnet, daß ein
fasriger oder poröser Träger zur Anwendung kommt, der in der Küvette durch ein Lösungsmittel
infolge beginnender Auflösung durch Aufhebung der lichtstreuenden und der doppelbrechenden
Eigenschaft seines Materials optisch gleichmäßig durchstrahlbar wird, während die
Struktur des Trägers so weit erhalten bleibt, daß die Probe ihre Lage beibehält,
und daß das Lösungsmittel gleiche Absorptionseigenschaften besitzt wie der in Auflösung
begriffene Träger.